FI100106B - Menetelmä plasminogeenin yksisäikeisen yhdistelmäaktivaattorin valmist amiseksi - Google Patents

Description

100106

Menetelmä plasminogeenin yksisäikeisen yhdistelmä-aktivaattorin valmistamiseksi

Keksintö koskee plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoreita, tällaisia plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoreita koodittavia DNA-sekvenssejä, tällaisia DNA-sekvenssejä sisältäviä yhdistelmävektoreita, tällaisilla yhdistelmävek-toreilla transformoituneita isäntäsoluja, menetelmiä tällaisten plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoreiden valmistamiseksi, DNA-sekvenssejä, yhdistelmävektoreita ja isäntiä.. Plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoreita voidaan käyttää farmaseuttisissa koostumuksissa.

Veritulpat ovat hyvin suuri kuolemanaiheuttaja kehittyneissä maissa. Verihyytymät koostuvat fibriinistä, jota muodostuu sen liukoisesta esiasteesta, fibrinogeenis-tä, trombiinientsyymin vaikutuksesta. Suuri joukko entsyymejä ja muita aineita varmistavat normaalisti sen, että veri hyytyy vain silloin ja siellä, missä hyytymistä vaaditaan verenhukan estämiseen.

Nisäkkäiden plasma sisältää entsymaattisen systeemin, nimeltään fibrinolyyttinen systeemi, joka kykenee liuottamaan verihyytyrniä. Yksi fibrinolyyttisen systeemin komponentti on entsyymijoukko nimeltään plasminogeenin aktivaattorit, joka muuntaa plasminogeenin (plasmiinin . inaktiivinen proentsyymimuoto) proteolyyttiseksi plasmii- nientsyymiksi. Tämän jälkeen plasmiini hajottaa hyytymien fibriiniverkon liukoisiksi tuotteiksi. Tapauksissa, joissa kehon trombolyyttinen kapasiteetti ei riitä poistamaan verisuonensisäisiä tulppia, kuten esimerkiksi tromboemboliassa tai leikkauksenjälkeisissä komplikaati-;\ oissa, saattaa olla välttämätöntä antaa trombolyyttisiä aineita.

Ihmisen kehon nesteistä ja soluista voidaan eristää kahta plasminogeeninaktivaattorityyppiä (joista tästedes käytetään lyhennettä "PA"), jotka ovat plasminogeenin urokinaasiaktivaattori eli urokinaasityyppinen 2 100106 plasminogeenin aktivaattori (käytetään tästedes lyhennettä "u-PA"), joka on esimerkiksi ihmisen virtsassa ja munuais-soluissa esiintyvä seriiniproteaasi, ja kudostyyppinen plasminogeenin aktivaattori (käytetään tästedes lyhennettä "t-PA), jota endoteelisolut tuottavat, ja jota löytyy lukuisista endokriinisistä kudoksista.

Sekä t-PA että u-PA esiintyvät kahdessa molekyylimuo-dossa: yksisäikeinen (joista usein käytetään vastaavia lyhenteitä "sc-tPA" ja "sc-u-PA") ja kaksisäikeinen (te) muoto. Yksisäikeinen muoto eli proentsyymimuoto muuttuu kaksisäikeiseksi proteolyyttisten entsyymien vaikutuksesta, jotka vaikuttavat polypeptidisekvenssin tarkalleen määrättyihin kohtiin. Näin syntyneet prosessoidun PA-proteiinin kaksi ketjua pysyvät kiinni toisissaan rikki-rikkisillan kautta. Karboksiterminaalinen fragmentti eli B-ketju välittää PA:n entsymattisen aktiivisuuden, kun taas aminoterminaalinen A-ketju sisältää säätely-yksiköt, kuten fibriiniinsitoutumsikohdat. Inaktiivisen yksisäikeisen PA:n spesifinen sitoutuminen verihyytymän komponentteihin, kuten fibriiniin, sekä sitä seuraava muuttuminen aktiiviseksi kaksisäikeiseksi PA:ksi katalyyttisten proteolyyttisten entsyymimäärien vaikutuksesta kyseisessä kohdassa antaa tulokseksi tehokkaan paikkaspesifisen lääkkeen.

t-PA ja u-PA ovat kahden eri geenin koodittamat ja ne voidaan erottaa toisistaan immunologisesti ja entsymaattisesti ja niillä on erilainen vaste inhibiittorien, stimulaattorien ja aktivaattorien suhteen. Niinpä Erytrina latissiman tuottama proteaasien inhibiittori (DE-3) inhiboi voimakkaasti vain t-PA:ta. Fibriini \ ja fibriinin fragmentit stimuloivat t-PA-aktiivisuutta suuresti, kun taas u-PA-aktiivisuus on insensitiivinen fibriinin ja sen fragmenttien stimuloivalle vaikutukselle. Vielä eräs nämä kaksi PA-entsyymiä toisistaan erottava ominaisuus on se, että kaksisäikeisellä t-PA:11a on suuri affiniteetti fibriinin ja fibriinifragmenttien tl.

3 100106 suhteen, kun taas kaksisäikeisellä u-PA:lla ei ole huomattavaa affiniteettia fibriinin suhteen.

Kun otetaan huomioon injektoitujen t-PA-laatujen epätyydyttävä stabiilisuus seerumissa, kaksisäikeisen u-PA:n pieni affiniteetti fibriinin suhteen ja se, että yksisäikeisen u-PA:n affiniteetin fibriinin suhteen ajatellaan olevan epäsuoran eli vaativan veren lisätekijää (ks. D.J. Binnema et ai., 8th Int. Congress of Fibrinolysis, Wien, 1986), on olemassa jatkuva tarve saada käyttöön parempia plasminogeenin aktivaattoreita, joilla on suuri affiniteetti fibriinin suhteen, suotuisampi vaste stimulaattoreiden suhteen, vähäisempi inaktivoitu-minen inhibiittorien vaikutuksesta ja pitempi tehollinen puoliintumisaika verenkierrossa.

Näin ollen esillä oleva keksintö tarjoaa uusia plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoreita, jotka ovat säilyttäneet t-PA:n ja u-PA:n edulliset ominaisuudet, mutta joilta puuttuvat kantaentsyyymien ei-toivotut ominaisuudet.

Nyt on yllättäen havaittu, että haluttaessa hoitaa tromboosia ja muita tiloja, joissa on toivottavaa saada aikaan fibrinolyysi plasminogeenin aktivoitumisen kautta, on yksiketjuisilla plasminogeenin yhdistelmäaktivaattori-proteiineilla parempia biologisia ominaisuuksia kuin yksiketjuisella t-PA:11a tai u-PA:11a. Tarkemmin sanottuna tarvitaan esillä olevan keksinnön mukaisia uusia plasmino-geeninaktivaattorimolekyylejä pienempiä määriä verihyy-tymien lysoimiseen kuin luontaisia plasminogeeninakti-vaattorimolekyylejä. Keksinnönmukaisia yksiketjuisia plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoriproteiineja voidaan tuottaa suuria määriä yhdistelmä-DNA-tekniikalla ja ne muuttuvat potilaisiin injektoituina fibriinin vaikutuksesta kaksiketjuiseen muotoonsa vain lysoitavan veri-hyytymän kohdassa. Kaksiketjuisia plaminogeenin yhdiste lmäaktivaattor imolekyy le jä on selostettu kirjallisuudessa (eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no.

4 100106 155 387; K.C. Robbins, 8th International Congress of Fibrinolysis, Wien, 1986), mutta edullisempia plasmino-geenin yhdistelmäaktivaattorimolekyylien yksiketjuisia muotoja ei voida tuottaa proteiinitasolla, kuten viitatussa kirjallisuudessa on selostettu, vaan niitä voidaan tuottaa suurina määrinä ja teollisessa mittakaavassa vain yhdistelmä-DNA-tekniikalla.

Näin ollen esillä olevan keksinnön tarkoituksena on lisäksi tarjota keinoja ja menetelmiä yksiketjuisten u-PA/t-PA-yhdistelmäproteiinien tuottamiseen. Tällaisiin keinoihin kuuluvat DNA-sekvenssit, jotka koodittavat mainittuja u-PA/t-PA-yhdistelmäproteiineja, mainittuja DNA-sekvensssejä sisältävät yhdistelmävektorit ja mainituilla yhdistelmävektoreilla transformoituneet isännät. Edelleen keksintö tarjoaa menetelmiä mainittujen yksisäi-keisten u-PA/t-PA-proteiinien tuottamiseksi ja mainittujen DNA-sekvenssien, mainittujen yhdistelmävektorien ja mainittujen isäntien aikaansaamiseksi. Esillä oleva keksintö tarjoaa myös kustannuksiltaan edullisemman menetelmän kaksisäikeisten palsminogeenin yhdistelmäakti-vaattorimolekyylien- tuottamiseksi siten, että yhdistelmä-DNA-sekvenssien avulla aikaansaadut yksiketjuiset tuotteet voidaan katkaista sopivalla proteolyyttisella entsyymillä, kuten plasmiinilla, in vitro-olosuhteissa.

Erityisesti tämä keksintö koskee yksiketjuista plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoria, jonka aminohappo-järjestys koostuu vähintään kahdesta alasekvenssistä, jotka vastaavat aminohappojen identtisyydeltään ja niiden lukumäärältään ihmisen t-PA:n ja ihmisen u-PA:n alasek-venssejä.

Kuten · muissa veren fibrinolyyttiseen systeemiin ja koaguloitumisssysteemiin liittyvissä seriiniproteaa-seissa, on myös u-PA:ssa ja t-PA:ssa ryhmiteltyinä suuria ei-katalyyttisiä jaksoja A-ketjussa, joka on liittyneenä katalyyttiseen alueeseen (B-ketju). t-PA:n ei-katalyyttinen A-ketju voidaan jaotella erillisiksi 11 5 100106 osakokonaisuuksiksi, jotka ovat "sormialue", "kasvutekijä-alue" ja kaksi "kringlealuetta", kun taas u-PA:n A-ketju koostuu "kasvutekijäalueesta" ja yhdestä "kringlerakentees-ta" (ks. L. Patthy, Cell 41, 657 - 663 (1985)). B-ketju-jen katalyyttinen kohta muodostuu His-, Asp- ja Ser-täh-teestä, jotka ovat t-PA:ssa asemissa 322, 371 ja 478 ja u-PA:ssa asemissa 204, 255 ja 356, ja kyseinen katalyyttinen kohta on oleellinen fibrinolyyttiselle aktiivisuudelle.

Proteiinin sisältämä osakokonaisuus on proteiinin kokonaisrakenteen sisällä oleva rakenteellinen ja/tai toiminnallinen kokonaisuus. Esimerkiksi t-PA:n A-ketjun neljä osakokonaisuutta (sormialue, kasvutekijäalue ja kaksi kringlealuetta) ovat asettuneet peräkkäin sarjaksi. Näiden osakokonaisuuksien rajat määräytyvät parhaiten vastaavassa DNA-sekvenssissä olevien eksoni-introniliitos-kohtien mukaan (L. Patthy, edellä). Käytännön syistä on kunkin osakokonaisuuden minimikooksi kuitenkin määritelty aminohapposekvenssi, joka on niiden kyseisen -osakokonaisuuden alueella olevien ensimmäisen ja-viimeisen kysteiinitähteen välissä, jotka ilmeisesti osallistuvat s-s-sillan muodostukseen. Vierekkäisiin osakokonaisuuksiin kuuluvat, näiden kysteiinitähteiden edessä ja jäljessä olevat aminohapot määritellään liitoskohtasek-vensseiksi (J). Eksoni-introniliitoskohdat asettuvat näiden J-alueiden sisälle (ks. edellä).

Näin ollen yksiketjuinen t-PA voidaan esittää seuraavan kaavan avulla

T - F- J1 - G - J2 - Κχ - J3 - K2 - J4 - TPAB

jossa T edustaa N-pään aluetta, joka kattaa aminohapot 1 - 5, F on sormialue kattaen aminohapot 6 - 43, G on kasvutekijäalue kattaen aminohapot 51 - 84, on kringle- rakenne 1 kattaen aminohapot 92 - 173, K- on kringleraken- B ^ ne 2 kattaen aminohapot 180 - 261, TPA on katalyyttinen 6 100106 seriiniproteaasialue kattaen aminohapot 307 - 527 ja (aminohapot 44 - 50), J^ (aminohapot 85 - 91), (aminohapot 174 - 179) ja (aminohapot 262 - 306) ovat liitossekvenssejä, jotka yhdistävät osakokonaisuus-alueet toisiinsa.

Yksiketjuinen u-PA voidaan esittää seuraavan kaavan avulla

Τ' -U-J5-K-Jg- UPAB

jossa Τ' edustaa N-pään aluetta, joka kattaa aminohapot 1 - 12, U on kasvutekijäalue, joka kattaa aminohapot 13 - 42, K on kringlerakenne, joka kattaa aminohapot g 50 - 131, UPA on katalyyttinen seriiniproteaasialue, joka kattaa aminohapot 189 - 411, ja Jg (aminohapot 43 - 49) ja Jg (aminohapot 132 - 188) ovat liitosseksens-sejä, jotka yhdistävät osakokonaisuuksia toisiinsa.

Liitossekvenssit ja Jg sisältävät kukin aktivoin-tikohdan (prosessointikohta) ja siitä N-päähän päin kysteiinitähteen, joka osallistuu katalyyttialueeseen (B^-ketju) liittävään rikki-rikkisiltaan.

Nyt on yllättäen havaittu, että yksiketjuisilla plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoreilla, jotka sisältävät toisen plasminogeeninaktivaattorin katalyyttisen

· B B

seriiniproteaasialueen (TPA tai UPA ) liittyneenä aminohapposekvenssiin, joka sisältää toisen plasminogeeninaktivaattorin kaikki A-ketjun osakokonaisuudet tai joitakin niistä tai joitakin erillisiä osakokonaisuuksia kummastakin plasminogeeninaktivaattorista, omaavat arvokkaita farmakologisia ominaisuuksia.

Näin ollen tässä keksinnössä kuvataan menetelmä, jonka avulla voidaan valmistaa yksiketjuista plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoria, joka koostuu aminohapposekvenssistä, joka sisältää ihmisen u-PA:n A-ketjun kaikki osakokonaisuudet tai sen erillisiä osakokonaisuuksia tai ihmisen u-PA:n ja ihmisen t-PA:n A-ketju-jen erillisiä osakokonaisuuksia, liitettynä sarjaan ii 7 100106 g ihraisen t-PA:n katalyyttisen alueen kanssa (TPA ), sekä yksiketjuista plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoria, joka koostuu aminohapposekvenssistä, joka sisältää ihmisen t-PA:n A-ketjun kaikki osakokonaisuudet tai sen erillisiä osakokonaisuuksia tai ihmisen t-PA:n ja u-PA:n A-ketjujen erillisiä osakokonaisuuksia, liitettynä sarjaan ihmisen u-PA:n katalyyttisen alueen g (UPA ) kanssa.

Edullisessa toteutustavassa sisältävät tämän keksinnön mukaiset plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorit g ihmisen u-PA:n katalyyttisen alueen (UPA ).

Erityisesti valmistetaan yksiketjuisia plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoreita, jotka koostuvat aminohapposekvenssistä, joka voidaan valita joukosta, jonka muodostavat aminohapposekvenssi, joka sisältää ihmisen t-PA:n A-ketjun kaikki osakokonaisuudet, aminohapposekvenssi, joka sisältää ihmisen t-PA:n A-ketjun erillisiä osakokonaisuuksia, kuten ihmisen t-PA:n sormialueen tai kringlealueen, erityisesti kringle 2-alueen, ja aminohapposekvenssi, joka sisältää ihmisen t-PA:n ja/tai ihmisen u-PA:n A-ketjun kaksi, kolme tai neljä osakokonaisuutta, erityisesti ihmisen t-PA:n kaksi tai kolme osakokonaisuutta tai ihmisen u-PA:n ja ihmisen t-PA:n kaksi tai kolme osakokonaisuutta, kuten ihmisen t-PA:n / sormi-, kasvutekijä- ja kringle 2-alueen, ihmisen t-PA:n sormi- ja kringle 2-alueen tai u-PA-kasvutekijäalueen ja t-PA-kringle 2-alueen, niin, että kyseinen aminohappo* sekvenssi on liitettynä sarjaan ihmisen u-PA:n katalyyttisen alueen kanssa, ja edelleen keksintö koskee yksiket-juista plasminogeenin aktivaattoria, joka koostuu aminohapposekvenssistä, joka sisältää u-PA-kasvutekijä- ja t-PA-kringle 2-alueen, niin, että kyseinen aminohappo-sekvenssi on liitettynä sarjaan ihmisen t-pA:n katalyyttisen alueen kanssa.

Mielellään plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin aminohapposekvenssi alkaa t-PA:n N-pään sekvenssistä -- (T, aminohapot 1-5) tai u-PA:n N-pään sekvenssistä 8 100106 (Τ', aminohapot 1-12) tai se alkaa millä tahansa liitossekvenssillä, joka on luonnostaan liittyneenä plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin ensimmäisen osakokonaisuuden N-päähän tai se alkaa tällaisen liitossek-venssin fragmentilla, jossa fragmenttissa on mielellään vähintään viisi aminohappotähdettä.

Keksinnönmukaisessa menetelmässä A-ketjun osakokonaisuudet liitetään toisiinsa luontaisten liitossekvenssien (esim. J^, J2, J3 ja J5), yhteenliitettyjen liitossekvenssien tai yhdis-telmäliitossekvenssien tai näiden fragmenttien välityksellä. Niinpä ensimmäinen osakokonaisuus liitetään toiseen osakokonaisuuteen liitossekvenssillä, joka esiintyy luonnostaan ensimmäisen osakokonaisuuden C-päässä, liitossekvenssillä, joka esiintyy luonnostaan toisen osakokonaisuuden N-päässä, yhteenliitetyllä liitossekvenssillä, joka koostuu mainituista liitossekvens-seistä,tai jollakin näiden fragmenttivaihtoehdolla.

Keksinnönmukaisessa menetelmässä A-ketjun osakokonaisuudet liitetään B-ketjun

B B

seriiniproteaasialueeseen (TPA tai UPA ) liitossekvenssillä, joka voidaan valita joukosta, jonka muodostavat liitossekvenssi J^, joka kytkee A-ketjun B-ketjuun ihmisen t-PA:ssa, liitossekvenssi Jg, joka kytkee A-ketjun B-ketjuun ihmisen u-PA:ssa,ja yhdistelmäsekvenssi, joka koostuu mainittujen liitossekvenssien osista, niin, että mainittu liitossekvenssi sisältää prosessointikohdan, jonka plasmiini kykenee katkaisemaan, ja prosessoin-tikohdasta N-päähän päin kysteiinitähteen, joka voi osallistua katalyyttiseen B-ketjualueeseen sitovaan rikki-rikkisiltaan, ja liitossekvenssissä on mielellään « vähintään 40 ja korkeintaan 60 aminohappotähdettä.

Etusijalle asetetaan osakokonaisuuksien liittyminen toisiinsa asemissa, jotka määräytyvät vastaavan DNA:n eksoni-introniliitoskohtien mukaan. A-ketjun liitos B-ketjuun sijaitsee mieluimmin aktivointikohdassa.

il 100106

Voidaan esimerkiksi valmistaa yksiket juista plasmino-geenin yhdistelmäaktivaattoria, joka aktivaattori sisältää u-PA:n A-ketjun tai A-ketjun, joka oleellisesti ottaen koostuu u-PA-kasvutekijäalueesta ja t-PA-kringle 2-alueesta, liittyneenä sarjassa t-PA:n katalyyttiseen alueeseen (B-ketjuun), tai joka aktivaattori sisältää t-PA:n A-ketjun, A-ketjun, joka oleellisesti ottaen koostuu t-PA:n sormialueesta, A-ketjun, joka oleellisesti ottaen koostuu u-PA-kasvutekijäalueesta ja t-PA-kringle 2-alueesta, A-ketjun, joka olleellisesti ottaen koostuu t-PA-sormialueesta ja -kringle 2-alueesta, tai A-ketjun, joka oleellisesti ottaen koostuu t-PA-sormialueesta, -kasvutekijäalueesta ja -kringle 2-alueesta, niin, että mainittu A-ketju on liittyneenä sarjassa u-PA:n katalyyttiseen alueeseen, ja A-ketju on liittyneenä B-ketjuun liitossekvenssillä, joka sisältää aktivointikohdan ja kysteiinitähteen, joka kykenee muodostamaan B-ketjuun yhdistävän rikki-rikkisillan.

Erityisesti keksintö koskee vastaavasti yksiket-juista plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoria, joka sisältää A-ketjun, joka oleellisesti ottaen koostuu t-PA-kringle 2-alueesta, liitettynä u-PA:n katalyyttiseen alueeseen (B-ketju) aktivoitunis.kohdan kohdasta.

Erityisen edullinen yksiketjuinen plasminogeenin yhdietelmäaktivaattori on sellainen, joka sisältää A-ketjun, joka oleellisesti ottaen koostuu t-PA-kringle 2-alueesta tai t-PA-sormialueesta ja t-PA-kringle 2-alueesta, liittyneenä sarjaan u-PA:n katalyyttisen alueen (B-ketju) kanssa niin, että A-ketjun osakokonaisuuden (osakokonaisuuksien) ja B-ketjun välinen liitos on aktivoin-tikohdassa.

Keksinnönmukaisesti valmistetaan erityisesti seu-raavia plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoreita 10 100106 UPAATPAB(BC) - (uPA(l-158)-tPA(276-527)], UPA^TPAB(BR) - (uPA(l-131)-tPA(263-527)], TPAAUPAB(BC) - [tPA(l-275)-uPA(159-411) ] , TPAAUPAB(BR) - [tPA(1-262)-uPA(132-411)] , UKzUPAB(BR) * [uPA(l-44)-tPA(176-261)-uPA(134-411)), FUPAB(BC) * [tPA(l-49)-tPA(262-275)-uPA(159-411) ], FUPAB(BR) - [tPA(1-49)-uPA(l34-411)], FK2UPAB(BC) - (tPA(l-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411)], FK2UPAB(BR) - [tPA(l-49)-tPA(176-262)-uPA(132-411)], UK2TPA(BC) - [uPA(l-44)-tPA(176-527)], K2UPAB(BC) - (tPA(l-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411)], FGK2UPA®(BC) - {tPA(l-86)-tPA(176-275)-uPA(l59-411)] ja FGK2UPAB(BR) - {tPA(l-86)-tPA(176-262)-uPA(132-411)J,

• . A A

joissa UPA on u-PA:n A-xetju, TPA on t-PA:n A-ketju,

B B

UPA on u-PA:n B-ketju, TPA on t-PA:n B-ketju, U tarkoittaa u-PA:n kasvutekijäaluetta, Kj tarkoittaa t-PA:n kringle 2-aluetta, F tarkoittaa t-PA:n sormialuetta, G tarkoittaa t-PA:n kasvutekijäaluetta, (BC) tarkoittaa A-ketjun osakokonaisuuden(osakokonaisuuksien) ja B-ket-jun välistä liitosta aktivointikohdassa ja (BR) tarkoittaa sitä, että A-ketjun osakokonaisuus(osakokonaisuudet) on(ovat) liittynyt(liittyneet) B-ketjuun liitossekvens-sillä, joka on luonnostaan liittyneenä B-ketjuun niin, että mukana ovat aktivointikohta ja siitä N-päähän päin kysteiinitähde, joka osallistuu B-ketjuun sitovaan rikki-rikkisiltaan. Numerot viittaavat aminohapposekvenssei-hin, jotka on otettu u-PA:sta ja t-PA:sta vastaavasti. Esimerkiksi URKUPA®(BR) = /uPA(1-44)-tPA( 176-261)-uPA-(134-411 )J tarkoittaa yksiketjuista plasminogeenin yhdis- 11 11 100106 telmäaktivaattoria, joka koostuu u-PA:n aminohapoista 1- 44 (kasvutekijäalue, U) ja t-PA:n aminohapoista 176- 261 (kringle 2-alue, K-) liitettyinä lineaarisella ta-

^ B

valla u-PA:n aminohappoihin 134-411 (B-ketju, UPA ).

Erityisen edullisia, ja siten patenttivaatimusten kohteena ovat plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorit FGK2UPAB(BC), FK2UPAB(BC) ja K2UPAB(BC).

Keksinnönmukaisista plasminogeenin yhdistelmäaktivaat-toreista voidaan muodostaa mutantteja, joissa vähintään yksi, mielellään kaikki, N-glykosyloitumiskohdat on muunnettu siten, ettei glykosyloitumista voi tässä (näissä) kohdassa (kohdissa^ tapahtua.

Tiedetään hyvin, että ehto nisäkässoluissa tapahtuvalle N-glykosyloitumisel]eon tripeptidisekvenssin -Asn-L-Ser(tai Thrh esiintyminen, jossa Asn on vastaanottaja ja L voi olla mikä tahansa geneettisesti koodite-tu ista 20 aminohaposta paitsi proliini tai asparagiini-happo, jotka estävät glykosyloitumisen. t-PA-molekyyIissä on kolme sopivaa kohtaa N-glykosidisidoksen muodostumiselle (numerot viittaavat Asn:n asemaan t-PA:n aminohapposekvenssissä, ks. kuva 1 liitteenä olevissa piirrok-117 sissa): -Asn -Ser-Ser- (läsnä kringle 1-alueessa), 184 448

Asn -Gly-Ser- (läsnä kringle 2-alueessa) ja Asn -Arg-

Thr- (läsnä t-PA:n B-ketjussa). u-PA:n ainut N-glykosy- *: 302 loitumiskohta on B-ketjussa (Asn -Ser-Thr, ks, kuva 3). On selvää, että plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorit, joissa on t-PA:n kringle 1-alue, t-PA:n kringle 2- alue, t-PA:n B-ketju ja/tai u-PA:n B-ketju, sisältävät myös vastaavat N-glykosyloitumiskohdat.

Jotta voitaisiin estää glykosyloituminen (yhdessä tai useammissa ) N-glykosyloitumiskohdissa, pitää ne tri-peptidisekvenssit, jotka tulevat tunnistetuiksi N-gly-kosyloitumissignaaleina, muuttaa. Asn- ja/tai Ser-(tai Thr-)tähteen korvaaminen edellä mainituissa tripep-tidisekvensseissä millä tahansa muulla aminohapolla poistaa glyskosidisidosten muodostumisen näissä kohdissa.

12 100106

Mukavuussyistä ei N-glykosyloituraiskohtien muuntamista tehdä proteiinitasolla. Sen sijaan on edullista muuntaa plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoria koodittava geeni siten, että mainitun muunnetun geenin ilmentyessä isännässä valmistuu plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin mutanttia, jossa yksi tai useampi N-glykosyloitumiskohta on muuttunut siten, että glykosyloituminen ei voi tapahtua siinä tai niissä. On edullista muuntaa kaikki keksin-nönmukaisissa plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoreissa esiintyvät N-glykosyloitumiskohdat.

Erityisesti asparagiini korvataan valiinilla, leusiinilla, isoleusiinilla, alaniinilla tai varsinkin glutamiinilla ja seriini tai treoniini korvataan valiinilla, metioniinilla tai varsinkin alaniinilla.

Erityisesti voidaan mainita seuraavat muunnetut plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorit FUPAB(Gln302)(BC) · [tPA(l-49)-tPA(262-275)-uPA(159-301,

Gin, 303-411)], FK2(Alal86)UPAB(Gln302)(BC) - [tPA(l-49)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411)], UK2(Alal86)TPAB(Ala450)(BC) - [uPA(l-44)-tPA(176-185, Ala, 187-449, Ala, 451-527)], K2(Alal86)UPAB(Gln302)(BC) - [tPA(l-3)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411)], FGK2(Alal86)UPAB(Gln302)(BC) - [tPA(l-86)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411)], ja lisäksi FK2UPAB(Gln302)(BC) - (tPA(l-49)-tPA(176-275)-uPA(l59-301, Gin, 303-411)], K2UPAB(Gln302)(BC) - [tPA(l-3)-tPA(176-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411)], UK2TPAB(Ala450)(BC) - [uPA(l-44)-tPA(176-449, Ala, 451-527)], ja FGK2UPAB(Gln302)(BC) - [tPA(l-86)-tPA(176-275)-uPA(l59-301, Gin, 303-411)].

tl is 100106

Keksinnönmukaisia plasminogeenin yhdistelmäaktivaat-toreita ja niiden mutantteja voidaan valmistaa yhdistelmä-DNA-tekniikalla siten, että esimerkiksi viljellään transformoitunutta isäntää, joka ilmentää plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoriproteiinia tai sen mutanttia, olosuhteissa, jotka sallivat näiden ilmentymisen ja eristetään plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoriproteiini tai sen mutanttiproteiini vastaavasti. Tarkemmin sanottuna haluttuja yhdisteitä valmistetaan siten, että a) valmistetaan DNA, joka koodittaa plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoriproteiinia tai sen mutanttia, tai syntetisoidaan tällainen DNA, b) sisällytetään kyseinen DNA sopivaan iImentämisvektoriin, cj siirretään saatu yhdistelmävektori vastaanottaja-isäntään, d) valitaan transformoitunut isäntä transformoitumatto-mien isäntien joukosta esimerkiksi viljelemällä olosuhteissa, joissa vain transformoituneet isännät pysyvät hengissä, e) viljellään transformoitunutta isäntää olosuhteissa, jotka sallivat plasminogeenin yhdistelmäproteiinin ilmentymisen, ja f) eristetään plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoripro-teiini tai sen mutantti.

Seuraavassa selostetaan yksityiskohtaisemmin niitä vaiheita, joiden avulla plasminogeenin yhdistelmäaktivaat-toriproteiinien valmistus tapahtuu yhdistelmä-DNA-tekniik-4 kaa käyttäen.

Plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoriproteiineja koodattavat DNA-sekvenssit

Esillä olevassa keksinnössä kuvataan DNA-sekvenssejä, joiden sisältämä sekvenssi koodittaa plasminogeenin 14 100106 yhdistelmäaktivaattoria, joka koostuu vähintään kahdesta alasekvenssistä, jotka aminohappojensa identtisyyden ja lukumäärän puolesta vastaavat ihmisen u-PA:n ja ihmisen t-PA:n alasekvenssejä, ja lisäksi kuvataan plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin mutantteja koodittavia DNA-sek-venssejä. Erityisesti keksintö koskee DNA-sekvenssejä, joiden sisältämä DNA-sekvenssi koodittaa patenttivaatimuksessa 3 mainittuja plasminogeenin yhdistelmäaktivaat-toriproteiinej a.

Keksinnönmukaisissa DNA-sekvensseissä on mielellään päissä reunasekvenssi. Nämä reunasekvenssit sisältävät erityisesti sopivia katkaisukohtia, jotka mahdollistavat DNA-sekvenssin sijoittamisen sopiviin vektorei-hin.

Edelleen keksinnönmukaiset DNA-sekvenssit sisältävät u-PA:n tai t-PA:n signaalisekvenssin liittyneenä kypsää plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoria koodittavan sekvenssin ensimmäiseen kodoniin. Hiivasoluissa ilmennettäessä voivat keksinnönmukaiset DNA-sekvenssit sisältää vaihtoehtoisesti hiivan signaalisekvenssin, joka on käytettyyn hiivan promoottoriin, erityisesti PH05:een, luontaisesti liittyvä signaalisekvenssi, tai hiivan invertaasin signaalisekvenssin.

DNA:n alasekvenssien nukleotidijärjestykset ovat mielellään identtiset u-PA-cDNA:n ja t-PA-cDNA:n vastaavien nukleotidijärjestysten kanssa. Geneettisen koodin degeneroitumisesta johtuen voivat nukleotidijärjestykset olla erilaisia kuitenkin edellyttäen, että niistä syntyvät aminohappojen muodostamat alasekvenssit pysyvät muuttumattomina. DNA-sekvensseissä, jotka koodittavat plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorimutantteja, on vähintään yksi mutatoidun plasminogeenin yhdistelmä-. aktivaattorin N-glykosyloitumiskohtaa koodittavista kodoneista korvattu toisella, eri aminohappoa kooditta-valla kodonilla, joka poistaa N-glykosyloitumisen tunnis-tuskohdan.

ti.

15 100106 u-PA:n cDNA ja t-PA:n cDNA tunnetaan ennestään (ks. W.E. Holmes et al.. Biotechnology 2/ 923 - 929 (1985); D. Pennica et al., Nature 301, 214 - 221 (1983)). Lisäksi tunnetaan perimän u-PA-geenin ja perimän t-PA-geenin täydelliset nukleotidijärjestykset kaikki introni t ja eksonit mukaanlukien (ks. A. Riccio et al.,

Nucl. Acids Res. 12, 2759 - 2771 (1985); S.J. Friezner-Degen et al., J. Biol. Chem. 261, 6972 - 6985 (1986)).

Koska u-PA:n ja t-PA:n cDNA ja perimän DNA-sek-venssi tiedetään, voidaan keksinnönmukaiset DNA-sek-venssit valmistaa alalla tunnetuilla menetelmillä. Näiden DNA-sekvenssien valmistusmenetelmät sisältävät DNA:n kemiallisen syntetisoinnin tai sellaisten fragmenttien valmistamisen, jotka koodittavat u-PA:n cDNA:n ja t-PA:n cDNA:n polynukleotidien alasekvenssejä, ja näiden liittämisen yhteen ennalta määrättyyn järjestykseen ja menetelmä saattaa sisältää yhden tai useampia, kuten kaksi tai neljä, mutatointivaihetta.

Keksinnönmukaisia plasminogeenin yhdistelmä-aktivaattoreita koodittavien DNA-sekvenssien mutantteja voidaan valmistaa alalla tunnetuilla menetelmillä.

Näiden DNA-sekvenssien valmistusmenetelmissä voidaan mm. leikata plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin kantageenistä pois DNA-pätkä, joka sisältää ei-toivottua aminohappoa koodittavan kodonin, ja korvata se DNA-jaksol-la, jossa mainittu kodoni on korvattu haluttua aminohappoa koodittavalla deoksiribonukleotiditripletillä, tai deoksiribonukleotidien korvautuminen toisilla voidaan saada aikaan paikkaan kohdistetulla mutatoinnilla.

DNA:n kemiallinen syntetisointi tunnetaan alalla hyvin ja siinä käytetään tavanomaisia menetelmiä. Sopivista menetelmistä on esitetty katsaus julkaisussa S.A. Narang, Tetrahedron 21./ 3 (1983). Erityisesti voidaan käyttää eurooppalaisessa patenttihakemusjulkaisussa no. 146 785 kuvattuja menetelmiä ja tämä julkaisu liitetään tähän viitteeksi.

16 100106

Vielä eräässä tämän keksinnön mukaisten DNA-sek-venssien syntetisointitavassa leikataan irti sopivia restriktiofragmentteja, jotka koodittavan u-PA:n ja t-PA:n polynukleotidisekvenssejä, u-PA:n cDNA:sta ja t-PA:n cDNA:sta (tai perimän u-PA-DNA:sta tai t-PA-DNA: sta) ja näistä fragmenteista valmistetaan täydellinen plasminogeenin yhdistelmäaktivattorin rakennegeeni. Voidaan soveltaa kahta toimintatapaa. Kumpaa toimintatapaa sitten käytetäänkin, pitää huolehtia siitä, että fragmenttien yhteenliittyminen tapahtuu osakokonaisuuksien väleissä olevissa kohdissa, jotta osakokonaisuudet säilyvät ehjinä. Ensimmäisessä toimintatavassa käytetään hyväksi restriktiokohtia. Kun sopiva restriktiokohta on tarjolla ennalta määrätyssä (määrätyissä) liitoskohdassa ( liitoskohdissa) sekä u-PA:n että t-PA:n DNA-sek-venssissä, DNA-sekvenssit katkaistaan vastaavalla restrik-tioendonukleaasilla ja fragmentit liitetään yhteen tasaisten päiden yhteenliittämisellä tai epätasaisten päiden yhteenliittämisellä (riippuen valitusta restriktio-endonukleaaasista). Vaihtoehtoisesti voidaan käyttökelpoiset restriktiokohdat saada aikaan esimerkiksi paikkaan kohdistetulle mutatoinnilla (ks. M.J. Zoller et ai., Methods Enzymol 100. 468 (1983)) pitäen samalla huolta siitä, ettei DNA:n mutatoituminen johda muuttuneeseen aminohapposekvenssiin. Erityisen edullisia luontaisia tai keinotekoisesti aikaansaatuja restriktiokohtia ovat sellaiset, jotka erottavat toisistaan A-ketjua ja B-ketjua koodittavan DNA-jakson tai DNA-jaksoja, jotka koodittavat A-ketjujen sisältämiä erillisiä osakokonaisuuksia. Tällä tavalla voidaan valmistaa yhdistelmä-DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoreita, joissa on haluttu liitoskohta A-ketjun osakokonaisuuksien ja katalyyttisen seriiniproteaasialueen välissä. Toinen toimintatapa lähtee liikkeelle siitä olettamuksesta, että osakokonaisuuksien rajat määräytyvät parhaiten perimä-DNA:ssa il 17 100106 sijaitsevien eksonien ja intronien välisten liitoskohtien perusteella (ks. L. Patthy, Cell 41, 657 - 663 (1985)), eli niiden cDNA:n kohtien mukaan, joista intronit on silmukoitu. Koska nämä kohdat harvoin sattuvat yhteen restriktiokohtien kanssa, on otettu käyttöön toimintatapa, jota voidaan noudattaa minkä tahansa uuden rakenteen aikaansaamisessa. Tällöin ensimmäisessä vaiheessa sopivat restriktiofragmentit, jotka koodattavat tiettyä(tiettyjä) aluetta(alueita), mutta sisältävät myös lisä-DNA-sekvenssejä, jotka ulottuvat odotetun yhteenliittämiskohdan yli (jopa useilla sadoilla emäs-pareilla), liitetään bakteriofagiin ml3 ja alakloonataan siinä. Toisessa vaiheessa ylimääräiset DNA-sekvenssit katkaistaan lenkkeinä käyttämällä in vitro-mutatointia (Zoller et ai., supra). Tämä menettelytapa mahdollistaa tarkat yhteenliittämiset oikeaan lukuvaiheistukseen minkä tahansa nukleotidiaseman kohdalla, josta syystä tämä menettelytapa asetetaan etusijalle.

Mutatoitujen plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorien valmistusta varten voidaan osan leikkaaminen irti kypsästä yhdistelmä-DNA:sta suorittaa restriktioentsyymiä käyttämällä. Edellytyksenä tälle menetelmälle on sopivien restriktiokohtien tarjollaolo muunnettavan kodonin läheisyydessä. Pieni restriktiofragmentti, joka sisältää ei-toivotun aminohapon kodonin, poistetaan endonukleaa-sikatkaisulla. Esimerkiksi kemiallisella synteesillä valmistetaan vastaava kaksisäikeinen DNA-sekvenssi, johon sisällytetään haluttua aminohappoa koodittava tripletti. Kun saatu DNA-fragmentti liitetään oikean-suuntaisesti jäljelle jääneeseen suureen fragmenttiin, saadaan mutatoitua plasminogeenin yhdsitelmäaktivaattoria koodittava kaksisäikeinen DNA-sekvenssi. Mukavuussyistä ja jotta yhdistelmägeeniä olisi helpompi käsitellä, sen on edullista sijaita suuremmassa DNA-jaksossa, joka on varustettu sopivilla kytkijöillä, jotta jakso voidaan sijoittaa kloonausvektoriin ja kloonata siinä.

18 100106

Esillä olevan keksinnön edullisessa toteutustavassa suoritetaan mutatoitua plasminogeenin yhdistelmäakti-vaattoria koodittavan DNA-sekvenssin valmistus paikkaan kohdistetulla mutatoinnilla. Tämä menetelmä on in vitro-mutatointimenetelmä, jolla määrätty kohta kloonatun DNA:n alueen sisältä voidaan muuntaa (ks. seuraavia katsausartikkeleita: M.J. Zoller ja M. Smith, Methods

Enzymol. 100, 468 (1983); D. Botstein ja D. Shortle,

Science 229, 1193 (1985)). Mutatointi voidaan suorittaa joko täydelliseen plasminogeenin yhdistelmäaktivaattori-geeniin tai sen funtionaalisiin osiin, jotka sisältävät ei-toivotun(ei-toivottujen ) aminohapon(aminohappojen) kodonin(kodonit). Mutatoinnin jälkeen liitetään mutatoi-tunut funtionaalinen osa muihin plasminogeenin yhdistelmä-aktivaattorin osiin niin, että tuloksena on mutatoitu plasminogeenin yhdistelmäaktivaattori.

Menetelmälle, jolla mutatoidaan plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorigeeni tai sen funktionaalinen osa, on tunnusomaista se, että yksisäikeinen geeni tai sen osa hybridisoidaan oligodeoksiribonukleotidialukkee-seen, joka on komplementaarinen yhdistelmägeenin muta-toitavan alueen kanssa lukuunottamatta epäparia(epäpareja), joka(jotka) ohjaa(ohjaavat) mutatoitumista, hybridisoitu-nutta oligodeoksiribonukleotidia käytetään alukkeena aloittamaan komplementaarisen DNA-säikeen synteesi ja saadulla (osittain) kaksisäikeisellä DNA:11a transformoidaan vastaanottajamikro-organismikanta, mikro-orga-nismikantaa viljellään ja DNA:n sisältäviä transformant-teja viljellään ja ne transformantit, jotka sisältävät DNA:ta, jossa on muunnetun (mutatoidun) plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin geeni, valitaan.

Yhdistelmävektorit, jotka sisältävät plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin DNA-sekvenssin

Keksintö koskee yhdistelmävektoreita, jotka sisältä- il 19 100106 vät plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoria koodittavan DNA-sekvenssin, joka koostuu vähintään kahdesta alasek-venssistä, jotka vastaavat aminohappojensa identtisyyden ja lukumäärän puolesta ihmisen u-PA:n ja ihmisen t-PA:n alasekvenssejä, tai ne sisältävät plasminogeenin yhdis-telmäaktivaattorin mutanttia koodittavan DNA-sekvenssin, ja lisäksi keksintö koskee tällaisten yhdistelmävektorien valmistusta.

Vektori valitaan sen mukaan, mitä isäntäsoluja on tarkoitus käyttää transformoinnissa. Periaatteessa kaikki vektorit, jotka replikoituvat valitussa, isännässä ja tuottavat keksinnönmukaista haluttua polypepti-diä siinä, ovat sopivia. Esimerkkejä sopivista isännistä ovat eukaryootit, joista restriktioentsyymit tai muuntavat enstyymit puuttuvat, tai joissa niitä on vain vähän, kuten hiivat, esimerkiksi Saccharomyces cerevisiae-kannat, joita mainittakoon S. cerevisiae GRF18, ja nisä-kässolut, erityisesti vakiintuneet ihmisen tai eläimen solulinjat, joista mainittakoon myeloomasolut, ihmisen alkion keuhkojen fibroblastii L-132, COS-solut, LTK-solut, SV-40-viruksella transformoituneet Afrikan vihreän apinan solut eli COS-7-solut ja kiinalaisen hamsterin munasarjasolut eli CHO-solut. Etusijalle asetettavia isäntäsoluja ovat edellä mainitut nisäkässolut ja Saccha-• romyces cerevisiae-kannat, esimerkiksi S. cerevisiae GRF18.

a. Hiivoissa käytettäviksi sopivat vektorit

Hiivoissa replikoitumiseen ja ilmentämiseen sopivat vektorit sisältävät replikoitumisen aloituskohdan hiivaa varten sekä geneettisen valintamerkin hiivaa varten. Yhdistelmävektorit, jotka sisältävät hiivan replikoitumisen aloituskohdan, esimerkiksi kromosomaalisen autonomisesti replikoituvan segmentin (ars), pysyvät yllä kromosominulkopuolisesti hiivasolun sisällä transfor-moinnin jälkeen ja replikoituvat autonomisesti. Li- 20 100106 saksi voidaan käyttää vektoreita, jotka sisältävät hiivan 2^u-plasmidi-DNA:lie homologisia sekvenssejä.

Tällaiset yhdistelmävektorit integroituvat uudelleenryh-mityksen avulla solun sisällä jo ennestään oleviin 2μ-plasmideihin tai replikoituvat autonomisesti. 2ji-sekvens-sit ovat erityisen sopivia suuren transformointifrek-venssin omaaviin plasmideihin ja sallivat suuret kopio-määrät.

Sopivia merkkigeenejä hiivoille ovat erityisesti sellaiset, jotka antavat isännälle antibioottiresistenssin, tai auksotrofisten hiivamutanttien ollessa kyseessä geenit, jotka täydentävät isännän puutteita. Tällaiset geenit antavat esimerkiksi vastustuskyvyn G418-antibioo-tin suhteen tai prototrofian auksotrofiselle hiivamutan-tille, kuten esimerkiksi URA3-, LEU2-, HIS3- tai TRP1-geenin. Hiivojen yhdistelmävektorit sisältävät mielellään lisäksi replikoitumisen aloituskohdan ja merkkigee-nin bakteeri-isäntää, erityisesti E. colia, varten, jotta yhdistelmävektorien ja niiden välituotteiden rakentaminen voi tapahtua bakteeri-isännässä.

Ilmentämisenohjaussekvenssejä, jotka soveltuvat hiivassa ilmentämiseen, ovat esimerkiksi sellaiset, jotka kuuluvat hyvin ilmentyville hiivageeneille. Näin ollen voidaan käyttää TRP1-geenin, ADHI- tai ADHII-geenin, * happofosfataasigeenien (PH03 tai PH05) tai isosytokromi- geenin promoottoria tai glykolyysigeenien promoottoreita, kuten enolaasi-, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaa-si- (GAPDH), 3-fosfoglyseraattikinaasi- (PGK), heksokinaasir, puryvaattidekarboksylaasi-, fosfofruktokinaasi-, glukoosi-6-fos-faatti-isomeraasi-, 3-fosfoglyseraattimutaasi-, pyruvaat-tikinaasi-, trioosifosfaatti-isomeraasi-, fosfoglukoosi-isomeraasi-, invertaasi- tai glukokinaasigeenin promoottoria. Tämän keksinnön mukaiset edulliset vektorit sisältävät promoottorin, jonka aikaansaamaa transkriptiota voidaan ohjata, esimerkiksi PH05- tai ADHII-geenin promoottorin, jolloin promoottori voidaan kytkeä päälle 21 100106 ja pois päältä kasvuolosuhteita muuttamalla. Esimerkiksi PHOS-promoottori voidaan kytkeä pois päältä ja päälle vain lisäämällä tai vähentämällä kasvualustan epäorgaanisen fosfaatin konsentraatiota.

Keksinnönmukaiset hiivan yhdistelmävektorit sisältävät mielellään myös hiivageenin 3’-reunasekvenssin, jossa on tarvittavat signaalit transkription lopettamiselle ja polyadenyloinnille. Sopivia 3'-reunasekvenssejä ovat esimerkiksi käytettyyn promoottoriin luontaisesti liittyvät, kuten hiivan PH05-geenin 3'-reunasekvenssi.

b. Nisäkässoluissa käytettävät vektorit

Nisäkässoluissa tapahtuvaan replikoitumiseen ja ilmentämiseen sopivissa vektoreissa on usein virus-DNArta, joka on peräisin esimerkiksi simian virus 40:stä (SV 40), Rous-sarkoomaviruksesta (RSV), adenovirus 2:sta, naudan papilloomaviruksesta (BPV), papovaviruksen BK-mu-tantista (BKV) tai hiiren tai ihmisen sytomegaloviruk-sesta (MCMV ja HCMV vastaavasti).

Ilmentämisenohjaussekvenssejä, jotka sopivat käytettäviksi nisäkässoluissa, ovat SV40:n aikainen ja myöhäinen promoottori, adenoviruksen myöhäinen pääpromoottori, hiiren metallotioneiinigeenin promoottori ja hiiren tai ihmisen sytomegaloviruksen välittömän aikaisen pää-geenin tehostaja-promoottorialue, ihmisen immunoglobu-liinin tehostaja-promoottorialue, ihmisen «-globiinin promottori mahdollisesti SV40-tehostajaan liittyneenä ja lämpöshokkigeeneistä johdetut promoottorit.

Sopivia merkkigeenejä nisäkässoluissa käytettäviksi ovat esimerkiksi transposoni-Tn5:n neo- ja ble-geeni, jotka antavat vastustuskyvyn G418-antibioottia ja bleo-mysiinityyppisiä antibiootteja vastaan vastaavasti, E. colin hygromysiini-B-resistenssigeeni, nisäkässolujen tai E. colin dihydrofolaattireduktaasigeeni (dhfr), joka muuttaa solujen DHFR~-fenotyypin DHFR+-fenotyypiksi . ja/tai antaa metotreksaattiresistenssin, tai herpes 22 100106 simplex-viruksen tymidiinikinaasigeeni, joka tekee TK -soluista fenotyyppisesti TK+-soluja.

Nisäkässolujen yhdistelmävektorit sisältävät mielellään nisäkäsgeenin luetuksi tulemattoman 3'-alueen, joka sisältää signaalit oikealle transkription lopettamiselle ja polyadenyloitumiselle, kuten esimerkiksi fi-glo-biinigeenin 3'-reuna-alueen. Polypeptidiä koodittavan alueen vieressä olevat alueet sisältävät mielellään yhden tai useampia luontaisia introneja, joiden päissä on tarvittavat silmukointisignaalit. Tällaiset lisäykset on arvioitu tarpeellisiksi, koska cDNA:t ja prokary-oottiset DNA:t, kuten edellä mainitut valintageenit, eivät yleensä sisällä tällaisia transkriptio- ja proses-sointisignaalej a.

Tällaiset vektorit sisältävät mielellään replikoitu-misen aloituskohdan ja antibioottiresistenssigeenin E. colissa tapahtuvaa lisäämistä varten. Nisäkkään replikoitumisen aloituskohta voidaan tuoda joko sisällyttämällä vektorin rakenteeseen eukaryoottinen aloituskohta, kuten SV40:stä tai muusta viruslähteestä johdettu, tai saamalla se isäntäsolun kromosomista siten, että vektori integroituu isäntäsolun kromosomiin.

Nisäkässoluissa käytettäviksi soveltuvat edulliset yhdistelmävektorit sisältävät plasminogeenin yhdistelmä-aktivaattorin tai mutatoidun plasminogeenin yhdistelmäak-tivaattorin cDNA:n sijoitettuna toiminnallisesti niin, että sen ylävirrassa on hiiren sytomegaloviruksen välittömän aikaisen päägeenin tehostaja-promoottori ja sen alavirrassa on kanin beeta-globiinigeenin 3'-pää, joka sisältää toisen intronin oikeine silmukointisignaalei-neen sekä polyadenyloitumissekvenssin. Edelleen ne sisältävät transposoni-Tn5:n tai mahdollisesti transpo-soni-Tn9:n neomysiiniresistenssigeenin koodittavat sekvenssit tai hygromysiinifosfotransferaasia koodittavat sekvenssit, joiden vieressä on ylävirran puolella peräjälkeen SV40-viruksen aikainen promoottori, joka sisäl- li 23 1 00 1 06 tää myös SV40:n replikoitumisen aloituskohdan, ja Tn5-neo-geenin luontainen promoottori, ja alavirran puolella SV40:n aikaisen geenin segmentti, joka sisältää pienen t-antigeenin silmukoitumissignaalit ja polyadenyloi-tumissignaalit. Koko rakenne kloonataan E. coli-plasmi-din pBR322 fragmenttiin, joka sisältää plasmidin replikoitumisen aloituskohdan ja ampisilliiniresistenssigeenin, mutta josta puuttuvat ns. myrkkysekvenssit, jotka estävät SV40-laatuisen DNA:n replikoitumisen nisäkässoluissa. Haluttaessa sisällytetään vektoriin dehydrofolaattire-duktaasia (DHFR) koodittava geeni, jolloin mielellään käytetään julkaisussa R.J. Kaufman et ai.. Mol. Cell.

Biol. 2, 1304-1319 (1982) kuvattua modulaarista DHFR-gee-niä. Tämä modulaarinen DHFR-geeni koostuu peräkkäisessä järjestyksessä lueteltuna tyyppiä 2 olevan adenoviruksen myöhäisestä pääpromoottorista, immunoglobuliinigeenin fragmentista, hiiren DHFR-cDNA:n koodittavasta alueesta ja SV40:n aikaisesta polyadenyloitumiskohdasta.

Nämä uudet etusijalle asetettavat, nisäkässoluissa käytettävät yhdistelmävektorit edustavat kehitystä tunnettuun tekniikan tasoon verrattuna. Ne ovat parempia tähän mennessä tunnettuihin vektoreihin verrattuina siinä, että ne sisältävät voimakkaat ilmentämissignaa-lit kloonattua cDNA:ta varten, jotka ilmentämissignaalit 4 sijaitsevat hiiren sytomegaloviruksen välittömässä aikaisessa promoottori-tehostajassa ja beeta-globiinin silmukoitumis-polyadenyloitumissekvensseissä ympäristössä, joka sallii ilmentymisen suurina määrinä mitä erilaisimmissa nisäkässolutyypeissä. Tarkemmin sanottuna vektoreita voidaan käyttää (a) ilmentämään ohimene- ·. västi cDNA-laatuja normaaleissa kudosviljelmälinjoissa, jotka siis eivät ole SV40:llä transformoituneita, ja (b) vielä paremmin suurina kopiomäärinä kädellissoluissa, jotka ilmentävät SV40 T-antigeeniä, jolloin vektori pystyy replikoitumaan sisältämänsä SV40:n replikoitumisen aloituskohdan kautta, seka (c) ilmentämään tällaista 24 100106 kloonattua cDNA:ta stabiilisti normaaleissa kudosviljel-mäiinjoissa, joissa vektori pystyy integroitumaan isäntä-solun kromosomiin, ja (d) suuremmasta kopiomäärästä johtuen vielä paremmin silloin, kun vektori tuodaan SV40 T-antigeeniä tuottaviin kädellissolulinjoihin, joissa vektori kykenee replikoitumaan episomaalisesti.

MCMV:n tehostaja-promoottorialue kattaa esimerkiksi DNA-jakson, joka alkaa nukleotidiväliltä -835 - -443 ja loppuu nukleotidiin +50 (mRNA:n alusta laskettuna) MCMV:n välittömän aikaisen päägeenin 5'-alueessa. Etusijalle asetettava MCMV:n tehostaja-promoottorialue kattaa nukleotidit -542 - +50.

Kanin /J-globiinigeenin 3'-reuna-alue sisältää kanin beeta-globiinigeenin toisen puolikkaan (P. Dierks et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 1411-1415 (1981); A. van Ooyen et ai., Science 206, 337 - 344 (1979)), joka alkaa toisesta eksonista, mielellään BamHI-kohdasta, ja sisältää näin toisen intronin, jossa on reuna-sekvensseissä silmukoitumissignaalit, ja joka loppuu polyadenyloitumissignaalien taakse, mielellään Bglll-kohtaan, joka sijaitsee 1,2 ke:n päässä edellä mainitun BamHI-kohdan takana.

SV40:n replikoitumisenaloituskohta sisältyy esimerkiksi virus-DNA:n HindIII-SphI-fragmenttiin (nukleotidit 5171 - 128, aloituskohta = asema 1; Tooze J. (toim.), DNA Tumor Viruses, Part 2, 2. painos, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Etusijalle asetattava toteutustapa on kuitenkin Hindlll-Hpall-fragmentti (nukleotidit 5171 - 346), joka replikoituna -senaloituskohdan lisäksi sisältää viruksen varhaisen tehostaja-promoottorin, joka on hyödyllinen edistäessään vektorin valintageenin transkriptiota.

Neomysiinigeeni kloonataan kudosviljelmäsoluissa aktiivisen promoottorin taakse, joka mielellään on edellä mainitussa Hpall-Hindlll-fragmentissa sijaitseva SV40:n varhainen promoottori. Neomysiinigeenin koodittavat sek- ti 25 100106 venssit sisältyvät esimerkiksi transposoni-Tn5:n Bglll-Smal-fragmenttiin (E. Beck et ai., Gene 19, 327-336 (1982); P. Southern et ai., J. Mol. Appi. Genet. 1_, 327-341 (1982); F. Colbere-Garapin et ai., J. Mol. Biol. 150, 1-14 (1981)). On edullista varustaa neomysiinigeeni toisella promoottorilla, joka sallii transkription myös E. colissa. Esimerkiksi Tn5-neomysiinigeenin luontainen promoottori, joka sijaitsee mielellään Hindlll-Bglll-fragmentissa, voidaan sijoittaa eukaryoottisen promoottorin taakse neo-koodittavien sekvenssien eteen (Southern et ai., supra) tai edemmäs ylävirtaan eukaryoottisen promoottorin eteen (Colbere-Garapin et ai., supra). Tullakseen ilmentyneiksi kudosviljelmäsoluissa pitää bakteeriperäistä neo-geeniä seurata polyadenyloitu-missignaalin, joka mielellään SV40 t-antigeenin geenin osa ja sisältää myös silmukoitumissignaalit. Neomysii- nifosfotra ntferaasia koodittava sekvenssi, erityisesti edellä mainittu Tn5-fragmentin Bglll-Smal-osa, voidaan myös korvata hygromysiini-B-fosfotransferaasia koodattavalla sekvenssillä, joka mielellään on plasmidin pLG89 BamHI-fragmentin muodossa (L. Gritz et ai., Gene 25, 179-188 (1983)), joka voidaan helpoimmin sijoittaa plasmidiin pSVd (Luedin et ai., EMBO-J. 6, 109-114 (1987)), joka on pSV2911neo:n johdannainen, jossa Bglll-kytkijä on tuotu Smal-kohtaan vektorissa.

Vielä eräässä edullisessa valintageenissä käytetään dihydrofolaattireduktaasientsyymin koodittavaa sekvenssiä, kuten pSV2dhfr:ssä (ATCC 37145) olevaa, joka transformoituneiden solulinjojen valinnan lisäksi mahdollistaa plasmidiin liitetyn DNA-sekvenssin monistuksen usein , niin, että keksinnönmukaisten plasmidin koodittamien proteiinien tuotanto kohoaa vastaavassa suhteessa.

E. colin plasmidista pBR322 johdettu fragmentti sisältää pBR322:n replikoitumisen aloituskohdan ja ampi-silliiniresistenssigeenin. Fragmentti otetaan mielellään pBR322:n johdannaisesta, kuten pSVOd:stä (P. Mellon et. ai., Cell 2J_, 279-288 (1981)), jossa niin sanottu 26 1 00 1 06 myrkkysekvenssi, joka estäisi SV40 T-antigeenin aikaansaaman vektorin replikoitumisen, on poistettu.

Keksinnön edullinen toteutustapa koskee yhdistelmä-vektoreita, jotka kykenevät replikoitumaan eukaryoottises-sa isäntäsolussa, ja j^tka voidaan valita siinä, joka yhdistelmävektori sisältää promoottorin ja plasminogee-nin yhdistelmäaktivaattoria koodittavan DNA-sekvenssin niin, että mainittu DNA-sekvenssi on sijoitettu mainittuun yhdistelmävektoriin yhdessä transkriptionaloitus-ja lopetussignaalin ja luennanaloitus- ja lopetussignaa-lin kanssa mainitun promoottorin ohjaukseen niin, että DNA-sekvenssi ilmentyy transformoituneessa isännässä tuottaen proteiinia.

Keksinnönmukaiset yhdistelmävektorit valmistetaan tunnettuja alan menetelmiä käyttäen, esimerkiksi liittämällä yhteen promoottorin sisältävä DNA-jakso, plasmino-geenin yhdistelmäaktivaattoria koodittava alue, 3'-reuna-sekvenssi ja vektori-DNA.

DNA-jaksojen yhteenliittämiseen in vitro-olosuhteis-sa voidaan käyttää eri menetelmiä. Tasaiset päät (DNA-kahdenteet, joissa on täydelliset emäsparit), jotka on saatu aikaan tietyillä restriktioendonukleaaseilla, voidaan liittää suoraan yhteen T4 DNA-ligaasilla. Tavallisemmin DNA-jaksot liitetään yhteen yksisäikeisten kohesiivisten päidensä avulla ja suljetaan kovalentti-sesti DNA-ligaasilla, esimerkiksi T4 DNA-ligaasilla. Tällaiset yksisäikeiset "kohesiiviset päät" voidaan muodostaa katkaisemalla DNA tiettyyn ryhmään kuuluvilla endonukleaaseilla, jotka tuottavat epätasaisia päitä (DNA-kahdenteen kaksi säiettä katkeavat kohdista, jotka ovat muutaman nukleotidin päässä toisistaan). Yksi-säikeistä jaksoa voidaan myös muodostaa lisäämällä terminaalista transferaasia käyttäen nukleotideja tasaisiin päihin tai epätasaisiin painin ("homopolymeerinen hän-

II

27 100106 nitys") tai yksinkertaisesti vain nakertamalla tasapäi-sen DNA-segmentin toista säiettä sopivalla eksonukle-aasilla, kuten λ-eksonukleaasilla. Vielä eräässä epätasaisten päiden valmistusmenetelmässä liitetään tasa-päiseen DNA-jaksoon kemiallisesti syntetisoitu kytkijä-DNA, joka sisältää tunnistuskohdan epätasaisia päitä muodostavalle endonukleaasille, ja katkaistaan näin saatu DNA vastaavalla endonukleaasilla. Keksinnönmu-kaisten yhdistelmävektorien komponentit liitetään yhteen haluttuun järjestykseen, jotta voidaan taata oikea toiminta.

Isännät, jotka ovat transformoituneet plasminoqeenin yhdistelmäaktivaattorin DNA-sekvenssin sisältävällä yhdistelmävektorilla

Keksintö koskee myös eukaryoottisia isäntäorganis-meja, jotka ovat transformoituneet yhdistelmävektorilla, sisältää plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoria kooditta-van DNA-sekvenssin, joka aktivaattori koostuu vähintään kahdesta alasekvenssistä, jotka aminohappojensa identtisyyden ja lukumäärän puolesta vastaavat ihmisen u-PA:n ja ihmisen t-PA:n alasekvenssejä, ja edelleen keksintö koskee menetelmiä tällaisten isäntien valmistamiseksi.

Esimerkkejä sopivista eukaryoottisista isännistä on lueteltu edellä ja niistä mainittakoon erityisesti hiiva-ja nisäkässolut.

28 100106

Transformoituneiden eukaryoottisten isäntien valmistusmenetelmässä transformoidaan tai transfektoidaan eukaryoottinen isäntä ilmentämisvektorilla , joka sisältää keksinnönmukaisen DNA-sekvenssin ilmentämisenohjaussek-senssin säätelyn alaisuudessa.

Eukaryoottisten isäntäsolujen transformoituminen saadaan aikaan tunnetuilla alan menetelmillä. Esimerkiksi hiivan transformoituminen yhdistelmävektorilla voidaan saada aikaan julkaisussa Hinnen et ai., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 75^ 1919 (1978) kuvatulla menetelmällä. Tämä menetelmä voidaan jakaa kolmeen vaiheeseen: 1) Poistetaan hiivan solunseinä tai osia siitä.

(2) "Paljaat" hiivasolut (sferoplastit) käsitellään transformoivalla DNA:11a PEG:n (polyetyleeniglykoli) 2+ ja Ca -ionien läsnäollessa.

(3) Solunseinä regeneroidaan ja transformoituneet solut valitaan kiinteässä agarkerroksessa.

Edulliset toimintatavat: (1): Hiivan solunseinä poistetaan entsymaattisesti käyttämällä erilaisia glukosidaasivalmisteita, kuten

R R

etanan suolinesteitä (esim. Glusulase tai Helicase ) tai mikro-organismeista saatuja entsyymiseoksia (esim.

p

Zymolase ), osmoottisesti stabiloiduissa liuoksissa (esimerkiksi 1 M sorbitoli).

'. (2): Hiivan sferoplastit aggregoituvat PEG:n läsnäollessa, jolloin indusoituu sytoplasmakalvojen paikallisia yhtymisiä. Yhtymisolosuhteiden syntyminen on oleellisen tärkeätä ja monista transformoituneista hiivasoluista tulee diploidisia tai jopa triploidisia transformointiprosessin kuluessa. Voidaan käyttää toi-Y menpiteitä, jotka mahdollistavat fuusioituneiden sfero- plastien rikastumisen transformanttien suhteen, eli transformoituneet solut voidaan helposti seuloa ennalta valittujen fuusiotuotteiden perusteella.

(3): Koska solunseinättömät hiivasolut eivät jakaudu, solunseinä pitää regeneroida. Tämä regeneroin-ti on käytännöllistä suorittaa peittämällä sferoplas- 29 100106 tit agariin. Esimerkiksi sula agar (noin 50°C) ja sfe-roplastit sekoitetaan keskenään. Kun liuos jäähdytetään hiivan kasvulämpötHaan (noin 30°C), muodostuu kiinteä kerros. Tämän agarkerroksen tarkoitus on estää välttämättömien makromolekyylien nopea diffuusio ja häviäminen sferoplasteista ja näin edesauttaa solun-seinän regeneroitumista. Solunseinän regeneroituminen voidaan kuitenkin saada aikaan (vaikkakin pienemmällä teholla) maljäämällä sferoplasteja valmiiden agarker-rosten päällä.

Regenerointiagar on edullista valmistaa niin, että transformoituneiden solujen regenerointi ja valinta voidaan suorittaa samanaikaisesti. Koska valintamerkkei-nä käytetään yleensä hiivan geenejä, jotka koodittavan aminohapon biosynteettisen reitin entsyymiä (supra), on regenerointi edullista suorittaa hiivan minimiravinne-alustassa. Jos vaaditaan hyvin korkeita regeneroitumiste-hokkuuksia, on seuraava kaksivaiheinen menetelmä edullinen: (1) solunseinä regeneroidaan ravinnerikkaassa, monipuolisessa alustassa ja (2) transformoituneet solut valitaan maljaamalla solukerroksen jäljennös valinta-agar-maljoissa.

Yhdistelmävektorien vienti nisäkässoluihin suoritetaan transfektoimalla apuyhdisteiden, esimerkiksi dietyy-liaminoetyylidekstraanin, dimetyylisulfoksidin, glyserolin, polyetyleeniglykolin tms., lsänäollessa tai käyttämällä vektori-DNA:n ja kalsiumfosfaatin yhteissakkaa. Muita sopivia menetelmiä ovat vektori-DNA:n mikroinjek-tointi solun tumaan ja elektroporaatio eli DNA:n vieminen sisään lyhyttä sähköpulssia käyttämällä, joka lisää solukalvojen läpäisevyyttä. Transfektoituneiden solujen valinta voidaan tämän jälkeen suorittaa valintamerkin avulla, joka on joko kovalenttisesti integroituneena ilmentämisvektoriin tai erillisenä kokonaisuutena lisättynä. Sopivia valintamerkkejä ovat mm. geenit, jotka antavat antibioottiresistenssin tai täydentävät isäntäso-• lun geneettisiä puutteita (supra).

30 100106

Yhdessä edullisessa valintasysteemissä käytetään hyväksi soluja, joista puuttuu dihydrofolaattireduktaa-si (DHRF ), esimerkiksi CHO-soluja, jotka ehdottomasti vaativat tymidiiniä, glysiiniä ja puriineja kasvaakseen, ellei ulkoista DHFR-geeniä ole tarjolla. Kun sopiviin DHFR--soluihin, esimerkiksi CHO-soluihin, tuodaan vektori, joka sisältää plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin geenin ja lisäksi DHFR-geenin, voidaan transformoituneet solut valita lisäämällä ravinnealustan sisältämän, anti-folaattilääkkeen, metotreksaatin, konsentraatiota.

Erityisen edullinen valintamenetelmä on sellainen, jossa sopivat nisäkässolut, esimerkiksi CHO-solut, käsitellään yhteissakalla, joka sisältää vektori-DNA:n, jossa on plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin geeni ja antibioottiresistenssiä, esimerkiksi G-418-resistens-siä, koodittava geeni, ja kalsiumfosfaattia. Transformoituneet solut valitaan viljelemällä vastaavan antibiootin, esim. G-418:n, läsnäollessa ja/tai seulomalla plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin ilmentymisen suhteen.

Keksinnönmukaisten transformoituneiden isäntäorga-nismien plasminogeenin yhdistelmäaktivattorituotantoa tai mutanttiaktivaattorituotantoa voidaan parantaa muta-toinneilla ja valitsemalla alan tunnettuja menetelmiä käyttäen. Mutatoituminen voidaan saada aikaan esimerkiksi UV-säteilytyksellä tai sopivilla kemiallisilla aineilla. Erityisen edullista on proteaasivajäiden mutanttien tuottaminen ja erityisesti tällaisten hiivamutanttien tuottaminen, jotta vältytään syntyneen plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin proteolyyttiseltä hajoamiselta.

Transformoituneiden isäntäsolujen kasvattaminen

Edelleen keksintö koskee menetelmää yksiketjuisten plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorien tuottamiseksi, joiden aminohappojärjestys koostuu vähintään kahdesta alasekvenssistä, jotka aminohappojensa identtisyyden 3i 100106 ja lukumäärän puolesta vastaavat ihmisen t-PA:n ja ihmisen u-PA:n alasekvenssejä, jossa menetelmässä viljellään sopivissa ravinneolosuhteissa transformoitunutta eukary-oottista isäntää, joka sisältää mainittua plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoria koodittavan DNA-sekvenssin, ja eristetään mainittu plasminogeenin yhdistelmäaktivaatto-ri.

Transformoituneita isäntäsoluja kasvatetaan alalla tunnetuilla menetelmillä nestemäisessä alustassa, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja.

Keksinnönmukaisten transformoituneiden hiivasolujen kasvattamiseen voidaan käyttää erilaisia hiililähteitä. Esimerkkejä edullisista hiililähteistä ovat assimiloituvat hiilihydraatit, kuten glukoosi, maltoosi, mannitoli ja laktoosi, tai asetaatti, joita voidaan käyttää yksin tai sopivina seoksina. Esimerkkejä sopivista typpiläh-teistä ovat aminohapot, kuten kasaminohapot, peptidit ja proteiinit ja niiden hajoamistuotteet, kuten tryptoni, peptoni ja lihauutteet, hiivauutteet, mallasuute ja myös ammoniumsuolat, kuten esimerkiksi ammoniumkloridi, -sulfaatti tai -nitraatti, joita voidaan käyttää joko yksin tai sopivina seoksina. Epäorgaanisia suoloja, joita voidaan käyttää, ovat natriumin, kaliumin, magnesiumin ja kalsiumin sulfaatti, kloridi; fosfaatti ja karbonaatti .

Ravinnealusta sisältää lisäksi esimerkiksi kasvua edistäviä aineita, kuten hivenaineita, esimerkiksi rautaa, sinkkiä, mangaania tms., ja mielellään aineita, jotka saavat aikaan valintapaineen ja estävät sellaisten solujen kasvua, jotka ovat menettäneet ilmentämisplasmidin.

Niinpä esimerkiksi, jos isäntämikro-organismina käytetään hiivakantaa, joka on auksotrofinen esimerkiksi välttämättömän aminohapon suhteen, sisältää plasmidi mielellään 32 100106 geenin, joka koodittaa isännän puutteen täydentävää entsyymiä. Hiivakannan viljely suoritetaan minimiravinne-alustassa, josta puuttuu mainittu aminohappo.

Viljely suoritetaan alalla tunnettuja menetelmiä käyttäen. Viljelyolosuhteet, kuten lämpötila, ravinnealus-tan pH-arvo ja fermentointiaika, valitaan niin, että keksinnönmukaisille plasminogeenin aktivaattoriproteiineil-le saavutetaan mahdollisimman korkea tiitteri. Niinpä hiivakantaa viljellään mielellään aerobisissa olosuhteissa pinnanalaisviljelmänä ravistellen tai sekoittaen noin 20 - 40°C:n lämpötilassa, mielellään noin 30°C:ssa, pH:n ollessa välillä 5-8, mielellään noin 7, mielellään niin pitkään, että keksinnönmukaista proteiinia saadaan mahdollisimman paljon.

Nisäkässoluja viljellään kudosviljelmäolosuhteis-sa käyttämällä kaupallisesti saatavissa olevia ravinnealus-toita, jotka haluttaessa on täydennety kasvua edistävillä aineilla ja/tai nisäkkään seerumilla. Soluja kasvatetaan joko kiinteään kantajaan, esimerkiksi mikrokantajaan tai huokoisiin lasikuituihin, kiinnittyineinä tai vapaasti kelluvina sopivissa viljelyastioissa. Ravinnealusta valitaan niin, että muodostuu valintapaine ja vain ne solut pysyvät hengissä, jotka edelleen sisältävät yhdistelmä vektori -DNA: n, jossa on geneettinen merkki. Niinpä esimerkiksi ravinnealustaan lisätään antibioottia, jos yhdistelmävektori sisältää vastaavan antibioottiresis-tenssigeenin.

Kun solutiheys on saavuttanut riittävän arvon, kasvatus lopetetaan ja proteiini eristetään. Kun käytetään nisäkässoluja, plasminogeenin yhdistelmäaktivaattori-proteiini erittyy tavallisesti ravinnealustaan.

Tuotteen sisältävä ravinnealusta erotetaan soluista, joihin sen jälkeen voidaan tuoda tuoretta ravinnealustaa niin, että saadaan aikaan jatkuva tuotanto. Kun käytetään hiivasoluja, voi proteiini myös kertyä solujen sisään, erityisesti periplasmiseen tilaan. Viimeksimai- n 33 100106 nitussa tapauksessa on plasminogeeninaktivaattoriproteii-nin talteenoton ensimmäinen vaihe proteiinin vapauttaminen solun sisältä. Useimmissa menetelmissä solunseinä poistetaan ensin hajottamalla se entsymaattisesti gluko-sidaaseja käyttäen (supra). Vaihtoehtoisesti solunseinä poistetaan käsittelemällä kemiallisilla aineilla, so. tiolireagensseilla tai EDTA:11a, jotka saavat aikaan solunseinien vaurioitumista, mikä mahdollistaa tuotetun plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin vapautumisen. Saatu seos rikastetaan sen jälkeen plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin suhteen tavanomaisilla menetelmillä, kuten poistamalla suurin osa ei-proteiinimateriaalista polyetyleeniamiinikäsitte-lyllä, saostamalla proteiinit ammoniumsulfaatilla, suorittamalla geelielektroforeesi, dialysointi, kromatogra-fia, esimerkiksi ioninvaihtokromatografia, molekyyliko-koon perutuva ekskluusiokromatografia, HPLC tai käänteis- p faasi-HPLC, geelisuodatus sopivassa Sephadex -pylväässä, tms. Esipuhdistetun tuotteen lopullinen puhdistuminen saavutetaan esimerkiksi affiniteettikromatografiällä, joista mainittakoon vasta-aineaffiniteettikromatografia ja erityisesti affiniteettikromatografia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat anti-t-PA tai anti-u-PA, käyttäen, jotka on kiinnitetty alalla tunnetuilla menetelmillä liukenemattomaan matriisiin, tai kun kyseessä on t-PA:n katalyyttisen B-ketjun sisältävä plasminogeenin yhdistelmäaktivaattori, käyttämällä DE-3-affiniteettikromatograf iaa (DE-3 on proteaasien inhibiittori, joka on eristetty Erytrina latissimasta), tai vastaavilla menetelmillä.

Keksinnön avulla saadaan aikaan hybridoomasolulin-joja, jotka tuottavat monoklonaalisia vasta-aineita, jotka kohdistuvat t-PA:n tai u-PA:n tiettyihin osakokonaisuuksiin, ja voidaan siten tuottaa mainittuja monoklonaalisia vasta-aineita.

Jotta plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin yksiket- 100106 juisen muodon, joka on oleellisesti ottaen vapaa kaksi-ketjuisesta muodosta, valmistus olisi helpompaa, on edullista sisällyttää proteaasien inhibiittoria, kuten

D

aprotiniinia (Trasylol ) tai haiman emäksisen trypsiinin inhibiittoria, mukaan puhdistusvaiheessa inhiboimaan proteaasijäämiä, joita voi olla läsnä viljelyväliainees-sa, ja jotka voivat aiheuttaa yksiketjuisen muodon (osittaisen) muuttumisen kaksiketjuiseksi muodoksi.

Lopullinen puhdistuminen voidaan tämän jälkeen saada aikaan kromatografiapylväässä, joka sisältää valintaan tarkoitettua affiniteettireagenssia.

5. Farmaseuttiset koostumukset

Uusilla yksiketjuisilla plasminogeenin yhdistelmä-aktivaattoriproteiineilla, jotka ovat tämän keksinnön mukaisia, on arvokkaita farmakologisia ominaisuuksia. Niitä voidaan käyttää samoin kuin ennestään tunnettuja plasminogeenin aktivaattoreita haluttaessa ennalta ehkäistä tai hoitaa veritulppia tai muita tiloja, joissa halutaan saada aikaan paikallinen fibrinolyyttinen tai proteolyyttinen aktiivisuus plasmi-nogeeninaktivoitumismekanismin kautta, joista tiloista mainittakoon arterioskleroosi, sydän- ja aivoinfer ktit, laskimoveritulpat, tromboembolia, leikkauksenjälkeiset suonentukokset, tromboflebiitti ja diabeettiset vaskulo-patiat.

Nyt on yllättäen havaittu, että keksinnönmukaisis-sa uudissa plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoriproteii-neissa yhdistyvät luonnonmukaisen t-PA:n ja luonnonmukaisen u-PA:n edulliset ominaisuudet.

Näin ollen nämä uudet plasminogeenin yhdistelmäaktivaat-toriproteiinit ovat fibrinolyytti-sesti aktiivisia. Ainutlaatuiset fibriinin ohjaamat ominaisuudet, so. kyky aktivoida plasminogeeni ensisijaisesti fibriinin länäollessa, ovat säilyneet. Lisäksi uusien proteiinien stabiilisuus in vivo on pitempi kuin

VK

35 To 0106 alkuperäisen t-PA:n

Esillä olevan keksinnön avulla saadaan aikaan myös farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät terapeuttisesti tehokkaan määrän vaikuttavaa ainetta (plasminogee-nin yhdistelmäaktivaattori) sekä orgaanisia tai epäorgaanisia, kiinteitä tai nestemäisiä farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantaja-aineita, jotka soveltuvat parente-raaliseen, so. intramuskulaariseen, subkutaaniseen tai intraperitoneaaliseen, antotapaan, ja jotka eivät vuoro-vaikuta aktiivisten aineosien kanssa haitallisesti.

Sopivia ovat esimerkiksi infuusioliuokset, mielellään vesiliuokset tai suspensiot, jotka on mahdollista valmistaa välittömästi ennen käyttöä esimerkiksi lyofi-lisoiduista valmisteista, jotka sisältävät pelkkää vaikuttavaa aineosaa tai lisäksi kantaja-ainetta, kuten manni-tolia, laktoosia, glukoosia, albumiinia tms. Farmaseuttiset koostumukset steriloidaan ja haluttaessa niihin sekoitetaan apuaineita, kuten esimerkiksi säilöntäaineita, stabilointiaineita, emulgointiaineita, liuotusaineita, puskurointiaineita ja/tai osmoottoisen paineen säätöön tarkoitettuja suoloja. Sterilointi voidaan suorittaa steriloivalla suodatuksella huokoskooltaan pienten suodattimien (huokosten halkaisija 0,45 pm tai pienempi) läpi, minkä jälkeen koostumus voidaan haluttaessa lyofilisoida. Steriiliyden ylläpysymistä auttamaan voidaan myös lisätä antibiootteja.

Keksinnön avulla saatavat farmaseuttiset koostumukset jaetaan annosyksikkömuotoihin, esimerkiksi ampulleihin, jotka sisältävät 1 - 2000 mg farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta annosyksikköä kohti ja noin 1 -200 mg, mielellään noin 5 - 100 mg vaikuttavaa ainetta annosyksikköä kohti.

Riippuen sairauden laadusta ja potilaan iästä ja tilasta on noin 70 kg painavalle potilaalle annettava vuorokausiannos alueella noin 3 - 100 mg, mielellään 5 - 50 mg per 24 tuntia. Sydäninfarktitapauksessa •100106 36 on annos mielellään noin 30 - 80 mg 60 - 120 minuutin kuluessa annettuna, mielellään kolmena eränä noin 90 minuutin kuluessa. Plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin määrä voidaan antaa kokonaisuudessaan bolus-injektiona.

Keksintö tarjoaa myös menetelmän farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi siten, että keksinnönmukai-nen biologisesti aktiivinen proteiini ja farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja-aine sekoitetaan keskenään.

Näitä uusia proteiineja voidaan käyttää ihmiseen ennaltaehkäisevässä ja terapeuttisessa tarkoituksessa.

Keksintö koskee erityisesti DNA-sekvenssejä, yhdistelmä vektoreita, transformoituneita isäntäkantoja ja plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoriproteiineja ja näiden valmistusmenetelmiä, kuten esimerkeissä on selostettu.

Piirrosten lyhyt selostus

Seuraavassa kokeellisessa osassa selostetaan esillä olevan keksinnön eri toteutustapoja liitteenä olevien piirrosten avulla, jotka ovat seuraavat.

Kuvat 1 ja 3 esittävät ihmisen t-PA:n cDNA:n ja ihmisen u-PA:n cDNA:n nukleotidisekvenssiä ja siitä pääteltyä aminohappojärjestystä vastaavasti. Kypsien proteiinien ensimmäinen aminohappo on alleviivattu.

Kuvat 2 ja 4 esittävät ihmisen t-PA:n cDNA:n ja ihmisen u-PA:n cDNA:n restriktioendonukleaasikarttaa vastaavasti.

Kuva 5 on kaavioesitys plasmidin pEcoO.474ScaI rakentamisesta.

Kuva 6 on kaavioesitys plasmidin ph.tPAAScal rakentamisesta, joka plasmidi sisältää mutatoidun t-PA:n cDNA:n.

Kuva 7 on kaavioesitys plasmidin pUNC.tc rakenta- 37 1 00 1 06 misesta, joka plasmidi sisältää cDNA-liitannäisen, joka koostuu u-PA:n A-ketjun osakokonaisuuksista ja t-PA:n B-ketjusta.

Kuva 8 on kaavioesitys plasmidin ptNC-UC rakentamisesta, joka plasmidi sisältää cDNA-liitännäisen, joka koostuu t-PA:n A-ketjun osakokonaisuuksista ja u-PA:n B-ketjusta.

Kuva 9 on kaavioesitys plasmidin pD02 rakentamisesta .

Kuva 10 on kaavioesitys plasmidin pDOlO rakentamisesta, joka sisältää t-PA:n cDNA:n yhdistettynä beeta-globiinifragmenttiin.

Kuva 11 on kaavioesitys plasmidin pCGA26 rakentamisesta, joka sisältää t-PA:n cDNA:n MCMV IE-promoottorin ohjauksessa sekä beetaglobiinifragmentin.

Kuva 12 on kaavioesitys t-PA:nilmentämisplasmidin pCGA28 ja universaali-ilmentämisplasmidin pCGA44 rakentamisesta, jotka molemmat plasmidit sisältävät neomysiini-resistenssigeenin.

Kuva 13 kaavioesitys t-PA:nilmentämisplasmidin pCGA42 ja universaali-ilmentämisplasmidin pCGA42d rakentamisesta, jotka kumpikin sisältävät hygromysiiniresis-tenssigeenin.

Kuva 14 on kaavioesitys t-PA:nilmentämisplasmidin pCGA48 rakentamisesta, joka sisältää neomysiiniresistens-sigeenin ja DHFR-geenin.

Kuva 15 on kaavioesitys ilmentämisplasmidin pBRla rakentamisesta, joka sisältää plasmidin ph.tPAAScal mutatoidun t-PA-cDNA-liitännnäisen.

Kuva 16 on kaavioesitys ilmentämisplasmidin pBR2a rakentamisesta, joka sisältää plasminogeenin yhdistelmä-akti vaattorin cDNA-liitännäisen, joka koostuu u-PA:n A-ketjun osakokonaisuuksista ja t-PA:n B-ketjusta.

Kuva 17 on kaavioesitys u-PA:n ilmentämisplasmidin pBR3 rakentamisesta.

Kuva 18 on kaavioesitys ilmentämisplasmidin pBR4a rakentamisesta, joka sisältää plasminogeenin yhdistelmä- 38 100106 aktivaattorin cDNA-liitännäisen, joka koostuu t-PA:n A-ketjun osakokonaisuuksista ja u-PA:n B-ketjusta.

Kuva 19 on kaavioesitys hiivan ilmentämisvekto-rin pJDB207/PHO5-1-TPA rakentamisesta, joka sisältää PH05-promoottorin, invertaain signaalisekvenssin ja t-PA:n cDNA:n.

Kuva 20 on kaavioesitys plasmidin pCS16 rakentamisesta.

Kuva 21 on kaavioesitys plasmidin pCS16/UPA rakentamisesta, joka sisältää u-PA:n cDNA:n.

Kuva 22 on kaavioesitys plasmidin pJDB207/PHO5-I-UPA rakentamisesta.

Kuvat 23 - 26 esittävät kaaviollisesti menetelmiä, joilla primääriset plasminogeenin yhdistelmäaktivaattori-rakenteet, jotka sisältävät u-PA:n tai t-PA:n A-ketjun osakokonaisuudet ja katalyyttisen B-ketjualueen, muunnetaan lopullisiksi rakenteiksi, joissa osakokonaisuuksien liitoskohta on aktivointikohdassa ja/tai luontaisessa eksoni-introni1i itoskohdassa.

Kuva 23 esittää sellaisen geenin rakentamista, joka koodittaa plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoria, joka koostuu t-PA:n A-ketjun osakokonaisuuksista ja u-PA:n B-ketjusta.

Kuva 24 esittää sellaisen geenin rakentamista, joka koodittaa plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoria, joka koostuu u-PA:n A-ketjun osakokonaisuuksista ja t-PA:n B-ketjusta.

Kuva 25 esittää sellaisen geenin rakentamista, joka koodittaa plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoria, , joka koostuu u-PA:n kasvutekijäalueesta, t-PA:n kringle * 2-alueesta ja t-PA:n B-ketjusta.

Kuva 26 esittää sellaisen geenin rakentamista, joka koodittaa plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoria, joka koostuu u-PA:n kasvutekijäalueesta, t-PA:n kringle 2-alueesta ja u-PA:n B-ketjusta.

Kuva 27 on luettelo esimerkeissä kuvatuista plas-

II

39 1 00 1 06 minogeenin yhdistelmäaktivaattoreista ja mutatoiduista plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoreista.

Liitteenä olevissa kuvissa käytettyjen symbolien merkitykset ovat seuraavat:

D

AMP, Amp ampisilliiniresistenssigeeni (beeta- laktamaasi) p TET, Tet tetrasykliiniresistenssigeeni NEO Tn5-neomysiinifosfotransferääsi TN5PR transposoni TN5:n bakteeripromoottori HPH hygromysiinifosfotransferääsi pBRori plasmidin pBR322 replikoitumisen aloituskohta POIS "myrkkysekvenssi" eli pBR322:n sekvens si, joka estää SV40:n replikoitumisen SV40ori SV40:n replikoitumisen aloituskohta, sattuu yhteen varhaisen ja myöhäisen promoottorin kanssa SV40enh,SV40E 72 ep:n pituinen tehostaja, joka on SV40:n varhaisen promoottorin osa HCMVE ihmisen sytomegaloviruksen (HCMV) välittömän varhaisen päägeenin tehostaja MCMVP hiiren sytomegaloviruksen (MCMV) . välittömän varhaisen päägeenin promoot- tori/mRNA:naloituskohta RSV Rous-sarkoomaviruksen LTR (promoottori) CAP eukaryoottisen mRNA:n 5' m7Gp "cap":n asema polyA mRNA:n polyadenyloitumiskohta .. SPLD silmukan luovutuspuoli eli intronin 5'-pää SPLA silmukan vastaanottopuoli eli-intronin 3'-pää BAP bakteeriperäinen emäsfosfataasi CTP vasikan suolen fosfataasi (BamHI/Bgl2) Sau3a-kohta, joka syntyy BamHI-kohdan 40 1 00 1 06

Bglll-kohdan yhteenliittämisestä Seal(del) mutatoitu Scal-kohta x < y restriktioentsyymikohta x, joka sijait see myötäpäivään y:stä p promoottori inv.SS invertaasin signaalisekvenssi t transkription lopettaja

L kytkijä-DNA

DHFR dihydrofolaattireduktaasi

mtPA Bowes-melanooman t-PA

Esimerkki 1: Scal-kohdan sijoittaminen krinqle-rakenteiden ja entsyymiosakokonaisuuden väliin ihmisen t-PA:n cDNA: ssa

Eräs tapa valmistaa kimeerisiä eli yhdistelmämole-kyylejä, jotka sisältävät osakokonaisuuksia sekä t-PA:sta että u-PA:sta, on saada aikaan vastaavista klooneista johdettuja haluttuja restriktiofragmentteja, koota ne yhteen liuoksessa ja sen jälkeen kloonata näin saadut rakenteet. Kloonauksen jälkeen yhdistelmämolekyylien rakenne varmistetaan restriktiokartoituksella ja DNA-sek-venssianalyysillä.

Yhdistelmämolekyylien aikaansaamiseksi sekä t-PA:n cDNA että u-PA:n cDNA katkaistaan vastaavasti kringle-rakenteiden ja entsyymiosakokonaisuuksien välistä. Kun kyseessä on u-PA, tämä saavutetaan suorittamalla osittainen katkaisu restriktioendonukleaasilla MstI, joka erottaa ei-katalyyttisen osakokonaisuuden entsymaattisesta osakokonaisuudesta ja siihen liittyvistä 3'-pään sekvensseistä. t-PA:ssa ei ole läsnä mitään vastaavalla taval- • % . la käyttökelpoista katkaisukohtaa, joten sellainen on tuotava seuraavassa esitetyllä tavalla.

A) Plasmidin pEcoO.474ScaI rakentaminen (ks. kuva 5) Tässä rakentamistoimenpiteessä t-PA:n cDNA:n ainut Scal-kohta (AGTACT), joka on nukleotidiasemissa tt 41 100106 940 - 945, tuhotaan (AGTACT-·»AGTATT) ja toinen Scal-koh-ta tuodaan nukleotidiasemiin 963-968 (TCCACC —AGTACT) kringle 2:n 3'-päähän (ks. kuvat 1 ja 2). Näillä muutoksilla ei vaikuteta minkään aminohapon koodittamiseen.

Kaikki restriktiokatkaisut suoritetaan valmistajan ohjeiden mukaan (New England Biolabs, Bethesda Research Laboratories) ja saadut katkaisutulokset analysoidaan suorittamalla polyakryyliamidielektroforeesi (3,5 %).

Geeli värjätään etidiumbromidilla (1,0 ^jg/ml) ja tehdään näkyväksi ultraviolettivalolla. Haluttu vyöhyke leikataan irti ja elektroeluoidaan 0,5 x TBE:ssä (1 x TBE = 90 mM Tris-boraatti, pH 8,3, 2,5 mM EDTA). Elekt-roeluoitunut materiaali sijoitetaan Elutip-d-pylvääseen (Schleicher ja Schuell), sitoutunut DNA eluoidaan korkeassa suolapitoisuudessa ja saostetaan lisäämällä etanolia. Pelletti pestään etanolilla, kuivataan ja liuotetaan veteen.

Plasmidi pW349F (eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 143 081), joka sisältää ihmisen t-PA:n cDNAm (syntetisoitu HeLaS3-soluista eritetystä mRNArsta ja kloonattu plasmidin pBR322 Pstl-kohtaan), katkaistaan EcoRI:llä ja 470 emäsparin (ep) fragmentti (ks. kuva 2) eristetään. 150 e'p:n EcoRI,ScaI-fragmentti ja 290 ep:n EcoRI,HaeIII-fragmentti saadaan katkaisemalla 470 ep:n EcoRI-fragmentti Scalrllä ja Haellltlla vastaavasti. 470 ep:n EcoRI-fragmentin kaksi säiettä erotetaan toisistaan denaturoimalla DNA DMSO-puskurissa (30 % DMSO:ta, 1 mM EDTA, 0,5 % ksyleenisyanolia, 0,05 % bromi-fenolisinistä) ja elektroforesoimalla 5-prosenttisessa polyakryyliamidigeelissä 0,5 x TBErssä jännitteellä 8 volttia/cm (Maniatis et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Erottuneet säikeet otetaan talteen elektroeluutiolla ja sitä seuraavalla etanolisaostuksella. 31-meerinen deoksioligonukleotidi (johon on sisällytetty halutut 5 nukleotidimuutosta ks. kuva 5) syntetisoidaan fosfo- 32 tnesterimenetelmällä. 50 pikomoolia 31-meenä P- 42 100106 leimataan 5'-päästä 20 pl:n reaktiossa, joka sisältää 1 x kinaasipuskuria (10 x kinaasipuskuri = 0,5 M Tris.

HC1, pH 7,5, 0,1 M MgCl2, 50 mM DTT, 1 mM spermidiini, 1 mM EDTA), 30 jiCi (*32P)ATP:tä (Amersham, noin 3000 Ci/mmol) ja 10 yksikköä T4 polynukleotidikinaasia (Bet-hesda Research Labs.). Reaktiota inkuboidaan 30 minuuttia 37°C:ssa ja sen jälkeen lisätään 1 jxl 10 mM ATP-liuosta, 10 yksikköä T4-kinaasia ja inkubointia jatketaan 30 minuuttia 37°C:ssa. Reaktio katkaistaan kuumentamalla 10 minuuttia 68°C:ssa. Leimattua31-meeriä, jolla on transkriboiduksi tulemattoman säikeen sekvenssi, käytetään koettimena dot-blot-analyysissä (suoritetaan julkaisun Zoller ja Smith, Nucl. Acids Res., 10, 6487 - 6500 (1982) mukaan paitsi, että esihybridisointi ja hybridisointi suoritetaan 50°C:ssa ja pesu 60°C:ssa), jotta saadaan selville kumpi kahdesta säikeestä hybridi-soituu siihen eli edustaa transkriboiduksi tulevaa säiettä. Kyseiset neljä DNA:ta sekoitetaan keskenään 20 jal:n emäspariutusreaktiossa, joka siis sisältää 0,3 pmol transkriboiduksi tulevaa säiettä, 2 pmol 150 ep:n EcoRI,Seal-fragmenttia, 2 pmol 290 ep:n EcoRI,HaeIII-fragmenttia, 25 pmol fosforyloitua 31-meeriä ja 1 x emäs-pariutuspuskuria (5 x emäspariutuspuskuri = 0,5 M NaCl, 32,5 mM Tris.HCl, pH 7,5, 40 mM MgCl2 ja 5 mM /S-merkaptoetanoli). Seosta inkuboidaan 3 minuuttia 100°C:ssa, 30 minuuttia 30°C:ssa, 30 minuuttia 4°C:ssa ja sen jälkeen 10 minuuttia jäällä, minkä jälkeen lisätään 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia (New England Biolabs) ja saatua reaktioseosta inkuboidaan 12,5°C:ssa yön yli.

470 ep:n emäspariutunut fragmentti otetaan talteen 3,5-prosenttisesta polyakryyliamidigeelistä edellä kuvatulla tavalla ja liitetään EcoRI:llä katkaistuun ja defosforyloituun pBR322-DNA:han (New England Biolabs) inkuboimalla yön yli 12°C:ssa liuoksessa, jossa on 50 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 1 rtM spermidiiniä ja 0,1 mg/ml naudan seerumial- ti 43 100106 bumiinia. Yhteenliittämisseoksella transformoidaan transformontikelpoiset E. coli HBlOl-solut (Maniatis et ai., supra). Ampisilliiniresistentit pesäkkeet valitaan L-agarissa, joka sisältää 50 pg/ml ampisilliiniä, ja pesäkkeet, jotka sisältävät 470 ep:n fragmentin, tunnistetaan pesäkehybridisaatiolla käyttämällä 31-meeriä koettimena (D. Woods, Focus 6, 1 - 3 (1984)). Plasmidi-DNA eristetään useista positiivisesti hybridi-soituvista pesäkkeistä pienessä mittakaavassa (Holmes et ai., Analyt. Biochem. 114, 193 - 197 (1981)) ja uuden Scal-kohdan syntyminen todetaan yhdistetyllä EcoRI,ScaI-katkaisulla. Puhtauden takaamiseksi transformoidaan E. coli HBlOl-solut positiivisten pesäkkeiden plasmidi-DNA:11a toisen kerran. Suuren mittakaavan plasmidin-valmistus suoritetaan käyttämällä yhtä tällaista toisen sukupolven positiivsita pesäkettä (Katz et ai., J. Bac-teriol. 114, 577 - 591 (1973); Biochemistry 1£, 1677 - 1683 (1977)) ja alkuperäisen Scal-kohdan tuhoutuminen ja uuden Scal-kohdan syntyminen varmistetaan DNA-sek-venssianalyysillä käyttämällä Maxamin ja Gilbertin menetelmää (Methods Enzym. 6ji, 499 - 560 (1980)). Saadulle plasmidille annetaan nimeksi pEcoO.47dScaI.

B) Ihmisen t-PA:n rakentaminen, jossa on mutatoitu Seal-kohta (ks. kuva 6) Tässä rakentamisessa korvataan villityyppisessä ihmisen t-PA:ssa oleva 470 ep:n EcoRI-fragmentti mutant-ti Scal-kohdan sisältävällä 470 ep:n EcoRI-fragmentilla. Plasmidi pW349F, joka sisältää ihmisen t-PA:n cDNA:n ' (ks. edellä), katkaistaan Clal:llä ja syntyneet epä tasaiset päät tehdään tasaisiksi lisäämällä dCTP:tä ja dGTP:tä (50 ^um kumpaakin) ja 10 yksikköä DNA-polyme-raasi I:n-Klenow-fragmenttia (Boehringer, Mannheim). Reaktiota inkuboidaan huoneenlämpötilassa 30 minuuttia ja sen jälkeen uutetaan fenolilla ja eetterillä ja saos-tetaan etanolilla. Pelletti liuotetaan veteen, katkais 44 100106 taan EcoRI:llä ja Scal:llä ja 1,5 ke:n EcoRI,Scal-frag-mentti ja 4,3 ke:n Clal(tasainen pää),EcoRI-fragmentti eristetään. Muodostetaan seos, jossa on nämä kaksi fragmenttia ja 470 ep:n fragmentti, joka on saatu plas-midista pEcoO.47AScaI suorittamalla EcoRI-katkaisu, ja liitetään yhteen edellä kuvatulla tavalla 12°C:ssa yön ajan. Yhteenliittämisseoksella transformoidaan transformointikelpoiset E. coli HBlOl-solut ja tetrasyk-liiniresistentit pesäkkeet valitaan L-agarissa, joka sisältää 12,5 pg/ml tetrasykliiniä. Pesäkkeet, jotka sisältävät 470 ep:n mutanttifragmentin, tunnistetaan pesäkehybridisaatiolla käyttämällä koettimena edellä kuvattua 31-meeriä. Useista positiivisesti hybridisoitu-vien pesäkkeiden minilysaateista valmistetaan DNA ja rakenteen tarkka luonne varmistetaan suorittamalla tarvittavat restriktiokatkaisut. Yhdelle tällaiselle plas-midille, joka sisältää halutut muutokset, annetaan nimeksi ph.tPAhScal.

Esimerkki 2: u-PA/t-PA-yhdistelmämolekyylin rakentami nen; plasmidi pUNC.tc (ks. kuva 7) Tämä rakenne on u-PA:n ei-katalyyttisen alueen (sisältää koodittamattoman 5'-alueen, signaalin, kasvutekijä- ja kringle-sekvenssin) ja ihmisen t-PA:n katalyyttisen eli entsyymialueen yhdistelmä.

Urokinaasin cDNA valmistetaan ihmisen Hep3-soluista saadusta mRNA:sta (ks. T. Maniatis et ai., Molecular Cloning (1982), s. 188 - 246). u-PA:n cDNA:n 1,3 ke:n Smal-BamHI-fragmentti ja 1 ke:n BamHI-EcoRI-fragmentti kloonataan pUN121:n Smal,EcoRI-kohtiin (B. Nilsson et ai., Nucl. Acids Res. 1Λ, 8019-8030 (1983)), jolloin saadaan plasmidi pcUK176. Ihmisen u-PA-cDNA-liitännäisen restriktioendonukleaasikartta on esitetty kuvassa 4. u-PA-liitännäisen nukleotidisekvenssi ja päätelty aminohapposekvenssi on esitetty kuvassa 3.

45 100106

Plasmidi pcUK176 katkoistaan Xmal.-llä (ks. kuva 4; Xmal on Smalm isoskitsomeeri) ja Mstlrllä ja 521 ep:n fragmentti eristetään. Restriktioentsyymi MstI

it tunnistaa DNA-sekvenssin TGC^GCA (nuolet osoittavat katkaisukohtaa) ja tuottaa siis katkaisussa tasaiset päät. Näin ollen tämä entsyymi katkaisee u-PA:n cDNAm nukleotidien 520 - 525 kohdalta eli heti viimeisen kyste-iinitähteen jälkeen (aminohappo 131) sisältäen kringle-alueen (Holmes et ai., Biotechnology 2/ 923 - 929 (1985)), joten tämä katkaisu erottaa siististi toisistaan ei-ka-talyyttistä aluetta koodittavan sekvenssin ja katalyyttistä aluetta koodittavan sekvenssin.

Plasmidi ph.tPAÄScal katkaistaan Scalrllä ja HindIII:lla (Hindlll on läsnä vektorissa) ja 1,8 ke:n fragmentti otetaan talteen. Restriktioentsyymi Seal tunnistaa DNA-sekvenssin AGT^ACT (nuolet osoittavat katkaisukohtaa) ja antaa myös tasaiset päät katkaisun tuloksena. Seal katkaisee ph.tPAÄScaI-DNA:n seriini-tähteen 262 jälkeen (1 aminohapon päässä kringle 2:n viimeisen kysteiinin jälkeen; Pennica et ai., Nature 301, 214 - 221 (1983)), joten katkaisu erottaa ei-kata-lyyttisen ja katalyyttisen osakokonaisuuden toisistaan.

Kyseiset kaksi fragmenttia sekoitetaan keskenään ja liitetään Xmal,HindIII-katkaistuun pUCl8-vektori-DNA: hän. Kun on transformoitu E. coli HB101, tunnistetaan oikean liitännäisen sisältävät pesäkkeet pesäkehybridi-saatiolla käyttämällä koettimena ihmisen t-PA:n 2,0 ke m Bglll-fragmenttia (ks. kuva 2) (koetin leimataan satunnaisella käynnistysmenetelmällä: Feinberg et ai., Ana-lyt. Biochem. 132, 6-13 (1983)). u-PA-fragmentin ja : t-PA-fragmentin liitoskohdan DNA-sekvenssi todetaan DNA-sekvenssianalyysillä. Yhdelle oikealle kloonille annetaan nimeksi pUNC.tc.

Esimerkki 3: t-PA/u-PA-yhdistelmämolekyylin rakentami nen; plasmidi ptNC.UC (ks. kuva 8) 46 100106 Tämä rakenne on käänteinen pUNC.tcm rakenteelle siten, että ph.tPAäScal:n (sisältää koodittamattoman 5'-alueen, leader-sekvenssin, sormialueen, kasvutekijä-alueen, kringle 1-alueen ja kringle 2-alueen)onliitettynä ihmisen u-PA:n katalyyttiseen osakokonaisuuteen. Plasmidi ph.tPAAScal katkaistaan Saclrllä ja Scalrllä (ks. kuva 8) ja noin 1,0 ke:n fragmentti eristetään. Plasmidi pcUK176 katkaistaan ensin BamHI:llä ja sen jälkeen osittain Mstlrllä ja noin 800 ep:n fragmentti otetaan talteen. Seuraavaksi BamHI-katkaisutuote katkaistaan EcoRI:llä ja noin 1,0 ke:n fragmentti eristetään. Nämä kolme fragmenttia sekoitetaan Sacl:llä ja EcoRI:llä katkaistun pUC19-vektorin kanssa ja liitetään yhteen.

E. coli HB101 transformoidaan yhteenliittämisseoksella ja oikean liitännäisen sisältävät pesäkkeet tunnistetaan pesäkehybridisaatiolla käyttämällä koettimena samaa, edellä kuvattua 2,0 ke:n Bglll-koetintä. t-PA-DNA:n ja u-PA-DNA:n välisen liitoskohdan DNA-sekvenssi varmistetaan DNA-sekvenssianalyysillä. Yhdelle oikealle kloonille annetaan nimeksi ptNC.UC.

Esimerkki 4: Ilmentämisvektorin rakentaminen nisäkässo- luissa käytettäväksi A) t-PA:n cDNA:ssa sijaitsevan HgiAI-kohdan muuttaminen Hindlll-kohdaksi Tämä saavutetaan viiden vaiheen kautta (kuva 9).

Plasmidi pW349F (eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 143 081) katkaistaan osittain restriktioentsyy-millä HgiAI inkuboimalla 20 yig/ml DNA:ta 1 tunti 37°C:ssa : määrän 12 yksikköä/ml kanssa entsyymiä valmistajan (Bethesda Research Laboratories) suosittelemassa puskurissa, johon on täydennykseksi lisätty 10 jig/ml etidiumbro-midia vähentämään plasmidin sekundääristä katkeamista. Sitten linearisoitu plasmidi-DNA sijoitetaan 0,8-prosent-tiseen agaroosigeeliin, joka on tehty TBE-puskuriin 11 47 100106 (TBE: 89 mM Tris-boraatti, pH 8,9, joka sisältää 1

mmol/1 EDTA:ta), eluoidaan elektroforeettisesti samassa puskurissa, uutetaan kahdesti fenolilla ja kahdesti kloroformilla ja lopuksi saostetaan alkoholilla -20°C:ssa sen jälkeen, kun on lisätty 0,1 tilavuutta 3 M natrium-asetaattia, pH 5,2. Pelletoitu DNA liuotetaan pitoisuuteen 0,2 mg/ml TE-puskuriin (TE: 10 mM Tris-HCl, pH

7,? sisältäen 0,1 mmol/1 EDTA:ta).

63 yUl linearisoitua DNA:ta inkuboidaan sen jälkeen 30 minuuttia 37°C:ssa 15 yksikön kanssa T4 DNA-polymeraa-sia ligaasipuskurissa (33 mM Tris-asetaatti (pH 7,9), 66 mmol/1 kaliumasetaattia, 10 mmol/1 magnesiumasetaat-tia, 0,5 mmol/1 ditiotreitolia ja 0,1 mg/ml naudan seerumin albumiinia), minkä jälkeen kuumennetaan 10 minuuttia 60°C:ssa entsyymin inaktivoimiseksi. Tämän inkuboin-nin tarkoitus on käyttää T4-polymeraasin eksonukleolyyt-tistä aktiivisuutta poistamaan ulostyöntyvät neljä nukleotidia, jotka ovat jääneet jäljelle HgiAI-katkaisussa, niin, että saadaan tasapaisiä DNA-molekyylejä.

HindiII-kytkijoiden (CAAGCTTG) liittämiseksi tasapäi-seen DNA:hän edellä saatuun liuokseen lisätään 6 jil (300 ng) kinasoitua kytkijää, 4 jil 10 mM ATP-liuosta ja 3 jil T4 DNA-ligaasia (New England Biolabs, 400 yksikköäni) ja sen jälkeen inkuboidaan 16 tuntia 16°C:ssa. Yhteenliittämisreaktio katkaistaan kuumentamalla seosta 10 minuuttia 68°C:ssa, minkä jälkeen DNA katkaistaan HindIII:lla ja BglII:lla eli 15 μΐ (135 yksikköä) Hindlll: a, 1,5 |il 4 M NaCl-liuosta, 0,2 yal 1 M MgC^-liuosta ja 11 jil naudan seerumialbumiiniliuosta (1 mg/ml) lisätään, inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa ja sen jälkeen lisätään : 40 yksikköä BglII:ta ja inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa.

Saatu 177 emäsparin fragmentti puhdistetaan 6-prosenttises-sa polyakryyliamidigeelissä suorittamalla ajo TBE-puskurissa, eluoidaan TNE-puskuriin (TNE: 10 mM Tris-HCl pH 8,8 sisältäen 100 mmol/1 NaCl ja 1 mmol/1 EDTA), absorboidaan DEAE-selluloosaan (Whatman DE52), eluoidaan liuoksella, jossa on 1 mol/1 NaCl TNE-puskurissa, laimenne- 1β 100106 48 taan 4 tilavuudella vettä, saostetaan -20°C:ssa sen jälkeen, kun on lisätty 2,5 tilavuutta etanolia, ja liuotetaan lopuksi 17 jil:a.an TE-puskuria (TE: 10 mM tris-HCl pH 8,0 sisältäen 1 mmol/1 EDTA).

Plasmidi pRSVneo on plasmidin pSV2neo (P.J. Southern ja P. Berg, J. Mol. Appi. Genet. 1_, 327-341 (1982)) johdannainen, jossa SV40:stä johdettu Pvu-HindIII-fragmentti on korvattu PvuII-HindiII-fragmentilla, joka sisältää Rous-sarkoomaviruksen LTR-promoottorin, suorittamalla rakentaminen samoin, kuin pRSVcat rakennettiin pSV2cat: stä (C.M. Gorman et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 6777-6781 (1982)). 5 jig tätä plasmidia katkaistaan 50 jil:n tilavuudessa 24 yksiköllä Bglllrta valmistajan ohjeiden mukaan. Kun on inkuboitu 1 tunti 37°C:ssa, lisätään 40 yksiköä HindIII:a ja inkubointia jatketaan 1,5 tuntia ja sen jälkeen puhdistetaan suuri 5,4 ke:n fragmentti edellä kuvatulla tavalla.

17 jil puhdistettua 177 ep:n fragmenttia liiteään 18 tuntia 16°C:ssa yhteen 2 jilzn (20 ng) kanssa pRSVneo-fragmenttia käyttämällä 0,25 ^il (100 yksikköä) T4-ligaa-sia ligaasipuskuri kokonaistilavuuden ollessa 22 μΐ, minkä jälkeen saadulla plasmidi-DNA:11a transformoidaan E. coli D. Hanahanin menetelmää noudattaen (J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983)). Saaduista ampisilliiniresitenteis-tä kannoista valitaan yksi, joka sisältää plasmidin nimeltään ptPAL, jossa on 177 ep:n HindIII-BglII-fragmentti restriktioanalyysin perusteella todettuna. 0,1 jig tätä plasmidia katkaistaan 60 pl:ssa 16 yksiköllä BglII:ta valmistajan ohjeiden mukaan 1,5 tuntia 37°C:ssa. Sitten tähän liuokseen lisätään 20 yksikköä vasikan suolen fosfataasia (Boehringer Mannheim) ja inkubointia jatketaan 30 minuuttia, jonka jälkeen DNA uutetaan kahdesti fenolilla ja kahdesti klorofromilla ja saostetaan sen jälkeen, kun on lisätty 0,1 tilavuutta 3,0 M natriumase-taattia pH 5,2 ja 0,6 tilavuutta isopropanolia, liuotetaan TE-puskuriin ja jatkopuhdistetaan agaroosigee- li 49 100106 lielektroforeesilla kuten edellä on selostettu, uutetaan kahdesti fenolilla ja kahdesti kloroformilla ja saoste-taan -20°C:ssa sen jälkeen, kun on lisätty 2,5 tilavuutta etanolia ja 0,1 tilavuus 0,3 M natriumasetaattia pH 5,2, ja lopuksi liuotetaan 30 piiraan TE-puskuria. 2,1 ke:n tPA-Bglll-fragmentti leikataan sen jälkeen irti 5 pgrsta plasmidia pW349F 25 ^xl:n reaktiossa käyttämällä 20 yksikköä BglII:ta (2 tuntia, 37°C), puhdistetaan 0,8-prosenttisessa agaroosigeelissä, eluoidaan elektrofo-reettisesti edellä kuvatulla tavalla ja uutetaan kahdesti fenolilla ja kahdesti kloroformilla ja saostetaan -20°C: ssa sen jälkeen, kun on lisätty 2,5 tilavuutta etanolia ja 0,1 tilavuutta 3 M natriumasetaattia, jonka pH on 5,2, ja liuotetaan TE-puskuriin pitoisuuteen 8 ng/jil. 1 yul t-PA-fragmentteja liitetään sen jälkeen 10 yil:n reaktiossa yhteen 7,5 ng:n kanssa Bglllilla leikattua vektori-DNA:ta käyttämällä 100 yksikköä T4-ligaasia (Biolabs) reaktioajan ollessa 17 tuntia 16°C:ssa ja tämän jälkeen suoritetaan E. colin transformointi. Yksi saaduista klooneista, nimeltään pD02, sisältää t-PA:n Bglll-frag-mentin sijoittuneena siten, että plasmidi sisältää jatkuvan avoimen lukuvaiheistuksen ihmisen t-PA:lle.

B) t-PA:n cDNA:n yhdistäminen beeta-globiinifragmenttiin

Plasmidi pDOlO (kuva 10) rakennetaan liittämällä samanaikaisesti yhteen kolme DNA-fragmenttia: (i) 2,1 ke:n fragmentti, joka alkaa HindiII-kohdasta ja päättyy Bglll-kohtaan sisältäen koko t-PA:ta koodittavan sekvenssin, eristetään agaroosigeelistä, johon on ladattu 10 |ig pD02-DNA:ta, joka on sitä ennen katkaistu osittain BglII:lla ja täysin HindIII:lla. (ii) pUB on plasmidi, joka sisältää kanin beeta-globiinigeenin (A. Van Ooyen et ai., Science 206, 337 (1979)) alakloonattuna Bglll-osittaishajotustuotteena plasmidin pUC9 BamHI-kohtaan (J. Vieira ja J. Messing, Gene 1£, 259-268 (1982); ibid.

19, 269-276 (1982)). Tästä plasmidista leikataan irti 50 100106 1,2 ke:n BamHI-HindIII-fragmentti, joka sisältää toisen intronin ja polyadenyloitumiskohdan, ja suoritetaan puhdistus agaroosigeelielektroforeesilla. (iii) Vektori pDOl sisältää plasmidin pBR322 Hindlll-AccI-fragmentin, joka sisältää replikoitumisen aloituskohdan, Hindlll-kohdasta (kuva 10) myötäpäivään etenevässä järjestyksessä 0,3 ke:n fragmentin, joka sisältää ihmisen sytome-galoviruksen (HCMV) tehostajan, joka päättyy synteettiseen Xbal-kohtaan, ja tämän tehostajan toisena kopiona homologiseen promoottoriin liittyneenä ja päättyen synteettiseen Hindlll-kohtaan. Tämä vektori-DNA katkaistaan HindIII:lla ja 6,3 ke:n lineaarinen plasmidi puhdistetaan agaroosigeelielektroforeesilla.

C) tPA/globiiniyhdistelmän sijoittaminen pSP62Pst33:een (ks. kuva 11) pSP62Pst33 (kuva 11) on plasmidi, joka sisältää hiiren sytomegaloviruksen (MCMV) 2,1 ke:n PstI-fragmentin, joka sisältää viruksen välittömän varhaisen promoottorin (IE), sijoitettuna plasmidin pSP62 (Boehringer Mannheim) Pstl-kohtaan, kuten kuvasta ilmenee. Plasmidin pSP62Pst33 Hindlll-kohtaan sijoitetaan plasmidin pDOlO Hindlll-frag-mentti. Valitaan plasmidi pCGA26, jossa t-PA:ta koodit-tava sekvenssi sijaitsee niin, että se voi tulla transkriboiduksi oikeassa suunnassa MCMV IE-promoottorin ohjaamana.

D) MCMV/tPA/globiiniyksikön sijoittaminen plasmidiin pSV2911neo (ks. kuva 12)

Plasmidi pSV2911neo (F. Asselbergs et ai., J. Mol.

^ Biol. 189, 401-411 (1986)) sisältää neomysiinifosfotrans- feraasigeenin (neo) TN5-transposonista SV40-ilmentämiska-setissa (kuva 12). Näin ollen se antaa nisäkäskudosviljel-mäsoluihn tuotuna vastustuskyvyn neomysiinin ja kahamysii-nin suhteen. pSV2911neo-DNA valmistetaan kloonausta varten katkaisemalla BamHI:llä, käsittelemällä vasikan suolen emäsfosfataasilla, uuttamalla kaksi kertaa ti 51 100106 fenolilla ja kaksi kertaa kloroformilla ja saostamalla alkoholilla ja lopuksi liuottamalla TE-puskuriin. Plasmi-di pCGA26 katkaistaan restriktioentsyymillä Accl, joka katkaisee sekvenssin GT/ACAC asemasta 345 MCMV-tehostaja/ promoottorialueella (K. Doersch-Haessler et ai., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 82, 8325-8329 (1985)) ja sekvenssin GT/CGAC (voidaan leikata myös Sällillä) globiiniosan takaa. Kaksi katkaisun tuloksena yli ulottuvaa emästä täytetään E. colin (suuri fragmentti) DNA-polymeraasi I:tä käyttäen ja näin satuihin tasaisiin päihin liitetään BamHI-kytkijät (CGGATCCG) ja nämä katkaistaan BamHI-entsyymillä. 3,8 ke:n fragmentti, jossa on MCMV/tPA/globii-niyksikkö, jossa nyt on BamHI-päät, puhdistetaan agaroo-sigeelillä ja liitetään sen jälkeen edellä kuvatulla tavalla saatuun pSV2911neo-DNA:han,jolloin saadaan ilmen-tämisplasmidi pCGA28.

E) pCGA28:sta johdetut ilmentämisvektorit pCGA42 on pCGA28:n johdannainen, jossa neon koo-dittava sekvenssi (Bglll-kohdan ja Smal-kohdan välissä) on korvattu hygromysiiniresistenssigeenin koodittavalla sekvenssillä. Tämä on saatu aikaan (ks. kuva 13) katkaisemalla plasmidi pSV2911neo ainoasta Smal-kohdastaan, liittämällä näin saatuun DNArhan Bglll-kytkijä (CAGATCTG) ja katkaisemalla tämän jälkeen BglII:lla. Saatu suuri DNA-fragmentti, joka koostuu vektorista ilman neo-koo-dit ussekvenssiä, puhdistetaan agaroosigeelissä ja liitetään plasmidin pLG89 pieneen BamHI-fragmenttiin (L. Gritz et ai., 25., 179-188 (1983)), joka samoin on puhdistettu agaroosigeelissä, jolloin saadaan plasmidit pCGA25c ja pCGA25d, jotka sisältävät hygromysiinifosfo-transferaasigeenin koodittavassa ja koodittamattomassa suunnassa vastaavasti. Kun suoritetaan CHO DUKXB1-solujen transfektointi standardiolosuhteissa (ks. esimerkki 16), antaa pCGA25c 60 pesäkettä/pg DNA:ta, jotka • ovat resistenttejä määrälle 0,2 pg/ml hygromysiiniä B, 52 100106 mikä konsentraatio tappaa solut, joiden sisältämä plasmi-di, esimerkiksi pCGA28, ei koodita hygromysiiniresistens-siä. Plasmidissa pCGA25c sijaitsevat hygromysiini B-resistenssiä koodittavat sekvenssit niin, että ne E. colissa tulevat transkroboiduiksi Tn5-promoottorin ohjaamina (joka Tn5-transposonissa saa aikaan kanamysiini-resistenssigeenin transkription). Näin ollen 2,5 ml:n viljelmä Luria-ravinneliemessä (LB), joka sisältää 40 mg/ml hygromysiini B:tä, ja joka on ympätty 0,05 ml:11a yön yli kasvanutta eli saturoitunutta E. coli DHl-baktee-riviljelmää (kasvatettu ampisilliinivalintapaineessa (50 mg/ml)), saavuttaa 3 tunnissa 37°C:ssa pidetyssä ilmastetussa viljelmässä 10 kertaa suuremman bakteeri-tiheyden kuin siinä tapauksessa, että kasvatetaan bakteereita, joiden sisältämissä plasmideissa ei ole E. colissa toimivaa hygromysiinigeeniä, joista plasmideista mainittakoon pCGA25d, pCGA28 ja pAT153 (A.J. Twigg et ai., Nature 283, 216-218 (1980)). Hygromysiini B-resis-tenssigeenin toimivuus sekä eläinkudosviijelmäsoluissa että E. colissa edesauttaa suuresti plasmidin pCGA25c ja sen johdannaisten käyttöä. Plasmidi pCGA42 rakennetaan tämän jälkeen sijoittamalla pCGA28:n BamHI-fragmentti, joka sisältää MCMV/t-PA/beeta-globiinikasetin, plas-midiin pCGA25c. Sen käyttötarkoitus on siirtää t-PA:ta ilmentävä geeni soluihin, joita ei voida transformoida genetisiiniresistenteiksi, tai jotka jo ovat genetisii-niresistenttejä. Myös pCGA42 kykenee ilmentämään hygro-mysiinigeeninsä E. colissa, niin, että E. coli DHl, joka sisältää pCGA42:n, voi kasvaa yli 10 kertaa suurempiin tiheyksiin kuin esimerkiksi plasmidin pCGA28 sisältävä E. coli, kun testaus suoritetaan edellä kuvatuissa olosuhteissa.

Plasmidi pCGA28 sisältää kaksi Sacl-kohtaa, yhden, joka alun perin on osa aivan MCMV-promoottorin takana olevasta kytkijästä, ja toisen, joka on t-PA:n cDNA:n alueella. Sacl-kohtien välissä oleva sekvenssi poiste 53 100106 taan katkaisemalla ensin tällä restriktioentsyymillä, puhdistamalla suuri fragmentti agaroosigeelissä ja muodostamalla tästä lineaarisesta DNA:sta rengas T4 DNA-ligaasia käyttämällä, jolloin syntyy plasmidi pCGA44 (ks. kuva 12). Mikä tahansa cDNA kloonattuna oikean-suuntaisesti pCGA44:n nyt ainoaan Sacl-kohtaan korvaa tehokkaasti t-PA:ta koodittavan sekvenssin pCGA28:ssa ja ilmentyy tehokkaasti.

Plasmidi pCGA42d on johdettu plasmidista pCGA42 poistamalla 1,4 ke:n Sacl-fragmentti (ks. kuva 13).

Nyt ainoaan Sacl-kohtaan voidaan sijoittaa muita cDNA-sekvenssejä kuin t-PA:n cDNA ja saada ne ilmentymään suurina määrinä kudosviljelmäsoluissa.

Esimerkki 5: u-PA:n, t-PA:n ja plasminoqeenin yhdistelmä- aktivaattorien cDNA-sekvenssien sijoittaminen vektoriin PCGA28 A) t-PA:n cDNA:n sijoittaminen (ks. kuva 15) Tässä rakentamisessa sijoitetaan plasmidin ph.tPAiScal sisältämä t-PA:n sisältävä cDNA-fragmentti plasmidiin pCGA28. Tätä rakennetta pidetään tarpeellise-nä kontrollina, jotta saadaan selville mahdolliset haitalliset muutokset, joita on saattanut aiheutua Scal-kohdan uudelleenkoostamisessa. 1,4 ke:n Sacl-fragmentti otetaan talteen plasmidista ph.tPAdScal suorittamalla sille Scal-katkaisu. Ilmentämisvektori pCGA28 katkaistaan myös Sacl:llä ja 8,2 ke:n vektorifragmentti eristetään ja defosforyloidaan 100 jj.l:n reaktiossa, joka sisältää 0,lmM Trisiä, pH 8,0, 0,1 % SDS:ää ja 0,02 yksikköä - bakteeriperäistä emäsfosfataasia. Kun on inkuboitu 30 minuuttia 60°C:ssa, reaktioseos uutetaan kahdesti fenolilla ja eetterillä ja sen jälkeen suoritetaan eta-nolisaostus. Pelletti liuotetaan veteen ja osa liuoksesta käytetään ph.tPMScaI:stä saadun 1,4 ke:n Sacl-fragmentin liittämiseen. Yhteenliittämisseoksella transformoidaan E. coli HB101 ja ampisilliiniresistenteistä 54 100106 pesäkkeistä valmistettu minilysaatin DNA katkaistaan tarvittavilla restriktioentsyymeillä, jotta saadaan varmistetuksi, että Sacl-liitännäinen on halutussa suunnassa. Plasmidille, jolla on haluttu suunta, annetaan nimeksi pBRIA. Plasmidille, jossa Sacl-fragmentti on vastakkaisesa suunnassa, annetaan nimeksi pBRIB.

B) UPAATPAB-yhdistelmä-cDNA:n sijoittaminen (ks. kuva 16) Tässä rakentamisessa sijoitetaan UPAATPAB-yhdistel-mä-cDNA-fragmentti, joka on saatu plasmidista pUNC.tc, ilmentämisvektoriin pCGA28. pUNC.tc-DNA katkaistaan Smalillä (ks. kuva 7), 1,24 ke:n fragmentti eristetään ja liitetään Saclrllä katkaistuun, defosforyloituun 8,2 ke:n pCGA28-vektori-DNA:hän. E. coli HBlOl-solut transformoidaan yhteenliittämisseoksella ja pesäkkeet, joissa on Sacl-liitännäinen halutussa suunnassa, tunnistetaan suorittamalla minilysaatin DNA:lie restriktio-katkaisut. Plasmidi, jossa pUNC.tc:stä saatu DNA-liitännäinen on halutussa suunnassa, nimetään plasmidiksi pBR2A, ja se, jossa liitännäinen on vastakkaisessa suunnassa, nimetään plasmidiksi pBR2B.

C) u-PA:n cDNA:n sijoittaminen (ks. kuva 17) Tässä rakentamisessa ihmisen u-PA:n DNA sijoitetaan ilmentämisvektoriin pCGA28 ja saatu plasmidi toimii yhdessä plasmidin pBRl kontrollina käytettynä kanta-plasmidina ja vahvistaa pCGA28-tyyppisten vektorien hyödyllisyyden. Plasmidi pcUK176 katkaistaan Smal:llä ja Ahalllilla (ks. kuva 4), 2,25 ke:n fragmentti eristetään ja liitetään fosforyloituun Sacl-kytkijään edellä kuvatulla tavalla. Sacl-katkaisun jälkeen 2,25 ke:n fragmentti otetaan talteen ja liitetään Sacl:llä katkaistuun, defosforyloituun 8,2 ke:n pCGA28-DNA-fragmenttiin.

E. coli HB101 transformoidaan ja pesäkkeet, joissa on haluttu plasmidi, tunnistetaan katkaisemalla minilysaa- li 55 100106 tin DNA restriktioentsyymeilla. Plasmidille, jossa on ihmisen u-PA:n DNA oikeassa suunnassa, annetaan nimeksi pBR3A ja plasmidille, jossa on liitännäinen vastakkaisessa suunnassa, annetaan nimeksi pBR3B.

D) TPAAUPAB-yhdistelmä-cDNA:n sijoittaminen (kuva 18) Tässä plasmidista ptNC.UC saatu TPA^UPA^n cDNA sijoitetaan ilmentämisvektoriin pCGA28. 2,75 ke:n Smal (läsnä vektorissa),Ahalll-fragmentti, joka on eristetty ptNC.UC-DNArsta, liitetään fosforyloituun Sacl-kytki-jään ja kytkijään yhdistetty 2,75 ke:n fragmentti otetaan talteen ja liitetään Sacl:llä katkaistuun, defosforyloi-tuun vektori-DNA:hän ja halutut pesäkkeet tunnistetaan edellä kuvatulla tavalla. Plasmidille, jossa on ptNC. UC-DNA-liitännäinen oikeassa suunnassa, annetaan nimeksi pBR4A.

Esimerkki 6: Hiivan iImentämisvektorin rakentaminen, joka sisältää PH05-promoottorin, invertaasin signaalisek-venssin ja t-PA:ta koodittavan alueen A) Invertaasin signaalisekvenssin oligodeoksiribonukleo-tidien synteesi: DNA-syntetisaattorilla (malli 380B, Applied Biosys-tems) syntetisoidaan neljä oligodeoksiribonukleotidia: 1-1, 1-2, 1-3 ja 1-4. Suojauksen poiston jälkeen synteettiset fragmentit puhdistetaan 12-prosenttisessa polyakryyliamidigeelissä, joka sisältää 8 mol/1 ureaa. Suolattomat, puhtaat oligodeoksiribonukleotidit saadaan käyttämällä Sep. Pak:ia (Waters Associates). Nämä fragmentit muodostavat kahdenteen, joka koodittaa invertaasin signaalisekvenssiä, ja jossa on usein käytetyt hiivan kodonit.

56 100106

Hindlll

EcoRI MetLeuLeuGlnAlaPheLeuPheLeuLeu 1-1 51AATTCATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTT 3' 1-2 3' GTACGAAAACGTTCGAAAGGAAAAGGAAAACCGAC 5'

AlaGlyPheAlaAlaLysIleSerAla 1-3 5 * GGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCATCTTAGCGTC 3' 1-4 3' CAAAACGTCGGTTTTAIAGACGTAGAATCGCAGAGCT 5'

Hgal_

XhoI

B) Invertaasin signaalisekvenssin alakloonaus plasmidiin p31 a) Vektorin valmistaminen: 1,5 pg plasmidia p31R/SS-TPAZl2 (eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 143 081) katkaistaan 10 yksiköllä EcoRI:tä (Boehringer) 50 pil:ssa liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl, pH 7,5, 6 mM MgC^, 100 mM NaCl ja 6 mM merkaptoetanolia, reaktioajan ollessa 1 tunti 37°C: ssa. Sen jälkeen lisätään 1 pii 2,5 M NaCl-liuosta ja 10 yksikköä XhoI:tä (Boehringer) ja inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa. 4,2 ke:n vektori eristetään 0,8-prosetti- sessa preparatiivisessa agaroosigeelissä. Geelisiivu siirretään Micro Colloidor-putkeen (Sartorius GmbH), peitetään 200 pl:lla TE-puskuria ja elektroeluoidaan (elektroforesoidaan 50 minuuttia virralla 90 inA). TE-liuos otetaan talteen ja saostetaan 2,5 tilavuudella absoluuttista etanolia sen jälkeen, kun on lisätty 0,1 tilavuutta ΙΟχΤΝΕ-puskuria. DNA-pelletti pestään kylmällä 80-prosenttisella etanolilla ja kuivataan vakuumissa.

DNA uudelleenliuotetaan 6 ^iltaan TE-puskuria (40 pmol/yal).

b) Oliqodeoksibribonukleotidien (1-1, 1-2, 1-3, 1-4) emäspariuttaminen, kinasointi ja liittäminen vektoriin

Liuosta, joka sisältää 10 pikomoolia kutakin näistä neljää deoksiribonukleotidista 10 jihssa 0,5 M Tris-HCl-puskuria, pH 8, inkuboidaan 5 minuuttia 95°C:ssa vesihauteella. Vesihaude jäähdytetään hitaasti 5 tunnin kulues-

II

57 100106 sa 30°C:seen. Tähän emäspariutettuun liuokseen lisätään 0,1 M MgC^-liuosta, 0,1 M NaCl-liuosta, 30 mM DTT-liuosta ja 4 mM ATP-liuosta (2 pl kutakin) ja 8 yksikköä (1 pl) polynukleotidikinaasia (Boehringer). Kinasointi suoritetaan 37°C:ssa 1 tunnissa. Emäspariu-tettuja, kinasoituja oligodeoksiribonukleotideja ja 60 pikomoolia katkaistua p31R/SS-TPA 2-vektoria (1,5 pl) liitetään yhteen käyttämällä 400 yksikköä (1 pl) T4 DNA-ligaasia (Biolabs) reaktioajan ollessa 17 tuntia 14°C:ssa. Reaktio pysäytetään inkuboimalla 10 minuuttia 65°C:ssa. 10 plrlla tätä yhteenliittämisseosta transformoidaan E. coli HB101 Ca++-solut (M. Dagert. ja S.D. Ehrlich, Gene ^6, 23-28 (1979)). Poimitaan

D

20 amp -pesäkettä. DNA valmistetaan nopealla eristysme-netelmällä (D.S. Holmes ja M. Quigley, Anal. Biochem.

114, 193-197 (1981)). DNA katkaistaan EcoRI:llä ja XhoI:llä, leimataan radioaktiivisesti EcoRI-päästä ja analysoidaan 6-prosenttisessa polyakryyliamidigeelissä, joka sisältää 8 mol/1 ureaa, käyttämällä merkkinä radioaktiivisesti leimattua, HaeIII:lla katkaistua pBR322-DNA:ta. Kaikista 20 pesäkkeestä saaduista DNA-laaduista löydetään oikeata kokoa olevat vyöhykkeet. Yhtä kloonia kasvatetaan 100 ml:ssa LB-alustaa, joka sisältää 100 yug/ml ampisilliiniä. Plasmidi-DNA eristetään ja sille annetaan nimeksi p31RIT-12.

C) pJDB207/PHQ5-I-TPA:n rakentaminen (ks. kuva 19) a) Vektorin rakentaminen: 3 pg plasmidia pJDB207/PHO5-TPAl8 (eurooppalainen ♦> patenttihakemusjulkaisu no. 143 081) inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa 10 yksikön kanssa BamHI:tä 50 pl:ssa liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl, pH 7,5, 6 mM MgC^, 100 mM NaCl ja 6 mM merkaptoetanolia. Erä tarkistetaan 1-pro-senttisessa agaroosigeelissä, joka on tehty TBE-puskuriin, jotta voidaan olla varmoja täydellisestä katkeamisesta.

58 100106

Hajoamistuotetta inkuboidaan 10 minuuttia 65°C:ssa.

Sitten lisätään 0,5 pl 5 M NaCl-liuosta ja vielä 15 yksikköä XhoI:tä (Boehringer). Saatua seosta inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa. 6,8 kein vektori eristetään 0,8-pro- senttisessa agaroosigeelissä. DNA uutetaan elektroeluu-tiolla ja liuotetaan saostuksen jälkeen TE-puskuriin.

b) Plasmidin p31/PH05-TPA18 katkaisu Xholillä 30 jig plasmidia p31/PH05-TPA18 (eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 143 081) inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa 60 yksikön kanssa Xholitä (15 yksikköä/pi) 200 piissä liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl, pH 8, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl ja 6 mM merkaptoetanolia, uutetaan samalla tilavuudella fenoli-kloroformia ja saostetaan etanolilla.

c) Xholillä katkaistun plasmidin p31/PH05-TPA18 osittainen katkaisu Pstlillä

Saostettu Xholillä katkaistu p31/PH05-TPA18-DNA uudelleensuspendoidaan 250 ^Iliaan liuosta, jossa on 10 mM tris.HCl, pH 7,5, 6 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanolia ja 2,5 mg etidiumbromidia, inkuboidaan 35 minuuttia 37°Cissa 22,5 yksikön kanssa Pstlitä ja sen jälkeen uutetaan samalla tilavuudella fenolia ja vielä samalla tilavuudella kloroformi-isoalyylialkoholi-seosta (50i1). 1,6 kein fragmentti eristetään prepara- tiivisessa 1-prosenttisessa agaroosigeelissä. DNA uutetaan elektroeluutiolla ja saostetaan (liitännäinen 1) .

d) Plasmidin p31RIT-12 Sali-XhoI-katkaisu: 30 ^ig plasmidia p3lRIT-12 inkuboidaan 1 tunti 37°Cissa 60 yksikön kanssa Sali itä (Boehringer, 12 yk-sikköä/yrl) ja 60 yksikön kanssa XhoI itä (15 yksikköä/yrl) 200 piissä liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl, pH 8, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl ja 6 mM merkaptoetanolia, uute-

II

59 100106 taan samalla tilavuudella fenoli-kloroformia ja saoste-taan etanolilla. 869 ep:n fragmentti eristetään 1,2-pro-senttisessa preparatiivisessa agaroosigeelissä. DNA uutetaan elektroeluutiolla, suola poistetaan DE-52:ssa ja sen jälkeen suoritetaan saostus etanolilla.

e) Sall-XhoI:llä katkaistun plasmidin p31RIT-12 katkaisu Hgal:llä

Sall-XhoI-katkaistu plasmidi p3lRIT-12 uudelleen-suspendoidaan 100 plraan liuosta, jossa on 6 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgC^, 50 mM NaCl, 1 mM ditiotreitolia ja 10 mg naudan seerumin albumiinia, inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa 6 yksikön kanssa Hgalrtä (Biolabs, 0,5 yksikköä/ jil). 600 ep:n fragmentti eristetään 1,2-prosenttisessa agaroosigeelissä. DNA uutetaan elektroeluutiolla ja seostetaan etanolilla.

f) Kytkijäoliqonukleotidien emäspariutus 90 pikomoolia kahta oligodeoksiribonukleotidia, joiden sekvenssit ovat seuraavat Hgal Päti 5' CTGCATCTTACCAAGTGATCTGCA 3' 3'AGAATGGTTCACTAG 5’ suspendoidaan 10 |il:aan 0,5 mM Tris.HCl-liuosta, pH 8, silikonoidussa Eppendorf-putkessa. Saatua liuosta inkuboidaan 5 minuuttia 95°C:ssa ja sen jälkeen jäähdytetään hitaasti huoneenlämpötilaan yön aikana.

g) Kytkijän kinasointi

Edellä saatuun liuokseen lisätään 2 ^il 0,1 M KCl-liuosta, 2 jul 0,1 M MgC^-liuosta, 3 |il 30 mM DTT-liuos-ta, 1 jil 200 mM ATP-liuosta ja 8 yksikköä polynukleotidiki-naasia (8 yksikköä/yul). Saatua seosta inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa.

h) Plasmidista p31RIT-12 saadun Hgal-fragmentin ja kytkijän liittäminen yhteen 60 100106

Kinasoidun kytkijän liuos siirretään putkeen, joka sisältää kuivan Hgal-fragmentin, ja sen jälkeen lisätään 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia. Saatua liuosta inkuboidaan huoneenlämpötilassa (21 - 22°C) 90 minuuttia, laimennetaan 100 plraan TE-liuoksella ja uutetaan samalla tilavuudella fenoli-kloroformia. Fragmentti saoste-taan lisäämällä 0,6 tilavuutta isopropanolia ja 0,1 tilavuutta 3 M natriumasetaattia vesiliuokseen huoneenlämpötilassa.

i) Edellä saaadun DNA:n BamHI-Pstl-katkaisu

Edellä saatu kuiva DNA katkaistaan 10 yksiköllä BamHI:tä ja 10 yksiköllä Pstlrtä 20 pulissa liuosta, jossa on 10 mM tris.HCl, pH 7,5, 100 mM MgC^ ja 6 mM merkaptoetanolia, inkubointiajan ollessa 1 tunti 37°C:ssa. Sitten liuos laimennetaan 100 jil:aan ja uutetaan samalla tilavuudella fenoli-kloroformia ja vesikerros saoste-taan isopropanolilla (liitännäinen 2).

i) Näiden kolmen fragmentin yhteenliittäminen 100 femtomoolia BamHI-XhoI-katkaistua pJDB207/PHO5-TPA18-vektorifragmenttia ja 200 femtomoolia kumpaakin kahdesta muusta liitännäisfragmentista (1 ja 2) liitetään yhteen 10 jil:ssa liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgC^, 10 mM DTT:tä, 2 mM ATP:tä ja 0,5 ^ig liivatetta, 400 yksikön kanssa T4 DNA-ligaasia 16 tuntia 15°C:ssa. Reaktio pysäytetään inkuboimalla 10 minuuttia 65°C:ssa. 5 ui:11a tätä yhteenliittämisseosta ' ++ transfromoidaan \ E. coll HB101 Ca -solut. Poimitaan 10 amp -pesäkettä ja DNA valmistetaan nopealla eristys-menetelmällä. Kun analysoidaan katkaisemalla EcoRI:llä, Pstl:llä ja BamHI-Hindlll:11a, havaitaan oikeankokoiset fragmentit. Yhtä kloonia kasvatetaan 100 mlrssa LB-alus-taa, joka sisältää 100 jig/ml ampisilliinia. Plasmidi-DNA eristetään ja sille annetaan nimeksi pJDB207/PHO5-I-TPA.

tl 61 100106

Esimerkki 7: Plasmidin pCS!6/UPA rakentaminen, joka sisältää u-PA:ta koodittavan alueen A) Plasmidin pCS16 rakentaminen (ks. kuva 20)

Plasmidin pUN121 (B. Nilsson et ai., Nucl. Acids. Res. 11, 8019-8030 (1983)) 1,5 ke:n PstI-BamHI-fragmentti, joka sisältää lambda-faagin cl-geenin ja osan tetrasyk-liiniresistenssigeenistä, kloonataan plasmidiin pUC18 (J. Norrander et ai., Gene 2$ 101-106 (1983)), joka on katkaistu Pstl:llä ja BamHI:llä. Saatu klooni katkaistaan Pstlrllä. Yli ulottuvat 3'-päät poistetaan reaktiolla T4 DNA-polymeraasin kanssa ja tasaisiin päihin liitetään Xhol-kytkijät. Kun on katkaistu Xholrllä, molekyyli liitetään uudestaan renkaaksi. Yhteenliittä-misseoksen erällä transformoidaan Ca++:lla käsitellyt E. coli HBlOl-solut. Yksittäisten ampisilliinille resistenttien transformoituneiden pesäkkeiden DNA analysoidaan. Valitaan yksi useista oikeista klooneista ja sille annetaan nimeksi pCS16.

B) Plasmidin PCS16/UPA rakentaminen (ks. kuva 21)

Urokinaasin cDNA sisältyy plasmidiin pcUK176 (ks. esimerkki 2) ja se alakloonataan plasmidiin pCS16. Alakloonattu cDNA ulottuu luetuksi tulemattoman 5’-alueen Smal-kohdasta (kuva 4) luetuksi tulemattoman 3'-alueen PvuII-kohtaan, joka on nukleotidiasemissa 1439-1444 (numerointi kuvan 3 mukainen).

15 jig plasmidia pcUK176 katkaistaan PvuII:11a.

379 ep:n PvuII-fragmentti eristetään muista fragmenteista 1,5-prosenttisessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin, pH 8,3. DNA elektroelu-oidaan, puhdistetaan DE52-ioninvaihtokromatografialla (Whatman) ja saostetaan etanolilla. 1,2 jig yksisäikeis-tä Xhol-kytkijää (5'-CCTCGAGG-3') fosforyloidaan 5'-päästään, kuumennetaan 10 minuuttia 75°C:ssa, annetaan emäspariutua itsensä kanssa huoneenlämpötilaan jäähdytettäessä ja varastoidaan -20°C:ssa. 0,9 jig kinasoitua, 62 100106 kaksisäikeistä Xhol-kytkijää liitetään 80-kertaisena molaarisena ylimääränä pcUK176:n 379 ep:n PvuII-fragmentin tasaisia päitä (ks. edellä) 20 plrssa liuosta, jossa on 60 mM tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl^, 5 mM DTT:tä, 3,5 mM ATP:tä ja 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs), inkubointiajan ollessa 16 tuntia 15°C:ssa. Seosta kuumennetaan 10 minuuttia 85°C:ssa. Ylimääräiset kytkijä-molekyylit poistetaan seostamalla 0,54 tilavuudella isopropanolia siten, että läsnä on 10 mmol/1 EDTA:ta ja 300 mM natriumasetaattia, pH 6,0, saostusajan ollessa 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. DNA katkaistaan XhoI: llä ja BamHI:llä. 121 ep:n BamHI-XhoI-fragmentti eristetään 1,5-prosenttisessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin, pH 8,3. 6 jig plasmidia pcUK176 katkaistaan Smal:llä ja BamHI:llä. 1,3 ke:n Smal-BamHI-fragmentti, joka sisältää suurimman osan u-PA:ta koodittavasta sekvenssistä, eristetään. 6 ^ig plasmidia pCS16 katkaistaan Smal:llä ja XhoI:llä. 2,7 ke:n vektorifragmentti eristetään. DNA-fragmentit elektro-eluoidaan geelistä ja saostetaan etanolilla. 0,2 piko-moolia 1,3 ke:n Smal-BamHI-fragmenttia, 0,2 pikomoolia 121 ep:n BamHI-XhoI-fragmenttia (nämä molemmat fragmentit muodostavat yhdessä täyden u-PAita koodattavan sekvenssin) ja 0,1 pikomoolia 2,7 ke:n vektorifragmenttia liitetään yhteen 10 jil:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.

HC1, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT:tä, 3,5 mM ATP:tä ja 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia, 15°C:ssa. 1 ^il:n erä ja 3 ui:n erä yhteenliittämisseosta lisätään 100 '++ jalzaan Ca :11a käsiteltyjä E. coli HBlOl-soluja. Trans-formointi suoritetaan julkaisussa A. Hinnen et ai.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA T5, 1929 (1978) kuvatulla tavalla. 12 ampisilliiniresistenttfi pesäkettä kasvatetaan LB-alustassa, joka sisältää 100 mg/1 ampisillii-niä. DNA eristetään menetelmällä Holmes et ai., Anal. Biochem. 114, 193 (1981) ja analysoidaan katkaisemalla EcoRI:llä, PvuII:lla ja XhoI:llä. Yhdelle kloo- il 63 100106 nille, jossa on halutut restriktiofragmentit, annetaan nimeksi pCS16/UPA.

Esimerkki 8: Plasmidin pJDB207/PHO5-I-UPA (kuva 22) rakentaminen pJDB207/PHO5-I-UPA sisältää PH05-promoottorin, invertaasin signaalisekvenssin, kypsää urokinaasia koo-dittavan sekvenssin ja PH05:n transkriptionlopettajan peräkkäin ryhmitellysti hiivan ilmentämisvektoriin pJDB207 kloonattuina.

20 pg plasmidia pCS16/UPA katkaistaan täysin 40 yksiköllä EcoRI:tä. Kun on uutettu fenolilla ja saostettu etanolilla, DNA katkaistaan vielä Taqlrllä 65°C:ssa.

Saadut fragmentit erotetaan toisistaan preparatiivises-sa 1,2-prosenttisessa agaroosigeelissä. 462 ep:n Taql-

EcoRI-fragmentti eristetään elektroeluutiolla geelistä ja saostetaan etanolilla.

Oligodeoksiribonukleotidikytkijä, jonka kaava on seuraava (I) 5'-CTGCAAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCAT-3 * (II) 3'- TCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGC-5' liitetään DNA-fragmentin TaqI-kohtaan. Kytkijä palauttaa kypsää u-PA:ta koodittavan sekvenssin 5’-pään (nukleotidit 130-154, kuva 3) ja saa aikaan lukuvaihes-tuksessa olevan liittymisen invertaasin signaalisekvens-siin. Kytkijän 5*-CTGCA-sekvenssi täyttää Hgal-katkai-sulla syntyneen invertaasin signaalisekvenssin sisenty-neen 3'-pään.

300 pikomoolia kutakin oligodeoksinukleotidia I ja II fosforyloidaan ja ne emäspariutetaan. 5,25 yUg (600 pmol) fosforyloitua kaksisäikeistä kytkijä-DNA: ta liitetään 1,7 yug:aan (5,6 pmol) 462 ep:n Taql-EcoRI-fragmenttia (ks. edellä) 175 pulissa liuosta, jossa on 60 mM tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATPrtä, 5 mM DTT:tä ja 800 yksikköä T4 DNA-ligaasia, inkubointi-ajan ollessa 10 minuuttia 85°C:ssa. Ylimääräiset kytki- 64 100106 jät poistetaan saostamalla siten, että läsnä on 10 mmol/1 EDTA ja 300 mM natriumasetaattia, pH 6,0 sekä 0,54 tilavuutta isopropanolia. DNA katkaistaan Pstl:llä. Eristetään yksi ainut 312 ep:n fragmentti, joka sisältää kytkijän liittyneenä DNA-sekvensseihin, jotka kooditta-vat u-PA:ta nukleotidiin 436 asti (Pstl-kohta, ks. kuva 3). DNA-fragmentti puhdistetaan elektroeluutiolla ja etanolisaostuksella.

Plasmidi pCS16/UPA katkaistaan XhoI:llä ja Pstl:llä. 1007 ep:n Pstl-XhoI-fragmentti eristetään ja puhdistetaan. Tämä fragmentti sisältää urokinaasia koodittavan sekvenssin suurimman osan.

Plasmidi p31RIT-12 (ks. esimerkki 6B) katkaistaan Sall:llä ja XhoI:llä. 882 ep:n Sali-Xhol-fragmentti eristetään geelistä elektroeluuutiolla ja etanolisaostuksella. Fragmentti katkaistaan vielä BamHI:llä ja Hgal:llä. 591 ep:n BamHI-Hgal-fagmentti eristetään. Tämä fragmentti sisältää PH05-promoottorialueen ja invertaasin signaalisek-venssin.

Plasmidi pJDB207/'PHO5-TPA18 (ks. eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 143 081) katkaistaan BamHI:llä ja XhoI:llä. 6,8 ke:n vektorifragmentti eristetään preparatiivisessa 0,6-prosenttisessa agaroosigeelissä, joka on tehty tris-asetaattipuskuriin, pH 8,2. DNA elektroeluoidaan ja saostetaan etanolilla.

Kukin DNA-fragmentti uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,1 pmol/^ul. 0,2 pikomoolia 591 ep:n BamHI-Hgal-fragmenttia, 0,2 pikomoolia 312 ep:n Hgal-Pstl-fragmenttia, 0,2 pikomoolia 1007 ep:n Pstl-XhoI-fragmenttia ja 0,1 pikomoolia 6,8 ke:n BamHI-XhoI-vektorifragmenttia ·, liitetään yhteen 15 tunnin ajan 15°C:ssa 10 ^il:ssa liuos ta, jossa on 50 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgC^, 5 mM DTT:tä, 1 mM ATP:tä ja 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia.

Yhdellä mikrolitralla yhteenliittämisseosta transformoidaan

++ R

E. coli HB101 Ca -solut. 12 amp -pesäkettä poimitaan ja kasvatetaan LB-alustassa, joka sisältää 100 mg/1 ampisilliiniä. DNA valmistetaan nopealla eristysmenetelmäl- ti 65 100106 lä (D.S. Holmes et ai., Anal. Biochem. 114, 193 (1981)).

Kun plasmidi-DNA katkaistaan HindIII:lla ja EcoRI:llä, havaitaan odotetut fragmentit. Yhden kloonin plasmidi-DNA valitaan ja sille annetaan nimeksi pJDB207/PHO5-I-UPA.

Esimerkki 9: Plasminogeenin t-PA/u-PA-yhdistelmäaktivaat- tori, ]ossa on t-PA:n A-ketjun osakokonaisuudet ja u-PA:n B-ketju (primäärinen DNA-rakenne)

Vielä eräs tapa rakentaa lukuvaiheistuksessa oleva yhdistelmä DNA-sekvensseistä, jotka koodittavat t-PA:n A-ketjua ja u-PA:n B-ketjua halutuissa asemissa koostuu kahdesta vaiheesta: Ensin liitetään yhteen edulliset restriktiofragmentit, joissa on koodittavat sekvenssit. DNA valmistetaan E. colissa ja alakloona-taan Ml3:ssa, jotta saadaan yksisäikeiset templaatit. Toisessa vaiheessa poistetaan ylimääräiset nukleotidisek-venssit in vitro-mutatoinnilla. t-PA:n A-ketjun ja u-PA:n B-ketjun tarkka lukuvaiheistuksessa oleva liitoskohta on aktivointikohdassa. Mutantti-DNA alakloonataan sopivassa hiivan ilmentämisvektorissa ja nisäkässolulin-joissa.

a) t-PA:n A-ketjua koodittavan DNA-fragmentin eristämi-- - ne n 10 ^ag plasmidia pJDB207/PHO5-I-TPA (ks. esimerkki 6) katkaistaan BamHE:llä ja PvuIIrlla. 1,7 ke:n BamHI-Pvull-fragmentti erotetaan 0,8-prosenttisessa agaroosigee-lissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin, pH 8,3. Tämä DNA-fragmentti sisältää PH05-promoottorin, invertaasin signaalisekvenssin ja kypsää t-PA:ta PvuII-katkaisukohtaan asti koodittavan sekvenssin (ks. kuva 1: nukleotidit asemissa 1305 - 1310). DNA elektroeluoi-daan, saostetaan etanolilla ja uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,1 pmol/|il.

66 100106 b) u-PA:n B-ketjua koodittavan DNA-fragmentin eristäminen

Plasmidi pCS16/UPA (ks. esimerkki 7B) katkaistaan Ball:llä (ks. kuvat 3 ja 4, nukleotidit asemissa 573 - 578) ja XhoI:llä. 868 ep:n Ball-XhoI-fragmentti eristetään edellä kuvatulla tavalla ja uudelleensuspen-doidaan veteen pitoisuuteen 0,1 pmol/^il.

c) Fragmenttien liittäminen vektorifragmenttiin

Plasmidi pJDB207/PHO5-TPAl8 (eurooppalainen patenttihakemus julkaisu no. 143 081) katkaistaan BamHI:llä ja Xholrllä. 6,7 ke:n vektorifragmentti eristetään 0,8-prosenttisessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-asetaattipuskuriin, pH 8,2. DNA elektroeluoidaan, saos-tetaan etanolilla ja uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,1 pmol/yrl.

0,2 pikomoolia 1,7 ke:n BamHI-PvuII-fragmenttia, 0,2 pikomoolia 868 ep:n Ball-Xhol-fragmenttia ja 0,1 pikomoolia 6,7 ke:n BamHI-XhoI-vektorifragmenttia liitetään yhteen 10 ^il:ssa liuosta, joka sisältää 60 mM Tris-HC1, pH 7,5, 10 mM MgCl^, 5 mM DTT:tä, 3,5 mM ATP:tä ja 400 yksikköä T4-DNA-ligaasia (Biolabs), inkubointiajan ollessa 16 tuntia 15°C:ssa. 1 ul:n ja 3 ul:n erät yhteen- ++ liittämisseosta lisätään 100 ^ul:aan Ca :11a käsiteltyjä E. coli HBlOl-soluja. Transformointi suoritetaan tavalliseen tapaan.

Kuusi transformoitunutta, ampisilliiniresistenttiä pesäkettä kasvatetaan LB-alustassa, joka sisältää 100 mg/1 ampisilliiniä. Plasmidi-DNA valmistetaan julkaisussa Holmes et ai., Analyt. Biochem. 114, 193 (1981) kuvatulla menetelmällä ja analysoidaan suorittamalla katkaisut BamHI:llä ja Pstl:llä. Yhdelle kloonille, jossa on halutut restriktiofragmentit, annetaan nimeksi pJDB207/ PHOS-I-TPA^PA®.

Il 67 100106

Esimerkki 10: Plasminoqeenin u-PA/t-PA-yhdistelmäakti- vaattori, jossa on u-PA:n A-ketjun osakokonaisuudet ja t-PA:n B-ketju (primäärinen DNA-rakenne)

Primäärinen yhdistelmä-DNA-rakenne sisältää u-PA:n nukleotidisekvenssit Smal-kohdasta EcoRI-kohtaan (ks. kuva 4) liitettynä t-PA:n nukleotidisekvensseihin, jotka ulottuvat Scal-kohdasta (asemat 940-945) Xhol-kohtaan, joka on tuotu asemaan 1800 Xhol-kytkijän muodossa. Näin saatu yhdistelmä-DNA-sekvenssi sisältää ylimääräisiä nukleotideja, jotka poistetaan in vitro-mutatoinnilla. Tarkka lukuvaiheistuksessa oleva u-PA:n A-ketjun ja t-PA:n B-ketjun liitoskohta on aktivointikohdassa.

a) u-PA:n A-ketjua koodittava DNA-fragmentti: 7 jig plasmidia pCS16/UPA katkaistaan EcoRI:llä. Saatujen kolmen fragmentin epätasaiset päät muutetaan tasaisiksi täyttöreaktiolla käyttämällä 7,5 yksikköä Klenow DNA-polymeraasia (BRL) 30 minuutin reaktiossa 25°C:ssa siten, että läsnä on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 0,1 mM dATP:tä ja 0,1 mM dTTPrtä. Reaktio pysäytetään lisäämällä EDTAzta lopulliseen pitoisuuteen 12,5 mmol/1. DNA katkaistaan vielä Kpnlrlla. 619 ep:n Kpnl-tasapäinen (EcoRI) fragmentti eristetään 1,5-prosent-tisessa agroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3, elektroeluoidaan ja saostetaan etanolilla.

b) t-PA:n B-ketjua koodittavan DNA-fragmentin eristäminen 6 jig pJDB207/PHO5-TPA18-fragmenttia katkaistaan Scalrllä ja XhoI:llä. 860 ep:n fragmentti eristetään 1,2-prosenttisessa Tris-boraatti-EDTA-puskurissa, pH 8,3, elektroeluoidaan ja saostetaan etanolilla.

68 100106 c) DNA-fragmenttien liittäminen pUC18:sta johdettuun vektoriin: 5 pg plasmidia pCS16/UPA (ks. esimerkki 7) katkaistaan Kpnl:llä ja XhoI:llä. Saatu 2,7 ke:n fragmentti eristetään 0,8-prosenttisessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin, pH 8,3. DNA elektroeluoidaan ja saostetaan etanolilla. Kaikki DNA-fragmentit uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,1 pmol/pl.

0,2 pikomoolia 619 ep:n Kpn-tasapäistä u-PA-frag-menttia, 0,2 pikomoolia 860 ep:n Scal-XhoI-t-PA-fragment-tia ja 0,1 pikomoolia 2,7 ke:n Kpnl-XhoI-fragmenttia liitetään yhteen edellä kuvatulla tavalla (esimerkki 9). Ca++:lla käsitellyt E. coli HBlOl-solut transformoidaan. 12 transformoitunutta, ampisilliiniresistenttiä pesäkettä kasvatetaan LB-alustassa, joka on täydennetty ampisilliinillä (100 mg/1). DNA valmistetaan Holmes et al:n (supra) menetelmällä ja analysoidaan suorittamalla katkaisut EcoRIrllä ja Pstlrllä. Yhdelle kloonille, jossa on halutut restriktiofragmentit, annetaan nimeksi pCS16/UPA^TPA®.

Esimerkki 11: Plasminogeenin u-PA/t-PA-yhdistelmäakti- . vaattori, jossa on t-PA:n toinen kringlealue ja B-ketju (primäärinen rakenne)

Plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorigeeni, joka sisältää urokinaasin "kasvutekijänkaltaisen" U-alueen, t-PA:n toisen kringlealueen (^) 3a ^ΡΑ:η katalyyttisen B-ketjun, rakennetaan seuraavalla tavalla: Kaksi resktriktioentsyymeilä saatua DNA-fragmenttia, joista toinen koodittaa u-PA:n kasvutekijäaluetta ja toinen t-PA:n ^-kringlealuetta ja B-ketjua, liitetään yhteen ja sijoitetaan plasmidiin pCS16. Saadulle kloonille annetaan nimeksi pCSlö/U^TPA . Fragmentti, joka sisältää u-PA:n ja t-PA:n koodittavat sekvenssit, alakloo-nataan M13:een. In vitro-mutatointi suoritetaan yksi-

II

69 1 00 1 06 säikeiselle DNA:lie, jotta saadaan poistetuksi ylimääräiset DNA-sekvenssit u-PA:n sekvenssin ja t-PA:n sekvenssien välisestä liitoskohdasta.

5 |ig plasmidia pCS16/UPA katkaistaan NcoI:llä (nukleotidit asemissa 326 - 331, ks. kuva 4). Restrik-tiofragmenttien epätasaiset päät täytetään inkuboimal-la 30 minuuttia huoneenlämpötilassa 50 pl:n reaktiossa, joka sisältää 5 yksikköä Klenow DNA-polymeraasia I (BRL) siten, että läsnä on dATP:tä, dTTPrtä, dCTPrtä ja dGTP:tä (kutakin 0,1 mM), 60 mM Tris.HCl pH 7,5, ja 10 mM MgC^. Reaktio pysäytetään lisäämällä EDTA:ta lopulliseen pitoisuuteen 12,5 mmol/1. DNA saostetaan etanolilla ja katkaistaan vielä XhoI:llä. 3 ke:n Xhol-tasa-päinen fragmentti (Ncol) eristetään 0,8-prosenttisessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA:han, pH 8,3, elektroeluoidaan ja saostetaan etanolilla.

Tämä fragmentti sisältää pCS16-vektorin ja u-PA:n kasvute-kijäaluetta koodittavan sekvenssin. 10 jig plasmidia pJDB207/PHO5-TPA18 (eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 143 081) katkaistaan BstXIillä (nukleotidit asemissa 577 - 588). Lineaarista DNA-fragmenttia, jossa on ulostyöntyvät 3'-päät, inkuboidaan 2,5 minuuttia 37°C:ssa 10 yksikön kanssa T4 DNA-polymeraasia (BRL) 100 yulrssa liuosta, jossa on 33 mM Tris-asetaat-tia, pH 7,9, 66 mM kaliumasetaattia, 10 mM magnesiumase-taattia, 0,5 mM DTT:tä ja 0,1 mg/ml naudan seerumialbu-miinia. Sitten inkubointia jatketaan 35 minuuttia 37°C:ssa 200 jil:n kokonaistilavuudessa siten, että läsnä on dATP:tä, dCTP:tä, dTTPrtä ja dGTPrtä (0,1 mM kutakin). DNA saostetaan etanolilla ja katkaistaan vielä Xholillä.

1,2 ke:n tasapäinen (BstXI)-XhoI-fragmentti erotetaan 0,8-prosenttisessa agaroosigeelissä, elektroeluoidaan ja saostetaan etanolilla. Tämä fragmentti sisältää t-PA:n i^ita ja B-ketjua koodittavan sekvenssin.

0,2 pikomoolia 1,2 ke:n t-PA-fragmenttia ja 0,1 pikomoolia 3 ke:n u-PA/vektorifragmenttia (ks. edellä) 70 1 00 1 06 liitetään yhteen edellä kuvatulla tavalla. Yhteenliit-tämisseoksen erillä transformoidaan transformointikel-poiset E. coli HBlOl-solut. Ampisilliiniresistentit pesäkkeet valitaan LB-agar-maljoissa, joissa on 100 mg/1 ampisilliiniä. Yksittäisistä tranformanteista valmistetaan DNA ja se analysoidaan katkaisemalla Scal:llä ja Smal:llä. Klooni, joka sisältää 0,5 ke:n Scal-liitos-fragmentin ja 1,55 ke:n Smal-liitosfragmentin valitaan ja sille annetaan nimeksi pCS16/UK 2TPA ·

Esimerkki 12: Plasminogeenin t-PA/u-PA-yhdistelmäakti- vaattori, jossa on t-PA:n toinen kringlealue ja u-PA:n katalyyttinen B-ketju (primäärinen rakenne)

Plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin geeni, joka sisältää urokinaasin "kasvutekijänkaltaisen" (U) osakokonaisuuden, t-PA:n toisen kringlealueen (K2) ja u-PA:n katalyyttisen B-ketjun, rakennetaan samoin kuin esimerkissä 11 on selostettu.

g

Plasmidin pCSl6/URKUPA rakentaminen: 5 jig plasmidia pCS16/UPA katkaistaan Bglllilla ja NcoI:llä (nukleotidit asemissa 391 - 396 ja 326 -331 vastaaavsti, ks. kuva 4). Restriktiofragmenttien • epätasaiset päät täytetään Klenow DNA-polymeraasi I:n (BRL) kanssa suoritetulla reaktiolla, kuten edellä on selostettu. 4,2 ke:n DNA-fragmentti, jossa on tasaiset päät, eristetään 0,8-prosenttisessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-asetaattipuskuriin, pH 8,2. DNA elektroeluoidaan ja saostetaan etanolilla. Tämä fragmentti sisältää u-PA:n G-alueen ja u-PA:n B-ketjun vekto-rimolekyyliin liitettyinä.

10 jig plasmidia p31/PH05-TPA18 (eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 143 081) katkaistaan Alul:llä. 447 ep:n Alul-fragmentti, joka sisältää t-PA:n koko K2-alueen, eristetään 1,5-prosenttisessa

II

71 100106 agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin, pH 8,3. DNA-fragmentti elektroeluoldaan ja saostetaan etanolilla.

0,2 pikomoolia 447 ep:n fragmenttia ja 0,1 piko-moolia 4,2 ke:n fragmenttia liitetään yhteen. Yhteen-liittämisseoksen erillä transformoidaan transformointi-kelpoiset E. coli HBlOl-solut. Transformoituneet solut valitaan LB-agarmaljoissa, joissa on 100 mg/1 ampisil-liiniä. Ampisilliiniresistenteistä soluista valmistetaan DNA ja suoritetaan analyysi katkaisemalla EcoRI.-llä ja Scalrllä. Yhdessä kloonissa, jossa on 551 ep:n EcoRI-fragmentti ja 403 ep:n Scal-fragmentti, on Alul-fragmentti sijoittuneena oikeansuuntaisesti. Tälle kloonille annetaan nimeksi pCSlö/UI^UPA .

Esimerkki 13: Primääristen yhdistelmä-DNA-rakenteiden kloonaaminen M13mpl8:aan A) pJDB207/PHQ5-I-TPa\jPAB BamHI-fragmentin kloonaaminen M13mpl8:aan 1,5 pg plasmidia pJDB207/PHO5-I-TPAAUPAB (ks. esimerkki 9), joka on saatu nopealla DNA:nvalmistuksella, katkaistaan 9 yksiköllä BaHI:tä (Boehringer) 20 yl:ssa liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl ja 6 mM merkaptoetanolia, inkubointiajän ollessa 1 tunti 37°C:ssa. Sen jälkeen lisätään 1 jil RNaasia (Serva, 1 mg/ml), inkuboidaan 15 minuuttia 37°C: ssa ja fenoloidaan ja 2,5 ke:n liitännäinen erotetaan 0,8-prosenttisessa preparatiivisessä agaroosigeelissä.

DNA uutetaan elektroeluutiolla ja saostetaan.

1 jig M13mpl8 (RF) katkasitaan BamHI:llä, käsitellään vasikan suolen emäsfosfataasilla ja 7,3 ke:n vektori- fragmentti eristetään 0,7-prosenttisessa preparatiivises-sa agaroosigeelissä. DNA elektroeluoidaan ja saostetaan.

100 pikomoolia BamHI:llä katkaistua M13mpl8-vekto-ria ja 200 pikomoolia BamHI-TPA^HjPA8-liitännäistä liite-• tään yhteen 10 ^u^ssa liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl 72 1 00 1 06 pH 7,5, 10 mM MgC^, 10 mM DTT: ta, 2 mM ATP:tä ja 0,5 jag liivatetta, käyttämällä 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia ja 7 tunnin inkubointiaikaa 15°C:ssa. Kun on inkuboitu 10 minuuttia 65°C:ssa, 5 ^ul tätä yhteenliittämisseos-ta käytetään transformointikelpoisten E. coli JM101-so-lujen transformointiin käsikirjassa "M13 Cloning and sequencing handbook" (julkaisija Amersham) mukaisesti. Poimitaan 36 väritöntä plakkia ja valmistetaan yksi-säikeinen ja replikoituva (RF) DNA-muoto. RF-DNA:n analyysi osoittaa, että kaikissa klooneissa on oikean-kokoinen liitännäinen, kun katkaistaan BamHIrllä. Oikean-kokoiset fragmentit, jotka saadaan EcoRI- ja Pstl-katkai-sun jälkeen, osoittavat, että kaikissa klooneissa DNA-liitännäiset ovat väärässä suunnassa (yksisäikeinen templaatti-DNA on koodittamaton säie). Yhdelle näistä klooneista annetaan nimeksi mpie/BamHI/TPA^UPA® ja sitä käytetään deleetiomutatointiin.

B. pCSie/UPA^TPA^in Kpnl-HindiII-fragmentin kloonaaminen M13mpl8:aan 1,5 ^ig pCSie/UPA^TPA®:tä (ks. esimerkki 10), joka on saatu nopealla DNAmvalmistuksella, katkaistaan 12 yksiköllä Kpnl:tä 20 ^il:ssa liuosta, joka sisältää 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgC^ ja 6 mM merkaptoetanolia, inkubointiajan ollessa 1 tunti 37°C:ssa. Sen jälkeen lisätään 1 yul 1 M NaCl-liuosta, DNA katkaistaan 12 yksiköllä HindIII:a reaktioajan ollessa 1 tunti 37°C:ssa.

1,5 ke:n fragmentti eristetään 0,8-prosenttisessa prepa-ratiivisessa agaroosigeelissä. DNA uutetaan elektro-eluutiolla ja saostetaan.

0,5 jig M13mpl8:aa (RF) katkaistaan Kpnl:llä ja Hindlll:11a. 7,3 kein vektorifragmentti eristetään 0,7-prosenttisessa preparatiivisessa agaroosigeelissä.

DNA elektroeluoidaan ja saostetaan.

100 femtomoolia Kpnl-Hindlll:11a katkaistua M13mpl8-vektoria ja 200 femtomoolia Kpnl-HindiII-liitän- n 73 100106 näistä liitetään yhteen 10 (ul:ssa liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT:tä, 2 mM ATP:tä ja 0,s jig liivatetta, käyttämällä 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia ja 7 tunnin inkubointiaikaan 15°C:ssa. Reaktio pysäytetään inkuboimalla 10 minuuttia 65°C:ssa.

5 n1:11a tätä yhteenliittämisseosta transformoidaan trans-formointikelpoiset E. coli JMlOl-solut. Poimitaan värittömät plakit ja valmistetaan yksisäikeinen ja repli-koituva (RF) DNA-muoto. RF-DNA:n analyysi osoittaa, että kaikissa klooneissa on oikea liitännäinen ja oikean-kokoiset fragmentit. Yhdelle näistä klooneista annetaan nimeksi mplS/Kpnl-Hindlll/UPA^PA0 ja sitä käytetään deleetiomutatointiin.

O

C. pCS16/UKITPA ;n Kpnl-Hindlll-fragmentin kloonaaminen M13mpl8:aan g 1,5 ^ig plasmidia pCS16/UK2TPA (ks. esimerkki 11), joka on saatu nopealla DNA:nvalmistusmenetelmällä, katkaistaan 12 yksiköllä Kpnlrtä (Boehringer) 20 piissä liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2 ja 6 mM merkaptoetanolia, inkubointiajan ollessa 1 tunti 37°C:ssa. Sen jälkeen lisätään 1 yul 1 M NaCl-liuosta, DNA katkaistaan 12 yksiköllä HindIII:a 1 tunnin reaktiolla 37°C:ssa. 1,5 ke:n fragmentti eristetään 0,8-prosentti- sessa preparatiivisessa agaroosigeelissä. DNA uutetaan elektroeluutiolla ja saostetaan.

0,5 ^xg plasmidia Ml3mpl8 (RF) katkaistaan Kpnlrllä ja HindIII:lla. 7,3 ke:n vektorifragmentti eristetään 0,7-prosenttisessa preparatiivisessa agaroosigeelissä.

DNA elektroeluoidaan ja saostetaan.

100 femtomoolia Kpnl-Hindll:11a katkaistua M13mpl8-vektoria ja 200 femtomoolia Kpnl-Hindlll-liitännäistä liitetään yhteen 10 yul:ssa liuosta, jossa on 50 mM Tris. HC1 pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT:tä, 2 mM ATP:tä ja 0,5 jdg liivatetta, käyttämällä 400 yksikköä T4DNA-li-. gaasia ja 7 tunnin reaktioaikaa 15°C:ssa. Reaktio pysäy- 100106 tetään inkuboimalla 10 minuuttia 65°C:ssa. 5 piillä tätä yhteenliittämisseosta transformoidaan transformointi-kelpoiset E. coli JMlOl-solut. Poimitaan 7 väritöntä plakkia ja valmistetaan yksisäikeinen ja replikoituva (RF) DNA-muoto. RF-DNA;n analyysi osoittaa, että kaikissa klooneissa on oikeankokoinen liitännäinen ja oikean-kokoiset fragmentit. Yhdelle näistä klooneista annetaan niineksi mpl 8/Kpnl-Hindi II/IHOTPA ja sitä käytetään deleetiomutatointiin.

D. pCS16/UK2UPAB:n Kpnl-HindiII-fragmentin kloonaaminen M13mpl8:aan a 1,5 pg plasmidia PCSI6/UK2UPA (ks. esimerkki 12), joka on saatu nopealla DNA:nvalmistuksella, katkaistaan 12 yksiköllä Kpnl:tä 20 piissä liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgC^ ja 6 mM merkaptoetano-lia, inkubointiajan ollessa 1 tunti 37°C:ssa. Kun on lisätty 1 jil 1 M NaCl-liuosta, DNA katkaistaan 12 yksiköllä Hindulta reaktioajan ollessa 1 tunti 37°C:ssa. 1,7 kein fragmentti eristetään 0,8-prosenttisessa preparatiivi-sessa agaroosigeelissä. DNA uutetaan elektroeluutiolla ja saostetaan.

0,5 pg M13mpl8iaa (RF) katkaistaan Kpnlillä ja Hindlllilla. 7,3 kein vektorifragmentti eristetään 0,7-prosenttisessa preparatiivisessa agaroosigeelissä.

DNA elektroeluoidaan ja saostetaan.

100 femtomoolia Kpnl-Hindlll:11a katkaistua vektoria ja 200 femtomoolia Kpnl-Hindlll-liitännäistä liitetään yhteen 10 piissä liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^, 10 mM DTTitä, 2 mM ATPitä ja 0,5 pg liivatetta, käyttämällä 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia ja 7 tunnin reaktioaikaa 15°Cissa. Reaktio pysäytetään inkuboimalla 10 minuuttia 65°Cissa. 5 piillä tätä yhteenliittämisseosta transformoidaan transformointikelpoiset E. coli JMlOl-solut. Poimitaan 10 väritöntä plakkia ja valmistetaan yksisäikeinen ja replikoituva (RF) DNA-

II

75 1 00 1 06 muoto. RF-DNA:n analyysi osoittaa, että kaikissa klooneissa on oikeankokoinen liitännäinen 3a oikeankokoi-set fragmentit. Yhdelle näistä klooneista annetaan nimeksi mpie/Kpnl-Hindlll/U^UPA ja sitä käytetään deleetiomutatointiin.

Esimerkki 14: Primääristen yhdistelmä-DNA-rakenteiden deleetiomutatointi A) Deleetiomutatoinnin yleispiirteet a) Mutatoivan alukkeen fosforylointi:

Mutatoinnin suorittamista varten fosforyloidaan 200 pikomoolia mutatoivaa aluketta 20 pl:ssa liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^, 5 mM DTTrtä, 0,1 mM spermidiiniä, 0,1 mM EDTA.-ta, ja joka sisältää 1 ^ul:n 10 mM ATP-liuosta, käyttämällä 8 yksikköä T4-poly-nukleotidikinaasia (Boehringer, 8 yksikköä/^il). Kun on inkuboitu 1 tunti 36°C:ssa, reaktio pysäytetään kuumentamalla 10 minuuttia 65°C:ssa.

Hybridisoitumisen seulontaa varten 20 pikomoolia mutatointialuketta fosforyloidaan kuten edellä käyttämällä 30 jiCi ^^P-ATP:tä (3000 Ci/mmol; Amersham International) ainoana ATP-lähteenä. Aluke laimennetaan 3,5 ml:11a 6 x SSC-liuosta ja käytetään suoraan koettimena.

b) Mutatointialukkeen ja universaalialukkeen emäspariu-tus yksisäikeiseen templaattiin 0,2 pikomoolia yksisäikeistä templaattia inkuboi-daan 20 pikomoolin kanssa fosforyloitua, mutatoivaa oligodeoksiribonukleoitidialuketta (10 pmol/^il) ja 10 .. pikomoolin kanssa universaalista M13-sekventointialu- ketta 5 minuuttia 95°C:ssa 10 jilzssa liuosta, jossa on 20 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^, 50 mM NaCl ja 1 mM DTT:tä. Liuoksen annetaan 30 minuutin aikana hitaasti jäähtyä huoneenlämpötilaan.

76 100106 c) Jatkamis-yhteenliittämisreaktio

Edellä saatuun emäspariutettuun seokseen lisätään 10 p.1 entsyymi-dNTP-liuosta (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), joka sisältää 1 ^il:n puskuria (0,2 M Tris.HCl pH 7,5, 0,1 M MgCl2, 0,1 M DTT:tä) , 4 jil 2,5 mM dNTP-seosta, 1 jil 10 mM ATP-liuosta, 0,5 ^il T4 DNA-ligaasia (Biolabs, 400 yksikköä/pl) ja 0,67 jil Klenow DNA-polymeraasia (BRL, 2,99 yksikköä/yal). Seosta inkuboidaan 1 tunti 15°C:ssa ja sen jälkeen 16 tuntia 8-9°C:ssa. Reaktio pysäytetään inkuboimalla 10 minuuttia 65°C:ssa.

d) Transformointi yhteenliittämisseoksella:

Yhteenliittämisseos laimennetaan suhteessa 1:20 ja 1:200 TE-puskurilla ja 1 ja 5 jil:lla kutakin näistä laimennoksista transformoidaan 0,2 ml E. coli BMH 71-18mutS:n korjausmiinuskantaa (BMH71-18( AIac-proAB), thi, supE, F'lacig, ΖΔΜ15, proA+B+), joka on tehty trans-formointikelpoiseksi. E. coli BMH71-18mutS:n (BMH71-18, mutS215::Tnio) rakentaminen on selostettu julkaisussa Kramer et ai., Cell 38, 879-887 (1984)). Transfektoin-nin jälkeen ruohomattosolut muodostetaan E. coli JM101:n korjauspluskantana, jotta saadaan minimoiduksi faagin joutuminen alttiiksi korjausmiinuskantojen mutaattori-fenotyypille (P. Carter, H. Bedouelle ja G. Winter,

Nucl. Acids. Res. 13, 4431-4443 (1985)).

e) Faagien seulonta

Transfektoidusta DNA:sta syntyneet 100 plakkia poimitaan hammastikuilla YT-maljoihin ja kasvatetaan • infektoituneiden bakteerien pesäkkeinä 15 - 18 tuntia.

Pesäkkeiden blottaus suoritettiin Grunsteinin ja Hognessin menetelmän sovellutuksella (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72, 3961-3865 (1985)). Nitroselluloosakalvo (Millipore S.A. , katalogin numero HAWP 090, huokoskoko 0,45 jim), sijoitetaan pesäkemaljan päälle 10 minuutiksi huoneenläm- 11 77 100106

Potilassa. Kalvot denaturoidaan 0,5 N NaOH-liuoksella, neutraloidaan 1 M Tris-HCl-liuoksella, jonka pH on 7,5, ja sen jälkeen käsitellään väkevällä suolaliuoksella (0,5 M Tris.HCl pH 7,5 + 1,5 M NaCl). Kalvoja paistetaan vakuumissa 30 minuuttia 80°C:ssa ja esihybridisoidaan 100 ml:ssa liuosta, jossa on 10 x Denhardt'in liuosta (D.T. Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Commun. 23, 641-646), 6 x SSC ja 0,2 % SDSrää, tiiviisti suljettavassa muovipussisssa 15 minuutin ajan.

Seulontahybridisointia varten esihybridisoituja kalvoja pestään 1 minuutti 50 ml:ssa 6 x SSC-liuosta ja sen jälkeen hybridisoidaan 30 minuuttia 3,5 ml:ssa 32 koetinliuosta, joka sisältää P:llä leimatun mutatointi-alukkeen. Hybridisoidut kalvot pestään kolmesti 100 mlrssa 6 x SSC-liuosta huoneenlämpötilassa pesuajän ollessa kokonaisuudessaan 2 minuuttia ja sen jälkeen autoradiografoidaan. Villityyppisten jää mutatoitunei-den faagien hyvä erottuminen toisistaan saavutetaan pesemällä nopeasti (5 minuuttia) 60°C:ssa 100 mlrssa liuosta, jossa on 0,1 x SSC-pitoisuus ja 0,1 % SDSrää.

f) Deleetiomutaation toteaminen hybridisoinnilla löydetyistä positiivisista klooneista

Positiivisista klooneista poimitaan faagit hammastikuilla 1 ml:aan 2xYT-alustaa, kuumennetaan 20 minuutiksi 70°C:een bakteerien tappamiseksi ja sen jälkeen 100 yulrlla faagisuspensiota ympätään 1,5 ml tuoreesti kasvavaa E. coli JM101-viljelmää (OD6Q0 noin 0,45). viljelmiä ravistellaan voimakkaasti (300 min *) 4 tuntia 37°C:ssa. Positiivisista klooneista valmistetaan faagi-varasto ja replikoituva DNA-muoto (J. Messing, Methods in Enzymology, 101, 21 - 78 (1983)). Mutanttien DNA (deleetiomutatoinnin jälkeen) analysoidaan sopivilla restriktioentsyymeillä ja saatua tulosta verrataan vil-lityyppisen DNA:n (ennen deleetiomutatointia) restriktio-fragmentteihin. Restriktioanalyysillä suoritetun varmistuksen jälkeen yhden oikean mutantin DNA plakkipuh- 78· 100106 distetaan. Mutaatiot varmistetaan vielä restriktioana-lyysillä ja sekventoinnilla ketjunkatkaisumenetelmää käyttäen (F. Sanger, S. Nielen ja A-R. Coulson, Proc.

Natl. Acad. Sei- USA 74, 5463-5467 (1977)).

B) mpl8/BamHI/TPAAUPAB:n deleetiomutatointi (ks. kuva 23)

Deleetiomutatointi suoritetaan kuten menetelmän yleisselostuksessa on kuvattu. Hybridisoinnin avulla sadut positiiviset kloonit varmistetaan restriktioanalyy-sillä. BamHI-fragmentista poistetaan deleetiomutatoin-nilla 333 emäsparia. BamHI:llä suoritettu restriktioana-lyysi vahvistaa 2150 ep:n fragmentin. EcoRI:llä suoritettu toinen restriktioanalyysi antaa mutanteille suoritettuna 660, 416, 287 ja 230 ep:n fragmentit eikä 660, 472, 416 ja 287 ep:n fragmentteja, jotka saadaan villi-tyypistä. Pstlrllä suoritettu analyysi antaa mutanteille kaksi fragmenttia, jotka ovat kooltaan 611 ja 414 emäsparia. Villityyppinen DNA antaa kolme fragmenttia, joiden koot ovat 622, 611 ja 414 emäsparia. Yhdelle mutanttikloonille, jonka rakenne on oikea, annetaan nimeksi mpl8/BamHI/MOTPA^UPA®.

t-PA:n A-ketiun ja u-PA:n B-ketjun välisei liitoskohdan DNA varmistetaan ketjunkatkaisusekventointimenetel-mällä käyttämällä sekventointialuketta, jonka sekvenssi on 5'CAGAGCCCCCCCGGTGC 3' Tämä aluke on komplementaarinen u-PA:n koodittavalle säikeelle (682-666).

C) mplS/Kpnl-Hindlll/UPA^TPA^n deleetiomutatointi (ks. kuva 24)

Deleetiomutatointi suoritetaan kuten menetelmän yleisselostuksessa on kuvattu. Hybridisoinnin avulla saadut positiiviset kloonit varmistetaan restriktioana-: lyysillä, joka suoritetaan Pstlrllä. Mutantissa havai- 79 100106 taan 467 ep:n vyöhyke, kun taas villityyppi antaa 544 ep:n fragmentin. Yhdelle mutantille, jolla on oikea rakenne, annetaan nimeksi mpl8/KpnI-HindIII/MOUPA^TPAB. Deleetio varmistetaan ketjunkatkaisusekventointimenetel-mällä käyttämällä sekventointialuketta, jonka sekvenssi on 5'CAAAGATGGCAGCCTGC 3' Tämä aluke on komplementaarinen t-PA:n koodittavalle säikeelle (1062-1046).

D. mpl8/KnpI-HindIII/UK2TPAB:n deleetiomutatointi (ks. kuva 25)

Deleetiomutatointi suoritetaan kuten menetelmän yleisselostuksessa on kuvattu. Hybridisoinnilla saadut positiiviset kloonit varmistetaan suorittamalla rest-riktioanalyysi Kpnl-Hindlll:11a, EcoRI:llä ja Pstl:llä. Tällöin saadaan seuraavat fragmentit:

Kpnl-HindiII EcoRI PstI

villi- mutantti villi- mutantti villi- mutantti tyyppi tyyppi tyyppi 1475 ep 1284 ep 542 ep 351 ep 622 ep ei 622 ep:n 472 ep 472 ep vyöhykettä

Havaitaan, että mutanteissa on oikeankokoinen liitännäinen ja oikeankokoiset fragmentit. Yhdelle mutanttikloonille, jolla on oikea rakenne, annetaan

D

nimeksi mpl8/Kpnl-HindiII/MOUI^TPA . Deleetio varmistetaan ketjunkatkaisusekventointimenetelmällä käyttämällä sekventointialuketta, jonka sekvenssi on 5'CCCAGTGCCTGGGCACTGGGGTTCTGTGCTGTG3' Tämä aluke on komplementaarinen t-PA:n koodittavalle säikeelle (853-821).

E) mpl8/KpnI-HindIII/UK2UPAB:n deleetiomutatointi (ks. kuva 26) 100106 g UK^UPA :n rakentamisessa tarvitaan kaksi erillistä deleetiomutaatiota.

Ensimmäinen deleetiomutatointi suoritetaan kuten menetelmän yleisselostuksessa on kuvattu. Hybridisoin-nilla saadut positiiviset kloonit varmistetaan suorittamalla restriktioanalyysi EcoRI:llä. Mutanteissa havaitaan 549, 416 ja 351 ep:n vyöhykkeet, kun taas villityyp-pi antaa 549, 452 ja 416 ep:n fragmentit. Yhdelle mutant-tikloonille, jolla on oikea rakenne, annetaan nimeksi mplS/Kpnl-Hindlll/MOUI^UPA®-!. Deleetio varmistetaan ketjunkatkaisusekventointimenetelmällä käyttämällä sekven-tointialuketta, jonka sekvenssi on 5'CCCAGTGCCTGGGCACTGGGGTTCTGTGCTGTG3' Tämä aluke on komplementaarinen t-PA:n koodittaval-le säikeelle (853-821).

Toisessa deleetiomutatointivaiheessa tehdään deleetio samanaikaisesti pistemutaation aikaansaamisen kanssa. Deleetiomutatointi suoritetaan kuten menetelmän yleisselostuksessa on kuvattu. Hybridisoinnilla saadut positiiviset kloonit varmistetaan suorittamalla restriktioanalyysi EcoRI:llä. Mutanteissa havaitaan 416, 351 ja 259 ep:n vyöhykkeet, kun taas villityyppi antaa 549, 416 ja 351 ep:n fragmentit. Yhdelle mutanttikloonille, jolla on oikea rakenne, annetaan nimeksi mpl8/KpnI-

O

HindiII/MOUK2UPA . Deleetio varmistetaan ketjunkatkai-susekventointimenetelmällä käyttämällä sekventointialuket-ta, jonka sekvenssi on 5'CAGAGCCCCCCCGGTGC3’ Tämä aluke on komplementaarinen u-PA:n koodittavalle säikeelle (682-666).

Esimerkki 15: t-PA/u-PA-yhdistelmä-cDNA-rakenteiden kloonaus hiivan ilmentämisvektoriin PJDB207 A) TPAAUPAB-yhdistelmägeenin kloonaus pJDB207:ään RF-DNA valmistetaan mpl8/BamHI/MOTPAAUPAB:tä varten nopealla DNA:neristysmenetelmällä (D.S. Holmes ja M.

81 100106

Quingley, Anal. Biochem. 114, 192-197 (1981)).

RF-DNA (noin 1,5 ^ig) katkaistaan 9 yksiköllä BamHI: tä 20 |il:ssa liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl, pH 7,5, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl ja 6 mM merkaptoetanolia, inku-bointiajan ollessa 1 tunti 37°C. Sen jälkeen lisätään 1 ui RNaasia (1 mg/ml) ja inkuboidaan 10 minuuttia 37°C: ssa ja 2,1 kein liitännäinen eristetään 0,7-prosenttises-sa preparatiivisessa agaroosigeelissä. DNA-liitännäinen uutetaan elektroeluutiolla ja saostetaan etanolilla.

1,5 jiq pJDB207/PHO5-I-TPAAUPAB katkaistaan BamHI: llä, käsitellään vasikan suolen emäsfosfataasilla ja 6,7 kein vektori eristetään. Elektroeluution jälkeen vektori-DNA saostetaan.

100 femtomoolia BamHI:llä katkaistua pJDB207/PHO5-I-TPA^UPA®-vektoria ja 200 femtomoolia TPAAUPAB-liitän-näistä liitetään yhteen 10 piissä liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTTitä, 2 mM ATPitä ja 0,5 jiq liivatetta, käyttämällä 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia ja 8 tunnin inkubointiaikaa 15°C:ssa. Reaktio pysäytetään inkuboimalla 10 minuuttia 65°C:ssa.

5 pulilla tätä yhteenliittämisseosta transformoidaan E. coli HB101 Ca^+-solut (M. Dagert ja S.D. Ehrlich,

Gene 6, 23-28 (1979)). 12 ampR-pesäkettä poimitaan ja DNA valmistetaan nopealla eristysmenetelmällä. DNA:n analysoinnilla löytyy 5 kloonia, joissa on oikea liitännäinen oikeassa suunnassa. Yhtä näistä klooneista kasvatetaan 100 ml:ssa LB-alustaa, joka sisältää 100 mg/ml ampisilliiniä. Plasmidi-DNA eristetään ja sille annetaan nimeksi pJDB207/PHO5-I-MOTPAAUPAB.

B) Geeniiiitännäisten MOUPA^PA5, MOUK?TPAB ja MOUK^UPA kloonaus plasmidiin pCS16 RF-DNA valmistetaan mplS/Kpnl-HIndlll/MOUPA^PA5:tä, mpl8/Kpnl-HindiII/MOUKATPA®:tä ja mpl8/KpnI-HindIII/ MOUK^UPA itä varten nopealla DNAineristysmenetelmällä.

: Kukin kolme RF-DNA:ta (noin 1,5 ^ug) katkaistaan 82 100106 12 yksiköllä Kpnl:tä ja 12 yksiköllä HindIII:a 20 piissä liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2 ja 6 mM merkaptoetanolia, inkubointiajan ollessa 1 tunti 37°C:ssa. Lisätään 1 jil 1 M NaCl-liuosta ja kukin DNA katkaistaan vielä 12 yksiköllä Hindlllra. Sen jälkeen lisätään 1 jil RNaasia (1 mg/ml) ja inkuboidaan 10 minuuttia 37°C:ssa ja 1,4 ke:n liitännäiset eristetään 0,8-pro-senttisessa preparatiivisessa agaroosigeelissä. DNA-lii-tännäiset uutetaan elektroeluutiolla ja saostetaan etanolilla.

3 jig pCS16/UPA:ta katkaistaan Kpnl:llä ja HindIII:lla ja 2,7 ke:n vektoritragmentti eristetään. Elektroeluution jälkeen vektori-DNA saostetaan etanolilla.

100 femtomoolia Kpnl-Hindlll:11a katkaistua pCS16- vektoria ja kulloinkin 200 femtomoolia Kpnl-Hindlll:11a katkaistua liitännäisfragmenttia liitetään yhteen 10

^ul:ssa liuosta, jossa on 50 nM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM

MgCl2, 10 mM DTT:tä, 2 mM ATP:tä ja 0,5 jxg liivatetta, käyttämällä 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia ja 8 tunnin reaktioaikaa 15°C:ssa. Reaktio pysäytetään inkuboimalla 10 minuuttia 65°C:ssa ja 5 ui:11a saatua yhteenliittä- 2+ misseosta transformoidaan E. coli HB101 Ca -solut.

Kustakin kolmesta yhteenliittämisreaktiosta poimi-

O

taan 6 amp -pesäkettä. DNA valmistetaan nopealla eris-tysmenetelmällä. Kun DNA:tanalysoidaan Kpnl-Hindlll:11a, havaitaan oikeaa kokoa olevat liitännäiset. Yhtä kloonia kustakin kolmesta yhteenliittämisestä kasvatetaan 100 ml:ssa LB-alustaa, joka sisältää 100 yag/ml ampisilliiniä. Plasmidi-DNA: t eristetään mpie/Kpnl-Hindlll/MOUPA^PA®: stä, mpl8/Kpnl-HindiII/MOUKATPA®:stä ja mpl8/KpnI-HindIII/ .. mou^UPA :stä ja niille annetaan nimiksi vastaavasti pCS16/MOUPAA, pCSl6/MOUK2TPAB ha pCS16/MOUK2UPAB.

C) Geeniliitännäisten MQUPA^PA5, MOlflUTPA5 ja MOU^UPA6 kloonaaminen plasmidiin pJDB207 5 jig plasmidia pJDB207/PH05-I-UPA katkaistaan n 83 100106 15 yksiköllä Scal:tä ja 15 yksiköllä XhoI:tä (Boehringer) 50 ^ulissa liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl-,, 150 mM NaCl ja 6 mM merkaptoetanolia, inku-bointiajan ollessa 1 tunti 36°C:ssa. Sen jälkeen lisätään 1 jil RNaasia (1 mg/ml) ja 6,7 ke:n vektori fragmentti eristetään. Elektroeluution jälkeen vektori-DNA saostetaan.

pCS16/MOUPAATPAB:tä, pCS16/MOUKATPA3:tä 3a pCS16/ MOUK2UPA :tä inkuboidaan kutakin erikseen 15 pg 1 tunti 36°C:ssa 30 yksikön kanssa XhoI:tä 200 ^ulissa liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 8, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl ja 6 mM merkaptoetanolia, uutetaan samalla tilavuudella fenoli-kloroformia ja saostetaan etanolilla. Kukin saostettu, Xholsllä katkaistu pCSlö/MOUPA^PA6-, pCS16/ MOUK2TPAB-ja pCS16/MOUK2UPAB-DNA uudelleensuspendoidaan 150 pl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanolia ja 1,5 ^g etidiumbromidia, inkuboidaan 40 minuuttia 37°C:ssa 12 yksikön kanssa Scal:tä (osittainen katkaisu) ja uutetaan ensin samalla tilavuudella fenolia ja sen jälkeen samalla tilavuudella kloroformi-isoamyylialkoholiseosta (50:1). Kukin 1,2 ke:n fragmentti eristetään 1-prosent-tisessa preparatiivisessa agaroosigeelissä. DNA:t uutetaan eletkroeluutiolla ja saostetaan.

100 femtomoolia Scal-XhoI-katkaistua pJDB207/PHO5-I-UPA-vektoria ja 200 femtomoolia kulloistakin Xhol-Scal: llä katkaistua pCSlö/MOUPA^SrA^n, pCS 16/MOUK-TPAB:n B ^ tai pCSl6/MOUK2UPA :n 1,2 ke:n liitännäistä liitetään yhteen 10 pl:ssa liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT:tä, 2 mM ATP:tä ja 0,5 ^ig liivatetta, käyttämällä 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia ja 16 tunnin reaktioaikaa 15°C:ssa. Reaktio pysäytetään inkuboimalla 10 minuuttia 65°C:ssa. 5 ^il:lla kullois takin yhteenliittämisseosta transformoidaan E. coli HB101 Ca2+-solut.

Kustakin kolmesta yhteenliittämisestä poimitaan 6 amp -pesäkettä. DNA:t valmistetaan nopealla eristys- 84 100106 menetelmällä. Kun DNA:t analysoidaan restriktioanalyysil-lä, havaitaan oikeankokoiset liitännäisvyöhykkeet. Yhtä kloonia kustakin kolmesta yhteenliittämisreaktiosta kasvatetaan 100 ml:ssa LB-alustaa, joka sisältää 100 yug/ml ampisilliiniä. Plasmidi-DNA:t, jotka on saatu pCS16/MOUPAATPAB:staf pCS16/MOUK2TPAB:Stä ja pCSl6/MOUK2 UPAB:stä nimetään vastaavasti nimillä pJDB207/PHO5-I-MOUPA^PA®, pJDB207/PHO5-I-MOUK2TPAB ja pJDB207/PHO5-I-mouk2upab.

Esimerkki 16: Saccharomyces cerevisiae GRF18:n transfor- mointi ja hiivasolu-uutteiden valmistus

Plasmidit pJDB207/PHO5-I-MOTPAAUPA®, pJDB207/PHO5-I-MOUPA^PA®, pJDB207/PHO5-I-MOUKATPA® ja pJDB207/PHO5-I-MOUK2UPA viedään kukin erilliseen Saccharomyces cerevisiae GRF18-kantaan käyttämällä julkaisussa Hinnen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978) selostettua transformointimenetelmää. 5 jig kutakin plasmidi-DNA:ta lisätään 100 ^il:aan sferoplastisuspensiota ja saatu seos käsitellään polyetyleeniglykolilla. Sferoplastit sekoitetaan 10 ml:aan regenerointiagaria ja viljellään hiivan minimiravinnealustamaljoissa, joissa ei ole leusiinia.

Kun on inkuboitu 3 vuorokautta 30°C:ssa, saadaan noin 200 transformoitunutta solua.

Kustakin hiivan transformoinnista poimitaan yksi pesäke. Eri pesäkkeet nimetään seuraavasti:

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHP5-I-MOTPAAUPAB Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-I-MOUPAATPA® Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-MOUKATPA® Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-I-MOUK2UPA

Hiivasoluja kasvatetaan 30°C:ssa 20 ml:ssa HE-17-alustaa (8,4 g Yeast Nitrogen Base:a (Difco), 10 g L-asparagiinia (Sigma), 1 g L-histidiiniä (Sigma), 40 ml 50-prosenttista glukoosiliuosta per litra liuosta) 50 ml:n Erlenmeyer-kolvissa ravistelemalla 24 tuntia 7 niin, että saavutetaan solutiheys 8 - 10 x 10 solua/ml.

il 85 100106

Solut sentrifugoidaan ja uudelleensuspendoidaan 10 ml:aan 0,9-prosenttista NaCl-liuosta. 2 ml:11a uudelleensuspendoi-tuja soluja ympätään 50 ml matala-P^-minimialustaa (kuten eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 143081 on selostettu), johon on lisätty 10 g/1 L-asparagiinia ja 10 g/1 L-histidiiniä (Sigma), 250 ml:n Erlenmeyer-kolveissa. Inkuboidaan 30°C:ssa nopeudella 250 min 48 tunnin kuluttua kerätään solut 10 ml:sta matalapa -alustaa sentrifugoimalla 10 minuuttia nopeudella 3000 min Falcon 2070-putkissa. Solut pestään kerran 10 ml:11a matala-P^-alustaa ja sentrifugoidaan. Solupel-letti suspendoidaan lyysipuskuriin (66 mM kaliumfosfaatti pH 7,4, 4 mM Zwittergent (Calbiochem)). Solusus-pensioon lisätään 8 g lasihelmiä ja ravistellaan Vortex Mixer-laitteessa (Scientific Instruments Inc., USA) täydellä nopeudella 4x2 minuuttia pitämällä ravistelujen välillä 2 minuuttia jäällä. Yli 90 % soluista särkyy tällä tavoin käsiteltäessä. Solujätteet ja lasihelmet sentrifugoidaan pohjaan nopeudella 3000 min ^ 4°C:ssa 5 minuutissa. Emäliuoksesta määritetään plasminogeenin aktivaattoriaktiivisuus ja siitä myös eristetään ja puhdistetaan plasminogeenin aktivaattori.

Esimerkki 17: Plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoria koodittavien sekvenssien sijoittaminen nisäkässolujen ilmentämisvektoriin A) UPAATPAB:n "täydellisen" koodittavan yhdistelmä-sekvenssin sijoittaminen mpl8/Kpnl-HindiII/MOUPA^TPA®:n RF-DNA katkaistaan Smal-kohdasta, joka sijaitsee aivan koodittavan sekvenssin alun ylävirrassa, ja liitetään Sacl-kytkijään (CGAGCTCG). Sitten plasmidi katkaistaan Sacl:llä, joka katkaisee liitettyjen kytkijöiden kohdalta ja luontaisesta Sacl-kohdasta, joka on plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoria koodittavan sekvenssin t-PA:sta johdetulla alueella. Näin syntyneistä kahdesta fragmentista 86 100106 pienempi puhdistetaan agaroosigeelissä ]a liitetään Saclrllä katkaistuun plasmidiin pCGA44 (ks. esimerkki 4), transformoidaan E. coli HB101 ja ehdokaskloonien DNA käsitellään EcoRIrllä. Kloonille, jolla on odotettu restriktiokuvio, annetaan nimeksi pCGCl/UPAATPAB.

g B) UKITPA -yhdistelmää koodittavan sekvenssin sijoittaminen

Mpl8/KpnI-HindIII/MOUK2TPAB:n RF-DNA katkaistaan Smal-kohdasta, joka sijaitsee aivan koodittavan sekvenssin alun ylävirrassa, ja liitetään Sacl-kytkijään kuten edellä. Saclrllä katkaisun jälkeen saatu fragmentti kloonataan Saclrllä katkaistuun plasmidiin pCGA44, kuten edellä on selostettu, ja kloonille, jolla on odo- g tettu restriktiokuvio, annetaan nimeksi pCGC2/UK2TPA .

g CJ_UK2UPA -yhdistelmää koodittavan sekvenssin sijoitta minen

Mpl8/KpnI-HindIII/MOUK2UPAB:n RF-DNA katkaistaan Smal-kohdasta, joka on u-PA:n koodittavan sekvenssin ylävirrassa, sekä XhoI-kohdasta, joka on koodittavan sekvenssin alavirrassa (vektori-DNA:ssa). DNA-fragmen-tin epätasainen pää täytetään käyttämällä E. colin DNA-polymeraasi I:tä (ks. esimerkki 5D). Tasaisiin päihin liitetään Sacl-kytkijät ja DNA katkaistaan Sacl:llä ja näin syntyneistä kahdesta fragmentista pienempi puhdistetaan agaroosigeelissä ja kloonataan Sacl:llä katkaistuun plasmidiin pCGA44. Kloonille, jolla on odo- g tettu EcoRI-kuvio, annetaan nimeksi pCGC3/UK2UPA .

D) TPA^UPA^n "täydellisen" koodittavan sekvenssin sijoittaminen

Vaihe 1: Mpl8/BamHI/MOTPA^UPA6:n RF-DNA katkais taan BamHIrllä ja pienempi fragmentti (noin 2,1 ke) kloonataan BamHI:l_lä katkaistuun vektoriin pJDB207/PHO5-‘ I-TPA^JPA® (ks. esimerkki 9). Oikeansuuntaisen frag-

II

87 100106 mäntin sisältävä plasmidi valitaan Hindlll-katkaisulla ja sille annetaan nimeksi pJDB207/PHO5-I-MOTPAAUPAB.

Vaihe 2: Noin 600 ep:n SacI-Narl-fragmentti, joka on saatu plasmidista ptNC.UC (ks. esimerkki 3), ja noin 1350 ep:n Narl-XhoI-fragmentti, joka on saatu plasmidista pJDB207/PHO5-I-TPAAUPAB, eristetään ja kloonataan SacI-XhoI:llä katkaistuun vektoriin pCSl6 (ks. esimerkki 7). Noin 1,9 ke:n liitännäinen varmistetaan katkaisemalla SacI-XhoI:llä ja EcoRI:llä. Yhdelle oikealle plasmidille annetaan nimeksi pCSlö/MOTPA^HjPA®.

Vaihe 3: Plasmidi pCS16/MOTPAAUPAB katkaistaan

XhoI-kohdasta, joka sijaitsee u-PA:n koodittavan sekvenssin alavirrassa, ja epätasaiset päät täytetään käyttämällä E. colin DNA-polymeraasia I. Tasaisiin päihin liitetään Sacl-kytkijät ja DNA katkaistaan Sacl:llä.

Kahdesta fragmentista pienempi puhdistetaan agaroosigee-lissä ja kloonataan Sacl:llä katkaistuun pBR4a-vektori-fragmenttiin (ks. esimerkki 5). Liitännäisen oikea suunta ja oikea koko varmistetaan katkaisemalla BamHI: llä ja Sacl:llä vastaavasti. Yhdelle oikealle plasmidille annetaan nimeksi pCGC4a/TPAAUPAB.

Esimerkki 18: Vielä muiden plasminoqeenin yhdistelmäak- tivaattoria koodittavien sekvenssien rakentaminen ja niiden sijoittaminen nisäkässolujen ilmentämisvektoriin A) pCGC4a/TPAAUPAB-fraqmentin kloonaaminen M13mpl8:aan 3 jig plasmidia pCGC4a/TPAAUPAB (ks. esimerkki 17) katkaistaan 12 yksiköllä Sacl:tä (Boehringer) 20 jil:ssa liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgC^ ja 6 mM merkaptoetanolia, inkubointiajan ollessa 1 tunti 37°C:ssa. Noin 1,9 ke:n fragmentti eristetään 0,7-prosenttisessa preparatiivisessa agaroosigeelissä.

DNA uutetaan elektroeluutiolla ja saostetaan.

0,5 ug M13mpl8:aa (RF) katkaistaan Sacl:llä. 7,3 ke:n vektorifragmentti eristetään 0,7-prosenttisessa 88 100106 agaroosigeelissä. DNA elektroeluoidaan ja saostetaan.

100 femtomoolia Sacl:llä katkaistua M13mpl8-vektoria ja 200 femtomoolia Sacl-liitännäistä liitetään yhteen 10 jilrssa liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl^, 10 mm DTT:tä, 2 mM ATP:tä ja 0,5 |ig liivatetta, käyttämällä 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia ja 7 tunnin reaktioaikaa 15°C:ssa. Reaktio pysäytetään inku-boimalla 10 minuuttia 65°C:ssa. 5 jil:lla tätä yhteenliit- tämisseosta transformoidaan transformointikelpoiset E. coli JMlOl-solut. Poimitaan 6 väritöntä plakkia ja valmistetaan yksisäikeinen ja replikoituva (RF) DNA-muoto. Km RF-DNA analysoidaan, havaitaan neljä kloonia, joiden liitännäinen on oikeaa kokoa ja oikeassa suunnassa. Yhdelle näistä klooneista annetaan nimeksi mpl8/SacI/ TPA^JPA® (BC ) .

B) pBR4a:n Sacl-fragmentin kloonaaminen M13mpl8:aan

Plasmidin pBR4a (ks. esimerkki 5) Sacl-fragment-ti kloonataan M13mpl8:aan. Yhdelle näistä klooneista, jonka liitännäinen on oikeaa kokoa ja oikeassa suunnassa, annetaan nimeksi mpl8/SacI/TPAAUPAB(BR).

C) TPA-UPA-yhdistelmärakenteiden deleetiomutatointi 1) ^UPA0 (BC):n rakentaminen (so. tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411))

Deleetiomutatointi suoritetaan kuten menetelmän yleisselostuksessa on kuvattu (ks. esimerkki 14) niin, että kohteena on mpl8/SacI/TPAAUPAB(BC). Hybridisoin-nilla saadut positiiviset kloonit varmistetaan suorittamalla restriktioanalyysi Sacl:llä. Mutanteista löydetään noin 1380 ep:n vyöhyke, kun taas villityypistä löydetään noin 1900 ep:n vyöhyke. Mutantit varmistetaan vielä EcoRI-katkaisulla. Yhdelle mutanttikloonille, g jolla on oikea rakenne, annetaan nimeksi mpie/SacI/^UPA (BC). Deleetio varmistetaan ketjunkatkaisusekventointi-menetelmällä käyttämällä sekventointialuketta, jonka

II

89 100106 sekvenssi on 5 ' CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG3 ' Tämä aluke on komplementaarinen t-PA(853-821):n koodittavan säikeen kanssa ja sisältää epäparin asemassa 838 (t-PA).

2) FUPAB(BC):n (so. tPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-411)) rakentaminen

Deleetiomutatointi suoritetaan kuten menetelmän yleisselostuksessa on kuvattu (ks. esimerkki 14) niin,

Δ B

että kohteena on mpl8/Sad/TPA ‘UPA (BC) . Hybridisoinnilla saadut positiiviset kloonit varmistetaan suorittamalla restriktioanalyysi Sacl:llä. Mutanteista löydetään noin 1200 ep:n vyöhyke, kun taas villityypistä löydetään noin 1900 ep:n fragmentti. Mutantit varmistetaan vielä EcoRI-katkaisulla. Yhdelle mutanttikloonille, jolla on oikea rakenne, annetaan nimeksi mpl8/SacI/ g FUPA (BC). Deleetio varmistetaan ketjunkatkaisusekven-tointimenetelmää käyttämällä niin, että sekventointi-alukkeena on sekvenssi 5'CAGAGCCCCCCCGGTGC3' Tämä aluke on komplementaarinen u-PA:n koodittavalle säikeellei 666-682).

3) FISUPA®(BC):n rakentaminen (so. tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411)) 90 100106

Deleetiomutatointi suoritetaan kuten menetelmän yleisselostuksessa on kuvattu (ks. esimerkki 14) niin, että kohteena on mpl8/SacI/TPAAUPAB(BC). Hybridisoin-nilla saadut positiiviset kloonit varmistetaan suorittamalla restriktioanalyysi Sacl:llä. Mutanteista löydetään noin 1470 ep:n vyöhyke, kun taas villityypistä löydetään noin 1900 ep:n fragmentti. Mutantit varmistetaan vielä EcoRI-katkaisulla. Yhdelle mutanttikloo-nille, jolla on oikea rakenne, annetaan nimeksi mpl8/ 3

Sacl/KJ^UPA (BC). Deleetio varmistetaan ketjunkatkai-susekventointimenetelmällä käyttämällä sekventointi-aluketta, jonka sekvenssi on 5 ' C C CAGTGC CTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG 3 ’ Tämä aluke on komplementaarinen tPA(853-821):n koodittavalle säikeelle ja sisältää epäparin asemassa 838 (t-PA).

4) FGK2UPAB(BC):n rakentaminen (so. tPA(l-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411))

Deleetiomutatointi suoritetaan kuten menetelmän yleisselostuksessa on kuvattu (ks. esimerkki 14) niin, että kohteena on mpl8/SacI/TPAAUPAB(BC). Hybridisoinnil-la saadut positiiviset kloonit varmistetaan suorittamalla restriktioanalyysi Sacl:llä. Mutanteästa löydetään noin 1580 ep:n vyöhyke, kun taas villityypistä löydetään noin 1900 ep:n fragmentti. Mutantit varmistetaan vielä EcoRI-katkaisulla. Yhdelle kloonille, jolla on oikea 3 rakenne, annetaan nimeksi mpl8/Sad/FGK2UPA (BC). Deleetio 91 100106 varmistetaan ketjunkatkaisusekventointimenetelmällä käyttämällä sekventointialuketta, jonka sekvenssi on 5·CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG 3 * Tämä aluke on komplementaarinen t-PA(853-821):n koodattavalle säikeelle ja sisältää epäparin asemassa 838 (t-PA).

5) Samaa deleetiomutatointia käyttämällä saadaan aikaan K2UPAB(BR) (tPA(1-3)-tPA(176-262)-uPA(132-411)) FUPAB(BR) (tPA(1-49)-uPA(134-411)) FK2UPAB(BR) (tPA(1-49)-tPA(176-262)-uPA(132-411)) ja FGK2UPAB(BR) (tPA(1-86)-tPA(176-262)-uPA(132-411)).

D) Plasminoqeenin yhdistelmäaktivaattona koodittavien sekvenssien sijoittaminen nisäkässolun ilmentämisvekto-riin 1. FUPAB(BC): n, K2UPAB(BC):n, FK2UPAB(BC):n ja FGK2UPAB(BC):n sijoittaminen

Plasmidien mpl8/SacI/K2UPAB(BC), rapl8/SacI/FUPAB(BC), mpl8/SacI/FK2UPAB(BC) ja mpl8/SacI/FGK2UPAB(BC) RF-DNA katkaistaan kukin Sacl:llä. Kahdesta fragmentista pienempi eristetään ja liitetään yhteen Saclrllä katkaistun pBR4a-vektorifragmentin (ks. esimerkki 5) kanssa, siirretään E. coli HB101:een ja liitännäisen oikea suunta ja koko varmistetaan katkaisemalla BamHI:Hä ja Sacl:llä vastaavasti. Saaduille plasmideille annetaan vastaavasti nimet pCGC5/K2UPAB, pCGC6/FUPAB, pCGC7/FK2UPAB ja pCGC8/FGK2UPAB.

2. Samalla tavalla sijoitetaan kukin seuraavista DNA- jaksoista plasmidiin pBR4a: K2UPAB(BR), FUPAB(BR), FK2UPAB(BR) ja FGK2UPAB(BR). Näin saaduille plasmideille annetaan vastaavasti nimet pBR5, pBR6, pBR7 ja pBR8.

92 100106

Esimerkki 19: Nisäkkäissä toimivat ilmentämisvektorit, joissa on DHFR-qeeni

Plasmidi pSV2dhfr (ATCC 37145) on plasmidi, joka mahdollistaa DHFR:n sisältävien solujen transformanttien valinnan käyttämällä metotreksaattia, joka on antifolaat-tilääke, tai DHFR- CHO-solujen DHFR+-transformanttien valinnan (DUKXBl-solut; G. Urlaub, Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 77, 4216-4220 (1980)). Tämän plasmidin ainoaan BamHI-kohtaan voidaan kloonata pCGA28:n BamHI-fragmentti, joka sisältää t-PA-geenin moduulina. Plasmideille, joissa on liitännäinen vastakkaisissa suunnissa, annetaan vastaavasti nimet pCGA700a/tPA ja pCGA700b/tPA. Kumpaakin voidaan käyttää t-PA:n ilmentämiseen kudosviljelmä-soluissa, mutta pCGA700a/tPA asetetaan etusijalle, sillä siinä t-PA:n transkriptiosuunta on sama kuin DHFR-geenin, ja koska tämä suunta johtaa usein hieman korkeampiin ilmentymistasoihin kuin plasmideissa, jotka transkri-boituvat toisiaan lähenevästä.

Vastaavalla tavalla plasminogeenin yhdistel-mäaktivaattoreita (alla) koodittavat, moduulimuodossa olevat geenit, jotka saadaan plasmideista pBRla/tPA, pBR2a/UPAATPAB, pCGCl/UPA^PA® ja pCGC2/UK2TPAB, voidaan liittää BamHI-fragmentteina pCGA700a/tPA:n DHFR-geeniin, jolloin saadaan vastaavasti plasmidit pCGA701a/tPA, pCGA702a/UPAATPAB, pCGA705a/UPAATPAB ja pCGA707a/UK2TPAB, joissa moduulimuodossa oleva plasminogeenin aktivaattori-geeni tulee transkriboiduksi samassa suunnassa kuin DHFR-geeni, ja plasmidit pCGA701b/tPA, pCGA702b/UPA^TPAB, pCGA705b/UPAATPAB ja pCGA707b/UK2TPAB, joissa nämä geenit tulevat traskriboiduiksi vastakkaisissa suunnissa. Johtuen siitä, että BamHI-sekvenssi on läsnä u-PA:n B-ketjua koodattavalla alueella, voidaan moduulina oleva plasmino- p geenin aktivaattorigeeni eristää vain neo -plasmidin osittaisella katkaisulla (kaksi kolmesta BamHI-kohdasta) ja suorittamalla sen jälkeen halutun fragmentin (ks. kuvia) eristäminen agaroosigeelielektroforeesilla. Näin voidaan plasmideista pBR3a/uPA, pBR4a/TPAAUPAB,

II

93 100106 pBR5/K2UPAB, pBR6/FUPAB, pBR7/FK2UPAB, pBR8/FGK2UPAB, pCGC3/UK2UPAB, pCGC4a/TPAAUPAB, pCGC5/K2UPAB, pCGC6/FUPAB, pCGC7/FK2UPABja pCGC8/FGK2UPAB rakentaa vastaavasti plasmidit pCGA703a/uPA, pCGA704a/TPAAUPAB, pCGA705a/K2UPAB, pCGA708a/FUPAB, pCGA706a/FK2UPAB, pCGA707a/FGK2UPAB, pCGA709a/UK-UPAB, pCGA711a/TPAAUPAB, pCGA712a/K_,UPAB, pCGA713a/FUPA , pCGA714a/FK:,UPAB ja ^ B ^ pCGA715a/FGK2UPA , joissa plasminogeenin aktivaattorin geeni tulee transkriboiduksi samassa suunnassa kuin DHFR-geeni, ja edelleen plasmidit pCGA703b/uPA, pCGA704b/TPAAUPAB, pCGA708b/FupAB, pCGA705b/K2UPAB, pCGA706b/FK2UPAB, pCGA707b/FGK2UPAB, pCGA709b/UK2UPAB, pCGA711b/TPAAUPAB, pCGA712b/K2UPAB/ pCGA713b/FUPAB, pCGA714b/FK2UPAB ja pCGA715b/FGK2UPAB, joissa kyseiset geenit tulevat transkriboiduiksi vastakkaisissa suunnissa.

Esimerkki 20: Plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorien tuottaminen transformoituneilla nisäkässoluilla A) Kudosviljelmäsolujen ylläpito ja transfektointi DNA:11a; yleismenetelmä DNA-rakenteet ilmennetään DUKXBl-soluissa, jotka ovat kiinalaisen hamsterin munasarjasolujen (CHO) mutant-teja, joista puuttuu dihydrofolaattireduktaasientsyymi (G. Urlaub et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77, 4216 - 4220 (1980)). DUKXBl-soluja kasvatetaan alfa-MEM-alustassa, joka sisältää nukleosideja (G1BCO), ja johon on lisätty 5 % vasikan sikiön seerumia.

·* Soluja maljataan tiheyteen 10 000/cm kuuden kolon maljoissa (halkaisija 3,4 cm) ja transformoidaan 4 jxg:lla DNA:ta: DNA liuotetaan pitoisuuteen 50 yag/ml liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl, pH 7,0, ja 0,1 mmol/1 EDTA:ta, jäähdytetään jäällä 5 minuuttia, lisätään 0,25 tilavuutta 1 M CaCl2~liuosta ja inkuboidaan jään päällä 10 .. minuuttia. Sitten tähän seokseen sekoitetaan sama ti- 94 100106 lavuus 2xHBS-liuosta (50 mM Hepes, 280 mM NaCl, 0,75 mM Na2HPO^, 0,75 mM NaH2PO^, pH 7,12) ja sen jälkeen inkuboidaan vielä 10 minuuttia jään päällä. Lopuksi tämä DNA-Ca-yhteissakka lisätään kasvualustaan ja soluja inkuboidaan DNA:n kanssa 16-18 tuntia, minkä jälkeen annetaan glyserolishokki eli solut huuhdellaan TBS-liuoksella (80 g/1 NaCl, 3,8 g/1 KCl, 1 g/1 NajHPO^.2H20, 0,114 g/1 CaCl2.2H20, 0,11 g/1 MgCl2.6H20, 25 mM Tris.HCl pH 7,5), inkuboidaan 1 minuutti liuoksen kanssa, jossa on 20 tilavuus-% glyserolia TBS:ssä, ja huuhdellaan uudestaan TBS-liuoksessa ja viljellään 24 tuntia kudos-viljelmäalustassa. Sitten solut trypsinoidaan ja siirretään Petri-maljoihin, joiden halkaisija on 8 cm. Seuraa-vana päivänä alkuperäinen ravinnealusta, jossa ei ole valinta-ainetta, korvataan alustalla, jossa on 1 mg/ml genetisiiniä. Ravinnealusta korvataan tuoreella joka kolmas tai neljäs päivä. Pesäkkeitä voidaan havaita suunnilleen 14. vuorokautena. Yksittäisistä pesäkkeistä eristetään solut raaputtamalla pipetin kärjellä ja samalla imemällä pipetin kärkeen, joka on täytetty trypsiini-liuoksella, ja sen jälkeen kukin pesäke siirretään omaan koloonsa 24-koloisessa kololevyssä, jossa on genetisiiniä sisältävää ravinnealustaa. Kun solut muodostavat yhtenäisen maton, suoritetaan jako 6-koloiseen kololevyyn ja sen jälkeen siirto Petri-majoihin, joiden halkaisija on 8 cm.

B. Plasminogeenin aktivaattorien määrittäminen agaroosi-maljoissa Näissä herkissä plasminogeenin aktivaattorien määrityksissä käytetään agaroosigeelejä, joihin lisätään plasminogeenia (varastoliuos, joka on valmistettu liuottamalla plasminogeenia Sigma A-6877 pitoisuuteen 1 mg/ml ja dialysoimalla 100 tilavuutta 50 mM Tris.HCl-puskuria vastaan, jonka pH on 8,0) ja joko kaseiinia (lisätään rasvattomana maitona) tai fibriiniä (lisätään fibrinogee- n 95 100106 ninä plus trombiinina). Näyte, joka sisältää plasminogeenin aktivaattoria, sijoitetaan reikiin, jotka pistetään 4 mm:n paksuiseen agaroosigeelikerrokseen, ja sen jälkeen geeliä inkuboidaan 37°C:ssa. Sen jälkeen entsymaattinen aktiivisuus havaitaan sen perusteella, että plasminogeenin aktivaattori diffundoituu radiaa-lisesti ulospäin näytekolosta, muuntaa geelin sisältämän plasminogeenin plasmiiniksi, joka puolestaan hajottaa kaseiinia tai fibriiniä saaden aikaan kirkkaan kehän sameaan geeliin näytekolon ympärille. Kehän säde (mitattuna näytekolon reunasta) on aktivoituneen plasminogeenin määrän mitta. Määritys ei osoita lineaarista vastetta verrattuna lisättyyn plasminogeeninaktivaattori-määrään. Pienten plasminogeeninaktivaattorimäärien mittaamista varten voidaan inkubointia jatkaa useita vuorokausia. Kaseiinimäärityksen menetelmä ja kalibrointi on esitetty julkaisussa Tang et ai., Ann. N.Y. Acad. Sei. 434, 536-540 (1984) paitsi, että 2-prosenttisen (massa/tilavuus) rasvattoman Carnation-maitojauhemaidon tilalla käytetään 12,5 tilavuus-% steriloitua (UHT), rasvatonta maitoa (Migros Corp., Sveitsi). Kun substraattina käytetään fibriiniä (Granelli-Piperno ja Reich, J. Exp. Med. 148, 223-234 (1978)), 0,2 g agaroosia liuotetaan 15 ml:aan 0,9-prosenttista NaCl-liuosta 42°C:ssa. Tässä vaiheessa lisätään 5 ml 0,9-prosenttista NaCl-liuosta, joka sisältää 80 mg naudan fibrinogeeniä (Sigma F-8630), 0,1 ml plasminogeeniliuosta (edellä) ja 0,1 ml natriumatsidiliuosta (100 mg/ml), 42°C:ssa. Lopuksi 0,2 ml naudan trombiinia (Sigma T-6634, liuoksena, jossa on 16,6 NIH-yksikköä/ml 0,9-prosenttisessa NaCl-liuoksessa) lisätään ja seos kaadetaan nopeasti Petri-maljaan (halkaisija 8 cm) ja annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan 1 tunnissa. Näin saatu geeli on noin 4 mm paksu ja sitä voidaan varastoida useita vuorokausia tai käyttää välittömästi samalla tavoin, kuin edellä on selostettu kaseiinipitoisen geelin kohdalla.

96 100106 C) Plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorien tuottaminen hamsterin soluissa CHO DUKXl-solut transformoidaan vastaavasti plas-midien pBRIA, pBRIB, pBR2A, pBR2B, pBR3A, pBR3B, pBR4A, pBR5, pBR7, pBR8, pCGCl, pCGC2, pCGC3, pCGC4a, pCGC5, pCGC6, pCGC7 ja pCGC8 DNA:11a, kuten edellä on selostettu (esimerkki 20A). Pesäkkeet ilmenevät noin 10. vuorokautena ja ne poimitaan noin 15. vuorokautena, kuten edellä on selostettu, ja kaksi viikkoa myöhemmin solujen lukumäärä on lisääntynyt riittävästi, jotta plasminogeenin aktivaattori voidaan mitata edellä kuvatulla tavalla. Transformoitumattomat solut ja solulin-jat, jotka ovat transformoituneet pBRlB.-llä, pBR2B:llä tai pBR3B:llä, joissa on Sacl-fragmentti liittyneenä koodittamattomassa suunnassa, eivät tuota havaittavia määriä plasminogeenin aktivaattoria.

D) Transformoituneita CHO-soluja kasvattamalla saatujen ravinnealustojen entsyymiaktiivisuus

Kun plasmidilla transformoituneita CHO-soluja ja kontrolli-CHO-soluja kasvatetaan viljelemällä 200 000 - 500 000 solua/ml 24 tuntia Alpha-MEM-alus-tassa, joka sisältää nukleosideja ja 5 % vasikan sikiön seerumia, saadaan konditioitu ravinnealusta, jota inku-boidaan 0,03 ml agaroosimaljassa, joka sisältää kaseiinia tai fibriiniä, jäljempänä mainittu aika.

Fibriinimaljassa havaitaan vähäinen tausta-aktiivisuus, joka luultavasti johtuu endögeenisestä hamsterin t-PA: sta, kun on kasvatettu DUKXB1-soluja. Kaseiinimal-joissa ei ilmene mitään kehää, jos yhdistelmäproteii-ninäytteisiin sekoitetaan 3 mikrolitraa kanissa tuotettua t-PA:n vasta-ainetta (synnytetty puhdistettua Bowes-mela-nooma-t-PA:ta vastaan) tai urokinaasin vasta-aineita (synnytetty Senoro-urokinaasia vastaan).

TPA:n vasta-aine ei inhiboi u-PA-entsyymiä : eikä urokinaasin vasta-aine inhiboi t-PA:ta merkittävässä il 97 100106 määrin. Tulosten yhteenveto on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1: Erilaisten plasminogeenin aktivaattorien aktiivisuus transformoiva plaanvldi kehän halkaisija kaseiinimalja fibrilnimalja 18 h 36 h 90 min 300 min 1. pBRla(t-PA) 2 mm 5 mm 1 mm 2 mm 2. pBR2a(UPA iPA; 0 mm 0 mm 0.5 mm 1.5 mm 3. pBR3a(u-PA) 5 mm 10 mm 0.5 n 2.5 mm 4. pBR4a( TPAjJPA0) 6 mm llmm 2 mm 3 mm 5. pBR6/K2UPAö_ 3 mm 8 mm ei määritelty 6. pBR7/FK2UPA_ 4 mm 9 mm 1 mm 2 mm 7. pBR8/FGK2UPA _ 3.5 mm 7 mm 0.8 m 2 mm 8. pCGCl/UPA ϊΡΑ 0 mm 6mm 0.2 mm 2 mm 9. pCGC2/UR2UPAI 5 mm 10 mm 1 mm 2.5 mm 10. pCGC3/UK2TPA _ 3.5 mm 5 mm 1.5 mm 2.5 mm 11. pCGC4a/TPAAUPA£ 2.5 mm 5 mm 0.5 mm 1.5 mm 12. pCGC5/K2UPAB 6.5 mm 12 mm 6 mm >10 mm 13. pCGC6/FUPA _ 2 mm 8 mm 0 mm 1 mm 14. pCGC7/FISUPA* 2.5 m 5mm 1 mm 2 mm 15. PCGC8/FGK2UPA 2.5 mm 6 mm lmm 2 mm 16. mtPA 1 pg/ml 3 mm 7 mm 1.5 mm 3 mm 17. DUKXB1 kontrolli 0 am 0 mm 0 mm 0.5 a

Esimerkki 21; Hybridoomasolujen valmistus ia monoklo-naalisten vasta-aineiden eristäminen a) Immunogeenin lähde; Näyte ihmisen osittain puhdistettua melanooma-t-PA:ta (arvioitu puhtausaste >90%).

b) Immunisointimenetelmä: Kolme ryhmää BALB/c- hiiriä (Tierfarm Sissein, Sveitsi), joiden hiiret ovat 10 - 14 viikon ikäisiä, immunisoidaan injektoimalla 98 100106 kahteen takakäpälään ja subkutaanisti 100 pg melanooma-t-PA:ta täydelliseen Freund'in adjuvanttiin (Difco) emulgoituna. Sitten ensimmäinen ryhmä (nro. 405) saa 10 pg t-PA:ta epätäydellisessä adjuvantissa joka viikko kuuden viikon ajan, kun taas toinen ryhmä (406) saa saman määrän kahden viikon välein. Kolmannelle ryhmälle (407) annetaan kahdesti 50 pg t-PA:ta niin, että antojen välissä on kolme viikkoa. Kaikista eläimistä otetaan verta viikolla 4 ja viikolla 8. Viimeisenä injektiona annetaan 100 pg t-PA:ta PBS-liuoksessa i.p. ja neljä vuorokautta myöhemmin pernasolut fuusioidaan SP2/o-mye-loomalinjaan standardimenetelmää noudattaen. Fuusioinnissa käytetään vain niitä hiiriä, joilla on korkea t-PA:n vasta-aineiden tiitteri.

c) Solujen fuusiointi: Kaikki fuusiointikokeet suoritetaan G. Köhlerin ja C. Milsteinin menetelmällä (Nature 256, 495 (1975)) käyttämällä erittämätöntä Sp2/0-Agl4-myeloomalinjaa (M. Shulman, C.D. Wilde ja G. Köhler, Nature 276, 269 (1978)). 10® pernasolua ja 10^ myelooma- solua sekoitetaan keskenään siten, että läsnä on 1 ml 50-prosenttista polyetyleeniglykolia (PEG 1500, Serva).

Pesun jälkeen solut uudelleensuspendoidaan 48 ml:aan Dulbecco’n välttämättömät minimiravinteet sisältävää alustaa (Gibco No. 0422501). Syöjäsoluina käytetään fuusiota kohti 3 x 10® normaalia hiiren peritoneaalista eksudaattisolua. Solut jaetaan 48:n 1 ml:n costar-kolon kesken ja niitä ruokitaan 3 kertaa viikossa HAT-standar-divalinta-alustalla 3-6 viikon ajan. Kun hybridooma-solujen kasvu tulee näkyväksi, emäliuokset seulotaan sekä suoralla antigeenin sitoutumisella (ELISA) että neutraloinnilla (kaseiini) (ks. jäljempänä). Neljän fuusiointikokeen tulokset ovat seuraavat: Ympätyistä 192 kolosta saadaan 192 hybridoomaa. Näistä 24 tuottaa t-PA:n vasta-ainetta. 24 positiivisesta hybridoomasta kloonataan 14 ja saaduista 574 kloonista 31 havaitaan tuottavan anti-t-PA mAb:tä stabiilisti. Kolme näistä tl 99 100106 (kloonit 405B.33.3, 406A.23.7 ja 407A.15.27) injektoidaan hiiriin ja askistesnesteet tuotetaan jatkotutkimuksia varten.

d) Monoklonaalisen vasta-aineen eristäminen ja puhdistaminen; BALB/c-hiiret, joiden ikä on 8 - 10 viikkoa (Tierfarm Sissein, Sveitsi) esikäsitellään vat-saontelonsisäisesti 0,3 ml:lla pristaania (Aldrich).

2-3 viikkoa myöhemmin annetaan vatsaontelonsisäisesti 2 - 5 x 106 kloonattua hybridoomasolua 405B.33.3, 406A.23.7 tai 407A.15.27 ja 0,2 ml pristaania. 8 - 10 vuorokauden kuluttua kerätään askitesneste, sentrifu-goidaan kiihtyvyydellä 800 x g ja varastoidaan -20°C:ssa.

Sulatettua askitesnestettä sentrifugoidaan kiihtyvyydellä 50000 x g 60 minuuttia. Rasvakerros, joka kelluu pinnassa, poistetaan huolellisesti ja proteiinipitoisuudeksi säädetään 10 - 12 mg/ml. Epäpuhdas immu-noglobuliini seostetaan lisäämällä tipoittain 0,9 tila-vuusekvivalenttia kyllästettyä ammoniumsulfaattia 0°C: ssa, sen jälkeen liuotetaan liuokseen, jossa on 20 mM Tris-HCl ja 50 mM NaCl, pH 7,9), ja dialysoidaan samaa puskuria vastaan. DEAE-D52-selluloosakromatografiällä (Whatman) saadaan immunoglobuliinijae käyttämällä pusku-rigradienttisysteemiä, jossa on 20 mM Tris-HCl ja 25 - 400 mM NaCl, pH 7,9. Immunoglobuliini saostetaan jälleen ammoniumsulfaatilla ja liuotetaan PBS-puskuriin konsentraatioon 10 mg/ml.

Natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeeli-elektroforeesi (SDS- PAGE) osoittaa, että näin saavutettu monoklonaalisten vasta-aineiden puhtausaste on yli 95 %.

e) Monoklonaalisten vasta-aineiden luokan ia alaluokan määrittäminen: Kloonatuilla hybridoomasoluilla tuotettujen monoklonaalisten vasta-aineiden luokka ja alaluokka määritetään ennestään tunnetulla Ouchterlo-nyn immunodiffuusiotekniikalla (agargeeli-immunodiffuu- 100 100106 siomenetelmä) käyttämällä luokka- ja alaluokkaspesifi-siä kanin vasta-aineita (Bionetics).

mAb-laatujen alaluokat ovat seuraavat: 405B.33.3: f,* 406A.23.7: 407A.15.27: j^ak f) Entsyymi-immunomääritys (ELISA): Kololevyn kolot päällystetään käyttämällä koloa kohti 0,5 pg t-PA^valmistetta (puhtausaste >95 %) 100 yil:ssa PBB -puskuria. Levyn vapaa sitomiskapasiteetti kyllästetään puskurilla, jossa on 0,2 % liivatetta PBS-puskurissa, joka sisältää 0,2 % NaN^ (massa/tilavuus), ja jonka pH on 7,4. 100 γ.1 näytteitä, jotka sisältävät vastaa vasti monoklonaalista vasta-ainetta 405B.33.3, 406A.23.7 tai 407A.15.27, inkuboidaan koloissa 37°C:ssa 2 tuntia.

Levyt pestään PBS-puskurilla, joka sisältää 0,05 % Tween 20, ja sen jälkeen inkuboidaan 2 tuntia 37°C:ssa fosfa-taasiin konjugoidun, kanissa tuotetun, hiirenvastai-sen immunoglobuliinivalmisteen kanssa. Kiinnittynyt entsyymi kehitetään inkuboimalla (37°C, 30 - 60 minuuttia) entsyymin substraattina toimivaa p-nitrofenolia sisältävän liuoksen (1 mg/ml 10-prosenttisessa dietanoli-amiinipuskurissa, joka sisältää 0,5 mM MgCl2 ja 0,02 (massa/tilavuus) NaN^, pH 9,8) kanssa ja optinen tiheys mitataan 405 nm:ssä.

Sama ELISA-mittaus suoritetaan myjs käyttämällä urokinaasia. Mikään näistä mAb-laaduista ei sido uroki-naasia. Kaikki mAb-laadut ovat t-PA-spesifisiä.

g) Kaseiininlyysimääritys (neutralointikoe):

Jotta saadaan määritetyksi mAb-laatujen inhiboiva vaikutus, t-PA ja vuorollaan kukin mAb (405B.33.3, 406B.23.7 ja 407A.15.27) sekoitetaan seokseksi ja inkuboidaan 30 - 60 minuuttia 4°C:ssa, minkä jälkeen suoritetaan tavallinen kaseiini/plasminogeenimääritys (ks. esimerkki 20B). Mikään näistä mAb-laaduista ei estä t-PA-aktii- n 101 100106 visuutta, mutta mAb 405B.33.3 aiheuttaa kaseiinin hydro-lysoitumisen viivästymisen (yli 6 tunnilla).

Esimerkki 22: Plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin puhdistaminen, yleismenetelmä

Transformoituneista hiivasoluista valmistetaan uutteet esimerkissä 16 kuvatulla tavalla. Plasmideilla transformoituneista nisäkässoluista, kuten CHO-soluista, valmistetaan uutteet seuraavalla tavalla:

Solut viljellään ensin 70 - 80 % konfluenssiin.

Sitten yhden solun paksuinen matto huuhdellaan edellä mainitulla liuoksella, josta seerumi on jätetty pois, ja sen jälkeen soluja kasvatetaan vielä 5-7 vuorokautta. Ravinneliuos otetaan talteen 24 tunnin välein ja samanaikaisesti soluille annetaan tuore ravinneliuos. Näin saatua kasvatuksen jälkeistä liuosta sentrifugoidaan kiihtyvyydellä 5000 x g 30 minuuttia ja suodatetaan 0,45 jm:n suodattimen läpi, jotta ei-toivotut solujät-teet saadaan poistetuiksi ennen affiniteettikromatogra-fiaa. Affiniteettimatriisina käytetään joko immobilisoitua proteaasin inhibiittoria DE-3, joka on saatu Erythrina latissimasta, tai immobilisoituja u-PA:n tai t-PA:n vasta-aineita.

Plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorit, jotka sisältävät t-PA:n katalyyttisen B-ketjun, puhdistetaan edellä kuvatulla tavalla valmistetusta kasvatuksen jälkeisestä ravinneliuoksesta tai hiivasolu-uutteista menetelmällä, joka alun perin kehitettiin t-PA:n puhdistamiseen ravinneliuoksesta, jossa oli kasvatettu melanooma-soluja (ks. C. Heussen et ai., J. Biol. Chem. 259, 11635 - 11638 (1984)).

Kaikki plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorit puhdistetaan käyttämällä polyklonaalisia vasta-aineita, jotka on synnytetty kaneissa tai vuohissa kanta-u-PA-tai kanta-t-PA-entsyymiä vastaan, tai käyttämällä mono-klonaalisia vasta-aineita (hiiriperäisiä), jotka on 102 1 00 1 06 synnytetty kantaentsyymejä vastaan edellyttäen, että vasta-aineet tunnistavat kyseisessä plasminogeenin yhdis-telmäaktivaattorissa läsnä olevan epitoopin (ks. esimerkki 21). Valittu vasta-aine immobilisoidaan liukenemattomaan matriisiin, joka voi olla esimerkiksi Affigel tai Sepharose-4B. Sen jälkeen edellä kuvattu ravinne-liuos, jossa on kasvatettu soluja, tai hiivasolu-uute sijoitetaan affiniteettimatriisipylvääseen, ei-toivo-tut proteiinit pestään pois sopivalla puskurilla, esimerkiksi Dulbecco'n PBS:llä (0,1 g/J-CaC^, 0,2 g/1 KC1, 0,2 g/1 KH2P04, 0,047 g/l MgCl2, 8,0 g/1 NaCl, 1,15 g/1 Na2HPO^; J. Exp. Med. 9J3, 167 (1954)) ja sen jälkeen plasminogeenin aktivaattorit eluoidaan pylväästä käyttämällä kaotrooppista ainetta eli kaliumtiosyanaattia (ks. M. Einarsson et ai., Biochem. Biophys. Acta 830, 1-10 (1985)) tai matala-pH-puskuria, kuten 0,1 - 0,2 M glysiini-HCl-puskuria, jonka pH on 2,1.

Kun saadut plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorit puhdistetaan monoklonaalisia vasta-aineita käyttämällä, saavutetaan yli 90 % puhtausaste.

D

Esimerkki 23: UK2TPA (BC):n puhdistus Ό a. DE-3 Sepharose -pylvään valmistus

1 ml:aa kohti syanogeenibromidilla aktivoitua R

Sepharose 4B :tä (Pharmacia) liitetään 5 mg Erythrina latissiman puhdistettua inhibiittoria (F.J. Joubert et ai., Hoppe-Seyler's Zeitschr. Physiol. Chem. 302, 531 (1981)) valmistajan ohjeita noudattaen. Matriisi tasapainotetaan 0,2 M ammoniumasetaattipuskurilla,

R

pH 7,0, joka sisältää 0,2 M NaCl, 0,1 % Synperonic :ia ja 0,02 % natriumatsidia.

b. UK?TPAB(BC):n kromatografinen puhdistus DE-3 Sepha-rose 4B -pylväässä

Ravinneliuos, jossa on kasvatettu soluja (ks.

n 103 100106 p esimerkki 22) tehdään 0,1-prosenttiseksi Synperonic :in p suhteen ja sijoitetaan sen jälkeen DE-3 Sepharose reen.

Kun on sekoitettu hitaasti 1 tunti 4°C:ssa, DE-3 Sepha- Ό rose 4B kaadetaan pylvääseen ja pestään 0,2 M NaCl-liuoksella, jossa on 0,1 % Synperonic:ia, kunnes aallonpituudella 280 nm mitattu UV-absorbanssi saavuttaa perustason, mikä osoittaa, ettei eluaatissa ole läsnä proteiineja. Tämän jälkeen pesua jatketaan 0,2 M ammoniumase-taattipuskurilla, jonka pH on 7,0, ja joka sisältää 0,2 mol/1 ammoniumtiosyanaattia ja 0,1 % Synperonic:ia.

Kun 280 nmrssä mitattu UV-absorbanssi osoittaa, ettei eluaatissa ole läsnä proteiinia, pylväs eluoidaan 0,2 M ammoniumasetaattipuskurilla, jonka pH on 7,0, ja joka sisältää 1,6 mol/1 ammoniumtiosyanaattia ja 0,1 % Syn-

O

peronic :ia. Korkeimmat amidolyyttiset aktiivisuudet sisältävät jakeet, kun mitataan fluorometrisellä määrityksellä käyttämällä Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC-substraattia (M. Zimmermann et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 750 (1978)), kerätään yhteen. Vähintään 80 % DE-3 n

Sepharose 4B -materiaaliin sijoitetusta aktiivisuudesta saadaan talteen yhdessä piikissä.

Yhteen kerätyt jakeet dialysoidaan 0,2 M ammonium-asetaattipuskuria vastaan, jonka pH on 7,0, ja joka sisäl- p tää 0,1 % Synperonic :iä, ja sijoitetaan pylvääseen, joka sisältää monoklonaalista vasta-ainetta 407A.15.27, joka kohdistuu t-PA:n ensimmäistä kringlealuetta vastaan p ja on kiinnitetty Sepahrose 4B rhen, ja tasapainotetaan 0,2 M ammoniumasetaattipuskurilla, jonka pH on 7,0,

O

ja joka sisältää 0,1 % Synperonic :ia, jotta endogeeninen t-PA saadaan poistetuksi. Effluentti, joka sisältää UK-TPAB(BC):n, kerätään.

^ B

Puhdistetun UKITPA (BC):n käänteisfaasi-HPLC,

^ R

kun käytetään Nucleosil 300-5-C18-pylvästä, jonka mitat ovat 4 x 110 mm, osoittaa yhtä ainutta piikkiä, kun eluoidaan 30 minuutin lineaarisella gradientilla aloittamalla seoksella, jossa on 70 % liuosta A, joka 104 100106 on 0,1 % trifluorietikkahappoa sisältävä vesi, ja 30 % liuosta B, joka on 0,08 % trifuorietikkahappoa sisältävä asetonitriili, ja lopettamalla seoksella, jossa on 40 % liuosta A ja 60 % liuosta B. Kun puhdistetulle proteiinille suoritettiin N-pään sekvenssianalyysi, saatiin ensimmäisiksi kymmeneksi aminohappotähteeksi SNELHQVPSN, joka on identtinen sen sekvenssin kanssa, jonka odotetaan olevan molekyyliä koodittava DNA-sekvenssi.

Esimerkki 24: F^UPA^BC) :n ja K^UPA^BCMn puhdista minen a. Vasta-aineaffiniteettipylväiden valmistus

Kanissa tuotetut u-PA:n vasta-aineet, jotka on puhdistettu anti-u-PA-seerumista, ja monoklonaaliset vasta-aineet 405B.33.3 ja 406A.23.7, kiinnitetään syano- p geenibromidilla aktivoituun Sepharose 4B :ään (Pharmacia) valmistajan ohjeita noudattaen käyttämällä 6 mg vasta-ainetta per ml aktivoitua Sepharose:a. Geelimatriisi tasapainotetaan PBS-luoksella, joka sisältää 0,1 % Syn- p peronic :ia ja 0,1 % natriumatsidia.

B B

b. FK^UPA (BC):n ja K^UPA (BC):n kromatografinen puhdistus vasta-aine-Sepharose 4B:llä

Ravinneliuos, jossa on kasvatettu soluja (ks.

p esimerkki 22), tehdään 0,1-prosenttiseksi Synperonic :n suhteen ja sijoitetaan anti-uPA-Sepahrose 4B:hen tai 405B.33.3-Sepharose 4B:hen tai 406A.23.7-Sepharose 4B:hen. Viimeksimainitut kaksi vasta-ainetta kohdistuvat t-PA:n toista kringlealuetta vastaan. Kun on sekoitettu hitaasti 2 tuntia 4°C:ssa, vasta-aine-Sepahrose kaadetaan pylvääseen ja pestään PBS-liuoksella, joka sisältää p 1 mol/1 NaCl ja 0,1 % Synperonic :iä, kunnes 280 nm:ssä mitattu UV-absorbanssi osoittaa, ettei eluaatissa ole proteiinia. Sitten pylväs eluoidaan 0,2 M glysiini-HCl-puskurilla, pH 2,5. Jakeet kerätään putkiin, jotka

II

105 100106 sisältävät neutraloivan määrän 1 M Tris-liuosta. Korkeimman amidolyyttisen aktiivisuuden sisältävät jakeet, kun mitataan fluorometrisellä määrityksellä käyttämällä Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC-substraattia (M. Zimmermann et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 750 (1978)), yhdistetään.

Puhdistettujen FK-UPAB(BC):n ja K7UPAB(BC):n käänteisfaasi-HPLC, kun käytetään Nucleosil 300-5-C18-pylvästä, jonka mitat ovat 4 x 110 mm, osoittaa yhtä ainutta piikkiä, kun eluoidaan 30 minuutin lineaarisella gradientilla aloittamalla seoksella, jossa on 70 % liuosta A, joka on 0,1 % trifluorietikkahappoa sisältävä vesi, ja 30 % liuosta B, joka on 0,08 % trifluorietikkahappoa sisältävä asetonitriili, ja lopettamalla seoksella, jossa on 40 % liuosta A ja 60 % liuosta B. Kun puhdistetuille proteiineille suoritetaan N-pään viiden ensimmäisen tähteen sekvenssianalyysi, saadaan K2UPAB(BC): ll&SYQGN ja FK2UPAB(BC): lie SYQVI, jotka sekvenssit ovat identtisiä odotettujen, vastaavia molekyylejä koodittavien DNA-sekvenssien kanssa.

Esimerkki 25: Plasminoqeenin yhdistelmäaktivaattorien aktiivisuusmääritykset fibrinogeenifraqmenttien läsnäollessa ja poissa ollessa Tässä käytetään kaksivaiheista mittausta, joka on selostettu julkaisussa Verheyen et ai., Thromb.

Haemost. 4j3, 266 (1982), ja joka perustuu plasminogee-nin muuttumiseen plasmiiniksi plasminogeeninaktivaattorin vaikutuksesta sekä tämänjälkeiseen reaktioon, jossa plasmiini reagoi kromogeenisen plasmiininsubstraatin, H-D-valyyli-L-leusyyli-L-lysiini-p-nitroanilididihydro-kloridin kanssa. Määritys suoritetaan 96 kolon mikro- τ> titterilevyssä ja käyttämällä Titertek -mikrotitterile-vynlukijaa. Kolot sisältävät 120-X jul 0,1 M Tris.HCl-puskuria, jonka pH on 7,5, ja joka sisältää 0,1 % Tween 106 100106 80, 20 ui Glu-plasminogeenia pitoisuutena 1,3 ^imol/1 edellä mainitussa Tris-puskurissa, 100 jil plasmiinin substraattia pitoisuutena 0,7 mmol/1 Tris-puskurissa, X jil näytettä, jolla on tunnettu konsentraatio (X vastaa 10, 20, 40 ja 60 ^il vastaavasti), tai urokinaasistan-dardia, jolla on kansainvälisissä yksiköissä ilmaistu määritelty aktiivisuus, ja 10 |il stimulaattoria (fibri-nogeenifragmentteja) pitoisuutena 3 mg/ml tislatussa vedessä tai 10 jdl tislattua vettä, jos kokeet halutaan suorittaa ilman stimulaattoria. Kasvanut valon absorptio jaettuna inkubointiajan neliöllä on verrannollinen plasminogeeninaktivaattoriaktiivisuuteen, kun aktivaat-torin konsentraatio tunnetaan, ja aktiivisuus ilmaistaan kansainvälisinä yksiköinä. Standardina on käytetty suurimolekyylimassaista urokinaasia, jolla on määritelty, kansainvälisissä yksiköissä ilmaistu aktiivisuus (American Diagnostics). Kukin plasminogeeninaktivaattori on määritetty identtisissä olosuhteissa ilman fibrino-geenifragmenttejä ja niiden läsnäollessa vastaavasti. Näissä olosuhteissa on saatujen aktiivisuuksien erotus mitta sille plasminogeeninaktivaattorien stimuloitumisel-le, jonka fibrinogeenifragmentit saavat aikaan. Analyysitulokset on esitetty taulukossa 2 ja niistä ilmenee, ettei urokinaasistandardin kohdalla ole stimuloi-• tumista, mutta sen sijaan fibrinogeenifragmentit sti muloivat uusia plasminogeeninaktivaattorimolekyylejä, jotka sisältävät urokinaasin katalyyttisen osakokonaisuuden. Huolimatta plasminogeenin kudosaktivaat-torin yhden tai useamman ei-katalyyttisen osakokonaisuuden F, G, K1 tai K2 puuttumisesta, havaitaan kaikilla testatuilla yhdistelmämolekyyleillä fibrinogeenifragment-tien aiheuttama stimuloituminen.

il W7 100106

Taulukko 2

Plasminogeenin aktivaattori kansainvälistä yksikköä stimuloituneena/kansainvälistä yksikköä stimuloitu-mattomana u-PA-standardi 1,0 FGK2UPAB(BC) 5,0 FK2UPAB(BC) 10,0 K2UPAB 6,0 FUPAB 3,6

Esimerkki 26: Plasminogeenin aktivaattorimutanttien hyy tymiä liuottava vaikutus

Hyytymiä liuottava vaikutus määritetään julkaisussa R.D. Philo ja P.J. Gaffney, Thromb. Haemost. 45, 107-109 (1981) kuvatulla menetelmällä. Kun liukenemisaika piirretään logaritmisesti plasminogeenin aktivaattorin kon-sentraation suhteen, saadaan suora viiva. Plasminogeenin aktivaattorin ominaisaktiivisuus määritetään vertaamalla käyriin, jotka on saatu plasminogeenin kudosaktivaatto-rin tai urokinaasin standardivalmisteille.

Kaikkien mitattujen aktivaattorien käyrillä on suunnilleen sama kulma, mikä mahdollistaa suoran suhteuttamisen hyytymän liukenemiseen tarvittavan ajan ja ominais-aktiivisuuden välille. Koska eri plasminogeeninaktivaat-toreilla ei ole sama molekyylimassa, pitää ominaisaktii-visuudet ilmaista molaarisina pitoisuuksina eikä massan mukaisina pitoisuuksina, kuten on tavallista, jotta eri molekyylien tehokkuuksille saadaan mielekäs kriteeri.

D

UK2TPA (BC):n havaitaan olevan vähintään yhtä aktiivinen kuin t-PA-standardi, kun taas FGK2UPAB(BC) ja FK2UPAB(BC) osoittavat aktiivisuuksia, jotka ovat lähes samat kuin t-PA mutta merkittävästi korkeammat kuin u-PA-

TJ

standardilla. K2UPA (BC):n aktiivisuuden havaitaan olevan lähes identtinen u-PA-standardin aktiivisuuden kanssa. Yhteenveto määrityksissä saaduista aktiivisuuksista on esitetty taulukossa 3: 108 1 00 1 06

Taulukko 3

Plasminogeenin akti- hyytyinänliuotusyksikköä/pmol* vaattori t-PA-standardi 23,6 UK2TPA(BC) 28,6 u-PA-standardi 13,2 FGK2UPAB(BC) 24,3 FK2UPAB(BC) 20,7 K2UPAB(BC) 10,4 FUPAB(BC) 2,7 *Hyytymänliuotusyksiköt ilmaistaan pikomooleina t-PA:ta käyttämällä t-PA:n molekyylimassaa, joka perustuu sen aminohappojärjestykseen, sekä ominaisaktiivisuutta 400 000 hyytymänliuotusyksikköä/mg

Esimerkki 27; Plasminogeeninaktivaattorin mutanttimole-kyylien puhdistuma kanien verenkierrosta 1. Leimaaminen

Kaikki mutanttimolekyylit leimataan radioaktiivises- 125 ti I:llä käyttämällä jodogeenimenetelmää (P.J. Fraker et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80^ 849-857 (1978)).

125

Jotta ylimääräinen vapaa I saadaan poistetuksi, mutanttimolekyylit affiniteettipuhdistetaan joko esimerkissä 23 kuvatulla menetelmällä (plasminogeeninaktivaat-torit, joissa on t-PA:n B-ketju) tai esimerkissä 24 kuvatulla menetelmällä (plasminogeeninaktivaattorit, joissa on u-PA:n B-ketju).

Saavutetut ominaisradioaktiivisuudet ovat tavallisesti 2-20 yuCi/pg. Leimattujen molekyylien homogeenisyys todetaan SDS-elektroforeesilla ja sitä seuraa-valla röntgenautoradiografiällä. Kaikissa tapauksissa mutanttimolekyylit vaeltavat pelkistämättömissä olosuhteissa yhtenä vyöhykkeenä ja niiden Mr-arvot ovat identtiset leimaamattomien proteiinien Mr-arvojen kanssa.

li 109 100106 2. Puhdistumatutkimukset

Kokeet suoritetaan Uuden Seelannin kaneilla, joiden paino on 1,8 - 2,4 kg. Eläimet nukutetaan antamalla

D

subkutaanisti 1750 mg/kg Urethan :ia (Merck, Darmstadt, Länsi-Saksa). Suoritetaan tracheotomia ja sijoitetaan muoviputki ulkoiseen kaulalaskimoon ja yhteiseen pääval-timoon. Kaulalaskimoon injektoidaan 0,5 ml fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta, joka sisältää noin 300 - 500 ng plasminogeeninaktivaattorimutant-tia, verinäytteet otetaan sarjassa (kukin 2 ml) peräjälkeen 60 minuutin välein yhteisen päävaltimon kautta.

Verinäytteet kerätään sitraattiin, sentrifugoi-daan välittömästi 15 minuuttia nopeudella 3000 min * ja plasma dekantoidaan. Erät saostetaan 10-prosentti-sessa etikkahapossa ja pelletit lasketaan gammalaski-messa.

Kun verrataan Bowes-melanoomasolulinjasta eristettyyn t-PA:han, on mutanteilla suraavat puoliintumisajat verenkierrossa.

Taulukko 4

Plasminogeenin Verenkierrossa olevan plasmino- yhdistelmäaktivaattori geeninaktivaattorin puoliintu misaika (min) t-PA 2 UK2TPAB(BC) 20 FGK2UPAB(BC) 10 FK2UPAB(BC) 10 K2UPAB(BC) 30 - 40 t-PA:n puhdistumakuvio on tyypillisesti biekspo- nentiaalinen niin, että siinä on hyvin nopea alfa-vaihe ja sitä seuraa hitaampi beeta-vaiheen eliminoituminen.

B B

UK2TPA (BC):n ja K2UPA (BC):n eliminoitumiset ovat lähes yksivaiheisia, mikä viittaa siihen,että jakautuminen toiseen osastoon on tukahtunut.

110 100106 3. Jakautuminen elimiin

Kanit käsitellään edellä kuvatulla tavalla. 20 minuutin kuluttua jodinoitujen mutanttimolekyylien injek-toinnista kanit surmataan, pääelimet otetaan, niiden painot mitataan ja homogenoidaan erät ja mitataan ne gamma-laskimessa.

Taulukko 5

Talteen saatu radioaktiivisuus (%) t-PA UK2TPAB(BC) k2upab(bc) maksa 40 10 7 sydän <1 <1 <1 keuhkot <1 <1 <1 perna <1 <1 <1 munuaiset 1,6 2 4

Plasminogeeninaktivaattorimutanteilla näyttää suurempi radioaktiivisten molekyylien osuus pysyvän verenkierrossa (supra), mikä sattuu yhteen paljon pienentyneen maksan puhdistuman kanssa. Vähäisempi sisäänotto maksan toimesta on näin ollen selitys _ n mutanttimolekyylien (esityisesti UKITPA (BC) ja K2UPA (BC)) pidentyneelle puoliintumisajalle ja yksivaiheiselle eliminoitumiskuviolle.

Esimerkeissä 28 - 34 käytetään plasmideja pCGC5/K2UPAB, pCGC6/FUPAB, pCGC7/FK2UPAB ja pCGC8/ FGK2UPAB (ks. esimerkki 18) plasmidien rakentamiseen hiivassa tapahtuvaa ilmentämistä varten. Hiivan invertaasin signaalisekvenssi liitetään lukuvaiheis-tukseen erikoodittavien sekvenssien kanssa. Ne ilmentyvät indusoitavissa olevan PH05-promoottorin ohjauksessa. Joissakin rakenteissa on mutatoidut glykosy-loitumiskohdat.

Esimerkki 28: Faagin F1 replikoitumisenaloituskohdan kloonaaminen ilmentämisvektoriin pJDB207; pEMBL-perheen plasmidit (Dente et ai., Nucl. Acids. Res. 11, 1645-55 (1983)) sisältävät faagin Fl-alueen,

II

111 100106 joka antaa kaikki cis-toimintaelementit DNA:n replikoitu-mista ja morfogeneesiä varten. Vain suorittamalla su-perinfektio faagilla F1 (auttaja), erittyy suuria määriä yksisäikeistä plasmidi-DNA:ta ravinnealustaan.

Plasmidi pEMBL19(+) katkaistaan Scal:llä ja EcoRI: llä. Eristetään 2,2 ke:n fragmentti, joka sisältää ampi-silliiniresistenssigeenin plasmidista pBR322 (Scal-kohta), Fl-intergeenisen alueen ja osan β-galaktosidaasigee-nistä monikytkijäalueeseen asti (EcoRI-kohta).

Plasmidi pJDB207 linearisoidaan katkaisemalla Hpal: llä. 10 ^ig linearisoitua plasmidia katkaistaan osittain 7,5 yksiköllä EcoRI:tä siten, että läsnä on 0,1 mg/ml etidiumbromidia, reaktioajan ollessa 40 minuuttia 37°C: ssa. Reaktio pysäytetään lisäämällä 10 mM EDTA-liuosta.

1,8 ke:n EcoRI-Hpal-fragmentti eristetään preparatiivi-sessa 0,8-prosenttisessa agaroosigeelissä.

3 ^ig Hpal:llä katkaistua pJDB207:ää katkaistaan vielä Seal:llä. 4,8 ke:n suuri Hpal-Scal-fragmentti eristetään. DNA-fragmentit elektroeluoidaan agaroosi-geelipaloista ja puhdistetaan DE52-kromatografisesti ja etanolisaostuksella.

0,2 pikomoolia 2,2 ke:n Scal-EcoRI-frag- menttia ja 0,2 pikomoolia 1,8 ke:n EcoRI-Hpal-fragmenttia ja 0,1 pikomoolia Hpal-Scal-vektorifragmenttia liitetään yhteen. Yhteenliittämisseoksella transformoidaan trans- 2+ formointikelpoiset E. coli HB101 Ca -solut.

12 ampisilliiniresistentin pesäkkeen plasmidi-DNA analysoidaan EcoRI/Pstl-kaksoiskatkaisulla. Valitaan yhden kloonin DNA, jossa on oikeat restriktiofragmentit, ja sille annetaan nimeksi pJDB207FlLac.

Esimerkki 29: Plasmidin pJDB207/PHQ5-I-FK2UPAB rakenta minen

B B

Plasmidissa pCGC7/FK2UPA läsnä oleva FK^UPA :n koodittava sekvenssi täydennetään hiivassa tapahtuvaa ilmentämistä varten liittämällä siihen hiivan invertaasin 112 100106 signaalisekvenssi, 3a geeni ilmennetään PH05-promoottorin ohjauksessa.

Plasmidi pCGC7/FK2UPAB (ks. esimerkki 18D) katkaistaan Pstlillä ja BamHI: lä. 1147 ep:n Pstl-BamHI- g fragmentti sisältää FISUPA :tä koodittavan sekvenssin, joka ulottuu t-PA:n nukleotidiasemassa 199 olevasta Pstl-kohdasta (kuva 1) u-PA:n asemassa 1322 oivaan BamHI-kohtaan (kuva 3).

Plasmidi pJDB207/PHO5-I-TPA (ks. esimerkki 6C) katkaistaan Sällillä ja PstI:Llä. 891 ep:n fragmentti eristetään. Se sisältää PH05-promoottorin, invertaa-sin signaalisekvenssin ja 19 t-PA:n emästä (Pstl-kohta).

Plasmidi pJDB207/PHO5-I-UPA (ks. esimerkki 8) katkaistaan Sällillä ja BamHI:llä. 6,6 ke:n vektorifrag-mentti sisältää u-PA:n geenin 3'-osan nukleotidiasemassa 1323 olevasta BamHI-kohdasta (kuva 3) asemaan 1441 (PvuII-kohta, johon on lisätty Xhol-kytkijä) sekä PH05:n transkr ipt ionlopetvissignaalit.

0,2 pikomoolia 891 ep:n Sali-Pstl-fragmenttia ja 0,2 pikomoolia 1147 ep:n Pstl-BamHI-fragmenttia ja 0,1 pikomoolia 6,6 ke: n Sali-BamHI :vektor if ragmentt ia liitetään yhteen ja yhteenliittämisseoksella transfor- 2+ moidaan E. coll HB101 Ca -solut.

8 ampisilliiniresistenttiä pesäkettä kasvatetaan LB-alustassa, joka sisältää ampisilliiniä 100 mg/1.

Plasmidi-DNA eristetään ja analysoidaan EcoRI- ja Hindlll- restriktiokatkaisulla. Valitaan yksi plasmidi, jossa on halutut restriktiofragmentit, ja sille annetaan nimeksi pJDB207/PHO5-I-FK2UPAB.

Plasmideja pCGC6/FUPAB jap CGC8/FGK-UPAB voidaan

^ B

käyttää samalla tavalla kuin plasmidia pCGC7/FK2UPA .

Näin saaduille hiivan ilmentämisplasmideille annetaan vastaavasti nimiksi pJDB207/PHO5-I-FUPAB ja pJDB207/ PH05-I-FGK2UPAB.

li 113 100106

Esimerkki 30: Urokinaasin B-ketjun glykosyloitumiskoh- dan (Asn 302) mutatointi: a) u-PA:n Pstl-BamHI-fragmentin kloonaaminen M13mpl8:aan: Plasmidi pJDB207/PHO5-I-UPA (ks. esimerkki 8) sisältää urokinaasin täydellisen koodittavan alueen.

DNA katkaistaan Pstl:llä ja BamHIillä. Urokinaasigee-nin 886 ep:n Pstl-BamHI-fragmentti sisältää glykosyloi-tumiskohdan (Asn 302) nukleotidiasemissa 1033-1041.

Toinen samaa kokoa oleva fragmentti katkaistaan vielä BstEII:lla. 886 ep:n Pstl-BamHI-fragmentti eristetään 0,8-prosenttisessa preparatiivisessa agaroosigeelissä.

M13mp RF-DNA katkaistaan Pstl:llä ja BamHIrllä.

7,3 kein fragmentti eristetään 0,8-prosenttisessa preparatiivisessa agaroosigeelissä. DNA-fragmentit elektro-eluoidaan agaroosigeelistä ja puhdistetaan DE52-kromato-grafisesti ja etanolisaostuksella.

0,1 pikomoolia 7,3 ke:n Pstl-BamHI-vektoria ja 0,2 pikomoolia 886 ep:n Pstl-BamHI-u-PA-fragmenttia liitetään yhteen. 1 ulilla ja 3 ulilla yhteenliittämis- ' 2+ seosta transformoidaan E. coli JM109 Ca -solut käsikirjassa "M13 cloning and sequencing handbook" kuvatun menetelmän mukaisesti (julkaisija Amersham). 12 väritöntä plakkia poimitaan ja valmistetaan yksisäikeinen DNA (J. Messing, Methods in Enzymology 101, 21-78 (1983)). Yksisäikeisestä DNAista valmistetaan osittain kaksisäi-keinen DNA emäspariuttamalla ja jatkamalla M13-universaa-lialuketta Klenow-polymeraasin avulla. Reaktiotuote uutetaan fenoli/kloroformilla ja DNA saostetaan etanolilla. DNA katkaistaan Pstlillä ja BamHIillä. 886 ep:n fragmentti osoittaa, että u-PA-fragmentti on tullut kloonatuksi M13mpl8-vektoriin. Yksi klooni jatko-analysoidaan ja oikea liitännäinen varmistetaan sekven-toimalla. Kloonille annetaan nimeksi M13mpl8/UPA.

114 100106 b) Asn302:ssa olevan glykosyloitumiskohdan mutatointi: 302

Mnmpie-iii- A Ser Thr tannainen (koodi ttama ton 3'...AAA CCT TTT CTC ΤΊΑ AGA TGG CTG ATA..5' säie):

Mutatoiva aluke W: 5'-GGA AAA GAG CAA TCT ACC GAC-3'

MutatOltll 5’... TTT GGA AAA GAG CAA TCT ACC GAC TAT.. 3' koodittava - säie: Gin

sekventointialuke: CTGCCCTCGATGTATAACG

967 985

Mutatointialuke ja sekventointaluke syntetisoidaan fosforamidiittimenetelmää käyttämällä (M.H. Caruthers, teoksessa Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments, toim. H.G. Gassen ja A. Lang, Verlag Chemie, Wein-heim, Länsi Saksa) Applied Biosystem Model 380B-synteti-saattorilla.

In vitro-mutatointi yksisäikeisellä templaatti-DNA:lla suoritetaan julkaisussa T.A. Kunkel, Proc. Nat.

Acad. Sci. USA 82, 488-492 (1985) kuvatulla menetelmällä. Urasiilia sisältävä yksisäikeinen templaatti-DNA tuote-. taan kasvattamalla yksi kierros E. coli-kannassa RZ1032 (dut , ung~).

100 pikomoolia mutatoivaa oligonukleotidialuketta W fosforyloidaan 20 ^ulissa liuosta, jossa on 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP ja 20 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia (Boehringer).

·. Kun on inkuboitu 30 minuuttia 37°C:ssa, reaktio pysäy tetään kuumentamalla 10 minuuttia 70°C:ssa.

0,3 pikomoolia urasiilia sisältävää M13mpl8/UPA-templaatti-DNA:ta inkuboidaan 10 pikomoolin kanssa fosforyloitua, mutatoivaa oligodeoksiribonukleotidialu-ketta W ja 10 pikomoolin kanssa M13-universaalisekven- >1 115 100106 tointialuketta 30 plrssa liuosta, jossa on 10 mM Tris-HC1, pH 8,0, ja 10 mM MgC^· Näyte kuumennetaan 80°C: seen ja annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan pienessä vesihauteessa.

c) Jatkamis-yhteenliittämisreaktio:

Edellä saatuun emäspariutettuun näytteeseen lisätään 10 pl entsyymi-dNTP-seosta, joka sisältää 1 mM dNTP-laatuja, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgC^, 20 mM DTT, 1 mM ATP, 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs, 400 yksikklä/pl) ja 6 yksikköä Klenow DNA-polymeraasia (Boehringer, 6 yksikklöä/pl). Inkuboidaan 15°C:ssa yön yli.

d) E. coli BMH71-solujen transformointi:

Yhteenliittämisseos laimennetaan 200 plrksi TE- puskurilla. 0,1 pii, 1 pl ja 10 pii jatkamis-yhteenliittä- misseosta lisätään transformointikelpoisiin E. coli 2+ BMH71 Ca -soluihin (Kunkel, supra). Kun on pidetty 30 minuuttia jään päällä, soluille annetaan 3 minuutin lämpöshokki (42°C) ja sen jälkeen pidetään jään päällä. Soluja maljataan pinta-agarin ja E. coli JM101-indi-kaattorisolujen kanssa.

Poimitaan 6 plakkia, joilla infektoidaan E. coli JM109. Faagit eristetään emäliuoksesta PEG-saostuksel-la. Yksisäikeinen DNA valmistetaan uuttamalla fenolillla ja saostamalla etanolilla. Templaatti-DNA:t uudelleen-suspendoidaan TE-puskuriin.

AAT-kodonin (Asn302) mutatoituminen CAA-kodoniksi (Gln302) varmistetaan yhdestä kloonista määrittämällä DNA-sekvenssi käyttämällä edellämainittua sekventointi-aluketta ja ketjunkatkaisumenetelmää (F. Sanger et ai.,

Proc. Nat. Acad. Sei USA 74, 5463-67 (1977)). Muta-toinnissa Asn on muuttunut Gln:ksi u-PA:n aminohappo-asemassa 302, mikä muutos eliminoi urokinaasin sisältämän ainoan glykosyloitumiskohdan. W tarkoittaa mu- 116 100106 taatiota u-PA:n B-ketjun glykosyloitumiskohdassa (Asn302—*-Gln302). Positiiviselle kloonille annetaan nimeksi M13mpl8/UPA-W.

Esimerkki 31; Urokinaasin B-ketjun mutaation (Gln302) g siirtäminen FK^UPA -yhdistelmään

Plasmidi pJDB207/PHO5-I-FK2UPAB katkaistaan Sali: llä ja XhoI:llä. 2,2 ke:n Sall-XhoI-fragmentti eristetään, elektroeluoidaan agaroosigeelistä, puhdistetaan DE52-kromatografisesti ja saostetaan etanolilla. Tämä DNA-fragmentti sisältää kaksi Mstl-kohtaa, jotka ovat PH05-promoottorissa ja u-PA-sekvenssissä. 3 jig 2,2 ke:n Sali-XhoI-fragmenttia katkaistaan osittain 3 yksiköllä Mstl:tä inkubointiajan ollessa 10 minuuttia 37°C:ssa. Reaktiotuotteet erotetaan 0,8-prosentti-sessa preparatiivisessa agaroosigeelissä ja 1651 ep:n Sali-Mstl-fragmentti eristetään ja elektroeluoidaan geelistä. DNA-fragmentti sisältää pBR322:n Sall-BamHI-fragmentin, PH05-promoottorin, invertaa- g sin signaalisekvenssin ja FISUPA :n koodittavan sekvenssin Mstl-kohtaan, joka on u-PA-osan nukleotidiasemassa 935.

RF-DNA valmistetaan M13mpl8/UPA-W:lie (Ks. esimerkki 30) nopealla DNArneristysmenetelmällä (D.S. Holmes et ai., Analyt. Biochem. 114, 193-97 (1981)). 5 jig DNA:ta katkaistaan BamHI:llä ja Mstl:llä. Lisätään 2 jig RNaasia (Serva), inkuboidaan 5 minuuttia 37°C:ssa ja 387 ep:n Mstl-BamHI-fragmentti eristetään 0,8-pro-senttisessa preparatiivisessa agaroosigeelissä. DNA-fragmentti elektroeluoidaan ja saostetaan etanolilla.

Tämä fragmentti sisältää mutaation ATT—*-CAA urokinaasin B-ketjun nukelotidiasemissa 1033-1035 (Asn302—**

Gin).

Plasmidi pJDB207/PHO5-I-UPA katkaistaan Sällillä ja BamHI:Hä. 6,6 ke:n vektorifragmentti (ks. esimerkki 29 ) eristetään. 0,2 pikomoolia 1651 ep:n Sall-MstI- 11 117 100106 fragmenttia, 0,2 pikomoolia 387 ep:n Mstl-BamHI-fragmenttia ja 0,1 pikomoolia 6,6 ke:n Sali-BamHI-fragmenttia liitetään yhteen. Transformointikelpoiset E. coli HB101 Ca^+-solut transformoidaan.

Kasvatetaan 12 ampisilliiniresistenttiä transformant tia. Plasmidi-DNA eristetään ja analysoidaan katkaisemalla EcoRI:llä ja HindIII:lla. Mutaatio (W) glykosyloitumiskohdassa tuhoaa nukleotidiasemissa 1032-1037 olevan EcoRI-kohdan. Mutaation läsnäolo varmis-taan sekventoinnilla. Yhdelle plasmidille, jossa on mutaatio u-PA:n B-ketjussa, annetaan nimeksi pJDB207/ PH05-I-FK2UPA -W. Tässä plasmidissa on ehjä glykosy-loitumiskohta kringlealueessa K2, mutta mutatoitunut kohta W( Asn302-*Gln) u-PA:n B-ketjussa.

Plasmidit pJDB207/PHO5-I-FUPAB-W ja pJDB2 07/PH05-I-FGK2UPAB-W

rakennetaan samalla tavalla lähtemällä mutatoitumatto-mista plasmideista (ks. esimerkki 29).

Plasmidin pJDB207/PHO5-I-FK2UPAB-W 4,8 ke:n Sall-Hpal-vektoriosa korvataan plasmidin pJDB207FlLac (ks. esimerkki 28) 6,2 ke:n Sall-Hpal-vektorifragmentilla.

6,2 ke:n fragmentissa on plasmidin pEMBL19 1,4 ke:n FILac-liitännäinen kloonattuna plasmidin pJDB207 4,8 ke:n fragmenttiin. Suoritetaan yhteenliittäminen, • transf oonionti ja uuden rakenteen analyysi ja yhdelle oikealle plasmidille, jossa on FILac-liitännäinen, annetaan nimeksi pJDB207FlLac/PHO5-I-KF2UPAB-W.

Plasrnidi pJDB207FlLac/PHO5-I-FGK2UPAB-W saadaan samalla tavalla.

Samalla tavalla plasmidin pJDB207/PHO5-I-MOU- _ n K2TPA (ks. esimerkki 15C) 4,8 ke:n Sall-Hpal-vektori-osa korvataan plasmidin pJDB207FlLac 6,2 ke:n Sall-Hpal-vektorifragmentilla. Saadulle plasmidille annetaan nimeksi pJDB207Fl/PHO5-I-UK2TPAB. Plasmidit pJDB207FlLac/PHO5-I-UK2UPAB, pJDB207FlLac/PHO5-I-TPA^PA® ja pJDB207FlLac/PHO5-I-UPAATPAB saadaan vas- 118 100106 taavalla tavalla plasmideista, joissa ei ole FlLac-vek-torif ragmenttia.

n

Esimerkki 32: FK^UPA -W:n kringle Koissa olevan qlyko- syloitumiskohdan mutatointi: a) Yksisäikeisen templaatin valmistus:

Plasmidilla pJDB207FlLac/PHO5-I-FK9UPAB-W transfor- ^ 2+ miodaan transformointikelpoiset E. coli RZ1032 Ca -solut (T.A. Kunkel, supra). Yhtä ampisilliiniresistenttiä pesäkettä kasvatetaan LB-alustassa, johon on lisätty 100 pg/ml ampisilliiniä, 20 pg/ml tymidiiniä ja 20 pg/ml deoksiadenosiinia. Kun solutiheys on 1 x 108 solua/ml, solut kerätään talteen, pestään LB-alustalla ja uudelleen-suspendoidaan LB-alustaan, joka sisältää 100 ;ag/ml ampisilliiniä ja 0,25 pg/ml uridiiniä. Kun optinen tiheys OD^qq on 0,3, lisätään auttajafaagia R408 (Pharmacia-PL Biochemicals, Inc.) m.o.i.-arvoon 20.

Viljelmää ravistellaan voimakkaasti 5 tuntia 37°C:ssa. Urasiilia sisältävä yksisäikeinen DNA, joka on ravinne-alustassa, eristetään T.A. Kunkel:in (supra) kuvaamalla tavalla. Lähtemällä plasmidista pEMBL19(+) (ks. esimerkki 28) Fl-alue kloonataan plasmidiin pJDB207 niin, että alueen suunta tulee olemaan vastapäivään. Eris- 3 . tetty yksisäikeinen DNA on F^UPA -liitännäisen koodittava säie ilmentämisplasmidissa.

b) t-PA:n kringle ^-alueen Asnl84-glykosyloitumiskoh-dan mutatointi

Mutatointi koskee glykosyloitumisen kohteena olevan, tunnistetuksi tulevan konsensusaminohapposekvens-sin kolmatta asemaa. Serl86 korvataan Ala:11a.

119 100106 184 186

Yksisäikeinen Asn Ser DNA (koodit- 5 ' . . .GGG AAT GGG TCA GCC TAC CGT...-3’ tava säie): mutatoiva aluke Y: 3’- CC TTA CCC CGT CGG ATG -5'

Mutatoitu koodittava 5'...GGG AAT GGG GCA GCC TAC CGT...-3' säie: Asn Gly Ala

Sekventointi- 5’-CCACGGGAGGCAGGAGG-3' aiuke; 775

Mutatointimenetelmä on selostettu esimerkissä 30. M13-universaalialukkeen tilalla käytetään PH05-

oligonukleotidialuketta, jonka kaava on 5'-AGTCGAGGTTAGT

ATGGC-3', joka hybridisoituu nukleotideihin -60 - -77 ATG:stä lukien PHOS-promoottorissa. Jatkamis- ja yhteenliittämisreaktion jälkeen transformoidaan trans- 2+ formointikelpoiset E. coli BMH71 Ca -solut (Kunkel, supra). Ampisilliiniresistentit pesäkkeet poimitaan ja niitä kasvatetaan LB-alustassa, joka sisältää 100 mg/1 ampisilliiniä. Valmistetaan plasmidi-DNA ja siitä analysoidaan mutaation läsnäolo DNA:n sekventoinnin avulla. TCA-kodonin mutatoituminen GCA-kodoniksi saa aikaan Ser:n muuttumisen Ala:ksi t-PA:n aminohappo-asemassa 186. Konsensussekvenssin kolmannessa asemassa tapahtunut mutaatio eliminoi glykosyloitumiskohdan. Yhdelle kloonille, jossa on mutatoitunut DNA, annetaan nimeks i pJDB2 07FlLac/PH05 -1 -FISUPA® -WY.

Y tarkoittaa mutaatiota Asnl84-glykosyloitumis-kohdassa, joka on t-PA:n K2-alueella, ja W tarkoittaa mutaatiota u-PA:n B-ketjun Asn302-kohdassa. Saadussa

B

glykosyloitumattomassa FISUPA -yhdistelmäproteiinissa on kaksi aminohappomuutosta: Ser186—*- Ala, joka on t-PA:n kringle K2-alueella, ja Asn302—»-Gin, joka on .. u-PA:n B-ketjussa.

120 100106

Kun plasmidille pJDB207F^Lac/PHO5-I-FGK2UPAB-W (ks. esimerkki 31) suoritetaan vastaava mutatointi, saadaan plasmidi pJDB207FlLac/PHO5-I-FK.,UPAB-WY,

^ B

joka koodittaa glykosyloitumatonta FG^UPA -yhdistelmä-proteiinia.

Esimerkki 33: Plasmidin pJDB207/PHQ5-I-K.,UPAB-WY

rakentaminen;

Plasmidi pCGC5/K2UPAB sisältää K2UPAByhdistelmä-proteiinia koodittavan nukleotidisekvenssin, joka määritellään aminohapposekvenssinä tPA(Serl-Gln3)(Glyl76-Arg275)-uPA(Ilel59-Leu411). Hiivassa tapahtuvaan ilmentämiseen käytetään indusoitavissa olevaa PH05-promoot-toria ja invertaasinsignaalisekvenssi on liitettynä

D

lukuvaiheistukseen K^UPA ;tä koodittavaan alueeseen. Plasmidi pCGC5/K2UPAB katkaistaan BglII:lla ja Accl: llä. 487 ep:n Bglll-Accl-fragmentti eristetään. Se sisältää koodittavan sekvenssin, joka ulottuu t-PA:n Bglll-kohdasta (nukleotidiasema 178) u-PA:n Accl-kohtaan (nukleotidiasema 779). Tämä fragmentti katkaistaan Hphlillä, jolloin tuloksena on 4 fragmenttia.

Kaksi oligodeoksiribonukleotidia, joiden kaavat ovat . Aan |Ala| (I) 5' -CTGCATCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAAIGGGGCAGCCTACCOTGGCACG- 3' (II) 3'- AGAAIGGTTCCTTTGTCACTGACGAIGAAACCCTTACCCCGTCGGATGGCACCGTG -5' f syntetisoidaan käyttämällä Applied Biosystem Model 380B-syntetisaattoria ja fosforamidiittimenetelmää. Oligonukleotidit I ja II muodostavat kaksisäikeisen DNA-kytkijän. Epätasaisessa 5'-päässä olevat 5 nukleotidia ovat osa hiivan invertaasin signaalisekvenssis-tä ja niitä seuraa t-PA:n koodittava sekvenssi (Serl-Gln3)(glyl76-Thrl91), joka ulottuu ensimmäiseen Hphl: llä katkaistuun nukleotidiasemaan 752 (ks. kuva 1). Glykosyloitumiskohta asemissa 729 - 737 (AsnGlySer) on 121 100106 mutatoitu kodonista TCA (Ser) kodoniksi GCA (Ala), jolloin glykosyloitumisen tunnistuskohta on tullut eliminoiduksi. t-PA:n aminohappoasemissa 184 - 186 sijaitsevalle glykosyloitumiskohdalle itoinen glykosyloitumiskoh- ta aidossa t-PA:ssa) annetaan nimeksi Y.

Oligonukleotidit I ja II fosforyloidaan 5'-päistään, kuumennetaan 10 minuuttia 85°C:ssa ja emäspariu-tetaan jäähdyttämällä huoneenlämpötilaan. 10,5 jig (270 pikomoolia) kinasoitua, kaksisäikeistä kytkijä-DNA:ta liitetään yhteen 30-kertaisena ylimääränä Hphl:llä katkaistuja DNA-fragmentteja (ks. edellä), kuten esimerkissä 8B on selostettu. Kytkijäylimäärä poistetaan saostamalla isopropanolilla. DNA katkaistaan vielä Scalrllä. 252 ep:n fragmentti eristetään 1,5-prosentti-sessa preparatiivisessa agaroosigeelissä, elektroeluoi-daan ja saostetaan etanolilla.

Plasmidi p31RIT-12 (ks. esimerkki 6b) katkaistaan Sallrllä ja XhoI:llä. Eristetty fragmentti katkaistaan vielä Hgal:llä (ks. esimerkki 6C) ja BamHI:llä. Saatu 591 ep:n fragmentti eristetään. Se sisältää PH05-promoot-torin ja invertaasin sLgnaalisekvenssin.

Plasmidi pJDB207/PHO5-I-FK2UPAB-W katkaistaan BamHI: 31ä. 5 jig lineaarista DNA:ta katkaistaan osittain 10 yksiköllä Scal:tä käyttämällä 10 minuutin inkubointi-aikaa. Reaktio pysäytetään lisäämällä 10 mM EDTA-liuosta.

7,7 ke:n BamHI-Seal-vektorifragmentti eristetään, elekro-eluoidaan ja saostetaan etanolilla. Se sisältää kooditta-van sekvenssin 3'-osan, joka ulottuu t-PA:n Seal-kohdasta (asema 953) u-PA:n B-ketjun loppuun (PvuII-kohta asemassa 1441 ja lisätty Xhol-kytkijä), PH05-terminaat-torin ja pJDB207-vektorisekvenssit. 0,2 pikomoolia 591 ep:n BamHI-Hgal-fragmenttia ja 0,2 pikomoolia 252 ep:n (kytkijä)-Seal-fragmenttia, jossa on epätasaiset päät, ja 0,1 pikomoolia 7,7 ke:n vektorifragmenttia 2+ liitetään yhteen. E. coli HB101 Ca -solut transformoidaan ja 12 ampisilliiniresistenttiä pesäkettä kas- 122 100106 vatetaan. Plasmidi-DNA eristetään ja analysoidaan katkaisemalla EcoRI:llä ja HindIII:lla. Mutaatioiden läsnäolo varmistetaan DNAinsekventoinnilla. Valitaan yksi oikea klooni ja sille annetaan nimeksi pJDB207/PHO5-I-K2UPAB-WY. t-PA:n kringle-K2-alueen ja u-PA:n B-ketjun sisältämät glykosyloitumiskohdat ovat molemmat mutatoituneet (Y ja W vastaavasti).

g Näin syntyneessä glykosyloitumattomassa K2UPA -yhdistelmäproteiinissa on kaksi aminohappomuutosta:

Serl86—^Ala, joka on t-PA:n K2~alueella, ja Asn302—»-Gin, joka on u-PA:n B-ketjussa.

g

Esimerkki 34: UKITPA -yhdistelmän qlykosyloitumiskoh- tien (Asnl84GlvSer) ja (Asn448ArqThr) mutatointi

Urasiilia sisältävä plasmidin pJDB207FlLac/PHO5-I- g UK2TPA yksisäikeinen templaatti (T.A. Kunkel, supra) (ks. esimerkki 31) valmistetaan esimerkissä 30 kuvatulla tavalla. Asnl84:ssä olevan glykosyloitumiskohdan mutatointi suoritetaan esimerkissä 32 kuvatulla tavalla.

Asn448-glykosyloitumiskohdan mutatointi johtaa aminohap-pomuutokseen Thr450—>-Ala.

448 450

Yksisäikeinen Asn ^r9jrHr] DNA (koodit- 5'-...CTT AAC AGA ACA GTC ACC GAC A...-3' tava säie):

Mutatoiva aluke Z: 3’-...GAA TTG TCT CGT CAG TGG CTG T...-5'

Mutatoitu koodittava 5’-...CTT AAC AGA GCA GTC ACC GAC A...-3' säie: __

Asn Arg jAla sekventointi- 5'-TGGCAGGCGTCGTGCAA-3’ aluke: 1603 1587

Mutatointimenetelmä on sama kuin esimerkissä 30 selostettu. Fosforyloidut mutatoivat alukkeet Y ja li 123 100106 Z emäspariutetaan kummatkin urasiilia sisältävään, yksi-säikeiseen pJDB207FlLac/PHO5-I-UK2TPAB-templaattiin. Haluttaessa voidaan käyttää lisäksi PH05-oligonukleo-tidialuketta (ks. esimerkki 32).

Jatkamis- ja yhteenliittämisreaktion jälkeen trans- 2+ formointikelpoiset E. coli BMH71 Ca -solut transformoidaan. Ampisilliiniresistenteistä transformanteista valmistetaan plasmidi-DNA ja analysoidaan molempien mutaatioiden läsnäolo suorittamalla DNA:n sekventointi mainittuja sekventointialukkeita käyttämällä.

Yhden kloonin plasmidi-DNA:lie, jossa on molemmat mutaatiot, annetaan nimeksi pJDB207FlLac/PHO5-I-UK2TPA -YZ. Y tarkoittaa glykosyloitumiskohdassa Asnl84 tapahtunutta mutaatiota ja Z tarkoittaa kohdassa Asn448 g tapahtunutta mutaatiota. Glykosyloitumattomassa UK2TPA -yhdistelmäproteiinissa on kaksi aminohappomuutosta:

Serl86—*>Ala, joka on t-pA:n I^-kringlealueella, ja Thr450—»-Ala, joka on t-PA:n B-ketjussa.

Tätä mutatointimenetelmää voidaan myös soveltaa templaatteihin pJDB207FlLac/PHO5-I-UK2UPAB, pJDB207FlLac/PHO5-I-TPAAUPAB ja pJDB207FlLac/PHO5-I-UPAATPAB (ks. esimerkki 31) käyttämällä mutatointialuketta W u-PA:n B-ketjussa olevan glykosyloitumiskohdanmutatointiin ja/tai muta-toivia alukkeita Y ja Z sekä muita eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 225286 julkaistuja t-PA:n gly-kosyloitumiskohtien mutatointiin.

Esimerkki 35: Saccharomyces cerevisiae GRF18:n trans- formointi ja hiivasolu-uutteiden valmistus

Saccharomyces cerevisiae-kanta GRF18 (DSM 3665) transformoidaan seuraavilla plasmideilla: 124 100106 pJDB207/PH05-I-FK2UPAB, pJDB207FlLac/PH05-I-FK2UPAB-W. pJDB207FlLac/PH05-I-FKzUPAB-VY, pJDB207F1Uc/PH05-I-UK2TPAB. pJDB207FlLac/PH05-I-UKzTPAB-YZ, pJDB207/PH05-I-K2UPAB-WY, pJDB207/PH05-I-FUPA8, pJDB207/PH05-I-FUPAB-W, pJDB207/PH05-I-FGKZUPAB, pJDB207/PH05-I-FGKZUPAB-W, PJDB207F1Uc/PH05-I-FGKzUPAB-W ja

pJDB207FlLac/PH05-I-FGKZUPA®-WY

Transformoinnit, solujen kasvatukset ja solu-uutteiden valmistukset suoritetaan esimerkissä 16 kuvatulla tavalla.

Saadut plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorit puhdistetaan samoin kuin esimerkeissä 22 - 24 on selostettu.

Esimerkki 36: Lyofilisoituien plasminogeenin yhdistelmä- aktivaattorien valmistus

Missä tahansa esimerkissä 22 - 24 saatu liuos jatkopuhdistetaan ja lyofilisoidaan seuraavalla tavalla:

Liuos laimennetaan 10 tilavuudella 0,1 M ammonium-asetaattia, pH 5,0 (kokonaistilavuus 80 ml) ja syötetään pylvääseen, joka sisältää 5 ml CM-Sepahrose Fast Flow-täytettä (Pharmacia), virtausnopeudella 25 ml/h huoneenlämpötilassa. (Pylväs on esitasapainotettu 0,1 M ammoniumasetaatilla.) Tuotteesta vapaa perkolaatti heitetään pois. Pylväs pestään 15 ml:11a 0,1 M ammonium-asetaattia, pH 5,0, ja 10 ml:11a 0,1 M ammoniumasetaat-tia, pH 7,0. Sitten adsorboitunut plasminogeenin yhdis-telmäaktivaattori eluoidaan 1 M ammoniumasetaatilla, pH 8,6, huoneenlämpötilassa (virtausnopeus 5 ml/h).

» 125 100106

Jotta vältetään kaasunmuodostus pylvääseen, eluointi suoritetaan 1-1,5 barin ylipaineessa. Eluaatin sisältämä plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorin pitoisuus mitataan UV-monitorilla (280 nm). Jae, joka sisältää hoin 90 % eluoituneesta plasminogeenin yhdistelmäakti-vaattorista, kerätään ja lyofilisoidaan. Kiinteän plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorilyofilisaatin puhtausaste on noin tai yli 95 %, kun arviointi suoritetaan HPLC-menetelmällä. Tuote on vapaa pinta-aktiivi-sista aineista.

Esimerkki 37: Farmaseuttinen koostumus parenteraalista antoa varten

Liuos, joka sisältää puhdasta uPA(1-44)-tPA(176- 527), ja joka on saatu edellä kuvatulla tavalla, dia- lysoidaan 0,3 M natriumkloridiliuosta vastaan, joka

R O

sisältää 0,01 % Tween 80 , ja varastoidaan -80 C:ssa.

Ennen antamista plasminogeeninaktivaattorin kokonaispitoisuudeksi säädetään 75 pg/ml ja NaCl-pitoisuudeksi 0,3 M. Liuos steriloidaan suodattamalla 0,22 junin kalvo-suodattimen läpi.

Edellä mainitun plasminogeeninaktivaattorin tilalla on myös mahdollista käyttää samaa määrää mitä tahansa edellisissä esimerkeissä kuvattua plasminogeeninakti-vaattorilajia, joista mainittakoon esimerkkeinä seu-raavat: uPA(l-158)-tPA(276-527), uPA( 1-131 )-tPA( 263-527), tPA(l-275)-uPA(159-411), tPA( 1-262)-uPA(132-411), uPA(l-44)-tPA(l76-261)-uPA(134-411), tPA(l-49)-tPA(262-275)-uPA(159-411), tPA(l-49)-uPA(134-411), tPA(l-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tPA(l-49)-tPA(176-262)-uPA(132-411), tPA( l-3)-tPA( 176-275)-uPA( 159-411), tPA(l-86)-tPA( 176-27 5)-uPA<159-411) tai tPA( 1 -86j -1 PA( 176-262) -uPA( 132-411) 126 100106 ja mutatoidut plasminogeenin yhdistelrn.äaktivaattorit, kuten esimerkiksi tPA(l-49)-tPA(262-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411), tPA(l-49)-tPA( 176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411), uPA(l-44)-tPA(176-185, Ala, 187-449, Ala, 451-527), tPA(l-3)-tPA( 176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411) tai tPA(l-86)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA<159-301, Gin, 303-411).

Esimerkki 38: Toinen farmaseuttinen koostumus parente- raalista antoa varten (injektioina annettava dispersio) 169,3 mg soijapavun lesitiiniä (soijapavun fosfati-di NC 95; valmistaja: Nattermann, Köln, Länsi-Saksa; puhtausaste 90 - 96 %; rasvahappokoostumus: linolihappoa 61 - 71 %, linoleenihappoa 4 - 7 %, öljyhappoa 6-13 %, palmitiinihappoalO - 15 %, steariinihappoa 1,5 - 3,5 %) ja 92,7 mg puhdasta natriumglykokolaattia liuotetaan 752,5 ml:aan steriloitua vettä. Liuoksen pH:ksi säädetään 1 N NaOH-liuoksella 7,4. Lisätään 10 mg lyofi-lisoitua uPA(1-44)-tPA(176-527). Seosta sekoitetaan, kunnes saadaan kirkas liuos. Liuos steriloidaan suodattamalla 0,22 ^im:n kalvosuodattimen läpi ja täytetään ampulleihin.

Edellä mainitun plasminogeeninaktivaattorin tilalla on myös mahdollista käyttää samaa määrää mitä tahansa edellisissä esimerkeissä kuvattua plasminogeeninakti-vaattorilajia, joista mainittakoon esimerkkeinä seuraa-vat: uPA(l-158)-tPA(276-527), uPA(l-131)-tPA(263-527), tPA(l-275)-uPA(159-411), tPA( 1-262)-υΡΑ(132-411), uPA( l-44)-tPA( 176-261 )-uPA( 134-411), tPA(l-49)-tPA(262-275)-uPA(159-411) , tPA(1-49)-uPA(134-411), tPA(l-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411), I! 127 100106 tPA( l-49)-tPA( 176-262)-uPA( 132-411) , tPA(1-3)-tPA( 176-275)-uPA(159-411) , tPA( 1 -86)-tPA( 176-275)-uPA( 159-411) tax tPA(1-86)-tPA(176-262)-uPA(132-411) tai mutatoidut plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorit, kuten esimerkiksi tPA(l-49)-tPA(262-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411), tPA(l-49)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411), uPA(l-44)-tPA(176-185, Ala, 187-449, Ala, 451-527), tPA(l-3)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA( 159-301, Gin, 303-411) tax tPA(1-86)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411).

Esimerkki 39: Kolmas farmaseuttinen koostumus parente- raalista antoa varten (bolus-injektio) 100 mg plasminogeenin yhdietelmäaktivaattoria tai plasminogeenin yhdistelmäaktivaattorimutanttia, kuten jotakin esimerkeissä 37 ja 38 kuvatuista, liuotetaan 1000 ml:aan 50 mM glutamiinihappo/natriumgluta-maattiliuosta, joka sisältää 0,7 % NaCl, ja jonka pH on 4,5. Liuoksella täytetään ampullit ja sitä voidaan antaa intravenoosisesti (bolus) infusoimalla.

Mikro-organismien talletukset

Seuraavat kannat talletettiin 23. lokakuuta, 1987 "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen"-kokoelmiin (DSM), Grisebachstrasse 8, D-3000 Göttingen, joissa niille annettiin seuraavat kokoelmanumerot: kokoelmanumero E. coli HB101/pW349F DSM 4291 E. coli HB101/pCS16 DSM 4294 E. coli HB101/pcUK176 DSM 4290 E. coli HB101/pCGA26 DSM 4296 ; E. coli HB101/pSV2911neo DSM 4292 100106 128

Seuraavat hybridoomasolulinjät talletettiin 20. marraskuuta, 1987 "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes"-kokoelmiin, Institut Pasteur,

Paris, (CNCM), joissa niille annettiin seuraavat koko-elmanumerot: hybridooma kokoelmanumero 405B.33.3 1-715 406A.23.7 1-716 407A.15.27 1-717 « 11

Claims (5)

100106

1. Menetelmä plasminogeenin yksisäikeisen yhdistelmäakti-vaattorin tuottamiseksi, joka on tPA(1-3)-tPA(176-275)-UPA(159-411), tPA(l-49)-tPA(176-275)—UPA(159-411) tai tPA(l-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tunnettu siitä, että sopivissa ravinneolosuhteissa viljellään transformoitua hiiva- tai nisäkäsisäntäsolua, joka sisältää mainittua plasminogeenin yhdistelmäaktivaattoria koodaavan DNA-sek-venssin, ja eristetään mainittu plasminogeenin yhdistel-mäaktivaattori.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuotetaan tPA(l-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411).

3. Plasminogeenin yksisäikeistä yhdistelmäaktivaattoria koodaava DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että aktivaattori on tPA(1-3)-tPA(176-275)-UPA(159-411), tPA(l-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411) tai tPA(1-86)-tPA(176-275)-UPA(159-411) .

4. Hiiva- tai nisäkäsisäntäsolussa käytettävä yhdistelmä-vektori, tunnettu siitä, että se käsittää DNA-sekvenssin, joka koodaa plasminogeenin yksisäikeistä yhdistelmäaktivaattoria, joka on tPA(l-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411), : tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411) tai tPA(l-86)- tPA(176-275)-uPA(159-411).

5. Hiiva- tai nisäkäsisäntäsolu, johon on transformoitu yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että vektori käsittää DNA-sekvenssin, joka koodaa plasminogeenin yksisäikeistä ;; yhdistelmäaktivaattoria, joka on tPA(l-3)-tPA(176-275)- UPA(159-411), tPA(l-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411) tai tPA(l-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411) . 100106