JP3092811B2 - ペプチドおよびdna配列 - Google Patents
ペプチドおよびdna配列Info
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Description
visiae)から異種タンパク質(たとえば、ヒト血清アル
ブミン)の分泌を指図するために使用できる分泌リーダ
ー配列に関する。
するタンパク質分子の移動は、一般に、タンパク質自体
の一次アミノ酸配列内に保持された情報によっている。
最も広く用いられ、したがって特性が最もよく調べられ
ている配列情報は、原核生物および真核生物のアミノ末
端リーダーまたはシグナル配列である。シグナル配列を
完全にまたは広範囲に欠失させた遺伝子研究により、シ
グナル配列はタンパク質の移動に必須なことが示されて
いる(Benson,S.A.ら:1985,Ann.Rev.Biochem.,54:101〜
134)。数百種の既知配列(Watson,M.E.E.:1984,Nuc.Ac
id.Res.,12:5145〜5164)中に、一致したシグナル配列
も、ある与えられた位置でのあるアミノ酸の絶対的要求
といったものも認めることはできないが、多くのリーダ
ー配列の共通の特徴には7〜10個の疎水性アミノ酸のコ
アがある。この疎水性コアに、欠失または荷電残基の挿
入のいずれかによる変化を生じる遺伝子操作を行うと、
一般に、タンパク質の移動の阻止が起こる(Benson,S.
A.ら:1985,Ann.Rev.Biochem.,54:101〜134)。さらに、
ニワトリのリゾチームリーダ配列に対する一連の広範囲
の修飾により、Yamamotoら、1987(Biochem.Biophys.Re
s.Commun.,149:431〜436)は、疎水性コアに対する一部
の変化は分泌の消失を生じるものの、リーダー配列機能
を増強してタンパク質の分泌レベルの上昇を生じる場合
もあることを明らかにした。
に必須であるが、いったん移動するとこれらの配列は、
タンパク質が移動した細胞分画内に含まれる酵素によ
り、通常、タンパク質の内部ペプチド鎖で切断される。
これらの酵素は、移動したタンパク質の一次構造内の特
定のアミノ酸配列を認識する。さらに、ある種の真核生
物タンパク質のその成熟型への完全なプロセッシング
は、多くの場合、タンパク分解的切断によるものである
(Bussey,H.:1988,Yeast,4:17〜26)。
ンパク質の製造に際してのビヒクルとして、かびとくに
酵母の工業的に利用に向けられた研究が次第に増加して
きた。
る生成物であるから、分泌経路を通してタンパク質を導
くためにはリーダー配列内に含まれた情報を利用するこ
とができる。しかしながら、この情報は酵母に対して異
種のペプチド内に含まれている。酵母分泌経路によるそ
の認識、それに続くプロセッシングは同種の酵母リーダ
ー配列の認識、プロセッシングの場合ほどは必ずしも効
率的ではない。したがって、別のアプローチとして、リ
ーダー配列を、天然に分泌される酵母タンパク質由来の
配列に置換することが行われてきた。
フェロモンの89個のアミノ酸のリーダー配列である。こ
のリーダーのプロセッシングは広く研究されていて(Ku
rjan & Herskowitz:Cell,30:933〜943,1982;Juliusら:
Cell,32:839〜852,1983;Dmochowskaら:Cell,50:573〜58
4,1987;Juliusら:Cell,36:309〜318,1984;Juliusら:Cel
l,37:1075〜1085,1984)、完全なタンパク分解的切断に
より13個のアミノ酸の成熟α−因子フェロモンを遊離す
るためには、少なくとも4種の遺伝子産物を要求する。
には、最初に、小胞体内のシグナルペプチダーゼによる
N−末端の19個のアミノ酸のシグナル配列の除去が必要
である。これに続いて、ゴルジ装置内に存在する3種の
遺伝子生成物の一連の作用で大きな前駆体分子が処理さ
れ、α−因子フェロモンの4個のコピーが遊離する。こ
れらは、Lys−Arg二塩基性アミノ酸対の後を切断するエ
ンドペプチダーゼであるKEX2遺伝子生成物、カルボキシ
ペプチダーゼβ様切断を行い最近KEX1遺伝子生成物と同
定された生成物、およびSTE13遺伝子の生成物で成熟α
−因子フェロモンに先立つGlu−AlaまたはAsp−Alaジア
ミノ酸対を続いて除去するジペプチジルアミノペプチダ
ーゼである。
ンパク質およびペプチドを分泌させるために効果的に使
用されてきた。しかしながら、本発明者らは、ヒト血清
アルブミンの分泌を指図するためにα−因子シグナルを
使用した場合、生成した細胞外HSAの大部分が45KD N
−末端フラグメントの形であることを見出した。
パク質の分泌を支援するためKluyveromyces lactisのキ
ラー毒素からの16個のアミノ酸のシグナルペプチド(プ
レ配列)の使用が開示されている。
ある。これは2種の独立の配列の融合によって作成する
ことができる。酸ホスファターゼシグナルの最初のアミ
ノ酸がヒトα−インターフェロンのタンパク分解的切断
部位に融合させたハイブリッドシグナルでは、インター
フェロンの発現および分泌を生じ(Hinnenら:Foundatio
n for Biochemical and Industrial Fermentation Rese
arch,229:1219〜1224,1983)、生成したインターフェロ
ンの10%が培地中に分泌された。同様のアプローチで、
α−因子リーダーの最初の22個のアミノ酸をヒトインタ
ーフェロンα−2シグナル配列の最後の12個のアミノ酸
に融合させると、培養上清へのインターフェロンα−2
の分泌を生じた。(Piggottら:Curr.Genet.,12:561〜56
7,1987)。インターフェロンα−2遺伝子をインターフ
ェロンβ遺伝子で置換した同様の構築体では、培養上清
へのヒトインターフェロンβの分泌は起こらなかった。
最後に、ヒトリゾチームの分泌に対するリーダー配列の
効果を評価するために計画された一連の実験において、
Yoshimuraら(Biochem.Biophys.Res.Commun.,145:712〜
718,1987)は、ニワトリリゾチームリーダーの最初の9
個のアミノ酸とAspergillus awamoriグリコアミラーゼ
リーダーの最後の9個のアミノ酸からなる融合リーダー
について報告している。この融合リーダーは生成した物
質の60%を培養上清に分泌させる効果があったが、完全
なニワトリリゾチームのわずか15%の効果しかなかっ
た。しかも、ヒトリゾチーム配列の前に完全なAspergil
lusグリコアミラーゼリーダー、またはAspergillusグリ
コアミラーゼリーダーの最初の9個のアミノ酸とニワト
リリゾチームリーダーの最後の9個のアミノ酸から誘導
した融合体を配置しても、分泌生成物は検出できなかっ
た。
リーダー配列を案出した。
供する。
能なアミノ酸を示す。可能な任意の置換が本発明の範囲
内に包含される。最後の2個の位置に対するリジンまた
はアルギニンの選択にはとくに制限はないが、これらの
各位置には常にLysまたはArgが存在しなければならな
い。配列(a)の位置20および21はそれぞれGlyおよびV
alではないことが好ましい。アミノ酸4個まで短いかま
たは長い配列も、C末端(Lys,Arg)、Lys−LysまたはA
rg−Argの独自性が維持され、N末端の5残基内に陽性
荷電残基が存在し、配列の中間にまたはそれに隣接して
一般に疎水性の領域が存在することを条件に包含され
る。
接、そのカルボキシル末端で、ポリペプチドのN−末端
残基に連結してなる融合タンパク質を提供する。ポリペ
プチドは任意の所望のポリペプチドであってよく、「プ
ロ−ポリペプチド」(換言すれば、翻訳後切断または他
の修飾たとえばグリコシル化を受ける前駆体)も包含さ
れる。「ポリペプチド」の語にはオリゴペプチドを含
む。ポリペプチドは、フィブロネクチンもしくはその部
分(たとえば、コラーゲンまたはEP 207 751に記載さ
れているフィブリン結合タンパク質)、ウロキナーゼ、
プロ−ウロキナーゼ、CD4の1−368部分(D.Smithら:19
87,Science,328:1704〜1707)、血小板由来成長因子(C
ollinsら:1985,Nature,316:748〜750)、形質転換成長
因子β(Derynckら:1985,Nature,316:701〜705)、フォ
ン・ビルブラント因子の1−272部分(Bonthamら:Nucl.
Acids Res.,14:7125〜7127)、フィブロネクチンのカテ
プシンD断片(585−1578)、α1−アンチトリプシ
ン、プラスミノーゲン活性化因子、XIII因子、α−グロ
ビン、β−グロビン、ミオグロビンもしくは神経成長因
子、またはこれらの保存的変異体であってよい。ポリペ
プチドはまた、HSAまたはそのN末端部分と任意の他の
ポリペプチドたとえば上に挙げたようなポリペプチドと
の融合体であってもよい。好ましくはポリペプチドは天
然のヒト血清アルブミン、修飾ヒト血清アルブミンまた
はそれらの断片であり、このような修飾型または断片は
「変異体」と呼ばれる。これらの変異体には、HSAの生
理的機能の少なくとも1つを保持し、その構造(とくに
三次構造)の点で本技術分野の熟練者によってHSAの型
または断片とみなされるのに十分なHSAとの類似性を有
するHSAのすべての型および断片が包含される。
リガンド結合性の少なくとも50%(好ましくは80%、ま
たは95%)を維持するHSAの変異体または断片が包含さ
れるこのような性質については、Brown,J.R.& Shockle
y,P.(1982):Lipid−Protein Interaction,1:26−28,
Jost,P.C.& Griffith,O.H.編、に論じられている。
ーダー配列の使用によって分泌させることができる有用
なHSA断片の例である。
融合化合物をコードするヌクレオチド配列が提供され
る。ヌクレオチド配列(またはリーダー配列をコードす
るその部分)は、それぞれ配列(a)および(b)につ
いて第2表および第3表に示す可能性から選択される。
表中、各アミノ酸をコードするコドンはそのアミノ酸の
下に掲げる。第2表および第3表のコドンは明らかなよ
うにRNAに関するものであるが、相当するDNAヌクレオチ
ド配列も本発明のこの態様の範囲内に包含されることを
理解すべきである。
域と、その制御領域の制御下にある上述のヌクレオチド
配列からなるDNA構築体が提供される。「適当な制御領
域」の語は、その構築体が意図される宿主内での上記ヌ
クレオチド配列の発現を可能にするのに必要なDNA領域
を意味する。制御領域には通常、転写開始および停止配
列、3′−ポリアデニル化配列、プロモーター、および
多くの場合、プロモーターの上流活性部位が包含され
る。本技術分野の熟練者には、本技術分野において利用
可能な配列から適当な領域を選択し、組立てることは容
易である。しかしながら、適当な発現ベクターおよびそ
の構築の例としてはEP 198 745、GB 2171 703(枯
草菌の場合)、EP 207 165、EP 116 201、EP 123
244、EP 123 544、EP 147 198、EP 201 239、E
P 248 637、EP 251 744、EP 258 067、EP 286
424およびEP 322 094に開示されている例を挙げるこ
とができる。
主が提供される。宿主はその構築体がその内部で適切に
作動することが明らかにされた任意の宿主であって、細
菌、酵母、糸状菌、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞
が包含される。しかしながら、好ましい宿主はSaccharo
myces cerevisiaeまたはSchizosaccharomyces pombeで
あり、とくに前者が好ましい。多くの天然の分泌シグナ
ルは異種宿主においても有効であるから(たとえば、酵
母における天然のHSAリーダー配列)、本発明のリーダ
ー配列が酵母以外の宿主においても機能するであろうと
考えることは全く合理的である。
レオチド配列によって発現されたポリペプチドまたはそ
の修飾変異体を得ることによるポリペプチドの製造方法
を提供する。「その修飾変異体」の語は、実際に分離さ
れるポリペプチドが翻訳後に、とくにリーダー配列の切
断によって修飾されていることを意味する。
プチドが提供される。
ましい態様を実施例により、添付の図面を参照しながら
詳細に説明する。
る。
る。
る。
る。
レプロリーダー配列(85アミノ酸)のKEX切断部位をコ
ードするDNA配列のすぐ下流に配置された。このタンパ
ク質配列が酵母自律的転写プラスミド上のプロモーター
の制御下に置かれ、酵母Saccharomyces cerevisiaeの
半数体株にトランスホームされると、培養上清中に成熟
HSAを検出することができる。N−末端アミノ酸配列情
報は、分泌されたタンパク質が天然のHSAと同じN−末
端アミノ酸組成すなわちAsp−Ala−Hisを有することを
示している。これはまた、分泌されたHSAの最初の2個
のアミノ酸がSTE13遺伝子の生成物、ジペプチジルエン
ドペプチダーゼに感受性のないことを示している。この
酵素はα因子フェロモンの連続反復配列の間からこのよ
うな配列の除去する能力があるからである。成熟HSAは
培養上清中に認められる主生成物であるが、HSAのN−
末端断片(45キロダルトン)も検出され、合成された総
HSAの約15%を占めた。この断片成分は、分泌能力の浪
費のみでなく、これがHSAの断片として完全なHSAの一部
の生化学的および生物物理学的性質をもつ点においてあ
る種の下流精製の問題を提供するものである。
個のアミノ酸を除去し、α因子プレプロリーダー配列の
KEX2切断部位に先行する5個のアミノ酸、すなわちアミ
ノ酸81〜85、Ser−Leu−Asp−Lys−Arg(第2表)で置
換し、天然のHSAリーダーとみなされる融合リーダーを
構築した。
ーで形質転換すると、酵母は、α因子リーダー配列の場
合に認められるレベルに匹敵するレベルで、培養上清中
に成熟HSAを分泌する。N−末端配列解析によると、成
熟HSAは正しいN−末端アミノ酸組成をもつことが明ら
かである。
換により、培養上清中に認められる45kd断片のレベルは
6分の1に低下することが見出された。すなわち、これ
は、夾雑ポリペプチドの低下という点での有意な改良を
提供するものであり、したがって酵母培養上清からの成
熟HSAの精製の助けになる。
82)の記載に従って実施した。プラスミドpEK113(第1
図)(EP−A−248 637)は制限エンドヌクレアーゼMs
t IIおよびHind IIIで完全に消化した。DNAはフェノー
ル/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿で回収し
た。次に線状化されたプラスミドDNAをE.coli DNAポリ
メラーゼIのクレノウ断片で処理して、ブラント末端を
もつ線状DNA分子を生成させた。
ied Biosystems Inc 380B DNAシンセサイザーで構築
した(製造業者の指示に従って)。
端を有するpEK113の等モル量とリゲートした。リゲーシ
ョン混合物でE.coli株MC1061を形質転換し、DNAが導入
された細胞をアンピシリン含有培地(50μg/mlアンピシ
リン)上で選択した。オリゴヌクレオチド二重鎖を含む
組換えプラスミドは、個々のコロニーから製造されたDN
Aを制限エンドヌクレアーゼMst IIおよびEcoR Iで消化
してスクリーニングした。このようにしてプラスミドpE
K25が形成された(第2図)。
びBamH Iで完全に消化し、DNA断片を1%(w/v)アガロ
ースゲルを通して電気泳動することにより分離し、ゲル
から電気溶出によって688塩基対Xba I−BamH I断片を回
収した。
ヌクレアーゼXho Iで完全に消化した。線状化されたDNA
をフェノール/クロロホルムで抽出し、エタノールで沈
殿させた。次に、回収されたDNAをE.coli DNAポリメラ
ーゼIのクレノウ断片で前述のように処理し、ついでDN
Aをフェノール/クロロホルムで抽出し、エタノールで
沈殿させた。回収されたDNAを次にXba Iで完全に消化
し、消化生成物をアガロースゲル電気泳動で分離した。
ゲルから電気溶出で1067塩基対断片を回収した。前述の
ようにして、以下のオリゴヌクレオチド二重鎖(II)が
製造された。
エンドヌクレアーゼBamH Iで完全に消化した。線状化さ
れたDNAをフェノール/クロロホルムで抽出し、エタノ
ールで沈殿させた。
9.7から誘導された1067b.p.DNA断片およびpEK25から誘
導された688b.p.DNA断片の等モル量を一緒にリゲートし
た。リゲートされたDNAでE.coliDH5を形質転換し、形質
転換体を50μg/mlアンピシリンL−ブイヨンアガール上
で選択した。pAYE230と命名された所望のプラスミド
(第3図)を含む組換えコロニーは、個々のコロニーか
ら制限エンドヌクレアーゼBamH Iで得られた消化DNAに
よって選択された。
を1%アガロースゲルに通して電気泳動によって分離し
た。HSAをコードする配列を含む1832塩基対断片を電気
泳出によって回収した。
IIで完全に消化した。線状化されたプラスミドをフェ
ノール/クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ
た。
ル量を標準条件下にリゲートした。このリゲーション混
合物でE.coliDH5を形質転換し、DNAが導入された細胞を
50μg/mlアンピシリン含有L−ブイヨンアガール上で選
択した。pAYE238と命名された所望のプラスミド(第4
図)を含むコロニーは、コロニーからのDNAをPvu IIで
消化して選択した。
株S150−2Bに、Hinnenら(1978)の記載に従ってトラン
スホームした。プラスミドpAYE238が導入された細胞
は、2%(w/v)グルコース、20mg/ヒスチジン、20mg
/トリプトファンおよび20mg/ウラシルを補充した最
小培地上で選択した。
ース含有YEPD培地10mlに移し、30℃、200rpmで72時間イ
ンキュベートした。細胞を含まない培養上清をPharmaci
a Phast System上、製造業者の指示書の記載に従い、不
連続性8〜25%勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって分析した。細胞を染色し、脱色し、595nmにおけ
るゲル走査によって天然HSAとHSA断片の相対量を評価し
た。
lactisキラー株(ORF2)毒素(Stark & Boyd,1986;Tok
umagaら、1987)の16アミノ酸プレ領域がα因子プレプ
ロリーダー配列のKEX2切断部位に先行する5個のアミノ
酸、すなわちアミノ酸81〜85、Ser−Leu−Asp−Lys−Ar
g(第3表)に融合させてなる第二の融合リーダーを構
築した。
クターで形質転換すると、酵母は天然のK.lactisプレプ
ロキラー株毒素リーダー配列またはα因子プレプロリー
ダー配列のいずれかを用いた場合よりも高レベルで、培
養上清中に成熟HSAを分泌した。N−末端配列の解析に
より、成熟HSAは正しいN−末端アミノ酸組成をもつこ
とが明らかである。
因子リーダーの置換により、培養上清中に認められる45
kd断片のレベルの6分の1への低下を生じた。すなわ
ち、これは、夾雑するポリペプチドの低下という点で有
意な改良を提供するものであり、したがって酵母培養上
清からの成熟HSAの精製の助けになる。
HSA分泌ベクターを生成させるために使用した実験操作
は、オリゴヌクレオチド二重鎖(II)の代わりに自動化
Applied Biosystems Inc.380B DNAシンセサイザー上で
合成した(製造業者の指示に従って)オリゴヌクレオチ
ド二重鎖(III)を用いたほかは例1に記載した操作と
同一であった。
19.7から誘導された1067bp DNA断片およびpEK25から誘
導された688b.p.DNA断片の等モル量を一緒にリゲートし
た。リゲートされたDNAでE.coliDH5を形質転換し、形質
転換体を50μg/mlアンピシリンL−ブイヨンアガール上
で選択した。pAYE304と命名された所望のプラスミド
(第5図)を含む組換えコロニーは、個々のコロニーか
ら制限エンドヌクレアーゼBamH Iで得られた消化DNAに
よって選択された。
を1%アガロースゲルに通して電気泳動によって分離し
た。HSAをコードする配列を含む1823塩基対断片を電気
溶出によって回収した。
IIで完全に消化した。線状化されたプラスミドをフェ
ノール/クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ
た。
ル量を標準条件下にリゲートした。このリゲーション混
合物でE.coliDH5を形質転換し、DNAが導入された細胞を
50μg/mlアンピシリン含有L−ブイヨンアガール上で選
択した。pAYE305と命名された所望のプラスミド(第6
図)を含むコロニーは、コロニーからのDNAをPvu IIで
消化することによって選択した。
株S150−2BにHinnenら(1978)の記載に従ってトランス
ホームした。プラスミドpAYE305が導入された細胞は、
2%(w/v)グルコース、20mg/ヒスチジン、20mg/
トリプトファンおよび20mg/ウラシルを補充した最小
培地上で選択した。
ース含有YEPD培地10mlに移し、30℃、200rpmで72時間イ
ンキュベートした。細胞を含まない培養上清をPharmaci
a Phast System上、製造業者の指示書の記載に従い、不
連続性8〜25%勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって分析した。細胞を染色し、脱色し、595nmにおけ
るゲル走査によって天然HSAとHSA断片の相対量を評価し
た。
y)、適当なプロモーターおよび上記例1の融合リーダ
ーに基づくベクターを用いてSchizosaccharomyces pomb
e(株Leul.32h)を形質転換し、0.1Mクエン酸/リン酸
ナトリウムでpH5.6に緩衝したEMM(Edinburgh最小培
地、Ogden,J.E.& Fantes,P.A.:1986,Curr.Genetics,1
0:509〜514)10ml中30℃で発酵させると、3日後、培養
上清中に10〜15mg/のHSAが得られた。
red Benzon Symp.16,383−395. Birnboim,H.C.& Doly,J.(1979)Nucl.Acids Res.7,1
513−1523. Hanahan,D.(1983)J.Mol.Biol.166,557−580. Henderson,R.C.A.,Cox,B.S.& Tubb,R.(1985)Curr.Ge
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Claims (8)
- 【請求項1】次式 もしくは で示されるアミノ酸配列を有する分泌シグナル配列とし
て作用するポリペプチド。 - 【請求項2】請求項1記載のポリペプチドがそのカルボ
キシル末端で第2のポリペプチドである天然のヒト血清
アルブミン(HSA)もしくはその断片のN−末端残基に
連結してなる融合化合物。 - 【請求項3】請求項1記載のポリペプチドが第2のポリ
ペプチドに直接連結している請求項2の融合化合物。 - 【請求項4】請求項1記載のポリペプチドあるいは請求
項2の融合化合物をコードするポリヌクレオチド配列。 - 【請求項5】1個または複数個の適当な制御領域と請求
項4記載のポリヌクレオチド配列からなり、該ポリヌク
レオチド配列は該制御領域の制御下にあるDNA構築体。 - 【請求項6】請求項5記載のDNA構築体で形質転換され
た宿主。 - 【請求項7】Saccharomyces cerevisiaeまたはSchizosa
ccharomyces pombeである請求項6の宿主。 - 【請求項8】1個または複数個の適当な制御領域と請求
項2の融合化合物をコードするポリヌクレオチド配列か
らなり、該ポリペプチド配列は該制御領域の制御下にあ
るDNA構築体で形質転換された宿主を、該融合化合物が
発現され次いで分泌シグナル配列として作用する請求項
1のポリペプチドが解裂するように培養し、天然のヒト
血清アルブミン(HSA)を得ることからなるHSAの製造方
法。
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