JPH06197787A - 新規なるｄｎａ分子及び宿主 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は高い比率にて生物学的に活性な適切
に折りたたまれた外来タンパク質を宿主細胞より生産さ
せる方法の提供を目的とする。 【構成】 本発明は、改質された小胞体に位置する「二
塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」をコードする新
規なるＤＮＡ分子、及び形質転換されている宿主におけ
る外来ポリペプチドの適切なプロセシングのための前記
小胞体に位置する「二塩基プロセシングエンドプロテア
ーゼ」の利用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、改質された小胞体に位
置する「二塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」をコ
ードする新規なるＤＮＡ分子、及び形質転換されている
宿主における外来ポリペプチドの適切なるプロセシング
のための前記小胞体に位置する「二塩基プロセシングエ
ンドプロテアーゼ」の利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】薬学的に受け入れられる又は酵素的に活
性であるタンパク質の製造は生物工学産業の急速なる発
展における重要なる分野である。組換ＤＮＡ操作の初期
の頃から、多大なる数の有用な外来タンパク質が、この
タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む適当なる発現
ベクターにより形質転換されている真核宿主細胞の中で
生産され且つ分泌されている。真核発現系における分泌
タンパク質の製造に伴う重要なる問題の一つは、不適切
に折りたたまれた生物学的に不活性な生成物の回避にあ
る。

【０００３】真核細胞から分泌されるタンパク質は小胞
体（ＥＲ）へと移動することが一般的に知られ、これは
シグナル配列の存在に基づくものであり、そしてこのシ
グナル配列は粗面ＥＲ膜に局在している酵素シグナルペ
プチダーゼによって切断される。次にこのタンパク質は
ＥＲからゴルジ体へ、そしてゴルジ由来分泌小胞を経由
して細胞表層へと輸送される（Ｓ．Ｐｆｅｆｆｅｒ ａ
ｎｄ Ｊ．Ｒｏｔｈｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．５６：８２９−５２，１９８７）。適切にプロ
セスされ且つ適切に折りたたまれているタンパク質の製
造における他の重要なる段階は、ゴルジ装置及び分泌小
胞の中でのプロタンパク質のその成熟型への転換にあ
る。プロタンパク質の切断は通称二塩基部位、即ち、少
なくとも二個の塩基性アミノ酸より成るモチーフにて起
こる。

【０００４】タンパク質前駆体のプロセシングに関与す
ることで知られる異なる種類の「二塩基プロセシングエ
ンドプロテアーゼ」、例えば哺乳類プロテアーゼである
フリン、ＰＣ２、ＰＣ１及びＰＣ３、並びに酵母ＹＡＰ
３遺伝子及び酵母ｙｓｃＦの生成物（ＫＥＸ２遺伝子生
成物とも呼ばれる；本明細書ではＫＥＸ２と呼ぶ）があ
る。

【０００５】ＫＥＸ２ｐは酵母交配フェロモンα因子の
成熟に関与する（Ｊ．Ｋｕｒｊａｎａｎｄ Ｉ．Ｈｅｒ
ｓｈｋｏｗｉｔｚ，Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３，
１９８２）。このα因子は１６５個のアミノ酸前駆体と
して生産され、これは細胞表層への輸送中にプロセスさ
れる。第一の段階において、１９個のアミノ酸シグナル
配列（プレ配列）がシグナルペプチダーゼによって切断
される。次にこの前駆体はグリコシル化され、そしてゴ
ルジへと移動し、ここで６６個のアミノ酸プロ配列がＫ
ＥＸ２ｐによって切断される。α因子プレ−プロ−配列
はα−因子「リーダー」配列としても知られる。ゴルジ
装置における第２のプロテアーゼ、即ち、ＫＥＸ１遺伝
子生成物はこのタンパク質の最終成熟にとって重要であ
る。

【０００６】ＫＥＸ２ｐはＫＥＸ２ｐ遺伝子よりコード
され、そしてＮ末端触媒性ドメイン、Ｓｅｒ／Ｔｈｒに
富むドメイン、膜−結合（ｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメイ
ン、及びゴルジ局在化にとって重要なＣ末端テールより
成る。Ｓｅｒ／Ｔｈｒに富むドメイン、膜結合ドメイン
及びＣ末端テールが含まれている２００個のＣ−末端ア
ミノ酸を欠いている突然変異ＫＥＸ２ｐ酵素は、ＫＥＸ
２ｐプロテアーゼ機能、即ち、塩基性アミノ酸の組、例
えばＬｙｓ−Ａｒｇ又はＡｒｇ−ＡｒｇのＣ末端側にて
切断を行う機能を保持している〔Ｆｕｌｌｅｒら、１９
８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，
１４３４−１４３８；Ｆｕｌｌｅｒ，１９８９，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４６，４８２−４８５〕。

【０００７】リーダー配列、例えば酵母α−因子リーダ
ー配列は真核細胞における分泌型外来タンパク質の生産
のために広く利用されている。しかしながら数多くのケ
ースにおいて大きな問題が生じており、その理由はタン
パク質、特に低分子量タンパク質のケースにおいて不適
切な折りたたみ及び凝集に基づく生物学的に不活性なタ
ンパク質が大量に生産されることによる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】驚くべきことに、もし
宿主細胞が小胞体（ＥＲ）において「二塩基プロセシン
グエンドプロテアーゼ」活性を有するなら、不活性を不
適切に折りたたまれたタンパク質に対して高い割合の生
物学的に活性な適切に折りたたまれた外来タンパク質が
この宿主細胞において生産されることが発見された。

【０００９】従って、本発明の目的は、ＥＲにおいて
「二塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」を有する宿
主細胞の利用を含んで成る、外来生物学的活性タンパク
質の調製方法を提供することにある。他の目的は、「二
塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」変異体をコード
する遺伝子による形質転換に基づいてＥＲに位置してい
る「二塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」変異体を
有する宿主細胞の提供、更にはこのような遺伝子を含ん
で成るＤＮＡ分子の提供、並びにこのようなＤＮＡ分子
及びこのような宿主細胞の調製方法の提供にある。

【００１０】

【課題を解決するための具体的手段】外来タンパク質の調製方法 本発明は、プロタンパク質から、宿主細胞において遊離
された外来生物学的活性タンパク質の調製方法に関し、
この方法はＥＲにおいて「二塩基プロセシングエンドプ
ロテアーゼ」活性を有する宿主細胞の利用を含んで成
る。

【００１１】本発明の意味に範囲する「二塩基プロセシ
ングエンドプロテアーゼ」活性は二個の塩基性アミノ
酸、例えばＡｒｇ−Ａｒｇ，Ａｒｇ−Ｌｙｓ，Ｌｙｓ−
Ａｒｇ又はＬｙｓ−Ｌｙｓのモチーフに特異的なエンド
プロテアーゼの活性であり、このエンドプロテアーゼは
ゴルジ装置に天然に局在しており、そしてプロタンパク
質又はポリタンパク質のプロセシングに天然に関与して
いる。

【００１２】「二塩基プロセシングエンドプロテアー
ゼ」なる語は、真核系酵素、例えば哺乳類起源の、例え
ばフリン、ＰＣ２、ＰＣ１、ＰＣ３（Ｂａｒｒ，Ｃｅｌ
ｌ ６６：１−３，１９９１）、そして好ましくは酵母
に由来する酵素、例えばＹＡＰ３エンドプロテアーゼ
〔Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉら、Ｙｅａｓｔ ６：１２７
−１３７（１９９０）〕、そして最も好ましくはＳ．セ
レビジア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エンドプロテア
ーゼＫＥＸ２ｐを含む。

【００１３】本発明の「二塩基プロセシングエンドプロ
テアーゼ」の生物学的活性変異体はゴルジ装置に拘束さ
れているのではなく、ＥＲ保持シグナル、即ち、ＥＲに
おける「二塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」の保
持に適切なる構造の存在に基づいてＥＲに位置してい
る。天然の「二塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」
は膜アンカー、即ち疎水性の膜−結合配列に基づいてゴ
ルジ装置又は分泌小胞の膜に連結している。ＥＲ保持シ
グナルはこのタンパク質、即ち、「二塩基プロセシング
エンドプロテアーゼ」のＣ−末端に、ＥＲにおいてこの
プロテアーゼが位置するために結合している。プロテア
ーゼ及びＥＲ保持シグナルより成るこのような融合タン
パク質を以降「ＥＲに位置する二塩基プロセシングエン
ドプロテアーゼ」と称する。

【００１４】本発明の好ましい態様において、このＥＲ
保持シグナルは、「二塩基プロセシングエンドプロテア
ーゼ」の可溶性型、即ち、細胞膜に連結していない「二
塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」の変異体のＣ−
末端に連結されている。このような可溶性型は疎水性の
膜結合配列を欠いているが、典型的な酵素的「二塩基プ
ロセシング」機能は保持し続けている。

【００１５】本発明において有用な可溶性「二塩基プロ
セシングエンドプロテアーゼ」の好ましい例は、可溶性
Ｓ．セレビジアＫＥＸ２ｐ、即ち、ＫＥＸ２ｐ変異体で
あってＴｙｒ⁶⁷⁹ 〜Ｍｅｔ⁶⁹⁹ の領域に位置する疎水性
の膜−結合配列を欠いているものである〔８１４残基の
Ｓ．セレビジアＫＥＸ２ｐのアミノ酸配列はＫ．Ｍｉｚ
ｕｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍｕｎ．１５６，２４６−２５４（１９８８）に
詳細されている〕。特に、本発明に関する可溶性ＫＥＸ
２ｐエンドプロテアーゼに関して、その膜結合部位は選
択的に除去されている。従って例えばアミノ酸７００
（Ｌｙｓ）より出発するＣ末端が未だ存在しているか、
又はこの膜結合部位、即ち、Ｃ末端より１３６〜約２０
０個目のアミノ酸を含むＣ−末端全体が除去されてい
る。このような可溶性ＫＥＸ２ｐタンパク質は例えばＥ
Ｐ第３２７，３７７号又はＲ．Ｓ．Ｆｕｌｌｅｒら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６
１４３４−１４３８（１９８９）に詳細されている。本
発明の最も好ましい可溶性「二塩基プロセシングエンド
プロテアーゼ」は、配列表の配列番号１に示した配列を
有する可溶性ＫＥＸ２ｐであり、以降これをＫＥＸ２ｐ
ｓと称する。

【００１６】ＥＲ−保持シグナルはＥＲにポリペプチド
が位置することを決定させる構造である。ＥＲに位置す
ることは、ＥＲ膜への特異的な連結に基づくか、又は優
先的にゴルジ装置とＥＲの間の区画からＥＲ内腔へのポ
リペプチドの再輸送による、可溶性タンパク質のゴルジ
装置の中への輸送の防止に基づくであろう。本発明にお
いて優先的に利用されているＥＲ保持シグナルは後者の
型、即ち、可溶性タンパク質のゴルジ装置への輸送を防
ぐような型である。

【００１７】このようなＥＲ保持シグナルの好ましい例
は、哺乳類細胞において機能する通称ＫＤＥＬ配列（配
列番号３）である。より好ましいのは、酵母クルイベロ
マイシス ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
ｌａｃｔｉｓ）において機能するＤＤＥＬ配列（配列番
号４）であり、そして最も好ましいのはＳ．セレビジア
及びＫ．ラクティスにおいて機能するＨＤＥＬ配列（配
列番号２）である。

【００１８】「ＥＲに位置する二塩基プロセシングエン
ドプロテアーゼ」の好ましい型は、哺乳細胞の「二塩基
プロセシングエンドプロテアーゼ」、例えばフリン、Ｐ
Ｃ１、ＰＣ２、ＰＣ３（Ｐ．Ｊ．Ｂａｒｒ．前記）もし
くは好ましくはそれらの可溶性変異体、又は哺乳細胞に
おいて機能的であることで知られているＳ．セレビジア
ＫＥＸ２ｐもしくは好ましくはその可溶性変異体に連結
しているＥＲ−保持シグナルＫＤＥＬを含んで成る。も
しこのような「ＥＲに位置する二塩基プロセシングエン
ドプロテアーゼ」、例えばフリンＫＤＥＬ，ＰＣ１ＫＤ
ＥＬ，ＰＣ２ＫＤＥＬ、ＰＣ３ＫＤＥＬ又はＫＥＸ２ｐ
ＫＤＥＬ酵素が、外来タンパク質の発現のための遺伝子
により形質転換された哺乳類宿主細胞において生産され
るとき、高い比率の適切に折りたたまれた分泌型外来タ
ンパク質が生産される。

【００１９】より好ましくは、このＤＤＥＬ保持シグナ
ルをＫ．ラクティスＫＥＸ２ｐ類似体もしくは好ましく
はその可溶性変異体に、又はＳ．セレビジアＫＥＸ２ｐ
もしくは好ましくはその可溶性変異体、特にＫＥＸ２ｐ
ｓに融合させる。Ｓ．セレビジアＫＥＸ２ｐはＫ．ラク
ティスにおいても機能する。Ｋ．ラクティス宿主細胞に
おいて生産されたこのようなＫＥＸ２ｐＤＤＥＬは高比
率で適切に折りたたまれた分泌外来タンパク質の発現を
可能にする。

【００２０】最も好ましくは、ＨＤＥＬ保持シグナルを
Ｓ．セレビジアＫＥＸ２ｐ又は好ましくはその可溶性変
異体、特にＫＥＸ２ｐｓに融合させる。Ｋ．ラクティス
又はより好ましくはＳ．セレビジア宿主細胞において生
産されたこのようなＫＥＸ２ｐＨＤＥＬタンパク質は、
高比率での適切に折りたたまれた分泌型外来タンパク質
の発現を可能にする。

【００２１】「ＥＲに位置している二塩基プロセシング
エンドプロテアーゼ」を生産する宿主細胞を作るため、
宿主細胞は「ＥＲに位置している二塩基プロセシングエ
ンドプロテアーゼ」をコードする発現カセットによって
形質転換されねばならない。形質転換された宿主細胞は
その染色体上に内因性二塩基プロセシングエンドプロテ
アーゼに関する完全内因性遺伝子を含み続けていてよ
い。即ち、Ｓ．セレビジア系の場合、ＫＥＸ２ｐＨＤＥ
Ｌにより形質転換すべき宿主細胞はＫＥＸ２⁺ 細胞、例
えばＡＢ１１０株でありうる。しかしながら、対応の内
因性二塩基プロセシングエンドプロテアーゼをコードす
る遺伝子が破壊されていてもよく、即ち、Ｓ．セレビジ
ア系の場合、この宿主細胞はＫｅｘ２^- 細胞、例えばＡ
Ｂ１１０株Ｋｅｘ^2- でもよい。

【００２２】宿主細胞の形質転換のために、「ＥＲに位
置する二塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」をコー
ドする発現カセットの複製及び発現を提供するハイブリ
ドベクターが利用される。このようなハイブリドベクタ
ーは、染色体外的に維持されているベクターでよく、又
は宿主ゲノムの中に組込まれて前記発現カセットによっ
て安定的に形質転換された細胞を提供するようなベクタ
ーでもよい。適切な染色体外維持ベクター、そして更に
は宿主ゲノムに組込まれて哺乳細胞又は酵母細胞を形質
転換せしめるベクターは当業界によく知られている。

【００２３】ハイブリドベクターは遺伝子操作の業界に
おいて有用な任意のベクター、例えばウィルス、プラス
ミド又は染色体ＤＮＡに由来するもの、例えばＳＶ４
０、ヘルペスウィルス、パピロマウィルス、レトロウィ
ルス、バキュロウィルスの誘導体又は酵母プラスミドの
誘導体、例えば酵母２μプラスミドでありうる。複数の
考えられるベクター系が本発明のクローン化ＤＮＡの組
込み及び発現にとって有用である。一般に、選ばれた宿
主において、本発明の発現カセットに含まれている所望
するポリペプチド遺伝子を複製及び／又は発現する全て
のベクターが適切である。このベクターは、形質転換を
もくろむ宿主細胞に依存して選ばれる。このような宿主
細胞は好ましくは哺乳類細胞（もし哺乳類細胞において
機能的な「二塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」を
用いるなら）又はより好ましくは酵母細胞（もし酵母細
胞において機能的な「二塩基プロセシングエンドプロテ
アーゼ」を用いるなら）である。主として、本発明の染
色体外維持されたハイブリドベクターはＥＲに位置する
「二塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」の発現のた
めの発現カセット及び複製起点又は自律複製配列を含ん
で成る。

【００２４】複製起点又は自律複製配列（染色体外因子
に自律的複製能力を授けるＤＮＡ因子）は、外因性起
点、例えば哺乳類ベクターの場合はシミアンウィルス
（ＳＶ４０）もしくはその他のウィルス起源に由来する
起点を含むようにベクターを作製することにより、又は
宿主細胞染色体機構のいづれかによって提供される。本
発明のハイブリドベクターは、形質転換され、選別さ
れ、且つクローンされる宿主に依存して選択マーカーを
含みうる。このマーカーの表現型発現に基づいて形質転
換体の選別を促進する任意のマーカー遺伝子が利用でき
る。適切なマーカーは特に抗生物質耐性、例えばテトラ
サイクリンもしくはアンピシリンに対する耐性を発現さ
せるもの、又は宿主遺伝的欠陥を補うものである。マー
カーとして、形質転換すべき宿主がこのマーカーによっ
て発現される生成物に対して栄養要求変異種であること
を条件として、自律複製セグメントに関与する構造遺伝
子を利用することも可能である。

【００２５】本発明のハイブリドベクター、即ち、ＥＲ
に位置する「二塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」
の製造のための発現カセットを含んで成るベクターの調
製に適切なる好ましいベクターは、Ｓ．セレビジアの中
で複製及び発現するのに適切であり、且つ酵母複製起点
及び酵母のための選択遺伝子マーカーを含むものであ
る。酵母複製起点、例えば染色体自律複製セグメント
（ＡＲＳ）を含むハイブリドベクターは、形質転換後に
酵母細胞の中に染色体外的に保持され、そして有系分裂
中に自律的に複製される。更に、酵母２μプラスミドＤ
ＮＡに相同性である配列を含むハイブリドベクター、又
はＡＲＳ及び染色体中心体の配列例えばＣＥＮ４を含む
ものが利用できる。完全又は部分Ｓ．セレビジア２μプ
ラスミド配列を含む２μベースプラスミドが好ましい。
酵母にとって適切であるマーカー遺伝子は特に、宿主に
抗生物質耐性を授けるものであるか、又は栄養養求酵母
突然変異体の場合、宿主の遺伝的欠陥を補う遺伝子であ
る。例えば抗生物質シクロヘキシミドに対する耐性を授
ける、又は栄養養求酵母突然変異体に原栄養性を授ける
このような遺伝子は、例えばＵＲＡ３，ＬＥＵ２，ＨＩ
Ｓ３又はＴＲＰ１遺伝子である。

【００２６】好ましくは、ハイブリドベクターは細菌宿
主、特にＥ．コリに関する複製起点及びマーカー遺伝子
を更に含み、これによってハイブリドベクター及びその
前駆体の作製及びクローニングはＥ．コリの中で行われ
ることができる。本発明の最も好ましい態様において、
Ｓ．セレビジアのＫｅｘ^2-株を、染色体外維持プラスミ
ド又は組込みプラスミドのいづれかであって、可溶性Ｋ
ＥＸ２ｐＨＤＥＬの発現のための発現カセットを含んで
成るものによって形質転換させる。

【００２７】ＥＲに位置する「二塩基プロセシングエン
ドプロテアーゼ」の発現のための「発現カセット」と
は、このようなポリペプチドを発現させることが可能で
あり、且つプロモーター及び構造遺伝子、並びに所望す
るならば転写ターミネーター、更には任意的に転写エン
ハンサー、リボソーム結合部位及び／又は更なる調節配
列を含んで成るＤＮＡ配列を意味する。

【００２８】このような発現カセットは、関連の「二塩
基プロセシングエンドプロテアーゼ」遺伝子に天然に連
結している調節因子、外来因子のいづれか又は両方の混
合、即ち、例えば、同族プロモーター及び外来ターミネ
ーター領域を含みうる。宿主細胞の性質に依存して、広
範囲にわたる種々のプロモーター配列が利用されうる。
翻訳開始のための配列は例えばシャイン−ダルガルノ
（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列である。転写の
開始及び終結並びにｍＲＮＡの安定化のために必要な配
列は、それぞれウィルス又は真核系ｃＤＮＡ、例えば発
現宿主由来の非コード化５′領域及び３′領域から一般
的に得ることができる。

【００２９】プロモーターの例は前記した通り、即ち、
酵母ＴＲＰ１−，ＡＤＨＩ−，ＡＤＨＩＩ−，ＣＹＣ
１，ＧＡＬ １／１０，ＣＵＰ１，ＰＨ０３−もしくは
ＰＨ０５−プロモーター、又は熱ショックタンパク質由
来のプロモーター、又は解糖系プロモーター、例えばグ
リセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡ
Ｐ）プロモーター（５′不完全ＧＡＰを含む）もしくは
エノラーゼ、３−ホスホグリセラーテキナーゼ（ＰＧ
Ｋ）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラー
ゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６リン酸イ
ソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベ
ートキナーゼ、トリオセホスフェートイソメラーゼ、ホ
スホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ遺伝子
のプロモーター、更にはα−因子プロモーター並びにハ
イブリドプロモーター、例えばハイブリドＰＨ０５−Ｇ
ＡＰもしくはＡＤＨ２−ＧＡＰプロモーター、又は熱シ
ョック因子を利用するハイブリドプロモーターである。

【００３０】哺乳類細胞における発現にとって適切であ
るプロモーターは、例えばウィルスに由来するもの、例
えばＳＶ４０、ラウス肉腫ウィルス、アデノウィルス
２、ウシパピロマウィルス、パポバウィルス、サイトメ
ガロウィルス由来のプロモーターであるか、又は哺乳類
細胞由来のプロモーター、例えばアクチン、コラーゲ
ン、ミオシンもしくはβ−グロビン遺伝子由来のプロモ
ーターである。酵母プロモーターをエンハンシング配
列、例えば酵母上流活性化配列（ＵＡＳ）と組合せるこ
とができ、そして哺乳類細胞において活性であるプロモ
ーターをウィルス又は細胞性エンハンサー、例えばサイ
トメガロウィルス、ＩＥエンハンサー、ＳＶ４０エンハ
ンサー、イムノグロブリン遺伝子エンハンサー他と組合
せることができる。エンハンサーは転写刺激ＤＮＡ配列
であり、例えばウィルス、例えばシミアンウィルス、ポ
リオーマウィルス、ウシパピロマウィルスもしくはモロ
ニー肉腫ウィルス、又はそのゲノム起源に由来しうる。
エンハンサー配列はフィサルムポリセプハルム（Ｐｈｙ
ｓａｒｕｍ ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ）の染色体外リ
ボソームＤＮＡに由来するか、又は酵母酸性ホスファタ
ーゼＰＨ０５遺伝子、又は酵母ＰＨ０５，ＴＲＰ，ＰＨ
０５−ＧＡＰＤＨハイブリド、又は類似のプロモーター
から上流にある活性化部位でもありうる。

【００３１】ＥＲにおいて「二塩基プロセシングエンド
プロテアーゼ」活性を有する本発明の宿主細胞は適切に
プロセスされた外来タンパク質の製造にとって有用であ
る。この目的のため、所望の外来タンパク質をコードす
る遺伝子の発現のための発現カセットもむろん宿主細胞
に導入すべきである。このような発現カセットを本明細
書では「生産遺伝子」と呼ぶ。

【００３２】このような生産遺伝子はプロモーター領
域、シグナルペプチダーゼによって切断されうるシグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡ配列、「二塩基プロセシ
ングエンドプロテアーゼ」によって所望の外来遺伝子生
成物から切断されうるプロ配列をコードするＤＮＡ配
列、所望の外来遺伝子生成物をコードするＤＮＡ配列、
及び／又は転写ターミネーター領域、並びに任意的に転
写エンハンサー、リボソーム結合部位及び／又は更なる
調節配列を含んで成る。シグナルペプチド、プロ配列及
び外来タンパク質のためのコード領域は「インフレー
ム」で連結されている、即ち、シグナルペプチドはプロ
配列のＮ末端に共有結合している構造遺伝子の翻訳の結
果であり、そしてこのプロ配列は外来タンパク質のＮ−
末端に共有結合している遺伝子の翻訳の結果である。

【００３３】このプロ配列は、分子シャペロン（ｃｈａ
ｐｅｒｏｎｅ）として働きうるフラグメントのランダム
ゲノムライブラリー由来の任意の配列、即ち、ポリペプ
チドであって、ｃｉｓ又はｔｒａｎｓが適切な構造の形
成に影響を及ぼしうるものでありうる。好ましくは、こ
れは膜輸送を可能とするランダム配列である。特にα−
因子プロ配列が好ましい。

【００３４】「二塩基プロセシングエンドプロテアー
ゼ」の発現に関して前記した通り、宿主細胞の性質に依
存して広範囲にわたる種々の調節配列が発現カセットに
おいて利用されうる。例えば、強力であり且つ同時によ
く調節されるプロモーターが最も有用である。翻訳開始
のための配列はシャイン−ダルガルノ配列である。転写
の開始及び終結並びにｍＲＮＡの安定化のために必要な
配列はそれぞれウィルス又は真核系ｃＤＮＡ、例えば発
現宿主由来の非コード化５′領域及び３′領域から一般
的に得ることができる。

【００３５】本発明の範囲に属するシグナルペプチド
は、所望のポリペプチドのＥＲへの移動をもたらすプレ
配列であり、例えばα−因子シグナル配列である。更な
るシグナル配列が論文より開示され、それには例えばＶ
ｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１４，４６８３（１９８６）が含まれる。
適切なプロモーターの例は前記した通り、即ち、酵母Ｔ
ＲＰ１−，ＡＤＨＩ−，ＡＤＨＩＩ−，ＣＹＣ１，ＧＡ
Ｌ １／１０，ＣＵＰ１，ＰＨ０３−もしくはＰＨ０５
−プロモーター、又は熱ショックタンパク質由来のプロ
モーター、又は解糖系プロモーター、例えばグリセルア
ルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモ
ーター（５′不完全ＧＡＰを含む）もしくはエノラー
ゼ、３−ホスホグリセラーテキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキ
ソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、グルコース−６リン酸イソメラーゼ、
３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナー
ゼ、トリオセホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコ
ースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ遺伝子のプロモー
ター、更にはα−因子プロモーター並びにハイブリドプ
ロモーター、例えばハイブリドＰＨ０５−ＧＡＰもしく
はＡＤＨ２−ＧＡＰプロモーター、又は熱ショック因子
を利用するハイブリドプロモーター、あるいは真核生物
ウィルス由来のプロモーター、例えばＳＶ４０、ラウス
肉腫ウィルス、アデノウィルス２、ウシパピロマウィル
ス、パポバウィルス、サイトメガロウィルス由来のプロ
モーターであるか、又は哺乳類細胞由来のプロモータ
ー、例えばアクチン、コラーゲン、ミオシンもしくはβ
−グロビン遺伝子由来のプロモーターである。真核生物
プロモーターをエンハンシング配列、例えば酵母上流活
性化配列（ＵＡＳ）、又はウィルスもしくは細胞性エン
ハンサー、例えばサイトメガロウィルス、ＩＥエンハン
サー、ＳＶ４０エンハンサー、イムノグロブリン遺伝子
エンハンサー他と組合せることができる。

【００３６】ＥＲに位置する「二塩基プロセシングエン
ドプロテアーゼ」及び該生産遺伝子をコードする発現カ
セットは同一又は異なるタイプのプロモーターを含んで
成りうる。例えば、これらは共に、外来タンパク質の前
駆体及びそれをプロセスするＥＲに位置する「二塩基プ
ロセシングエンドプロテアーゼ」の協奏発現を可能とす
る誘発性プロモーターによって調節されうる。

【００３７】本発明の好ましい態様において、Ｓ．セレ
ビジアにおける発現にとって適切である生産遺伝子（こ
こでこの細胞はＥＲに位置する「二塩基プロセシングエ
ンドプロテアーゼ」、好ましくはＹＡＰ３ｐＨＤＥＬ、
より好ましくはＫＥＸ２ｐＨＤＥＬ、又は最も好ましく
はＫＥＸ２ｐｓＨＤＥＬを含む）は、酵母「二塩基プロ
セシングエンドプロテアーゼ」によって前駆体から切断
されうる酵母プロ配列をコードするＤＮＡ配列、好まし
くはＳ．セレビジアα−因子リーダー配列、及びその下
流にある所望の外来タンパク質をコードするＤＮＡ配列
より構成され、この融合遺伝子は酵母における転写及び
翻訳を調節する発現コントロール配列のコントロール下
にある。

【００３８】この外来タンパク質は、あらゆる生物学的
対象及び原核生物又は特に真核生物、特に高等真核生
物、例えば哺乳類（人間及び動物を含む）起源のタンパ
ク質、例えば酵素であって、例えば栄養素の生産のた
め、及び化学もしくは分子生物学における酵素反応の実
施のための酵素であるか、又はタンパク質であって、人
間及び動物の疾患の治療もしくはその予防にとって有用
であるタンパク質、例えばホルモン、免疫調節性、抗−
ウィルス性及び抗腫瘍特性を有するポリペプチド、抗
体、ウィルス抗原、血液凝固因子、繊維素溶解剤、成長
調節因子、更には食品等でありうる。

【００３９】このようなタンパク質の例は、例えばホル
モン、例えばセクレチン、サイモシン、レラキシン、カ
ルシトニン、黄体形成ホルモン、上皮小体ホルモン、ア
ドレノコルチコトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン、
β−リポトロピン、ウロガストロン、インスリン、成長
因子例えば表皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長
因子（ＩＧＦ）、例えばＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２、マ
スト細胞成長因子、神経成長因子、グリア由来神経成長
因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）もしくは形質転
換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦβ、成長ホルモ
ン、例えばヒトもしくはウシ成長ホルモン、インターロ
イキン、例えばインターロイキン−１もしくは−２、ヒ
トマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、インターフ
ェロン、例えばヒトα−インターフェロン、例えばイン
ターフェロン−αＡ、αＢ、αＤもしくはαＦ、β−イ
ンターフェロン、γ−インターフェロン又はハイブリド
インターフェロン、例えばαＡ−αＤ−もしくはαＢ−
αＤ−ハイブリドインターフェロン、特にハイブリドイ
ンターフェロンＢＤＢＢ、プロテナーゼインヒビター例
えばα₁ −アンチトリプシン、ＳＬＰ１等、肝炎ウィル
ス抗原、例えばＢ型肝炎表層もしくはコア抗原又はＡ型
肝炎抗原、又は非Ａ−非Ｂ型肝炎抗原、プラスミノーゲ
ン活性剤、例えば組織プラスミノーゲン活性剤又はウロ
キナーゼ、ハイブリドプラスミノーゲン活性剤、例えば
Ｋ₂ ｔｕＰＡ、チック抗凝集ペプチド（ＴＡＰ）、腫瘍
壊死因子、ソマトスタチン、レニン、イムノグロブリ
ン、例えばイムノグロブリンＤ，ＥもしくはＧの軽及び
／又は重鎖、又はヒト−マウスハイブリドイムノグロブ
リン、イムノグロブリン結合因子、例えばイムノグロブ
リンＥ結合因子、ヒトカルシトニン−関連ペプチド、血
液凝固因子、例えば因子IVもしくはVIIIc 、血小板因子
４、エリトロポイエチン、エグリン、例えばエグリン
Ｃ、デスルファトヒルジン、例えばデスルファトヒルジ
ン変異体ＨＶ１、ＨＶ２もしくはＰＡ、コルチコスタチ
ン、エシスタチン、シスタチン、ヒトスーパーオキサイ
ドジスムターゼ、ウィルスチミジンキナーゼ、β−ラク
タマーゼもしくはグルコースイソメラーゼである。好ま
しいのは、ヒトα−インターフェロン、例えばインター
フェロンαＢ、又はハイブリドインターフェロン、特に
ハイブリドインターフェロンＢＤＢＢ（ＥＰ第２０５，
４０４号参照）、ヒト組織プラスミノーゲン活性剤（ｔ
−ＰＡ）、ヒト一本鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン
活性剤（ｓｃｕ−ＰＡ）、ハイブリドプラスミノーゲン
活性剤Ｋ₂ ｔｕＰＡ（ＥＰ第２７７，３１３号参照）、
ヒトカルシトニン、デスルファトヒルジン、例えば変異
体ＨＶ１、より好ましくはインスリン関連タンパク質、
例えばインスリン、レラキシン、更により好ましくはイ
ンスリン様成長因子II、そして特にインスリン様成長因
子Ｉである。塩基性アミノ酸の組、例えばＡｒｇ−Ａｒ
ｇ，Ｌｙｓ−Ａｒｇ，Ｌｙｓ−Ｌｙｓ及びＡｒｇ−Ｌｙ
ｓがタンパク質表層上に露出し、それ故タンパク質分解
も受け易いタンパク質は、本発明に関する方法に適して
おらず、従ってこの連なる塩基性アミノ酸のうちの一方
を、その生物学的活性に影響を及ぼすことなく、別の非
塩基性アミノ酸へと交換されるような突然変異をされな
くてはならないであろう。

【００４０】生産遺伝子は、ＥＲに位置する「二塩基プ
ロセシングエンドプロテアーゼ」をコードする遺伝子と
同じベクター分子になくてはならないことはない。この
後者が染色体外維持されているベクター上に位置してい
る場合、この生産遺伝子が同一のベクター分子にあるこ
とが好ましいことがある。生産遺伝子の発現にとって適
切な発現ベクターは、例えばＥＲに位置する「二塩基プ
ロセシングエンドプロテアーゼ」の発現にとって適切で
あるものとして前記したもの、即ち、当業界の遺伝子操
作に有用なあらゆるベクターに由来するベクター、例え
ばウィルス、プラスミド又は染色体ＤＮＡ、例えばＳＶ
−４０、ヘルペスウィルス、パピロマウィルス、レトロ
ウィルス、バキュロウィルスの誘導体又は酵母プラスミ
ドの誘導体、例えば酵母２μプラスミドに由来するもの
でありうる。好ましいベクターはＳ．セレビジアにおい
て複製及び発現するベクターである。

【００４１】好ましくは、本発明のハイブリドベクター
は細菌宿主、特にＥ．コリの複製起点及びマーカー遺伝
子も含み、これによってこのハイブリドベクター及びそ
の前駆体の作製及びクローン化はＥ．コリの中で行うこ
とができるようになる。本発明に従う、ＥＲにおいて
「二塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」活性を有す
る宿主細胞の利用を含んで成る外来生物活性タンパク質
の製造のための方法は、（ａ）適切な宿主細胞を、ＥＲ
に位置する「二塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」
をコードする発現カセットを含んで成るハイブリドベク
ター及び生産遺伝子をコードするハイブリドベクターに
よって形質転換させるか、又は（ｂ）適切な宿主細胞
を、ＥＲに位置する「二塩基プロセシングエンドプロテ
アーゼ」及び生産遺伝子の両方を含んで成るハイブリド
ベクターによって形質転換させるか、又は（ｃ）ＥＲに
位置する「二塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」を
コードする遺伝子によって安定的に形質転換されている
適切な宿主細胞を、生産遺伝子をコードするハイブリド
ベクターによって形質転換させ；この形質転換させた宿
主細胞を、このＥＲに位置する「二塩基プロセシングエ
ンドプロテアーゼ」をコードする遺伝子及び生産遺伝子
が発現される条件のもとで培養し、そして常法に従って
この培養培地から所望の外来ポリペプチドを単離するこ
とを含んで成る。

【００４２】本発明は、インスリン様タンパク質、好ま
しくはＩＧＦ−２、そしてより好ましくはＩＧＦ−１で
あって、α−因子リーダー配列を含む前駆体として生産
されるものの製造のために、酵母株、より好ましくはサ
ッカロマイシス セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株、例えばＡＢ１１０又
はＡＢ１１０Ｋｅｘ^2-、ＥＲに位置する酵母「二塩基プ
ロセシングエンドプロテアーゼ」例えばＹＡＰ３ＤＤＥ
Ｌ、又は好ましくはＹＡＰ３ＨＤＥＬ、又はより好まし
くはＫＥＸ２ｐＨＤＥＬ、最も好ましくはＫＥＸ２ｐｓ
ＨＤＥＬを、用いる方法を優先的に考慮している。

【００４３】形質転換は当業界に知られる方法、例えば
Ｈｉｎｎｅｎら〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７５，１９１９（１９７８）〕に詳細の方
法に従う。この方法は三つの段階に分けることができ
る： （１）酵母の細胞壁又はその一部の除去。 （２）この「暴露」酵母細胞（スフェロプラスト）の、
ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）及びＣａ²⁺イオンの
存在下における発現ベクターとの処理。 （３）寒天の固形層における細胞壁の再生及び形質転換
細胞の選別。

【００４４】形質転換せしめた宿主細胞は当業界に知ら
れる方法により、炭素、窒素及び無機塩の同化性起源を
含む液体培地の中で培養する。種々の炭素起源が本発明
に関する形質転換酵母細胞の培養に用いることができ
る。好ましい炭素起源の例は同化性炭水化物、例えばグ
ルコース、マルトースもしくはラクトース、又は酢酸塩
であり、これらはそれ自体又は適当な混合物中で用いる
ことができる。適切な窒素起源の例はアミノ酸、例えば
カスアミノ酸、ペプチド及びタンパク質並びにそれらの
分解生成物、例えばトリプトン、ペプトン又は肉類抽出
物、酵母抽出物、麦芽抽出物及び更にはアンモニウム
塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸塩又は硝酸塩であ
り、これらはそれ自体又は適当な混合物中で用いること
ができる。更に利用できうる無機塩は、例えばナトリウ
ム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩、
塩化物、リン酸塩及び炭酸塩である。培地は更に、例え
ば増殖−促進物質、例えば微量元素、例えば鉄、亜鉛、
マグネシウム等、並びに好ましくは淘汰圧を及ぼし、そ
して発現プラスミドを失った細胞の増殖を防ぐための物
質が含む。従って、例えば必須アミノ酸において栄養養
求性である酵母株を宿主微生物として用いたとき、この
プラスミドはこの宿主の欠陥を補う酵素をコードする遺
伝子を含んでいることが好ましい。酵母株の培養はこの
ようなアミノ酸を欠く最少培地の中で行う。

【００４５】培養は当業界に知られる方法によって行わ
れる。培養条件、例えば温度、培地のpH値及び培養時間
は、本発明に従って製造される外来タンパク質の最大力
価が得られるように選択する。従って、酵母株を好気的
条件のもとで、浸水培養により、振騰又は攪拌しなが
ら、約２０〜４０℃、好ましくは約３０℃の温度で、５
〜８のpH、好ましくは約pH７にて、約４〜約９６時間、
好ましくは本発明のタンパク質の最大収率が達せられる
まで培養することが好ましい。この培養培地は、淘汰圧
が及ぼされ、そしてこの遺伝子マーカーを含んでいるハ
イブリドベクターＤＮＡを未だ含み続けている細胞のみ
が生存するように選ぶ。従って、この培地に抗生物質を
加えることが、このハイブリドベクターが対応の抗生物
質耐性遺伝子を含んでいる場合にある。

【００４６】細胞密度が十分なる値に到達したら、培養
を中断し、そして該生成物を含む培地と細胞とを分け
る。この細胞は新鮮な培地に付与されて連続生産のため
に用いられうる。このタンパク質は細胞内、特にペリプ
ラズマ空間の中に蓄積されることもありうる。この場
合、所望のタンパク質の回収の第一段階はこの細胞の内
部からこのタンパク質を遊離させることより成る。まず
細胞壁を酵素消化によって除去するか、又はそうでなけ
れば細胞壁を化学試薬、即ち、チオール試薬もしくはＥ
ＤＴＡによる処理によって除去し、これらは生産された
タンパク質が遊離されることを可能にする細胞壁損傷を
生じせしめる。得られる混合物を常用の手段、例えばポ
リエチレンイミンによる処理によってほとんどの非タン
パク質材料を除去する、硫酸アンモニウムを用いてこの
タンパク質を沈殿させる、ゲル電気泳動、透析、クロマ
トグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィー
（この外来タンパク質が大量の酸性又は塩基性アミノ酸
を含む場合に特に好ましい）、サイズ排除クロマトグラ
フィー、ＨＰＬＣ又は逆相ＨＰＬＣ、適切なセファデッ
クス（商標）カラムでの分子量サイジング等により、こ
の外来タンパク質について富化せしめる。予備精製生成
物の最終精製は例えばアフィニティークロマトグラフィ
ー、例えば当業界に知られる方法によって不溶性マトリ
ックス上に固定されている抗体を用いる抗体アフィニテ
ィークロマトグラフィー、特にモノクローナル抗体アフ
ィニティークロマトグラフィーによって行われる。組換ＤＮＡ分子 本発明は前記したＥＲに位置する「二塩基プロセシング
エンドプロテアーゼ」に関する発現カセットをコードす
る組換ＤＮＡ分子も考慮する。本発明は更に、このよう
な組換ＤＮＡ分子も含んで成るハイブリドベクターを考
慮している。

【００４７】本発明は好ましくは、組換ＤＮＡ分子又は
ハイブリドベクターであって、ＫＥＸ２ｐ、優先的には
可溶性ＫＥＸ２ｐ変異体、最も好ましくは配列表の配列
番号１に示すＫＥＸ２ｐｓに関しての、及びＥＲ保持シ
グナル、優先的には配列表の配列番号２に示すＨＤＥＬ
配列に関してのコード領域を含んで成るものを考慮す
る。ＥＲ保持シグナルに関するコード配列はＫＥＸ２ｐ
コード領域の下流方向に位置する。Ｃ−末端にて連結し
ているＨＤＥＬを有するＫＥＸ２ｐを本明細書ではＫＥ
Ｘ２ｐＨＤＥＬと命名し、それに対応する構造遺伝子を
ＫＥＸ２ＨＤＥＬとする。

【００４８】前記した通り、いくつかの可溶性ＫＥＸ２
ｐ変異体が論文に記載されている。本発明に関する更な
る欠失突然変異体は当業界に知られる方法、例えば前記
突然変異体をコードする対応のＤＮＡを作り、これを発
現コントロール配列のコントロール下にある適当なベク
ターＤＮＡに挿入し、形成せしめた発現ベクターによっ
て適当な宿主微生物を形質転換せしめ、この形質転換せ
しめた宿主微生物を適当な培養培地の中で培養し、そし
て生産される突然変異体を単離することによって製造で
きる。任意の前記突然変異体をコードするＤＮＡは、例
えばＫＥＸ２ｐをコードするＤＮＡを含むプラスミドを
獲得し、そして（１）膜結合部位をコードするＤＮＡ領
域内もしくはその３′側を切断する制限酵素（例えばＥ
ｃｏＲＩ，ＢｓｔＸＩ又はＮａｒＩ）によってこれを消
化し、この切断せしめたＤＮＡを適当なエンドヌクレア
ーゼ、例えばＢａｌ３１によって消化して、前記ＤＮＡ
領域を除去し、そしてブラント末端リゲーション等によ
ってこの線状プラスミドを環化せしめること、又は
（２）膜結合部位をコードするＤＮＡ領域に対して５′
側に一つの制限部位及び３′側に対して一つの制限部位
を選ぶもしくは作り（例えば位置特異的突然変異誘発に
より)(例えばＰｖｕII及びＮａｒＩ又はＥｃｏＲＩ；
３′制限部位は、ＫＥＸ２遺伝子の翻訳停止シグナルに
隣接するプラスミドＤＮＡ内にあってもよい）、前記制
限部位を認識する二つの制限酵素によってこのプラスミ
ドを消化し、そしてブラント末端リゲーション等によっ
てこの線状プラスミドを環化せしめること、又は（３）
ループアウト突然変異誘発を利用することによってこの
膜結合部位をコードするＤＮＡ領域を除去すること、又
は（４）ＫＥＸ２の場合はＰｖｕIIによる消化によって
Ｃ−末端全体を除去し、そしてブラント末端リゲーショ
ン等によってこの線状プラスミドを環化せしめること、
によって作られうる。ＫＥＸ２のＤＮＡ配列はわかって
いるため（Ｋ．Ｍｉｚｕｍｏら、前記）、適切な突然変
異誘発性オリゴヌクレオチドは容易に考案され、そして
Ｍ１３クローニング系に適用する前記ＤＮＡ領域を欠失
するために用いられうる。突然変異されたＫＥＸ２遺伝
子が酵母ＥＲ保持シグナルをコードするＤＮＡ配列に連
結されていることに注意を払うことが必要である。この
ようなＤＮＡ配列は、合成リンカーＤＮＡを介して所望
の位置に導入するか、又はこれは隣接のベクターＤＮＡ
によって提供されうる。優先的には、この突然変異され
たＫＥＸ２遺伝子はその３′末端に、前記のＨＤＥＬ配
列をコードするコドンを含む。これらの方法全ては常用
の技術を利用する。

【００４９】本発明の範囲内は、配列番号１及び２のＤ
ＮＡ配列の遺伝子コードと同義性のＤＮＡ配列、即ち、
ヌクレオチドは変わっているが、同一のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ配列も含んで成る。このような同義性
ＤＮＡ配列は例えば新規な制限酵素切断部位を含みう
る。宿主株 本発明の他の観点は宿主細胞、好ましくは哺乳類、より
好ましくは酵素、更により好ましくはＫ．ラクティス、
そして最も好ましくはＳ．セレビジア細胞であって、Ｅ
Ｒに位置する「二塩基プロセシングエンドプロテアー
ゼ」をコードする発現カセットを含んで成る本発明のハ
イブリドベクターによって形質転換されているものを含
む。本発明は、ＥＲに位置する「二塩基プロセシングエ
ンドプロテアーゼ」をコードする発現カセットによって
安定的に形質転換されている宿主細胞、即ち、染色体に
組込まれたこのような組換発現カセットを含んで成る宿
主細胞も考慮する。

【００５０】ＫＥＸ２ＨＤＥＬをコードする発現カセッ
トの組込みのために適切な宿主は例えば酵母、優先的に
はＳ．セレビジアのＫｅｔ２^- 突然変異体である。形質
転換宿主細胞の調製方法は、宿主細胞を、任意の構成性
又は誘発性プロモーター、好ましくは前記したプロモー
ター又はＫＥＸ２遺伝子のプロモーターのコントロール
下にあるＫＥＸ２ｐＨＤＥＬ発現カセットより成る組込
みベクターによって形質転換させ、そして安定的に形質
転換された細胞を選別することを含んで成る。安定な組
込み形質転換は当業界に周知であり、そして例えばＰ．
Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９
８７）又はＦ．Ｌ．ＧｒａｈａｍらＶｉｒｏｌｏｇｙ
５２：４５６−４６７（１９７３）における哺乳類細
胞、及びＲ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．１９４：２８１−３０２（１９９１）に
おけるＳ．セレビジア細胞について報告されている手法
に従って行うことができる。

【００５１】本発明は特に組換ＤＮＡ分子、ハイブリド
ベクター、形質転換宿主、タンパク質及びそれらの製造
方法、並びに実施例に記載する生物学的活性タンパク質
の製造に関する。以下の実施例を本発明の例示のために
提供するが、これらは何ら限定を意味するものではな
い。

【００５２】

【実施例】例１ ：可溶性ＫＥＸ２ｐ変異体をコードする短縮型ＫＥ
Ｘ２遺伝子の作製 可溶性ＫＥＸ２ｐプロテアーゼ活性を得るため、Ｃ末端
の２００個のアミノ酸をコードする６００ｂｐを欠いて
いる突然変異ＫＥＸ２遺伝子を作製した。この短縮遺伝
子は−１〜−５０２に達しているＫＥＸ２プロモーター
のコントロール下にある。翻訳は、ｐＵＣ１８のポリリ
ンカーを起源とする停止ゴドン（ＴＡＡ）にて停止す
る。

【００５３】詳しくは、プラスミドｐＵＣ１９〔ベーリ
ンガーマンハイムＧｍｂＨ，ＦＲＧ〕をＨｉｎｄIII で
完全に消化し、そして２６８６ｂｐのフラグメントを単
離した。この末端を補完し、そしてこのフラグメントを
再リゲートさせた。小分けしたリゲーション混合物をカ
ルシウム処理した形質転換コンピテントＥ．コリＪＭ１
０１〔インビトロゲン、サンディエゴ、ＵＳＡ〕細胞に
加えた。１２種の形質転換されたアンピシリン耐性Ｅ．
コリ形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンの存
在下において増殖させた。プラスミドＤＮＡを調製し、
そしてＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩによる消化によって
分析した。ＨｉｎｄIII 部位を欠くプラスミドをｐＵＣ
１９ｗｏＨと命名した。

【００５４】３２０７ｂｐのＢａｌＩ−ＡｈａIII ＫＥ
Ｘ２フラグメント（全ゲノム酵母ＤＮＡより入手）の両
端にＢａｍＨＩリンカーを加え、次いでＢａｍＨＩによ
って完全に消化せしめた。プラスミドｐＵＣ１９ｗｏＨ
をＢａｍＨＩにより完全に切断し、線状の２６９０ｂｐ
のフラグメントを単離し、そして上記のＢａｍＨＩＫＥ
Ｘ２フラグメントにリゲートさせた。小分けしたリゲー
ション混合物をＥ．コリＪＭ１０１細胞に形質転換させ
た。１２種の形質転換させたアンピシリン耐性コロニー
をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地の中
で増殖し、プラスミドＤＮＡを抽出し、そしてＢａｍＨ
Ｉ消化によって分析した。予測の制限フラグメントを有
する一個のクローンを選別し、そしてｐＫＳ３０１ｂと
命名した（ＤＳＫ６０２８として寄託）。

【００５５】プラスミドｐＤＰ３４（ＤＳＭ４４７３と
して寄託）に本質的に相当する２μｍ酵母ベクターｐＡ
Ｂ２４をＢａｍＨＩにより完全に切断し、そしてこの線
状ｐＡＢ２４フラグメントを単離した。プラスミドｐＫ
Ｓ３０１ｂをＢａｍＨＩにより消化し、そして完全ＫＥ
Ｘ２遺伝子を含むフラグメントを単離し、次いでこの線
状酵母ベクターｐＡＢ２４にリゲートさせた。小分けし
たリゲーション混合物をＥ．コリＪＭ１０１に形質転換
させ、そして１２種の陽性クローンのプラスミドＤＮＡ
をＢａｍＨＩ消化によって調べた。予測の制限フラグメ
ントを有する一つのクローンをｐＡＢ２２６と称する。

【００５６】プラスミドｐＫＳ３０１ｂをＳｐｈＩ，Ｐ
ｖｕII及びＳｃａＩによって完全に消化した。ＫＥＸ２
配列（−５０２〜＋１８４３）及びｐＵＣ１９のポリリ
ンカーの一部を含む２．３７ｋｂのＳｐｈＩ−ＰｖｕII
フラグメントを単離した。プラスミドｐＵＣ１８〔ベー
リンガーマンハイム、ＦＲＧ〕をＳｐｈＩ及びＳｍａＩ
により完全に切断した。２６６０ｂｐのＳｐｈＩ−Ｓｍ
ａＩ ｐＵＣ１８フラグメントを、ＳｐｈＩ／ＳｐｈＩ
及びＰｖｕII／ＳｍａＩリゲーションによって２．３７
ｋｂのＳｐｈＩ−ＰｖｕII ＫＥＸ２フラグメントにリ
ゲートさせた。このＰｖｕII／ＳｍａＩリゲーション
は、６１４個のアミノ酸をコードするＫＥＸ２ ＯＲＦ
を、７個の付加Ｃ−末端アミノ酸をコードし（−Ｇ−Ｖ
−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｎ−Ｓ）そしてそれに停止コドン（ＴＡ
Ａ）が続いているｐＵＣ１８配列におけるＯＲＦ（オー
プンリーディングフレーム）に融合させた。小分けした
リゲーション混合物をＥ．コリＪＭ１０１に形質転換さ
せた。アンピシリン耐性Ｅ．コリ形質転換体からプラス
ミドＤＮＡを単離し、そしてＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩ、
並びにＨｉｎｄIII による消化によって分析した。予測
の制限パターンを有する一つのクローンをｐ１８Ｋｅｘ
ｐと称する。配列表の配列番号１において、ＫＥＸ２−
由来のＤＮＡを有する可溶性ＫＥＸ２ｐｓをコードする
ＯＲＦを示す。

【００５７】プラスミドｐ１８ＫｅｘｐをＰｖｕII、Ｓ
ａｌＩ及びＳｃａＩによって完全に切断した。−５０２
〜＋１８４３に達するＫＥＸ２配列及び２０６ｂｐのｐ
ＵＣ１８配列を含む２５５２ｂｐのＳａｌＩ−ＰｖｕII
フラグメントを単離した。プラスミドｐＤＰ３４をＢａ
ｍＨＩにより消化し、そしてこの線状プラスミドの末端
を補完した。Ｔ４ポリメラーゼの不活性化の後、この線
状補完プラスミドをＳａｌＩにより切断し、そして１
１．７８ｋｂのフラグメントを単離した。ｐＤＰ３４
ＢａｍＨＩ^* −ＳａｌＩフラグメント（ＢａｍＨＩ^* ：
補完ＢａｍＨＩ）をＳａｌＩ／ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩ
^* ／ＰｖｕIIリゲーションによって２５５２ｂｐのＳａ
ｌＩ−ＰｖｕIIフラグメントにリゲートさせた。小分け
したリゲーション混合物を形質転換コンピテントＥ．コ
リＪＭ１０１細胞に形質転換させた。プラスミドＤＮＡ
をアンピシリン耐性細胞から抽出し、そしてＳａｌＩ，
ＮｃｏＩ，ＳｍａＩ，ＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩによる制限
分析によって分析した。予測の制限フラグメントを有す
る一つのクローンをｐＤＰＫｅｘｐと称する。例２ ：ｐＤＰＫｅｘｐＨＤＥＬの作製 プラスミドｐ１８Ｋｅｘｐ（例１参照）は、ｐＵＣ１８
のポリリンカー領域に挿入されている可溶性ＫＥＸ２ｐ
（ＫＥＸ２ｐｓ）をコードする短縮ＫＥＸ２遺伝子より
成る。ｐ１８ＫｅｘｐにおけるＫＥＸ２ｐｓのＣ末端を
コードするＤＮＡ配列の後に、Ａｓｐ７１８及びＥｃｏ
ＲＩが続く（配列番号１参照）。このプラスミドをＡｓ
ｐ７１８及びＥｃｏＲＩによって切断し、そしてＨＤＥ
Ｌ配列及び二つの停止コドンをコードする配列番号１１
及び１２のハイブリダイズ化オリゴヌクレオチドにリゲ
ートし、リゲーション生成物ｐ１８ＫｅｘｐＨＤＥＬを
得た。プラスミドｐ１８Ｋｃｘｐ及びＰ１８ＫｅｘｐＨ
ＤＥＬはＳａｃＩ又はＳｆａＩ消化によって区別でき
る。ポリリンカー挿入領域をｐ１８ＫｅｘｐＨＤＥＬに
おいてシーケンス化した。

【００５８】プラスミドｐ１８ＫｅｘｐＨＤＥＬをＳａ
ｌＩ，ＰｖｕII及びＳｃａＩにより切断し、そして２５
７２ｂｐのＳａｌＩ−ＰｖｕIIフラグメントを単離し
た。プラスミドｐＤＰ３４をＢａｍＨＩにより切断し、
そしてその接着末端をクレノウポリメラーゼによって補
完した。補完後、このポリメラーゼをフェノール／クロ
ロホルムによって破壊し、クロロホルム抽出し、次いで
エタノール沈殿した。ＢａｍＨＩ切断補完ｐＤＰ３４フ
ラグメントを次にＳａｌＩにより消化し、そして１１７
８０ｂｐのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ^* （ＢａｍＨＩ^* ：Ｂ
ａｍＨＩ部位補完）を単離した。

【００５９】ｐ１８ＫｅｘｐＨＤＥＬより単離した２５
７２ｂｐのＳａｌＩ−ＰｖｕIIフラグメントをこの１１
７８０ｂｐのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ^* ｐＤＰ３４フラグ
メントとリゲートさせた。ＳａｌＩ／ＳａｌＩ及びＰｖ
ｕII／ＢａｍＨＩ^* のリゲーションはプラスミドｐＤＰ
ＫｅｘｐＨＤＥＬを導いた。例３ ：ＩＧＦ−１発現カセットを含む酵母ベクターの作
製 プラスミドｐＤＰ３４は、完全２μ配列、酵母にとって
の選択マーカーとしての酵母ゲノムＵＲＡ３及びｄＬＥ
Ｕ２配列、並びにＥ．コリにおける選別及び増殖のため
のｐＢＲ３２２配列を含む、Ｅ．コリ−Ｓ．セレビジア
シャトルベクターである〔Ａ．Ｈｉｎｎｅｎ，Ｂ．Ｍｅ
ｙｈａｃｋ ａｎｄ Ｊ．ＨｅｉｍのＹｅａｓｔ ｇｅ
ｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｐ．Ｊ．Ｂａｒ
ｒ，Ａ．Ｊ．Ｂｒａｋｅ ＆ Ｐ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌ
ａ，編、頁、１９３−２１３（１９８９）、Ｂｕｔｔｅ
ｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａ
ｍ〕。ｐＢＲ３２２〔ベーリンガーマンハイムＧｍｂ
Ｈ、独国）の２７６ｂｐのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグ
メントを、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩによる消化の後に単
離した線状ベクターにリゲートさせた。小分けしたリゲ
ーション混合物をカルシウム処理した形質転換コンピテ
ントＥ．コリ ＨＢ１０１細胞〔インビトロゲン、サン
ディエゴ、ＵＳＡ〕に加えた。４種の形質転換されたア
ンピシリン耐性Ｅ．コリ形質転換体が１００μｇ／ｍｌ
のアンピシリンの存在下において増殖した。プラスミド
ＤＮＡを調製し、そしてＳａｌＩ−ＢａｍＨＩによる消
化によって分析した。予測の制限フラグメントを有する
一つのプラスミドをｐＤＰ３４Ａと称する。酵母におけ
る発現のためのヒトインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ
−１）遺伝子発現カセットをｐＤＰ３４ＡのＢａｍＨＩ
部位にリゲートさせた。この発現カセットのＤＮＡ配
列、

【００６０】

【化１】

【００６１】は配列番号５に示す。これは、ＢａｍＨＩ
−切断性リンカー、それに続く約４００ｂｐフラグメン
トのＳ．セレビジア グリセルアルデヒド−３リン酸デ
ヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、次いでα
−因子前駆体の最初の８５個のアミノ酸をコードする
Ｓ．セレビジアα−因子リーダー配列（Ｊ．Ｋｕｒｊａ
ｎら、Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３，１９８２）、
そのすぐ後に、化学合成ＩＧＦ−１遺伝子〔Ｇ．Ｔ．Ｍ
ｕｌｌｅｎｂａｃｈ，Ａ．Ｌ．Ｃｈｏｏ，Ｍ．Ｓ．Ｕｒ
ｄｅａ，Ｐ．Ｊ．Ｂａｒｒ，Ｊ．Ｐ．Ｍｅｒｒｙｗｅａ
ｔｈｅｒ，Ａ．Ｊ．Ｂｒａｋｅ，ａｎｄ Ｐ．Ｖａｌｅ
ｎｚｕｅｌａ，Ｆｅｄ，Ｐｒｏｃ，４２，４３４（要
約)(１９８３）〕、約２７５ｂｐのＳ．セレビジアα−
因子ターミネーター（αＦＴ；Ｋｕｒｉａｎら、Ｃｅｌ
ｌ ３０：９３３−９４３，１９８２）及び第２Ｂａｍ
ＨＩ−切断性リンカーより成る。小分けしたリゲーショ
ン混合物をＥ．コリ ＨＢ１０１に形質転換させた。６
種の形質転換体由来のプラスミドＤＮＡをＳａｌＩ及び
ＢａｍＨＩによって分析した。ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフ
ラグメントに対して３′に向いている発現カセットのプ
ロモーターを有する一つのクローンをｐＤＰ３４Ａ／Ｇ
ＡＰＤＨ−αＦＬ−ＩＧＦ１−αＦＴと命名した。 例４ ：二種類の突然変異したα−因子リーダー配列の作
製 ４００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーター、２５５ｂｐのα
ＦＬ配列、２１６ｂｐの化学合成ＩＧＦ−１遺伝子（Ｉ
ＧＦ−１遺伝子及び二つの停止コドン）及び２７５ｂｐ
のαＦＴより成る１１４６ｂｐのＢａｍＨＩフラグメン
トをｐＤＰ３４Ａ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬ−ＩＧＦ１−α
ＦＴ（例３参照）より遊離せしめた。これを、ＢａｍＨ
Ｉ消化した、細菌性アルカリホスファターゼ（Ｇｉｂｃ
ｏ−ＢＲＬ、バッセス、スイス国）処理した複製型の
（ＲＦ）ファージベクターＭ１３ｍｐ１８（ベーリンガ
ーマンハイムＧｍｂＨ、独国）にリゲートさせた。小分
けしたリゲーション混合物をＥ．コリ ＪＭ１０１に形
質転換させた。６個のプラーク由来のプラスミドＤＮＡ
をＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ及びＢａｍＨＩ−ＳａｌＩに
よって分析した。適切な制限フラグメントを有し、そし
てプロモーターがこのベクターのＥｃｏＲＩ部位に直接
隣接している一つのＲＦクローンを選別し、そしてｍｐ
１８／ＢａｍＨＩ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬ−ＩＧＦ１−α
ＦＴと命名した。配列番号６の突然変異誘発性オリゴデ
スオキシリボヌクレオチドプライマーを利用する２−プ
ライマープロトコール〔Ｍ．Ｊ．Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ
Ｍ．Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈ，ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，
１５４，３２９−３５０（１９８７）〕を用いる位置特
異的突然変異誘発は、アミノ酸Ａｌａ²⁰をＡｓｐ²⁰に、
そしてＰｒｏ²¹をＬｅｕ²¹に変える、αＦＬの新しい配
列を提供する。放射性標識化突然変異誘発性プライマー
によってハイブリダイゼーションさせた後の一つの陽性
クローンより得た一本鎖ＤＮＡをシーケンス化し〔Ｆ．
Ｓａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ ａｎｄ Ａ．Ｒ．
Ｃｏｕｌｓｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ７４，５４６３−５４６７（１９７
７）〕、所望の突然変異について認識した。突然変異し
たαＦＬ配列をαＦＬＭｕｔ２と命名し、そして得られ
るファージをｍｐ１８／ＢａｍＨＩ／ＧＡＰＤＨ−αＦ
ＬＭｕｔ２−ＩＧＦ１−αＦＴと命名した。

【００６２】配列番号７，８，９及び１０の４種の突然
変異誘発性オリゴデスオキシリボヌクレオチドプライマ
ーを用いる位置特異的突然変異誘発は、以下のアミノ酸
が置換されているαＦＬ配列をもたらした： Ａｌａ¹³→Ａｓｎ¹³，Ｇｌｎ³²→Ａｓｎ³²，Ｐｒｏ³⁴→
Ｔｈｒ³⁴，Ｇｌｙ⁴⁰→Ａｓｎ⁴⁰，Ｌｙｓ⁷⁶→Ａｓｎ⁷⁶及
びＧｌｕ⁷⁸→Ｔｈｒ⁷⁸。

【００６３】一本鎖ＤＮＡ鋳型におけるＤＮＡシーケン
シングは全ての突然変異を実証した。突然変異したαＦ
Ｌ配列をαＦＬＧ１Ｇ２Ｇ３Ｇ５と命名し、そしてその
ファージをｍｐ１８／ＢａｍＨＩ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬ
Ｇ１Ｇ２Ｇ３Ｇ５−ＩＧＦ１−αＦＴと命名した。例５ ：ＧＡＰＤＨ−αＦＬ−ＩＧＦ１−αＦＴ，ＧＡＰ
ＤＨ−αＦＬＭｕｔ２−ＩＧＦ１−αＦＴ及びＧＡＰＤ
Ｈ−αＦＬＧ１Ｇ２Ｇ３Ｇ５−ＩＧＦ１−αＦＴを含む
酵母ベクターの作製 ベクターｐＤＰ３４Ａ（例３参照）の中に固有ＢｇｌII
部位を作るため、プラスミドＤＮＡをＳａｃＩによって
完全に消化し、そして３′突き出しをＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ（ニューイングランドバイオラブ、ビバーリー、
ＭＡ、ＵＳＡ）によって平滑にした。線状のブラント末
端化ベクターｐＤＰ３４ＡをＢｇｌIIリンカー（ベーリ
ンガーマンハイムＧｍｂＨ、独国）にリゲートした。リ
ンカーリゲーションの後、このベクターをＢａｌIIによ
って消化し、次いで再リゲートさせた。小分けした再リ
ゲート化混合物のＥ．コリＨＢ１０１における形質転換
の後に得られる６種のアンピシリン耐性形質転換体のプ
ラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｌII−ＳａｌＩ及びＢｇ
ｌII−ＳｃａＩによって分析した。予測の制限フラグメ
ントを有する一つのクローンであって、ＳａｃＩ部位の
代りにＢｇｌII部位が作られていることが確認されたも
のをｐＤＰ３４Ｂと命名した。

【００６４】ｐＤＰ３４ＢをＢａｍＨＩにより完全に消
化し、そして細菌性アルカリホスファターゼによって処
理した。この線状ベクターＤＮＡは、ｐＤＰ３４Ａ／Ｇ
ＡＰＤＨ−αＦＬ−ＩＧＦ１−αＦＴ（例３参照）、ｍ
ｐ１８／ＢａｍＨＩ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬＭｕｔ２−Ｉ
ＧＦ１−αＦＴ（例４参照）及びｍｐ１８／ＢａｍＨＩ
／ＧＡＰＤＨ−αＦＬＧ１Ｇ２Ｇ３Ｇ５−ＩＧＦ１−α
ＦＴ（例４参照）より得られる１１４６ｂｐのＢａｍＨ
Ｉフラグメントをサブクローンするために用いた。リゲ
ーションの後、小分けした３種のリゲーション混合物そ
れぞれをＥ．コリ ＨＢ１０１に形質転換せしめた。３
種のリゲーションそれぞれに由来の４種の形質転換体の
プラスミドＤＮＡをＳａｌＩによって分析し、ＳａｌＩ
−ＢａｍＨＩｐＢＲ３２２フラグメントに対するＢａｍ
ＨＩフラグメントの方向を決定した。ｐＢＲ３２２ＤＮ
Ａがプロモーターの５′末端にある１１４７ｂｐのフラ
グメントをもたらすプラスミドを選び、そしてｐＤＰ３
４Ｂ／ＢａｍＨＩ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬ−ＩＧＦ１−α
ＦＴ、ｐＤＰ３４Ｂ／ＢａｍＨＩ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬ
Ｍｕｔ２−ＩＧＦ１−αＦＴ及びｐＤＰ３４Ｂ／Ｂａｍ
ＨＩ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬＧ１Ｇ２Ｇ３Ｇ５−ＩＧＦ１
−αＦＴと命名した。例６ ：同一のプラスミド上に、ＫＥＸ２ｐに関する、及
び野生型α−因子リーダー分泌シグナルを有するＩＧＦ
−１に関する発現カセットを含む酵母ベクターの作製 酵母ベクターｐＤＰ３４Ｂ（例５）をＢａｌIIによって
完全に消化し、そして細菌性アルカリホスファターゼに
よって処理した。プラスミドｐＫＳ３０１ｂ（例１）を
ＢａｍＨＩにより消化し、そして完全ＫＥＸ２遺伝子を
含む〜３２１０ｂｐのフラグメントを単離し、そして線
状ベクターｐＤＰ３４Ｂにリゲートさせた。小分けした
リゲーション混合物をＥ．コリ ＨＢ１０１に形質転換
させ、４種の形質転換体のプラスミドＤＮＡをＢａｍＨ
Ｉ及びＢａｌIIによる制限分析によって調べた。予測の
制限フラグメントを有する一つのクローンをｐＤＰ３４
Ｂ／ＫＥＸ２とした。

【００６５】ｐＤＰ３４Ｂ／ＫＥＸ２をＢａｍＨＩによ
り完全に消化し、そして細菌性アルカリホスファターゼ
によって処理した。ｐＤＰ３４Ａ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬ
−ＩＧＦ１−αＦＴ（例３）より単離したＩＧＦ−１発
現カセットを含む１１４６ｂｐのＢａｍＨＩフラグメン
トを線状ベクターｐＤＰ３４Ｂ／ＫＥＸ２にリゲートさ
せた。形質転換後、４種のクローンのプラスミドＤＮＡ
をＳａｌＩ及びＢａｍＨＩ−ＢｇｌIIによって分析し
た。ＩＧＦ−１発現カセットにおけるプロモーターがｐ
ＢＲ３２２−ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに対し
て３′側にあり、そしてＫＥＸ２遺伝子がＩＧＦ−１カ
セットと反対方向にある一つのクローンを選び、そして
ｐＤＰ３４Ｂ／ＫＥＸ２／ＧＡＰＤＨ−αＦＬ−ＩＧＦ
−１−αＦＴと命名した。例７ ：同一のプラスミド上に、ＫＥＸ２ｐ２に関する、
及び野生型α−因子リーダー分泌シグナルを有するＩＧ
Ｆ−１に関する発現カセットを含む酵母ベクターの作製 プラスミドｐＤＰＫｅｘｐ（例１）のＳｍａＩによる消
化の後、ＢａｍＨＩリンカー〔ベーリンガーマンハイム
ＧｍｂＨ、独国〕を加え、次いでＢａｍＨＩ及びＳｃａ
Ｉにより消化し、〜２５６０ｂｐのＢａｍＨＩフラグメ
ントを単離した。これを線状ｐＤＰ３４Ｂにリゲートし
た。ＢａｍＨＩ及びＢａｍＨＩ−ＢｇｌIIによる形質転
換のプラスミドＤＮＡの分析は、ｐＤＰ３４Ｂ／Ｋｅｘ
ｐと命名された予測の制限フラグメントを有する一つの
クローンをもたらした。

【００６６】このＩＧＦ−１発現カセットを例６と同じ
方法でｐＤＰ３４Ｂ／ＫｅｘｐのＢａｍＨＩ部位にサブ
クローンさせた。ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩ−ＢｌｌIIに
よる制限分析は、ＩＧＦ−１発現カセットのプロモータ
ーがｐＢＲ３２２ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの
３′側にあり、そして可溶性ＫＥＸ２がＩＧＦ−１カセ
ットと反対方向にある異なるクローンをもたらした。こ
のようなクローンの一つを選び、そしてｐＤＰ３４Ｂ／
Ｋｅｘｐ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬ−ＩＧＦ１−αＦＴと命
名した。例８ ：同一のプラスミド上に、ＫＥＸ２ｐｓＨＤＥＬに
関する、及び野生型α−因子リーダー分泌シグナルを有
するＩＧＦ−１に関する発現カセットを含む酵母ベクタ
ーの作製 ｐＤＰＫｅｘｐＨＤＥＬ（例２参照）をＢａｍＨＩによ
り消化し、そして長さ約２５８０ｂｐのフラグメントを
単離した後、これを線状ｄＤＰ３４Ｂにリゲートさせ
た。Ｅ．コリ ＨＢ１０１形質転換体のプラスミドＤＮ
ＡをＢａｍＨＩ−ＢｇｌIIによって分析した。予測の制
限フラグメントを有する一つのクローンをｐＤＰ３４Ｂ
／ＫｅｘｐＨＤＥＬと命名した。

【００６７】ＩＧＦ−１発現カセットを例６と同じ方法
でｐＤＰ３４Ｂ／ＫｅｘｐＨＤＥＬのＢａｍＨＩ部位に
サブクローンした。アンピシリン耐性Ｅ．コリ ＨＢ１
０１形質転換体のプラスミドＤＮＡをＳａｌＩ及びＢａ
ｍＨＩ−ＢｇｌIIによって分析した。ＩＧＦ−１発現カ
セットのプロモーターがｐＢＲ３２２ＳａｌＩ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメントの３′側にあり、そして可溶性ＫＥＸ
２ＨＤＥＬがＩＧＦ−１カセットの反対方向にある一つ
のクローンをｐＤＰ３４Ｂ／Ｋｅｘ２ｐＨＤＥＬ／ＧＡ
ＰＤＨ−αＦＬ−ＩＧＦ１−αＦＴと命名した。例９ ：プラスミドｐＤＰ３４Ｂ／ＫＥＸ２／ＧＡＰＤＨ
−αＦＬＭｕｔ２−ＩＧＦ１−αＦＴ、ｐＤＰ３４Ｂ／
Ｋｅｘｐ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬＭｕｔ２−ＩＧＦ１−α
ＦＴ、ｐＤＰ３４Ｂ／ＫｅｘｐＨＤＥＬ／ＧＡＰＤＨ−
αＦＬＭｕｔ２−ＩＧＦ１−αＦＴ、ｐＤＰ３４Ｂ／Ｋ
ＥＸ２／ＧＡＰＤＨ−αＦＬＧ１Ｇ２Ｇ３Ｇ５−ＩＧＦ
１−αＦＴ、ｐＤＰ３４Ｂ／Ｋｅｘｐ／ＧＡＰＤＨ−α
ＦＬＧ１Ｇ２Ｇ３Ｇ５−ＩＧＦ１−αＦＴ及びｐＤＰ３
４Ｂ／ＫｅｘｐＨＤＥＬ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬＧ１Ｇ２
Ｇ３Ｇ５−ＩＧＦ１−αＦＴの作製 これらのプラスミドを例６，７及び８に詳細の手順と類
似の方法で作製した。発現カセット、ＧＡＰＤＨ−αＦ
ＬＭｕｔ２−ＩＧＦ１−αＦＴ及びＧＡＰＤＨ−αＦＬ
Ｇ１Ｇ２Ｇ３Ｇ５のＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＤＰ
３４Ｂ／ＢａｍＨＩ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬＭｕｔ２−Ｉ
ＧＦ１−αＦＴ（例５参照）及びｐＤＰ３４Ｂ／Ｂａｍ
ＨＩ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬＧ１Ｇ２Ｇ３Ｇ５−ＩＧＦ１
−αＦＴ（例５参照）から単離し、そして既にＫＥＸ
２、可溶性ＫＥＸ２、又はＫＥＸ２ＨＤＥＬ遺伝子を含
んでいる酵母ベクターにサブクローンした。例１０ ：酵母ＡＢ１１０株のＫｅｘ２^- 突然変異体の作
製 ｐＫＳ３０１ｂ（例１）をＫＥＸ２遺伝子の固有Ｂｇｌ
II部位にて切り出した。プラスミドＹＥｐ１３〔Ｊ．Ｂ
ｒｏａｃｈら、Ｇｅｎｅ ８，１２１−１３３（１９７
９）〕由来の〜２９２０ｂｐのＢｇｌIIフラグメントを
線状ベクターｐＫＳ３０１ｂにリゲートさせた。小分け
したリゲーション混合物をＥ．コリＨＢ１０１に形質転
換させた。１２種のアンピシリン耐性形質転換体由来の
プラスミドＤＮＡをＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩにより分
析した。予測のフラグメントを有する一つのクローンを
ｐＵＣ１９／Ｋｅｘ２：：ＬＥＵ２と命名した。このプ
ラスミドは、機能的ＬＥＵ２遺伝子によって分断されて
いるＫＥＸ２遺伝子のコード配列を有する。

【００６８】ｐＵＣ１９／Ｋｅｘ２：：ＬＥＵ２をＢａ
ｍＨＩにより消化し、線状Ｋｅｘ２：：ＬＥＵ２フラグ
メントを遊離させた。酵母ＡＢ１１０株を線状ＤＮＡに
よる形質転換体のために用いた（例１１）。４種のＬＥ
Ｕ２⁺ 形質転換のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ
III によって消化した。ＫＥＸ２のゲノムコピーがＬＥ
Ｕ２遺伝子によって実際に分断されているかを確認する
ため、サザンブロット分析を行った。予測の制限フラグ
メントを有する一つの酵母形質転換体をＡＢ１１０Ｋｅ
ｘ２^- と命名した。例１１ ：Ｓ．セレビジアＡＢ１１０株及びＡＢ１１０Ｋ
ｅｘ２^- 株の形質転換 Ｋｌｅｂｅら〔Ｇｅｎｅ ２５，３３３−３４１（１９
８３）〕に詳細の通りに酵母形質転換を行った。

【００６９】Ｓ．セレビジアＡＢ１１０を以下のプラス
ミドで形質転換させ（例１２参照）、そしてその形質転
換体を表示の通りに命名した：プラスミド 形質転換体名 ｐＤＰ３４Ｂ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬ−ＩＧＦ１ −αＦＴ（例５） ｙＩＧ１ ｐＤＰ３４Ｂ／ＫＥＸ２／ＧＡＰＤＨ−αＦＬ −ＩＧＦ１−αＦＴ（例６） ｙＩＧ２ ｐＤＰ３４Ｂ／ＫＥＸ２ＨＤＥＬ／ＧＡＰＤＨ −αＦＬ−ＩＧＦ１−αＦＴ（例８） ｙＩＧ３ ｐＤＰ３４Ｂ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬＭｕｔ２ −ＩＧＦ１−αＦＴ（例５） ｙＩＧ４ ｐＤＰ３４Ｂ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬＧ１Ｇ２Ｇ３Ｇ５ −ＩＧＦ−αＦＴ（例５） ｙＩＧ５ 各形質転換体のうちの３個のクローンを選び、そして付
加番号を付けて命名した（即ち、ｙＩＧ１−１、ｙＩＧ
１−２、ｙＩＧ１−３）。

【００７０】Ｓ．セレビジアＡＢ１１０Ｋｅｘ２^- （例
１０参照）を以下のプラスミドによって形質転換させ、
そして表示の通りに命名した。プラスミド 形質転換体名 ｐＤＰ３４Ｂ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬ−ＩＧＦ１ −αＦＴ（例５） ｙＩＧ６ ｐＤＰ３４Ｂ／ＫＥＸ２／ＧＡＰＤＨ−αＦＬ −ＩＧＦ１−αＦＴ（例６） ｙＩＧ７ ｐＤＰ３４Ｂ／ＫＥＸ２／ＧＡＰＤＨ−αＦＬＭｕｔ２ −ＩＧＦ１−αＦＴ（例９） ｙＩＧ８ ｐＤＰ３４Ｂ／Ｋｅｘｐ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬＭｕｔ２ −ＩＧＦ１−αＦＴ（例９） ｙＩＧ９ ｐＤＰ３４Ｂ／ＫｅｘｐＨＤＥＬ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬＭｕｔ２ −ＩＧＦ−αＦＴ（例９） ｙＩＧ１０ ｐＤＰ３４Ｂ／ＫＥＸ２／ＧＡＰＤＨ−αＦＬＧ１Ｇ２Ｇ３Ｇ５ −ＩＧＦ１−αＦＴ（例９） ｙＩＧ１１ ｐＤＰ３４Ｂ／Ｋｅｘｐ／ＧＡＰＤＨ−αＦＬＧ１Ｇ２Ｇ３Ｇ５ −ＩＧＦ１−αＦＴ（例９） ｙＩＧ１２ ｐＤＰ３４Ｂ／ＫｅｘｐＨＤＥＬ／ＧＡＰＤＨ −αＦＬＧ１Ｇ２Ｇ３Ｇ５−ＩＧＦ１−αＦＴ（例９） ｙＩＧ１３ 各形質転換体のうちの３個のクローンを選び、そして付
加番号を付けて命名した（即ち、ｙＩＧ６−１、ｙＩＧ
６−２、ｙＩＧ６−３）。例１２ ：振騰フラスコ培養における酵母形質転換体の増
殖並びに高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及
びウェスタンブロットによるＩＧＦ−１タンパク質の定
量／定性分析 Ｓ ．セレビジアＡＢ１１０（Ｍａｔα，ｈｉｓ４−５８
０，ｌｅｕ２，ｕｒａ３−５２，ｐｃｐ４−３，〔ｃｉ
ｒ⁰ 〕）は既に詳細されている〔Ｐ．Ｊ．Ｂａｒｒら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２６３，１６４７１−１６４
７８（１９８８）〕。６．５ｇ／ｌの酵母抽出物、４．
５ｇ／ｌのカスアミノ酸及び３０ｇ／ｌのグルコースを
含むリッチ培地を非選択予備培養培地として用いた。Ｉ
ＧＦ−１を、３０ｇ／ｌのグルコース、８．５ｇ／ｌの
カスアミノ酸及び必要なアミノ酸を添加せしめた１．７
ｇ／ｌの酵素窒素ベースを含むウラシル−選択培地であ
るメイン培養において発現させた。酵母形質転換体（例
１１参照）をローターリーシェーカー上で３０℃で、１
８０ｒｅｖ．／分にて２４時間にわたり２０ｍｌ容量の
予備培養培地の中で、そして７２時間にわたりメイン培
養培地の中で増殖させた。

【００７１】小分けした細胞を回収し、そしてこの培養
培地の中で分泌された活性モノマーＩＧＦ−１分子をＨ
ＰＬＣ及びＥＬＩＳＡ〔Ｋ．Ｓｔｅｕｂｅら、Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８，６５１−６５７（１９９
１）〕によって測定した。小分けした培養培地を１３０
００ｘｇで２分間遠心した。細胞を３ｘのラエムリ（Ｌ
ａｅｍｍｌｉ）緩衝液（６％のＳＤＳ、０．１５Ｍのト
リスpH６．８、６ｍＭのＥＤＴＡ、３０％のグリセロー
ル、０．０５％のブロモフェノールブルー）に再懸濁さ
せ、次いで、ガラスビーズを強く振騰せしめることによ
って溶解させ、そして沸騰湯浴の中でこのサンプルを３
分間インキュベーションした。細胞リゼート由来のタン
パク質を１５％のポリアクリルアミドゲル〔Ｕ．Ｋ．Ｌ
ａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６８０−６８５
（１９７０）〕を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分け
た。タンパク質を、セミドライブロッター〔サルトリウ
ス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）ＧｍｂＨ、独国〕の補助を伴
ってニトロセルロースフィルター上にエレクトロブロッ
トさせた。写したタンパク質を、バイオラッド免疫アッ
セイキット〔バイオラッド、リッチモンド、ＣＡ、ＵＳ
Ａ〕により提供された手順に従って抗−ＩＧＦ−１抗体
によって検定した。例１３ ：ＨＰＬＣ及びウェスタンブロットによる、形質
転換体ｙＩＧ１，ｙＩＧ６及びｙＩＧ７由来の分泌型及
び細胞内ＩＧＦ−１タンパク質の比較 酵母ＡＢ１１０株（形質転換体ｙＩＧ１−１，ｙＩＧ１
−２及びｙＩＧ１−３）並びにＡＢ１１０Ｋｅｘ２^- 株
（形質転換体ｙＩＧ６−１，ｙＩＧ６−２及びｙＩＧ６
−３）におけるプラスミドｐＤＰ３４Ｂ／ＧＡＰＤＨ−
αＦＬ−ＩＧＦ１−αＦＴ（例５参照）の形質転換に由
来する分泌されたＩＧＦ−１をＨＰＬＣにより比較し、
そしてその結果を表１に示す。

【００７２】 表−１ 形質転換体 mg／ｌにおけるＨＰＬＣ力価 ｙＩＧ１−１ ８ ｙＩＧ１−２ ７ ｙＩＧ１−３ ７ ｙＩＧ６−１ ０ ｙＩＧ６−２ ０ ｙＩＧ６−３ ０ ｙＩＧ６−１，ｙＩＧ６−２及びｙＩＧ６−３由来の細
胞内タンパク質のウェスタンブロット分析は、αＦＬの
プロセシングが生じていないＩＧＦ−１を示している。

【００７３】この結果は、ＫＥＸ２の機能的コピーを染
色体上で欠いている酵母株からは成熟ＩＧＦ−１が培地
に分泌されなかったことを示唆する。ＫＥＸ２の機能的
コピーをプラスミド上に再導入させたら、例えばｐＤＰ
３４／ＫＥＸ２／ＧＡＰＤＨ−αＦＬ−ＩＧＦ１−αＦ
Ｔ（例６参照）を酵母ＡＢ１１０Ｋｅｘ２^-1 株に導入し
たら（形質転換体ｙＩＧ７−１，ｙＩＧ７−２及びｙＩ
Ｇ７−３）、分泌されたＩＧＦ１−が再び観察された。例１４ ：形質転換ｙＩＧ１，ｙＩＧ２及びｙＩＧ３より
分泌されたＩＧＦ−１タンパク質のＨＰＬＣ及びＥＬＩ
ＳＡによる比較 ＨＰＬＣは上清液中の活性なモノマーＩＧＦ−１の量を
測定する。ＥＬＩＳＡは上清液中のＩＧＦ−１様物質の
総量を決定する。モノマーの他に、ＥＬＩＳＡはジスル
フィド架橋二量体及び多量体、不適切に折りたたまれた
ＩＧＦ−１、酸化ＩＧＦ−１、並びにその他の分子を定
量する。表２は、ＩＧＦ−１及びＫＥＸ２ｐを同時発現
する形質転換体（ｙＩＧ１及びｙＩＧ２）並びにＩＧＦ
−１及びＫＥＸ２ＨＤＥＬｐを同時発現する形質転換体
（ｙＩＧ３）から分泌されたＩＧＦ−１のＨＰＬＣ力価
及びＥＬＩＳＡ値の比較を示している。

【００７４】 表 ２： 形質転換体 ＨＰＬＣ力価（mg／ｌ） ＥＬＩＳＡ値（mg／ｌ） ｙＩＧ１ ９ ９８ ｙＩＧ２ ８ ９２ ｙＩＧ３ ９ ２７ これらの結果は３種類の形質転換体それぞれに由来する
３つの独立した株に由来する平均値である。可溶性ＫＥ
Ｘ２ＨＤＥＬの同時発現は、モノマー以外の分子の形成
が劇的に低められたことを示す。例１５ ：ＨＰＬＣ分析による、形質転換体ｙＩＧ１，ｙ
ＩＧ４，ｙＩＧ８，ｙＩＧ９及びｙＩＧ１０から分泌さ
れたＩＧＦ−１の比較 突然変異したリーダー配列αＦＬＭｕｔ２はＡＢ１１０
株におけるＩＧＦ−１の分泌を可能にしない。グリコシ
ル化された、プロセスされていないαＦＬ−ＩＧＦ−１
分子が細胞内に蓄積された。グリコシル化の性質により
（コアグリコシル化のみが観察される）、これらの分子
はαＦＬ配列における突然変異に基づいて小胞体を超え
て搬送されなかったことが明白である。ＡＢ１１０Ｋｅ
ｘ２^-1 において、αＦＬＭｕｔ分泌シグナルを用いる、
ＫＥＸ２酵素の３種の異なる型、ＫＥＸ２、可溶性ＫＥ
Ｘ２及び可溶性ＫＥＸ２ＨＤＥＬを伴うＩＧＦ−１の同
時発現は、可溶性ＫＥＸ２ＨＤＥＬタンパク質が他の二
つとは異なることを示した。

【００７５】形質転換体ｙＩＧ１，ｙＩＧ４，ｙＩＧ
８，ｙＩＧ９及びｙＩＧ１０由来の細胞内ＩＧＦ−１−
様タンパク質のウェスタンブロット分析は、可溶性ＫＥ
Ｘ２ＨＤＥＬタンパク質のみが細胞内プールから成熟型
ＩＧＦ−１を遊離させることを示した。例１６ ：ＨＰＬＣ分析による形質転換体ｙＩＧ１，ｙＩ
Ｇ５，ｙＩＧ１１，ｙＩＧ１２及びｙＩＧ１３から分泌
されたＩＧＦ−１タンパク質の分析 突然変異したリーダー配列αＦＬＧ１Ｇ２Ｇ３Ｇ５はＡ
Ｂ１１０株におけるＩＧＦ−１の少ない分泌を可能にす
る。グリコシル化されていない、プロセスされていない
αＦＬ−ＩＧＦ−１分子が細胞内に蓄積した。これらの
分子はαＦＬのシグナル配列を欠いているものと考えら
れ、即ち、ＥＲへの移動が生じたことを示唆する。しか
しながら、ＥＲへの侵入はαＦＬのプロ領域における考
えられる３個の配列（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）の
グリコシル化に原因しない。ＡＢ１１０Ｋｅｘ２^- にお
ける、ＫＥＸ２酵素の三種類の型（ＫＥＸ２、可溶性Ｋ
ＥＸ２及び可溶性ＫＥＸ２ＨＤＥＬ）を伴うＩＧＦ−１
の同時発現は、ｙＩＧ１３において発現された可溶性Ｋ
ＥＸ２ＨＤＥＬタンパク質が、より多くの成熟型ＩＧＦ
−１を細胞内プールから遊離せしめることにおいて独特
であることを示した。例１７ ：酵母形質転換体ｙＩＧ１，ｙＩＧ５及びｙＩＧ
１３由来のモノマーＩＧＦ−１の分泌の速度を研究する
ための経時的実験 ゴルジの代わりにＥＲにおける、ＩＧＦ−１からのαＦ
Ｌのプロ領域の遊離は、種々の時間で分泌されるモノマ
ーＩＧＦ−１の総量に影響を及ぼす。このプロ領域はＥ
Ｒからゴルジへの未プロセスＩＧＦ−１の輸送を促進せ
しめる役割を有することが考えられる。この可能性を実
証するため、ｙＩＧ１，ｙＩＧ５及びｙＩＧ１３由来の
三つの個々の株を振騰フラスコの中で培養し、そして４
０ｈ，４８ｈ，６０ｈ及び７２ｈ後にこの酵母培養物由
来の小分けした上清液を採取してＨＰＬＣによってモノ
マーＩＧＦ−１の分泌を測定した。三種の形質転換体ｙ
ＩＧ１，ｙＩＧ５及びｙＩＧ１３それぞれに属する三つ
の個々の株（例えばｙＩＧ１−１，ｙＩＧ１−２，ｙＩ
Ｇ１−３、及びｙＩＧ５−１，ｙＩＧ５−２，ｙＩＧ５
−３、及びｙＩＧ１３−１，ｙＩＧ１３−２，ｙＩＧ１
３−３）から得た平均値を表３に示す。

【００７６】 表３ 株 分泌ＩＧＦ−１（mg／ｌ） ４０ｈ ４８ｈ ６０ｈ ７２ｈ ｙＩＧ１ ２．５ ４ ７ ８．５ ｙＩＧ５ ０．８ １ １．２ １．５ ｙＩＧ１３ ２．５ ４．５ ９．２ ６例１８ ：ウェスタンブロットによる、可溶性ＫＥＸ２Ｈ
ＤＥＬタンパク質を用いたＩＧＦ−１の分泌の分析（二
量体のかなりの減少が示された） ４０，４８及び６０時間目にて、分子内ジスルフィド架
橋化ＩＧＦ−１分子の形成は、可溶性ＫＥＸ２ＨＤＥＬ
タンパク質を用いては観察されなかった。しかしなが
ら、ＫＥＸ２ｐを発現する株は全ての時点にて二量体を
示した。これらの二量体はジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）によって少なくすることができ、従って事実上これ
らの二量体がジスルフィド結合していることを示唆し
た。寄託微生物 以下の微生物をブタペスト条約に従い、ドイツ国微生物
寄託所（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ
Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ：ＤＳＭ）、Ｍａｒ
ｓｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３３００ Ｂｒ
ａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに寄託した（寄託日及び承認番号
を付与する）：エッシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＤＰ３４：１９８８年３月１４
日、ＤＳＭ ４４７３。エッシェリヒア コリ ＪＭ１０１／ｐＫＳ３０１ｂ：
１９９０年６月２５日、ＤＳＭ６０２８。

【００７７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１８６６塩基対 配列の型：ポリヌクレオチド及び対応のポリペプチド 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖 起源：酵母ゲノムＤＮＡ 直接の起源：Ｅ．コリ JM 101/pKS 301b(DSM 6028) 特徴：１〜1866、可溶性ＫＥＸ２コード領域 配列： ATG AAA GTG AGG AAA TAT ATT ACT TTA TGC TTT TGG TGG GCC TTT 45 Met Lys Val Arg Lys Tyr Ile Thr Leu Cys Phe Trp Trp Ala Phe 1 5 10 15 TCA ACA TCC GCT CTT GTA TCA TCA CAA CAA ATT CCA TTG AAG GAC 90 Ser Thr Ser Ala Leu Val Ser Ser Gln Gln Ile Pro Leu Lys Asp 20 25 30 CAT ACG TCA CGA CAG TAT TTT GCT GTA GAA AGC AAT GAA ACA TTA 135 His Thr Ser Arg Gln Tyr Phe Ala Val Glu Ser Asn Glu Thr Leu 35 40 45 TCC CGC TTG GAG GAA ATG CAT CCA AAT TGG AAA TAT GAA CAT GAT 180 Ser Arg Leu Glu Glu Met His Pro Asn Trp Lys Tyr Glu His Asp 50 55 60 GTT CGA GGG CTA CCA AAC CAT TAT GTT TTT TCA AAA GAG TTG CTA 225 Val Arg Gly Leu Pro Asn His Tyr Val Phe Ser Lys Glu Leu Leu 65 70 75 AAA TTG GGC AAA AGA TCA TCA TTA GAA GAG TTA CAG GGG GAT AAC 270 Lys Leu Gly Lys Arg Ser Ser Leu Glu Glu Leu Gln Gly Asp Asn 80 85 90 AAC GAC CAC ATA TTA TCT GTC CAT GAT TTA TTC CCG CGT AAC GAC 315 Asn Asp His Ile Leu Ser Val His Asp Leu Phe Pro Arg Asn Asp 95 100 105 CTA TTT AAG AGA CTA CCG GTG CCT GCT CCA CCA ATG GAC TCA AGC 360 Leu Phe Lys Arg Leu Pro Val Pro Ala Pro Pro Met Asp Ser Ser 110 115 120 TTG TTA CCG GTA AAA GAA GCT GAG GAT AAA CTC AGC ATA AAT GAT 405 Leu Leu Pro Val Lys Glu Ala Glu Asp Lys Leu Ser Ile Asn Asp 125 130 135 CCG CTT TTT GAG AGG CAG TGG CAC TTG GTC AAT CCA AGT TTT CCT 450 Pro Leu Phe Glu Arg Gln Trp His Leu Val Asn Pro Ser Phe Pro 140 145 150 GGC AGT GAT ATA AAT GTT CTT GAT CTG TGG TAC AAT AAT AAT ACA 495 Gly Ser Asp Ile Asn Val Leu Asp Leu Trp Tyr Asn Asn Ile Thr 155 160 165 GGC GCA GGG GTC GTG GCT GCC ATT GTT GAT GAT GGC CTT GAC TAC 540 Gly Ala Gly Val Val Ala Ala Ile Val Asp Asp Gly Leu Asp Tyr 170 175 180 GAA AAT GAA GAC TTG AAG GAT AAT TTT TGC GCT GAA GGT TCT TGG 585 Glu Asn Glu Asp Leu Lys Asp Asn Phe Cys Ala Glu Gly Ser Trp 185 190 195 GAT TTC AAC GAC AAT ACC AAT TTA CCT AAA CCA AGA TTA TCT GAT 630 Asp Phe Asn Asp Asn Thr Asn Leu Pro Lys Pro Arg Leu Ser Asp 200 205 210 GAC TAC CAT GGT ACG AGA TGT GCA GGT GAA ATA GCT GCC AAA AAA 675 Asp Tyr His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Ile Ala Ala Lys Lys 215 220 225 GGT AAC AAT TTT TGC GGT GTC GGG GTA GGT TAC AAC GCT AAA ATC 720 Gly Asn Asn Phe Cys Gly Val Gly Val Gly Tyr Asn Ala Lys Ile 230 235 240 TCA GGC ATA AGA ATC TTA TCC GGT GAT ATC ACT ACG GAA GAT GAA 765 Ser Gly Ile Arg Ile Leu Ser Gly Asp Ile Thr Thr Glu Asp Glu 245 250 255 GCT GCG TCC TTG ATT TAT GGT CTA GAC GTA AAC GAT ATA TAT TCA 810 Ala Ala Ser Leu Ile Tyr Gly Leu Asp Val Asn Asp Ile Tyr Ser 260 265 270 TGC TCA TGG GGT CCC GCT GAT GAC GGA AGA CAT TTA CAA GGC CCT 855 Cys Ser Trp Gly Pro Ala Asp Asp Gly Arg His Leu Gln Gly Pro 275 280 285 AGT GAC CTG GTG AAA AAG GCT TTA GTA AAA GGT GTT ACT GAG GGA 900 Ser Asp Leu Val Lys Lys Ala Leu Val Lys Gly Val Thr Glu Gly 290 295 300 AGA GAT TCC AAA GGA GCG ATT TAC GTT TTT GCC AGT GGA AAT GGT 945 Arg Asp Ser Lys Gly Ala Ile Tyr Val Phe Ala Ser Gly Asn Gly 305 310 315 GGA ACT CGT GGT GAT AAT TGC AAT TAC GAC GGC TAT ACT AAT TCC 990 Gly Thr Arg Gly Asp Asn Cys Asn Tyr Asp Gly Tyr Thr Asn Ser 320 325 330 ATA TAT TCT ATT ACT ATT GGG GCT ATT GAT CAC AAA GAT CTA CAT 1035 Ile Tyr Ser Ile Thr Ile Gly Ala Ile Asp His Lys Asp Leu His 335 340 345 CCT CCT TAT TCC GAA GGT TGT TCC GCC GTC ATG GCA GTC ACG TAT 1080 Pro Pro Tyr Ser Glu Gly Cys Ser Ala Val Met Ala Val Thr Tyr 350 355 360 TCT TCA GGT TCA GGC GAA TAT ATT CAT TCG AGT GAT ATC AAC GGC 1125 Ser Ser Gly Ser Gly Glu Tyr Ile His Ser Ser Asp Ile Asn Gly 365 370 375 AGA TGC AGT AAT AGC CAC GGT GGA ACG TCT GCG GCT GCT CCA TTA 1170 Arg Cys Ser Asn Ser His Gly Gly Thr Ser Ala Ala Ala Pro Leu 380 385 390 GCT GCC GGT GTT TAC ACT TTG TTA CTA GAA GCC AAC CCA AAC CTA 1215 Ala Ala Gly Val Tyr Thr Leu Leu Leu Glu Ala Asn Pro Asn Leu 395 400 405 ACT TGG AGA GAC GTA CAG TAT TTA TCA ATC TTG TCT GCG GTA GGG 1260 Thr Trp Arg Asp Val Gln Tyr Leu Ser Ile Leu Ser Ala Val Gly 410 415 420 TTA GAA AAG AAC GCT GAC GGA GAT TGG AGA GAT AGC GCC ATG GGG 1305 Leu Glu Lys Asn Ala Asp Gly Asp Trp Arg Asp Ser Ala Met Gly 425 430 435 AAG AAA TAC TCT CAT CGC TAT GGC TTT GGT AAA ATC GAT GCC CAT 1350 Lys Lys Tyr Ser His Arg Tyr Gly Phe Gly Lys Ile Asp Ala His 440 445 450 AAG TTA ATT GAA ATG TCC AAG ACC TGG GAG AAT GTT AAC GCA CAA 1395 Lys Leu Ile Glu Met Ser Lys Thr Trp Glu Asn Val Asn Ala Gln 455 460 465 ACC TGG TTT TAC CTG CCA ACA TTG TAT GTT TCC CAG TCC ACA AAC 1440 Thr Trp Phe Tyr Leu Pro Thr Leu Tyr Val Ser Gln Ser Thr Asn 470 475 480 TCC ACG GAA GAG ACA TTA GAA TCC GTC ATA ACC ATA TCA GAA AAA 1485 Ser Thr Glu Glu Thr Leu Glu Ser Val Ile Thr Ile Ser Glu Lys 485 490 495 AGT CTT CAA GAT GCT AAC TTC AAG AGA ATT GAG CAC GTC ACG GTA 1530 Ser Leu Gln Asp Ala Asn Phe Lys Arg Ile Glu His Val Thr Val 500 505 510 ACT GTA GAT ATT GAT ACA GAA ATT AGG GGA ACT ACG ACT GTC GAT 1575 Thr Val Asp Ile Asp Thr Glu Ile Arg Gly Thr Thr Thr Val Asp 515 520 525 TTA ATA TCA CCA GCG GGG ATA ATT TCA AAC CTT GGC GTT GTA AGA 1620 Leu Ile Ser Pro Ala Gly Ile Ile Ser Asn Leu Gly Val Val Arg 530 535 540 CCA AGA GAT GTT TCA TCA GAG GGA TTC AAA GAC TGG ACA TTC ATG 1665 Pro Arg Asp Val Ser Ser Glu Gly Phe Lys Asp Trp Thr Phe Met 545 550 555 TCT GTA GCA CAT TGG GGT GAG AAC GGC GTA GGT GAT TGG AAA ATC 1710 Ser Val Ala His Trp Gly Glu Asn Gly Val Gly Asp Trp Lys Ile 560 565 570 AAG GTT AAG ACA ACA GAA AAT GGA CAC AGG ATT GAC TTC CAC AGT 1755 Lys Val Lys Thr Thr Glu Asn Gly His Arg Ile Asp Phe His Ser 575 580 585 TGG AGG CTG AAG CTC TTT GGG GAA TCC ATT GAT TCA TCT AAA ACA 1800 Trp Arg Leu Lys Leu Phe Gly Glu Ser Ile Asp Ser Ser Lys Thr 590 595 600 GAA ACT TTC GTC TTT GGA AAC GAT AAA GAG GAG GTT GAA CCA GGG 1845 Glu Thr Phe Val Phe Gly Asn Asp Lys Glu Glu Val Glu Pro Gly 605 610 615 GTA CCG AGC TCG AAT TCG TAA 1866 Val Pro Ser Ser Asn Ser 620

【００７８】配列番号：２ 配列の長さ：１２塩基対 配列の型：ＤＮＡ及び対応のペプチド 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖 起源：酵母ゲノムＤＮＡ 直接の起源：合成 特徴：ＥＲ保持シグナルＨＤＥＬのコード領域 配列： CAC GAC GAA TTA 12 His Asp Glu Leu

【００７９】配列番号：３ 配列の長さ：４アミノ酸 配列の型：ペプチド トポロジー：直鎖 起源：Ｋ．ラクティス 特徴：ＥＲ保持シグナルＤＤＥＬ 配列： Asp Asp Glu Leu

【００８０】配列番号：４ 配列の長さ：４アミノ酸 配列の型：ペプチド トポロジー：直鎖 起源：哺乳類細胞 特徴：ＥＲ保持シグナル、ＫＤＥＬ 配列： Lys Asp Glu Leu

【００８１】配列番号：５ 配列の長さ：１１５８塩基対 配列の型：ＤＮＡ及び対応のポリペプチド 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖 直接の起源：ｐＤＰ３４Ａ／ＧＡＰＤＨ−のＦＬ−ＩＧ
Ｆ１−αＦＴ 特徴：酵母におけるＩＧＦ−１の発現のための発現カセ
ット １〜６ ：ＢａｍＨＩ制限部位 ６〜404 ：Ｓ．セレビジア ＧＡＰＤＨプロモーター 405〜659 ：Ｓ．セレビジア α−因子リーダー 660〜869 ：ＩＧＦ−１ コード領域 870〜876 ：二つの停止コドンをコードするリンカー 877〜1152：Ｓ．セレビジア α−因子ターミネーター 1153〜1158：ＢａｍＨＩ制限部位 配列： GGATCCCCAG CTTAGTTCAT AGGTCCATTC TCTTAGCGCA ACTACAGAGA 50 ACAGGGGCAC AAACAGGCAA AAAACGGGCA CAACCTCAAT GGAGTGATGC 100 AACCTGCCTG GAGTAAATGA TGACACAAGG CAATTGACCC ACGCATGTAT 150 CTATCTCATT TTCTTACACC TTCTATTACC TTCTGCTCTC TCTGATTTGG 200 AAAAAGCTGA AAAAAAAGGT TGAAACCAGT TCCCTGAAAT TATTCCCCTA 250 CTTGACTAAT AAGTATATAA AGACGGTAGG TATTGATTGT AATTCTGTAA 300 ATCTATTTCT TAAACTTCTT AAATTCTACT TTTATAGTTA GTCTTTTTTT 350 TAGTTTTAAA ACACCAAGAA CTTAGTTTCG AATAAACACA CATAAACAAA 400 CACC ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA TTC GCA GCA 446 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala -85 -80 -75 TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA GAT GAA 491 Ser Ser Ala Leu Ala Ala Leu Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu -70 -65 -60 ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TTA GAT TTA 536 Thr Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Leu Asp Leu -55 -50 -45 GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA 581 Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr -40 -35 -30 AAT AAC GGG TTA TTG TTT ATA AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT 626 Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala -25 -20 -15 GCT AAA GAA GAA GGG GTA CAG CTG GAT AAA AGA GGT CCA GAA ACC 671 Ala Lys Glu Glu Gly Val Gln Leu Asp Lys Arg Gly Pro Glu Thr -10 -5 1 TTG TGT GGT GCT GAA TTG GTC GAT GCT TTG CAA TTC GTT TGT GGT 716 Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val Cys Gly 5 10 15 GAC AGA GGT TTC TAC TTC AAC AAG CCA ACC GGT TAC GGT TCT TCT 761 Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser Ser 20 25 30 TCT AGA AGA GCT CCA CAA ACC GGT ATC GTT GAC GAA TGT TGT TTC 806 Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe 35 40 45 AGA TCT TGT GAC TTG AGA AGA TTG GAA ATG TAC TGT GCT CCA TTG 851 Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60 AAG CCA GCT AAG TCT GCT TGA TAAGTCGACT TTGTTCCCAC TGTACTTTTA 902 Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70 GCTCGTACAA AATACAATAT ACTTTTCATT TCTCCGTAAA CAACATGTTT 952 TCCCATGTAA TATCCTTTTC TATTTTTCGT TCCGTTACCA ACTTTACACA 1002 TACTTTATAT AGCTATTCAC TTCTATACAC TAAAAAACTA AGACAATTTT 1052 AATTTTGCTG CCTGCCATAT TTCAATTTGT TATAAATTCC TATAATTTAT 1102 CCTATTAGTA GCTAAAAAAA GATGAATGTG AATCGAATCC TAAGAGAATT 1152 GGATCC 1158

【００８２】配列番号：６ 配列の長さ：３１塩基 配列の型：ＤＮＡ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 起源：合成オリゴヌクレオチド 直接の起源：合成 特徴：突然変異誘発性オリゴデスオキシリボヌクレオチ
ドプライマー 配列： GTAGTGTTGA CTAGATCTGC TAATGCGGAG G 31

【００８３】配列番号：７ 配列の長さ：２５塩基 配列の型：ＤＮＡ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 起源：合成オリゴヌクレオチド 直接の起源：合成 特徴：突然変異誘発性オリゴデスオキシリボヌクレオチ
ドプライマー 配列： GCGGAGGATGC GTTGAATAAA ACTGC 25

【００８４】配列番号：８ 配列の長さ：２８塩基 配列の型：ＤＮＡ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 起源：合成オリゴヌクレオチド 直接の起源：合成 特徴：突然変異誘発性オリゴデスオキシリボヌクレオチ
ドプライマー 配列： CAGCTTCAGC AGTAATGTTT GCCGTTTC 28

【００８５】配列番号：９ 配列の長さ：２１塩基 配列の型：ＤＮＡ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 起源：合成オリゴヌクレオチド 直接の起源：合成 特徴：突然変異誘発性オリゴデスオキシリボヌクレオチ
ドプライマー 配列： ATCTAAGTAG TTGATGACAG C 21

【００８６】配列番号：１０ 配列の長さ：３０塩基 配列の型：ＤＮＡ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 起源：合成オリゴヌクレオチド 直接の起源：合成 特徴：突然変異誘発性オリゴデスオキシリボヌクレオチ
ドプライマー 配列： GCTGTACCCC GGTTTCGTTA GCAGCAATGC 30

【００８７】配列番号：１１ 配列の長さ：３０塩基 配列の型：ＤＮＡ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 起源：合成オリゴヌクレオチド 直接の起源：合成 特徴：「ＨＤＥＬ」及び二つの停止コドンをコードし、
ＳｆｕＩ部位を含んでいるオリゴデスオキシリボヌクレ
オチド 配列： GTACCGTTCG AACACGACGA ATTATAATAG 30

【００８８】配列番号：１２ 配列の長さ：３０塩基 配列の型：ＤＮＡ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 起源：合成オリゴヌクレオチド 直接の起源：合成 特徴：配列番号１１のオリゴヌクレオチドをコードする
ＨＤＥＬとハイブリダイズし、ＳｆｕＩ部位を含んでい
るオリゴデスオキシヌクレオチド 配列： AATTCTATTA TAATTCGTCG TGTTCGAACG 30

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/60 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 クリスティーヌ ステファン フランス国，68260 キンジェルシェ，リ ュ ドゥ レンテント 26 (72)発明者 ペーター ゼーボト ドイツ連邦共和国，7854 インツリンゲ ン，エルシュテルベク ８ (72)発明者 ハワード リーズマン スイス国，4105 ビール−ベンケン，レッ テンベク 15

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 宿主においてプロ配列が切断された外来
   タンパク質の製造方法であって、小胞体（ＥＲ）におい
   て「二塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」活性を有
   する宿主細胞の利用を含んで成る方法。
2. 【請求項２】 ＥＲに位置するＫＥＸ２又はＹＡＰ３プ
   ロテアーゼを有する酵母宿主細胞の利用を含んで成る、
   請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 ＥＲに位置するＫＥＸ２プロテアーゼを
   有する酵母宿主細胞の利用を含んで成る、請求項１に記
   載の方法。
4. 【請求項４】 酵母α−因子プロ配列が切断された外来
   生物学的活性タンパク質の製造のための請求項１に記載
   の方法。
5. 【請求項５】 インスリン関連タンパク質の製造のため
   の請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 ＥＲに位置する「二塩基プロセシングエ
   ンドプロテアーゼ」のための発現カセットをコードする
   組換ＤＮＡ分子。
7. 【請求項７】 「二塩基プロセシングエンドプロテアー
   ゼ」及びＥＲ保持シグナルより成る、ＥＲに位置する
   「二塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」をコードす
   る、請求項６に記載の組換ＤＮＡ分子。
8. 【請求項８】 可溶性「二塩基プロセシングエンドプロ
   テアーゼ」及びＥＲ保持シグナルより成る、ＥＲに位置
   する「二塩基プロセシングエンドプロテアーゼ」をコー
   ドする、請求項６に記載の組換ＤＮＡ分子。
9. 【請求項９】 ＫＥＸ２ｐＨＤＥＬ，ＫＥＸ２ｐｓＨＤ
   ＥＬ及びＹＡＰ３ＨＤＥＬより成る群から選ばれるタン
   パク質をコードする、請求項７に記載の組換ＤＮＡ分
   子。
10. 【請求項１０】 請求項６に記載の組換ＤＮＡ分子を含
    んで成るハイブリドベクター。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載のハイブリドベクタ
    ーによって形質転換されている宿主細胞。
12. 【請求項１２】 安定的に形質転換されている、請求項
    １１に記載の宿主細胞。
13. 【請求項１３】 請求項６に記載の組換ＤＮＡ分子を製
    造する方法。
14. 【請求項１４】 請求項１１に記載の宿主細胞を製造す
    る方法。