DE3781420T2

DE3781420T2 - Hybrides plasminogenaktivatoraehnliches polypeptid.

Info

Publication number: DE3781420T2
Application number: DE8787101209T
Authority: DE
Inventors: Naganori Numao; Michito Tagawa; Masakatsu Wada; Masayuki Yamada; Midori Yokoyama
Original assignee: Central Glass Co Ltd; Hodogaya Chemical Co Ltd; Nippon Soda Co Ltd; Nissan Chemical Corp; Sagami Chemical Research Institute; Tosoh Corp
Current assignee: Central Glass Co Ltd; Hodogaya Chemical Co Ltd; Nippon Soda Co Ltd; Nissan Chemical Corp; Sagami Chemical Research Institute; Tosoh Corp
Priority date: 1986-01-31
Filing date: 1987-01-29
Publication date: 1993-02-25
Anticipated expiration: 2007-01-30
Also published as: JPS62272975A; JP2589687B2; DK175604B1; DK50987A; EP0231883B1; WO1987004720A1; SU1732814A3; ES2043610T3; DK50987D0; EP0231883A1; DE3781420D1

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft hybride Plasminogenaktivator-ähnliche Polypeptide und ein Verfahren zu der Herstellung mit Hilfe der Gentechnologie. Die erfindungsgemäßen hybriden Plasminogenaktivator-ähnlichen Polypeptide können zur Prävention und der Behandlung von verschiedenen Arten cardiovaskulärer Störungen oder Krankheiten verwendet werden.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Plasminogenaktivator hydrolisiert in einem begrenzten Umfang das Enzym Plasminogen in inaktiver Form, das im Plasma vorhanden ist, um dieses in das Enzym Plasmin in aktiver Form umzuwandeln. Das Plasmin kann Fibringerinnsel, die in einem Blutgefäß erzeugt wurden, hydrolysieren, wobei dies zur Lyse des Thrombus, d. h. zur Fibrinolyse, führt. Da das Plasmin in vivo durch einen im Plasma vorhandenen Plasmininhibitor rasch inaktiviert wird, wird ein Plasminogenaktivator als ein thrombolytisches Mittel klinisch verwendet.
Als Plasminogenaktivator wird gegenwärtig Urokinase, isoliert aus menschlichem Urin, klinisch verwendet. Jedoch besitzt Urokinase einen Nachteil, indem es zu einer systemischen Haemorrhagie führen kann, wenn es in großer Menge verabreicht wird. Die systemische Haemorrhagie hängt von dem Verhältnis von Fibrinogen-abbauender Aktivität und Fibrin-abbauender Aktivität des Plasminogenaktivators ab. Insbesondere hängt die systemische Haemorrhagie von der Affinität des Plasminogenaktivators zu Fibrin ab. Deshalb sind Versuche unternommen worden, Urokinase mit einer Affinität zu Fibrin herzustellen.
Andererseits besitzt ein Gewebsplasminogenaktivator eine hohe Affinität zu Fibrin und ist deshalb als ein Ersatz für Urokinase in Betracht gezogen worden. Jedoch besitzt der Gewebsplasminogenaktivator eine niedrigere Enzymaktivität als die Urokinase und ist weniger stabil im Blut.
Deshalb gibt es eine Nachfrage nach einem neuen Typus an Plasminogenaktivator mit einer befriedigenden Affinität zu Fibrin und einer ausreichenden Enzymaktivität wie auch einer zufriedenstellenden Stabilität in vivo.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt deshalb hybride Plasminogenaktivator-ähnliche Polypeptide bereit, die eine für eine Affinität zu Fibrin verantwortliche Polypeptidregion, die von Gewebsplasminogenaktivator stammt, verknüpft durch eine Peptidbindung mit einer für die Enzymaktivität verantwortlichen Polypeptidregion, die von Prourokinase stammt, umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Gensystem bereit, das für die Herstellung des oben erwähnten Polypeptids verwendet wird, umfassend DNA-Segmente, die für das Polypeptid codieren, Plasmide, die das DNA-Segment enthalten, und Mikroorganismen, die mit dem Plasmid transformiert sind.
Es wird auch ein Verfahren für die Herstellung des hybriden Plasminogenaktivator-ähnlichen Polypeptids bereitgestellt, das umfaßt Kultivieren der oben erwähnten Mikroorganismen und Gewinnen des Polypeptids aus dem kultivierten Produkt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1-1 bis 1-5 stellen eine Nukleotidsequenz eines cDNA-Inserts dar, die für den humanen Gewebsplasminogenaktivator in Plasmid pDPA3 codiert, und eine entsprechende Aminosäuresequenz in einem offenen Leseraster, die in dem cDNA-Insert enthalten ist. In der Aminosäuresequenz stellt ein Teil der Sequenz, der durch Kleinbuchstaben dargestellt ist, eine Leadersequenz dar und ein Teil der Sequenz, die durch Großbuchstaben dargestellt ist, repräsentiert eine Aminosäuresequenz des Gewebsplasminogenaktivators;
Fig. 2-1 bis 2-5 stellen eine Nukleotidsequenz eines cDNA-Inserts, das für eine humane Prourokinase in Plasmid pKU22 codiert, und eine entsprechende Aminosäuresequenz in einem offenen Leseraster, die in dem cDNA-Insert enthalten ist, dar. In der Aminosäuresequenz stellt ein Teil der Sequenz, der durch Kleinbuchstaben gezeigt ist, eine Leadersequenz dar und ein anderer Teil der Sequenz, der durch Großbuchstaben dargestellt ist, repräsentiert eine Aminosäuresequenz von humaner Prourokinase;
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung von Ausführungsformen des erfindungsgemäßen hybriden Polypeptids;
Fig. 4 ist ein Flußdiagramm, das die Konstruktion von Plasmiden zeigt, die ein für humane Prourokinase codierendes Gen enthalten;
Fig. 5 ist ein Flußdiagramm, das die Konstruktion von Plasmiden zeigt, die ein für ein erfindungsgemäßes hybrides Polypeptid codierendes Gen enthalten;
Fig. 6 stellt die Konstruktion des Plasmids pKYU22 aus Plasmiden pPE3 und pKYU21 dar;
Fig. 7 stellt die Restriktionsspaltstellenkarte von Plasmid pPE3 dar.
Fig. 8 stellt die Konstruktion des Plasmids pKMU1 aus Plasmid pKYU22 und einem synthetischen Oligodesoxyribonukleotid dar;
Fig. 9 stellt die Konstruktion des Plasmids pMUT4L dar;
Fig. 10 stellt die Konstruktion einer einzelsträngigen Phagen-DNA dar, die ein 1200 bp Insert aus Plasmid pKYU22 und eine Phagen-DNA M13mp8 RF enthält;
Fig. 11 stellt ein Verfahren zum Einfügen einer Punktmutation mit Hilfe eines Primers dar;
Fig. 12 stellt die Konstruktion des Plasmids pMUT4Lpm3 aus einer doppelsträngigen DNA einer M13-Phagenmutanten (pm3) und Plasmid pMUT4L dar;
Fig. 13 stellt die Konstruktion des Plasmids pDPAT2 aus Plasmiden pYTU3, pDPA3 und pK12 dar;
Fig. 14 stellt die Konstruktion eines Plasmids pHA00 aus Plasmiden pDPAT2 und pMUT4L (auch als pPE3p bezeichnet) und die Konstruktion des Plasmids pHA03 aus Plasmiden pDPAT2 und pMUT4Lpm3 (auch als pPE3pm3 bezeichnet) dar;
Fig. 15 stellt die Konstruktion des Plasmids pHA20 aus Plasmiden pDPAT2 und pHA00 und die Konstruktion des Plasmids pHA23 aus Plasmiden pDPAT2 und pHA03 dar;
Fig. 16 stellt die Konstruktion des Plasmids pHA13 aus dem Plasmid pHA23 dar;
Fig. 17 stellt ein Ergebnis einer Elektrophorese dar, worin ein Expressionsprodukt von Escherichia coli JM103/pHA03 (Spur 2) verglichen wird mit einem Expressionsprodukt von E. coli JM103/pPE3 (pMUT4L), das native humane Prourokinase (UK) herstellt (Spur 1) und einem Expressionsprodukt von E. coli JM103/pDPAT2, das nativen humanen Gewebsplasminogenaktivator (t-PA) herstellt (Spur 3). In dieser Figur stellt A eine Zusammensetzung von Coomassie Blue-gefärbten Proteinen dar; B stellt Produkte dar, die mit einem Antiurokinase-Antikörper reaktionsfähig sind, entwickelt durch eine Enzymfärbemethode; C stellt Produkte dar, die mit einem Antigewebsplasminogenaktivator-Antikörper reaktionsfähig sind, entwickelt durch eine Enzymfärbemethode;
Fig. 18-1 bis 18-4 stellen Elutionsprofile von Affinitätschromatographie dar, die die Fibrinaffinität von verschiedenen Arten von Plasminogenaktivatoren zeigen;
Fig. 19 stellt die Konstruktion des Plasmids pMUT9Lpm1 aus den Plasmiden pMUT4L und pMUT4pm1 dar;
Fig. 20 stellt die Konstruktion des Plasmids pHA21L aus Plasmid pHA20 und pMUT9Lpm1, und Plasmid pHA24L aus Plasmiden pHA20 und pMUT4Lpm4 dar;
Fig. 21 stellt die Konstruktion des Plasmids pHA11L aus Plasmiden pHA21L und pMUT9Lpml dar;
Fig. 22 stellt die Konstruktion des Plasmid pHA01L aus Plasmid pHA21L dar; und
Fig. 23 stellt eine SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese einer unlöslichen Fraktion (Spur 2) und von Überstand (Spur 1) eines Expressionsprodukts von Plasmid pHA24L dar.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

A. Hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid

Das erfindungsgemäße hybride Plasminogenaktivatorähnliche Polypeptid umfaßt eine Polypeptidregion, die für eine Affinität zu Fibrin verantwortlich ist und von dem Gewebsplasminogenaktivator stammt, und eine Polypeptidregion, die verantwortlich für eine Enzymaktivität ist und von Prourokinase stammt.
Der Gewebsplasminogenaktivator ist ein Protein, das ein Polypeptid, bestehend aus ungefähr 500 Aminosäuren, umfaßt und eine Polypeptidregion in seiner N-terminalen Hälfte enthält, die für die Affinität zu Fibrin verantwortlich ist. Das erfindungsgemäße hybride Plasminogenaktivatorähnliche Polypeptid umfaßt als seinen N-terminalen Anteil eine Polypeptidregion, die für die Affinität zu Fibrin verantwortlich ist. Dieser Teil des vorliegenden Polypeptids stammt von einem nativen Gewebsplasminogenaktivator-Polypeptid. Das heißt, daß dieser Teil des vorliegenden Polypeptids das ganze Polypeptid des nativen Gewebsplasminogenaktivators oder einen Teil davon, der für seine Affinität zu Fibrin verantwortlich ist, oder eine Modifikation davon darstellen kann. Diese Modifikation wird durchgeführt durch den Zusatz von einer oder mehreren Aminosäuren zu der nativen Form oder der Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren von der nativen Form oder dem Ersatz von einer oder mehreren Aminosäuren in der nativen Form, wobei im wesentlichen die Fibrinaffinität der nativen Form beibehalten wird. Wenn ein Teil des nativen Gewebsplasminogenaktivator- Polypeptids für die für die Fibrinaffinität verantwortliche Region verwendet wird, kann die Länge dieses Teils stark unterschiedlich sein bis zu einem Ausmaß, in dem die Fibrinaffinität beibehalten wird.
Zum Beispiel stellten die vorliegenden Erfinder hybride Polypeptide her, die als N-terminale Hälfte enthalten ungefähr zwei Domänen, bestehend aus einer Aminosäuresequenz von dem ersten N-terminalen Serin bis zu dem Glycin in Position 219 des humanen Gewebsplasminogenaktivators, berechnet von dem N-terminalen Serin, wie in Fig. 1-1 bis 1-3 gezeigt; ungefähr eine Domäne, bestehend aus einer Aminosäuresequenz von dem Serin in Position 128 bis zu Glycin in Position 219, berechnet von dem N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, wie in Figuren 1-2 bis 1-3 gezeigt; oder ungefähr eine halbe Domäne, bestehend aus einer Aminosäuresequenz von Methionin in Position 161 bis Glycin in Position 219, berechnet von dem N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, wie in Fig. 1-2 bis 1-3 gezeigt. Diese Polypeptide wurden auf ihre Affinität zu Fibrin hin getestet, und es wurde bestätigt, daß sämtliche dieser Polypeptide Fibrinaffinität besitzen. Deshalb kann die Region mit Fibrinaffinität der vorliegenden hybriden Polypeptide jede Polypeptidregion des Gewebsplasminogenaktivators sein, die eine Region enthält, die für die Fibrinaffinität verantwortlich ist. Fig. 1-1 bis 1-5 stellen eine Nukleotidsequenz dar, die für einen humanen Gewebsplasminogenaktivator codiert, und eine entsprechende Aminosäuresequenz, die als die Region mit Fibrinaffinität des vorliegenden hybriden Polypeptids verwendet wird, worin das erste Serin, Serin in Position 128, Methionin in Position 161 und Glycin in Position 219 durch Pfeile markiert sind.
Die Prourokinase ist ein Protein, umfassend ein Polypeptid, bestehend aus 411 Aminosäuren von dem N-terminalen Serin bis zu dem C-terminalen Leucin und umfassend in seiner C-terminalen Hälfte eine Polypeptidregion, die für die Enzymaktivität verantwortlich ist. Das erfindungsgemäße hybride Plasminogenaktivatorähnliche Polypeptid umfaßt als seine C-terminale Hälfte eine Polypeptidregion, die für die Enzymaktivität verantwortlich ist. Dieser Teil des vorliegenden Polypeptids stammt von einem Prourokinasepolypeptid. Das heißt, daß dieser Teil des vorliegenden Polypeptids ein ganzes Polypeptid der nativen Prourokinase oder einen Teil davon, der für seine Enzymaktivität verantwortlich ist, oder eine Modifikation davon darstellen kann. Diese Modifikation wird durchgeführt durch den Zusatz von einer oder mehreren Aminosäuren zu der nativen Form oder der Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren von der nativen Form oder dem Ersatz von einer oder mehreren Aminosäuren in der nativen Form, wobei im wesentlichen die Enzymaktivität beibehalten wird. Wenn ein Teil des Prourokinase- Polypeptids für die für die Enzymaktivität verantwortliche Region verwendet wird, kann die Länge dieses Teils stark verschieden sein bis zu einem Ausmaß, in dem die Enzymaktivität beibehalten wird.
Zum Beispiel stellten unter Berücksichtigung der Annehmlichkeiten der Genmanipulation die vorliegenden Erfinder hybride Polypeptide her, die als eine C-terminale Hälfte enthalten eine Aminosäuresequenz von Glutamin in Position 150 bis zu dem C-terminalen Leucin in Position 411, berechnet von dem N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, wie in Fig. 2-2 bis 2-4 gezeigt, oder eine Aminosäuresequenz von dem Alanin in Position 132 bis zu dem C-terminalen Leucin in Position 411, berechnet von dem N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, wie in Fig. 2-2 bis 2-4 gezeigt. Diese hybriden Polypeptide wurden dann auf die Enzymaktivität hin getestet, und es wurde bestätigt, daß diese Polypeptide Enzymaktivität besitzen.
Prourokinase, die eine inaktive Form darstellt, wird durch Spaltung des Polypeptids zwischen Lysin in Position 158 und Isoleucin in Position 159 aktiviert, um aktive Urokinase zu erzeugen, und die aktive Urokinase wird ziemlich schnell abgebaut. Deshalb wird erwartet, daß ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid, das an der oben angegebenen Position schwierig zu spalten ist, in vivo aufrecht erhalten wird. Die vorliegenden Erfinder stellten ein hybrides Plasminogenaktivatorähnliches Polypeptid her, worin das Phenylalanin in Position 157, gezeigt in Fig. 2-2, in eine saure Aminosäure, wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure, abgeändert wird und zeigten, daß solche Polypeptide eine gesteigerte Resistenz gegenüber Proteasen, wie Plasmin, Thrombin und Trypsin, besitzen. Deshalb wird bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Peptide das Phenylalanin in Position 157 durch eine saure Aminosäure, wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure, ersetzt. Fig. 2-1 bis 2-5 stellen eine Nukleotidsequenz dar, die für humane Prourokinase codiert, und eine entsprechende Aminosäuresequenz, die in der Region des vorliegenden hybriden Polypeptids mit der Enzymaktivität verwendet wurde, worin Alanin in Position 132, Glutamin in Position 150 und Phenylalanin in Position 157 durch Pfeile markiert sind.
Deshalb umfaßt in einer bevorzugten Ausführungsform das erfindungsgemäße hybride Plasminogenaktivator-ähnliche Polypeptid eine N-terminale Region, die einer N-terminalen Region des humanen Gewebsplasminogenaktivators entspricht, die eine Polypeptidregion enthält, die für seine Affinität zu Fibrin verantwortlich ist, und eine C-terminale Region, die der C-terminalen Region von humaner Prourokinase entspricht, die eine Polypeptidregion enthält, die für seine Enzymaktivität verantwortlich ist, worin das Phenylalanin in Position 157, gezeigt in Fig. 2-2, gegebenenfalls durch Asparaginsäure oder Glutaminsäure ersetzt ist. In der Prourokinase ist eine Peptidbindung zwischen dem Lysin in Position 135 und dem Lysin in Position 136 sensibel gegenüber einer Protease vom Trypsintyp, wie Plasmin. Um deshalb die Spaltung der Peptidbindung zu verhindern, ist bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Aminosäure Lysin in Position 135 durch eine andere als eine basische Aminosäure ersetzt. Als die andere als eine basische Aminosäure kann jede neutrale Aminosäure oder saure Aminosäure verwendet werden, die die physiologische Eigenschaft des gewünschten Polypeptids nicht nachteilig beeinflußt, und es können z. B. Alanin, Asparagin, Asparaginsäure, Glutamin, Glutaminsäure, Phenylalanin, Glycin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Serin, Threonin, Valin, Tryptophan, Tyrosin und Prolin genannt werden. Ausführungsformen der vorliegenden hybriden Polypeptide sind in Fig. 3 gezeigt.

B. Gensysteme

Die vorliegende Erfindung stellt auch Gensysteme für die Herstellung des oben erwähnten hybriden Plasminogenaktivator-ähnlichen Polypeptids bereit, einschließlich Gensegmente, die für die hybriden Polypeptide codieren, Plasmide, die solche Gensegmente enthalten, und Mikroorganismen, die mit solchen Plasmiden transformiert sind.

Für das hybride Polypeptid codierendes Gen

Das Gen, das für das oben erwähnte hybride Plasminogenaktivator-ähnliche Polypeptid codiert, besteht aus Codons, die in einem für die Genexpression ausgewählten Wirtsmikroorganismus, wie E. coli, exprimiert werden können. Aus Gründen der Zweckmäßigkeit bei der Konstruktion des Gens wird es vorzugsweise erhalten durch Verknüpfen eines relevanten Teils von cDNA, die von mRNA stammt, die für einen humanen Gewebsplasminogenaktivator codiert, mit einem relevanten Teil von cDNA, die von mRNA stammt, die für humane Prourokinase codiert. Fig. 1-1 bis 1-5 zeigen cDNA, die für humanen Gewebsplasminogenaktivator codiert, zusammen mit einer entsprechenden Aminosäuresequenz; und Fig. 2-1 bis 2-5 zeigen cDNA, die für humane Prourokinase codiert, zusammen mit einer entsprechenden Aminosäuresequenz.

Plasmid

Obwohl Plasmide für die Expression des erfindungsgemäßen hybriden Plasminogenaktivator-ähnlichen Polypeptids verwendet werden können, die in Hefe oder tierischen Zellen arbeiten, ist die Verwendung eines Plasmids bevorzugt, das zusammen mit der codierenden Region die Kontrollregion zur Expression, die zur Expression der Gene in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli, notwendig ist, und die Region, die zur Replikation in E. coli notwendig ist, enthält. Als die Kontrollregion für die Expression kann jedes System beliebig verwendet werden, das zum Exprimieren des fremden Gens in E. coli geeignet ist. Zum Beispiel werden als Promotor-/Operator-Systeme tac, PL, lacUV5, PR, trp und lpp verwendet. Insbesondere sind der tac-Promotor/Operator, PL-Promotor/Operator und trp-Promotor/Operator bevorzugt. Als ein Beispiel für SD-Sequenzen kann die SD-Sequenz des Metapyrokatechasegens (C230SD) (Literaturstelle 1) und lacSD verwendet werden.

Wirts-Mikroorganismen

Obwohl tierische Zellen und solche Mikroorganismen wie Bakterien und Hefe als Wirt für das Einbringen der Plasmide verwendet werden können, ist die Verwendung von Bakterien, insbesondere von E. coli, bevorzugt.
Bei E. coli als Wirt in der vorliegenden Erfindung können Stämme von nicht-enterogenen, nicht-toxischen E. coli verwendet werden, wie die von E. coli K-12 stammenden, z. B. JM83, JM103, JM105, RB791, SM32, N99, RR1, W3110 und 1776.

Konstruktion des Gensystems

Ein Beispiel für das Verfahren zum Konstruieren von Genen, die an der vorliegenden Erfindung beteiligt sind, umfaßt die folgenden Schritte:
(1) Herstellen eines Gens, das für einen Gewebsplasminogenaktivator codiert, und Erhalten eines DNA-Fragments, das für eine Polypeptidregion mit einer Affinität zu Fibrin codiert;
(2) Herstellen eines Gens, das für Prourokinase codiert, und Erhalten eines DNA-Fragments, das für ein Polypeptid mit Enzymaktivität codiert; und
(3) Verknüpfen der beiden in Schritten (1) und (2) erhaltenen DNA-Fragmente in einem geeigneten Plasmid, um ein Gen zu konstruieren, das für das hybride Plasminogenaktivator-ähnliche Polypeptid codiert.
In dem Fall, in dem das Phenylalanin an Position 157 durch eine saure Aminosäure, wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure, ersetzt ist, wird während Schritt (2) ein Codon, das für das Phenylalanin an Position 157 codiert, in ein Codon umgewandelt, das für Asparaginsäure oder Glutaminsäure codiert.
Als ein Ursprung einer DNA-Region, die für eine Polypeptidregion mit Enzymaktivität codiert, werden Plasmid pMUT4L (auch als pPE3 bezeichnet), enthaltend ein für eine native humane Prourokinase codierendes Gen, und Plasmid pMUT4Lpm3 (auch als pPE3pm3 bezeichnet), enthaltend ein für ein stabilisiertes humanes Prourokinase-ähnliches Polypeptid codierendes Gen, worin die Aminosäure in Position 157 eine saure Aminosäure ist, gemäß dem in Fig. 4 gezeigten Flußdiagramm konstruiert. Ausführliche Konstruktionsverfahren für diese Plasmide werden in Beispielen 4 bis 15 offenbart.
Als ein Ursprung für eine DNA-Region, die für eine Polypeptidregion mit der Fibrinaffinität codiert, wird Plasmid pDPA3, enthaltend ein für einen humanen Gewebsplasminogenaktivator codierendes Gen, gemäß Verfahren konstruiert, die ausführlich in Beispielen 1 bis 3 offenbart sind.
Plasmide, die ein für das erfindungsgemäße hybride Plasminogenaktivator-ähnliche Polypeptid codierendes Gen enthalten, können aus den oben erwähnten Plasmiden pDPA3, pMUT4L (pPE3) und pMUT4Lpm3 (pPE3pm3) und den Vektorplasmiden pYTU3 und pK12 konstruiert werden.
Das Plasmid pYTU3 enthält den PL-Promotor und die C230-SD-Sequenz und wurde gemäß einem in JP-OS-61-158787 offenbarten Verfahren konstruiert; und E. coli HB101/pYTU3, enthaltend das Plasmid pYTU3, wurde bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi, 1-chome, Yatabe-cho, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken, Japan) (F.R.I), am 11. Dezember 1984 als FERM P-7992 hinterlegt. Das Plasmid pKI2 enthält den tac-Promotor/Operator und die C230-SD-Sequenz und wurde gemäß einem in der JP-OS-61-158787 offenbarten Verfahren konstruiert, und E. coli JM103/pK12, enthaltend das Plasmid pK12, wurde bei der F.R.I. am 11. Dezember 1984 als FERM P-7996 hinterlegt.
Plasmid pDPAT2, konstruiert in Beispiel 1, enthält ein Gen, das für reifen humanen Gewebsplasminogenaktivator codiert, unter der Kontrolle des tac-Promotor/Operators und der C230 SD-Sequenz und kann den reifen humanen Gewebsplasminogenaktivator exprimieren, oder es wird als Ausgangspunkt für eine Genregion, die für ein Polypeptid mit der Fibrinaffinität codiert, zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Plasmide, wie im folgenden beschrieben, verwendet. E. coli JM103/pDPAT2, enthaltend das Plasmid pDPAT2, wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen, Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (DSM) als eine internationale Hinterlegung unter dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren (Budapester Vertrag) am 28. Dezember 1985 hinterlegt und hat die Hinterlegungs-Nr. DSM 3629.
Plasmid pHA00, konstruiert in Beispiel 2, enthält ein Gen, das für ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid (HA00) codiert, das als seine N-terminale Hälfte eine Polypeptidregion von dem Methionin in Position 161 bis zum Glycin in Position 219 eines humanen Gewebsplasminogenaktivators, berechnet von dem N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, und als seine C-terminale Hälfte eine Polypeptidregion von Glutamin in Position 150 bis zum C-terminalen Leucin in Position 411 von humaner Prourokinase, berechnet von dem N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, unter der Kontrolle des tac-Promotors und der C230 SD-Sequenz enthält, und kann das oben erwähnte hybride Polypeptid in E. coli exprimieren. E. coli JM103/pHA00, enthaltend das Plasmid pHA00, wurde bei der DSM als DSM3628 am 28. Dezember 1985 unter dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Plasmid pHA03, konstruiert in Beispiel 3, enthält ein Gen, das für ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid codiert, das als seine N-terminale Hälfte eine Polypeptidregion von Methionin in Position 167 bis zum Glycin in Position 119 von humanem Plasminogenaktivator, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, und als seine C-terminale Hälfte eine Polypeptidregion vom Glutamin in Position 150 bis zum N-terminalen Leucin in Position 411 von humaner Prourokinase, berechnet von dem N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, worin das Phenylalanin an Position 157 durch Asparaginsäure ersetzt ist, umfaßt, unter der Kontrolle des tac-Promotors/Operators und der C230 SD-Sequenz, und kann das oben erwähnte hybride Polypeptid in E. coli exprimieren. E. coli JM103/pHA03, enthaltend das Plasmid pHA03, wurde bei der DSM unter DSM3627 am 28. Dezember 1985 unter dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Plasmid pHA20, konstruiert in Beispiel 4, enthält ein Gen, das für ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid (HA20) codiert, das als seine N-terminale Hälfte eine Polypeptidregion vom N-terminalen Serin in Aminosäureposition 1 bis zu Glycin in Position 219 von humanem Gewebsplasminogenaktivator, und als seine C-terminale Hälfte eine Polypeptidregion vom Glutamin in Position 150 bis zum C-terminalen Leucin in Position 411 von humaner Prourokinase, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, umfaßt, unter der Kontrolle des tac-Promotors/Operators und der C230 SD-Sequenz, und kann das oben erwähnte hybride Polypeptid in E. coli exprimieren. E. coli JM103/pHA23, enthaltend das Plasmid pHA23, wurde bei der DSM als DSM3626 am 28. Dezember 1985 unter dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Plasmid pHA23, konstruiert in Beispiel 5, enthält ein Gen, das für ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid (HA23) codiert, das als seine N-terminale Hälfte eine Polypeptidregion vom N-terminalen Serin in Aminosäureposition 1 bis zum Glycin in Position 219 von humanem Gewebsplasminogenaktivator, und als seine C-terminale Hälfte eine Polypeptidregion vom Glutamin in Position 150 bis zum C-terminalen Leucin in Position 411 von humaner Prourokinase, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, worin das Phenylalanin in Position 157 durch Asparaginsäure ersetzt ist, umfaßt, unter der Kontrolle des tac-Promotors und der C230 SD-Sequenz, und kann das oben erwähnte hybride Polypeptid in E. coli exprimieren. E. coli JM103/pHA23, enthaltend das Plasmid pHA23, wurde bei der DSM unter DSM3625 am 28. Dezember 1985 unter dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Plasmid pHA13, konstruiert in Beispiel 6, enthält ein Gen, das für ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid codiert, das als seine N-terminale Hälfte eine Polypeptidregion vom Serin in Position 128 bis zum Glycin in Position 219 von humanem Gewebsplasminogenaktivator, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, und als seine C-terminale Hälfte eine Polypeptidregion von Glutamin in Position 150 bis zu dem C-terminalen Leucin in Position 411 von humaner Prourokinase, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, worin das Phenylalanin in Position 157 durch Asparaginsäure ersetzt wird, umfaßt, unter der Kontrolle des tac-Promotors/Operators und der C230 SD-Sequenz, und kann das oben erwähnte hybride Polypeptid exprimieren.
Plasmid pHA21L, konstruiert in Beispiel 11, enthält ein Gen, das für ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid (HPA21L) codiert, das als seine N-terminale Hälfte eine Polypeptidregion vom N-terminalen Serin in Aminosäureposition 1 bis zum Cystein in Position 215 von humanem Gewebsplasminogenaktivator, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, und als seine C-terminale Hälfte eine Polypeptidregion von Alanin in Position 132 bis zum N-terminalen Leucin in Position 411 von humaner Prourokinase, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, worin Lysin in Position 135 durch Glutamin ersetzt ist, umfaßt, unter der Kontrolle des tac-Promotors/Operators und der C230 SD-Sequenz, und kann das oben erwähnte hybride Polypeptid in E. coli exprimieren. E. coli JM103/pHA21L, enthaltend das Plasmid pHA21L, wurde bei der DSM unter DSM3951 am 06. Januar 1987 unter dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Plasmid pHA24L, konstruiert in Beispiel 12, enthält ein Gen, das für ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid (HPA24L) codiert, das als seine N-terminale Hälfte eine Polypeptidregion vom N-terminalen Serin in Aminosäureposition 1 bis zum Cystein in Position 215 von humanem Gewebsplasminogenaktivator, und als seine C-terminale Hälfte eine Polypeptidregion vom Alanin in Position 132 bis zum C-terminalen Leucin in Position 411 von humaner Prourokinase, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, umfaßt, unter der Kontrolle des tac-Promotors/Operators und der C230 SD-Sequenz, worin das Lysin in Position 135 durch Glutamin und das Phenylalanin in Position 157 durch Asparaginsäure ersetzt ist, und kann das oben erwähnte hybride Polypeptid in E. coli exprimieren. E. coli JM103/pHA24L, enthaltend das Plasmid pHL24L, wurde bei der DSM unter DSM3952 am 06. Januar 1987 unter dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Plasmid pHA11L, konstruiert in Beispiel 13, enthält ein Gen, das für ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid (HPA11L) codiert, das als seine N-terminale Hälfte eine Polypeptidregion vom Serin in Position 128 bis zum Cystein in Position 215 von humanem Gewebsplasminogenaktivator, und als seine C-terminale Hälfte eine Polypeptidregion vom Alanin in Position 132 bis zum C-terminalen Leucin in Position 411 von humaner Prourokinase, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, worin das Lysin in Position 135 durch Glutamin ersetzt ist, umfaßt, unter der Kontrolle des tac-Promotors und der C230 SD-Sequenz, und kann das oben erwähnte hybride Polypeptid in E. coli exprimieren.
Plasmid pHA14L, konstruiert in Beispiel 14, enthält ein Gen, das für ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid (HPA14L) codiert, das als seine C-terminale Hälfte eine Polypeptidregion vom Serin in Position 128 bis zum Cystein in Position 215 von humanem Gewebsplasminogenaktivator, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, und als seine C-terminale Hälfte eine Polypeptidregion vom Alanin in Position 132 bis zum C-terminalen Leucin in Position 411 von humaner Prourokinase, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, worin das Lysin in Position 135 durch Glutamin und das Phenylalanin in Position 157 durch Asparaginsäure ersetzt ist, umfaßt, unter der Kontrolle des tac-Promotors/Operators und der C230 SD-Sequenz, und kann das oben erwähnte hybride Polypeptid exprimieren.
Plasmid pHA01L, konstruiert in Beispiel 15, enthält ein Gen, das für ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid (HPA01L) codiert, das als seine N-terminale Hälfte eine Polypeptidregion vom Methionin in Position 161 bis zum Cystein in Position 215 von humanem Gewebsplasminogenaktivator, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, und als seine C-terminale Hälfte eine Polypeptidregion vom Alanin in Position 132 bis zum N-terminalen Leucin in Position 411 von humaner Prourokinase, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, worin das Lysin in Position 135 durch Glutamin ersetzt ist, umfaßt, unter der Kontrolle des tac-Promotors/Operators und der C230 SD-Sequenz, und kann das oben erwähnte hybride Polypeptid in E. coli exprimieren.
Plasmid pHA04L, konstruiert in Beispiel 16, enthält ein Gen, das für ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid (HPA04L) codiert, das als seine N-terminale Hälfte eine Polypeptidregion vom Methionin in Position 161 bis zum Cystein in Position 215 von humanem Gewebsplasminogenaktivator, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, und als seine C-terminale Hälfte eine Polypeptidregion vom Alanin in Position 132 bis zum N-terminalen Leucin in Position 411 von humaner Prourokinase, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, worin das Lysin in Position 135 durch Glutamin und das Phenylalanin in Position 157 durch Asparaginsäure ersetzt ist, umfaßt, unter der Kontrolle des tac-Promotors/Operators und der D230 SD-Sequenz, und kann das oben erwähnte hybride Polypeptid in E. coli exprimieren.

D. Expression eines Gens und Reinigung von hybriden Polypeptiden

E. coli, das mit dem oben erwähnten Plasmid transformiert ist, wird z. B. in L-Medium kultiviert, das mit 100 ug/ml Ampicillin ergänzt ist, und wenn die Zellkonzentration eine Absorption von 0,3 bis 0,6 bei 550 nm erreicht, wird ein Induktionsmittel Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid dem Medium als 1 mM Induktionsmittel zugesetzt, und das Kultivieren wird für weitere mehrere Stunden fortgesetzt, um das hybride Polypeptid in den kultivierten Zellen zu akkumulieren.
Zum Gewinnen und Reinigen des gewünschten hybriden Polypeptids kann jedes herkömmliche Verfahren verwendet werden, das zum Gewinnen und Reinigen eines in Zellen akkumulierten Polypeptids geeignet ist. Zum Beispiel werden die kultivierten Zellen gesammelt, und die kultivierten Zellen werden dann mit herkömmlichen Mitteln aufgebrochen, und die aufgebrochenen Zellen werden zentrifugiert, um ein Präzipitat zu sammeln. Das gewünschte Polypeptid wird aus dem Präzipitat gewonnen. Als nächstes wird das Präzipitat mit Guanidinhydrochlorid behandelt, um das gewünschte Polypeptid zu lösen. Das gewünschte Polypeptid wird dann durch eine geeignete Kombination von herkömmlichen Verfahren zur Reinigung von Proteinen, wie Flüssigchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und ähnliches gereinigt. Eine Ausführungsform der Gewinnung und Reinigung des erfindungsgemäßen hybriden Polypeptids ist in Beispiel 7 beschrieben.

E. Eigenschaft des hybriden Polypeptids

(1) Analyse durch Elektrophorese

Analysenproben des wie oben erwähnt hergestellten Expressionsprodukts werden einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen, und das Gel wird mit Coomassie Blue gefärbt. Ein Beispiel des Ergebnisses ist in Fig. 17A gezeigt. In Fig. 17A stellen Spuren 1, 2 und 3 die Ergebnisse von Expressionsprodukten dar, die erhalten wurden von E. coli JM103/pPE3, E. coli JM103/pHA03 bzw. E. coli JM101/pDPAT2.

(2) Immunologische Bestätigung

Als nächstes wurde die Reaktivität der durch die oben erwähnte Elektrophorese getrennten Produkte mit einem Antigewebsplasminogenaktivator-Antiserum oder mit einem Antiurokinase-Antiserum auf einem Nitrozellulosefilter getestet, und die in Fig. 17B und C gezeigten Reaktionsmuster wurden erhalten. Wie aus den Figuren ersichtlich, wurde bestätigt, daß das erfindungsgemäße hybride Polypeptid HA03 mit beiden der oben erwähnten Antiseren reaktionsfähig ist.
Für andere hybride Polypeptide wurden ähnliche Ergebnisse erzielt.

(3) Affinität zu Fibrin

Fibrinaffinitätssäulen wurden hergestellt, und die Analysenprobe des Expressionsprodukts wurde auf die Säule gegeben, und die Elution wurde durchgeführt zunächst mit Tris-HCl-Puffer (A) und dann mit Tris-HCl-Puffer, enthaltend 2M KSCN (B). Das Eluat wurde fraktioniert, und die mit (A) eluierten Fraktionen wurden als nicht-adsorbierte Fraktionen bezeichnet; und mit (B) eluierte Fraktionen wurden als adsorbierte Fraktionen bezeichnet. Jede so erhaltene Fraktion wurde auf Plasminogenaktivatoraktivität auf einer Fibrinplatte mit Plasminogen getestet. Die Ergebnisse sind in Fig. 18-1 bis 18-4 gezeigt. Wie aus diesen Figuren ersichtlich, wurden erfindungsgemäße hybride Polypeptide und gewerblich erhältlicher Gewebsplasminogenaktivator (TPA) in adsorbierten Fraktionen eluiert, während eine gewerblich erhältliche Urokinase (UK) in nichtadsorbierten Fraktionen eluiert wurde. Deshalb ist es offensichtlich, daß das erfindungsgemäße hybride Polypeptid das gleiche Ausmaß an Fibrinaffinität wie der native Gewebsplasminogenaktivator besitzt.

(4) Messung des Km-Werts auf dem synthetischen Substrat S-2288

Zum Bestätigen der Enzymaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids wurden Km-Werte eines Expressionsprodukts HA03 von Plasmid pHA03 und einem Expressionsprodukt HA20 von Plasmid pHA20, welches Vertreter von hybriden Polypeptiden sind, die als ihre Region mit Fibrinaktivität ungefähr zwei Domänen oder ungefähr eine halbe Domäne des Polypeptids, und als ihre Region mit Enzymaktivität eine Region mit Enzymaktivität von nativer humaner Prourokinase oder einer entsprechenden Region, worin das Phenylalanin in Position 157 durch Asparaginsäure ersetzt ist, enthalten, nach Aktivierung mit Plasmin mit den Km-Werten einer gewerblich erhältlichen Urokinase verglichen. Die Km-Werte der drei Polypeptide waren gleich, 2,0-10&supmin;&sup4; Mol/l. Deshalb wurde bestätigt, daß die erfindungsgemäßen hybriden Polypeptide nach Aktivierung das gleiche Ausmaß an Enzymaktivität besitzen wie native Urokinase.

(5) Stabilität gegenüber Plasmin und Thrombin

Unter den erfindungsgemäßen hybriden Polypeptiden sind diejenigen, in denen das Phenylalanin in Position 157 durch Asparaginsäure ersetzt ist, d. h. hybride Polypeptide HA03, HA13 und HA23, schwierig durch Thrombin zu inaktivieren und werden durch Plasmin mit geringerer Geschwindigkeit aktiviert.
Wie aus der obigen Beschreibung ersichtlich, besitzen die erfindungsgemäßen hybriden Plasminogenaktivator-ähnlichen Polypeptide eine Fibrinaktivität in dem gleichen Ausmaß wie ein Gewebsplasminogenaktivator, und wenn sie aktiviert sind, besitzen sie eine Enzymaktivität in dem gleichen Ausmaß wie Urokinase. Weiterhin sind die hybriden Plasminogenaktivator-ähnlichen Polypeptide, in denen das Phenylalanin an Position 157 durch eine saure Aminosäure ersetzt ist, stabil gegenüber Plasmin, Thrombin oder anderen Proteasen, und deshalb wird angenommen, daß sie eine nicht nachlassende fibrinolytische Aktivität zeigen, wenn sie in vivo verabreicht werden.
Gegenwärtig sind Plasminogenaktivatoren mit solchen Eigenschaften nicht bekannt, und die vorliegenden Plasminogenaktivator-ähnlichen Polypeptide stellen einen neuen Typ dar.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird nun weiter erläutert durch die folgenden Referenzbeispiele und Beispiele.

Referenzbeispiel 1. Isolierung von Poly A&spplus;-RNA

Zellen der humanen Pharynx-Krebszellinie Detroit 562 wurden in modifiziertem Eagle's Medium, ergänzt mit 10% foetalem Kälberserum, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und 0,1% Lactalbumin, auf einer Plastikplatte unter der Anwesenheit von Kohlendioxid bei einer Konzentration von 5% kultiviert. Als ein konfluenter Status erreicht war, wurde das Medium entfernt und jeweils 2 ml einer denaturierten Lösung (6 M Guanidinthiocyanat, 5 mM Natriumcitrat, 0,5% Sarcosin, 0,1 M 2-Mercaptoethanol) zu der Plastikplatte mit 9 cm Durchmesser zugesetzt, um das zelluläre Material zu denaturieren und einen Extrakt zu erhalten. Gemäß dem Verfahren von Chirgwin et al. (Literaturstelle 2) wurde der so erhaltene Extrakt mit einer 5,7 M CsCl-Lösung überschichtet, und das Ganze wurde zentrifugiert, um RNA zu isolieren. Typischerweise wurden 12 mg RNA aus 60 Plastikplatten gewonnen.
Als nächstes wurde Poly A&spplus;-RNA durch Oligo-dT- Zellulosechromatographie isoliert (Literaturstelle 3). Schließlich wurden 600 ug einer RNA-Präparation erhalten.

Referenzbeispiel 2. Herstellen einer cDNA Bank

Gemäß dem Verfahren von Okayama und Berg (Literaturstelle 4) wurde cDNA synthetisiert. Das heißt, 2 ug eines Vektorprimers und 3 ug der oben erwähnten Poly A&spplus;-RNA wurden gemischt, und die cDNA-Verlängerungsreaktion wurde bei 37ºC für 40 min unter Verwendung von 12 Einheiten Reverser Transkriptase durchgeführt. Anschließend wurde gemäß der Literatur der Zusatz von Oligo-dT, Verdauen mit Hind III, Annealing und Zyklisieren mit einer Linker-DNA und der Ersatz der RNA-Kette durchgeführt. Die so endgültig hergestellte Reaktionsmischung wurde als cDNA-Bank bei -20ºC aufbewahrt. Diese Präparation kann unmittelbar vor dem Gebrauch zur Transformation von E. coli aufgetaut werden. Typischerweise wurden ungefähr 100000 Transformanden aus der oben erwähnten Reaktionsmischung erhalten, wenn E. coli 1776 als kompetente Zellen verwendet wurde.

Referenzbeispiel 3. Absuchen

Zum Isolieren von Klonen, die ein Plasmid enthalten, das ein Gen trägt, welches für ein Plasminogenaktivatorähnliches Protein codiert, aus den oben erwähnten Transformanden, wurden synthetische DNA-Fragmente als Probe verwendet. Die DNA-Fragmente besitzen die folgenden Nukleotidsequenzen: Probe I Probe II
Diese Nukleotidsequenzen sind komplentär zu Teilsequenzen von cDNA, die für einen Plasminogenaktivator aus einem Melanom codieren, wie berichtet von Pennica (Literaturstelle 6) (Probe I: Nukleotidposition 154-173; Probe II: Nukleotidposition 1099-1116 in der Literaturstelle).
Diese Fragmente wurden mit ³²P-γ-ATP an ihren 5'-Enden markiert. Die markierten Proben wurden mit den transformierten E. coli, kultiviert auf einem Nitrozellulosefilter und denaturiert mit Alkali, auf dem Filter in einem Hybridisierungspuffer aus 900 mM Natriumchlorid, 90 mM Natriumcitrat, 10 · Denhart's Lösung (Literaturstelle 7), bei 45ºC für 20 Stunden hybridisiert. Als nächstes wurden die Nitrozellulosefilter in einer Lösung aus 300 mM NaCl und 30 mM Natriumcitrat gewaschen, und die Filter wurden in Kontakt mit einem Röntgenfilm gebracht, um ein Autoradiogramm zu erhalten, und hybridisierungspositive Klone wurden nachgewiesen. Unter Verwendung einer Mischung der Proben I und II wurden aus ungefähr 50000 Klonen mehr als 10 hybridisierungspositive Klone isoliert. Unter diesen hybridisierungspositiven Klonen hybridisierte ein Klon E. coli 1776 (pDPA3) mit beiden Proben. Aus diesem Klon wurde das Plasmid pDPA3 nach einem herkömmlichen Verfahren erhalten.
E. coli 1776 (pDPA3), enthaltend das Plasmid pDPA3, wurde bei dem F.R.I am 08. November 1984 unter FERM P-7931 hinterlegt.
Eine Restriktionsspaltstellenkarte des Plasmids pDPA3 ist in Fig. 13 gezeigt. In dieser Figur entspricht der dicke Teil des Kreises dem cDNA-Insert. Dieses cDNA-Insert wurde nach der Methode von Maxam und Gilbert (Literaturstelle 8) sequenziert, und die Ergebnisse davon sind in Fig. 1-1 bis 1-5 gezeigt. Die cDNA-Sequenz besteht aus 2459 Basenpaaren, die eine an dem 3'-Ende vorhandene Poly-A-Sequenz nicht umfassen. Unter diesen codieren 1548 bp für 516 Aminosäuren. Diese codierende Sequenz umfaßt zusätzlich zu einer Sequenz, die für einen reifen Plasminogenaktivator (Nukleotidposition 261-1703) codiert, eine stromaufwärts gelegene Präprosequenz (Nukleotidposition 156-260). Es gibt eine 5'-nicht-codierende Region (Nukleotidposition 1-155) stromaufwärts von der codierenden Region und eine 3'-nicht-codierende Region (Nukleotidposition 1704-2459) stromabwärts von der codierenden Region.

Referenzbeispiel 4. Präparation von mRNA

mRNA wurde hergestellt nach dem Verfahren von J.M. Chirgwin et al. (Literaturstelle 2) unter Verwendung von Guanidinthiocyanat.
20 g Nierengewebszellen, gefroren bei -80ºC, wurden mit einem Waring-Mixer in flüssigem Stickstoff zerkleinert und in 80 ml einer 5 M Guanidinthiocyanatlösung (5 M Guanidinthiocyanat, 0,5% Natrium-N-lauroylsarcosin, 25 mM Natriumtartrat, 0,1 M Mercaptoethanol und 0,1% Antifoam A) suspendiert. Die Suspension wurde mit einem Teflonhomogenisator homogenisiert, und die Nukleinsäure wurde mit einer 20G 1/2 Injektionsnadel geschert. 24 ml dieser Lösung wurden auf 12 ml 5,7 M CsCl geschichtet, und nach Zentrifugation mit einer Beckmann-Zentrifuge in einem SW28-Rotor für 24 Stunden bei 15ºC bei 25000 Upm wurde die gesamte Roh-RNA gewonnen.
Die gesamte Roh-RNA wurde in einer 2% Kaliumacetatlösung gelöst, und das zweifache seines Volumens an Ethanol wurde zugesetzt. Die Mischung wurde über Nacht bei -20ºC stehengelassen und zentrifugiert, um das Präzipitat zu gewinnen. Gemäß dem Verfahren von H. Aviv et al. (Literaturstelle 3) wurde Poly-(A)&spplus;-RNA isoliert und durch Oligo-(dT)-Zellulose-Säulenchromatographie gereinigt. 10 g der Nierengewebszellen ergaben ungefähr 3 mg Gesamt-RNA, von der 2 bis 3% Poly(A)&spplus;-RNA waren.

Referenzbeispiel 5. Konstruktion der cDNA-Bank (I)

Die cDNA-Synthese wurde durchgeführt unter Verwendung von 40 ug der in Referenzbeispiel 4 erhaltenen Poly(A)&spplus;-RNA. Unter Verwendung von 40 ug Oligo(dT)12-18 als Primer wurde die Reaktion mit 40 Einheiten Reverser Transkriptase für 2 Stunden bei 42ºC durchgeführt, um den ersten Strang zu synthetisieren, und nach Entfernen der Matrizen-mRNA durch Alkalibehandlung wurde die Synthese des zweiten Strangs mit 100 Einheiten des Klenow-Fragments von E. coli DNA-Polymerase durchgeführt.
Nach Entfernen der Haarnadelstruktur mit S1-Nuklease wurde der (dC)10-20-Strang an das 3'-Ende der doppelsträngigen cDNA mit terminaler Desoxynukleotidyltransferase gebunden, und ungefähr 400 ng (dC)-verlängerter cDNA wurden erhalten.
Dieses Material wurde mit 800 ng eines gewerblich erhältlichen (dG)-verlängerten pBR322 (PstI-Stelle) (New England Nuclear Inc.) hybridisiert, und E. coli 1776 wurde nach der Methode von Hanahan (Literaturstelle 9) transformiert. Eine cDNA-Bank (I), bestehend aus ungefähr 2·10&supmin;&sup5; tetracyclinresistenten und ampicillinsensitiven Transformanden, wurde so erhalten. Die Größe der cDNA-Insertfragmente wurde anhand der raschen Isolierungsmethode (Literaturstelle 10) unter Anwendung des alkalischen Lyseverfahrens auf diese Transformanden bestimmt.

Referenzbeispiel 6. Präparation von synthetischen DNA-Oligomeren zur Verwendung als Proben für das Absuchen von cDNA-Banken

Die folgenden 16 unterschiedlichen DNA-Oligomere, die aus 14 Nukleotiden bestehen, die komplementär zu der mRNA sind, welche der Aminosäuresequenz der humanen Urokinase: Asn¹&sup6;&sup9;, GIn, Pro, Trp, Phe¹&sup7;³ entspricht, wie von G.J. Steffens et al. (Literaturstelle 11) und Gunzler et al. (Literaturstelle 12) beschrieben, wurden mit der Phosphortriestermethode synthetisiert:
AACCAAGGTTGATT
AACCAAGGTTGGTT
AACCAGGGTTGATT
AACCACGGTTGATT
AACCACGGTTGGTT
AACCATGGTTGATT
AACCATGGTTGGTT
AACCAAGGCTGATT
AACCAAGGCTGGTT
AACCAGGGCTGATT
AACCAGGGCTGGTT
AACCACGGCTGATT
AACCACGGCTGGTT
AACCATGG CTGATT
AACCATGGCTGGTT
AACCAGGGTTGGTT
Diese 16 verschiedenen DNA-Oligomere werden im folgenden als UK-Probe 1 bezeichnet.
Zum Verwenden als Kontrollproben wurden die folgenden 8 verschiedenen DNA-Oligomere, bestehend aus 14 Nukleotiden, welche komplementär zu der mRNA entsprechend Met²³&sup8;, Try, Asn, Asp, Pro²&sup8;&sup7; sind, auf die gleiche Weise synthetisiert:
5' GGATCATTATACAT 3'
GGATCGTTATACAT
GGATCGTTGTACAT
GGATCATTGTACAT
GGGTCATTATACAT
GGGTCGTTATACAT
GGGTCGTTGTACAT
GGGTCATTGTACAT
Diese 8 verschiedenen DNA-Oligomere werden im folgenden als UK-Probe II bezeichnet.
Mit Hilfe von T4-Polynukleotidkinase wurden jeweils 200 ng der UK-Proben I und II an dem 5'-Ende mit 3000 Ci/mMol ³²P-γ-ATP radioaktiv markiert, um Proben für die Koloniehybridisierung herzustellen.

Referenzbeispiel 7. Absuchen der cDNA-Bank (I)

(1) Absuchen

Ein autoklavierter Nitrozellulosefilter (0,45 um, Typ-TM-2, hergestellt von Toyo Roshi Co.) wurde auf LB-Agarmedium mit 15 ug/ml Tetracyclin gegeben, und das Medium wurde mit dem in Referenzbeispiel 5 hergestellten Transformanden derart inokkuliert, daß ungefähr 2000 Transformandenkolonien wachsen konnten. Nach 8 Stunden Inkubation bei 37ºC wurden die Kolonien auf zwei Nitrozellulosefilter kopiert, die für weitere 3 Stunden bei 37ºC inkubiert wurden. Der ursprüngliche Nitrozellulosefilter wurde als Masterfilter verwendet, während die zwei sekundären Filter auf LB-Agarmedium mit 15 ug/ml Tetracyclin und 100 ug/ml Chloramphenicol übertragen wurden, und diese wurden einer Inkubation bei 37ºC über Nacht unterzogen. Gemäß dem modifizierten Verfahren von Grunstein und Hogness (Literaturstelle 13) wurden die Filter über 0,5 M NaOH und 1,5 M NaCl für 3 min angebracht, um die Lyse der Kolonien und die DNA-Denaturierung zu bewirken, und nach Neutralisation über 0,5 M Tris-HCl (pH 7,6) und 1,5 M NaC1 wurden sie luftgetrocknet und für 2 Stunden bei 80ºC gebacken.
Nach dem Waschen der Filter in 4·SSC für 30 min bei 60ºC wurde die Prähybridisierung in 4·SSC, 10· Denhardt und 50 ug/ml denaturierter E. coli-DNA für eine Stunde bei 60ºC durchgeführt, und nach Zusatz von 0,1 mM ATP und der radioaktiv markierten Probe UK-Probe I (ungefähr 10&sup7; cpm/Filter) wurde die Hybridisierung für 16 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 6- bis 8-maligem Waschen in 4·SSC bei 39ºC wurden die Filter luftgetrocknet und nach Transformanden abgesucht, die mit der UK-Probe I hybridisieren, um 21 in Frage kommende Klone aus 8·10&sup4; Kolonien zu erhalten. Plasmide dieser Klone werden im folgenden als Plasmide pKYU1 bis PKYU21 bezeichnet.
Die 21 erhaltenen fraglichen Klone wurden auf die gleiche Weise, wie oben beschrieben, behandelt, und Klone, die mit der UK-Probe II hybridisieren, wurden erhalten. Die Plasmide in diesen Klonen werden im folgenden als Plasmid pKYU21 bezeichnet (Fig. 6).

(2) Eigenschaften von pKYU21-Plasmid-DNA

Nach Verdau der Plasmid-DNA pKYU21 mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen und dessen Subklonieren in M13mp8 nach der Maxam-Gilbert Methode (Literaturstelle 8) wurde die Bestimmung der Nukleotidsequenz nach der Dideoxykettenabbruchmethode (Literaturstelle 14) ermittelt. Beim Vergleich dieser Sequenz mit der bekannten Aminosäuresequenz von Urokinase wurde bestätigt, daß, obwohl die cDNA die gesamte codierende Region von Urokinase mit niedrigem Molekulargewicht enthält, ungefähr 100 bp DNA aus der 5'-Region der codierenden Region für Urokinase mit hohem Molekulargewicht fehlen.

Referenzbeispiel 8. Konstruktion der cDNA-Bank (II) durch Primerextensionsreaktion

Basierend auf der in Absatz (2) von Referenzbeispiel 7 ermittelten Nukleotidsequenz wurde das folgende DNA-Oligomer:
5' CTGAAGAGCATCAGA 3'
bestehend aus 15 Nukleotiden, die komplementär zu der mRNA-Sequenz sind, die &sup8;&sup9;Ser, Asp, Ala, Leu, Glu&sup9;³ entspricht, nach der Phosphortriestermethode synthetisiert.
Unter Verwendung von 100 ug Poly(A)&spplus;-RNA als Matrize und in Einklang mit den Verfahren von Agarwall et al. (Literaturstelle 15) oder dem Verfahren von Steward et al. (Literaturstelle 16) wurde der erste cDNA-Strang synthetisiert unter Verwendung von 100 Einheiten Reverser Transkriptase zusammen mit 1 ug 5'³²P-markiertem Primer, gefolgt von der Synthese des zweiten Strangs mit 100 Einheiten des Klenow-Fragments von E. coli DNA-Polymerase I. Dann wurde die einzelsträngige DNA mit S1-Nuklease verdaut, und ein (dC)n-Strang wurde an das 3'-Ende mit Hilfe von Terminaler Desoxynukleotidyltransferase angefügt.
Nach dem Hybridisieren dieses dC-verlängerten Inserts (cDNA) mit einem dG-verlängerten Vektor (pBR322) wurde E. coli 1776 transformiert, um eine cDNA-Bank (II), bestehend aus ungefähr 5·10&sup4; Transformanden, zu erhalten.

Referenzbeispiel 9. Absuchen der cDNA-Bank (II)

Die in Referenzbeispiel 8 erhaltenen Transformanden wurden einer Hybridisierung auf die gleiche Weise, wie in Absatz (1) von Referenzbeispiel 7 beschrieben, unterzogen. In diesem Fall wurde ein 150 bp Fragment aus einem PstI-BglII 5'-Verdau von pKYU21 radioaktiv markiert durch das Verfahren der Nicktranslation (Literaturstelle 9) unter Verwendung von ³²P-α-dCTP (3000 Ci/Mol), als eine Probe verwendet. Die Hybridisierung wurde bei 60ºC durchgeführt.
Der Filter wurde nach zwei- oder dreimaligem Waschen mit 2·SSC bei 60ºC luftgetrocknet, und mit der Probe hybridisierende Klone wurden durch Autoradiographie zum Vorschein gebracht. Acht positive Klone wurden aus ungefähr 3·10&sup4; Klonen erhalten. Die Plasmide in diesen Klonen werden im folgenden als Plasmide pPE1 bis pPE8 bezeichnet. Durch Verdau dieser Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym PstI wurde bestätigt, daß Plasmid pPE3 (Fig. 7) ein ungefähr 420 bp langes cDNA-Insert enthält.
Die durch Verdau der DNA des Plasmids pPE3 mit der Restriktionsendonuklease PstI erhaltenen Fragmente wurden in M13mp8 subkloniert, und die Bestimmung der Basensequenz wurde mit Hilfe der Dideoxykettenabbruchsmethode (Literaturstelle 14) durchgeführt. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß die cDNA nicht nur eine ausreichend lange codierende Region der 5'-Seite des Prourokinasegens enthält, sondern auch eine 66 bp lange, nicht-translatierte 5'-Region stromaufwärts von dem Startcodon der Translation ATG (Fig. 2-1 bis 2-5).

Referenzbeispiel 10. Konstruktion des Prourokinasegens (Fig. 6)

5 ug DNA des Plasmids pKYU21, enthaltend die gesamte codierende Region der Urokinase mit niedrigem Molekulargewicht, wurden mit jeweils 10 Einheiten der Restriktionsendonukleasen BglII und HindIII gespalten und dann elektroeluiert, um ein ungefähr 5,7 Kbp DNA-Fragment zu ergeben, während DNA des Plasmids pKYU21 mit jeweils 10 Einheiten von BglII und NcoI verdaut und dann eluiert wurden, um ein 66 bp DNA-Fragment zu ergeben. Dann wurden wieder 5 ug DNA des Plasmids pPEP3, erhalten in Referenzbeispiel 6, mit jeweils 10 Einheiten NcoI und HindIII gespalten, um ein 1,1 Kbp DNA-Fragment zu ergeben. Diese drei verschiedenen DNA-Fragmente wurden wiederholt mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit 2 Volumen Ethanol präzipitiert, um das Präzipitat zu reinigen und zu gewinnen. Diese drei verschiedenen DNA-Fragmente wurden mit T4-DNA-Ligase zusammenligiert zur Transformation in E. coli 1776. Die erhaltenen Transformanden wurden mit Hilfe der raschen Isolierungsmethode unter Verwendung des alkalischen Lyseverfahrens abgesucht, und ein Klon, enthaltend das Plasmid pKYU22, das das gesamte Gen für Prourokinase enthält, wurde erhalten.
Der Klon E. coli 1776/pKYU22 wurde bei dem F.R.I am 11. Januar 1985 unter FERM P-8041 und am 22. Januar 1986 international hinterlegt als FERM BP-968 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags.

Referenzbeispiel 11. Bestimmen der Nukleotidsequenz des Inserts von Plasmid pKYU22

Die Nukleotidsequenz des Inserts von Plasmid pKYU22 wurde anhand der Maxam-Gilbert-Methode und der Didoxykettenabbruchsmethode, denen das Subklonieren in M13mp8 vorausging, ermittelt. Das Ergebnis ist in Fig. 2-1 bis 2-5 dargestellt.
Wie aus diesen Figuren ersichtlich, besteht das Insert aus einer 66 bp nicht-codierenden 5'-Region, einer Leader-Sequenz ATG (Met)-GGC(Gly), einer Prourokinase codierenden Region AGC(Ser)-CTC(Leu), einem Translationsstopcodon TGA(XXX) und einem nicht-translatiertem 3'-Codon stromabwärts von dem Stopcodon.

Referenzbeispiel 12. Synthese eines in der 5'-Region modifizierten Prourokinasegens (Fig. 8)

Codons einer 5'-terminalen Region von nativer cDNA, die für Prourokinase codiert, wurden ersetzt, so daß das Prourokinasegen wirksam in E. coli unter der SD-Sequenz des von Pseudomonas putida-stammenden C230-Gens exprimiert werden kann; ein Startcodon der Translation ATG(Met) wurde benachbart zu und stromaufwärts von einem Codon für die erste Aminosäure (Ser) bereitgestellt, so daß Prourokinase direkt exprimiert werden konnte; eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym AatII wurde bereitgestellt, um die codierende Region nahe zu einer SD-Sequenz des Expressionsvektors zu verbinden. Zu diesem Zweck wurde die in Fig. 8 gezeigte doppelsträngige DNA durch ein Phosphortriesterverfahren synthetisiert. Diese doppelsträngige synthetische DNA besitzt an einem Ende eine AatII-Stelle, um sie in einen Vektor einzufügen, und eine TagI-Stelle an dem anderen Ende, um sie mit dem Prourokinasegen zu verbinden.
Die folgenden drei einzelsträngigen DNA-Oligomere, umfassend 29, 15 und 20 Nukleotide, wurden mit Hilfe der Phosphortriestermethode synthetisiert:
Als nächstes wurden jeweils 1 ug der synthetischen DNA-Oligomere für 2 Minuten auf 95ºC erwärmt, an den 5'-Enden mit T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert und gereinigt mit Hilfe einer Sep Pak (C18)-Säure (Waters). Nach Trocknung wurde das gereinigte Material in 50 ul 20 mM Tris-HCl (pH 7,6) und 10 mM MgCl&sub2; gelöst und hybridisiert durch Erwärmen auf 95ºC für 2 Minuten, langsames Abkühlen auf Raumtemperatur und dann Aufbewahren der Lösung bei 12ºC über Nacht, um die folgende doppelsträngige DNA zu ergeben:
Andererseits wurden 5 ug des Plasmids pKYU22 mit den Restriktionsendonukleasen BglII und AatII gespalten, und ein ungefähr 5,7 Kb DNA-Fragment wurde mit Hilfe der Elektroelution gewonnen. Andererseits wurden 5 ug DNA des gleichen Plasmids pKYU22 mit den Restriktionsendonukleasen PstI und BglII gespalten, und ein ungefähr 400 bp DNA-Fragment wurde mit Hilfe der Elektroelution erhalten. Dieses Fragment wurde wieder mit der Restriktionsendonuklease TagI gespalten, und ein ungefähr 260 bp DNA-Fragment wurde mit Hilfe der Elektroelution gewonnen. Diese zwei verschiedenen DNA-Fragmente wurden gewonnen und durch Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt und mit 2 Volumen Ethanol präzipitiert.
Diese zwei verschiedenen DNA-Fragmente und das zuvor erwähnte doppelsträngige synthetische DNA-Oligomer wurden mit Hilfe von T4 DNA-Ligase ligiert, und ,das Ligationsprodukt wurde zum Transformieren von E. coli 1776 verwendet. Dann wurden die Transformanden mit Hilfe der raschen Isolierungsmethode anhand des alkalischen Lyseverfahrens abgesucht, und ein Klon Escherichia coli 1776/pKMU1, enthaltend Plasmid pKMU1, das ein modifiziertes Prourokinasegen enthält, wurde erhalten. Der Klon E. coli 1776/pKMU1 wurde bei dem F.R.I. am 11. Januar 1985 unter FERM P-8040 hinterlegt.

Referenzbeispiel 13. Konstruktion des Plasmids pMUT4L (Fig. 9)

Das Expressionsplasmid pMUT4L, enthaltend ein humanes Prourokinasegen ohne eine Punktmutation, wurde aus dem oben erwähnten Plasmid pKMU1 und einem Expressionsvektor pTCM1 konstruiert. E. coli JM103/pTCM1, enthaltend das Plasmid pTCM1, wurde bei dem F.R.I. am 17. August 1984 unter FERM P-7779 hinterlegt.
5 ug des Plasmids pKMU1 aus Referenzbeispiel 12 wurden mit 12 Einheiten der Restriktionsendonuklease AatII gespalten, und der Verdau wurde nach Behandlung mit intestinaler Kalbsphosphatase (CIP) isoliert. Andererseits wurden 5 ug des Plasmids pTCM1 mit 10 Einheiten der Restriktionsendonuklease AatII gespalten; und ein ungefähr 500 bp DNA-Fragment wurde mit Hilfe der Elektroelution isoliert. Diese zwei verschiedenen DNA-Fragmente wurden durch wiederholte Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation gereinigt.
Beide DNA-Fragmente wurden mit Hilfe von T4 DNA-Ligase miteinander verknüpft und in E. coli JM103 transformiert. Die Transformanden wurden mit Hilfe der raschen Isolierungsmethode anhand des alkalischen Lyseverfahrens abgesucht, und ein Klon, enthaltend Plasmid pMUT1L, in dem der tac-Promotor/Operator und die C230 SD-Sequenz die normale Orientierung in bezug auf das Prourokinasegen besitzen, wurde erhalten.
Als nächstes wurden 5 ug des Plasmids pKK223-3 (Literaturstellen 17, 18 und 19) mit 10 Einheiten der Restriktionsendonuklease HindIII gespalten, und der Verdau wurde mit intestinaler Kalbsphosphatase (P.L. Biochemical) behandelt.
Andererseits wurden 1 ug des Plasmids pMUT1L, wie oben erhalten, mit 4 Einheiten der Restriktionsendonuklease DraI gespalten, und das Fragment der Spaltung und ein 1 ug 5'-phosphorylierter HindIII-Linker (dCAAGCTTG) wurden mit T4 DNA-Ligase ligiert. Die Spaltung wurde durchgeführt unter Verwendung von 12 Einheiten der Restriktionsendonuklease HindIII, und der Verdau wurde in 0,15 M NaCl gelöst. Die Lösung wurde mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform extrahiert, und die DNA wurde durch den Zusatz von 2 Volumen Ethanol präzipitiert. Das Präzipitat wurde bei 16000 Upm und 4ºC gesammelt und getrocknet.
Das erhaltene pMUT1L-Fragment der Spaltung und das Fragment der HindIII-Spaltung des zuvor erwähnten pKK223-3 wurden mit Hilfe von T4 DNA-Ligase ligiert und in E. coli JM103 transformiert. Die Transformanden wurden mit Hilfe des alkalischen Lyseverfahrens abgesucht, und ein Klon E. coli JM103/pMUT2L, enthaltend Plasmid pMUT2L, wurde erhalten.
5 ug des Plasmids pMUT2L wurden mit jeweils 10 Einheiten der Restriktionsendonukleasen SphI und TthHBI gespalten, und nach Extraktion mit Phenol/Chloroform wurde die DNA mit Ethanol präzipitiert. Die so gewonnene DNA wurde mit glatten Enden versehen mit Hilfe von T4 Polymerase in der Anwesenheit von 0,1 mM dGTP, dCTP, dATP und TTP und wurde erneut cyclisiert mit Hilfe von T4 DNA-Ligase. Die DNA wurde in E. coli JM103 transformiert, und Kolonienbildung auf einem LB-Agarmedium mit 50 ug/ml Ampicillin wurde ermöglicht. Die Transformanden wurden mit Hilfe des alkalischen Lyseverfahrens (Literaturstelle 10) abgesucht, und ein Klon E. coli JM103/pMUT4L wurde erhalten.

Referenzbeispiel 14. Einfügen von speziellen Mutationen zur Basensubstitution in das Codon für Aminosäure 157 mit Hilfe des M13-Phagen

(1) Präparation von einzelsträngiger Matrizen-DNA (Fig. 10)

Jeweils 1 ug doppelsträngiger DNA von Plasmid pKYU22 und Phage M13mp8 wurden in 20 ul einer Lösung mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 7 mM β-Mercaptoethanol und 50 mM NaCl mit Hilfe von 5 Einheiten PstI in einer Stunde bei 37ºC gespalten. Die entsprechenden DNA-Fragmente wurden nach Behandlung mit Phenol und Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Eine Mischung dieser zwei verschiedenen DNA-Fragmente wurde einer Ligierungsreaktion in 20 ul einer Lösung mit 66 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 1 mM ATP für 16 Stunden bei 12ºC mit Hilfe von T4 DNA-Ligase unterzogen. Die Transformation in E. coli JM103 wurde unter Verwendung der Reaktionsmischung gemäß dem Verfahren von Messing et al. (Literaturstelle 19) durchgeführt, und die Transformanden wurden mit Weichagar, enthaltend 0,02% X-gal und 1 mM IPTG, ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Einzelsträngige DNA wurde aus den durch die Rekombinanten gebildeten weißen Plaques hergestellt.
Mit Hilfe einiger der erhaltenen einzelsträngigen DNA als Matrize wurde die Basensequenz mit Hilfe der Dideoxy-Methode gemäß dem Verfahren von Messing et al. (Literaturstelle 20) ermittelt, und die Sequenz der klonierten einzelsträngigen DNA wurde bestätigt. Der codierende Strang und der Matrizen-Strang wurden, wie in Fig. 10 gezeigt, erhalten.

(2) Einfügen einer speziellen Mutation zur Basensubstitution (Fig. 11)

Mit Hilfe der erhaltenen einzelsträngigen M13-Phagen-DNA (ein Matrizenstrang des Urokinasegens ist kloniert worden) als Matrize wurde an einer spezifischen Sequenz eine Mutation ausgeführt mit Hilfe eines weiteren Oligonukleotidmutagens. In diesem Fall wurde das folgende synthetische Oligonukleotid:
5' GGCCCCGCGATAAGATTA 3'
als Primer verwendet. Obwohl das 18 bp Oligonukleotid komplementär zu dem Urokinasegen in der einzelsträngigen Matrizen-DNA ist, sind zwei Basen geändert worden, worin das Codon TTT, das für Phenylalanin codiert, zu dem Codon GAT, das für Asparaginsäure codiert, verändert worden ist.
Mit Hilfe des oben erwähnten Oligonukleotids als Primer wurde doppelsträngige DNA in vitro synthetisiert. Das heißt, 2 pMol 5'-phosphorylierter Primer wurden 0,5 pMol der einzelsträngigen Matrizen-DNA zugesetzt, und die Mischung wurde in 10 ul einer Lösung, enthaltend 7 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA, 20 mM NaCl und 7 mM MgCl&sub2;, für 20 Minuten bei 60ºC inkubiert, gefolgt von einer weiteren Inkubation für 20 Minuten bei 23ºC. Als nächstes wurden der Reaktionsmischung jeweils 0,5 mM dATP, dGTP, dTTP und dCTP auf ein Gesamtvolumen von 20 ul zugesetzt, der 2 Einheiten des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase zugesetzt wurden. Die Mischung wurde für 20 Minuten bei 23ºC inkubiert, und nach dem Zusatz von 1 ul 10 mM ATP und 1 Einheit T4 DNA-Ligase wurde die Mischung über Nacht bei 12ºC inkubiert. Gemäß dem Verfahren von Messing et al. (Literaturstelle 20) wurde die oben erwähnte Reaktionsmischung direkt in E. coli JM103 transformiert. Ungefähr 10000 Phagen-Plaques pro Mikroliter der Reaktionsmischung wurden so erhalten.
Nach dem Transfer der erhaltenen Plaques von dem Weichagarmedium auf Nitrozellulosefilter gemäß dem Verfahren von Benton und Davis et al. (Literaturstelle 21) wurde der Filter im Vakuum für 2 Stunden bei 80ºC gebacken. Der Nitrozellulosefilter wurde mit dem mit ³²P-markierten Oligonukleotid-Primer als einer Probe in einer Mischung von 6·SSC und 10·Denhardt über Nacht bei 37ºC hybridisiert. Der Filter wurde dann in 6·SSC bei 52ºC gewaschen, und Plaques von Phagenmutanten, die positive Signale ergaben, wurden mit Hilfe der Autoradiographie isoliert. Von der Phagenmutante wurde DNA des doppelsträngigen Typs (pm3) erhalten. Mit Hilfe der Phagenmutanten-DNA als Matrize wurde gemäß der Dideoxy-Methode die Nukleotidsequenz der Mutanten-DNA bestimmt, und das Auftreten der gewünschten Mutation betreffend eine Basensubstitution wurde bestätigt.
Weiterhin ist es möglich, daß Phenylalanin-codierende Codon TTT in Position 127 durch das Glu-codierende Codon GAA mit Hilfe des folgenden Oligonukleotids
5' GGCCCCGCGAAAAGATTA 3'
als Mutagen zu ersetzen.

Referenzbeispiel 15. Konstruktion des Plasmids PMUT4Lpm3 (Fig. 12)

Das Expressionsplasmid pMUT4Lpm3, in das das humane Urokinasestrukturgen mit der oben erwähnten Punktmutation stromabwärts von dem E. coli tac-Promotor eingefügt worden ist, wurde auf die folgende Weise konstruiert:
Nach vollständigem Verdau von 10 ug doppelsträngiger M13-Mutanten-DNA (pm3) mit PstI wurde ein Fragment von ungefähr 1,2 Kbp Länge isoliert. Andererseits wurden 10 ug des Plasmids pMUT4L mit PstI partiell verdaut, und ein Fragment von ungefähr 4,6 Kbp Länge wurde isoliert, von dem ein Fragment von ungefähr 1,2 Kbp Länge entfernt worden ist.
Jedes der oben erwähnten beiden Fragmente wurde durch Behandeln mit Phenol und Präzipitieren mit Ethanol gewonnen, und dann wurden die Präzipitate gemischt. Die Mischung wurde einer Ligierungsreaktion mit Hilfe von T4 DNA-Ligase bei 12ºC über Nacht unterzogen, und die Reaktionsmischung wurde zum Transformieren von E. coli HB101 verwendet. Die Transformanden wurden dann mit Hilfe des alkalischen Lyseverfahrens abgesucht, und ein Klon, enthaltend Plasmid pMUT4Lpm3, wurde erhalten. Escherichia coli 1776/pMUT4Lpm3, enthaltend Plasmid pMUT4Lpm3, wurde am 11. Juli 1985 bei dem F.R.I. unter FERM P-8341 hinterlegt und wurde interantional hinterlegt am 22. Januar 1986 unter FERM BP-971 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags.

Referenzbeispiel 16. Konstruktion des Plasmids pMUT4Lpm1

Die doppelsträngige Phagenmutante M13RFpml mit einem DNA-Fragment, in dem ein Codon AAA für Lysin in Position 135 zu einem Codon CAA für Glutamin mutiert ist, wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Referenzbeispiel 14 beschrieben erhalten, außer daß das folgende synthetische Oligonukleotid
5' GATGGACAAAAGCCC 3'
verwendet wurde. Die DNA-Sequenz der so erhaltenen Mutanten-DNA wurde mit der Dideoxy-Methode unter Verwendung der Phagenmutanten-DNA als Matrize bestimmt, und es wurde bestätigt, daß sie die gewünschte Punktmutation enthält.
Als nächstes wurde aus dem Phagen M13RFpm1 und dem Plasmid pMUT4L, das Plasmid pMUT4Lpm1 gemäß dem in Referenzbeispiel 15 beschriebenen Verfahren konstruiert.

Referenzbeispiel 17. Konstruktion des Plasmids pMUT4Lpm4

Ein mutierter doppelsträngiger Phage, enthaltend ein DNA-Fragment, in dem ein Codon AAA für Lysin in Position 135 zu einem Codon für Glutamin mutiert ist, wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Referenzbeispiel 14 beschrieben erhalten, außer daß das folgende synthetische Oligonukleotid:
5' GATGGACAAAAGCCC 3'
verwendet wurde. Von dem so erhaltenen mutierten Phagen wurde ein Einzelstrangphage gemäß dem gleichen Verfahren wie in Referenzbeispiel 14 beschrieben erhalten. Mit Hilfe des Einzelstrangphagen als Matrize wurde ein Codon TTT für Phenylalanin in Position 157 dann zu einem Codon GAT für Asparaginsäure gemäß dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben mutiert, außer daß das folgende synthetische Oligonukleotid:
5' GGCCCCGCGATAAGATTA 3'
verwendet wurde, um einen mutierten Doppelstrangphagen M13RFpm4 mit einem DNA-Fragment, in dem ein Codon AAA für Lysin in Position 135 zu einem Codon CAA für Glutamin und ein Codon für Phenylalanin in Position 157 zu einem Codon für Asparaginsäure mutiert ist, zu erhalten.
Als nächstes wurde von dem so erhaltenen doppelt mutierten Phagen M13RFpm4 und dem Plasmid PMUT4L das Plasmid pMUT4Lpm4 gemäß dem gleichen Verfahren wie in Referenzbeispiel 15 beschrieben konstruiert.

Referenzbeispiel 18. Konstruktion des Plasmids pMUT9Lpm1 (Fig. 19)

5 ug des in Referenzbeispiel 13 konstruierten Plasmids pMUT4L wurden mit 50 Einheiten ScaI und 100 Einheiten AatII in 100 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 125 mM NaCl, 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 6 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde dann einer 0,7% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 5500 bp wurde auf herkömmliche Weise gewonnen. Andererseits wurden 10 ug des gleichen Plasmids pMUT4L mit 50 Einheiten AatII und 50 Einheiten SmaI in 100 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 60 mM KCl, 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 6 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde dann einer 2% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von 55 bp wurde auf herkömmliche Weise gewonnen. Die zwei so erhaltenen DNA-Fragmente wurden mit 5 Einheiten T4 DNA-Ligase in 10 ul eines Puffers mit 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP bei 12ºC für 15 Stunden umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde zum Transformieren von E. coli JM103 gemäß einem herkömmlichen Verfahren verwendet, und so erhaltene Ampicillin-resistente Transformanden wurden nach einer Kolonie, enthaltend Plasmid pMUT8L, in Fig. 19 gezeigt, abgesucht, und von der ausgewählten Kolonie wurde das Plasmid pMUT8L auf herkömmliche Weise isoliert.
5 ug des so erhaltenen Plasmids pMUT8L wurden mit 50 Einheiten HindIII in 100 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2; und 60 mM NaCl bei 37ºC für 2 Stunden gespalten. Nach Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation der Reaktionsmischung wurde das Präzipitat mit einer Einheit des Klenow-Fragments in 20 ul eines Puffers mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM DTT und 80 uM dNTPs bei 22ºC für 30 Minuten behandelt. Nach Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation der Reaktionsmischung wurde das Präzipitat mit 5 Einheiten T4 DNA-Ligase in 20 ul eines Puffers mit 1 ug pSsTI-Linker und 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP bei 12ºC für 2 Stunden behandelt. Nach Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation der Reaktionsmischung wurde das Präzipitat mit 50 Einheiten PstI in 100 ul einer Lösung mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2; und 100 mM NaCl bei 37ºC für 2 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde dann einer 0,7% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 4300 bp wurde auf herkömmliche Weise gewonnen.
Andererseits wurden 5 ug des in Referenzbeispiel 16 konstruierten Plasmids pMUT4Lpml mit 50 Einheiten PstI in 100 ul eines Puffers mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2; und 100 mM NaCl&sub2; bei 37ºC für 2 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde dann einer 0,7% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 1200 bp wurde auf herkömmliche Weise gewonnen.
Die beiden so erhaltenen DNA-Fragmente wurden mit Hilfe von 5 Einheiten T4 DNA-Ligase für 15 Stunden bei 12ºC in 20 ul eines Puffers mit 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 10 mM ATP gemischt und ligiert. Die Reaktionsmischung wurde zum Transformieren von E. coli JM103 gemäß einem herkömmlichen Verfahren verwendet, und so erhaltene Ampicillin-resistente Transformanden wurden nach einer Kolonie, enthaltend Plasmid pMUT9Lpm1 abgesucht, und das Plasmid pMUT9Lpm1 wurde auf übliche Weise isoliert.

Beispiel 1. Konstruktion des Plasmids pDPAT2

50 ug des Plasmids pDPA3 wurden mit 75 Einheiten BglII in 200 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 4 Stunden gespalten. Nach Ethanolpräzipitation wurde das Präzipitat mit 5 Einheiten Klenow-Fragment in 50 ul eines Puffers mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM DTT und 80 uM dNTP bei 22ºC für 30 Minuten umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde einer 0,7% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 1800 bp wurde auf herkömmliche Weise gewonnen. Dieses DNA-Fragment wird als DNA-Fragment (A) bezeichnet.
Andererseits wurden 10 ug des Plasmids pYTU3 mit 20 Einheiten SalI in 50 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl, 0,2 mM EDTA und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 4 Stunden gespalten. Nach Ethanolpräzipitation wurde das Präzipitat mit 2 Einheiten Klenow-Fragment in 20 ul eines Puffers mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM DTT, 80 uM dNTP bei 22ºC für 30 Minuten behandelt. Nach Ethanolpräzipitation wurde das Präzipitat mit 1 Einheit alkalischer Phosphatase (aus Rinderdarm) in 20 ul eines Puffers mit 50 mM Tris-HCl (pH 9,0), 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;, 1 mM Spermidin bei 37ºC für 30 Minuten behandelt. Phenolbehandlung und Ethanolpräzipitation wurden durchgeführt. Das Präzipitat wurde in 20 ul einer Lösung mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM DTA gelöst. Die Lösung enthält 0,5 ug/ul DNA. 5 Kg dieser DNA und 5 ug des oben beschriebenen DNA-Fragments (A) wurden mit 10 Einheiten T4 DNA-Ligase in 30 ul eines Puffers mit 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP bei 15ºC für 15 Stunden behandelt. Nach Ethanolpräzipitation wurde das Präzipitat mit 15 Einheiten ClaI in 30 ul eines Puffers mit 6 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl bei 37ºC für 4 Stunden gespalten. Nach Ethanolpräzipitation wurde das Präzipitat mit 15 Einheiten BamHI in 30 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl und 2 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 4 Stunden gespalten. Nachdem die DNA in der Reaktionsmischung mit Ethanol präzipitiert war, wurde das Präzipitat mit 2 Einheiten Klenow-Fragment in 30 ul eines Puffers mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM DTT und 80 HM dNTP bei 22ºC für 30 Minuten behandelt. Die Reaktionsmischung wurde einer 0,7% Agarosegelelektrophorese unterzogen und ein DNA-Fragment von ungefähr 2000 bp wurde auf herkömmliche Weise gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (B) bezeichnet.
Andererseits wurden 2 ug des Plasmids pK12 mit 10 Einheiten SalI in 20 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl, 0,2 mM EDTA und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 4 Stunden gespalten. Nach Ethanolpräzipitation wurde das Präzipitat mit 20 Einheiten Klenow-Fragment in 20 ul eines Puffers mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM DTT und 80 uM dNTP bei 22ºC für 30 Minuten behandelt. Nach Ethanolpräzipitation wurde das Präzipitat mit 1 Einheit alkalischer Phosphatase (Rinderdarm) in 20 ul eines Puffers mit 50 mM Tris-HCl (pH 9,0), 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2; und 1 mM Spermidin bei 37ºC für 30 Minuten behandelt. Nach Phenolbehandlung wurde die Ethanolpräzipiation durchgeführt. Das Präzipitat wurde in 20 ul einer Lösung mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA gelöst. Diese Lösung enthielt 0,1 ug/ul DNA. 1 ug dieser DNA und 1 ug des oben erwähnten DNA-Fragments (B) wurden mit 1,5 Einheiten T4 DNA-Ligase in 20 ul eines Puffers mit 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP bei 15ºC für 15 Stunden umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde zum Transformieren von E. coli JM103 gemäß einem herkömmlichen Verfahren verwendet, und die erhaltenen Ampicillin-resistenten Transformanden wurden nach Kolonien abgesucht, die das Plasmid pDPAT2, gezeigt in Fig. 13, enthalten, und das Plasmid wurde gemäß einem herkömmlichen Verfahren isoliert.

Beispiel 2. Konstruktion des Plasmids pHA00

5 ug des Plasmids pPE3, (das gleiche wie pMUT4L) wurden mit 10 Einheiten PvuI in 50 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 7 mM MgCl&sub2;, 150 mM KCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 5 Stunden gespalten. Nach Ethanolpräzipitation wurde das Präzipitat mit 10 Einheiten EcoRI in 50 ul eines Puffers mit Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 2 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer 1,2% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 2000 bp wurde auf herkömmliche Weise gewonnen. Das so gewonnene DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (A) bezeichnet.
Als nächstes wurden 10 ug des Plasmids pPE3 mit 15 Einheiten PvuI in 50 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 7 mM MgCl&sub2;, 150 mM KCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 5 Stunden gespalten. Nach Ethanolpräzipitation wurde das Präzipitat mit 15 Einheiten BamHI in 50 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl und 2 mM β-Mercaptoethanol bei 30ºC für 3 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer 1,2 % Agarosegelelektrophorese unterzogen und DNA-Fragmente von ungefähr 2300 bp und ungefähr 1346 bp wurden mit herkömmlichen Mitteln gewonnen. Das so erhaltene Fragment von ungefähr 2300 bp wurde als DNA-Fragment (B) bezeichnet. 2 ug des wie oben beschrieben gewonnenen DNA-Fragments von ungefähr 1346 bp wurden mit 5 Einheiten BalI in 30 ul eines Puffers mit 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 7 mM MgCl&sub2; und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 8 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer 1,2% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 750 bp wurde nach einem herkömmlichen Verfahren gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (C) bezeichnet.
Andererseits wurden 10 ug des in Beispiel 1 konstruierten Plasmids pDPAT2 mit 15 Einheiten EcoRI in 100 ul eines Puffers mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 3 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer 1,2% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 472 bp wurde nach einem herkömmlichen Verfahren gewonnen. 2 ug der so gewonnenen DNA wurden mit 1 Einheit HaeIII in 50 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 60 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 30 Minuten gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer 5% Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen und ein DNA-Fragment von ungefähr 180 bp wurde nach einem herkömmlichen Verfahren gewonnen. 1 ug dieses DNA-Fragments und 1 ug des oben erwähnten DNA-Fragments (C) wurden mit 1 Einheit T4 DNA-Ligase in 20 ul eines Puffers mit 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP bei 15ºC für 12 Stunden umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde einer 1,2% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 931 bp wurde mit herkömmlichen Mitteln gewonnen. 1 ug dieses DNA-Fragments, 1 ug des DNA-Fragments (A) und 1 ug des DNA-Fragments (B) wurden mit 2 Einheiten T4 DNA-Ligase in 20 ul eines Puffers mit 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP bei 15ºC für 12 Stunden ligiert. Die Reaktionsmischung wurde zum Transformieren von E. coli JM103 verwendet, und die erhaltenen Ampicillin-resistenten Transformanden wurden nach Kolonien abgesucht, die das Plasmid pHA00, gezeigt in Fig. 14, enthalten, und das Plasmid wurde mit herkömmlichen Mitteln isoliert.

Beispiel 3. Konstruktion des Plasmids pHA03

Plasmid pHA03 wurde gemäß dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 2 beschrieben, konstruiert, außer, daß das Plasmid pPEpm3 (das gleiche wie pMUT4Lpm3) anstelle von Plasmid pPE3 verwendet wurde (Fig. 14).

Beispiel 4. Konstruktion des Plasmids pHA20

5 ug des in Beispiel 2 konstruierten Plasmids pHA00 wurden mit 7 Einheiten PstI in 20 ul eines Puffers mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2; und 50 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; bei 37ºC für 4 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer Ethanolpräzipitation unterzogen, und das Präzipitat wurde dann mit 10 Einheiten ScaI in 20 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 125 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 8 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer 1,2% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 1100 bp wurde mit herkömmlichen Mitteln gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (A) bezeichnet.
5 ug des Plasmids pHA00 wurden mit 7 Einheiten PstI in 20 ul eines Puffers mit 20 mM Tris-KCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; bei 37ºC für 4 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer Ethanolpräzipitation unterzogen, und das Präzipitat wurde dann mit 10 Einheiten EcoRI in 20 ul eines Puffers mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl und 9 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 3 Stunden gespalten. Nach Ethanolpräzipitation wurde das Präzipitat einer 0,7% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 3500 bp wurde mit herkömmlichen Mitteln gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (B) bezeichnet.
Andererseits wurden 15 ug des in Beispiel 1 konstruierten Plasmids pDPAT2 mit 20 Einheiten BglII in 100 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 4 Stunden gespalten. Nach Ethanolpräzipitation wurde das Präzipitat mit 25 Einheiten ScaI in 100 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 125 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 10 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer 1,2 % Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 625 bp wurde mit herkömmlichen Mitteln gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (C) bezeichnet.
10 ug des Plasmids pDPAT2 wurden mit 15 Einheiten BglII in 100 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl und 10 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 4 Stunden gespalten. Nach Ethanolpräzipitation wurde das Präzipitat mit 10 Einheiten EcoRI in 50 ul eines Puffers mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 3 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer 5% Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 150 bp wurde gemäß einem herkömmlichen Verfahren gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (D) bezeichnet.
1 ug DNA-Fragment (A), 1 ug DNA-Fragment (B), 1 ug DNA-Fragment (C) und 1 ug DNA-Fragment (D), alle oben beschrieben, wurden mit 4 Einheiten T4 DNA-Ligase in 30 ul eines Puffers mit 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP bei 15ºC für 16 Stunden ligiert. Die Reaktionsmischung wurde zum Transformieren von E. coli JM103 gemäß einem herkömmlichen Verfahren verwendet, und die erhaltenen Ampicillin-resistenten Transformanden wurden nach Kolonien abgesucht, die das Plasmid pHA20, gezeigt in Fig. 15, enthalten, und das Plasmid wurde mit herkömmlichen Mitteln isoliert.

Beispiel 5. Konstruktion des Plasmids pHA23

Plasmid pHA23 wurde gemäß dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 4 beschrieben, konstruiert, außer, daß das in Beispiel 3 konstruierte Plasmid pHA03 anstelle des Plasmids pHA00 zur Konstruktion des Plasmids pHA20 verwendet wurde (Fig. 15).

Beispiel 6. Konstruktion des Plasmids pHA13

25 ug des in Beispiel 5 konstruierten Plasmid pHA23 wurden mit 30 Einheiten BglII in 200 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 4 Stunden gespalten. Nach Ethanolpräzipitation wurde das Präzipitat mit 4 Einheiten Klenow-Fragment in 50 ul eines Puffers mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM DTT und 80 uM dNTP bei 22ºC für 30 Minuten behandelt. Nach Phenolbehandlung wurde die Ethanolpräzipitation durchgeführt. Das Präzipitat wurde mit 30 Einheiten PstI in 100 ul eines Puffers mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2; und 50 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; bei 37ºC für 4 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer 0,7% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 3500 bp, als DNA-Fragment (A) bezeichnet, und ein DNA-Fragment von ungefähr 1700 bp, als DNA-Fragment (B) bezeichnet, wurden mit herkömmlichen Mitteln isoliert.
7 ug des DNA-Fragments (B) wurden mit 10 Einheiten RsaI in 50 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 6 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer 1,2% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 1100 bp, als DNA-Fragment C bezeichnet, und ein DNA-Fragment von ungefähr 626 bp, als DNA-Fragment D bezeichnet, wurden mit herkömmlichen Mitteln gewonnen.
2 ug DNA-Fragment (D) wurden mit 5 Einheiten DdeI in 20 ul eines Puffers mit 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 8 Stunden gespalten. Nach Ethanolpräzipitation wurde das Präzipitat mit 1 Einheit Klenow-Fragment in 20 ul eines Puffers mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM DTT und 80 uM dNTP bei 22ºC für 30 Minuten behandelt. Nach Phenolbehandlung wurde die Ethanolpräzipitation durchgeführt. Das Präzipitat wurde einer 5% Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 241 bp wurde nach einem herkömmlichen Verfahren gewonnen. 1 ug diese DNA-Fragments, 0,5 ug DNA-Fragment (A) und 0,5 ug DNA-Fragment (C) wurden mit 3 Einheiten T4 DNA-Ligase in 20 ul eines Puffers mit 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP bei 15ºC für 15 Stunden ligiert. Die Reaktionsmischung wurde zum Transformieren von E. coli JM103 verwendet, und die erhaltenen Ampicillinresistenten Transformanden wurden nach Kolonien abgesucht, die das Plasmid pHA13, gezeigt in Fig. 16, enthalten, und das Plasmid wurde mit herkömmlichen Mitteln isoliert.

Beispiel 7. Expression und Extraktion des Genprodukts

(a) E. coli JM103/pDPAT2, JM103/pHA00, JM103/pHA03, JM103/pHA20, JM103/pHA23 und JM103/pHA13, hergestellt in den Beispielen 1 bis 5, und E. coli JM103/pMUT4L, hergestellt in Referenzbeispiel 15, wurden in 100 ml LB-Medium, das mit 100 ug/ml Ampicillin ergänzt war, bei 37ºC unter Schütteln kultiviert. Als die OD&sub6;&sub0;&sub0; des Kulturmediums 0,6 erreichte, wurde Isopropyl-β,D-thiogalactopyranosid dem Medium auf eine Endkonzentration von 1 mM zugesetzt, und die Kultivierung wurde für weitere 5 Stunden fortgesetzt. Das Kulturmedium wurde dann in ein Eisbad überführt. Das gekühlte Medium wurde bei 3000 Upm für 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, die dann in 50 ml Puffer mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 100 mM NaCl suspendiert wurden. Die Suspension wurde dann zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, die dann in 10 ml des gleichen Puffers resuspendiert wurden. Als nächstes wurden die Zellen durch beschallen aufgebrochen, und die aufgebrochenen Zellen wurden bei 15000 Upm für 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert, um ein Präzipitat zu erhalten.
(b) Jedes der in Schritt (a) hergestellten Präzipitate wurde in 10 ml eines Puffers mit 7,5 M Guanidinhydrochlorid und 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) suspendiert, und die Suspension wurde 90 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Als nächstes wurde die Suspension bei 10000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde auf 5 ml einer Lösung mit 1 M Guanidinhydrochlorid, 0,05 M Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM Glutathion vom reduzierten Typ und 0,2 mM Glutathion vom oxidierten Typ verdünnt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Als nächstes wurde die Lösung gegen 100 Vol einer Lösung mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 0,4 M NaCl bei 4ºC für 4 Stunden dialysiert und dann gegen 100 Vol einer Lösung mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 0,1 M NaCl für 2 Stunden, um einen Extrakt zu erhalten.

Beispiel 8.

Jedem Präzipitat, das von jedem Transformanden in Beispiel 7 (a) erhalten wurde, und das einer Menge von 1 ml des Kulturmediums entspricht, wurden 20 ul einer Probenlösung mit 3 M Harnstoff, 0,08 M Dithiothreitol und 1% SDS zugesetzt, und die Mischung wurde für 5 Minuten auf 95ºC erwärmt. Das wärmebehandelte Produkt wurde zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen, und 8 ul des so erhaltenen Überstands wurden auf ein SDS-Polyacrylamid-Gradientengel (Nature, 292 128, 1981) aufgetragen, und die Elektrophorese wurde über Nacht bei 50 V durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel durch Einbringen in eine Färbelösung, bestehend aus 1% Coomassie Blue, 10% Essigsäure, 25% Isopropanol und Wasser, für 1,5 Stunden gefärbt, und dann in eine Entfärbelösung, bestehend aus 10% Essigsäure, 10% Isopropanol und Wasser, für 2 Stunden eingebracht, gefolgt von einer Lösung, bestehend aus 5% Methanol und 7% Essigsäure und Wasser, für 2 Stunden. Ein Beispiel des so erhaltenen Gelmusters ist in Fig. 17A gezeigt. In Fig. 17A wurde eine Analyseprobe eines Expressionsprodukts von E. coli JM103/pHA03, das ein erfindungsgemäßes hybrides Plasminogenaktivatorähnliches Polypeptid (HA03) herstellt (Spur 2), verglichen mit einer Analysenprobe eines Expressionsprodukts von E. coli JM103/pPE3 (pMUT4L) (Spur 1), das native humane Prourokinase (UK) herstellt, und einer Analysenprobe eines Expressionsprodukts von E. coli JM103/pDPAT2, das nativen humanen Gewebesplasminogenaktivator (t-PA) herstellt (Spur 3), durch Elektrophorese verglichen.
Andererseits wurde jede, wie oben beschrieben, hergestellte Analysenprobe der gleichen SDS-Polyacrylamidgradienten-Gelelektrophorese, wie oben beschrieben, unterzogen, und die auf dem Gel getrennten Proteine wurden dann auf einen Nitrozellulosefilter übertragen, und der Filter wurde einem Enzymimmunoassay (EIA) (S. Tabe, Saibo Kogaku, Band 2, Seite 1061, 1983) unterzogen. Das heißt, nachdem die Proteine von dem SDS-Polyacrylamidgel auf einen Nitrozellulosefilter übertragen worden waren, um unspezifische Adsorption zu vermeiden, wurde der Nitrozellulosefilter in eine Lösung aus 3% Gelatine in TBS (20 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 500 mM NaCl) eingebracht, und dann wurde der Filter 2 Stunden in einer Lösung mit Antigewebsplasminogenaktivator-Antiserum, erhalten von mit Gewebsplasminogenaktivator immunisiertem Kaninchen, eingebracht. Der Filter wurde sorgfältig mit TBS-Lösung gewaschen und dann für 1 Stunde in eine Lösung eingebracht, die Meerrettich-Peroxidase markierten Antikaninchen-Antikörper-IgG (Ziege) enthielt. Nach einem sorgfältigen Waschvorgang wurde der Filter in eine Entwicklerlösung mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 500 mM NaCl, 0,06% 4-Chlor-1-naphthol und 0,015% H&sub2;O&sub2; für 5 Minuten eingebracht. Ein Beispiel der erhaltenen Ergebnisse ist in Fig. 17C gezeigt. Das gleiche Verfahren, wie oben beschrieben, wurde auf ein Antiurokinase-Antiserum angewendet. Ein Beispiel des erhaltenen Ergebnisses ist in Fig. 17B gezeigt.
Aus dem Vergleich der in Fig. 17A, 17B und 17C gezeigten Muster ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße hybride Polypeptid immunoreaktiv sowohl mit Antiserum gegen Gewebsplasminogenaktivator wie auch mit Antiserum gegen Urokinase ist.

Beispiel 9. Herstellung einer Fibrinaffinitätssepharosesäule®

3 g Fibrinogen (Daiichi Kagaku Yakuhin Kogyo, Japan; Typ 2, plasminogenfrei) wurden in 100 ml eines Bindungspuffers mit 0,1 M NaHCO&sub3;(pH 8,3) und 0,5 M NaCl gelöst. Die Lösung wurde bei 10000·g für 10 Minuten zentrifugiert, um unlösliche Materialien zu entfernen, und der Überstand wurde für die anschließende Reaktion verwendet.
2 g CNBr-aktivierte Sepharose®4B (Pharmacia) wurden in 30 ml M HCl quellen gelassen, um ungefähr 7 ml eines Trägermaterials zu erhalten. Die so erhaltene Präparation an Trägermaterial wurde auf einen G3-Glasfilter geladen und wurde viermal mit 25 ml 1 mM HCl gewaschen. Weiterhin wurde das Trägermaterial mit 20 ml des Bindungspuffers gewaschen, und das gewaschene Trägermaterial wurde in 20 ml des gleichen Puffers suspendiert. Unmittelbar nach der Präparation wurde die Suspension zu der oben erwähnten Fibrinogenlösung zugesetzt, und die Mischung wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren umgesetzt. Nach der Reaktion wurde der Überstand entfernt. Dem restlichen Material wurden 50 ml 0,2 M Glycin (pH 8,0) zugesetzt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt, um restliche aktive Gruppen zu inaktivieren. Nach Entfernen des Überstands wurde das restliche Material abwechselnd fünfmal mit jeweils 20 ml 0,2 M Glycinlösung (pH 8,0) und einem Acetatpuffer mit 0,1 M Natriumacetat (pH 5,0) und 0,5 M NaCl auf einem Glasfilter gewaschen, um schließlich ungefähr 7 ml eines mit Fibrinogen verbundenen Trägermaterials zu erhalten. Dieses Trägermaterial wurde in eine Säule, Durchmesser 16 mm· 70 mm, gefüllt.
300 Einheiten Rinderthrombin (Mochida Seiyaku, Japan) wurden in 3 ml destilliertem Wasser gelöst, und die Lösung wurde allmählich durch die oben hergestellt Säule für 2 Stunden durchlaufen gelassen, um das an das Trägermaterial gebundene Fibrinogen in Fibrin umzuwandeln. Die Säule wurde dann mit 100 ul eines Puffers mit 0,02 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl und 0,05% Triton X-100 äquilibriert.

Beispiel 10.

Der in Beispiel 7 (b) hergestellte Extrakt wurde in einer Menge, die 5 ug des Expressionsprodukts entspricht, auf 100 ul Endvolumen einer Flüssigkeit mit 0,02 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl und 2,05% Triton® X-100 eingestellt. Die so hergestellte Lösung wurde durch die in Beispiel 9 hergestellte Säule mit einer Flußrate von 0,5 ml/min durchlaufen gelassen, wobei die Reaktion des Expressionsprodukts in der aufgetragenen Lösung mit dem an das Trägermaterial gebundenen Fibrin in der Säule ermöglicht wurde. Anschließend wurde die Säule mit 40 ml eines Puffers mit 0,02 M Tris-HCl (pH 7,4), 0,15 M NaCl und 0,05% Triton® X-100 bei der oben angegebenen Flußrate gewaschen. Als nächstes wurde die Säule mit Elutionspuffer mit 2 M KSCN, 0,02 M Tris-HCl (pH 7,4) und 0,05% Triton® X-100 eluiert. Während des oben erwähnten Waschens und Eluierens wurde das gesamte Eluat a 2 ml mit Hilfe eines Fraktionssammlers fraktioniert. In jeder Fraktion wurde die Plasminogenaktivatoraktivität anhand der fibrinolytischen Aktivität auf einer plasminogenhaltigen Fibrinplatte gemessen.
Die fibrinolytische Aktivität wurde wie folgt gemessen: Eine Lösung von 0,1 g Fibrinogen (Daiichi Kagaku Yakuhin, Japan; Fibrinogen Typ 1), gelöst in 5 ml 0,06 M Phosphatpuffer, und eine Lösung von 0,025 g Agarose (Sigma), gelöst in 5 ml des gleichen Puffers, wurden gemischt. Zu der Mischung wurde Rinderthrombin (Mochida Seiyaku, Japan) auf eine Endkonzentration von 3 NIH Einheiten/ml (1 mM) zugesetzt, und nach Rühren wurde die Mischung in eine Petrischale mit einem inneren Durchmesser von 8,5 cm gegeben, um eine Fibrinplatte herzustellen. Jeweils 10 ul der Analysenproben wurden auf die Fibrinplatte tropfenförmig gegeben, und die Platte wurde bei 37ºC für 14 Stunden inkubiert. Die Durchmesser der sich entwickelnden lytischen Kreise wurden gemessen. Gemäß dem gleichen Verfahren, wie oben beschrieben, wurden Standardanalyseproben mit bekannten Einheiten, hergestellt aus kommerzieller Urokinase aus Harn (UK), tropfenförmig auf die Fibrinplatte aufgebracht, und die Platte wurde bei 37ºC für 14 Stunden inkubiert, und die Durchmesser der sich entwickelnden lytischen Kreise wurden gemessen. Aus diesen Messungen wurde eine Eichkurve der Aktivität gegen Durchmesser der lytischen Kreise erstellt. Durch Anwenden der Messungen des Durchmessers des lytischen Kreises von Testanalysenproben auf die Eichkurve wurde die Aktivität der Testanalysenprobe erhalten.
Fraktionen, die mit Waschpuffer ohne KSCN eluiert wurden, wurden als nicht-adsorbierte Fraktionen bezeichnet, während Fraktionen, die mit Elutionspuffer, der 2 M KSCN enthielt, eluiert wurden, als adsorbierte Fraktionen bezeichnet wurden. Die Elutionsprofile einer jeden Analysenprobe sind in Fig. 18-2 bis 18-4 gezeigt. Als Kontrollen wurden ein gewerblich erhältlicher Gewebsplasminogenaktivator (TPA), eine aus Harn stammende, gewerblich erhältliche Urokinase (UK) und aus E. coli stammender rekombinanter TPA (DPAT2) auf die gleiche Weise, wie oben beschrieben, behandelt, und die Elutionsprofile der Kontrollen sind in Fig. 18-1 gezeigt.
Wie aus diesen Figuren ersichtlich, während die gewerblich erhältliche Urokinase (UK) nicht an ein Fibrin-Sepharose®-Trägermaterial bindet, besitzen die erfindungsgemäßen hybriden Plasminogenaktivatorähnlichen Polypeptide, die die gesamte oder einen Teil der Domänenregion, welche für die Affinität von humanem Gewebsplasminogenaktivator zu Fibrin verantwortlich ist, enthalten, wie auch in E. coli hergestellter rekombinanter Gewebsplasminogenaktivator und ein gewerblich erhältlicher Gewebsplasminogenaktivator die Fähigkeit, an ein Fibrin-Sepharose®-Trägermaterial zu binden.

Beispiel 11. Km-Bestimmung mit Hilfe des synthetischen Substrats S-2288

S-2288 (Kabi) wurde in einem Reaktionspuffer mit 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0), 0,01% Triton® X-100 und 0,5 M NaCl gelöst, und schließlich wurden Lösungen hergestellt mit je 0,1 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM und 1 mM S-2288.
Die in Beispiel 7 (b) hergestellten Extrakte HA03 und HA20 und eine Lösung aus gewerblich erhältlicher Urokinase (UK), jeweils 10 ul, wurden mit dem Reaktionspuffer auf ein Endvolumen von 400 ul verdünnt. Zu diesen Analysenproben wurden 2 ul einer Lösung mit 1 mg/ml Plasmin (Sigma) zugesetzt, und die Reaktionsmischungen wurden bei 37ºC für 1 Stunde in einem Inkubator stehengelassen. Dann wurden die Reaktionsmischungen direkt in Eiswasser überführt und jeder wurden 2 ul einer Lösung aus 5 mg/ml Trypsininhibitor aus Sojabohnen (Sigma) zugesetzt, um die Reaktion mit Plasmin zu stoppen. Fünf Reaktionsmischungen wurden für jede Testanalysenprobe hergestellt, und zu jeder Reaktionsmischung wurde die oben erwähnte S-2288-Lösung mit einer verschiedenen Konzentration zugesetzt. Diese Reaktionsmischung wurde bei 37ºC für 1 Stunde in einem Inkubator stehengelassen. Danach wurden die Reaktionsmischungen sofort in ein Eiswasserbad überführt und jeder wurden 50 ul 10% Essigsäurelösung zugesetzt, um die Reaktion zu beenden. Als eine Kontrolle wurde das gleiche Verfahren, wie oben beschrieben, durchgeführt unter Verwendung von 400 ul des Reaktionspuffers anstelle der 400 ul der Testanalysenprobe.
Für jede Reaktionsmischung wurde die Absorbtion bei 405 nm gemessen, und für jede Analysenprobe wurde die Differenz zwischen der Absorbtion der Analysenprobe und der Absorbtion der Kontrolle, d. h. ein A-Wert, erhalten. Die Reaktionsgeschwindigkeit war v = A/60, deshalb gilt 1/v = 60/A, worin "60" angibt, daß die Reaktion für 60 Minuten durchgeführt wurde. Ein reziprokes Lineweaver- Burk-Plotdiagramm wurde erstellt durch Auftragen des 1/v-Werts auf der Ordinate und des 1/S-Werts auf der Abszisse, worin S eine Konzentration (M) eines Substrats in der Reaktionsmischung darstellt. Aus dem Diagramm wurden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Km-Werte erhalten. Tabelle Analysenprobe gemessener Km (Mol/l) Km aus Kabi S-2288-Datenblatt (Mol/l) kommerzielle UK
Wie aus der Tabelle ersichtlich, besitzt das vorliegende hybride Polypeptid HA03, bestehend aus einer Polypeptidregion von dem Met in Position 161 bis zum Gly in Position 219, die ungefähr einer halben Domäne eines humanen Gewebsplasmingenaktivators entspricht, und einer Polypeptidregion von Gln in Position 150 bis zu Leu in Position 411 von humaner Prourokinase, worin Phe in Position 157 durch Asp ersetzt ist, und das vorliegende hybride Polypeptid HA20, bestehend aus einer Polypeptidregion vom ersten Ser bis zum Gly in Position 219, die eine vollständige Domänenregion von humanem Gewebsplasminogenaktivator umfaßt, und eine Polypeptidregion vom Gln in Position 150 bis zum Leu in Position 411 von humaner Prourokinase, den gleichen Km-Wert wie gewerblich erhältliche Prourokinase.
Dies bedeutet, daß die für die Enzymaktivität in dem vorliegenden hybriden Polypeptid verantwortliche Region die gleiche Eigenschaft besitzt wie der entsprechende Teil von nativer Urokinase, unabhängig von der Länge der Region, die von dem Gewebsplasminogenaktivator stammt und die für die Fibrinaffinität verantwortlich ist, und unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Punktmutation in einer Serinproteaseregion, d. h. an Aminosäureposition 157.

Beispiel 11. Konstruktion des Plasmids pHA21L (Fig. 20)

10 ug des in Beispiel 4 konstruierten Plasmids pHA20 wurden mit 100 Einheiten BglII und 96 Einheiten PstI in 200 ul eines Puffers mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2; und 100 uM NaCl bei 37ºC für 2 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer 0,7% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 3400 bp wurde mit herkömmlichen Mitteln gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (E) bezeichnet.
Weiterhin wurden 5 ug des gleichen Plasmids pHA20 mit 100 Einheiten BglII und 20 Einheiten ScaI in 200 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 125 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 4 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde dann einer 0,7% Agarosegelelektrophorese unterzogen und ein DNA-Fragment von ungefähr 630 bp wurde mit herkömmlichen Mitteln gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (F) bezeichnet.
Andererseits wurden 5 ug des in Referenzbeispiel 18 konstruierten Plasmids pMUT9Lpml mit 30 Einheiten PstI in 100 ul eines Puffers mit 200 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2; und 100 mM NaCl bei 37ºC für 2 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde dann einer 0,7% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 1200 bp wurde mit herkömmlichen Mitteln gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde partiell verdaut mit 40 Einheiten FspI in 100 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl und 10 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 10 Minuten. Die Reaktionsmischung wurde dann einer 1,2% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 1100 bp wurde mit herkömmlichen Mitteln gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (G) bezeichnet.
Die folgenden zwei Oligonukleotide:
5' ACTGTGATGTGCCCTCCTGCACAGGAA 3'
3' TGACACTACACGGGAGGACGTGTCC 5'
wurden mit Hilfe der Phosphitmethode synthetisiert. Jeweils 1 ug dieser synthetischen Oligonukleotide wurde in 30 ul einer Lösung mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM β-Mercaptoethanol gemischt, für 5 Minuten auf 70ºC erwärmt und dann auf Eis gekühlt. Der Reaktionsmischung wurden 20 Einheiten T4- Polynukleotidkinase zugesetzt und sie wurde für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, um das 5'-Ende der Oligonukleotide zu phosphorylieren. Die Reaktionsmischung wurde für 2 Minuten auf 70ºC erwärmt und dann für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, um die beiden synthetischen Oligonukleotide zu hybridisieren. Nach Ethanolpräzipitation des hybridisierten Produkts wurde das Präzipitat mit dem oben erwähnten DNA-Fragment (F) gemischt und mit Hilfe von 5 Einheiten T4 DNA-Ligase in 20 ul eines Puffers mit 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 10 mM ATP bei 12ºC für 15 Stunden ligiert. Nach Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation der Reaktionsmischung wurde die Reaktionsmischung mit 10 Einheiten FspI und 20 Einheiten BglII in 50 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl und 10 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 4 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer 1,0% Agarosegelelektrophorse unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 650 bp wurde mit herkömmlichen Mitteln gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (H) bezeichnet.
Die DNA-Fragmente (E), (G) und (H), alle wie oben beschrieben hergestellt, wurden gemischt und mit Hilfe von 5 Einheiten T4 DNA-Ligase in 20 ul eines Puffers mit 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 10 mM ATP bei 12ºC für 15 Stunden ligiert. Die Reaktionsmischung wurde zum Transformieren von E. coli JM103 gemäß einem herkömmlichen Verfahren verwendet, und so erhaltene Ampicillin-resistente Transformanden wurden nach einer Kolonie abgesucht, die das Plasmid pHA21L enthält, und das Plasmid pHA21L wurde mit herkömmlichen Mitteln isoliert.

Beispiel 12. Konstruktion des Plasmids pHA24L

5 ug des in Referenzbeispiel 17 konstruierten Plasmids pMUT4Lpm4 wurden mit 50 Einheiten PstI in 100 ul eines Puffers mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2; und 100 mM NaCl bei 37ºC für 2 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer 0,7% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 1200 bp wurde mit herkömmlichen Mitteln gewonnen. Das DNA-Fragment wurde partiell verdaut mit 40 Einheiten FspI in 100 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl und 10 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 10 Minuten. Die Mischung wurde dann einer 1,2% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 1100 bp wurde mit herkömmlichen Mitteln gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (I) bezeichnet.
Andererseits wurden die DNA-Fragmente (E) und (G) gemäß dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 11 beschrieben, hergestellt. Diese DNA-Fragmente (E), (G) und (I) wurden gemischt und mit Hilfe von T4 DNA-Ligase in 20 ul eines Puffers mit 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 10 mM ATP bei 12ºC für 15 Stunden ligiert. Die Reaktionsmischung wurde zum Transformieren von E. coli JM103 gemäß einem herkömmlichen Verfahren verwendet, und Ampicillin-resistente Transformanden wurden nach einer Kolonie abgesucht, die Plasmid pHA24L, in Fig. 20 gezeigt, enthält, und das Plasmid pHA24L wurde mit herkömmlichen Mitteln isoliert.

Beispiel 13. Konstruktion des Plasmids pHA11L

5 ug des in Beispiel 11 konstruierten Plasmids pHA21L wurden mit 50 Einheiten ScaI und 50 Einheiten PstI in 100 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 125 NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 6 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer 1% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 1100 bp wurde mit herkömmlichen Mitteln gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (J) bezeichnet.
Weiterhin wurden 10 ug des gleichen Plasmids pHA21L mit 100 Einheiten DdeI in 200 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 150 NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 15 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde dann einer 4% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 330 bp wurde mit einem herkömmlichen Verfahren isoliert. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (K) bezeichnet.
Die folgenden zwei Oligonukleotide:
5' ATGAAGAGGTGACGTCATGTC 3'
3' TACTTCTCCACTGCAGTACAGACT 5'
wurden mit Hilfe der Phosphitmethode synthetisiert. Jeweils 2 ug dieser zwei synthetischen Oligonukleotide wurden gemischt, und die Phosphorylierung des 5'-Endes und das Hybridisieren wurden gemäß dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 11 beschrieben, durchgeführt. Nach Ethanolpräzipitation der hybridisierten Oligonukleotide wurde das Präzipitat mit dem oben beschriebenen DNA-Fragment (K) gemischt, und das Ligieren wurde gemäß dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 11 beschrieben, durchgeführt. Nach Ethanolpräzipitation wurde das Präzipitat mit 100 Einheiten ScaI und 100 Einheiten AatII in 100 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 125 mM NaCl und 7 mM 2-Mercaptoethanol bei 37ºC für 15 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer 4% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 250 bp wurde mit einem herkömmlichen Verfahren gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (L) bezeichnet.
Andererseits wurden 5 ug des in Referenzbeispiel 18 konstruierten Plasmids pMUT9Lpm1 mit 50 Einheiten AatII und 50 Einheiten PstI in 100 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 60 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 4 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde dann einer 0,7% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 3000 bp wurde mit Hilfe eines herkömmlichen Verfahrens gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (M) bezeichnet.
Die DNA-Fragmente (J), (L) und (M), alle wie oben beschrieben hergestellt, wurden gemischt und mit Hilfe von 5 Einheiten T4 DNA-Ligase in 20 ul eines Puffers mit 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 10 mM ATP bei 12ºC für 15 Stunden ligiert. Die Reaktionsmischung wurde zum Transformieren von E. coli JM103 gemäß einem herkömmlichen Verfahren verwendet, und die Ampicillin-resistenten Transformanden wurden nach einer Kolonie abgesucht, die das Plasmid pHA11L, gezeigt in Fig. 21, enthält, und das Plasmid pHA11L wurde gemäß einem herkömmlichen Verfahren isoliert.

Beispiel 14. Konstruktion des Plasmids pHA 14L

5 ug des in Beispiel 12 konstruierten Plasmids pHA24L wurden mit 50 Einheiten ScaI und 50 Einheiten PstI in 100 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 125 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 6 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde dann einer 1,0% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 1100 bp wurde nach einem herkömmlichen Verfahren gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (N) bezeichnet.
Andererseits wurden die DNA-Fragmente (L) und (M) genau gemäß dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 13 beschrieben, hergestellt. Diese DNA-Fragmente (L), (M) und (N) wurden gemischt und mit Hilfe von T4 DNA-Ligase in 20 ul eines Puffers mit 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 10 mM ATP bei 12ºC für 15 Stunden ligiert. Die Reaktionsmischung wurde zum Transformieren von E. coli JM103 verwendet, und Ampicillin-resistente Transformanden wurden nach einer Kolonie abgesucht, die das Plasmid pHA14L enthält, und das Plasmid pHA14L wurde gemäß einem herkömmlichen Verfahren isoliert.

Beispiel 15. Konstruktion des Plasmids pHA01L (Fig. 22)

5 ug des in Beispiel 11 konstruierten Plasmids pHA21L wurden mit 50 Einheiten EcoRI und 50 Einheiten PstI in 100 ul eines Puffers mit 20 mM Tris-KCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2; und 100 mM NaCl bei 37ºC für 4 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde einer 0,7% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 3300 bp wurde gemäß einem herkömmlichen Verfahren gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (O) bezeichnet.
5 ug des gleichen Plasmids pHA21L wurden mit 50 Einheiten ScaI und 50 Einheiten PstI in 100 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 125 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 15 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde dann einer 0,7% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 100 bp wurde mit Hilfe eines herkömmlichen Verfahrens gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (P) bezeichnet.
Weiterhin wurden 10 ug des gleichen Plasmids pHA21L mit 50 Einheiten EcoRI und ScaI in 100 ul eines Puffers mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 125 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol bei 37ºC für 15 Stunden gespalten. Die Reaktionsmischung wurde dann einer 2,0% Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein DNA-Fragment von ungefähr 150 bp wurde gemäß einem herkömmlichen Verfahren gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde als DNA-Fragment (Q) bezeichnet.
Die DNA-Fragmente (O), (P) und (Q), alle wie oben beschrieben hergestellt, wurden gemischt und mit Hilfe von 5 Einheiten T4 DNA-Ligase in 20 ul eines Puffers mit 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 10 mM ATP bei 12ºC für 15 Stunden ligiert. Die Reaktionsmischung wurde zum Transformieren von E. coli JM103 verwendet, und Ampicillin-resistente Transformanden wurden nach einer Kolonie abgesucht, die das Plasmid pHA01, gezeigt in Fig. 22, enthält, und das Plasmid pHA01 wurde gemäß einem herkömmlichen Verfahren isoliert.

Beispiel 16. Konstruktion des Plasmids pHA04L

Plasmid pHA04L wurde gemäß dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 15 beschrieben konstruiert, außer, daß das Plasmid pHA24L, konstruiert in Beispiel 12, anstelle des Plasmids pHA21L verwendet wurde.

Beispiel 17. Expression und Extraktion des hybriden Plasminogenaktivator-ähnlichen Polypeptids HPA24L

Das in Beispiel 12 konstruierte Plasmid pHA24L wurde zum Transformieren von E. coli KY1436 gemäß einem herkömmlichen Verfahren verwendet, und der so erhaltene Transformand wurde in 5 ml eines L-Mediums, ergänzt mit 50 ug/ml Ampicillin, in einem Teströhrchen bei 30ºC über Nacht unter Schütteln kultiviert. 2 ml des Kulturmediums wurden zu 1 l eines L-Mediums, ergänzt mit 50 ug/ml Ampicillin, in einen 5 l-Kolben gegeben, und das Kultivieren wurde bei 30ºC auf einem Belüftungsschüttler bei 250 Upm durchgeführt. Als die Absorbtion bei 60 nm (OD&sub6;&sub0;&sub0;) des Mediums erreichte, wurde diese in einen Inkubator bei 37ºC überführt, und das Kultivieren wurde für weitere 5 Stunden unter Schütteln bei 37ºC durchgeführt, um das Gen für das hybride Plasminogenaktivator-ähnliche Polypeptid HPA24L zu exprimieren.
Eine Menge des Kulturmediums, entsprechend 6 von OD&sub6;&sub0;&sub0;, wurde in Plastikzentrifugenröhrchen überführt und zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die Zellen wurden in 1,0 ml eines Puffers mit 0,1 mM NaCl und 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) suspendiert, und die Suspension wurde beschallt, um die Zellen auf zubrechen. Die beschallte Suspension wurde dann zentrifugiert, um eine unlösliche Fraktion zu gewinnen. Eine Menge der unlöslichen Fraktion, entsprechend 1 von OD&sub6;&sub0;&sub0;, wurden einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gemäß einem herkömmlichen Verfahren unterzogen. Das Ergebnis ist in Fig. 23 dargestellt, worin Spur 2 die Proteinzusammensetzung aus der unlöslichen Fraktion und Spur 1 die aus dem Überstand darstellt.
Andererseits wurde eine Menge der unlöslichen Fraktion, entsprechend 4 von OD&sub6;&sub0;&sub0;, in 160 ul einer Lösung mit 6 M Guanidinhydrochlorid und 25 mM Tris-HCl (pH 8,0) suspendiert, und die Suspension wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Suspension wurde dann auf eine Endkonzentration von 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 M Guanidinhydrochlorid, 2 mM Glutathion vom reduzierten Typ, 0,2 mM Glutathion vom oxidierten Typ, 1 mM EDTA und 0,1% Tween 80 eingestellt und bei Raumtemperatur für 15 Stunden stehengelassen, um einen Rohextrakt zu erhalten.

Beispiel 18. Bestimmen der Aktivität des HPA24L-Rohextrakts mit Hilfe des synthetischen Substrats S-2444

10 ul des in Beispiel 17 hergestellten HPA24L-Rohextrakts wurden einem Puffer mit 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) und 0,01 % Triton® X-100 zugesetzt, um ein Gesamtvolumen von 99 ul zu ergeben. Zu dieser Mischung wurden 1 ul einer 1 ug/ul Plasminlösung zugesetzt, und das Ganze wurde bei 37ºC für 15 Minuten inkubiert, und dann wurde 1 ul einer Lösung mit Trypsininhibitor aus Sojabohnen zugesetzt. Die Mischung wurde vollständig gemischt. Dann wurden der Mischung 0,7 ml eines Puffers mit 2 mM synthetischem Substrat X-2444 und 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) und 0,01% Triton® X-100 zugesetzt, und die Mischung wurde für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, und dann wurden 100 ul Eisessig zugesetzt, um die Reaktion zu beenden.
Die Absorbtion der Reaktionsmischung wurde bei 405 nm gemessen. Die Enzymaktivität der Reaktionsmischung wurde gemäß der folgenden Formel berechnet:
Internationale Einheit (I.E.) = (OD&sub4;&sub0;&sub5;/0,395)·6,5, und ungefähr 120 I.E. der Enzymaktivität wurden erhalten.

Beispiel 19. Expression und Extraktion von weiteren hybriden Plasminogenaktivator-ähnlichen Polypeotiden

Das gleiche Verfahren wie in Beispielen 17 und 18 beschrieben, wurde wiederholt für Plasmide pHA21L, pHA11L, pHA14L, pHA01L und pHA04L, und ähnliche Ergebnisse wie in Beispielen 17 und 18 beschrieben wurden erhalten.

Literatur

(1) JP-OS-60-241889
(2) Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald, R.J. und Rutter, W.J. (1979) Biochemistry 18, 5294-5299.
(3) Aviv, H. und Leder, P. (1972) Proc. Natl, Acad. Sci. USA 69, 1408-1412.
(4) Okayama H. und Berg, P., (1982) Molec. Gell Biol. 2, 101-170.
(5) Norgard M.V. (1978) Gene 3, 279-292.
(6) Pennica D. (1983) Nature 301, 214-221.
(7) Denhart D.T. (1966) Biochem. Biophys. Res. Commun. 23, 643-646.
(8) A.M. Maxam, und W. Gilbert (1980) Methods Enzymol. 65, 499-560.
(9) Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J. (1982) In: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., S. 254.
(10) Birnboim, H.C. und Doly, J. (1979) Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523.
(11) Steffens, G.J. Güenzler, W.A. Öetting, F., Frankus, E. und Flohe, L. (1982) Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 363, 1043-1058.
(12) Güenzler, W.A., supra, (1982) 1055.
(13) Grunstein M. und Hogness D.S., (1975) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72, 3961-3965.
(14) Messing, J., Grec, R. und Seeburg, P.H. (1981) Nucl. Acids Res. 9, 309-321.
(15) Agarwell, K.L., Brunstedt, J. und Noyes, B.E. (1981) J. Biol. Chem. 256, 1023-1028.
(16) Stewart A.G., Richards H., Roberts S., Marwick J., Edwards K., I. Bell, J. Smith und R. Derbyshire (1983) Nuc. Acids Res. 11, 6597-6609.
(17) Brousius J., Ullrich A., Raker M.A., Grey A., Dull T.J., Gutell R.R. und Noller H.F., (1981) Plasmid 6, 112-118.
(18) Brousius, J., (1984), Gene, 27, 151-160.
(19) Brousius J., (1984), Gene, 27, 161-172.
(20) Messing J., (1983) Methods in Enzymology, 101, 20-78.
(21) Benton W.D. und Davis R.W. (1977), Science 196, 180-182.

Claims

1. Ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid umfassend eine für die Affinität zu Fibrin verantwortliche Polypeptidregion, die vom

Gewebsplaminogenaktivatorpolypeptid stammt, verknüpft durch eine Peptidbindung mit einer für eine Enzymaktivität verantwortlichen Polypeptidregion, die vom

Prourokinasepolypeptid stammt, worin das hybride Plasminogenaktivator-ähnliche Polypeptid eine Affinität zu Fibrin und eine Enzymaktivität nach der Aktivierung besitzt.

2. Ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid gemäß Anspruch 1, worin die für die Affinität zu Fibrin verantwortliche Polypeptidregion aus ungefähr zwei Domänen einer N-terminalen Region eines menschlichen Gewebsplasminogenaktivatorpolypeptids besteht.

3. Ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid gemäß Anspruch 2, worin die ungefähr zwei Domänen eine Polypeptidregion von einem N-terminalen ersten Serin bis zu einem Cystein in Position 215 oder Glycin in Position 217 eines menschlichen Gewebsplasminogenaktivatorpolypeptids, berechnet von der ersten Aminosäure, darstellt.

4. Ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid gemäß Anspruch 1, worin die für die Affinität zu Fibrin verantwortliche Polypeptidregion aus ungefähr einer Domäne eines menschlichen Gewebsplasminogenaktivatorpolypeptids besteht.

5. Ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid gemäß Anspruch 4, worin die ungefähr eine Domäne eine Polypeptidregion von dem Serin in Positon 128 bis zu einem Cystein in Position 215 oder Glycin in Position 219 eines menschlichen Gewebsplasminogenaktivatorpolypeptids, berechnet von der N-terminalen Aminosäure Serin als der ersten Aminosäure, darstellt.

6. Ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid gemäß Anspruch 1, worin die für die Affinität zu Fibrin verantwortliche Polypeptidregion aus ungefähr einer halben Domäne eines menschlichen Gewebsplasminogenaktivatorpolypeptids besteht.

7. Ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid gemäß Anspruch 6, worin die ungefähr halbe Domäne ein Polypeptid von einem Methionin in Position 161 bis zu einem Cystein in Position 215 oder Glycin in Position 219 eines menschlichen Gewebsplasminogenaktivatorpolypeptids, berechnet von der N-terminalen Aminosäure Serin als der ersten Aminosäure, darstellt.

8. Ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid gemäß Anspruch 1, worin die für die Enzymaktivität verantwortliche Polypeptidregion aus einer C-terminalen Region mit Enzymaktivität eines menschlichen Prourokinasepolypeptids besteht.

9. Ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid gemäß Anspruch 8, worin die für die Enzymaktivität verantwortliche Polypeptidregion aus einer Polypeptidregion von einem Glutamin in Position 150 bis zu einem Leucin in Position 411 eines menschlichen Prourokinasepolypeptids, berechnet von einer N-terminalen Aminosäure Serin als der ersten Aminosäure, besteht, worin das Phenylalanin in Position 157 gegebenenfalls durch eine saure Aminosäure ersetzt ist.

10. Ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid gemäß Anspruch 8, worin die für die Enzymaktivität verantwortliche Polypeptidregion aus einer Polypeptidregion von einem Alanin in Position 132 bis zu einem Leucein in Position 411 einer menschlichen Prourokinase, berechnet von einer ersten N-terminalen Aminosäure Serin als der ersten Aminosäure, besteht, worin das Phenylalanin in Position 157 gegebenenfalls durch eine saure Aminosäure ersetzt ist und/oder die Aminosäure Lysin in Position 135 gegebenenfalls durch eine andere als ein basische Aminosäure ersetzt ist.

11. Ein hybrides Plasminogenaktivator-ähnliches Polypeptid gemäß Anspruch 9 oder 10, worin die saure Aminosäure Aparaginsäure ist, und die andere als die basische Aminosäure Glutamin ist.

12. Ein DNA-Segment, das für das hybride Plasminogenaktivator-ähnliche Polypeptid von Anspruch 1 kodiert, worin der DNA-Abschnitt, der die Polypeptidregion kodiert, die für die Affinität zu Fibrin verantwortlich ist, an der 5'-terminalen Seite vorhanden ist, und der DNA-Abschnitt, der für die Polypeptidregion kodiert, die für die Enzymaktivität verantwortlich ist, ist an der 3'-terminalen Seite des DNA-Segments vorhanden.

13. Ein DNA-Segment gemäß Anspruch 12, worin die DNA-Region, die für die Polypeptidregion kodiert, die für die Affinität zu Fibrin verantwortlich ist, ein entsprechender Abschnitt von cDNA ist, der mRNA entspricht, die von Zellen einer menschlichen pharyngealen Krebszellinie Detroit 562 stammt.

14. Ein DNA-Segment gemäß Anspruch 12, worin die DNA-Region, die für die Polypeptidregion kodiert, die für die Enzymaktivität verantwortlich ist, ein entsprechender Abschnitt von cDNA darstellt, die mRNA entspricht, die von menschlichen Nierengewebszellen stammt.

15. Ein DNA-Segment gemäß Anspruch 14, worin ein Codon, das für Phenylalanin in Position 157 kodiert, zu einem Codon mutiert wird, das für eine saure Aminosäure kodiert, und/oder ein Codon, das für Lysin in Position 135 kodiert, ist zu einem Codon mutiert, das für eine andere Aminosäure als eine basische Aminosäure kodiert.

16. Ein Plasmid, welches das DNA-Segment nach Anspruch 12 enthält und fähig ist, das Polypeptid zu exprimieren.

17. Ein Plasmid gemäß Anspruch 16, enthaltend einen Tac- Promotor/Operator und die Shine-Dalgarno-Sequenz des von Pseudomonas putida stammenden Methapyrocacechasegens.

18. Ein Plasmid gemäß Anspruch 17, das ein Plasmid darstellt, pHA00 hinterlegt unter DSM3628, pHA03, hinterlegt unter DSM3627, pHA20, hinterlegt unter DSM3626, pHA23, hinterlegt unter DSM3625, pHA21L, hinterlegt unter DSM3951, pHA24L, hinterlegt unter DSM3952;

pHA13, das ein Gen enthält, das für ein hybrides Plsminogenaktivator-ähnliches Polypeptid kodiert, das als seine N-terminale Hälfte eine Polypeptidregion von Serin in Position 128 bis Glycin in Position 219 von menschlichem Gewebsplaminogenaktivator, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, und als seine C-terminale Hälfte eine Polypeptidregion von Glutamin in Position 150 bis zu dem C-terminalen Leucin in Position 411 von menschlicher Prourokinase, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, enthält, worin Phenylalanin in Position 157 durch Asparaginsäure ersetzt ist, unter der Kontrolle des Tac-Promotors/Operators und der Shine-Dalgarno-Sequenz des von Pseudomonas utida stammenden Methapyrocatechasegens, und das das oben erwähnte hybride Polypeptid exprimieren kann und das die in Fig. 16 gezeigte Struktur besitzt;

pHA11L, das ein Gen enthält, das für ein hybrides Plsminogenaktivator-ähnliches Polypeptid kodiert, das als seine N-terminale Hälfte eine Polypeptidregion von Serin in Position 128 bis zu Cystein in Position 215 eines menschlichen Gewebsplaminogenaktivators, und als seine G-terminale Hälfte eine Polypeptidregion von Alanin in Postion 132 bis zu dem C-terminalen Leucin in Position 411 von menschlicher Prourokinase, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, enthält, worin Lysin in Position 135 durch Glutamin ersetzt ist, unter der Kontrolle des Tac-Promotors und der Shine-Dalgarno-Sequenz des von Pseudomonas putida stammenden Methapyrocatechasegens, und das das oben erwähnte hybride Polypeptid exprimieren kann und das die in Fig. 21 gezeigte Struktur besitzt;

pHA01L, das ein Gen enthält, das für ein hybrides Plsminogenaktivator-ähnliches Polypeptid kodiert, das als seine N-terminale Hälfte eine Polypeptidregion von Methionin in Position 161 bis Cystein in Position 215 von menschlichem Gewebsplaminogenaktivator, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, und als seine C-terminale Hälfte eine Polypeptidregion von Alanin in Position 132 bis zu dem N-terminalen Leucin in Position 411 von menschlicher Prourokinase, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, enthält, worin Lysin in Position 135 durch Glutamin ersetzt ist, unter der Kontrolle des Tac-Promotors/Operators und der Shine-Dalgarno-Sequenz des von Pseudomonas putida stammenden Methapyrocatechasegens, und das das oben erwähnte hybride Polypeptid exprimieren kann und das die in Fig. 22 gezeigte Struktur besitzt;

pHA14L, das identisch mit Plasmid pHA11L ist, außer daß das Codon für Phenylalanin in Positon 157 durch ein Codon für Asparaginsäure ersetzt ist,

pHA04L, das identisch mit Plasmid pHA01L ist, außer daß das Codon für Phenylalanin in Position 157 durch ein Codon für Asparaginsäure ersetzt ist.

19. Escherichia coli, transformiert mit dem Plasmid von Anspruch 16.

20. Ein Verfahren zum Herstellen des hybriden Plasminongeaktivator-ähnlichen Polypeptids von Anspruch 1, umfassend Kultivieren des E.Coli von Anspruch 19 und Gewinnen des Polypeptids von einem kultivierten Produkt.

Patentansprüche für den Vertragsstaat ES

1. Ein Verfahren zum Herstellen eines hybriden Plasminogenaktivator-ähnlichen Polypeptids umfassend eine für die Affinität zu Fibrin verantwortliche Polypeptidregion, die vom Gewebsplaminogenaktivatorpolypeptid stammt, verknüpft durch eine Peptidbindung mit einer für eine Enzymaktivität verantwortlichen Polypeptidregion, die vom Prourokinasepolypeptid stammt, worin das hybride Plasminogenaktivator-ähnliche Polypeptid eine Affinität zu Fibrin und eine Enzymaktivität nach der Aktivierung besitzt, wobei das Verfahren umfaßt:

Kultivieren eines Wirts, der mit einem Plasmid transformiert ist, das ein für das Polypeptid kodierendes DNA-Segment enthält, und Gewinnen des Polypeptids aus einem kultivierten Produkt.

2. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die für die Affinität zu Fibrin verantwortliche Polypeptidregion aus ungefähr zwei Domänen einer N-terminalen Region eines menschlichen Gewebsplasminogenaktivatorpolypeptids besteht.

3. Ein Verfahren gemäß gemäß Anspruch 2, worin die ungefähr zwei Domänen eine Polypeptidregion von einem N-terminalen ersten Serin bis zu einem Cystein in Position 215 oder Glycin in Position 217 eines menschlichen Gewebsplasminogenaktivatorpolypeptids, berechnet von der ersten Aminosäure, darstellt.

4. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die für die Affinität zu Fibrin verantwortliche Polypeptidregion aus ungefähr einer Domäne eines menschlichen Gewebsplasminogenaktivatorpolypeptids besteht.

5. Ein Verfahren gemäß Anspruch 4, worin die ungefähr eine Domäne eine Polypeptidregion von dem Serin in Positon 128 bis zu einem Cystein in Position 215 oder Glycin in Position 219 eines menschlichen Gewebsplasminogenaktivatorpolypeptids, berechnet von der N-terminalen Aminosäure Serin als der ersten Aminosäure, darstellt.

6. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die für die Affinität zu Fibrin verantwortliche Polypeptidregion aus ungefähr einer halben Domäne eines menschlichen Gewebsplasminogenaktivatorpolypeptids besteht.

7. Ein Verfahren gemäß Anspruch 6, worin die ungefähr halbe Domäne ein Polypeptid von einem Methionin in Position 161 bis zu einem Cystein in Position 215 oder Glycin in Position 219 eines menschlichen Gewebsplasminogenaktivatorpolypeptids, berechnet von der N-terminalen Aminosäure Serin als der ersten Aminosäure, darstellt.

8. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die für die Enzymaktivität verantwortliche Polypeptidregion aus einer C-terminalen Region mit Enzymaktivität eines menschlichen Prourokinasepolypeptids besteht.

9. Ein Verfahren gemäß Anspruch 8, worin die für die Enzymaktivität verantwortliche Polypeptidregion aus einer Polypeptidregion von einem Glutamin in Position 150 bis zu einem Leucin in Position 411 eines menschlichen Prourokinasepolypeptids, berechnet von einer N-terminalen Aminosäure Serin als der ersten Aminosäure, besteht, worin das Phenylalanin in Position 157 gegebenenfalls durch eine saure Aminosäure ersetzt ist.

10. Ein Verfahren gemäß Anspruch 8, worin die für die Enzymaktivität verantwortliche Polypeptidregion aus einer Polypeptidregion von einem Alanin in Position 132 bis zu einem Leucein in Position 411 einer menschlichen Prourokinase, berechnet von einer ersten N-terminalen Aminosäure Serin als der ersten Aminosäure, besteht, worin das Phenylalanin in Position 157 gegebenenfalls durch eine saure Aminosäure ersetzt ist und/oder die Aminosäure Lysin in Position 135 gegebenenfalls durch eine andere als ein basische Aminosäure ersetzt ist.

11. Ein Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, worin die saure Aminosäure Aparaginsäure ist, und die andere als die basische Aminosäure Glutamin ist.

12. Ein Verfahren zum Herstellen eines DNA-Segments, das für das hybride Plasminogenaktivator-ähnliche Polypeptid von Anspruch 1 kodiert, worin der DNA-Abschnitt, der die Polypeptidregion kodiert, die für die Affinität zu Fibrin verantwortlich ist, an der 5'-terminalen Seite vorhanden ist, und der DNA-Abschnitt, der für die Polypeptidregion kodiert, die für die Enzymaktivität verantwortlich ist, ist an der 3'-terminalen Seite des DNA-Segments vorhanden, wobei das Verfahren umfaßt:

(1) Herstellen eines Gens, das für einen Gewebsplasminogenaktivator kodiert, und Erhalten eines DNA-Fragments, das für eine Polypeptidregion mit einer Affinität zu Fibrin kodiert;

(2) Herstellen eines Gens, das für Prourokinase kodiert, und Erhalten eines DNA-Fragments, das für eine Polypeptidregion mit Enzymaktivität kodiert;

(3) Verknüpfen der beiden in Schritten (1) und (2) erhaltenen DNA-Fragmente.

13. Ein Verfahren gemäß Anspruch 12, worin die DNA-Region, die für die Polypeptidregion kodiert, die für die Affinität zu Fibrin verantwortlich ist, ein entsprechender Abschnitt von cDNA ist, der mRNA entspricht, die von Zellen einer menschlichen pharyngealen Krebszellinie Detroit 562 stammt.

14. Ein Verfahren gemäß Anspruch 12, worin die DNA-Region, die für die Polypeptidregion kodiert, die für die Enzymaktivität verantwortlich ist, ein entsprechender Abschnitt von cDNA darstellt, die mRNA entspricht, die von menschlichen Nierengewebszellen stammt.

15. Ein Verfahren gemäß Anspruch 14, worin ein Codon, das für Phenylalanin in Position 157 kodiert, zu einem Codon mutiert wird, das für eine saure Aminosäure kodiert, und/oder ein Codon, das für Lysin in Position 135 kodiert, ist zu einem Codon mutiert, das für eine andere Aminosäure als eine basische Aminosäure kodiert.

16. Ein Verfahren zum Herstellen eines Plasmids enthaltend das DNA-Segment von Anspruch 12 und das das Polypeptid exprimieren kann, wobei das Verfahren umfaßt Einfügen des DNA-Segments in ein Plasmid enthaltend eine Kontrollregion zur Expression.

17. Ein Verfahren gemäß Anspruch 16, worin das Plasmid einen Tac-Promotor/Operator und die Shine-Dalgarno-Sequenz des von Pseudomonas putida stammenden Methapyrocatechasegens enthält.

18. Ein Verfahren gemäß Anspruch 17, worin das Plasmid darstellt ein Plasmid pHA00, hinterlegt unter DSM3628, pHA03, hinterlegt unter DSM3627, pHA20, hinterlegt unter DSM3626, pHA23, hinterlegt unter DSM3625, pHA21L, hinterlegt unter DSM3951, pHA24L, hinterlegt unter DSM3952;

pHA13, das ein Gen enthält, das für ein hybrides Plsminogenaktivator-ähnliches Polypeptid kodiert, das als seine N-terminale Hälfte eine Polypeptidregion von Serin in Position 128 bis Glycin in Position 219 von menschlichem Gewebsplaminogenaktivator, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, und als seine G-terminale Hälfte eine Polypeptidregion von Glutamin in Position 150 bis zu dem C-terminalen Leucin in Position 411 von menschlicher Prourokinase, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, enthält, worin Phenylalanin in Position 157 durch Asparaginsäure ersetzt ist, unter der Kontrolle des Tac-Promotors/Operators und der Shine-Dalgarno-Sequenz des von Pseudomonas putida stammenden Methapyrocatechasegens, und das das oben erwähnte hybride Polypeptid exprimieren kann und das die in Fig. 16 gezeigte Struktur besitzt;

pHA11L, das ein Gen enthält, das für ein hybrides Plsminogenaktivator-ähnliches Polypeptid kodiert, das als seine N-terminale Hälfte eine Polypeptidregion von Serin in Position 128 bis zu Cystein in Position 215 eines menschlichen Gewebsplaminogenaktivators, und als seine C-terminale Hälfte eine Polypeptidregion von Alanin in Postion 132 bis zu dem C-terminalen Leucin in Position 411 von menschlicher Prourokinase, berechnet vom N-terminalen Serin als der ersten Aminosäure, enthält, worin Lysin in Position 135 durch Glutamin ersetzt ist, unter der Kontrolle des Tac-Promotors und der Shine-Dalgarno-Sequenz des von Pseudomonas putida stammenden Methapyrocatechasegens, und das das oben erwähnte hybride Polypeptid exprimieren kann und das die in Fig. 21 gezeigte Struktur besitzt;

19. Ein Verfahren zum Herstellen von Escherichia coli, transformiert mit dem Plasmid von Anspruch 16, durch Einbringen des Plasmids in den Mikroorganismus in bekannter Weise.

20. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der kultivierte Wirt E.Coli ist.