DE69012888T2

DE69012888T2 - Plasminogenaktivator.

Info

Publication number: DE69012888T2
Application number: DE69012888T
Authority: DE
Inventors: Seiga Ito; Tatsunari Nishi; Shigeyoshi Yasamura
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1989-06-19
Filing date: 1990-06-18
Publication date: 1995-06-01
Anticipated expiration: 2010-06-19
Also published as: EP0405285A1; CA2019219A1; US5160735A; US5342775A; EP0405285B1; JPH0322979A; DE69012888D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft einen neuen, unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie hergestellten Plasminogen-Aktivator, eine für den Aktivator kodierende Desoxyribonucleinsäure (DNA), ein die DNA enthaltendes rekombinantes Plasmid, eine mit dem rekombinanten Plasmid transformierte mikrobielle oder Animalzelle, und ein Verfahren zur Herstellung des Plasminogen-Aktivators unter Verwendung der mikrobiellen oder Animalzelle.
Der erfindungsgemäße neue Plasminogen-Aktivator ist gegenüber der Protease (Thrombin), die den Plasminogen-Aktivator vom Urokinase-Typ in eine inaktive, doppelkettige Struktur spaltet, stabil. Daher kann er leicht gewonnen und zu einer reinen Form aufgereinigt werden. Dieser neue Plasminogen-Aktivator besitzt eine erhöhte spezifische Aktivität, ist stabil und besitzt eine gute thrombolytische Aktivität. Dementsprechend kann der neue erfindungsgemäße Plasminogen-Aktivator, wie erwartet, als therapeutisches Mittel u.a. zur Behandlung von und/oder zur Vorbeugung gegen Zerebral-Thrombose und Myocard-Infarkt verwendet werden.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Urokinase (UK), Streptokinase (SK) und der Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) werden gegenwärtig als thrombolytische Agentien verwendet.
Die Primärstruktur von humaner Urokinase ist von Heynecker et al. (JP-A-59-51300, der hier verwendete Ausdruck "JP-A" bedeutet "eine ungeprüft veröffentlichte japanische Patentanmeldung") beschrieben worden, und ihre Faltungsstruktur ist beschrieben worden und ist in Figur 1 dargestellt. Diese Faltungsstruktur, die auf der Grundlage einer Homologie mit anderen Proteinen vorgeschlagen worden ist, kann in die folgenden drei Domänen unterteilt werden. Die erste Domäne auf der N-terminalen Seite ist eine Domäne, die homolog zum epidermalen Wachstumsfaktor ist. Im folgenden wird diese Domäne als "Wachstumsfaktor-Domäne" bezeichnet. Die zweite Domäne ist die sogenannte "Kringel- Domäne". Die dritte Domäne an der C-terminalen Seite ist die sogenannte Serin-Protease-Domäne. Im folgenden wird die dritte Domäne als "Protease-Domäne" bezeichnet.
Humane Urokinase tritt in zwei Formen auf, einer einzelkettigen Form und einer doppelkettigen Form. Die einzelkettige Form von UK wird Prourokinase (im folgenden als "pro-UK" bezeichnet) genannt und besitzt in solch einer Struktur keine thrombolytische Aktivität. Nur aufgrund einer Spaltung durch Plasmin in eine doppelkettige Struktur kann sie eine thrombolytische Aktivität entfalten. Wenn pro-UK jedoch durch Thrombin gespalten wird, das pro-UK an einer Stelle spaltet, die zwei Aminosäuren stromaufwärts von der Plasmin-Spaltungsstelle liegt, besitzt die resultierende doppelkettige Struktur jedoch keine thrombolytische Aktivität mehr [Ichinose et al., J. Biol. Chem., 261, 3486 (1986)]. So wird nach Verabreichung in das Blut pro-UK durch Thrombin, das im Blut vorhanden ist, in eine inaktive, doppelkettige Struktur gespalten. Weiterhin wird, wenn bei dem Reinigungsverfahren für pro-UK eine Kontamination durch eine Thrombin-ähnliche Protease vorliegt, die Protease möglicherweise pro-UK in eine inaktive doppelkettige Struktur spalten.
Um zu verhindern, daß pro-UK durch eine Thrombinähnliche Protease gespalten wird, ist ein pro-UK-Derivat vorgeschlagen worden, das sich aus der Einführung einer Aminosäure-Substitution in die Thrombinspaltungsstelle an der Position P&sub1; oder P1' ergibt (EP-A-0200451 und JP-A-62- 143686).
Da jedoch die Thrombin-Spaltungsstelle nur durch zwei Aminosäuren von der Plasmin-Spaltungsstelle getrennt ist, erschwert die Aminosäuresubstitution, die in der Nachbarschaft der Plasmin-Spaltungsstelle eingeführt wurde, nämlich bei P&sub3; bis P1', gleichzeitig, daß eine Plasmin- Spaltung auftritt, wodurch die Überführung des erhaltenen pro-UK-Derivates in eine aktive Form schwierig wird und eine verringerte spezifische Aktivität resultiert. In der Tat ist bei dem oben erwähnten pro-UK-Derivat, in dem die Aminosäuresubstitution in Position P&sub3; oder P&sub2; relativ zur Plasmin-Spaltungsstelle erfolgt, eine Abnahme der Empfindlichkeit gegenüber Plasmin und somit eine Abnahme der spezifischen Aktivität beobachtet worden.
In Bezug auf die Numerierung der Aminosäurereste des zu spaltenden Peptid-Substrates wird die zu spaltende Peptidbindung durch -P&sub1;-P1'- dargestellt, und die Aminosäuren auf der Aminoseite der zu spaltenden Peptidbindung werden mit den Positionskennzeichen P&sub1;, P&sub2;, P&sub3;, P&sub4; usw. ausgehend von der Aminosäure, die die Aminoseite der Peptidbindung bildet, in Richtung des Amino-Terminus versehen. Die Aminosäuren auf der Carboxylseite dieser Bindung werden mit den Positionskennzeichen P1' P2', P3', P4' usw., ausgehend von der Aminosäure, die die Carboxyl-Seite der Peptidbindung bildet, in Richtung des Carboxyl-Terminus versehen.
Es ist eine erfindungsgemäße Aufgabe, ein neues pro-UK-Derivat zu entwickeln, das stabil gegen jede Thrombin-ähnliche Protease ist, die zur Inaktivierung von pro-UK befähigt ist, und das keine wesentliche Abnahme der spezifischen Aktivität zeigt.
Bisher sind Berichte über die Konstruktion von pro-UK-Derivaten, die mehr oder weniger resistent gegenüber einer Spaltung durch Thrombin sind, veröffentlicht worden, wobei man eine Aminosäuresubstitution in Position P&sub1; in Bezug auf die Thrombin-Spaltungsstelle (Position P&sub3; in Bezug auf die Plasmin-Spaltungsstelle; die 156. Aminosäure des reifen pro-UK) oder in Position P1' in Bezug auf die Thrombin-Spaltungsstelle (P&sub2; in Bezug auf die Plasmin-Spaltungsstelle; die 157. Aminosäure des reifen pro-UK) eingeführt hat. Da jedoch die Position der Aminosäuresubstitution in diesen Derivaten nur zwei oder drei Aminosäuren von der Plasmin-Spaltungsstelle entfernt ist, können die pro-UK- Derivate möglicherweise eine verminderte spezifische Aktivität als Resultat einer Abnahme der Suszeptibilität gegenüber Plasmin besitzen. In der Tat haben die Erfinder bestätigt, daß eine Aminosäuresubstitution im reifen pro-UK in Position 157 (P&sub2; in Bezug auf die Plasmin-Spaltungsstelle) zu einer Abnahme der spezifischen Aktivität führt. Weiterhin ist im Falle der Aminosäuresubstitution in Position 157 festgestellt worden, daß es ein weiteres Problem zusätzlich zur Abnahme der spezifischen Aktivität gibt. Die Resistenz der Pro-UK-Derivate gegenüber Thrombin ist nämlich noch iminer nicht zufriedenstellend.

KURZFASSUNG DER ERFINDUNG

Bei dem Versuch, diese Probleme zu lösen, führten die Erfinder eine neue Aminosäuresubstitution an einer bestimmten Stelle, nämlich in Position 155 [Prolin (Pro)] der reifen pro-UK ein. Als Ergebnis wurde überraschenderweise festgestellt, daß die durch die Aminosäuresubstitution in Position 155 erhaltenen pro-UK-Derivate völlig resistent gegenüber Thrombin sind und zusätzlich eine erhöhte spezifische Aktivität im Vergleich zu natürlich vorkommender pro-UK besitzen.
Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen Plasminogen-Aktivator des Human-Prourokinase-Typs bereit, der dadurch gekennzeichnet ist, daß der 155. Aminosäurerest [ausgehend von dem N-terminalen Serin der reifen humanen Prourokinase] durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt worden ist. Die Erfindung stellt ferner eine DNA, die für das Peptid kodiert, das diesen Aktivator bildet, ein rekombinantes Plasmid, in das diese DNA insertiert ist, eine mikrobielle oder Animalzelle, die mit diesem Plasmid transformiert ist, und ein Verfahren zur Herstellung dieses Plasminogen-Aktivators, das diese mikrobielle oder Animalzelle verwendet, bereit.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 erläutert die Faltungsstruktur der humanen pro-UK.
Figur 2 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pUKT6.
Figur 3 erläutert das Konstruktionsschema für die Plasmide pUKT4 und pUKS3.
Figur 4 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pSEUKT6.
Figur 5 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pSEUKT4.
Figur 6 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pSEUKS3.
Figur 7 (1) und (2) erläutern den Resistenzgrad von verschiedenen pro-UK-Derivaten gegenüber Thrombin im Vergleich zu derjenigen von natürlich vorkommender pro-UK gegenüber Thrombin, wobei die Zeichen für natürlich vorkommendes pro-UK, O für das pro-UK-Derivat UK-T6, Δ für das pro-UK-Derivat UK-T4, für das pro-UK-Derivat UK-S3 und für das pro-UK-Derivat UK-T stehen. In (1) und (2) betragen die Thrombin-Konzentrationen 5,0 IU/ml bzw. 100 IU/ml.
Figur 7 (3) erläutert die Ergebnisse der SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese von natürlich vorkommender pro-UK und verschiedenen pro-UK-Derivaten nach Behandlung mit 5,0 IU/ml Thrombin, wobei vergleichend der zeitliche Ablauf des Verdaus von jedem einzelkettigen Polypeptid dargestellt ist.
Figur 8 erläutert das Schema der cDNA-Synthese mittels der Okayama-Berg-Methode und die Konstruktion einer rekombinanten Plasmid-DNA, die diese cDNA enthält.
Figur 9 erläutert das Konstruktionsschema für die Plasmid-DNA pCCK1.
Figur 10 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pCCK2.
Figur 11 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pUK11, die die humane pro-UX-cDNA enthält.
Figur 12 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pTrS20.
Figur 13 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pTrS33.
Figur 14 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pTerm2.
Figur 15 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pTSF10.
Figur 16 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pTA4.
Figur 17 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pTkSD217.
Figur 18 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pTkSL11.
Figur 19 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pTkSS4.
Figur 20 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pTkSJ1.
Figur 21 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pTkSR18.
Figur 22 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pUKA2.
Figur 23 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pUKB101.
Figur 24 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pTG3.
Figur 25 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid phPA2.
Figur 26 erläutert das Konstruktionsschema für das einzelstrangige pUKmpS1.
Figur 27 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pUKS1.
Figur 28 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pAGE105M.
Figur 29 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pAGE106.
Figur 30 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pSE1PA1-5.
Figur 31 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pSE1PA1-9.
Figur 32 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pUC19H.
Figur 33 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pSE1PA1-9A.
Figur 34 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pUKF2.
Figur 35 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pUKFpro.
Figur 36 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pSEUK1-1A.
Figur 37 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pSPAS1-9A.
Figur 38 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pUKT1.
Figur 39 erläutert das Konstruktionsschema für das Plasmid pSEUKT.
Bei den oben erwähnten Figuren werden die folgenden Abkürzungen in der Human-t-PA cDNA-Region verwendet: F für die Finger-Domäne, G für die Wachstumsfaktor-Domäne, K1 für den Kringel 1, K2 für den Kringel 2, K2' für den Kringel, der aus einem partiellen Austausch von Kringel 2 durch den Kringel 1 resultiert, und P für die Protease- Domäne. Bei der humanen pro-UK cDNA-Region (gepunktete Region) werden die folgenden Abkürzungen verwendet: D für die Wachstumsfaktor-Domäne, K für den Kringel, und P für die Protease-Domäne.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Der neue, erfindungsgemäße Plasminogen-Aktivator ist ein humaner Plasminogen-Aktivator des Prourokinase- Typs, der sich daraus ergibt, daß man den 155. Aminosäurerest, Prolin, [ausgehend vom N-Terminus, Serin, der reifen huinanen Prourokinase] der reifen humanen Prourokinase durch einen anderen Aminosäurerest als Prolin substituiert. Diese Aminosäure-Substitution führt zu einer Erhöhung der Plasminogen-Aktivator-Aktivität und zum Erwerb einer Resistenz gegenüber Thrombin-ähnlichen Proteasen. Während eine Substitution des 155. Aminosäurerestes, Prolin, durch einen Threoninrest bevorzugt ist, kann irgendein Aminosäurerest, der ausgewählt ist unter Asparagin, Asparaginsäure, Alanin, Arginin, Isoleucin, Glycin, Glutamin, Glutaminsäure, Threonin, Serin, Cystein, Tyrosin, Tryptophan, Valin, Histidin, Phenylalanin, Methionin, Lysin und Leucin als Substituent verwendet werden, vorausgesetzt, daß dieser Rest eine Resistenz gegenüber Thrombin-ähnlichen Proteasen bietet.
Es ist weiterhin möglich, die Resistenz gegenüber diesen Proteasen zu erhöhen, indem man den 153. Aminosäurerest (Leucin) durch irgendeinen anderen Aminosäurerest, gleichzeitig mit der Aminosäuresubstitution in Position 155, ersetzt. In diesem Fall wird die Plasminogen-Aktivator-Aktivität ebenfalls nicht verringert.
Ein neuer Plasminogen-Aktivator, der sich aus der Substitution des 153. Aminosäurerestes, Leucin, durch einen Asparaginrest und des 155. Aminosäurerestes, Prolin, durch einen Threoninrest ergibt, besitzt eine neu geschaffene N-Glycosylierungsstelle, wodurch das Protein stabilisiert werden kann. Es wird angenommen, daß eine N-Glycosylierung am 153. Aminosäurerest, Asparagin, auftreten kann, wenn dieser Plasminogen-Aktivator in Animalzellen exprimiert wird.
Im folgenden wird der neue, erfindungsmäße Plasminogen-Aktivator kurz als "pro-UK-Derivat" bezeichnet.
Das erfindungsgemäße, rekombinante Plasmid wird durch Insertion eines DNA-Fragmentes, das für das oben erwähnte pro-UK-Derivat kodiert, in ein geeignetes Plasmid, das zur DNA-Expression in Wirtszellen in der Lage ist, hergestellt.
Das DNA-Fragment, das für das erfindungsgemäße pro-UK-Derivat kodiert, kann durch Einführung einer Basen- Substitution in eine humane UK-DNA hergestellt werden, was eine Aminosäuresubstitution bewirkt. Als humane UK-DNA werden eine cDNA, die durch reverse Transkription einer Boten- RNA, die für humane UK kodiert, erhalten wurde, und eine humane UK-DNA, die aus chromosomaler DNA erhalten wurde, verwendet.
Die humane UK-cDNA kann irgendeine cDNA sein, die für humane UK kodiert. Insbesondere kann die humane UK- cDNA, die in dem Plasmid pUK1 oder pUK11 enthalten ist, verwendet werden. pUK1 und pUK11 sind Plasmide, die von den Erfindern hergestellt worden sind, und die Verfahren für ihre Herstellung sind in den Referenz-Beispielen 1, 2 und 3 beschrieben.
Die humane UK-cDNA in pUK1 kodiert für eine pro- UK-Modifikation, der ein Teil der N-terminalen Region von pro-UK fehlt, während diejenige in pUK11 für eine pro-UK- Modifikation kodiert, der ein Teil der C-terminalen Region von pro-UK fehlt. Die Basensequenzen der jeweiligen cDNAs stimmen jedoch teilweise mit der in Tabelle 4 dargestellten Basensequenz überein.
Ein Escherichia coli-Stamm, enthaltend pUK1, und ein Escherichia coli-Stamm, enthaltend pUK11, sind am 3. September 1987 beim Fermentation Research Institut, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukubashi, Ibaraki 305, Japan, unter den Bezeichnungen (und Hinterlegungsnummern) Escherichia coli EUK11 (FERM BP-1463) bzw. Escherichia coli EUK11 (FERM BP-1464) hinterlegt worden.
Das Plasmid, in das die für ein pro-UK-Derivat kodierende DNA zu insertieren ist, kann irgendein Plasmid sein, das die Expression dieser DNA in mikrobiellen oder Animalzellen ermöglicht. Escherichia coli wird vorzugsweise als mikrobielle Zelle verwendet. Um eine Expression eines pro-UK-Derivates in Escherichia coli zu bewirken, kann ein Plasmid verwendet werden, das die Insertion einer Fremd-DNA dort an einer Stelle stromabwärts eines geeigneten Promotors, beispielsweise des trp oder des lac-Promotors ermöglicht, und worin der Abstand zwischen der Shine- Dalgarno-Sequenz (im folgenden als "SD-Sequenz" bezeichnet), und dem Initiations-Codon (ATG) geeignet ist, und beispielsweise 6 - 18 Basen lang ist. Insbesondere sind pKYP10 (U.S.-Patent Nr. 4 686 191) und pTrS33 (Referenz- Beispiel 4), die beide von den Erfindern konstruiert worden sind, bevorzugte Beispiele für ein solches Plasmid.
Das Plasmid, das zur Bewirkung einer Expression der DNA, die für ein pro-UK-Derivat kodiert, in Animalzellen verwendet wird, kann irgendein Plasmid sein, das die Expression dieser DNA in Animalzellen ermöglicht. Bevorzugt ist ein Plasmid, das die Insertion einer Fremd-DNA an einer Stelle ermöglicht, die stromabwärts eines geeigneten Promotors liegt, beispielsweise des frühen SV40-Promotors oder des späten SV40-Promotors, und das ein Poly(A)-Signal, ein Splice-Signal usw. enthält.
Bevorzugte Plasmide sind pAGE103 [Mizukami et al., J. Biochem., 101, 1307-1310 (1987)] und pSE1PA1SE1dhfrl-9A (im folgenden kurz als "pSPAS1-9A" bezeichnet) (Referenz-Beispiel 14), die beide von den Erfindern konstruiert worden sind.
Ein Escherichia coli-Stamm, enthaltend pAGE103, ist am 23.März 1987 beim Fermentation Research Institute unter der Bezeichnung (und Hinterlegungsnummer) Escherichia coli EAGE103 (FERM BP-1312) hinterlegt worden. Als Plasmid, das das Dihydrofolat-Reduktase (im folgenden als "dhfr" bezeichnet) -Gen als selektiver Marker besitzt, kann u.a. pSV2-dhfr [S. Subramani et al, Mol. Cell. Biol., 1, 854 (1981)] genannt werden.
Eine Rekombination zwischen der DNA, die für ein pro-UK-Derivat kodiert, und einer Vektor-DNA kann unter Verwendung bekannter Verfahren, die im allgemeinen bei der rekombinanten DNA-Technologie verwendet werden, durchgeführt werden, nämlich durch den Verdau beider DNAs mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen und nachfolgender Ligation unter Verwendung von T4 DNA-Ligase. Vor der Ligation können die Enden der DNA-Fragmente, die durch den Verdau mit dem Restriktionsenzym oder den Restriktionsenzymen erhalten wurden, unter Verwendung des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase aufgefüllt werden, oder sie können unter Verwendung der T4 DNA-Polymerase aufgefüllt oder zum Schneiden prozessiert werden. Ebenfalls können DNA-Linker verwendet werden.
Wir beschreiben nun, nur als Beispiele und zu Illustrationszwecken, die Konstruktion von rekombinanten Plasmiden, wobei pUK1 als das pro-UK cDNA-enthaltende Plasmid verwendet wird, und wobei die entsprechenden DNAs, die für verschiedene pro-UK-Derivate kodieren, eingebaut werden, falls notwendig, über die Zwischenstufe eines oder mehrerer chemisch synthetisierter DNA-Fragmente, und die Konstruktion von rekombinaten Plasmiden, indem die entsprechenden DNAs, die für verschiedene pro-UK-Derivate kodieren, in den Vektor pSPAS1-9A (Referenz-Beispiel 14) zur Expression in Animalzellen eingebaut werden.
In dem folgenden ersten Beispiel wird das rekombinante Plasmid pUKT6, das für ein pro-UK-Derivat (UK-T6) kodiert, konstruiert.
Wie in Figur 2 dargestellt ist, wird phPA2 (Referenz-Beispiel 10), das aus pUK1 konstruiert wurde, mit EcoRI und HindIII gespalten, und ein DNA-Fragment von etwa 3,4 kb wird gereinigt. Getrennt davon wird pUKS1 (Referenz- Beispiel 11) mit HindIII und CfrI gespalten, und ein DNA- Fragment von etwa 0,75 kb wird gereinigt. Die beiden so erhaltenen DNA-Fragmente werden zusammen mit den zwei 5'-phosphorylierten synthetischen DNAs, die in Figur 2 dargestellt sind, in Gegenwart von T4 DNA-Ligase zusammen ligiert, was pUKT6 ergibt, das für ein pro-UK-Derivat (UK- T6) kodiert, das sich von pro-UK darin unterscheidet, daß der 155. Aminosäurerest Pro (ab dem N-Terminus) von pro-UK durch Thr ersetzt worden ist.
In dem nächsten folgenden Beispiel werden das rekombinante Plasmid pUKT4, das für ein pro-UK-Derivat (UK-T4) kodiert, und das rekombinante Plasmid pUKS3, das für ein weiteres pro-UK-Derivat (UK-S3) kodiert, konstruiert.
Wie in Figur 3 dargestellt ist, wird phPA2 (Referenz-Beispiel 10) mit EcoRI und HindIII gespalten, und ein DNA-Fragment von etwa 3,4 kb wird gereinigt. Getrennt davon wird pUKS1 (Referenz-Beispiel 11) mit HindIII und CfrI gespalten, und ein DNA-Fragment von etwa 0.75 kb wird gereinigt. Die zwei so erhaltenen DNA-Fragmente werden zusammen mit den zwei 5'-phosphorylierten synthetischen DNAs, die in Figur 3 dargestellt sind, in Gegenwart von T4 DNA- Ligase zusammen ligiert, was pUKT4 ergibt, das für ein pro- UK-Derivat (UK-T4) kodiert, das sich von pro-UK darin unterscheidet, daß der 153. Aminosäurerest Leu (ab dem N-Terminus) und der 155. Aminosäurerest Pro der pro-UK durch Ser bzw. Thr ersetzt worden sind. pUKS3, das für ein pro-UK-Derivat (UK-S3) kodiert, das sich von pro-UK darin unterscheidet, daß der 153. Aminosäurerest Leu (ab dem N-Terminus) und der 155. Aminosäurerest Pro von pro-UK durch Asn bzw. Thr ersetzt worden sind, wird auch erhalten.
Plasmid DNAs, die zur Expression der entsprechenden pro-UK-Derivate (UK-T6, UK-T4, UK-S3 und UK-T) und von natürlicher pro-UK in Animalzellen befähigt sind, können beispielsweise auf die folgende Weise hergestellt werden.
Wie in Figur 4 dargestellt ist, wird pSPAS1-9A (Referenz-Beispiel 14) mit XhoI und KpnI gespalten, und ein DNA-Fragment von etwa 8,6 kb wird gereinigt. Getrennt davon wird pSE1UKpro1-1A (im folgenden kurz als pSEUK1-1A bezeichnet) (Referenz-Beispiel 13) mit XhoI und BglII gespalten, und ein DNA-Fragment von etwa 0,75 kb wird gereinigt. Weiterhin wird getrennt davon pUKT6 mit BglII und KpnI gespalten, und ein DNA-Fragment von etwa 1,15 kb wird gereinigt. Die drei so erhaltenen DNA-Fragmente werden unter Verwendung von T4 DNA-Ligase zusammen ligiert, was das Plasmid pSE1UKT6SEd1-3 (im folgenden kurz als pSEUKT6 bezeichnet) ergibt, das zur Expression eines pro-UK-Derivates (UK-T6) befähigt ist.
Wie in Figur 5 dargestellt ist, wird danach pSPAS1-9A (Referenz-Beispiel 14) mit XhoI und KpnI gespalten, und ein DNA-Fragement von etwa 8,6 kb wird gereinigt. Getrennt davon wird psEUK1-1A (Referenz-Beispiel 13) mit XhoI und BglII gespalten, und ein DNA-Fragment von etwa 0,75 kb wird gereinigt. Weiterhin wird getrennt davon pUKT4 mit BglII und KpnI gespalten, und ein DNA-Fragment von etwa 1,15 kb wird gereinigt. Die drei so erhaltenen DNA- Fragmente werden unter Verwendung von T4 DNA-Ligase zusammen ligiert, was das Plasmid pSE1UKT4SEd1-3 (im folgenden kurz als pSEUKT4 bezeichnet) ergibt, das zur Expression eines pro-UK-Derivates (UK-T4) befähigt ist.
Wie in Figur 6 dargestellt ist, wird danach pSPAS1-9A (Referenz-Beispiel 14) mit XhoI und KpnI gespalten, und ein DNA-Fragment von etwa 8,6 kb wird gereinigt. Getrennt davon wird pSEUK1-1A (Referenz-Beispiel 13) mit XhoI und BglII gespalten, und ein DNA-Fragment von etwa 0,75 kb wird gereinigt. Weiterhin wird getrennt davon pUKS3 mit BglII und KpnI gespalten, und ein DNA-Fragment von etwa 1,15 kb wird gereinigt. Die drei so erhaltenen DNA-Fragmente werden in Gegenwart von T4 DNA-Ligase zusammen ligiert, was das Plasmid pSE1UK3SEd1-3 (im folgenden kurz als pSEUKS3 bezeichnet) ergibt, das zur Expression eines pro-UK-Derivates (UK-S3) befähigt ist.
Die DNA-Sequenzen der drei pro-UK-Derivate UK-T6, UK-T3 und UK-S3 und die diesen entsprechenden Aminosäuresequenzen sind in den Tabellen 1, 2, bzw. 3 dargestellt. Die Aminosäuresequenz von natürlich vorkommender pro-UK und die entsprechende DNA-Sequenz sind in der Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 1 Tabelle 2 Tabelle 3 Tabelle 4-1 Signal Peptid Wachstumfaktor Domäne Kringel Domäne Protease-Domäne Tabelle 4-2
Die Reaktionsbedingungen, die im allgemeinen bei den oben genannten rekombinanten Verfahren angewendet werden, sind im folgenden zusammengefaßt.
Der Verdau von DNA mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen wird im allgemeinen unter Verwendung von 0,1 bis 100 Einheiten (vorzugsweise 1 bis 3 Einheiten pro Mikrogramm DNA) des jeweiligen Restriktionsenzyms bei 20 bis 70ºC (die optimale Temperatur kann in Abhängigkeit von dem oder den Restriktionsenzymen variieren) 15 Minuten bis 24 Stunden in einem Reaktionsgemisch durchgeführt, das 0,1 bis 20 Mikrogramm DNA, 2 bis 200 mM (vorzugsweise 10 bis 40 mM) Tris-HCl (pH 6,0 bis 9,5, vorzugsweise pH 7,0 bis 8,0), 0 bis 200 mM NaCl und 2 bis 20 mM (vorzugsweise 5 bis 10 mM) MgCl&sub2; enthält. Die Reaktion wird im allgemeinen durch 5- bis 30-minütiges Erhitzen auf 55 bis 75ºC beendet. Die Reaktion kann auch beendet werden, indem man das oder die Restriktionsenzyme unter Verwendung eines geeigneten Reagens, wie Phenol oder Diethylpyrocarbonat, inaktiviert.
Das DNA-Fragment, das sich aus dem Restriktionsenzym-Verdau ergibt, kann durch Elektrophorese auf einem Agarosgel mit niedriger Gelierungstemperatur (im folgenden als "LGT-Methode" bezeichnet) [L. Wieslander, Analytical Biochemistry, 98, 305 (1979)] oder durch Einfrieren und Auftauen im Agarosegel (im folgenden als "AFT- Methode" bezeichnet) gereinigt werden. Diese AFT-Methode umfaßt das Vermischen eines Agarosegelstückes (0,7 - 1,5%), das ein DNA-Fragment enthält, mit dem gleichen Volumen TE- Puffer [10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA] und zwei Volumina Phenol (gesättigt mit TE-Puffer), die Wiederholung von zwei Einfrier- (-70ºC) und Auftau- (65ºC) Zyklen, Zentrifugation, die Abtrennung der erhaltenen oberen wässrigen Schicht und die Gewinnung des DNA-Fragmentes durch Präzipitation mit Ethanol. Alternativ kann das DNA-Fragment auch elektrophoretisch eluiert und aus einem Agarose- oder Polyacrylamidgel, beispielsweise unter Verwendung eines Maxfield-Modell AE-3241 DNA-Fragment-Kollektors (Atto), gereinigt werden. (Im folgenden wird die zuletzt genannte Methode als "elektrophoretische Elutionsmethode" bezeichnet).
Die Ligation von DNA-Fragmenten wird im allgemeinen unter Verwendung von 1 bis 1000 Einheiten T4 DNA-Ligase bei 1 bis 37ºC (vorzugsweise bei 3 bis 20ºC) 15 Minuten bis 72 Stunden in einem Reaktionsgemisch durchgeführt, das 2 bis 200 mM (vorzugsweise 10 bis 40 mM) Tris-HCl (pH 6,1 bis 9,5, vorzugsweise pH 7,0 bis 8,0), 2 bis 20 mM (vorzugsweise 5 bis 10 mM) MgCl&sub2;, 0,1 bis 10 mM (vorzugsweise 0,5 bis 2,0 mM) ATP und 1 bis 50 mM (vorzugsweise 5 bis 10 mM) Dithiothreitol (im folgenden als "DTT" bezeichnet) enthält. Die rekombinante Plasmid-DNA, die man durch die Ligationsreaktion enthält, wird in Escherichia coli eingebracht, falls notwendig, unter Verwendung der Transformations-Methode von Cohen et al.[S.N. Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)] oder der Transformationsmethode von Hanahan [J. Mol. Biol., 166, 557 (1983)].
Die rekombinante RF-DNA des M13-Phagen, die durch die Ligationsreaktion hergestellt wird, wird beispielsweise in den Escherichia coli-Stamm JM105 [J. Messing et al., Gene, 33, 103 (1985)] eingebracht, falls notwendig, unter Verwendung des bekannten Transfektionsverfahrens [Y. Kuchino et al., Tampakushitsu, Kakusan, Koso (Protein, Nucleic Acid and Enzyme), 29, 294 (1984)].
Die rekombinante Plasmid-DNA oder die rekombinante RF-DNA des M13-Phagen kann aus dem Escherichia coli-Stamm, der diese enthält, beispielsweise durch das Verfahren von Birnboim et al. [H.C. Birnboim et al., Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979)] isoliert werden.
Die Isolierung der einzelsträngigen DNA aus dem rekombinanten M13-Phagen kann mit Hilfe des bekannten Verfahrens [Y. Kuchino et al., Tampakushitsu, Kakusan, Koso, 29, 294 (1984)] durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäß zu verwendenden Desoxyoligonucleotide können mittels Festphasen-Synthese durch das Phosphoamidit-Verfahren [S.L. Beaucage et al., Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981) und L.J. BcBrie et al., ibid. 24, 245 (1983)] unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes von Applied Biosystems, Modell 380A (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA 94404) synthetisiert werden. Um ein so synthetisiertes Desoxyoligonucleotid mit einem oder mehreren anderen DNA-Fragmenten zu verbinden, werden etwa 20 Picomol des Desoxyoligonucleotides in 20 ul T4 Kinase-Puffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0, 5 mM ATP] unter Zugabe von 5 Einheiten T4 DNA-Kinase 5'-phosphoryliert. Zur Verwendung als Hybridisierungs-Sonde wird das Desoxyoligonucleotid an seinem 5'-Ende unter Verwendung von 20 bis 50 uCi 5'- [γ-³²P] ATP (3000 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL) anstelle von 0,5 mM ATP in dem oben erwähnten T4 Kinase- Puffer markiert.
Zur Strukturanalyse von Plasmid-DNAs wird die jeweilige Plasmid-DNA einem Verdau mit ein bis zehn Restriktionsenzymen und nachfolgender Agarose-Gel- oder Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese zur Überprüfung der Spaltungsstellen unterzogen. Falls notwendig, kann die Basensequenz einer DNA weiterhin mittels des Didesoxy-Sequenzierungsverfahrens unter Verwendung des M13-Phagens bestimmt werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide des pro-UK- Derivates können unter Verwendung von Escherichia coli- oder Animalzellen als Wirt beispielsweise folgendermaßen hergestellt werden.
Die Polypeptide des pro-UK-Derivates werden unter Verwendung von Animalzellen als Wirt wie folgt hergestellt. Der zur Bewirkung der Expression der pro-UK-Derivat-Polypeptide zu verwendende Wirt kann irgend ein Stamm oder eine Linie von Animalzellen sein, vorausgesetzt, daß sich damit die Expression der Polypeptide durchführen läßt. Zu bevorzugten spezifischen Animalzellen zählen u.a. dhfr-defiziente CHO-Zellen [G. Urlaub & L.A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 4216 (1980)].
Im folgenden wird ein Beispiel für die Herstellung eines Polypeptides eines pro-UK-Derivates beschrieben, wobei pSEUKT6 als Expressions-Plasmid des pro-UK-Derivates UK-T6 und dhfr-defiziente CHO-Zellen als Wirt verwendet werden.
Das Plasmid pSEUKT6 wird in dhfr-defiziente CHO- Zellen, beispielsweise unter Verwendung des Calciumphosphat-Verfahrens [Graham & Van der Eb, Virology, 52, 546 (1978)], eingebracht. Transformanten-Stämme, die pSEUKT6 enthalten, können beispielsweise unter Verwendung von MEM- ALPHA-Medium (Ribonucleinsäure-frei und Desoxyribonucleinsäure-frei; Gibco-Oriental), das mit G418 und dialysiertem, fötalen Kälberserum ergänzt worden ist, ausgewählt werden. Weiterhin kann ein Transformanten-Stamm, bei dem das Gen für das physiologisch aktive Polypeptid amplifiziert ist, aus den Transformanten ausgewählt werden, die resistent gegenüber Methotrexat sind. Der so erhaltene Transformanten-Stamm wird in einem Medium kultiviert, wodurch das Polypeptid des pro-UK-Derivates in der Kultur hergestellt werden kann.
Zu geeigneten Medien zählen HAM F10-Medium, HAM F12-Medium (beide von Flow Laboratories erhältlich), Dulbecco's MEM-Medium, RPMI-1640-Medium (die zwei letztgenannten sind von Nissui Pharmaceutical erhältlich), MEM ALPHA-Medium, und gemischte Medien, die von diesen abgeleitet sind, jeweils ergänzt mit irgendeinem von verschiedenen Seren (Z.B. fötales Kälberserum). Falls notwendig, können 0,5 bis 5 mM Glutamin, Antibiotika [Penicillin (25 U/ml), Streptomycin (25 ug/ml), G418 (0,3 mg/ml), etc.], Natriumbicarbonat (0,01%) usw. jeweils in einer geeigneten Menge dem Medium zugegeben werden.
Zur Kultivierung können verschiedene Arten von Kulturflaschen, Schalen, Rollerflaschen, Wirbelkolben ("spinner flasks"), Schüttel-Fermenter und dergleichen verwendet werden. Die Kultivierung wird im allgeineinen bei einer Impfzelldichte von 5x10&sup4; bis 1x10&sup6;-Zellen/ml 2 bis 10 Tage bei 30 bis 40ºC durchgeführt, wobei die erfindungsgemäße Substanz hauptsächlich extrazellulär in einer Menge, die von der Zelldichte abhängt, sekretiert wird.
Die Zellen werden aus der Kultur durch Zentrifugation entfernt, und das pro-UK-Derivat-Polypeptid wird aus dem Überstand nach der Zentrifugation isoliert und gereinigt. Die Plasminogen-aktivierende Aktivität des erhaltenen pro-UK-Polypeptid-Derivates kann mit Hilfe des Fibrinplatten-Assayverfahrens untersucht werden [Granelli-Piperno & Reich, J. Exp. Med., 148, 223 (1978)].
Während die Herstellung des UK-T6, einem der neuen pro-UK-Derivate, oben genau beschrieben worden ist, können weitere pro-UK-Derivate im wesentlichen auf die gleiche Weise nach den hierin dargelegten Beschreibungen und Anweisungen hergestellt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern weiterhin die vorliegende Erfindung, wobei jedoch nicht beabsichtigt ist, den Schutzumfang der Erfindung dadurch einzuschränken.

BEISPIEL 1

Herstellung des rekombinanten Plasmides pUKT6, kodierend für das pro-UK-Derivat UK-T6 (siehe Figur 2):

Etwa 2ug der im Referenz-Beispiel 11 erhaltenen DNA des pUKS1-Plasmids wurden in 30 ul Y-100-Puffer [eine Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 7 mM MgCl&sub2;, 6 mM 2-Mercaptoethanol] gelöst. 16 Einheiten CfrI (Takara Shuzo; wenn nicht anders angegeben, wurden die im folgenden erwähnten Restriktionsenzyme von Takara Shuzo erhalten) und 10 Einheiten HindIII wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA- Fragment von etwa 0,75 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 10 erhaltenen DNA des phPA2-Plasmid in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 10 Einheiten HindIII und 1 Einheit EcoRI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 3,4 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Die folgenden zwei synthetischen DNAs (jeweils mit 43 Basen) wurden unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes, Applied Biosystems, Modell 380A, synthetisiert:
Die so erhaltenen synthetischen DNAs (jeweils 25 Picomol) wurden sodann am 5'-Ende phosphoryliert, indem man sie in 10 ul einer Lösung (im folgenden als "T4-Kinase- Puffer" bezeichnet), enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA und 0,5 mM ATP, unter Zugabe von 5 Einheiten T4 DNA-Kinase (Takara Shuzo), 30 Minuten bei 37ºC behandelte.
Das DNA-Fragment, das von pUKS1 stammte (etwa 7,5 kb, etwa 0,1 ug), das DNA-Fragment, das von phPA2 stammte (etwa 3,4 kb, etwa 0,1 ug) und die zwei 5'- phosphorylierten, synthetischen DNAs (jeweils 1 Picomol), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul eines Puffers (im folgenden als "T4 Ligase-Puffer" bezeichnet) gelöst, der 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP enthielt. 300 Einheiten T4 Ligase (Takara Shuzo) wurden zugegeben, und die Ligations-Reaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MN294 [F- hsdR&supmin; hsdM&spplus; endoI&supmin; thi] [ATCC31446; der gleiche Stamm, der als Escherichia coli 294 in dem Bericht von K. Backman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 4174 (1976) bezeichnet wurde], zu transformieren, was Ampicillin (im folgenden "Ap")-resistente Transformanten ergab. Die Plasmid-DNA wurde aus diesen Transformanten isoliert und einer Strukturanalyse durch Verdau mit Restriktionsenzymen und einer DNA-Sequenzbestimmung durch das M13-Didesoxy- Sequenzierungsverfahren unterzogen. Eine Plasmid-DNA, von der festgestellt worden war, daß sie die gewünschte Struktur besaß, wurde als pUKT6 (siehe Figur 2) bezeichnet.

BEISPIEL 2

Herstellung der rekombinanten Plasmide pUKT4 und pUKS3, die für die pro-UK-Derivate UK-T4 bzw. UK-S3 kodieren (siehe Figur 3):

Etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 11 erhaltenen DNA des pUKS1-Plasmides wurden in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 16 Einheiten CfrI und 10 Einheiten HindIII wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 0,75 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 10 erhaltenen DNA des phPA2- Plasmides in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 10 Einheiten Hindlll und 1 Einheit EcoRI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10- minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 3,4 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Die folgenden zwei synthetischen DNAs (jeweils mit 43 Basen) wurden synthetisiert und 5'-phosphoryliert, wie in Beispiel 1 beschrieben
Das DNA-Fragment, das von pUKS1 stammte (etwa 0,75 kb, etwa 0,1 ug), das DNA-Fragment, das von phPA2 stammte (etwa 3,4 kb, etwa 0,1 ug) und die zwei 5'-phosphorylierten synthetischen DNAs (jeweils 1 Picomol), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 300 Einheiten T4-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap-resistente Transformanten ergab. Plasmid-DNA wurde aus diesen Transformanten isoliert und einer Strukturanalyse durch Verdau mit Restriktionsenzymen und einer DNA-Sequenzbestimmung durch das M13-Didesoxy-Sequenzierungsverfahren unterzogen. Eine Plasmid-DNA, die die gewünschte Struktur besaß und für eine Aminosäuresequenz kodierte, die derart modifiziert war, daß die 153. (ab dem N-Terminus) Aminosäure Leu und die 155. Aminosäure Pro durch Ser bzw. Thr ersetzt worden sind, wurde als pUKT4 bezeichnet, und eine andere Plasmid-DNA, die ebenfalls eine gewünschte Struktur besaß und für eine Aminosäuresequenz kodierte, die derart modifiziert war, daß die 153. (ab dem N-Terminus) Aminosäure Leu und die 155. Aminosäure Pro durch Asn bzw. Thr ersetzt worden sind, wurde als pUKS3 bezeichnet (siehe Figur 3).

BEISPIEL 3

Herstellung der DNA des UK-T6-Expressionsplasmids pSEUKT6 (siehe Figur 4):

Etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 14 erhaltenen DNA des pSPAS1-9A-Plasmides wurden in 30 ul Y-0-Puffer [eine Lösung, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2; und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt] gelöst. 10 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 10 Einheiten XhoI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für eine weitere Stunde bei 37ºC durchgeführt. Nach 10- minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 8,6 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden 3 ug der DNA des pSEUK1- 1A-Plasmides in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 12 Einheiten BglII und 12 Einheiten XhoI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA- Fragment von etwa 0,75 kb unter Verwendung des AFT- Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden getrennt davon etwa 3 ug DNA des pUKT6-Plasmides, das wie oben beschrieben erhalten wurde, in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 15 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 12 Einheiten BglII zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für eine weitere Stunde bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,15 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Das DNA-Fragment, das von pSPAS1-9A stammte (etwa 8,6 kb, etwa 0,1 ug), das DNA-Fragment, das von pSEUK1-1A stammte (etwa 0,75 kb, etwa 0,02 ug) und das DNA-Fragment, das von pUKT6 stammte (etwa 1,15 kb, etwa 0,02 ug), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 100 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap- resistente Transformanten ergab. Die aus einem dieser Transformanten isolierte DNA des Plasmides pSEUKT6 wurde einer Strukturanalyse durch Verdau mit Restriktionsenzymen unterzogen, wobei festgestellt wurde, daß sie die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 4).

BEISPIEL 4

Herstellung der DNA des UK-T4-Expressionsplasmids pSEUKT4 (siehe Figur 5):

Etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 14 erhaltenen DNA des pSPAS1-9A-Plasmides wurden in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 10 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 10 Einheiten XhoI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für eine weitere Stunde bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 8,6 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden 3 ug der DNA des pSEUK1-1A-Plasmides in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 12 Einheiten BglII und 12 Einheiten XhoI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 0,75 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden getrennt davon etwa 3 ug der wie oben beschrieben erhaltenen DNA des pUKT4- Plasmides in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 15 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 12 Einheiten BglII zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für eine weitere Stunde bei 37ºC durchgeführt. Nach 10- minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,15 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Das DNA-Fragment, das von pSPAS1-9A stammte (etwa 8,6 kb, etwa 0,1 ug), das DNA-Fragment, das von pSEUK1-1A stammte (etwa 0,75 kb, etwa 0,02 ug) und das DNA-Fragment, das von pUKT4 stammte (etwa 1,15 kb, etwa 0,02 ug), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 100 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap- resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse durch Verdau mit Restriktionsenzymen wurde festgestellt, daß die DNA des Plasmides pSEUKT4, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 5).

BEISPIEL 5

Herstellung des UK-S3-Expressionsplasmids pSEUKS3 (siehe Figur 6):

Etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 14 erhaltenen DNA des pSPAS1-9A-Plasmides wurden in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 10 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2M NaCl und 10 Einheiten XhoI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für eine weitere Stunde bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 8,6 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden 3 ug der DNA des Plasmides pSEUK1-1A in 30 ul Y-100-puffer gelöst. 12 Einheiten BglII und 12 Einheiten XhoI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 0,75 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden getrennt davon 3 ug der DNA des pUKS3-Plasmides, das wie oben beschrieben erhalten worden war, in 30 ul Y-0-puffer gelöst. 15 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 12 Einheiten BglII zugegeben, und eine Verdaureaktion wurde für eine weitere Stunde bei 37ºC durchgeführt. Nach 10- minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,15 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Das DNA-Fragment, das von pSPAS1-9A stammte (etwa 8,6 kb, etwa 0,1 ug), das DNA-Fragment, das von pSEUK1-1A stammte (etwa 0,75 kb, etwa 0,02 ug), und das DNA-Fragment, das von pUKS3 stammte (etwa 1,15 kb, etwa 0,02 ug), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 100 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Apresistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse durch Verdau mit Restriktionsenzymen wurde festgestellt, daß die DNA des Plasmides pSEUKS3, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 6).

BEISPIEL 6

Herstellung von verschiedenen pro-UK-Derivaten und von natürlicher pro-UK in Animalzellen

(1) Herstellung des UK-T6-Polypeptides in CHO-Zellen, die pSEUKT6 enthielten:

pSEUKT6 (erhalten in Beispiel 3) wurde in dhfr- defiziente CHO-Zellen im wesentlichen nach dem Calciumphosphat-Verfahren eingeführt. So wurden 5 ml MEM α (nicht- selektives Medium), ergänzt mit 1/10 Volumen FKS (fötales Kälberserum) und 1/50 Volumen 7,5% NaHCO&sub3; (Flow Laboratories) mit CHO-Zellen bis zu einer Zellkonzentration von 1x10&sup5; Zellen/ml beimpft [LUX-Platten mit 6 cm Durchmesser wurden zur Kultivierung verwendet (LUX-Platten wurden ebenfalls in den nachfolgenden Beispielen verwendet)]. Die Zellen wurden in einem CO&sub2;-Inkubator einen Tag bei 37ºC kultiviert. Getrennt davon wurden 10 ug pSEUKT6-DNA in 450 ul 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) gelöst. 500 ul einer Lösung, die 280 mM NaCl, 1,5 mM Na&sub2;HPO&sub4; und 50 mM HEPES (N-2- Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (pH 7,1) enthielt, wurde zu der Lösung gegeben. Nach dem Mischen wurden weiterhin 50 ul 2,5 M CaCl&sub2; zugegeben. Nach dem Mischen ließ man das erhaltene Gemisch 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Die gesamte Menge dieser DNA-Lösung wurde zu einer dhfr-defizienten CHO-Zellkultur gegeben, die hergestellt worden war, indem man das Medium verwarf, 10 ml frisches MEM α (nicht-selektives Medium) zugab und eine Stunde kultivierte. Das resultierende Gemisch wurde 8 Stunden inkubiert. Danach wurden die Zellen mit PBS (phosphat-gepufferte Salzlösung; 8g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,15 g/l Na&sub2;HPO&sub4; (wasserfrei), 0,2 g/l KH&sub2;PO&sub4;) gewaschen und nach Zugabe von 5 ml MEM α (nicht-selektives Medium) 16 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen. 3 ml einer Lösung, die 0,05% Trypsin und 0,2% EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) enthielt, wurden zugegeben, die überschüssige Lösung entfernt und die Inkubation 5 Minuten bei 37ºC fortgesetzt (Trypsin-Behandlung). MEM α (selektives Medium), ergänzt mit 10% dialysiertem FKS (Gibco-Oriental), 1/50 Volumen 7,5% NaHCO&sub3;, 1/100 Volumen 100 x Nicht-Essentielle Aminosäuren-Lösung und 0,3 mg/ml G418 (Gibco-Oriental), wurde zu den Zellen gegeben, die darin gründlich suspendiert wurden. Die Inkubation wurde 5 Tage in einem CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC unter Verwendung einer Schale mit einem Durchmesser von 10 cm durchgeführt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und nach Zugabe von MEM α (selektives Medium) 5 Tage kultiviert. Es wurde dem gleichen, oben beschriebenem Verfahren gefolgt, und die Inkubation wurde für weitere 5 Tage fortgesetzt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, einer Trypsin-Behandlung unterzogen, in 10 ml MEM α (selektives Medium) suspendiert und in einer Schale mit einem Durchmesser von 6 cm 3 bis 7 Tage in einem CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC kultiviert. Kolonien, die auftraten, wurden einer Typsin-Behandlung unterzogen und in eine Schale mit einem Durchmesser von 10 cm bis zu einer Zellkonzentration von 5x10&sup4; Zellen/ml unter Verwendung von 10 ml MEM α (selektives Medium), das 50 mM MTX enthielt, überimpft. Ein Austausch des Mediums wurde dreimal in Abständen von 5 Tagen unter Verwendung des gleichen, oben erwähnten Mediums durchgeführt. MTX-resistente Kolonien, die auftraten, wurden jeweils isoliert. Jede Kolonie wurde in einer Schale mit einem Durchmesser von 6 cm bis zur Konfluenz kultiviert. Danach wurde das Medium durch 5 ml MEM α (selektives Medium), das 50 nM MTX enthielt, ersetzt, und nach einem Tag wurde der Kulturüberstand auf die Aktivität von UK-T6 mit dem Fibrinplatten-Assayverfahren untersucht [Granelli- Piperno & Reich, J.Exp. Med., 148, 233 (1978)]. Bei dem Klon Nr. 24 wurde die höchste Aktivität festgestellt, und die Produktion von UK-T6 belief sich auf 5 ug/10&sup6; Zellen/Tag. Dieser Klon wurde in 100 ml MEM α (selektives Medium), das 50 nM MTX enthielt, in einer Rollerflasche, Falcon Modell 3027, kultiviert. Nach Konfluenz wurde die Kultivierung 3 Tage in einem Medium fortgesetzt, das eine identische Zusammensetzung zu dem oben erwähnten besaß, mit der Ausnahme, daß es FKS-frei war und 10 KIU/ml Aprotinin (Boehringer-Mannheim) enthielt. Der so enthaltene Kulturüberstand (100 ml pro Ansatz) wurde in Beispiel 7 verwendet.

(2) Herstellung des UK-T4-Polypeptides in Animalzellen, die pSEUKT4 enthielten:

Unter Verwendung des in Beispiel 4 erhaltenen rekombinanten Plasmids pSEUKT4 und von dhfr-defizienten CHO- Zellen und nach dem gleichen, oben beschriebenen Verfahren, erhielt man UK-T4-produzierende Zellstämme. Es wurde festgestellt, daß unter diesen der Klon Nr. 8 die höchste Aktivität besaß, wobei die UK-T4-Produktion 3 ug/10&sup6; Zellen/Tag betrug. Dieser Klon wurde in 100 ml MEM α (selektives Medium), das 50 nM MTX enthielt, in einer Rollerflasche, Falcon Modell 3027, kultiviert. Nach Konfluenz wurde die Kultivierung 3 Tage in einem Medium fortgesetzt, das eine identische Zusammensetzung zu dem oben erwähnten besaß, mit der Ausnahme, daß es FKS-frei war und 10 KIU/ml Aprotinin (Boehringer-Mannheim) enthielt. Der so erhaltene Kulturüberstand (100 ml pro Ansatz) wurde in Beispiel 7 verwendet.

(3) Herstellung des UK-S3 Polypetides in Animalzellen, die pSEUKS3 enthielten:

Unter Verwendung des in Beispiel 5 erhaltenen rekombinanten Plasmides pSEUKS3 und von dhfr-defizienten CHO- Zellen und unter Anwendung des gleichen, oben beschriebenen Verfahrens erhielt man UK-S3-produzierende Zellstämme. Es wurde festgestellt, daß unter diesen der Klon Nr. 13 die höchste Aktivität besaß, wobei die UK-S3-Produktion 3 ug/10&sup6; Zellen/Tag betrug. Dieser Klon wurde in 100 ml MEM α (selektives Medium), das 50 nM MTX enthielt, in einer Rollerflasche, Falcon Modell 3027, kultiviert. Nach Konfluenz wurde die Kultivierung 3 Tage in einem Medium fortgesetzt, das eine identische Zusammensetzung zu dem oben erwähnten besaß, mit der Ausnahme, daß es FKS-frei war und 10 KIU/ml Aprotinin (Boehringer-Mannheim) enthielt. Der so erhaltene Kulturüberstand (100 ml pro Ansatz) wurde in Beispiel 7 verwendet.

(4) Herstellung des pro-UK-Polypeptides in Animalzellen, die pSE1UKT1-1d enthielten (im folgenden als "pSEUKT" bezeichnet):

Unter Verwendung des im Referenz-Beispiel 16 erhaltenen rekombinanten Plasmides pSEUKT und von dhfr-defizienten CHO-Zellen und unter Anwendung des gleichen, oben beschriebenen Verfahrens, erhielt man UK-T-produzierende Zellstämme. Es wurde festgestellt, daß unter diesen der Klon Nr. 21 die höchste Aktivität besaß, wobei die UK-T4- Produktion 3 ug/10&sup6; Zellen/Tag betrug. Dieser Klon wurde in 100 ml MEM α (selektives Medium), das 15 nM MTX enthielt, in einer Rollerflasche, Falcon Modell 3027, kultiviert. Nach Konfluenz wurde die Kultivierung 3 Tage in einem Medium fortgesetzt, das eine identische Zusammensetzung wie das oben erwähnte besaß, mit der Ausnahme, daß es FKS-frei war und 10 KIU ml Aprotinin (Boehringer-Mannheim) enthielt. Der so erhaltene Kulturüberstand (100 ml pro Ansatz) wurde in Beispiel 7 verwendet.

(5) Herstellung des pro-UK-Polypeptides in Animalzellen, die pSEUK1-1A enthielten:

Unter Verwendung des im Referenz-Beispiel 13 erhaltenen rekombinanten Plasmides pSEUK1-1A, von pSV2-dhfr und von dhfr-defizienten CHO-Zellen und unter Anwendung des gleichen, oben beschriebenen Verfahrens wurden pro-UK-produzierende Zellstämme erhalten. Es wurde festgestellt, daß unter diesen der Klon Nr. 5 die höchste Aktivität besaß, wobei die pro-UK-produktion 3 ug/10&sup6; Zellen/Tag betrug. Dieser Klon wurde in 100 ml MEM α (selektives Medium), das 50 nM MTX enthielt, in einer Rollerflasche, Falcon Modell 3027, kultiviert. Nach Konfluenz wurde die Kultivierung 3 Tage in einem Medium fortgeführt, das eine identische Zusammensetzung mit dem oben erwähnten besaß, mit der Ausnahme, daß es FKS-frei war und 10 KIU/ml Aprotinin (Boehringer-Mannheim) enthielt. Der so erhaltene Kulturüberstand (100 ml pro Ansatz) wurde in Beispiel 7 verwendet.

BEISPIEL 7

Reinigung von pro-UK des natürlichen Typs und von verschiedenen pro-UK-Derivaten aus Kulturüberständen von Animalzellen:

Die in Beispiel 6 erhaltenen Serum-freien Kulturüberstände (jeweils 200 ml), die natürliche pro-UK oder ein pro-UK-Derivat enthielt, wurden jeweils auf eine Säule mit einem monoklonalen anti-UK Antikörper appliziert (4 ml) [hergestellt durch Bindung eines monoklonalen anti-UK Antikörpers (hergestellt nach dem Verfahren von Milstein et al. [c. Milstein et al., Nature, 256, 495-497 (1975)] unter Verwendung von Urokinase mit niedrigem Molekulargewicht (Nippon Chemical Research) als Antigen) an CNBr -aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals)] äquilibriert mit 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7,5), der 0,01% Tween 80, 0,05% NaN&sub3; und 100 mM NaCl enthielt.
Danach wurden 3 Bettvolumina des gleichen Puffers, der zur Säulenäquilibrierung verwendet wurde, auf die Säule appliziert. Die Elution wurde sodann unter Verwendung von 16 ml Phosphat-Citrat-Puffer (pH 4,0), der 0,01% Tween 80, 0,05% NaN&sub3;, 100 mM NaCl und 200 mM Arginin enthielt, durchgeführt, und das Eluat wurde in 1 ml Portionen fraktioniert. Die aktiven Fraktionen des Eluats wurden sofort mit Phosphorsäure auf pH 7,5 eingestellt und danach gegen Phosphatpuffer (pH 7,5), der 0,01% Tween 80, 0,05 % NaN&sub3;, 100 mM NaCl und 200 mM Arginin (im folgenden als "UK- Puffer" bezeichnet) 24 Stunden bei 4ºC dialysiert. Das Dialysat wurde als abschließend gereinigte Probe bei den nachfolgenden Versuchen verwendet. Eine SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese zeigte, daß die abschließend gereinigte Probe ein einzelkettiges Produkt mit einer Reinheit von nicht weniger als 95% enthielt. Die SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese legte eine Kohlenhydrat-Ketten-Addition an das pro-UK-Derivat UKS3 nahe, das eine N-Glykosylierungsstelle besitzt, nämlich -Asn-X-Thr-. Eine Erhöhung des Molekulargewichtes wurde ebenfalls bestätigt.

BEISPIEL 8

Vergleich der spezifischen Aktivität zwischen pro-UK des natürlichen Typs und pro-UK-Derivaten:

Die abschließend gereinigten Proben, die pro-UK des natürlichen Typs bzw. pro-UK-Derivate, die in Beispiel 7 erhalten wurden, enthielten, wurden jeweils auf eine Reversed-phase HPLC-Säule (TSK-Gel ODS-120T, Tosoh) appliziert. Die Peakfläche wurde mit der Peakfläche von natürlicher pro-UK verglichen, deren Konzentration mit dem Lowry-Verfahren [Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, 265 (1951)] bestimmt worden war, um die Konzentration von jedem Protein zu bestimmen. Die Aktivität von jeder Probe wurde mit dem Fibrinplatten-Assayverfahren bestimmt.
Das Fibrinplatten-Assayverfahren wurde auf die folgende Weise durchgeführt.
Rinder-Thrombin (Sigma) (1000 U) wurde in 5 ml 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7,0) gelöst. Die Lösung wurde durch einen 0,45 um Membranfilter sterilfiltriert, was eine Thrombin-Lösung ergab. Getrennt davon wurde eine Fibrinogen-Lösung hergestellt, indem Rinder-Fibrinogen (Nakalai-Tesque) in 100 ml sterilisiertem 50 mM Phosphat- Puffer (pH 7,0) unter 30-minütigem Rühren gelöst wurde und danach das unlösliche Material unter Verwendung von sterilisierter Glaswolle entfernt wurde, was eine Fibrinogen-Lösung ergab. Weiterhin wurde eine 2%-ige Agarlösung hergestellt, indem man 2 g Agar (Sigma) zu 100 ml 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7,0) gab, dies 20 Minuten bei 1,5 Atmosphären und 120ºC sterilisierte und danach die Lösung bei 60ºC hielt.
In jede Schale wurden 0,25 ml der Thrombin-Lösung, 5 ml der Fibrinogen-Lösung und 5 ml der Agar-Lösung gegeben. Das Gemisch wurde gerührt, und danach ließ man es bis zur Erstarrung des Agars stehen. Somit wurde eine Fibrin-Schale erhalten.
Humane Urokinase (doppelkettige Form, aus Urin, Nippon Chemical Research) wurde im UK-Puffer gelöst, und die Konzentration wurde auf 10, 100, 1000 und 10000 IU/ml eingestellt. Diese Lösungen wurden als Standards verwendet. Jede Probe wurde mit UK-Puffer auf 0,5 ug/ml verdünnt.
Es wurden Löcher mit einem Durchmesser von 2 mm auf jeder Fibrinschale angebracht, wobei die Anzahl der Löcher der Anzahl der Standards und Proben entsprach. Die Löcher wurden mit 5 ul der jeweiligen Standards oder Proben, die wie oben beschrieben hergestellt worden waren, gefüllt. Nach einer 24-stündigen Inkubation bei 37ºC wurde der Durchmesser des jeweils entstandenen Hofes gemessen. Die Aktivität von jeder Probe wurde unter Verwendung einer Kalibrierungskurve (Aktivität: Hof-Durchmesser), die unter Verwendung der Standards hergestellt worden war, bestimmt.
Die Daten der spezifischen Aktivität von pro-UK des natürlichen Typs und der entsprechenden pro-UK-Derivate sind in der nachfolgenden Tabelle 5 dargestellt. Während die spezifischen Aktivitäten von UK-T6, UK-T4 und UK-S3 höher waren (1,2 bis 1,8-fach) als die von pro-UK des natürlichen Typs, betrug die spezifische Aktivität des pro-UK- Derivates UK-T (mit einer Aminosäuresubstitution an der Position P&sub1;' relativ zur Thrombin-Spaltungsstelle) nur 60% von derjenigen von natürlicher pro-UK. Diese Abnahme der spezifischen Aktivität war vermutlich auf diese Einführung einer Aminosäuresubstitution in der Nachbarschaft der Plasmin-Spaltungsstelle (nämlich an der Position P&sub2; relativ zur Plasmin-Spaltungsstelle) zurückzuführen, wodurch die Durchführung der Spaltung mit Plasmin erschwert wurde. Daher sind die pro-UK-Derivate (UK-T6, UK-T4 und UK-S3) mit Aminosäuresubstitutionen an der Position P&sub2; auch vom Gesichtspunkt der spezifischen Aktivität her vorteilhaft.

BEISPIEL 9

Vergleich der Thrombin-Empfindlichkeit zwischen natürlicher pro-UK und pro-UK-Derivaten.

Die abschließend gereinigten Proben, die pro-UK des natürlichen Typs bzw. pro-UK-Derivate, wie sie in Beispiel 7 erhalten worden waren, enthielten, wurden jeweils auf eine Reversed-Phase HPLC-Säule (TSK-Gel ODS-120, Tosoh) appliziert. Jede Probe wurde mit der Diffusat-Lösung (erhalten bei der Dialyse im Beispiel 7) bis auf 30 ug/ml auf der Grundlage der erhaltenen Peakfläche verdünnt. Zu 100 ul dieser Lösung wurden 20 ul 30 IU/ml oder 600 IU/ml humanes Thrombin zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC inkubiert.Das humane Thrombin wurde von Sigma erhalten. Das humane Thrombin wurde nach einer 1,5-stündigen 10 IU Thrombin/1000 IU Aprotinin-Behandlung bei 37ºC verwendet. 15, 30, 60, 120 und 240 Minuten nach der Zugabe von Thrombin wurde eine Probenentnahme in 24 ul-Portionen durchgeführt, woran sich die Zugabe von 4 ul 84 uM Thrombin-Inhibitor (THROMSTOP, American Diagnostica) zur Beendigung der Reaktion anschloß. Eine Probe wurde auch hergestellt, indem man den Thrombin-Inhibitor direkt nach Zugabe des Thrombins zugab. Diese Probe wurde als 0 Minuten-Probe verwendet. Weiterhin wurden in einer Kontrollgruppe Proben ohne Zugabe von Thrombin bei 37ºC inkubiert.
Ein Vergleich hinsichtlich der Empfindlichkeit gegenüber Thrombin wurde durchgeführt, indem man die verbleibenden Aktivitäten von pro-UK des natürlichen Typs und der pro-UK-Derivate in den Reaktionsgemischen, die wie oben beschrieben mittels des Fibrinplatten-Assayverfahrens erhalten worden waren, bestimmte (siehe Beispiel 8). Als Ergebnis zeigte sich, daß die pro-UK-Derivate eine offensichtlich verringerte Empfindlichkeit gegenüber Thrombin im Vergleich mit pro-UK des natürlichen Typs besaßen (siehe Figur 7 - (1)). Insbesondere wurde auch gezeigt, daß UK-T6, UK-T4 und UK-S3 eine noch geringere Empfindlichkeit gegenüber Thrombin als UK-T besaßen (siehe Figur 7-(2)). Tabelle 5 Probe Spezifische Aktivität ( x10&sup4; IU/mg) pro-UK des natürlichen Typs UK-T6 UK-T4 UK-S3 UK-T
Zur weiteren Bestätigung der oben genannten Ergebnisse wurden 10 ul von jedem der oben genannten Reaktionsgemische einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen [Laemmli, Nature, 227, 680 (1970)]. während pro-UK des natürlichen Typs mit Thrombin allmählich gespalten wurde, wurden die pro-UK-Derivate mit Thrombin kaum gespalten (siehe Figur 7-(3)). Diese Ergebnisse zeigten in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen des Fibrinplatten- Assays, daß die pro-UK-Derivate eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber Thrombin besaßen.
Stämme von Escherichia coli, die die Plasmide pSEUS3, pSEUKT4 und pSEUKT6 enthielten, sind am 15. Juni 1989 beim Fermentation Research Institute nach dem Budapester Vertrag mit den Bezeichnungen (und mit den Hinterlegungsnummern) Escherichia coli ESEUKS3 (FERM BP-2478), Escherichia coli ESEUKT4 (FERM BP-2479) und Escherichia coli ESEUKT6 (FERM BP-2480) hinterlegt worden.
Im folgenden sind die Referenz-Beispiele, auf die in den oben genannten Beispielen Bezug genommen wurde, dargestellt.

REFERENZ-BEISPIEL 1

Herstellung des Plasmides ptPA7, das die humane t-PA-cDNA trägt:

(1) Herstellung von poly(A) RNA aus Detroit 562-Zellen:

RNA wurde aus humanen Pharynx-Karzinomzellen Detroit 562 mit Hilfe des Guanidium-Thiocyanat-Lithiumchlorid-Verfahrens [Cathala et al., DNA, 2, 329 (1983)] wie folgt hergestellt.
Humane Pharynx-Karzinomzellen Detroit 562 [W.D. Peterson, Jr, et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 136, 1187 (1971)] ließ man in 50 ml MEM-Medium (Nissui Pharmaceutical), das 10% FKS, 1/100 Volumen 100 x Nicht- Essentielle Aminosäuren-Lösung (Flow Laboratories), 1 mM Natriumpyruvat und 0,1% Lactoalbumin-Hydrolysat (Gibco- Oriental) enthielt, in einer Gewebekulturflasche (Corning; 150 cm²) wachsen. Nach Kultivierung bei 37ºC bis zu Konfluenz wurden die Zellen mit PBS gewaschen. 100 ng/ml Phorbol-Myristatacetat (PMA) wurden zugegeben, und nach Zugabe von 30 ml desselben Mediums, das oben erwähnt worden war, mit der Ausnahme, daß es FKS-frei war, wurde die Inkubation 24 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden die Zellen mit 10 ml einer Lösung behandelt, die 0,05% Trypsin und 0,02% EDTA enthielt, was eine Zell-Suspension ergab. Sechs Gewebekulturflaschen des oben genannten Typs wurden verwendet, was insgesamt 1x10&sup8; Zellen ergab. Die Zellen wurden aus der vereinigten Zell-Suspension durch Zentrifugation gesammelt (1100 x g, 4ºC, 10 Minuten), mit 80 ml Phosphatpuffern gewaschen und unter Verwendung eines Vortex-Mixgerätes in 10 ml einer Lösung solubilisiert, die 5 M Guanidiniumthiocyanat, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH7) und 8% (v/v) 2-Mercaptoethanol enthielt. Das solubilisierte Produkt wurde in ein Zentrifugenröhrchen transferiert. 80 ml 4 M LiCl wurden zugegeben und nach Rühren ließ man das erhaltene Gemisch 20 Stunden bei 4ºC stehen. Eine Zentrifugation unter Verwendung eines Hitachi RPR10-Rotors (9000 Upm, 90 Minuten) resultierte in der Gewinnung einer RNA als ein Präzipitat. Das RNA-Präzipitat wurde in 50 ml einer Lösung suspendiert, die 4 M Harnstoff und 2 M Lithiumchlorid umfaßte, und die RNA wurde wiederum als Präzipitat durch Zentrifugation unter Verwendung eines Hitachi RPR10-Rotors (9000 Upm, 60 Minuten) gewonnen. Das RNA-Präzipitat wurde in 10 ml einer Lösung gelöst, die 0,1% Natriumlaurylsulfat, 1 mM EDTA und 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) enthielt, und nach Extraktion mit Phenol-Chloroform durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Etwa 2,5 mg der erhaltenen RNA wurden in 1 ml einer Lösung gelöst, die 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA enthielt. Nach 5-minütiger Inkubation bei 65ºC wurden 0,1 ml 5 M NaCl zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde einer Oligo(dT)-Cellulose-Säulenchromatographie (P-L Biochemicals) (Säulenvolumen: 0,5 ml) unterzogen. Die adsorbierte poly(A)-haltige mRNA wurde mit einer Lösung eluiert, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA enthielt. Etwa 90 ug der poly(A)-haltigen RNA wurden so erhalten.

(2) cDNA Synthese und Insertion dieser DNA in einen Vektor:

Die Synthese der cDNA und die Herstellung eines rekombinanten Plasmides mit der darin insertierten cDNA wurde mit Hilfe des Okayama-Berg-Verfahrens [Mol. Cell. Biol., 2, 161 (1982)] durchgeführt. Diese Verfahren sind schematisch in Figur 8 dargestellt.
400 ug pCDV1 [Okayama & Berg, Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)] wurden zu 300 ul einer Lösung gegeben, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2; und 10 mM NaCl enthielt. 500 Einheiten KpnI wurden zugugeben, und die Reaktion wurde 6 Stunden bei 37ºC zur Spaltung des plasmides an der in diesem enthaltenen KpnI-Stelle durchgeführt. Nach Extraktion mit Phenol-Chloroform wurde die DNA mittels Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Etwa 200 ug der KpnI-gespaltenen DNA wurden zu 200 ul eines Puffers gegeben, der 40 mM Natriumcacodylat, 30 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1 mM CaCl&sub2; und 0,1 mM Dithiothreitol (DTT) enthielt (im folgenden als "TdT-puffer" bezeichnet), dem dTTP bis zu einer Konzentration von 0,25 mM zugegeben wurde. Weiterhin wurden 81 Einheiten terminale Desoxynucleotidyl-Transerase (im folgenden als "TdT" bezeichnet) (P-L Biochemicals) zugegeben, und die Reaktion wurde 11 Minuten bei 37ºC durchgeführt, wobei eine poly(dT)-Kette, die etwa 67 dT-Reste umfaßte, an den 3'- Terminus der KpnI-Spaltungsstelle des pCDV1 angefügt wurde. Nach Phenol-Chloroform-Extraktion wurden 100 ug der poly(dT)-Ketten-haltigen pCDV1 DNA aus der Lösung mittels Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Die so erhaltene DNA wurde zu 150 ul eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2; und 100 mM NaCl enthielt. 360 Einheiten EcoRI wurden weiterhin zugegeben, und die Reaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde nach dem LGT-Verfahren behandelt, und ein DNA-Fragment von etwa 3,1 kb wurde gewonnen. Man erhielt etwa 60 ug pCDV1, bei dem eine poly(dT)-Kette zugefügt worden war. Die erhaltene DNA wurde in 500 ul einer Lösung gelöst, die 10 mM Tris-HCl (pH 8,) und 1 mM EDTA enthielt. Die Lösung wurde 5 Minuten bei 65ºC inkubiert und danach auf Eis gekühlt. 50 ul 5 M NaCl wurden der Lösung zugefügt. Das erhaltene Gemisch wurde einer Oligo(dA)-Cellulose-Säulenchromatographie (Collaborative Research) unterzogen. Moleküle, die eine genügend lange poly(dT)-Kette besaßen, wurden an die Säule adsorbiert. Sie wurden mit einer Lösung eluiert, die 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA enthielt, was 27 ug pCDV1, dem eine poly(dT)-Kette zugefügt worden war, ergab (im folgenden als "Vektor-Primer" bezeichnet).

Eine Linker-DNA wurde folgendermaßen hergestellt:

Etwa 14 ug pL1 [Okayama & Berg, Mol. Cell. Biol., 3 280 (1983)] wurden zu 200 ml eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl enthielt. Es wurden 50 Einheiten PstI zugegeben, und die Reaktion wurde 4 Stunden bei 37ºC zur Spaltung der pL1-DNA an der darin enthaltenen PstI-Stelle durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer phenol-Chloroform-Extraktion unterzogen, und danach wurden etwa 13 ug der PstI-gespaltenen pL1-DNA mittels Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Etwa 13 ug der so erhaltenen DNA wurden zu 50 ul einer Lösung gegeben, die hergestellt worden war, indem man dGTP zu TdT- Puffer bis zu einer Endkonzentration von 0,25 mM zufügte. Weiterhin wurden 54 Einheiten TdT (P-L Biochemicals) zugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde 13 Minuten bei 37ºC inkubiert, wobei eine (dG)-Kette, die etwa 14 dG-Reste umfaßte, an das 3'-Ende der PstI-Spaltungsstelle des pL1 zugefügt wurde. Nach Phenol-Chloroform-Extraktion wurde die DNA mittels Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Die erhaltene DNA wurde zu 100 ul eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2; und 60 mM NaCl enthielt. 80 Einheiten HindII wurden zugegeben, und das Gemisch wurde 3 Stunden bei 37ºC inkubiert, wobei die pL1-DNA an der HindIII-Stelle gespalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, und ein DNA-Fragment von etwa 0,5 kb wurde mit Hilfe des DEAE- Papier-Verfahrens gewonnen [Dretzen et al., Anal. Biochem., 112, 295 (1981)]. Eine Oligo(dG)-Ketten-haltige Linker-DNA (im folgenden kurz als "Linker-DNA" bezeichnet) wurde somit erhalten.
Etwa 4 ug der poly(A)-RNA und etwa 1,4 ug des Vektor-Primers, die jeweils wie oben beschrieben hergestellt worden waren, wurden in 22,3 ul einer Lösung gelöst, die 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 8 mM MgCl&sub2;, 30 mM KCl, 0,3 mM DTT, 2 mM dNTP (dATP, dTTP, dGTP und dCTP) und 10 Einheiten Ribonuclease-Inhibitor (P-L Biochemicals) enthielt. 10 Einheiten reverse Transcritpase (Seikagaku Kogyo) wurden zugegeben, und die Inkubation wurde 90 Minuten bei 41ºC zur Synthese einer zur mRNA komplementären DNA durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion unterzogen, wonach eine Präzipitation mit Ethanol folgte, wodurch die Vektor-Primer-DNA mit einem daran angefügten RNA-DNA-Doppelstrang gewonnen wurde. Die erhaltene DNA wurde in 20 ul TdT-Puffer gelöst, der 66 uM dCTP und 0,2 ug poly(A) enthielt. 14 Einheiten TdT (P-L Biochemicals) wurden zugefügt, und das Gemisch wurde 2 Minuten bei 37ºC zur Addition einer (dC)-Kette, die 20 dC-Reste umfaßte, an das 3'-Ende der cDNA inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde einer phenol-Chloroform-Extraktion unterzogen, und danach wurde eine Vektor-Primer-DNA mit einer an die cDNA angefügten (dC)-Kette mittels Präzipitation mit Ethanol aus diesem gewonnen. Die erhaltene DNA wurde in 400 ul einer Lösung gelöst, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2; und 60 mM NaCl enthielt. 20 Einheiten HindIII wurden zugegeben, und die Spaltung an der HindIII-Stelle wurde durch die Durchführung einer 2-stündigen Inkubation bei 37ºC bewirkt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenol- Chloroform-Extraktion unterzogen und danach einer Präzipitation mit Ethanol, wodurch man 0,5 Picomol einer Vektor- Primer-DNA aus einer cDNA mit einer angefügten (dC)-Kette erhielt. Ein 0,2 Picomol-Teil der DNA und 0,4 Picomol der oben erwähnten Linker-DNA wurden in 100 ul einer Lösung gelöst, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M Nacl und 1 mM EDTA enthielt. Die Inkubation wurde 10 Minuten bei 65ºC, danach 25 Minuten bei 42ºC und weiterhin 30 Minuten bei 0ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde modifiziert, was ein Gesamtvolumen von 1000 ul eines Reaktionsgemisches ergab, das 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 4 mM MgCl&sub2;, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,1 M KCl und 0,1 mM 13-NAD enthielt. Zu diesem Reaktionsgemisch wurden 25 Einheiten von Escherichia coli- stammender DNA-Ligase (New England Biolabs) zugefügt, und die Inkubation wurde 18 Stunden bei 11ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde mit dNTP (jeweils zu 40 uM) und β-NAD (bis zu 0,15 mM) ergänzt. 10 Einheiten von Escherichia coli-stammender Ligase, 20 Einheiten von Escherichia coli-stammender Polymerase 1 (P-L Biochemicals) und 10 Einheiten von Escherichia coli-stammender Ribonuclease H (P-L Biochemicals) wurden zugegeben, und die Inkubation wurde 1 Stunde bei 12ºC und danach 1 Stunde bei 25ºC durchgeführt. Bei den oben erwähnten Reaktionen war die cDNA-haltige rekombinante DNA zirkularisiert, und der RNA-Teil des RNA-DNA-Doppelstranges wurde durch DNA ersetzt, wodurch ein rekombinantes Plasmid in Form einer vollständigen, doppelsträngigen DNA gebildet wurde.

(3) Auswahl einer rekombinanten DNA, die die cDNA des humanen t-PA enthielt:

Als t-PA cDNA wurde, wie im folgenden beschrieben, durch Kolonie-Hybridisierung ein Klon ausgewählt, der in der Lage war, mit einer ³²P-markierten, synthetischen DNA-Sonde zu assoziieren, die die DNA-Sequenz
besaß, die mit einem Teil der Basensequenz der t-PA Singalpeptid-Region der humanen t-PA cDNA übereinstimmt [Pennica et al., Nature, 301, 214 (1983)].
Zunächst wurde Escherichia coli C600SF8 [Cameron, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3416 (1975)] mit dem rekombinanten Plasmid transformiert, das im Kapitel (2) mit Hilfe des Verfahrens von Hanahan [J. Mol. Biol., 166, 557 (1983)] erhalten worden war. Etwa 10000 erhaltene Kolonien wurden auf einem Nitrocellulose-Filter mit dem Verfahren nach Hanahan und Meselson [Methodes in Enzymology, 100, 333 (1983)] immobilisiert. Danach wurde eine Filter-Prähybridisierung in einer Lösung, die 6 x NET [1 x NET = 150 mM NaCl, 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA], 10 x Denhardt- Lösung und 100 ug/ml fragmentierter, chromosomaler DNA von Escherichia coli enthielt, wenigstens 4 Stunden bei 65ºC durchgeführt. Die oben erwähnte ³²P-markierte Sonde wurde zu dieser Prähybridisierungslösung zugegeben, und man ließ sie mit der DNA auf dem Filter assoziieren (65ºC, wenigstens 16 Stunden). Danach wurde der Filter zweimal mit 6x SSC (1 x SSC = 150 mM NaCl, 15 mM Natrium-Citrat) (Raumtemperatur, 5 Minuten/Waschung) und danach mit einer Lösung, die 2 x SSC und 0,1% SDS enthielt, 30 Minuten bei 65ºC gewaschen. Nach weiterem, 15-minütigem Waschen bei 65ºC mit einer Lösung, die 2 x SSC und 0,1% SDS enthielt, wurde der Filter zweimal mit 6 x SSC bei Raumtemperatur (5 Minuten pro Waschung) gewaschen. Der Filter wurde an der Luft getrocknet, und ein positiver Klon wurde mittels Autoradiographie identifiziert. Die DNA-Sequenz der cDNA des Plasmides ptPA7, das in diesem positiven Klon enthalten war, wurde mit dem Didesoxy-Sequenzierungsverfahren unter Verwendung des M13-Phagen bestimmt. Es wurde festgestellt, daß die cDNA von ptPA7 für einen t-PA kodiert, der eine Aminosäuresequenz besitzt, die völlig identisch mit derjenigen des t-PA ist, über die von Pennica et al. [Nature, 301, 214 (1983)] berichtet worden ist. Es wurde jedoch gezeigt, daß die Codons für die 95. Aminosäure (Asparaginsäure) und die 512. Aminosäure (Threonin) des reifen t-PA GAT und ACC anstelle von GAC bzw. ACA lauteten.
Dieser Bakterienstamm ist beim Fermentation Research Institute nach dem Budapester Vertrag unter der Hinterlegungsnummer Escherichia coli EtPA7 (FERM BP-1467) hinterlegt worden.

REFERENZ-BEISPIEL 2

Herstellung des Plasmides pUK1, das die humane pro-UK cDNA enthielt:

Die im Referenz-Beispiel 1 hergestellte, von der Detroit 562-Zelle stammende cDNA-Bank wurde unter Verwendung des Kolonie-Hybridisierungsverfahrens abgesucht, und ein humaner pro-UK cDNA-Klon wurde isoliert. So wurde das im Referenz-Beispiel 1 erhaltene rekombinante Plasmid verwendet, um Escherichia coli C600SF8 [Cameron, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3416 (1975)] nach dem Verfahren nach Hanahan [J. Mol. Biol., 166, 557 (1983)] zu transformieren. Etwa 30000 erhaltene Kolonien wurden auf einem Nitrocellulose-Filter nach dem Verfahren von Hanahan und Meselson [Methods in Enzymology, 100, 333 (1983)] immobilisiert. Danach wurde eine Filter-Prähybridisierung wenigsten 4 Stunden bei 65ºC in einer Lösung bewirkt, die 6 x NET, 10 x Denhart-Lösung und 100 ug/ml fragmentierter chromosomaler DNA von Escherichia coli enthielt.
Danach wurde eine ³²P-markierte, synthetische DNA-Sonde mit 41 Basen, die eine identische DNA-Sequenz zu einem Teil der Kringel-Domäne der humanen pro-UK cDNA [Holmes et al., Bio/Technology, 3, 923 (1985)] und somit die DNA-Sequenz
besaß (bei der von den Erfindern isolierten humanen pro-UK cDNA entspricht dies dem unterstrichenen Teil der in Tabelle 4 dargestellten Basensequenz), zu der oben erwähnten Prähybridisierungslösung gegeben und mit der DNA auf dem Filter assoziieren gelassen (65ºC, wenigstens 16 Stunden).
Danach wurde der Filter zweimal mit 6 x SSC (Raumtemperatur, 5 Minuten pro Waschung) und danach 30 Minuten bei 57ºC mit einer Lösung, die 1 x SSC und 0,1% SDS enthielt, gewaschen. Der Filter wurde weiterhin 15 Minuten bei 57ºC mit einer Lösung, die 1 x SSC und 0,1% SDS enthielt, und danach zweimal mit 6 x SSC (Raumtemperatur, 5 Minuten pro Waschung) gewaschen. Der Filter wurde an der Luft getrocknet, und ein positiver Klon wurde mittels Autoradiographie identifiziert. Die DNA-Sequenz der cDNA des Plasmides pUK1, das in diesem positiven Klon enthalten war, wurde mit dem Didesoxy-Verfahren unter Verwendung des M13-Phagen bestimmt. Es wurde festgestellt, daß die cDNA des pUK1 für die translatierte Region des stromabwärts von der 41. Aminosäure (Cys) des pro-UK (gemäß der in Tabelle 4 verwendeten Numerierung der Aminosäurereste des pro-UK) gelegenen Teils des pro-UK und für die 3'-nichtranslatierte Region kodierte. Die Aminosäuresequenz des von der cDNA des pUK1 kodierten pro-UK stimmte mit derjenigen überein, über die von Holmes et al. [Bio/Technology, 3, 923 (1985)] berichtet worden war. Die Codons für die folgenden Aminosäuren waren jedoch in der dritten Base verschieden von denjenigen, über die von Holmes et al. berichtet worden war.
254. Aminosäure Asn: AAC AAT,
340. Aminosäure Leu: CTA CTG,
345. Aminosäure Pro: CCC CCA,
346 Aminosäure Gln: CAA CAG.
Der oben erwähnte Bakterienstamm ist beim Fermentation Research Institute nach dem Budapester Vertrag unter der Bezeichnung Escherichia coli EUK1 (FERM BP-1463) hinterlegt worden.

REFERENZ-BEISPIEL 3

Herstellung des Plasmides pUK11, das die humane pro-UK cDNA enthielt:

Da die im Referenz-Beispiel 2 erhaltene pro-UK cDNA, die von dem Plasmid p-UK1 kodiert wurde, weder die Signalregion noch die Region der Wachstumsfaktor-Domäne von pro-UK enthielt, wurde eine cDNA, die diese Regionen enthielt, wie nachfolgend beschrieben kloniert.
Zunächst wurde ein Vektor zur cDNA-Klonierung , pCCK2, folgendermaßen hergestellt.

(1) Herstellung des rekombinanten Plasmides pCCK1:

Escherichia coli HB101 wurde mit dem Plasmid pRC19, das von Kuwano et al. [J. Biochem., 96, 923-926 (1984)] hergestellt worden war und eine cDNA für den Rattenhirn-Cholecystokinin (CCK)-Vorläufer enthielt, transformiert und kultiviert. Die pRC19-DNA wurde aus den kultivierten Zellen auf übliche Weise präpariert. Etwa 3 ug der erhaltenen pRC19-DNA wurde in 30 ul Y-50-Puffer [eine Lösung, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 7 mM MgCl&sub2; und 7 mM 2-Mercaptoethanol enthielt] gelöst. Eine Einheit PvuII wurde zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 1 Stunde bei 37ºC durchgeführt, wobei die DNA durch PvuII partiell verdaut wurde. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment mit etwa 530 bp unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurde 1 ug der Plasmid-DNA pUC19, die von Norrander et al. hergestellt worden war [Norrander, J. et al., Gene, 26, 101 (1983); erhältlich von Takara Shuzo] in 30 ul Y-0-Puffer, der 20 mM KCl enthielt, gelöst. 16 Einheiten SmaI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 30ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 2,7 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Das so erhaltene von pRC19-stammende DNA-Fragment (etwa 530 bp, etwa 0,01 ug) und das von pUC19-stammende DNA-Fragment (etwa 2,7 kb, etwa 0,05 ug) wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 200 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das erhaltene rekombinante Plasmid-Gemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap-resistente Transformanten ergab. Die Plasmid-DNA pCCK1, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, wurde einer Strukturanalyse mit Restriktionsenzymen unterzogen, und es wurde festgestellt, daß sie die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 9).

(2) Herstellung des rekombinanten Plasmides pCCK2:

Etwa 2 ug der wie oben beschrieben erhaltenen pCCK1 Plasmid-DNA wurden in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 12 Einheiten SacI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M Nacl und 10 Einheiten BamHI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA- Fragment von etwa 0,55 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 2 ug der im später beschriebenen Referenz-Beispiel 4 erhaltenen pTrS33 Plasmid-DNA auf die gleiche Weise, wie oben beschrieben, behandelt und ein SacI-BamHI-Fragment von etwa 2,85 kb wurde unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Das von pCCK1 stammende DNA-Fragment (etwa 0,55 kb, etwa 0,02 ug) und das von pTrS33 stammende DNA-Fragment (etwa 2,85 kb, etwa 0,1 ug), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 50 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das erhaltene rekombinate Plasmid-Gemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap-resistente Transformanten ergab. Die Plasmid-DNA pCCK2, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, wurde einer Strukturanalyse unter Verwendung von Restriktionsenzymen unterzogen, und es wurde festgestellt, daß sie die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 10).

(3) Isolierung des Plasmides pUK11, das die humane pro-UK cDNA enthielt:

Etwa 8 ug der poly(A)-RNA (mRNA), die von der Detroit 562-Zelle stammte [gelöst in 7 ul 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) -0,5 mM EDTA] wurden 10 Minuten auf 65ºC erhitzt und danach auf Eis abgeschreckt. Die Zusammensetzung dieser Lösung wurde so eingestellt, daß die resultierende Lösung in einem Gesamtvolumen von 80 ul 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 8 mM MgCl&sub2;, 30 mM KCl, 5 mM DTT, 1 mM dNTp (dATP, dTTP, dGTP und dCTP), 10 Einheiten Ribonuclease-Inhibitor (P-L Biochemicals) und 5 ug/ml Oligo- (dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; (Collaborative Research) enthielt. Die Lösung wurde 15 Minuten bei 41ºC gehalten. Danach wurden 20 Einheiten Reverse Transkriptase (Seikagaku Kogyo) zugegeben, und das Gemisch wurde zur Synthese einer cDNA, die komplementär zur mRNA war, 90 Minuten bei 41ºC gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion unterzogen. Die Zugabe von Ethanol ergab ein Präzipitat, das in 40 ul 0,3 M NaOH gelöst wurde. Man ließ die Lösung 15 Stunden bei 37ºC stehen, um eine Hydrolyse der mRNA zu bewirken. Danach wurde die Lösung durch Zugabe von 10 ul 1 M Tris-HCl (pH 7,5) und 40 ul 0,3 N HCl neutralisiert, und eine einzelsträngige cDNA wurde durch Prazipitation mit Ethanol gewonnen und in 28,5 ul H&sub2;O gelöst.
Die Zusammensetzung dieser Lösung wurde so eingestellt, daß die resultierende Lösung in einem Gesamtvolumen von 40 ul 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 8 mM MgCl&sub2;, 30 mM KCl, 5 mM DTT, 1 mM dNTP (dATP, dTTP, dGTP und dCTP) und 2,5 u g/ml des synthetischen DNA-Primers CATGAGAGCCCTGCTGG (identisch mit einem Teil der Basensequenz der Signalpeptid-Region von Human-pro-UK) enthielt. Die Lösung wurde 10 Minuten bei 65ºC und danach 30 Minuten bei 41ºC gehalten. Danach wurden 10 Einheiten Reverse Transkriptase zugegeben, und das Gemisch wurde zur Überführung der einzelsträngigen cDNA in eine doppelsträngige cDNA 60 Minuten bei 41ºC gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion unterzogen. Die Zugabe von Ethanol ergab ein Prazipitat, das in 30 ul Y-0-Puffer, der 25 mM NaCl enthielt, gelöst. 25 Einheiten BssHII (New England Biolabs) wurden zu der Lösung zugegeben, und die verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 50ºC durchgeführt. Weiterhin wurden 1,25 ul 2 M NaCl und 12 Einheiten BamHI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein cDNA-Fragment von etwa 1,1 bis 1,4 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Getrennt davon wurden 2 ug der, wie oben beschrieben, erhaltenen pCCK2-Plasmid DNA mit BssHII und BamHI auf die gleiche Weise, wie oben beschrieben, gespalten, und ein BssHII-BamHI-Fragment von etwa 2,9 kb wurde unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Das so erhaltene cDNA-Fragment (etwa 1,1 bis 1,4 kb, etwa 0,02 ug) und das vom pCCK2 stammende DNA- Fragment (etwa 2,9 kb, etwa 0,05 ug) wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 200 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli C600SF8 zu transformieren, was etwa 25000 Ap-resistente Transformanten ergab. Unter diesen Ap- resistenten Stämmen wurden etwa 1000 positive Klone unter Verwendung des im Referenz-Beispiel 2 erwähnten Kolonie-Hybridisierungs-Verfahren erhalten, die in der Lage waren, mit der gleichen Probe zu assoziieren, die zur Isolierung der pro-UK cDNA im Referenz-Beispiel 2 verwendet worden war. Die Hybridisierungsbedingungen und die Bedingungen des Filterwaschens waren die gleichen, die im Referenz-Beispiel 2 angewendet worden waren. Das aus einem der so erhaltenen positiven Klone isolierte Plasmid pUK11 (siehe Figur 11) wurde einer Basensequenz-Bestimmung für die Regionen des pro-UK Signalpeptides der Wachstumsfaktor-Domäne und der Kringel-Domäne durch das Didesoxy-Verfahren unter Verwendung des M13-Phagens unterzogen. Die so festgestellte DNA-Sequenz stimmte mit derjenigen überein, über die von Holmes [Bio/Technology, 3, 923 (l985)] berichtet worden war.

REFERENZ-BEISPIEL 4

Herstellung des rekombinanten Plasmides pTrS33:

(1) Herstellung des ATG-Vektors pTrS20:

Der ATG-Vektor pTrs20, in dem die SD-Sequenz 14 Basen vom Initiationscodon ATG entfernt liegt, und der eine SacI-Stelle direkt hinter dem ATG-Codon besitzt, wurde gemäß dem in Figur 12 dargestellten Schema hergestellt.
Zunächst wurden 3 ug pKYP10, das wie im US-Patent Nr. 4 686 191 hergestellt worden war, in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 6 Einheiten des Restriktionsenzyms BanII und 6 Einheiten des Restriktionsenzyms NruI (New England Biolabs) wurden zugegeben, und die Spaltungsreaktion wurde 3 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden etwa 0,5 ug eines Ptrp-haltigen DNA-Fragmentes (BanII-NruI-Fragment) von etwa 3,8 kb durch das LGT-Verfahren gewonnen.
Getrennt davon wurde der folgende DNA-Linker mit Hilfe des Phosphotriester-Verfahrens synthetisiert, der das Initiationscodon ATG stromabwärts des Ptrp lieferte.
Die synthetischen 19-mer und 17-mer DNAs (jeweils 10 Picomol) wurden in einem Gesamtvolumen von 20 ul einer Lösung gelöst, die 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreitol, 0,1 mM EDTA und 1 mM ATP enthielt. 3 Einheiten T4 Polynukleotid-Kinase (Takara Shuzo) wurden zugegeben, und die Phosphorylierungsreaktion wurde 60 Minuten bei 37ºC durchgeführt.
Danach wurden 0,1 ug des von pKYP10 stammenden BanIII-NruI-Fragmentes (etwa 3,8 kb), das wie oben beschrieben erhalten worden war, und etwa 0,5 Picomol des oben erwähnten DNA-Linkers in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 2 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das erhaltene rekombinante Plasmid-Gemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 [Bolivar et al., Gene, 2, 75 (1977)] zu transformieren, was Ap-resistente Kolonien ergab. Jede Kolonie wurde kultiviert, und eine plasmid-DNA wurde aus den kultivierten Zellen gewonnen. Die Struktur der Plasmid-DNA wurde durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen EcoRI,
BanIII, HindIII, SacI und NruI und nachfolgender Agarose- Gelelektrophorese untersucht. Ein Plasmid, bei dem festgestellt wurde, daß es die gewünschte Struktur besaß, wurde als pTrS20 bezeichnet (siehe Figur 12). Es wurde mit Hilfe des Didesoxy-Sequenzierungsverfahrens unter Verwendung des M13-Phagens bestätigt, daß pTrS20 die folgende DNA-Sequenz in der Nachbarschaft der BanIII- und HindIII-Stellen besaß:

(2) Herstellung von pTrS33:

Etwa 3 ug der pTrs20 Plasmid-DNA, die wie oben beschrieben erhalten worden war, wurden in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 12 Einheiten SacI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 10 Einheiten PstI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,15 kb mit Hilfe des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden 2 ug pKYP26, das wie in der EP-A-0 214 555 beschrieben hergestellt worden war [ein Escherichia coli-Stamm, der pKYP26 enthält, ist bei dem Fermentation Research Institute nach dem Budapester Vertrag unter der Bezeichnung Escherichia coli IKYP26 (FERM BP-863) hinterlegt worden], in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 8 Einheiten PstI und 10 Einheiten BamHI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,7 kb mit Hilfe des AFT-Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden getrennt davon 2 ug der M13mp18 RF DNA [Norrander, J. et al., Gene, 26, 101 (1983); erhalten von Takara Shuzo] in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 10 Einheiten SacI wurden zugegeben , und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 1 M NaCl und 10
Einheiten ClaI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 0,65 kb mit Hilfe des AFT-Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden getrennt davon die folgenden zwei synthetischen DNAs (43 Basen und 45 Basen) (auch in Figur 13 dargestellt) unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes Applied Biosystems Modell 380A synthetisiert:
Sie wurden auf die gleiche, oben beschriebene Weise getrennt 5'-phosphoryliert.
Das von pTrS20-stammende DNA-Fragment (etwa 1,15 kb, etwa 0,1 ug), das von pKYP26 stammende DNA- Fragment (etwa 1,7 kb, etwa 0,1 ug), das von M13mp18 stammende DNA-Fragment (etwa 0,65 kb, etwa 0,05 ug) und zwei 5'-phosphorylierte synthetische DNAs (jeweils 1 Picomol), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 50 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene rekombinante Plasmid-Gemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap-resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen und eine DNA-Sequenzierung mit Hilfe des Didesoxy- Verfahrens unter Verwendung des M13-Phagens umfaßte, wurde festgestellt, daß das Plasmid pTrS33, das aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 13).

REFERENZ-BEISPIEL 5

Herstellung des rekombinanten Plasmids pTerm2:

Etwa 2 ug der pKYP26 Plasmid-DNA (EP-A-0 214 555) wurden in 30 ul einer Lösung gelöst, die 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 75 mM NaCl, 7 mM MgCl&sub2; und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt. 16 Einheiten Asp718 (Boehringer-Mannheim) und 10 Einheiten PstI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,7 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 2 ug der pTrs20 Plasmid-DNA, die im Referenz-Beispiel 4-(1) erhalten worden war, in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 8 Einheiten PstI und 10 Einheiten NruI (Boehringer-Mannheim) wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,5 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden getrennt davon die in Figur 14 dargestellten zwei synthetischen DNAs (19 Basen und 23 Basen) unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes Applied Biosystems Modell 380A snythetisiert und jeweils unter Verwendung des gleichen, oben erwähnten Verfahrens 5'-phosphoryliert.
Das von pKYP26 stammende DNA-Fragment (etwa 1,7 kb, etwa 0,1 ug), das von pTrs20 stammende DNA-Fragment (etwa 1,15 kb) und die zwei 5'-phosphorylierten, synthetischen DNAS (jeweils 1 Picomol), die somit erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 50 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap-resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen und eine DNA- Sequenzierung mit Hilfe des Didesoxy-Verfahrens unter Verwendung des M13-Phagens umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pTerm2, die aus einem dieser Tranformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 14).

REFERENZ-BEISPIEL 6

Herstellung des rekombinanten Plasmides pTkSS4:

(1) Herstellung des rekombinanten Plasmides pTSF10:

Escherichia coli C600SF8, transformiert mit dem im Referenz-Beispiel 1 erhaltenem Plasmid ptPA7, das die humane t-PA cDNA enthielt, wurde kultiviert, und die ptPA7- DNA wurde aus den kultivierten Zellen auf übliche Weise hergestellt. Etwa 2 ug der erhaltenen ptPA7-DNA wurden in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 8 Einheiten BglII wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC, wurde ein DNA-Fragment von etwa 2,0 kb unter Verwendung des AFT- Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 2 ug der pTrs33-DNA (Referenz-Beispiel 4) in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 2,8 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Das von ptPA7 stammende DNA-Fragment (etwa 2,0 kb, etwa 0,1 ug) und das von pTrS33 stammende DNA-Fragment (etwa 2,8 kb, etwa 0,1 ug), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 50 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap-resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pTSF10, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß.

(2) Herstellung des rekombinanten Plasmides pTA4:

Etwa 3 ug der pTSF10 Plasmid-DNA, die wie oben beschrieben erhalten worden war, wurden in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 12 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 3 M NaCl und 12 Einheiten BstEII (New England Biolabs) zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 60ºC durchgeführt. Danach wurde ein DNA-Fragment von etwa 0,3 kb unter Verwendung des AFT- Verfahrens gereinigt.
Getrennt davon wurde Escherichia coli IGHA2 (hinterlegt beim Fermentation Research Institute unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-400) kultiviert, und die pGHA2 Plasmid-DNA (US-Patent Nr. 4 868 125) wurde aus den kultivierten Zellen auf übliche Weise hergestellt. Etwa 2 ug der erhaltenen pGHA2-DNA wurden in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 8 Einheiten PstI und 8 Einheiten BglII wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA- Fragment von etwa 0,75 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Weiterhin wurden getrennt davon 3 ug der ptPA7- DNA (Referenz-Beispiel 1) in 30 ul einer Lösung gelöst, die 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 7 mM MgCl&sub2; und 6 mM 2-Mercaptoethanol (im folgenden als "Y-150-Puffer" bezeichnet) enthielt. 10 Einheiten BglII wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 12 Einheiten BstEII zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 60ºC durchgeführt. Ein DNA-Fragment von etwa 1,55 kb wurde aus dem Reaktionsgemisch unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden getrennt davon etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 5 erhaltenen pTerm2-DNA in 30 ul Y-0- Puffer in Gegenwart von 12 Einheiten KpnI 2 Stunden bei 37ºC verdaut. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 8 Einheiten PstI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,7 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Die so erhaltenen vier DNA-Fragmente (0,03 ug des von pTSF10 stammenden Fragmentes, 0,05 ug des von pGHA2 stammenden Fragmentes, 0, 1 ug des von ptPA7 stammenden Fragmentes und 0,1 ug des von pTerm2 stammenden Fragmentes) wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 50 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap-resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pTA4, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 16).

(3) Herstellung des rekombinanten Plasmides pTkSD217:

Etwa 10 ug der pTA4 Plasmid-DNA, die wie oben beschrieben erhalten worden war, wurden in 100 ul Y-100-Puffer gelöst. 30 Einheiten XhoI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach Phenol-Extraktion und Chloroform-Extraktion wurde das hergestellte DNA-Fragment durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen und in 50 ul TE-Puffer [10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA] gelöst. Zu 10 ul dieser DNA-Lösung wurden 10 ul an 5-fach konzentriertem BAL31-Puffer [100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 3 M NaCl, 60 mM CaCl&sub2;, 60 mM MgCl&sub2;, 5 mM EDTA], 30 ul Wasser und 0,5 Einheiten der Exonuclease BAL31 (Takara Shuzo) gegeben, und die Reaktion wurde 5 Minuten bei 30º C durchgeführt. Dies sind die Reaktionsbedingungen, unter denen die DNA etwa 0,5 kb vom XhoI-Terminus entfernt abgetrennt werden kann. Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol beendet. Nach weiterer Extraktion mit Chloroform wurde das hergestellte DNA-Fragment durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde in 30 ul Y-100- Puffer gelöst. 10 Einheiten BamHI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,5 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Getrennt davon wurden etwa 2 ug der pTrS33 Plasmid-DNA (Referenz-Beispiel 4) in 30 ul Y-0-Puffer in Gegenwart von etwa 12 Einheiten SaCI 2 Stunden bei 37ºC verdaut. Nach Phenol-Extraktion und Chloroform-Extraktion wurde das hergestellte DNA-Fragment durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen und in einem Gesamtvolumen von 40 ul eines Puffers gelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 7 mM MgCl&sub2;, 6 mM 2- Mercaptoethanol, 0,25 mM dATP, 0,25 mM dCTP, 0,25 mM dGTP und 0,25 mM dTTP (im folgenden als "Polymerase-Puffer" bezeichnet) enthielt. 6 Einheiten Klenow-Fragment (Klenow Pol I) (Takara Shuzo) wurden zugegeben, und die Reaktion wurde 1 Stunde bei 15ºC durchgeführt, wobei die SacI überstehenden Enden in glatte Enden überführt wurden. Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol beendet. Nach Chloroform- Extraktion wurde ein DNA-Fragment durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde in 30 ul Y-100- Puffer gelöst. 10 Einheiten BamHI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA- Fragment von etwa 2,8 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Das von pTA4 stammende DNA-Fragment (etwa 1,5 kb, etwa 0,2 ug) und das von pTrS33 stammende DNA-Fragment (etwa 2,8 kb, etwa 0,1 ug), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 50 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap-resistente Transformanten ergab. Die Plasmid-DNA pTkSD217, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, wurde einer Strukturanalyse unterzogen, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen umfaßte, und die DNA-Sequenz stromabwärts des Escherichia coli Tryptophan-Promotors (Ptrp) wurde mit Hilfe des Didesoxy-Sequenzierungsverfahrens unter Verwendung des M13-Phagens bestimmt [J. Messing et al., Gene, 19, 269 (1985)]. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß pTkSD217 die gewünschte Struktur besaß, und daß die DNA-Sequenz wie folgt lautete (siehe Figur 17). Kringel

(4) Herstellung des rekombinanten Plasmides pTkSL11:

Etwa 3 ug der pTkSD217 Plasmid-DNA, die wie oben beschrieben erhalten worden war, wurden in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 10 Einheiten HindII und 15 Einheiten ScaI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 0,23 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden 2 ug der im Referenz-Beispiel 5 erhaltenen pTerm2 Plasmid- DNA in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 10 Einheiten HindIII und 10 Einheiten NsiI (New England Biolabs) wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Wärmebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 2,8 kb unter Verwendung des AFT- Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden die folgenden 2 synthetischen DNAs (35 Basen und 31 Basen) unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes Applied Biosystems Modell 380A synthetisiert und mit Hilfe des oben erwähnten Verfahrens jeweils 5'-phosphoryliert.
Das von pTkSD217 stammende DNA-Fragment (etwa 0,23 kb, etwa 0,01 ug), das von pTerm2 stammende DNA-Fragment (etwa 2,8 kb, etwa 0,1 ug) und die zwei 5'-phosphorylierten synthetischen DNAs (jeweils 1 Picomol), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 300 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap-resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen und eine DNA- Sequenzbestimmung mit Hilfe des M13 Didesoxy-Sequenzierungsverfahrens umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pTkSL11, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 18).

(5) Herstellung des rekombinanten Plasmides pTkSS4:

Etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 1 erhaltenen ptPA7 Plasmid-DNA wurden in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 12 Einheiten des Restriktionsenzyins ScaI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA- Fragment von etwa 2,0 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden 2 ug der pTkSL11 Plasmid-DNA, die wie oben beschrieben erhalten worden war, derselben, oben beschriebenen Reaktion ausgesetzt. Nach 10- minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 2,0 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Das von ptPA7 stammende DNA-Fragment (etwa 2,0 kb, etwa 0,2 ug) und das von pTkSL11 stammende DNA- Fragment (etwa 2,0 kb, etwa 0,1 ug), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 300 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap-resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pTkSS4, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 19).

REFERENZ-BEISPIEL 7

Herstellung des rekombinanten Plasmides pTkSR18:

(1) Herstellung des rekombinanten Plasmides pTkSJ1:

Etwa 2 ug des im Referenz-Beispiel 6-(2) erhaltenen Plasmides pTA4 wurden in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 10 Einheiten EcoRI und 30 Einheiten Bbel wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein BbeI- EcoRI-Fragment von etwa 2,8 kb unter Verwendung des AFT- Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 3 ug der pTA4-DNA in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 12 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 1 Einheit EcoRI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für eine weitere Stunden bei 37ºC durchgeführt. Unter diesen Reaktionsbedingungen verlief der Verdau der DNA mit KpnI vollständig und der mit EcoRI partiell. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein EcoRI-KpnI-Fragment von etwa 1,4 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden die folgenden zwei synthetischen DNAs (16 Basen und 24 Basen) unter Verwendung eines DNA- Synthesegerätes Applied Biosystems Modell 380A synthetisiert und jeweils auf dieselbe, oben beschriebene Weise 5'-phosphoryliert.
Das von pTA4 stammende BbeI-EcoRI-Fragment (etwa 2,8 kb, etwa 0,1 ug), das von pTA4 stammende EcoRI-KpnI- Fragment (etwa 1,4 kb, etwa 0,05 ug) und die zwei 5'-phosphorylierten synthetischen DNAs (jeweils 1 Picomol), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 50 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4º C durchgeführt.
Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap-resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen und eine DNA- Sequenzierung mit Hilfe des Didesoxy-Verfahrens unter Verwendung des M13-Phagens umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pTkSJ1, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 20).

(2) Herstellung des rekombinanten Plasmides pTkSR18:

Etwa 3 ug der wie oben beschrieben erhaltenen pTkSJ1 Plasmid-DNA wurden in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 10 Einheiten XhoI und 15 Einheiten ScaI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA- Fragment von etwa 0,5 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 4 erhaltenen pTrS33 Plasmid-DNA in Y-0-Puffer gelöst, der 150 mM KCl enthielt. 8 Einheiten PvuI und 15 Einheiten SalI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von 1,0 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden getrennt davon etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 5 erhaltenen pTerm2 Plasmid-DNA in 30 ul Y-150-Puffer gelöst. 8 Einheiten PvuI und 8 Einheiten NsiI (New England Biolabs) wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,85 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden die folgenden zwei synthetischen DNAs (35 Basen und 31 Basen) unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes Applied Biosystems Modell 380A synthetisiert und jeweils auf dieselbe, oben erwähnte Weise 5'-phosphoryliert.
Das von pTkSJ1 stammende XhoI-SacI-Fragment (etwa 0,5 kb, etwa 0,05 ug), das von pTrS33 stammende PvuI-SalI- Fragment (etwa 1,0 kb, etwa 0,1ug), das von pTerm2 stammende NsiI-PvuI-Fragment (etwa 1,85 kb, etwa 0,1 ug) und die zwei 5'-phosphorylierten synthetischen DNAS (jeweils 1 Picomol), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 50 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap- resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen und eine DNA-Sequenzierung mit Hilfe des Didesoxy-Verfahrens unter Verwendung des M13-Phagens umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pTkSR18, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 21).

REFERENZ-BEISPIEL 8

Herstellung des rekombinanten Plasmides pUKB101:

(1) Herstellung des rekombinanten Plasmides pUKA2:

Die pUK1-DNA wurde aus einem transformierten Stamm von Escherichia coli C600SF8 hergestellt, der das im Referenz-Beispiel 2 erhaltene Plasmid pUK1 enthielt, das die humane pro-UK cDNA enthielt. Etwa 2 ug der erhaltenen pUK1-DNA wurden in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 8 Einheiten des Restriktionsenzyms NcoI und 8 Einheiten des Restriktionsenzyms StuI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,2 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 4 erhaltenen pTrS33 Plasmid-DNA in 30 ul einer Lösung gelöst, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM KCl, 7 mM MgCl&sub2; und 6 mM 2-Mercaptoethanol (im folgenden als "K-25-Puffer" bezeichnet) enthielt. 16 Einheiten des Restriktionsenzyms SmaI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 30ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 1 M NaCl und 10 Einheiten NcoI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 2,85 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Das von pUK1 stammende DNA-Fragment (etwa 1,2 kb, etwa 0,05 ug) und das von pTrS33 stammende DNA-Fragment (etwa 2,85 kb, etwa 0,1 ug), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul eines Puffers gelöst, der 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol (DTT) und 1 mM ATP enthielt. 100 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ampicillin-Ap-resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pUKA2, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 22).

(2) Herstellung des rekombinanten Plasmides pUKB101:

Etwa 2 ug der wie oben beschrieben erhaltenen pUKA2 Plasmid-DNA wurden in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 12 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 10 Einheiten NcoI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,2 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden 2 ug der im Referenz-Beispiel 4 erhaltenen pTrS33 Plasmid- DNA in 30 ul K-25-Puffer gelöst. 16 Einheiten SmaI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 30ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 10 Einheiten PstI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,15 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 5 erhaltenen pTerm2 Plasmid-DNA in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 12 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 10 Einheiten PstI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,7 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden die folgenden zwei synthetischen DNAS (41 Basen und 45 Basen) unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes Applied Biosystems Modell 380A synthetisiert.
Diese synthetischen DNAs (jeweils 20 Picomol) wurden einzeln am 5'-Ende phosphoryliert, indem die Reaktion in 20 ul T4 Kinase-Puffer in Gegenwart von 5 Einheiten T4 DNA-Kinase 30 Minuten bei 37ºC durchgeführt wurde.
Das von pUKA2 stammende DNA-Fragment (etwa 1,2 kb, etwa 0,05 ug), das von pTrS33 stammende DNA-Fragment (etwa 1,15 kb, etwa 0,05 ug), das von pTerm2 stammende DNA- Fragment (etwa 1,7 kb, etwa 0,05 ug) und die zwei 5'-phosphorylierten synthetischen DNAS (jeweils 1 Picomol), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 300 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap-resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen und eine DNA- Sequenzbestimmung mit Hilfe des M13 Didesoxy-Sequenzierungsverfahren umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pUKB 101, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 22).

REFERENZ-BEISPIEL 9

Herstellung des rekombinanten Plasmides pTG3:

Etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 6 erhaltenen pTkSS4 Plasmid-DNA wurden in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 10 Einheiten des Restriktionszenzymes NarI (New England Biolabs) wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,0 ul 2 M NaCl und 12 Einheiten BamHI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA- Fragment von etwa 3,3 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 3 ug der im Referenz-Beispiel 7 erhaltenen pTkSR18 Plasmid-DNA derselben, oben beschriebenen Reaktion unterzogen, und nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 0,2 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Das von pTkSS4 stammende DNA-Fragment (etwa 3,3 kb, etwa 0,1 ug) und das von pTkSR18 stammende DNA-Fragment (etwa 0,2 kb, etwa 0,01 ug), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ml T4 Ligase-Puffer gelöst. 100 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap- resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pTG3, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 24).

REFERENZ-BEISPIEL 10

Herstellung des rekombinanten Plasmides phPA2:

Etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 9 erhaltenen pTG3 Plasmid-DNA wurden in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. Jeweils 10 Einheiten von EcoRI und PvuI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA- Fragment von etwa 1,7 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Getrennt davon wurden 2 ug der im Referenz-Beispiel 8 erhaltenen ptwB101 Plasmid-DNA in 30 ul Y-10-Puffer gelöst. Jeweils 10 Einheiten NcoI und PvuI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 3,0 kb unter Verwendung des AFT- Verfahrens gereinigt.
Weiterhin wurden getrennt davon 2 ug der im Referenz-Beispiel 7 erhaltenen pTkSR18 Plasmid-DNA in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. Jeweils 10 Einheiten HindIII und AatII wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 0,55 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Weiterhin wurden die folgenden vier synthetischen DNAs (37 Basen und 41 Basen sowie 41 Basen und 45 Basen) unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes Applied Biosystems Modell 380A synthetisiert. Basen
Diese synthetischen DNA (jeweils 20 Picomol) wurden einzeln am 5'-Ende phosphoryliert, indem sie der Reaktion in 20 ul T4 Kinase-Puffer in Gegenwart von 5 Einheiten T4 DNA-Kinase 30 Minuten bei 37ºC unterzogen wurden.
Das von pTG3 stammende DNA-Fragment (etwa 1,7 kb, etwa 0,05 ug), das von pUK101 stammende DNA-Fragment (etwa 3,0 kb, etwa 0,05 ug), das von pTkSR18 stammende DNA-Fragment (etwa 0,55 kb, etwa 0,05 ug) und die vier 5'-phosphorylierten, synthetischen DNAs (jeweils 1 Picomol), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 300 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap-resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen und eine DNA- Sequenzbestimmung unter Verwendung des M13 Didesoxy-Sequenzierungsverfahren umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA phPA2, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 25).

REFERENZ-BEISPIEL 11

Herstellung des rekombinanten Plasmids pUKS1, das für das pro-UK-Derivat UK-S1 kodiert

(1) Herstellung einer einzelsträngigen DNA-Matrize (einzelsträngiges pUKmpS1):

Etwa 3 ug des im Referenz-Beispiel 2 erhaltenen pUK1 wurden in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. Jeweils 10 Einheiten der Restriktionsenzyme PstI und BamHI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein 890-bp PstI-BamHI DNA-Fragment unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt [Bio/Technology, 2, 66-67 (1984)].
Getrennt davon wurden 1 ug der M13 PhagenVektor M13mp18 RF DNA (Takara Shuzo) in insgesamt 30 ul Y-100-Puffer gelöst. Jeweils 10 Einheiten der Restriktionsenzyme PstI und BamHI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 7,2 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Das von pUK1 stammende DNA-Fragment (890 bp) und das von M13mp18RF stammende DNA-Fragment (etwa 7,2 kb), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 300 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Das oben genannte Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli JM105 mit Hilfe eines bekannten Verfahrens [Messing et al., Methods in Enzymology, 101, 20 (1983)] zu transfizieren, was einen rekombinanten Phagen ergab. Danach wurde Escherichia coli JM105 mit diesem rekombinanten Verfahren mit Hilfe des Verfahrens nach Messing et al. infiziert. Aus dem Kulturüberstand wurde eine einzelsträngige Phagen-DNA gewonnen, während eine doppelsträngige Phagen-DNA aus kultivierten Zellen auf die gleiche Weise wie bei der Gewinnung von Plasmid-DNAs gewonnen wurde. Die Struktur dieser doppelsträngigen Phagen-DNA (pUKmpS1) wurde durch einen Verdau mit Restriktionsenzymen bestätigt (siehe Figur 26).
(2) Mutagenese der UK cDNA unter Verwendung eines Oligonucleotides:

(a) Herstellung einer synthetischen DNA zur Mutagenese und deren Phosphorylierung:

Zur Herstellung eines UK-Derivates, bei dem die 164. Aminosäure Asn anstatt Phe in UK war, und das eine angefügte Kohlenhydratkette besaß (im folgenden wird dieses Derivat als "UK-S1" bezeichnet) wurde eine synthetische DNA mit 17 Basen, aus 5'-GGGGAGAAAACACCACC-3' unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes Applied Biosystems Modell 380A synthetisiert.
Danach wurden 25 Picomol der so erhaltenen synthetischen DNA am 5'-Ende phosphoryliert, indem man die Reaktion in 10 ul T4 Kinase-Puffer in Gegenwart von 5 Einheiten T4 DNA-Kinase (Takara Shuzo) 30 Minuten bei 37ºC durchführte.

(b) Ortsspezifische Mutagenese und Verwendung von zwei Oligonucleotid-Primern

Man ließ eine Lösung, die hergestellt worden war, indem 6,5 ul einer Lösung, die die wie oben beschrieben erhaltene einzelsträngige, rekombinante Phagen-DNA (etwa 2 ug) enthielt, mit 1 ul eines 10-fach konzentrierten Polymerase-Puffers [enthaltend 500 mM Tris-HCl (pH 7,8), 70 mM MgCl&sub2;, 60 mM 2-Mercaptoethano1, 0,25 mM dATP, 0,25 mM dCTP, 0,25 mM dGTP und 0,25 mM dTTP] und mit 2 ul einer Lösung, die die wie oben beschrieben erhaltene synthetische DNA (2,5 Picomol) zur Mutagenese enthielt, vermischt wurden, 5 Minuten bei 65ºC, 5 Minuten bei 55ºC, 10 Minuten bei 37ºC und danach 10 Minuten bei 25ºC stehen. Danach wurden 3 Einheiten des Escherichia coli DNA-Polymerase I Klenow-Fragmentes (Takara Shuzo) (im folgenden kurz als "Klenow-Fragment" bezeichnet) zugegeben, und die Reaktion wurde 30 Minuten bei 25ºC durchgeführt. Danach wurden zum Reaktionsgemisch 1 ul des 10-fach konzentrierten Polymerase-Puffers, 6 ul des M13 Primers M4 mit 0,5 Picomol/ul (Takara Shuzo) und 3 Einheiten des Klenow-Fragmentes gegeben. Nachdem die Reaktion 10 Minuten bei 37ºC und danach 40 Minuten bei 25ºC durchgeführt worden war, wurden 2 ul 10 mM ATP und 300 Einheiten T4 DNA-Ligase zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 11º C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenol-Extraktion und einer Chloroform-Extraktion unterzogen, und ein DNA-Fragment wurde durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde in insgesamt 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 12 Einheiten EcoRI und 12 Einheiten PstI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10- minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein Psti-EcoRI- Fragment (etwa 600 bp) unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
(c) Insertion des mutierten DNA-Fragmentes in einen Vektor:
Etwa 3 ug der im Referenz-Beispiel 3 erhaltenen pUK11 Plasmid-DNA wurden in 30 ul Y-50-Puffer gelöst. 10 Einheiten AatII (Toyobo) und 8 Einheiten PstI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein AatII-Psti-Fragment von etwa 1,0 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 3 ug der im Referenz-Beispiel 8 erhaltenen pUKB101 Plasmid-DNA in 30 ul Y-50-Puffer gelöst. 10 Einheiten AatII und 10 Einheiten EcoRI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehand1ung bei 65ºC wurde ein AatII-EcoRI-Fragment von etwa 2,9 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Das von pUK11 stammende AatII-PstI-Fragment (etwa 0,05 ug) und das von von pUKB101 stammende AatII-EcoRI- Fragment (etwa 0,1 ug), die so erhalten worden waren, wurden zusammen mit den mutierten PstI-EcoRI-Fragment (etwa 600 bp) in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 300 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli C600SF8 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3416 (1975)] zu transformieren, was Ap-resistente Transformanten ergab. Ein rekombinantes Plasmit, pUKS1, das in der Lage war, mit einer Sonde zu hybridisieren, die herstellt worden war, indem die oben erwähnte synthetische DNA zur Mutagenese mit ³²P am 5'-Ende radioaktiv markiert worden war, wurde aus einem der Transformanten unter Verwendung des Kolonie-Hybridisierungsverfahrens isoliert. Eine Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen und eine DNA-Sequenzbestimmung mit dem Didesoxy-Verfahren unter Verwendung des M13-Phagens umfaßte, bestätigte, daß pUKS1 die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 27).

REFERENZ-BEISPIEL 12

Herstellung des t-PA-Expressionsplasmides pSE1PA1-9A:

(1) Herstellung des rekombinanten Plasmides pAGE105M:

Ein Escherichia coli HB101-Transformant, der das Plasmid pAGE28, hergestellt von den Erfindern [Mizukami et al., J. Biochem., 101, 1307-1310 (1987)], enthielt, wurde kultiviert, und die pAGE28-DNA wurde aus den kultivierten Zellen mit Hilfe eines üblichen Verfahrens hergestellt. Etwa 2 ug der erhaltenen pAGE28-DNA wurden in 30 ul Y-100- Puffer gelöst. 8 Einheiten XhoI und 12 Einheiten ScaI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 2,8 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurde ein Escherichia coli HB101-Transformant, der das Plasmid pAGE103, hergestellt von den Erfindern [Mizukami et al., J. Biochem., 101, 1307-1310 (1987)] enthielt, kultiviert, und die pAGE103-DNA wurde aus kultivierten Zellen auf übliche Weise hergestellt. Etwa 3 ug der erhaltenen pAGE103-DNA wurden in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 10 Einheiten EcoRI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach Phenol-Extraktion und Chloroform-Extraktion wurde ein DNA-Fragment durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde in insgesamt 40 ul Polymerase-Puffer gelöst. 6 Einheiten Klenow- Fragment wurden zugegeben, und die Reaktion wurde 1 Stunde bei 15ºC durchgeführt, wodurch die EcoRI-überstehenden Enden in glatte Enden überführt wurden. Die Reaktion wurde durch Phenol-Extraktion beendet, und nach Chloroform-Extraktion wurde ein DNA-Fragment durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde in 30 ul Y-100- Puffer gelöst. 12 Einheiten XhoI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 0,4 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurde ein Escherichia coli-Transformant, der das Plasmid pKCR, herstellt von O'Hara et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)], enthielt, kultiviert, und die pKCR-DNA wurde aus kultivierten Zellen auf übliche Weise hergestellt. Etwa 2 ug der erhaltenen pKCR-DNA wurden in 30 ul Y-150-Puffer gelöst. 12 Einheiten BamHI und 16 Einheiten Sali wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach Phenol-Extraktion und Chloroform-Extraktion wurde ein DNA- Fragment durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde in insgesamt 40 ul Polymerase-Puffer gelöst. 6 Einheiten Klenow-Fragment wurden zugegeben, und die Reaktion wurde 1 Stunde bei 15ºC durchgeführt, wodurch die BamHI- und SalI-überstehenden Enden in glatte Enden überführt wurden. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,85 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Das von pAGE28 stammende DNA-Fragment (etwa 2,8 kb, etwa 0,05 ug), das von pAGE103 stammende DNA-Fragment (etwa 0,4 kb, etwa 0,03 ug) und das von pKCR stammende DNA-Fragment (etwa 1,85 kb, etwa 0,2 ug), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 300 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Kanamycin (im folgenden als "Km" bezeichnet)-resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen umfaßte, wurde festgestellt, daß das Plasmid pAGE105M, das aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 28).

(2) Herstellung des rekombinanten Plasmides pAGE106:

Etwa 2 ug der wie oben beschrieben erhaltenen pAGE105M-DNA wurden in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 12 Einheiten ScaI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 5,0 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden 20 Picomol des EcoRI-Linkers GGAATTCC (Collaborative Research) auf die gleiche, oben beschriebene Weise 5'-phosphoryliert.
Das von pAGE105M stammende DNA-Fragment (etwa 5,0 kb, etwa 0,1 ug), und der 5'-phosphorylierte EcoRI-Linker (1 Picomol), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 100 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Km- resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pAGE106, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 29).

(3) Herstellung des t-PA Expressions-Plasmides pSE1PA1-5:

Etwa 2 ug der wie oben beschrieben erhaltenen pAGE106-DNA wurden in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 12 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 10 Einheiten BamHI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA- Fragment von etwa 5,0 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 3ug der im Referenz-Beispiel 1 erhaltenen ptPA7 Plasmid-DNA in 30 ul Y-0- Puffer gelöst, der 75 mM NaCl enthielt. 12 Einheiten FokI und 12 Einheiten EcoRI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 0,7 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden getrennt davon etwa 3 ug der pTA4-DNA in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 12 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 1 Einheit EcoRI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für eine weitere Stunde bei 37ºC durchgeführt. Unter den oben genannten Bedingungen war der Verdau der DNA mit KpnI vollständig, und derjenige mit EcoRI partiell. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein EcoRI-KpnI-Fragment von etwa 1,4 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden die folgenden zwei synthetischen DNAs (jeweils mit 21 Basen) unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes Applied Biosystems Modell 380A synthetisiert und mit Hilfe desselben, oben erwähnten Verfahrens einzeln 5'- phosphoryliert.
Das von pAGE106 stammende DNA-Fragment (etwa 5,0 kb, etwa 0,1 ug), das von ptPA7 stammende DNA-Fragment (etwa 0,7 kb, etwa 0,1 ug), das von pTA4 stammende EcoRI- KpnI-Fragment (etwa 1,4 kb, etwa 0,05 ug) und die zwei 5'- phosphorylierten sythetischen DNAs (jeweils 1 Picomol), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 50 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Km- resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen und eine DNA-Sequenzbestimmung mit Hilfe des Didesoxy-Verfahrens unter Verwendung des M13-Phagens umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pSE1PA1-5, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 30).

(4) Herstellung des t-PA Expressions-Plasmides pSE1PA1-9:

Etwa 2 ug der wie oben beschrieben erhaltenen pSE1PA1-5-DNA wurden in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 12 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 8 Einheiten HindIII zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA- Fragment von etwa 5,0 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 2 ug pSE1PA1-5- DNA in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 12 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,0 ul 2 M NaCl und 10 Einheiten NcoI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 4,9 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden die folgenden vier synthetischen DNAs (47 Basen, 49 Basen, 49 Basen und 47 Basen; diese synthetischen DNAS bilden einen Teil der 5'-nichttransfertierten Region der t-PA-cDNA) unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes Applied Biosystems Modell 380A synthetisiert und auf die gleiche, oben erwähnte Weise einzeln 5'-phosphoryliert. Basen
Das von pSE1PA1-5 stammende DNA-Fragment mit 5, 0 kb (etwa 0,1 ug), das von pSE1PA1-5 stammende DNA-Fragment mit 4,9 kb (etwa 0,1 ug) und die vier 5'-phosphorylierten synthetischen DNAs (jeweils 1 Picomol), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 50 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Km- resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen und eine DNA-Sequenzbestimmung mit Hilfe des Didesoxy-Verfahrens unter Verwendung des M13-Phagens umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pSE1PA1-9, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 31).

(5) Herstellung des rekombinanten Plasmides pUC19H (um das Ap-Resistenz-Gen portabel zu machen):

Etwa 2 ug der Plasmid-DNA pUC19, hergestellt von Norrander et al. [Norrander, J. et al., Gene, 26, 101 (1983); erhältlich von Takara Shuzo] wurden in 30 ul Y-50- Puffer gelöst. 10 Einheiten HindIII und I Einheit DraI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde I Stunde bei 37ºC durchgeführt. Unter diesen Bedingungen war der Verdau der DNA mit HindIII vollständig, während derjenige mit DraI partiell war. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurden zwei DNA-Fragmente, nämlich ein HindIII-DraI-Fragment von etwa 1,55 kb und ein DraI-HindIII-Fragment von etwa 1,1 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden 20 Picomol des HindIII-Linkers CAAGCTTG (Collaborative Research) auf dieselbe, oben erwähnte Weise 5'-phosphoryliert.
Die von pUC19 stammenden DNA-Fragmente (etwa 1,55 kb und etwa 1,1 kb) und der 5'-phosphorylierte HindIII- Linker (2 Picomol), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 50 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap- resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pUC19H, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 32).

(6) Herstellung des rekombinanten Plasmides pSE1PA1-9A (insertion des Ap-Resistenz-Gens in pSE1PA1-9):

Etwa 2 ug der wie oben beschrieben erhaltenen pUC19H Plasmid-DNA wurden in 30 ul Y-50-Puffer gelöst. 8 Einheiten HindIII wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach Phenol-Extraktion und Chloroform-Extraktion wurde ein DNA-Fragment durch Prazipitation mit Ethanol gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde in insgesamt 40 ul Polymerase-Puffer gelöst. 6 Einheiten Klenow-Fragment wurden zugegeben, und die Reaktion wurde 1 Stunde bei 15ºC durchgeführt, wobei die HindIII- überstehenden Enden in glatte Enden überführt wurden. Die Reaktion wurde durch Phenol-Extraktion beendet, und nach Chloroform-Extraktion wurde ein DNA-Fragment durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde in 30 ul Y-50-Puffer gelöst. 8 Einheiten PvuII wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,4 kb unter Verwendung des AFT- Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 2 ug des wie oben beschrieben erhaltenen t-PA-Expressions-Plasmides pSE1PA1-9 in 30 ul Y-150-Puffer gelöst. 8 Einheiten XhoI und 8 Einheiten EcoRV wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 5,9 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden 3 ug der pAGE28 Plasmid-DNA, die wie oben beschrieben hergestellt worden war, in 30 ul Y-150-Puffer gelöst. 10 Einheiten XhoI und 10 Einheiten EcoRV wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 0,85 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Das von pUC19H stammende DNA-Fragment (etwa 1,4 kb, etwa 0,1 ug), das von pSE1PA1-9 stammende DNA-Fragment (etwa 5,9 kb, etwa 0,1 ug) und das von pAGE28 stammende DNA-Fragment (etwa 0,85 kb, etwa 0,05 ug), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 100 Einheiten T4 DNA- Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Transformanten ergab, die sowohl gegenüber Ap als auch gegenüber Km resistent waren. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pSE1PA1-9A, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 33).

REFERENZ-BETSPIEL 13

Herstellung des Expressions-Plasmides pSEUK1-1A für humane pro-UK:

(1) Herstellung des rekombinanten Plasmides pUKF2:

Etwa 3 ug der im Referenz-Beispiel 3 erhaltenen pUK11 Plasmid-DNA wurden in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 12 Einheiten NcoI und 12 Einheiten HindII wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 0,45 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 8-(1) erhaltenen pUKA2 Plasmid-DNA in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 10 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 10 Einheiten NcoI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,2 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden 2 ug der im Referenz-Beispiel 5 erhaltenen pTerm2 Plasmid-DNA in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 10 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 8 Einheiten HindIII zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 2,85 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Das von pUK11 stammende DNA-Fragment (etwa 0,45 kb, etwa 0,02 ug), das von pUKA2 stammende DNA-Fragment (etwa 1,2 kb, etwa 0,05 ug) und das von pTerm2 stammende DNA-Fragment (etwa 2,85 kb, etwa 0,05 ug), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 50 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap- resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pUKF2, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 34).

(2) Herstellung des rekombinanten Plasmides pUKFpro:

Etwa 2 ug der wie oben beschrieben erhaltenen pUKF2 Plasmid-DNA wurden in 30 ul Y-0-Puffer gelöst, der 25 mM NaCl enthielt. 10 Einheiten BssHII (New England Biolabs) wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 50ºC durchgeführt. Danach wurden 1,0 ul 2 M NaCl und 10 Einheiten HindIII zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 4,3 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden die folgenden 6 synthetischen DNAs (39 Basen, 41 Basen, 41 Basen, 39 Basen, 17 Basen und 17 Basen) synthetisiert und jeweils unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens 5'-phosphoryliert. Basen
Das von pUKF2 stammende DNA-Fragment (etwa 4,3 kb, etwa 0,1 ug) und die sechs 5'-phosphorylierten synthetischen DNAs (jeweils 1 Picomol), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 300 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap- resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen und eine DNA-Sequenzbestimmung mit Hilfe des M13-Didesoxy-Verfahrens umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pUKFpro, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 35).

(3) Herstellung des rekombinanten Plasmides pSEUK1-1A:

Etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 12 erhaltenen pSE1PA1-9A Plasmid-DNA wurden in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 10 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 10 Einheiten HindIII zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 6,3 kb unter Verwendung des AFT- Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 3 ug der wie oben beschrieben erhaltenen pUKFpro Plasmid-DNA in 30 u l Y-0-Puffer gelöst. 15 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 10 Einheiten HindIII zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,55 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Das von pSE1PA1-9A stammende DNA-Fragment (etwa 6,3 kb, etwa 0,1 ug) und das von pUKFpro- stammende DNA- Fragment (etwa 1,55 kb, etwa 0,05 ug), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 100 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap- resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pSEUK1-1A, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 36).

REFERENZ-BEISPIEL 14

Herstellung des t-PA Expressions-Plasmides pSPAS1-9A:

(1) Herstellung des rekombinanten Plasmides pSE1dhfr1A:

Etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 12-(2) erhaltenen pAGE106 Plasmid-DNA wurden in 30 ul Y-50-Puffer gelöst. 12 Einheiten Asp718 (Boehringer-Mannheim) wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach Phenol-Extraktion und Chloroform-Extraktion wurde ein DNA-Fragment durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde in insgesamt 40 ul Polymerase-Puffer gelöst.
6 Einheiten Klenow-Fragment wurden zugegeben, und die Reaktion wurde 1 Stunde bei 15ºC durchgeführt, wobei die Asp718-überstehenden Enden in glatte Enden überführt wurden. Nach Phenol-Extraktion und Chloroform-Extraktion wurde danach ein DNA-Fragment durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen und in insgesamt 30 ul Y-150-Puffer gelöst. 10 Einheiten MluI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 3,3 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Getrennt davon wurden etwa 3 ug der pSV2dhfr Plasmid-DNA, die das dhfr-Gen enthielt [Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1, 854 (1981)] in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 12 Einheiten BglII wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach Phenol-Extraktion und Chloroform-Extraktion wurde ein DNA- Fragment durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde in insgesamt 40 ul Polymerase-Puffer gelöst. 6 Einheiten Klenow-Fragment wurden zugegeben, und die Reaktion wurde 1 Stunde bei 15ºC durchgeführt, wobei die Bglii-überstehenden Enden in glatte Enden überführt wurden. Danach wurde nach Phenol-Extraktion und Chloroform-Extraktion ein DNA-Fragment durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen und in insgesamt 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 12 Einheiten HindII wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 0,75 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden etwa 3 ug der im Referenz-Beispiel 12 erhaltenen pSE1PA1-9A Plasmid-DNA in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 12 Einheiten HindIII wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 1 M NaCl und 12 Einheiten MluI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für weitere 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 2,9 kb unter Verwendung des AFT- Verfahrens gereinigt.
Das von pAGE106 stammende DNA-Fragment (etwa 0,1 ug), das von pSV2dhfr stammende DNA-Fragment (etwa 0,03 ug) und das von pSE1PA1-9A stammende DNA-Fragment (etwa 0,1 ug), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 100 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren , was Ap- resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pSE1dhfr1A, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 37).

(2) Herstellung des rekombinanten Plasmides pSPAS1-9A:

Etwa 3 ug der wie oben beschrieben erhaltenen pSE1dhfr1A Plasmid-DNA wurden in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 12 Einheiten XhoI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach Phenol-Extraktion und Chloroform-Extraktion wurde ein DNA-Fragment durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde in 40 ul Polymerase-Puffer gelöst. 6 Einheiten Klenow-Fragement wurden zugegeben, und die Reaktion wurde 1 Stunde bei 15ºC durchgeführt, wobei die XhoI-überstehenden Enden in glatte Enden überführt wurden. Nach Phenol-Extraktion und Chloroform-Extraktion wurde ein DNA-Fragment durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen und in 30 ul Y-150-Puffer gelöst. 12 Einheiten MluI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 4,4 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Getrennt davon wurden etwa 3 ug der im Referenz- Beispiel 12 erhaltenen pSE1PA1-9A Plasmid-DNA in 30 ul Y- 50-Puffer gelöst. 12 Einheiten ClaI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach Phenol-Extraktion und Chloroform-Extraktion wurde ein DNA-Fragment durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde in 40 ul Polymerase-Puffer gelöst. 6 Einheiten Klenow-Fragment wurden zugegeben, und die Reaktion wurde 1 Stunde bei 15ºC durchgeführt, wodurch die ClaI-überstehenden Enden in glatte Enden überführt wurden. Danach wurde nach Phenol-Extraktion und Chloroform-Extraktion ein DNA-Fragment durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen und in 30 ul Y-150-Puffer gelöst. 12 Einheiten MluI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 6,75 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Das von pSE1dhfr1A stammende DNA-Fragment (etwa 0,1 ug) und das von pSE1PA1-9A stammende DNA-Fragment (etwa 0,1 ug), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 100 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap- resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pSPAS1-9A, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 37).

REFERENZ-BEISPIEL 15

Herstellung des rekombinanten Plasmides pUKT1, das für das pro-UK-Derivat UK-T kodiert:

Etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 3-(3) erhaltenen pUK11 Plasmid-DNA wurden in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 16 Einheiten Eco0109 und 10 Einheiten HindIII wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 0,75 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 10 erhaltenen phPA2 Plasmid- DNA in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. Jeweils 10 Einheiten HindIII und EcoRI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 3,4 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden die folgenden zwei synthetischen DNAs (jeweils mit 43 Basen) synthetisiert und unter Anwendung des bereits oben erwähnten Verfahrens 5'-phosphoryliert.
Das von pUK11 stammende DNA-Fragment (etwa 0,75 kb, etwa 0,1 ug), das von phPA2 stammende DNA-Fragment (etwa 3,4 kb, etwa 0,1 ug) und die zwei 5'-phosphorylierten synthetischen DNAs (jeweils 1 Picomol), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 300 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Apresistente Transformanten ergab. Plasmid-DNAs wurden aus diesen Transformanten isoliert und einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen umfaßte, und einer DNA-Sequenzbestimmung unter Anwendung des M13 Didesoxy- Sequenzierungsverfahrens unterzogen. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß pUKT1 die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 38).

REFERENZ-BEISPIEL 16

Herstellung der UK-T-Expressions-Plasmid-DNA pSEUKT:

Etwa 2 ug der im Referenz-Beispiel 14 erhaltenen pSPAS1-9A Plasmid-DNA wurden in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 10 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaC1 und 10 Einheiten XhoI zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für eine weitere Stunde bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 8,6 kb unter Verwendung des AFT- Verfahrens gereinigt. Getrennt davon wurden etwa 3 ug der pSEUK1-1A Plasmid-DNA in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. 12 Einheiten BglII und 12 Einheiten XhoI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA- Fragment von etwa 0,75 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt. Weiterhin wurden getrennt davon 3 ug der wie oben beschrieben erhaltenen pUKT1 Plasmid-DNA in 30 ul Y-0-Puffer gelöst. 15 Einheiten KpnI wurden zugegeben, und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Danach wurden 1,5 ul 2 M NaCl und 12 Einheiten BglII zugegeben, und die Verdaureaktion wurde für eine weitere Stunde bei 37ºC durchgeführt. Nach 10-minütiger Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,15 kb unter Verwendung des AFT-Verfahrens gereinigt.
Das von pSPAS1-9A stammende DNA-Fragment (etwa 8,6 kb, etwa 0,1 ug), das von pSEUK1-1A stammende DNA-Fragment (etwa 0,75 kb, etwa 0,02 ug) und das von pUKS1 stammende DNA-Fragment (etwa 1,15 kb, etwa 0,02 ug), die so erhalten worden waren, wurden in 20 ul T4 Ligase-Puffer gelöst. 100 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli MM294 zu transformieren, was Ap- resistente Transformanten ergab. Aufgrund einer Strukturanalyse, die einen Verdau mit Restriktionsenzymen umfaßte, wurde festgestellt, daß die Plasmid-DNA pSEUKT, die aus einem dieser Transformanten isoliert worden war, die gewünschte Struktur besaß (siehe Figur 39).
Wie oben detailliert beschrieben worden ist, ermöglicht es die vorliegende Erfindung, Polypeptide, die als thrombolytische Agentien verwendbar sind, im industriellen Maßstab unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie bereitzustellen, und ermöglicht die Verwendung dieser Polypeptide zu therapeutischen Zwecken.
Während die Erfindung detailliert und unter Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen beschrieben worden ist, ist es für den Fachmann offensichtlich, daß verschiedene Änderungen und Modifikationen hierin vorgenommen werden können, ohne vom Sinn und Schutzumfang abzuweichen.

Claims

1. Plasminogen-Aktivator, der eine identische Peptidsequenz mit der natürlich vorkommenden humanen Prourokinase besitzt, mit der Ausnahme, daß die 155. Aminosäure ab dem Serin, der N-terminalen Aminosäure, eine andere als Prolin, der 155. Aminosäure der natürlich vorkommenden humanen Prourokinase, ist, und der gegebenenfalls zusätzlich Methionin am N-Terminus aufweist.

2. Plasminogen-Aktivator gemäß Anspruch 1, worin die 153. Aminosäure ab Serin, der N-terminalen Aminosäure, eine andere als Leucin, der 153. Aminosäure von natürlich vorkommender humaner Prourokinase, ist.

3. Plasminogen-Aktivator gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, wobei die 155. Aminosäure ausgewählt ist unter Asparagin, Asparaginsäure, Alanin, Arginin, Isoleucin, Glycin, Glutamin, Glutaminsäure, Threonin, Serin, Cystein, Tyrosin, Tryptophan, Valin, Histidin, Phenylalanin, Methionin, Lysin und Leucin.

4. Plasminogen-Aktivator gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, wobei die 155. Aminosäure Threonin ist.

5. Plasminogen-Aktivator gemäß Anspruch 2, wobei die 153. Aminosäure ausgewählt ist unter Asparagin und Serin.

6. Plasminogen-Aktivator gemäß Anspruch 2, wobei die 153. Aminosäure Asparagin und die 155. Aminosäure Threonin ist.

7. Plasminogen-Aktivator gemäß Anspruch 2, wobei die 153. Aminosäure Serin und die 155. Aminosäure Threonin ist.

8. Plasminogen-Aktivator gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, der die in der Tabelle 1, Tabelle 2 oder Tabelle 3 dargestellte Peptidsequenz besitzt.

9. Desoxyribonucleinsäure (DNA), die für den Plasminogen-Aktivator gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 codiert.

10. Rekombinante DNA, abgeleitet von der DNA des Anspruchs 9 durch deren Insertion in eine Vektor-DNA.

11. Mikrobielle oder Animalzelle, enthaltend die rekombinante DNA des Anspruchs 10.

12. Verwendung des Plasminogen-Aktivators der Ansprüche 1 oder 2 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention von Zerebralthrombose oder Myocardinfarkt.

13. Pharmazeutisches Mittel zur Prävention oder Behandlung von Zerebralthrombose oder Myocardinfarkt, umfassend eine wirksame Menge des Plasminogen-Aktivators des Anspruchs 1 oder des Anspruchs 2, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.