JP5532401B2 - ヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子に結合するモノクローナル抗体 - Google Patents

ヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子に結合するモノクローナル抗体 Download PDF

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Description

本発明は、細胞膜に結合しているヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子（ｈｅｐａｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、以下ＨＢ−ＥＧＦと記す。）、膜型ＨＢ−ＥＧＦおよび分泌型ＨＢ−ＥＧＦに結合するモノクローナル抗体およびその抗体断片に関する。
ＨＢ−ＥＧＦは、１９９２年に東山らによって、マクロファージに分化したヒトマクロファージ様細胞株Ｕ−９３７の培養上清より、精製、単離された（非特許文献１）。ＨＢ−ＥＧＦは、上皮細胞成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）ファミリーに保存されている６つのシステインを共有しており、ＥＧＦファミリーに属し、またＥＧＦファミリーに属する他のタンパク質と同様に、Ｉ型膜タンパク質として合成される（非特許文献１および２）。膜型ＨＢ−ＥＧＦは、熱や浸透圧によるストレス、増殖因子、サイトカイン、およびＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）アゴニストであるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）などの、様々な生理的刺激によって活性化されたメタロプロテアーゼにより、１４〜２２キロダルトン（以下、ｋＤａと記す）の分泌型ＨＢ−ＥＧＦに変換される（非特許文献１〜３）。分泌型ＨＢ−ＥＧＦは、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１）（非特許文献１）、ＥｒｂＢ４（非特許文献４）およびＮ−アルギニン二塩基転換酵素（非特許文献５）に結合し、線維芽細胞や平滑筋細胞 （非特許文献１）、ケラチノサイト（非特許文献６）、ヘパトサイト（非特許文献７）、メサンギウム細胞（非特許文献８）に対して増殖促進活性を有する。また、心臓弁等の器官形成（非特許文献２８、２９および３１）や創傷治癒（非特許文献９および１０）、アテローム性動脈硬化症で生じる平滑筋細胞の過形成（非特許文献１１）、再狭窄（非特許文献１２および１３）、肺性高血圧（非特許文献１４）、肝再生（非特許文献１５）、脳障害（非特許文献１６）や癌（非特許文献２８〜３５）に、ＨＢ−ＥＧＦが関与すること等も知られている。
一方、細胞表面には相当量の膜型ＨＢ−ＥＧＦが、分泌型へ切断されないまま発現していることが報告されている（非特許文献１７）。膜型ＨＢ−ＥＧＦは、細胞表面でＣＤ９などのテトラスパニンや、インテグリンα３β１と複合体を形成していることが知られており、ジャクスタクライン増殖因子として近接する細胞と相互作用するとの報告もある（非特許文献１７〜２２）。また、Ｎａｇｌｉｃｈらは、膜型ＨＢ−ＥＧＦがジフテリアトキシンのレセプターとして機能し、ジフテリアトキシンの細胞内への進入に関与していることを報告している（非特許文献２３）。
目加田らはＨＢ−ＥＧＦノックアウト（ＫＯ）マウスを作製して、ＨＢ−ＥＧＦの生理的機能を解析した結果、ＨＢ−ＥＧＦ ＫＯマウスは心室の拡張、心機能の低下、および心臓弁肥大の症状を示し、半数以上が生後数日で死亡した。このことは、ＨＢ−ＥＧＦが心臓の発達と機能維持に必須なタンパク質であることを示している（非特許文献２４）。
次に目加田らは、プロテアーゼによる切断部位に変異を入れることにより、分泌型に変換されなくなったＨＢ−ＥＧＦ（以下、ＨＢｕｃと称す。）、および膜貫通領域が欠損したプロテアーゼ非依存的に分泌されるＨＢ−ＥＧＦ（以下、ＨＢ△ｔｍと称す。）の、２種類の遺伝子を作製した。それぞれのＨＢ−ＥＧＦ変異体を発現する遺伝子組換えマウスを作製し、膜型および分泌型ＨＢ−ＥＧＦの生理的機能を解析した（非特許文献２５）。その結果、ＨＢｕｃ発現マウスはＨＢ−ＥＧＦ ＫＯマウスに類似した症状を示したことから、分泌型ＨＢ−ＥＧＦが活性型タンパク質として機能していると考えられた。ＨＢ△ｔｍ発現マウスは新生児期以前または新生児期に大半が死亡した。さらに、対立遺伝子の片方のみに変異を導入したＨＢ△ｔｍ／＋マウスでは、ケラチノサイトの過形成、および新生児期から心室肥大が認められた。これらの症状は、ＨＢ−ＥＧＦ ＫＯマウスやＨＢｕｃ発現マウスとは正反対の表現型であった。ジフテリアトキシンの変異体として知られているＣＲＭ１９７（非特許文献２６）は、ＨＢ−ＥＧＦの細胞増殖促進活性を特異的に阻害し、かつ細胞膜を透過しない。このＣＲＭ１９７が、ＨＢ△ｔｍ発現マウスの表現型である過形成や心室肥大を抑制したことから、ＨＢ△ｔｍ発現マウスで生成したＨＢ△ｔｍは、分泌前に細胞内の受容体に結合して作用するのではなく、細胞外に分泌された後に細胞表面の受容体に結合して作用することが推定されている。したがって、生体内の膜型ＨＢ−ＥＧＦと分泌型ＨＢ−ＥＧＦとの量的バランスが、正常な生理機能の維持に必須であり、また生体内ではＨＢ−ＥＧＦの膜型から分泌型への変換プロセスが、制御されていると考えられる。
東山らは、胸部大動脈を狭窄して心肥大を誘発させたマウスで、心臓内の分泌型ＨＢ−ＥＧＦタンパク質が増加することを見出している。このマウスに、膜型ＨＢ−ＥＧＦを分泌型に変換するプロテアーゼを阻害する低分子化合物を投与すると、心臓における膜型ＨＢ−ＥＧＦの分泌型への変換が抑制された結果、心肥大が抑制されることを報告している（非特許文献２７）。
これまでに、乳癌、肝癌、膵癌、膀胱癌等、種々の癌で、ＨＢ−ＥＧＦが正常組織と比較して高発現していることが報告されている（非特許文献２８〜３１）。また、最近、ＨＢ−ＥＧＦが癌の増殖に重要な因子であることが明らかにされた（非特許文献３２および３３）。目加田らは、ヌードマウスにヒト卵巣癌細胞株を移植するモデル系において、ＨＢ−ＥＧＦのｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を癌細胞株へ導入すること、あるいは癌細胞株を移植したマウスにＣＲＭ１９７を投与することにより、顕著な腫瘍増殖阻害効果が認められることを明らかにした。また、東山らは、膀胱癌の細胞株にＨＢ−ＥＧＦ遺伝子を導入した株で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞増殖、コロニー形成能、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）発現およびサイクリンＤ１などの発現が増加することを明らかにした。また、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても、ヌードマウスにおける造腫瘍性の亢進や腫瘍血管新生の亢進が認められることを報告した。このような増殖促進作用は、膜型ＨＢ−ＥＧＦまたは分泌型ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子を発現させた場合にのみ認められ、プロテアーゼ抵抗性膜型ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子を強制発現させた場合には、認められなかった。したがって、分泌型ＨＢ−ＥＧＦは、卵巣癌や膀胱癌の腫瘍増殖に関わる重要な因子である可能性が示唆された。臨床患者のＨＢ−ＥＧＦ発現に関しては、目加田らが、卵巣癌患者の腫瘍組織中のＨＢ−ＥＧＦ ｍＲＮＡ発現量および腹水中の分泌型ＨＢ−ＥＧＦタンパク質濃度を解析した結果、ＥＧＦファミリーの中でＨＢ−ＥＧＦのみが発現亢進していることを報告している（非特許文献３２）。更に宮本らは、腫瘍のＨＢ−ＥＧＦｍＲＮＡが高発現している卵巣癌患者では、低発現の患者に比べて予後が不良であることを報告した（非特許文献３４）。以上の結果は、少なくとも卵巣癌において、癌の産生する分泌型ＨＢ−ＥＧＦがオートクラインもしくはパラクラインの機序で、癌の増殖に関与していることを示している（非特許文献３５）。分泌型ＨＢ−ＥＧＦに結合して活性を阻害する抗体としてはいくつかのポリクローナル抗体と、１種のモノクローナル抗体（ともにＲ＆Ｄ社製）が知られている。抗ＨＢ−ＥＧＦヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社製）は、ＣＯＳ−７細胞に発現させた細胞表面の膜型ＨＢ−ＥＧＦに結合することが、報告されている（非特許文献３）。膜型タンパク質が癌などの細胞表面に存在する場合、そのタンパク質に結合するモノクローナル抗体が該細胞の増殖を阻害する治療薬となり得ることが広く知られている（非特許文献３６）。
一般にヒト以外の動物の抗体、例えばマウス抗体などをヒトに投与すると、異物として認識されることにより、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＨＡＭＡ）が誘導されることが知られている。ＨＡＭＡは投与されたマウス抗体と反応し、副作用を引き起こしたり（非特許文献３７〜４０）、マウス抗体の体内からの消失を速め（非特許文献３８、４１、４２）、マウス抗体の治療効果を減じてしまうことが知られている（非特許文献４３、４４）。
これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してヒト以外の動物の抗体からヒト型キメラ抗体やヒト化抗体などの遺伝子組換え抗体の作製が試みられている。
ヒト型キメラ抗体やヒト化抗体は、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体と比較してヒトへの臨床応用上、様々な利点を有している。例えば、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が延長したことが報告されている（非特許文献４５、４６）。すなわち、ヒト型キメラ抗体やヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒトにおいて副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される。
また、ヒト型キメラ抗体やヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して作製するため、様々な形態の分子として作製することができる。例えば、ヒト抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と表記する）定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）（Ｈ鎖Ｃ領域を、ＣＨと表記する）としてγ１サブクラスを使用すれば、抗体依存性細胞傷害（以下、ＡＤＣＣと表記する）活性などのエフェクター機能の高いヒト型キメラ抗体やヒト化抗体を作製することができ（非特許文献１４）、かつ、マウス抗体に比べ血中半減期の延長が期待される（非特許文献４６）。特に膜型ＨＢ−ＥＧＦを発現した細胞や、分泌型ＨＢ−ＥＧＦが細胞膜に結合している細胞を減少させる治療においては、抗体のＦｃ領域（抗体Ｈ鎖のヒンジ領域以降の領域）を介した補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）やＡＤＣＣ活性等の細胞傷害活性の高さがその治療効果に重要であるために、ヒト型キメラ抗体やヒト化抗体はマウス抗体などのヒト以外の動物の抗体と比較して望ましい（非特許文献４７、４８）。
さらに、ヒト型キメラ抗体やヒト化抗体は、最近の蛋白質工学、遺伝子工学の進歩により、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖと表記する）（非特許文献４９）、２量体化Ｖ領域断片（以下、Ｄｉａｂｏｄｙと表記する）（非特許文献５０）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（以下、ｄｓＦｖと表記する）（非特許文献５１）、ＣＤＲを含むペプチド（非特許文献５２）などの、分子量の小さい抗体断片としても作製でき、これらの抗体断片は、完全な抗体分子に比べ、標的組織への移行性に優れている（非特許文献５３）。
以上の事実は、ヒトへの臨床応用に用いる抗体としては、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体よりもヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体または該抗体断片の方が望ましいことを示している。
Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２５１，９３６，１９９１ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７（１９９２）６２０５−６２１２ Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４０２，８８４，１９９９ ＥＭＢＯ Ｊ． １６（１９９７）１２６８−１２７８ ＥＭＢＯ Ｊ． ２０（２００１）３３４２−３３５０ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１９９４）２００６０−２００６６ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９８（１９９４）２５−３１ Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １８９（１９９９）４３１−４３８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０（１９９３）３８８９−３８９３ Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １５１（２０００）２０９−２１９ Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．，９５，４０４，１９９５ Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． １６ （１９９６）１５２４−１５３１ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７ （２００２）３７４８７−３７４９１ Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４３（１９９３）７８４−７９３ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２２ （１９９５） １５８４−１５９０ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ８２７（１９９９）１３０−１３８ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，Ｖｏｌ．１３３３，Ｆ１７９，１９９７ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２８ （１９９５）９２９−９３８ Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２９（１９９５）１６９１−１７０５ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．，Ｖｏｌ．１１，３３５，２０００ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．９８，５０５，２００２ Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．４９，４３９，２００１ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．６９，１０５１，１９９２ ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．１００，３２２１，２００３ Ｊ． ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６３，４６９，２００３ Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７０，１０１５，１９９５ Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．８，３５，２００２ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ．，Ｖｏｌ．６７，８１，２００１ Ｏｎｃｏｌ． Ｒｅｐ．，Ｖｏｌ．８，９０３，２００１ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．２０２，１７０５，１９９４ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６１，６２２７，２００１ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６４，５７２０，２００４ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６４，５２８３，２００４ Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１１，４７８３， ２００５ Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１１，４６３９， ２００５ Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．，Ｖｏｌ．２，５２−６２，２００３ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２，８８１（１９８４） Ｂｌｏｏｄ，６５，１３４９（１９８５） Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８０，９３２（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，１２４２（１９８５） Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２６，１０１１（１９８５） Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８０，９３７（１９８８） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５，１５３０（１９８５） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４６，６４８９（１９８６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，１１１８（１９９６） Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８５，６６８（１９９５） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４，１３８２（１９９０） Ｎａｔｕｒｅ，３２２，３２３（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，６２９（１９９７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２，２４９（１９９５） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２９６６（１９９６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２，３４０２（１９９２）
ＨＢ−ＥＧＦが関与する疾患を治療するための医薬が求められている。
本発明は以下の（１）〜（２８）に関する。
（１）細胞膜に結合しているＨＢ−ＥＧＦ、膜型ＨＢ−ＥＧＦおよび分泌型ＨＢ−ＥＧＦに結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片。
（２）細胞膜に結合しているＨＢ−ＥＧＦ、膜型ＨＢ−ＥＧＦおよび分泌型ＨＢ−ＥＧＦの上皮増殖因子様ドメイン（ＥＧＦ様ドメイン）に結合する（１）記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
（３）分泌型ＨＢ−ＥＧＦとＨＢ−ＥＧＦ受容体との結合を阻害する、（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
（４）分泌型ＨＢ−ＥＧＦに対して中和活性を有する（１）〜（３）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
（５）分泌型ＨＢ−ＥＧＦと、ＨＢ−ＥＧＦ受容体またはジフテリアトキシンとの結合領域に結合する（１）〜（４）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
（６）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１３３番目、１３５番目、および１４７番目のうち、少なくとも１つのアミノ酸を含むエピトープに結合する（１）〜（５）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
（７）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１３３番目、１３５番目および１４７番目のアミノ酸を含むエピトープに結合する（６）に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
（８）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１４１番目のアミノ酸を含むエピトープに結合する（１）〜（５）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
（９）ハイブリドーマＫＭ３５７９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４９１）が生産するモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する（１）〜（３）、（５）および（８）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
（１０）ハイブリドーマＫＭ３５６７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５７３）が生産するモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する（１）〜（７）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
（１１）ハイブリドーマＫＭ３５６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４９０）が生産するモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する（１）〜（７）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
（１２）モノクローナル抗体が、遺伝子組換え抗体である、（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
（１３）遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる、（１２）に記載の抗体またはその抗体断片。
（１４）抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨと記す）の相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲと記す）１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１２、１３および１４で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体の軽鎖可変領域（以下、ＶＬと記す）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１５、１６および１７で表されるアミノ酸配列を含む、（１３）に記載の遺伝子組換え抗体またはその抗体断片。
（１５）ヒト型キメラ抗体のＶＨが、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、ＶＬが、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む、（１３）に記載のヒト型キメラ抗体またはその抗体断片。
（１６）ヒト化抗体のＶＨが、配列番号２２で表されるアミノ酸配列または配列番号２２で表されるアミノ酸配列の９番目のＡｌａをＴｈｒに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４１番目のＰｒｏをＴｈｒに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１８番目のＶａｌをＬｅｕに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含み、かつ、
ヒト化抗体のＶＬが、配列番号２３で表されるアミノ酸配列または配列番号２３で表されるアミノ酸配列の１５番目のＬｅｕをＶａｌに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、４９番目のＰｒｏをＳｅｒに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、（１３）に記載のヒト化抗体またはその抗体断片。
（１７）ヒト化抗体のＶＨが、配列番号２２で表されるアミノ酸配列の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１８番目のＶａｌをＬｅｕに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含み、かつ、
ヒト化抗体のＶＬが、配列番号２３で表されるアミノ酸配列または配列番号２３で表されるアミノ酸配列の１５番目のＬｅｕをＶａｌに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、４９番目のＰｒｏをＳｅｒに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、（１３）に記載のヒト化抗体またはその抗体断片。
（１８）ヒト化抗体のＶＨが、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む、（１３）に記載のヒト化抗体またはその抗体断片。
（１９）ヒト化抗体のＶＨが、配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む、（１３）に記載のヒト化抗体またはその抗体断片。
（２０）ヒト化抗体のＶＨが、配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む、（１３）に記載のヒト化抗体またはその抗体断片。
（２１）抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）および６個のＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（１）〜（２０）のいずれか１項に記載の抗体断片。
（２２）（１）〜（２１）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片をコードするＤＮＡ。
（２３）（２２）に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
（２４）（２３）に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（２５）（２４）に記載の形質転換体を培地で培養し、培養物中に（１）〜（２１）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする（１）〜（２１）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片の製造方法。
（２６）（１）〜（２１）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片を有効成分として含有する医薬。
（２７）（１）〜（２１）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片を有効成分として含有する、ＨＢ−ＥＧＦが関与する疾患の治療剤。
（２８）ＨＢ−ＥＧＦが関与する疾患が癌である、（２７）に記載の治療剤。
本発明によれば、細胞膜に結合しているＨＢ−ＥＧＦ、膜型ＨＢ−ＥＧＦおよび分泌型ＨＢ−ＥＧＦに結合するモノクローナル抗体を提供することができる。
バインディングＥＬＩＳＡにおける各種抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体の反応性を示す。上段にヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質に対するバインディングＥＬＩＳＡの結果、下段に陰性対象としたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対するバインディングＥＬＳＡの結果を示す。横軸に各抗体の濃度を、縦軸に各抗体の結合活性を示す。◇はモノクローナル抗体ＫＭ５１１、■はモノクローナル抗体ＫＭ３５６６、△はモノクローナル抗体ＫＭ３５６７、▲はモノクローナル抗体ＫＭ３５７９、○はモノクローナル抗体ＭＡＢ２５９をそれぞれ表す。 抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６、ＫＭ３５６７、ＫＭ３５７９およびＭＡＢ２５９のＨＢ−ＥＧＦ−ＥＧＦＲ結合阻害活性を示す。横軸に各抗体の濃度を、縦軸にビオチン標識ＨＢ−ＥＧＦの結合を蛍光強度で示す。横ばいの実線はビオチン標識ＨＢ−ＥＧＦ添加、抗体非添加時の蛍光強度、横ばいの点線はビオチン標識ＨＢ−ＥＧＦ非添加、抗体非添加時の蛍光強度を示す。△はモノクローナル抗体ＫＭ３５６６、×はモノクローナル抗体ＫＭ３５６７、●はモノクローナル抗体ＫＭ３５７９、■はモノクローナル抗体ＭＡＢ２５９をそれぞれ表す。 各種抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体のＨＢ−ＥＧＦ中和活性を示す。横軸に各抗体の濃度を、縦軸に増殖阻害率（％）を示す。◇はモノクローナル抗体ＫＭ５１１、■はモノクローナル抗体ＫＭ３５６６、▲はモノクローナル抗体ＫＭ３５７９、○はモノクローナル抗体ＭＡＢ２５９をそれぞれ表す。 各種抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体のＨＢ−ＥＧＦ中和活性を示す。横軸に各抗体の濃度を、縦軸に細胞増殖を示す。ＨＢ−ＥＧＦ（＋）は、ＨＢ−ＥＧＦ添加、抗体非添加時の細胞増殖、ＨＢ−ＥＧＦ（−）は、ＨＢ−ＥＧＦ非添加、抗体非添加時の細胞増殖を示す。□はモノクローナル抗体ＭＡＢ２５９、■はモノクローナル抗体ＫＭ３５６７、▲はモノクローナル抗体ＫＭ３５６６をそれぞれ表す。 ＦＣＭ解析における各種抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体の反応性を示す。横軸に各抗体の濃度を、縦軸に平均蛍光強度ＭＦＩ値を示す。×はモノクローナル抗体ＫＭ５１１、△はモノクローナル抗体ＫＭ３５６６、□はモノクローナル抗体ＫＭ３５７９、○はモノクローナル抗体ＭＡＢ２５９をそれぞれ表す。破線は抗体非添加陰性対照（抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体非添加、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体添加時）の平均蛍光強度ＭＦＩ値を表す。 ＦＣＭ解析における、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する各種抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体の反応性を示す。各ヒストグラムの左のピークは陰性対照抗体ＫＭ５１１、右のピークは各抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体を示す。（ａ）ＭＡＢ５２９、（ｂ）ＫＭ３５６６、（ｃ）ＫＭ３５６７、（ｄ）ＫＭ３５７９を示す。 抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３５６６の造成工程を示す。 精製した抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５−２０％グラジュエントゲル使用）の泳動パターンを示す。レーン１が分子量マーカー、レーン２が還元条件下、レーン３が非還元条件下における、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６を示す。 フローサイトメトリーでの、ヒト固形癌細胞株に対する抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６の反応性を示す。図の縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度を示す。 フローサイトメトリーでの、リコンビナントＨＢ−ＥＧＦを処理したヒト固形癌細胞株に対する、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６の反応性を示す。図の縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度を示す。 抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６のヒトＨＢ−ＥＧＦに対する中和活性を示す。図の縦軸は生細胞数を表す。ＯＤ４５０ｎｍの吸光度値を、横軸は抗体濃度を示す。■は陰性対照抗体ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、□はＫＭ３９６６を示す。ＨＢ−ＥＧＦ（−）はＨＢ−ＥＧＦ非添加、ＨＢ−ＥＧＦ（＋）はＨＢ−ＥＧＦ添加を示す。 抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６のヒト固形癌細胞株に対する抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を示す。図の縦軸は細胞傷害活性率（％）を、横軸は抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６の抗体濃度を示す。横ばいの直線は抗体非添加時の細胞傷害活性を示す。 抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６の初期癌モデルにおける抗腫瘍活性を示す。図の縦軸は腫瘍体積を、横軸は癌細胞移植後の日数を表す。●はＰＢＳ投与群、○はＫＭ３９６６ １０ｍｇ／ｋｇ投与群を示す。バーは標準偏差を示す。 抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６の進行癌モデルにおける抗腫瘍活性を示す。図の縦軸は腫瘍体積を、横軸は癌細胞移植後の日数を表す。●はＰＢＳ投与群、○はＫＭ３９６６ １０ｍｇ／ｋｇ投与群を示す。バーは標準偏差を示す。 フローサイトメトリーでの抗ＨＢ−ＥＧＦマウス抗体ＫＭ３５６６のヒト血液癌細胞株に対する反応性を示す。図の縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度を示す。Ａは急性骨髄性白血病細胞株、ＢはＴ細胞性白血病細胞株を示す。 抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６のヒト血液癌細胞株に対する抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を示す。図の縦軸は細胞傷害活性率（％）を、横軸は抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６の抗体濃度を示す。横ばいの直線は抗体非添加時の細胞傷害活性を示す。 抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のヒト卵巣癌細胞株ＭＣＡＳに対する反応性を示す。図の縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度を示す。 抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のヒト胃癌細胞株ＭＫＮ−２８に対する中和活性を示す。縦軸には、リコンビナントヒトＨＢ−ＥＧＦ添加時の細胞増殖を１とした時の細胞増殖を示し、横軸には添加したリコンビナントヒトＨＢ−ＥＧＦおよび抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のタンパク質濃度を示す。 抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のヒト血液癌細胞株に対する抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を示す。図の縦軸は細胞傷害活性率（％）を、横軸は抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体の抗体濃度を示す。横ばいの直線は抗体非添加時の細胞傷害活性を示す。 抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６、ＫＭ３５７９、およびキメラ抗体ＫＭ３９６６の変異ＨＢ−ＥＧＦ発現細胞に対する反応性を示す。図の縦軸は各抗体の反応性（％）を、横軸は変異ＨＢ−ＥＧＦの種類を示す。
本発明において、膜型ＨＢ−ＥＧＦとは、細胞膜貫通ドメインを有して細胞膜に結合し、かつシグナル配列、プロ領域、ヘパリン結合ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、ジャクスタメンブレンドメイン、細胞質ドメインから構成されるＨＢ−ＥＧＦをいう。具体的には配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドがあげられる。また、本発明において、分泌型ＨＢ−ＥＧＦとは、膜型ＨＢ−ＥＧＦの膜結合部位がプロテアーゼ等で切断された、ＥＧＦ様ドメインを含む細胞外ドメインをいう。具体的には配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドがあげられる。細胞膜に結合しているＨＢ−ＥＧＦとは、分泌型ＨＢ−ＥＧＦが、そのヘパリン結合活性および静電気的結合活性などにより、細胞膜表面に結合しているＨＢ−ＥＧＦをいう。
細胞膜において、分泌型ＨＢ−ＥＧＦが結合する物質としては、細胞膜上に存在し、分泌型ＨＢ−ＥＧＦが結合する物質であれば、いかなるものでも良いが、具体的には多糖類、より好ましくはグリコサミノグリカンがあげられ、特に好ましくはヘパラン硫酸などがあげられる。
ＨＢ−ＥＧＦはジフテリアトキシン、ＥＧＦ受容体ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４と結合する活性を有する。
膜型ＨＢ−ＥＧＦとしては、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のタンパク質などがあげられる。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ジフテリアトキシンが結合する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ジフテリアトキシンが結合するタンパク質；
また、分泌型ＨＢ−ＥＧＦとしては、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のタンパク質などがあげられる。
（ａ）配列番号３、４または５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号３、４または５で表されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＥＧＦ受容体ＥｒｂＢ１、またはＥｒｂＢ４が結合する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３、４または５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＥＧＦ受容体ＥｒｂＢ１、またはＥｒｂＢ４が結合するタンパク質；
配列番号２、３、４または５で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ジフテリアトキシンまたはＥＧＦ受容体ＥｒｂＢ１、またはＥｒｂＢ４が結合するタンパク質とは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｐｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、などに記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号２、３、４または５で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡに、部位特異的変異を導入することにより取得できるタンパク質を意味する。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記部位特異的変異導入法などの周知の技術により、欠失、置換、もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、配列番号２、３、４または５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、ジフテリアトキシン、ＥＧＦ受容体ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４が結合するタンパク質とは、配列番号２、３、４または５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ、ジフテリアトキシン、ＥＧＦ受容体ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４が結合する活性を有するタンパク質である。
相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であって、塩基配列はＢＬＡＳＴ［（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．），２１５，４０３（１９９０）］に従って、デフォルトパラメーターを用いて算出される数値などがあげられる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， ２５，３３８９（１９９７）］；ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．），７，６４９（１９９７）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌにおいてデフォルトパラメーターを用いて算出される数値などがあげられる。デフォルトパラメーターとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、−Ｅ（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、−ｑ（ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｓｍａｔｃｈ）が−３、−ｒ（ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍａｔｃｈ）が１、−ｅ（ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ）が１０、−Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸残基の場合は３残基、−ｙ（Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ） ｆｏｒ ｂｌａｓｔ ｅｘｔｅｍｓｉｏｎｓ ｉｎ ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）。また、アミノ酸配列の解析ソフトとしてはＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）］などもあげられる。
本発明の抗体は、細胞膜に結合しているＨＢ−ＥＧＦ、膜型ＨＢ−ＥＧＦおよび分泌型ＨＢ−ＥＧＦに結合するモノクローナル抗体であって、細胞膜に結合しているＨＢ−ＥＧＦ、膜型ＨＢ−ＥＧＦおよび分泌型ＨＢ−ＥＧＦの上皮増殖因子様ドメイン（ＥＧＦ様ドメイン）に結合するモノクローナル抗体を包含する。
ＥＧＦ様ドメインとは、具体的には配列番号４または５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあげられる。
当該ＥＧＦ様ドメインに結合する抗体とは、分泌型ＨＢ−ＥＧＦとＨＢ−ＥＧＦ受容体との結合を阻害するモノクローナル抗体を包含する。
分泌型ＨＢ−ＥＧＦとＨＢ−ＥＧＦ受容体の結合を阻害する抗体としては、分泌型ＨＢ−ＥＧＦと、ＨＢ−ＥＧＦ受容体またはジフテリアトキシンとの結合領域に結合するモノクローナル抗体などがあげられる。
本発明の抗体は、分泌型ＨＢ−ＥＧＦに対して中和活性を有する抗体を包含する。本発明において中和活性としては、分泌型ＨＢ−ＥＧＦの生物活性を抑制する活性をいい、例えば、ＨＢ−ＥＧＦ受容体が発現している細胞の細胞増殖を抑制する活性などがあげられる。
本発明の抗体の具体例としては、配列番号２で表されるアミノ酸を有するポリペプチドの１１５番目から１４７番目のアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、好ましくは１３３番目から１４７番目のうち、少なくとも１つのアミノ酸を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、より好ましくは１１５番目、１２２番目、１２４番目、１２５番目、１２７番目、１２９番目、１３３番目、１３５番目、１４１番目、および１４７番目のアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、更に好ましくは１３３番目、１３５番目、および１４７番目のアミノ酸のうち、少なくとも１３３番目および１３５番目のアミノ酸を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、最も好ましくは１３３番目、１３５番目および１４７番目のアミノ酸を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体などがあげられる。
更に具体的には、ハイブリドーマＫＭ３５６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４９０）、ハイブリドーマＫＭ３５６７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５７３）が生産するモノクローナル抗体、またはハイブリドーマＫＭ３５７９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４９１）が生産するモノクローナル抗体と競合反応するモノクローナル抗体、およびこれらモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合するモノクローナル抗体が、本発明の抗体として例示される。
中和活性を有する抗体の具体例としては、配列番号２で表されるアミノ酸を有するポリペプチドの１３３番目、１３５番目および１４７番目のアミノ酸を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体があげられる。
モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基とも言う）を認識し、アミノ酸配列（１次構造）が均一である。本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマが産生する抗体、遺伝子組換え抗体などがあげられる。
エピトープとは、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、糖鎖が結合したアミノ酸配列および糖鎖が結合したアミノ酸配列からなる立体構造などがあげられる。本発明のエピトープとしては具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸を有するポリペプチドの１１５番目から１４７番目のアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸を含むエピトープ、より好ましくは１１５番目、１２２番目、１２４番目、１２５番目、１２７番目、１２９番目、１３３番目、１３５番目、１４１番目、および１４７番目のアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸を含むエピトープ、更に好ましくは１３３番目、１３５番目、および１４７番目のアミノ酸のうち、少なくとも１３３番目および１３５番目のアミノ酸を含むエピトープ、最も好ましくは１３３番目、１３５番目および１４７番目のアミノ酸を含むエピトープなどがあげられる。
ハイブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、ミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる所望の抗原特異性を有するモノクローナル抗体を生産する細胞をいう。
遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはそれらの抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。
本発明の遺伝子組換え抗体の具体例としては、抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１２、１３および１４でそれぞれ表されるアミノ酸配列、および抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１５、１６および１７で表されるアミノ酸配列を含む遺伝子組換え抗体があげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬとヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨと表記する）および軽鎖定常領域（以下、ＣＬと表記する）とからなる抗体をいう。
本発明のヒト型キメラ抗体は、以下のようにして作製することができる。まず、細胞膜に結合しているＨＢ−ＥＧＦ、分泌型ＨＢ−ＥＧＦおよび膜型ＨＢ−ＥＧＦに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得する。取得したｃＤＮＡを、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入を行い、発現させることにより、ヒト型キメラ抗体を製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
本発明のヒト型キメラ抗体としては、具体的には、抗体のＶＨが配列番号９で表されるアミノ酸配列および抗体のＶＬが配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体などがあげられ、ヒト型キメラ抗体ＫＭ３９６６などがあげられる。
ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいい、ＣＤＲ移植抗体、再構成抗体（ｒｅｓｈａｐｅｄ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）などともいう。
本発明のヒト化抗体は、以下のように作製することができる。まず、ハイブリドーマが産生する、細胞膜に結合しているＨＢ−ＥＧＦ、分泌型ＨＢ−ＥＧＦおよび膜型ＨＢ−ＥＧＦに結合する、ヒト以外の動物のモノクローナル抗体の、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと記す）に移植した可変領域をコードするｃＤＮＡを作製する。作製したｃＤＮＡを、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築する。次に、作製したヒト化抗体発現ベクターを、動物細胞へ導入してヒト化抗体を発現させることにより、ヒト化抗体を製造することができる。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列であれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、またはＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）などに記載の、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列などが用いられる。
ヒト化抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト化抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
本発明のヒト化抗体としては、具体的には、抗体のＶＨが配列番号２２で表されるアミノ酸配列、または配列番号２２で表されるアミノ酸配列中の９番目のＡｌａ、２０番目のＶａｌ、３０番目のＴｈｒ、３８番目のＡｒｇ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、９５番目のＴｙｒおよび１１８番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列および／または抗体のＶＬが、配列番号２３で表されるアミノ酸配列、または配列番号２３で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＬｅｕ、１９番目のＡｌａ、２１番目のＩｌｅ、４９番目のＰｒｏおよび８４番目のＬｅｕから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列をそれぞれ含むヒト化抗体などがあげられるが、導入される改変の数に特に制限はない。
例えば、以下に示すヒト化抗体があげられる。
抗体のＶＨのアミノ酸配列については、抗体のＶＨが配列番号２２で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌ、３０番目のＴｈｒ、３８番目のＡｒｇ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、９５番目のＴｙｒ、および１１８番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するヒト化抗体。
好ましくは抗体のＶＨが配列番号２２で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌ、３０番目のＴｈｒ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、９５番目のＴｙｒ、および１１８番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するヒト化抗体。
好ましくは３０番目のＴｈｒ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、９５番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するヒト化抗体。
好ましくは３０番目のＴｈｒ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するヒト化抗体。
好ましくは３０番目のＴｈｒ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、９５番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するヒト化抗体。
好ましくは３０番目のＴｈｒ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するヒト化抗体。
好ましくは３０番目のＴｈｒ、７０番目のＩｌｅが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト化抗体などがあげられる。
上記のアミノ酸改変の結果得られる抗体ＶＨのアミノ酸配列としては、配列番号２２で表されるアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＴｈｒに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４１番目のＰｒｏをＴｈｒに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１８番目のＶａｌをＬｅｕに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列があげられる。
１１個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２２で表されるアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＴｈｒに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４１番目のＰｒｏをＴｈｒに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１８番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列があげられる。
１０個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２２で表されるアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＴｈｒに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４１番目のＰｒｏをＴｈｒに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列などがあげられる。
９個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２２で表されるアミノ酸配列中の
９番目のＡｌａをＴｈｒに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、４１番目のＰｒｏをＴｈｒに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列、
および
２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１８番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、などがあげられる。
８個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２２で表されるアミノ酸配列中の
９番目のＡｌａをＴｈｒに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、４１番目のＰｒｏをＴｈｒに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列、
２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１８番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、および
２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１８番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、などがあげられる。
７個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２２で表されるアミノ酸配列中の
９番目のＡｌａをＴｈｒに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、４１番目のＰｒｏをＴｈｒに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列、および
２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１８番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
６個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２２で表されるアミノ酸配列中の
９番目のＡｌａをＴｈｒに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列、および
２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列、などがあげられる。
５個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２２で表されるアミノ酸配列中の
９番目のＡｌａをＴｈｒに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、および
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列、などがあげられる。
４個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２２で表されるアミノ酸配列中の
９番目のＡｌａをＴｈｒに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、４１番目のＰｒｏをＴｈｒに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列、および
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および１１８番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
３個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２２で表されるアミノ酸配列中の
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
９番目のＡｌａをＴｈｒに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、４１番目のＰｒｏをＴｈｒに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列、および
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および１１８番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
２個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２２で表されるアミノ酸配列中の
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
９番目のＡｌａをＴｈｒに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
２０番目のＶａｌをＬｅｕに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
４１番目のＰｒｏをＴｈｒに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
６８番目のＶａｌをＡｌａに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列、
７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および１１８番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
９番目のＡｌａをＴｈｒに、および３０番目のＴｈｒをＡｒｇに置換したアミノ酸配列、
２０番目のＶａｌをＬｅｕに、および３０番目のＴｈｒをＡｒｇに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、および３８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、および４１番目のＰｒｏをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、および６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、および６８番目のＶａｌをＡｌａに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列、および
３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、および１１８番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
１個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２２で表されるアミノ酸配列中の
９番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、２０番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに置換したアミノ酸配列、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列、４１番目のＰｒｏをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列、６８番目のＶａｌをＡｌａに置換したアミノ酸配列、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列、および１１８番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、があげられる。
抗体のＶＬについては、例えば配列番号２３で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＬｅｕ、１９番目のＡｌａ、２１番目のＩｌｅ、および８４番目のＬｅｕが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列があげられる。
好ましくは、配列番号２３で表されるアミノ酸配列中の１９番目のＡｌａ、２１番目のＩｌｅ、および８４番目のＬｅｕが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列があげられる。
上記のアミノ酸改変の結果得られるＶＬのアミノ酸配列としては、配列番号２３で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＬｅｕをＶａｌに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、４９番目のＰｒｏをＳｅｒに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列があげられる。
５個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２３で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＬｅｕをＶａｌに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、４９番目のＰｒｏをＳｅｒに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列などがあげられる。
４個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２３で表されるアミノ酸配列中の
１５番目のＬｅｕをＶａｌに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、および４９番目のＰｒｏをＳｅｒに置換したアミノ酸配列、
１５番目のＬｅｕをＶａｌに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列、
１５番目のＬｅｕをＶａｌに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、４９番目のＰｒｏをＳｅｒに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列、
１５番目のＬｅｕをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、４９番目のＰｒｏをＳｅｒに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列、および
１９番目のＡｌａをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、４９番目のＰｒｏをＳｅｒに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
３個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２３で表されるアミノ酸配列中の
１５番目のＬｅｕをＶａｌに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、および２１番目のＩｌｅをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
１５番目のＬｅｕをＶａｌに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、および４９番目のＰｒｏをＳｅｒに置換したアミノ酸配列、
１５番目のＬｅｕをＶａｌに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列、
１５番目のＬｅｕをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、および４９番目のＰｒｏをＳｅｒに置換したアミノ酸配列、
１５番目のＬｅｕをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列、
１５番目のＬｅｕをＶａｌに、４９番目のＰｒｏをＳｅｒに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列、
１９番目のＡｌａをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、および４９番目のＰｒｏをＳｅｒに置換したアミノ酸配列、
１９番目のＡｌａをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列、
１９番目のＡｌａをＶａｌに、４９番目のＰｒｏをＳｅｒに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列、および
２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、４９番目のＰｒｏをＳｅｒに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
２個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２３で表されるアミノ酸配列中の
１５番目のＬｅｕをＶａｌに、および１９番目のＡｌａをＶａｌに置換したアミノ酸配列、
１５番目のＬｅｕをＶａｌに、および２１番目のＩｌｅをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
１５番目のＬｅｕをＶａｌに、および４９番目のＰｒｏをＳｅｒに置換したアミノ酸配列、
１５番目のＬｅｕをＶａｌに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列、
１９番目のＡｌａをＶａｌに、および２１番目のＩｌｅをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
１９番目のＡｌａをＶａｌに、および４９番目のＰｒｏをＳｅｒに置換したアミノ酸配列、
１９番目のＡｌａをＶａｌに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列、
２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、および４９番目のＰｒｏをＳｅｒに置換したアミノ酸配列、
２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列、
および４９番目のＰｒｏをＳｅｒに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
１個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２３で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列、１９番目のＡｌａをＶａｌに置換したアミノ酸配列、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、４９番目のＰｒｏをＳｅｒに置換したアミノ酸配列、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列、などがあげられる。
本発明のヒト化抗体の具体例としては、可変領域のＨ鎖が配列番号２２、および／または可変領域のＬ鎖が配列番号２３で表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体、可変領域のＨ鎖が配列番号２２および／または可変領域のＬ鎖が配列番号４３で表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体、可変領域のＨ鎖が配列番号４２および／または可変領域のＬ鎖が配列番号２３で表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体、可変領域のＨ鎖が配列番号４２および／または可変領域のＬ鎖が配列番号４３で表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体などがあげられる。
ヒト抗体とは、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を単離し培養することができ、培養上清中より該抗体を精製することができる。ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が宿主動物のゲノム遺伝子に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで、培養上清中にヒト抗体を生成蓄積させることができる。
上述の抗体または抗体断片を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、付加、置換または挿入され、かつ上述の抗体またはその抗体断片と同様な活性を有する抗体またはその抗体断片も、本発明の抗体またはその抗体断片に包含される。
欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｐｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数である。、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
上記の抗体のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、次のことを示す。同一配列中の任意、かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味する。また、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じる場合もあり、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。天然型アミノ酸残基としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンおよびＬ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
本発明の抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、６個のＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧ型抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる。この断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂは、抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより、Ｆａｂを発現させ、製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧ型抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦ（ａｂ’）２は、抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによりＦａｂ’を発現させ、製造することができる。
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のｓｃＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによりｓｃＦｖを発現させ、製造することができる。
Ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一とすることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。本発明のｄｉａｂｏｄｙは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによりｄｉａｂｏｄｙを発現させ、製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ７， ６９７−７０４， １９９４）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のｄｓＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによりｄｓＦｖを発現させ、製造することができる。
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、ＨＢ−ＥＧＦに特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするｃＤＮＡを構築し、該ｃＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ＣＤＲを含むペプチドを製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
上述の抗体または該抗体断片に、放射性同位元素、タンパク質または薬剤を結合させた抗体の誘導体も、本発明で用いることができる。
本発明で用いられる抗体の誘導体は、細胞膜に結合しているＨＢ−ＥＧＦ、膜型ＨＢ−ＥＧＦおよび分泌型ＨＢ−ＥＧＦに特異的に結合する抗体または該抗体断片の、Ｈ鎖或いはＬ鎖のＮ末端側或いはＣ末端側、抗体中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体中の糖鎖に薬剤を化学的手法（抗体工学入門、金光修著、（株）地人書館、１９９４）により結合させることにより製造することができる。
または、細胞膜に結合しているＨＢ−ＥＧＦ、膜型ＨＢ−ＥＧＦおよび分泌型ＨＢ−ＥＧＦに特異的に結合する抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたいタンパク質などの薬剤をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入するという遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
薬剤としては、化学療法剤、抗体医薬、免疫賦活剤、高分子の薬剤などがあげられる。
タンパク質としては、サイトカイン、増殖因子、毒素タンパク質などがあげられる。
さらに、抗体または該抗体断片に結合させる薬剤は、プロドラッグの形態でもよい。本発明におけるプロドラッグとは、腫瘍環境に存在する酵素などによって化学的な修飾を受け、癌細胞を傷害する作用を有する物質に変換される薬剤をいう。
化学療法剤としては、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物由来アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤、キナーゼ阻害剤などのいかなる化学療法剤も包含される。化学療法剤としては、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシンリポ（ドキシル）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ（ダウノゾーム）、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、イリノテカン、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、Ｆｌｔ３阻害剤、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｏｔｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）阻害剤、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）阻害剤（イレッサ、タルセバなど）ラディシコール、１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール−トランスレチノイン酸、サリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、金チオマレート、Ｄ−ペニシラミン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（ターグレチン）、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、ゲムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、１３１トシツテマブ、タルグレチン、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、イファスファミド、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、スラミン、メトトレキセート、Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄおよびその誘導体、などがあげられる。
化学療法剤と抗体とを結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介して化学療法剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介して化学療法剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等があげられる。
抗体医薬としては、抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原、腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗原、病変部位の血管新生に関与する抗原に対する抗体があげられる。
抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原としては、Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（以下、ＣＤと記載する）１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０ （Ｂ７．１）、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６ （Ｂ７．２）、ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）−Ｃｌａｓｓ ＩＩ、ＥＧＦＲなどがあげられる。
腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗体の抗原としては、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｂ７ファミリー分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７４、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４）、Ｂ７ファミリー分子のリガンド（ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ）、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０リガンド、ＣＤ１３７、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）受容体ファミリー分子（ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２）、ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ （ＴＲＡＩＬ）ファミリー分子、ＴＲＡＩＬファミリー分子の受容体ファミリー（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫ）、ＲＡＮＫリガンド、ＣＤ２５、葉酸受容体４、サイトカイン［ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１α（以下、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎをＩＬと記す）、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）β、ＴＮＦα等］、これらのサイトカインの受容体、ケモカイン（ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｉ−３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、ＣＴＡＣＫ等）、これらのケモカインの受容体があげられる。
病変部位の血管新生を阻害する抗体の抗原としては、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）、ＥＧＦ、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＰＤＧＦ）、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）、ＴＧＦβ、ＩＬ−８、Ｅｐｈｉｌｉｎ、ＳＤＦ−１など、およびこれらの受容体があげられる。
免疫賦活剤としては、イムノアジュバントとして知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤が、β（１→３）グルカン（レンチナン、シゾフィラン）、αガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）、菌体粉末（ピシバニール、ＢＣＧ）、菌体抽出物（クレスチン）があげられる。
高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの高分子薬剤を抗体または抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的あるいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失、抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。例えば、ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などがあげられる［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε−アミノ基の修飾剤（特開昭６１−１７８９２６）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（特開昭５６−２３５８７）、アルギニンのグアニジノ基の修飾剤（特開平２−１１７９２０）などがあげられる。
サイトカインまたは増殖因子としては、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球などの細胞を亢進するサイトカインまたは増殖因子であればいかなるものでもよいが、例えば、インターフェロン（以下、ＩＮＦと記す）−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）などがあげられる。
毒素タンパク質としては、リシン、ジフテリアトキシン、ＯＮＴＡＫなどがあげられ、毒性を調節するためにタンパク質に変異を導入したタンパク毒素も含まれる。
放射性同位元素としては、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、９９Ｔｃ、７７Ｌｕ、２１１Ａｔ等があげられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法等によって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ （ＭＸ−ＤＴＰＡ）などがあげられる。
本発明においては、本発明で用いられる抗体と、１つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与することや、または放射線照射とを組み合わせることもできる。他の薬剤としては、上述の化学療法剤、抗体医薬、免疫賦活剤、サイトカインまたは増殖因子などがあげられる。
放射線照射としては、Ｘ線、γ線などの光子（電磁波）照射、電子線、陽子線、重粒子線などの粒子線照射などが含まれる。
組み合わせて投与する方法としては、本発明で用いられる抗体との同時投与でもよいし、また、本発明で用いられる抗体の投与と前後して投与しても構わない。
以下に、本発明を詳細に説明する。
１．遺伝子組換え抗体の製造方法
（１）抗原の調製
分泌型ＨＢ−ＥＧＦまたは分泌型ＨＢ−ＥＧＦの部分長（以下、これらを単に分泌型ＨＢ−ＥＧＦと称することもある）をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより、分泌型ＨＢ−ＥＧＦまたは分泌型ＨＢ−ＥＧＦの部分断片を得ることができる。また、ＨＢ−ＥＧＦを発現している細胞から、プロテアーゼ処理することにより細胞外領域のＨＢ−ＥＧＦを精製することができる。分泌型ＨＢ−ＥＧＦを多量に発現している各種ヒト腫瘍培養細胞、ヒト組織などから分泌型ＨＢ−ＥＧＦを精製することもできる。さらに、分泌型ＨＢ−ＥＧＦの部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
具体的には、本発明で用いられる分泌型ＨＢ−ＥＧＦとしては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、これをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
まず、全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。この際もし必要であれば、全長ｃＤＮＡをもとにしてＨＢ−ＥＧＦをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、上記全長ｃＤＮＡの代わりに該ＤＮＡ断片を使用してもよい。次いで、該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ＨＢ−ＥＧＦを生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、大腸菌、動物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれをも用いることができる。
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞において自律複製可能又は染色体中への組込が可能で、分泌型ＨＢ−ＥＧＦをコードするＤＮＡを転写できる位置に適当なプロモーターを含有しているものが用いられる。
大腸菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合には、本発明において用いられるＨＢ−ＥＧＦをコードするＤＮＡを含有してなる組換えベクターは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明において用いられるＤＮＡ及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。該組換えベクターは、さらに、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３等を挙げることができる。
プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターを挙げることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーター等のように、人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
また、上記組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明において用いられる分泌型ＨＢ−ＥＧＦをコードするＤＮＡの塩基配列においては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより、目的とする分泌型ＨＢ−ＥＧＦの生産率を向上させることができる。さらに、上記組換えベクターにおける遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属等に属する微生物、例えば、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９等を挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等を挙げることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３等を挙げることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等を挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等を挙げることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された分泌型ＨＢ−ＥＧＦを得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ＨＢ−ＥＧＦを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、分泌型ＨＢ−ＥＧＦを製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明において用いられる分泌型ＨＢ−ＥＧＦをコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、動物細胞等由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養して該ＨＢ−ＥＧＦを生成蓄積させ、該培養物より採取することにより、本発明において用いられる分泌型ＨＢ−ＥＧＦを製造することができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
分泌型ＨＢ−ＥＧＦの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、及び宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる分泌型ＨＢ−ＥＧＦの構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
分泌型ＨＢ−ＥＧＦが宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４， １７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、又は特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該遺伝子産物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。分泌型ＨＢ−ＥＧＦは、例えば、以下のようにして単離・精製することができる。分泌型ＨＢ−ＥＧＦが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独又は組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、分泌型ＨＢ−ＥＧＦが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ＨＢ−ＥＧＦの不溶体を回収する。回収した該タンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該タンパク質を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により分泌型ＨＢ−ＥＧＦの精製標品を得ることができる。
分泌型ＨＢ−ＥＧＦ又はその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ＨＢ−ＥＧＦ又はその糖修飾体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
また、本発明において用いられる分泌型ＨＢ−ＥＧＦは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウス、ラットまたはハムスターに上記のように調製した抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、ＨＢ−ＥＧＦノックアウトマウスを被免疫動物として用いる方法もある。
免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）や水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリアタンパク質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに５〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８〕などで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたはハムスターを脾細胞の供給源として提供する。
脾細胞を骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄して融合用脾細胞として提供する。
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８：１−７，１９７８）、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４１（ＮＳ−１）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：５１１−５１９，１９７６）、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ−２）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９−２７０，１９７８）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３：１５４８−１５５０，１９７９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５）などが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えた培地（以下、正常培地という。）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍＬ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合
前述した抗体産生細胞と骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングリコール−１，０００（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬの混液を抗体産生細胞数１０８当たり０．２〜１ｍＬの容量で加え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌ／Ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）およびアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）を加えた培地〕１００ｍＬ中に懸濁する。この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとり、後述するバインディングアッセイなどにより、細胞膜に結合しているＨＢ−ＥＧＦ、分泌型ＨＢ−ＥＧＦおよび膜型ＨＢ−ＥＧＦのいずれにも反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマもしくは精製抗体を選択する。
また、ついで、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
（５）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（４）で得られた抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２×１０６〜５×１０７細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析した後、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行い、ＩｇＧあるいはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
（６）バインディングアッセイ
抗原としては、（１）に記載の方法により、本発明において用いられるＨＢ−ＥＧＦをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入して得た遺伝子導入細胞やリコンビナントタンパク質、あるいはヒト組織から得た精製ＨＢ−ＥＧＦや部分ペプチドを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリアタンパク質とコンジュゲートを作製して、これを用いる。
これらの抗原のうち、分泌型ＨＢ−ＥＧＦおよびＨＢ−ＥＧＦが細胞に結合している細胞株を９６ウェルプレートに分注し固層化した後、第一抗体として、被免疫動物血清、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清もしくは精製抗体を分注して反応させる。ＰＢＳまたはＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した後、第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行う。
前述したような方法で、細胞膜に結合しているＨＢ−ＥＧＦ、分泌型ＨＢ−ＥＧＦおよび膜型ＨＢ−ＥＧＦのいずれにも反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマもしくは精製抗体を選択することができる。
得られたモノクローナル抗体のうち、分泌型ＨＢ−ＥＧＦのＨＢ−ＥＧＦ受容体への結合阻害活性を有する抗体としては、ハイブリドーマ細胞株ＫＭ３５６６が生産するモノクローナル抗体ＫＭ３５６６、ハイブリドーマ細胞株ＫＭ３５６７が産生するモノクローナル抗体ＫＭ３５６７、およびハイブリドーマ細胞株ＫＭ３５７９が生産するモノクローナル抗体をあげることができる。ハイブリドーマ細胞株ＫＭ３５７９は、平成１８年１月２４日付でブダペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−１０４９１として寄託されている。
また、本発明の抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体と競合してＨＢ−ＥＧＦに結合するモノクローナル抗体は、上述のバインティングアッセイ系に、被検抗体を添加して反応させることで取得できる。すなわち、被検抗体を加えた時にモノクローナル抗体の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ＨＢ−ＥＧＦへの結合について、取得したモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体を取得することができる。
更に、本発明の抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体が認識するエピトープと同じエピトープに結合する抗体は、上述のバインティングアッセイ系で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの、部分的な合成ペプチド、またはエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。
（７）中和活性
更に、得られたモノクローナル抗体が分泌型ＨＢ−ＥＧＦに対して中和活性を有しているか否かは、ＨＢ−ＥＧＦ依存性細胞を用いた細胞増殖阻害アッセイを行うことにより確認することができる。
細胞増殖阻害アッセイに用いる細胞としては、分泌型ＨＢ−ＥＧＦが結合することができる受容体を有する細胞であればいかなる細胞でもよいが、具体的にはＥＧＦ受容体遺伝子をマウス骨髄性由来細胞株３２Ｄ ｃｌｏｎｅ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１１３４６）に導入して得られた細胞株などがあげられる。
得られたモノクローナル抗体と分泌型ＨＢ−ＥＧＦとをプレート上で反応させた後に上述の細胞株を加えて培養を行う。対照として、分泌型ＨＢ−ＥＧＦを添加しモノクローナル抗体を添加しないプレート、およびモノクローナル抗体と分泌型ＨＢ−ＥＧＦのいずれも添加しないプレートに、同様に上述の細胞株を加えて培養を行う。各プレートでの細胞数を計測することにより、細胞増殖阻害率を求めることができる。細胞増殖阻害率が高いモノクローナル抗体は、中和活性を有するモノクローナル抗体として選択することができる。
中和活性を有するモノクローナル抗体の具体例としては、ハイブリドーマ細胞株ＫＭ３５６６が生産するモノクローナル抗体ＫＭ３５６６、およびハイブリドーマ細胞株ＫＭ３５６７が産生するモノクローナル抗体ＫＭ３５６７をあげることができる。ハイブリドーマ細胞株ＫＭ３５６６およびＫＭ３５６７は、ブダペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にそれぞれ平成１８年１月２４日付でＦＥＲＭ ＢＰ−１０４９０、および平成１８年３月２３日付でＦＥＲＭ ＢＰ−１０５７３として寄託されている。
２．遺伝子組換え抗体の作製
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
遺伝子組換え抗体発現用ベクターとしては、ヒト抗体のＣＨおよび／またはＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであればいかなるものでもよい。ヒト化抗体発現用ベクターは、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）などがあげられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７−１３１０，１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｇｅｎｅ，２７，２２３−２３２，１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７８，１５２７−１５３１，１９８１）、ｐＳＧ１βｄ２−４（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３−１８０，１９９０）などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７−１３１０，１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＆Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１４９，９６０−９６８，１９８７）、イムノグロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｃｅｌｌ，４１，４７９−４８７，１９８５）とエンハンサー（Ｃｅｌｌ，３３，７１７−７２８，１９８３）などがあげられる。
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプ、あるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、遺伝子組換え発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターの方が好ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１−２７８，１９９４）。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９−５６７，１９９８）などがあげられる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
ハイブリドーマよりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージあるいはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分あるいはＶ領域部分をプローブとして用いて、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなど、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマから全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３−２８，１９８７）、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）などがあげられる。また、ハイブリドーマからｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などがあげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）、あるいは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマから抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８−６１，１９９２）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４，１９８９）、λＺＡＰ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９，１９８５）、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３ １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，２８０−２８９，１９８３）およびｐＵＣ１８（Ｇｅｎｅ，３３，１０３−１１９，１９８５）などのファージあるいはプラスミドベクターが用いられる。
ファージあるいはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，２７１−２８９，１９９２）、Ｃ６００（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５９，１７７−１９０，１９６８）、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８−７８２，１９８３）、ＮＭ５２２（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６６，１−１９，１９８３）、Ｋ８０２（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６，１１８−１３３，１９６６）およびＪＭ１０５（Ｇｅｎｅ，３８，２７５−２７６，１９８５）などが用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、放射性同位元素あるいは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲ法と表記する；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素等で切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドベクターにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、ジデオキシ法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７４，５４６３−５４６７，１９７７）などの反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（ＡＢＩ社製）などを用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌のためのシグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することにより、シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することによって見出すことができる。
さらに、ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴやＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどに対してＢＬＡＳＴ法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０，１９９０）などの配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
上記２（１）に記載の遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨおよびＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型として、５’末端に適当な制限酵素の認識配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ法によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを増幅し、それぞれを上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（４）ヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体）のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）などがあげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト化抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を考慮して塩基配列に変換し、ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。設計した塩基配列に基づき、１５０塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、ＶＨ、ＶＬとも４本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記２（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドにクローニングし、上記２（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドを取得する。
（５）ヒト化抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト化抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６−２７１，１９９１）。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト化抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６−２７１，１９９１）。ヒト化抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１２，５３５−５４２，１９７７）あるいはコンピューターモデリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１−１５０７，１９９４）などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト化抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて上記２（４）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について上記２（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト化抗体発現ベクターの構築
上記２（１）に記載の遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、上記２（４）および（５）で構築したヒト化抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、上記２（４）および（５）でヒト化抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記２（１）に記載の遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングすることができる。
（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
作製した多種類の遺伝子組換え抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、上記２（３）および（６）に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）が一般に用いられる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９１）。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９１）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，８４，７４１３−７４１７，１９８７）などがあげられる。
発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）などにより測定できる。
（８）遺伝子組換え抗体の安定発現
上記２（３）および（６）に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換細胞を得ることができる。宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）などがあげられる。遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、以下、ＹＢ２／０細胞と表記する）などがあげられる。
発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換体は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８ ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、またはこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いることができる。得られた形質転換細胞を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性は、ＥＬＩＳＡにより測定できる。また、形質転換細胞は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ増幅系などを利用して遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。
遺伝子組換え抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ ８，１９８８； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＰＡＧＥと表記する：Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，１９７０）やウェスタンブロッティング法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ １２，１９８８； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）などで測定することができる。
（９）遺伝子組換え抗体と抗原との結合活性評価
遺伝子組換え抗体と抗原との結合活性評価は、上記に記載のＥＬＩＳＡ法や、フローサイトメーターを用いたバインディングアッセイを用いて行うことができる。また、モノクローナル抗体と競合する抗体およびモノクローナル抗体が認識するエピトープに反応する遺伝子組換え抗体は、バインディングアッセイにおいて、対象の遺伝子組換え抗体を共存させて反応させ、モノクローナル抗体の結合を阻害できるか否かを確かめることにより選択できる。
３．抗体断片の作製
抗体断片は、上記１および２に記載の抗体をもとに遺伝子工学的手法あるいはタンパク質化学的手法により、作製することができる。
遺伝子工学的手法としては、目的の抗体断片をコードする遺伝子を構築し、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、大腸菌などの適当な宿主を用いて発現、精製を行うなどの方法があげられる。
タンパク質化学的手法としては、ペプシン、パパインなどのタンパク質分解酵素を用いた部位特異的切断、精製などの方法があげられる。
抗体断片として、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、６個のＣＤＲを含むペプチドの製造法について以下に具体的に説明する。
（１）Ｆａｂの作製
Ｆａｂは、タンパク質化学的にはＩｇＧをタンパク質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインＡ結合性を有するＩｇＧサブクラスであれば、プロテインＡカラムに通すことで、ＩｇＧ分子やＦｃ断片と分離し、均一なＦａｂとして回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。プロテインＡ結合性を持たないＩｇＧサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｆａｂは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。また、Ｆａｂは遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ発現用ベクターとしては、Ｆａｂ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＩＴ１０６（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０４１−１０４３，１９８８）などがあげられる。Ｆａｂ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにＦａｂを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常タンパク質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったＦａｂが漏出する。リフォールディング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なＦａｂを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２）。
（２）Ｆ（ａｂ’）２の作製
Ｆ（ａｂ’）２は、タンパク質化学的にはＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Ｆａｂと同様の精製操作により、均一なＦ（ａｂ’）２として回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９５）。また、下記３（３）に記載のＦａｂ’をｏ−ＰＤＭやビスマレイミドヘキサンなどのようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、ＤＴＮＢ［５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）］で処理し、Ｓ−Ｓ結合させる方法によっても作製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（３）Ｆａｂ’の作製
Ｆａｂ’は、上記３（２）に記載のＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、Ｆａｂ’は遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ’発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ’発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ’発現用ベクターとしては、Ｆａｂ’用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＡＫ１９（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１０，１６３−１６７，１９９２）などがあげられる。Ｆａｂ’発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにＦａｂ’を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常タンパク質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂ’とすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、プロテインＧカラムなどを用いることにより、均一なＦａｂ’を精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（４）ｓｃＦｖの作製
ｓｃＦｖは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、ｓｃＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ発現ベクターを作製することができる。ｓｃＦｖ発現用ベクターとしては、ｓｃＦｖのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＆Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５，４８−５６，１９９４）などがあげられる。ｓｃＦｖ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にｓｃＦｖがファージ表面タンパク質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、ｓｃＦｖ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズムにｓｃＦｖを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常タンパク質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｓｃＦｖとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（５）Ｄｉａｂｏｄｙの作製
Ｄｉａｂｏｄｙは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶＨとＶＬをリンカーがコードするアミノ酸残基が８残基以下となるように連結したＤＮＡを作製し、ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターにクローニングし、ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを作製することができる。ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターとしては、ｄｉａｂｏｄｙのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５，４８，１９９４）などがあげられる。ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズムにｄｉａｂｏｄｙを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常タンパク質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｉａｂｏｄｙとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｄｉａｂｏｄｙを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（６）ｄｓＦｖの作製
ｄｓＦｖは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。まず、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡをｄｓＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを作製することができる。ｄｓＦｖ発現用ベクターとしては、ｄｓＦｖ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＵＬＩ９（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）などがあげられる。ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにｄｓＦｖを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズムからＶＨおよびＶＬを取得し、混合した後に、通常タンパク質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｓＦｖとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、さらに精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）。
（７）６個のＣＤＲを含むペプチドの作製
６個のＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法あるいはｔＢｏｃ法等の化学合成法によって作製することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを作製し、作製したＤＮＡを適当な発現用ベクターにクローニングし、ＣＤＲペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、ＣＤＲペプチドをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＡＸ４ａ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などがあげられる。発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズマ層からＣＤＲペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過等により、精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７，１９９４）。
４．本発明の医薬および治療剤
本発明のヒト化抗体を有効成分として含有する医薬は、ＨＢ−ＥＧＦが関与する各種疾患を治療することができる。
ＨＢ−ＥＧＦが関与する疾患としては、癌、心疾患、動脈硬化などがあげられる。
癌としては、乳癌、肝癌、膵癌、膀胱癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍などの固形癌があげられる。また、いずれかの固形癌に伴う連続性転移、血行性転移またはリンパ性転移、腹膜播種などによる転移癌などもあげられる。また白血病（急性骨髄性白血病、Ｔ細胞性白血病など）、リンパ腫、ミエローマなどの造血細胞由来の癌（血液癌、ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ、ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）などの癌種があげられる。
本発明の抗体またはその抗体断片を有効成分とする医薬は、通常は薬理学的に許容される１つ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、又は口腔内、鼻腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、腹腔内及び静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体又はペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。乳剤及びシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該抗体又はペプチドそのもの、ないしは受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例表される。該抗体及び用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量又は投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇである。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の例示であり、本発明の範囲を限定するものでない。
実施例１
抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体の作製
（１）免疫原の調製
Ｒ＆Ｄシステム社製リコンビナント分泌型ヒトＨＢ−ＥＧＦ（カタログ番号 ２５９−ＨＥ／ＣＦ）凍結乾燥品をダルベッコリン酸バッファー（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）にて溶解し、免疫原として用いた。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例１（１）で調製したリコンビナント分泌型ヒトＨＢ−ＥＧＦ ２５μｇを水酸化アルミニウムアジュバント〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＭａｎｕａＬ， ＣｏＬｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ９９、１９８８〕２ ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともにＨＢ−ＥＧＦ欠損マウス（大阪大学微生物病研究所 細胞機能分野研究室より供与、ＰＮＡＳ、ＶＯＬ．１００、ＮＯ．１００、３２２１−３２２６、２００３）に投与した。投与２週間後より、該ＨＢ−ＥＧＦ ２５μｇのみを１週間に１回、計４回投与した。該マウスの眼底静脈より部分採血し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。脾臓をＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した。得られた沈殿画分にトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ＰＨ７．６）を添加し、１〜２分間処理することにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分（細胞画分）をＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。
（３）酵素免疫測定法（バインディングＥＬＩＳＡ）
アッセイには実施例１（１）のリコンビナントヒトＨＢ−ＥＧＦを９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社）に０．５μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させたものを用いた。該プレートを洗浄後、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳを５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間放置し、残っている活性基をブロックした。放置後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、該プレートに一次抗体として被免疫マウス抗血清、ハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ウェル分注し、２時間放置した。該プレートを０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［（ＩＣＩ社商標Ｔｗｅｅｎ ２０相当品：和光純薬社製）］／ＰＢＳ（以下Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記）で洗浄後、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧガンマ鎖（キルケガード アンド ペリー ラボラトリーズ社）を５０μＬ／ウェル加えて室温、１時間放置した。該プレートをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ〔２．２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム〕基質液〔１ｍｍｏＬ／Ｌ ＡＢＴＳ／０．１ｍｏＬ／Ｌ クエン酸バッファー（ＰＨ４．２）、０．１％Ｈ２Ｏ２〕を添加し、発色させＯＤ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｅｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて測定した。
（４）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１：ＡＴＣＣより購入）を１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０（インビトロジェン社）で培養し、細胞融合時に２×１０７個以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
（５）ハイブリドーマの作製
実施例１（２）で得られたマウス脾細胞と実施例１（４）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）１ｇ、ＭＥＭ培地１ｍＬ、およびジメチルスルホキシド０．３５ｍＬの混液を１０８個のマウス脾細胞あたり０．５ｍＬ加え、該懸濁液に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにした。該懸濁液を遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）し、得られた沈澱画分の細胞をゆるやかにほぐした後、該細胞を、メスピペットによる吸込み吸出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地にＨＡＴ Ｍｅｄｉａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を加えた培地〕１００ｍＬ中に懸濁した。該懸濁液を９６ウェル培養用プレートに２００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。培養後、培養上清を実施例１（３）に記載した酵素免疫測定法で調べ、リコンビナントヒトＨＢ−ＥＧＦに反応するウェルを選び、そこに含まれる細胞から限界希釈法によるクローニングを２回繰り返し、抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株ＫＭ３５６６、ＫＭ３５６７およびＫＭ３５７９を確立した。
（６）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に実施例１（５）で得られたハイブリドーマ株を５〜２０×１０６細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後、ハイブリドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍＬ／匹）した。該腹水を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）し固形分を除去した。精製ＩｇＧモノクローナル抗体は、カプリル酸沈殿法〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＭａｎｕａＬ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８〕により精製することにより取得した。モノクローナル抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いたＥＬＩＳＡ法により決定した。モノクローナル抗体ＫＭ３５６６のサブクラスはＩｇＧ１、ＫＭ３５６７のサブクラスはＩｇＧ１、モノクローナル抗体ＫＭ３５７９はＩｇＧ２ｂであった。
実施例２
ＨＢ−ＥＧＦに対する抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体の反応性
（１）バインディングＥＬＩＳＡにおけるＨＢ−ＥＧＦとの反応性
実施例１（３）に示した方法に従って行なった。１次抗体には抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６、ＫＭ３５６７、ＫＭ３５７９、市販抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＭＡＢ２５９（Ｒ＆Ｄ社製）、および陰性対照抗体ＫＭ５１１（抗ＧＣＳＦ誘導体モノクローナル抗体）の各精製抗体を、１０μｇ／ｍＬから５倍希釈で段階的に希釈したものを用いた。結果を図１Ａに示した。
抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６、ＫＭ３５６７、ＫＭ３５７９、およびＭＡＢ２５９は、いずれもリコンビナントヒトＨＢ−ＥＧＦに反応し、ＢＳＡには全く反応しなかった。
（２）ウエスタンブロットにおけるＨＢ−ＥＧＦとの反応性
１レーンあたり、２０ｎｇのリコンビナントヒトＨＢ−ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製）をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にて分画し、泳動後のゲルをＰＶＤＦ膜に転写した。該膜を１０％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキング後、抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６、ＫＭ３５６７、ＫＭ３５７９、ＭＡＢ２５９および陰性対照抗体ＫＭ５１１の精製抗体を、それぞれ１０％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて１μｇ／ｍＬに希釈し、室温で２時間反応させた。該膜をＴｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、希釈したペルオキシターゼ標識マウスイムノグロブリン（ザイメット社）を、室温で１時間反応させた。該膜をＴｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄し、ＥＣＬＴＭ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシア社製）を用いてバンドを検出した。
抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６、ＫＭ３５６７、ＫＭ３５７９およびＭＡＢ２５９はいずれも、リコンビナント分泌型ヒトＨＢ−ＥＧＦの分子量に該当する１５〜３０ｋＤａ付近のバンドを検出した。
（３） 抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体のＨＢ−ＥＧＦ−ＥＧＦＲ結合阻害活性の評価
抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６、ＫＭ３５６７、ＫＭ３５７９およびＭＡＢ２５９のＨＢ−ＥＧＦ−ＥＧＦＲ結合阻害活性を３２Ｄ／ＥＧＦＲ細胞（ＥＧＦＲ遺伝子をマウス骨髄由来細胞株３２Ｄ ｃｌｏｎｅ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１３４６）に導入して造成した細胞株。以下、３２Ｄ／ＥＧＦＲと記す。）とビオチン標識ＨＢ−ＥＧＦを用いて検討した。
リコンビナント分泌型ＨＢ−ＥＧＦはＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（ピアス社製）を用いて常法によりビオチン標識を行った。
ＫＭ３５６６、ＫＭ３５６７、ＫＭ３５７９およびＭＡＢ２５９を１０μｇ／ｍＬより５倍希釈で段階的に希釈し、５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに分注した。その後、３２Ｄ／ＥＧＦＲ細胞を１×１０４個／５０μＬ／ウェルで分注した。更に、至適濃度に希釈したビオチン標識ＨＢ−ＥＧＦとアレクサ６４７標識ストレプトアビジンをそれぞれ１０μＬ／ウェル、５０μＬ／ウェルで分注し、混合後、室温遮光下で３時間反応させた。レーザー光６３３ｎｍ Ｈｅ／Ｎｅで励起される６５０ｎｍ〜６８５ｎｍの波長を８２００ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム社製）で測定した。
その結果、図１Ｂに示すように、ＫＭ３５６６、ＫＭ３５６７、ＫＭ３５７９およびＭＡＢ２５９は、いずれも抗体濃度依存的に、ビオチン化ＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦＲへの結合を阻害した。従って、全ての抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体は、ＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦＲとの結合を阻害することが明らかになった。
実施例３
ＨＢ−ＥＧＦに対する抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体の中和活性の検討
抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６、ＫＭ３５６７、ＫＭ３５７９およびＭＡＢ２５９のＨＢ−ＥＧＦ中和活性を、ＨＢ−ＥＧＦ依存性細胞を用いた細胞増殖阻害アッセイで調べた。ＨＢ−ＥＧＦ依存性細胞としては、３２Ｄ／ＥＧＦＲを用いた。抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６、ＫＭ３５６７、ＭＡＢ２５９ 、および陰性対照抗体ＫＭ５１１の精製抗体を、それぞれ２０μｇ／ｍＬより３〜４倍希釈で段階的に希釈し、５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに分注した。次に、０．１μｇ／ｍＬのリコンビナントヒトＨＢ−ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社）を、１０μＬ／ウェルで分注し、混合した後氷上で２時間反応させた。その後、３２Ｄ／ＥＧＦＲ細胞を、１×１０４個／４０μＬ／ウェルで播種し、３６時間培養した。生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク社）を１０μＬ／ウェルで添加し、２時間後にＯＤ４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｅｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて測定した。
ＨＢ−ＥＧＦ添加、抗体非添加のウェルの吸光度を阻害率０％とし、ＨＢ−ＥＧＦ非添加、抗体非添加のウェルの吸光度を阻害率１００％として、各ウェルの細胞増殖阻害率を算出した結果を図２Ａに示した。その結果、ＫＭ３５６６は、細胞株３２Ｄ／ＥＧＦＲに対してＭＡＢ２５９と同程度のＨＢ−ＥＧＦ依存性増殖の阻害活性を示した。従って、２つの抗体は同程度のＨＢ−ＥＧＦ中和活性を有していることが明らかになった。一方、ＫＭ３５７９は細胞株３２Ｄ／ＥＧＦＲの増殖を全く阻害しなかったことから、ＨＢ−ＥＧＦ中和活性を有さないことが明らかになった。
更に、同様にしてＫＭ３５６７の中和活性を検討した結果を図２Ｂに示した。その結果、ＫＭ３５６７は、ＫＭ３５６６と比べて活性は弱いものの、ＨＢ−ＥＧＦ依存性細胞増殖の阻害活性を有していた。
実施例４
膜型ＨＢ−ＥＧＦに対する抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体の反応性の検討
１〜５×１０５細胞のヒト胃癌細胞株ＭＫＮ−２８（ＨＳＲＲＢ ＪＣＲＢ０２５３）、ヒト卵巣癌ＥＳ−２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９７８）およびヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２６）に、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで各濃度に希釈した抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６、ＫＭ３５６７、ＫＭ３５７９、ＭＡＢ２５９、および陰性対照抗体ＫＭ５１１を加え、混合して全量を５０μＬとした。これらの細胞懸濁液を、氷上で４０分間反応後、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３回洗浄を行った。該細胞に、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈調製したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μＬ添加し、氷冷下４０分間反応させた。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄を行った後、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁してフローサイトメーター（コールター社製）用いて、蛍光強度を測定した。
図３に、ＭＫＮ−２８およびＥＳ−２に、上記モノクローナル抗体を２０μｇ／ｍＬから２倍希釈で反応させた場合の平均蛍光強度（ＭＦＩ値）を示す。図４に、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に、上記モノクローナル抗体を２０μｇ／ｍＬで反応させた場合のヒストグラムを示す。その結果、ＭＫＮ−２８についてはＫＭ３５６６、ＫＭ３５７９の結合活性が認められ、またＥＳ−２では、ＫＭ３５６６＞ＫＭ３５７９の順で結合活性が認められた。更に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ではＫＭ３５６６＞ＫＭ３５６７≒ＫＭ３５７９の順で結合活性が認められた。また、いずれの細胞についてもＭＡＢ２５９のＭＦＩ値は陰性対照抗体ＫＭ５１１および抗体非添加陰性対照と同程度であり、細胞への結合がほとんど認められなかった。以上より、モノクローナル抗体ＫＭ３５６６、ＫＭ３５６７およびＫＭ３５７９は、癌細胞株の膜型および細胞膜に結合したＨＢ−ＥＧＦに結合することが明らかとなった。
実施例５
抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡの単離、解析
（１）抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの調製
実施例１に記載のハイブリドーマＫＭ３５６６より、ＲＮＡｅａｓｙ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）およびＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ハイブリドーマ細胞５×１０７細胞より約４．８μｇのｍＲＮＡを調製した。
（２）抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６のＨ鎖およびＬ鎖可変領域の遺伝子クローニング
実施例５（１）で取得した抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６のｍＲＮＡの１μｇから、ＢＤ ＳＭＡＲＴＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、５’側にキット添付のＢＤ ＳＭＡＲＴ ＩＩＴＭ Ａ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ配列を有するｃＤＮＡを取得した。そのｃＤＮＡを鋳型として、キット添付のユニバーサルプライマーＡｍｉｘと、配列番号６で表される塩基配列を有するマウスＩｇ（γ）特異的プライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、ＶＨのｃＤＮＡ断片を増幅した。またＩｇ（γ）特異的プライマーの代わりに配列番号７で表される塩基配列を有するマウスＩｇ（κ）特異的プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＶＬのｃＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、９４℃で５分間加熱後、９４℃で３０秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを５回、９４℃で３０秒間、７０℃で３０秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを５回、９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを３０回それぞれ行った後、７２℃で１０分間反応させた。ＰＣＲはＰＴＣ−２００ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて行った。
得られたＰＣＲ産物をクローニングし、塩基配列を決定するため、アガロースゲル電気泳動で分離し、Ｈ鎖、Ｌ鎖各々約６００ｂｐのＰＣＲ産物をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出した。得られた抽出断片を、ＳｍａＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）ベクターに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて連結した後、コーエンらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９， ２１１０（１９７２）］により大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られた形質転換体より自動プラスミド抽出機（クラボウ社製）を用いてプラスミドを抽出し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＰＥバイオシステムズ社製）を用い添付の説明書に従って反応後、同社のシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７００によりクローニングしたＰＣＲ産物の塩基配列を解析した。その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する、完全長のＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドＫＭ３５６６ＶＨ１０Ｇ２およびＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドＫＭ３５６６ＶＬ１０Ｋ２が取得された。
（３）抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体Ｖ領域のアミノ酸配列の解析
プラスミドＫＭ３５６６ＶＨ１０Ｇ２に含まれていたＶＨの全塩基配列を配列番号８に、該配列から推定された、シグナル配列を含んだＶＨの全アミノ酸配列を配列番号９に、プラスミドＫＭ３５６６ＶＬ１０Ｋ２に含まれていたＶＬの全塩基配列を配列番号１０におよび該配列から推定された、シグナル配列を含んだＶＬの全アミノ酸配列を配列番号１１にそれぞれ示した。既知のマウス抗体の配列データ［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］との比較、並びに精製した抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６のＨ鎖及びＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（島津製作所社製：ＰＰＳＱ−１０）を用いて解析した結果との比較から、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６をコードする完全長ｃＤＮＡであり、Ｈ鎖については配列番号９に記載のアミノ酸配列の１から１９番目が、Ｌ鎖については配列番号１１に記載のアミノ酸配列の１から２０番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。
次に、抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の新規性について検討した。配列解析システムとしてＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ社製）を用い、既存のタンパク質のアミノ酸配列データベースをＢＬＡＳＴＰ法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７）］により検索した。その結果、ＶＨ、ＶＬともに完全に一致するアミノ酸配列は認められず、抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６のＶＨおよびＶＬは新規なアミノ酸配列を有していることが確認された。
また、抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号１２、１３および１４に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号１５、１６および１７にそれぞれ示した。
実施例６
抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体の作製
（１）抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３５６６の構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と、実施例５（２）で得られたプラスミドＫＭ３５６６ＶＨ１０Ｇ２およびＫＭ３５６６ＶＬ１０Ｋ２を用いて、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３５６６を以下のようにして構築した。
プラスミドＫＭ３５６６ＶＨ１０Ｇ２を鋳型として１００ｎｇ使用し、１０×ＫＯＤ緩衝液１０μＬ、２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ １０μＬ、２５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを２μＬ、１０μｍｏｌ／Ｌの配列番号１８および１９記載の塩基配列を有するプライマーをそれぞれ１μＬ、ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）１μＬ、を含む総量１００μＬからなる溶液を、９６℃で３分間加熱後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間の反応を２５サイクル、７２℃で８分間反応させた。この反応によって、ｐＫＡＮＴＥＸ９３に挿入するための制限酵素認識配列が付加されたＫＭ３５６６のＶＨをコードする遺伝子配列を合成した。同様に、プラスミドＫＭ３５６６ＶＬ１０Ｋ２を鋳型として１００ｎｇ、１０×ＫＯＤ緩衝液１０μＬ、２ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰを１０μＬ、２５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを２μＬ、１０μｍｏｌ／Ｌの配列番号２０および２１記載の塩基配列を有するプライマーをそれぞれ１μＬ、ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）１μＬ、を含む総量１００μＬからなる溶液を、９６℃で３分間加熱後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間の反応を２５サイクル、７２℃で８分間反応させた。この反応によって、ｐＫＡＮＴＥＸ９３に挿入するための制限酵素認識配列が付加されたＫＭ３５６６のＶＬをコードする遺伝子配列を合成した。それぞれのＰＣＲ反応産物をエタノール沈殿することにより精製、濃縮し、ＳｍａＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）ベクターにクローニングすることで、ＫＭ３５６６のＶＨをコードする遺伝子配列を含むプラスミドｐＫＭ３５６６ＶＨと、ＶＬをコードする遺伝子配列を含むプラスミドｐＫＭ３５６６ＶＬとを取得した。
次に、ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と、上記で得られたｐＫＭ３５６６ＶＬに、それぞれ制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて５５℃で１時間反応後、引き続き制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＴａＫａＲａ社製）を加えて、３７℃で１時間反応させた。その反応液をアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約１２．８ｋｂのｐＫＡＮＴＥＸ９３のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片および約０．４３ｋｂのＶＬの、ＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片をそれぞれ回収した。得られた２種類の断片をＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて添付の説明書に従って連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製して制限酵素処理により確認し、目的の約０．４３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片が挿入されたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ３５６６ＶＬを取得した。
次に、上記で得られたｐＫＡＮＴＥＸ３５６６ＶＬとｐＫＭ３５６６ＶＨに、それぞれ制限酵素ＡｐａＩ（ＴａＫａＲａ社製）を加えて３７℃で１時間反応させた後、さらに制限酵素ＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。その反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１３．２ｋｂのｐＫＡＮＴＥＸ３５６６ＶＬおよび約０．４７ｋｂのＶＨの、ＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片をそれぞれ回収した。得られた２種類の断片をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて添付の説明書に従って連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製して制限酵素処理により確認し、目的の約０．４７ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片が挿入されたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ３５６６を取得した。該プラスミドに関して、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて、添付の説明書に従って反応後、同社のシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７００により塩基配列を解析した。その結果、目的のＫＭ３５６６のＶＨをコードするｃＤＮＡ、およびＶＬをコードするｃＤＮＡがそれぞれクローニングされた、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３５６６を取得した。ベクター構築の概略図を図５に示した。
（２）抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体の動物細胞での発現
上記（１）で得られた抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３５６６を用いて抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体の動物細胞での発現を、常法［Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９２）］により行い、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体を産生する形質転換株ＫＭ３９６６を取得した。
（３）精製キメラ抗体の取得
上記（２）で得られた形質転換株ＫＭ３９６６を、通常の培養法で培養した後、細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間の遠心分離を行って培養上清を回収した後、０．２２μｍ孔径ＭｉｌｌｅｘＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を通して濾過滅菌した。得られた培養上清よりＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｈｉｇｈ−ｃａｐａｃｉｔｙレジン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６を精製した。得られた抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６の精製標品の精製度および発現分子サイズを、グラジュエントゲル（ＡＴＴＯ社製、Ｅ−Ｔ５２０Ｌ）を用いて、添付の説明書に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
結果を図６に示した。精製した抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６は、非還元条件下では分子量が１５０〜２００ｋＤａ付近に１本のバンドが、還元条件下では約５０ｋＤａと約２５ｋＤａの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、ＩｇＧクラスの抗体が、非還元条件下では分子量は約１５０ｋＤａであり、還元条件下では、分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、約５０ｋＤａの分子量のＨ鎖と、約２５ｋＤａの分子量のＬ鎖に分解されるという報告［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｈａｐｔｅｒ １４（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６）］と一致している。よって、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６が正しい構造の抗体分子として発現されていることが確認された。
実施例７
抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体の活性評価
（１）ヒト固形癌細胞株に対する結合活性
実施例６で得られた抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６のヒト固形癌細胞株に対する結合性を評価するため、蛍光抗体法により以下のように検討した。
ヒト卵巣癌細胞株のＭＣＡＳ（ＪＣＲＢ０２４０）、ＲＭＧ−Ｉ（ＪＣＲＢ ＩＦ０５０３１５）、ＥＳ−２（ＣＲＬ１９７８）、ヒト乳癌細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２６）、Ｔ４７Ｄ（ＨＴＢ−１３３）、ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３０）、ＺＲ−７５−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５００）、ヒト胃癌細胞株のＭＫＮ−２８（ＨＳＲＲＢ ＪＣＲＢ０２５３）の各種細胞株を、０．０２％−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製）で剥離しＰＢＳで洗浄後、９６ウェルＵ底プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に、１〜２×１０５個／５０μＬ／ウェルずつ分注した。１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２０μｇ／ｍＬに調製した抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６溶液を、５０μＬ／ウェルずつ分注してプレートミキサーで攪拌し、氷上に３０分間静置した。ＰＢＳにより２回洗浄後、１００倍希釈した２次抗体ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を、５０μＬ／ウェルずつ添加し、プレートミキサーで攪拌し、遮光して氷上に３０分間静置した。ＰＢＳで２回洗浄後、フローサイトメーターＥＰＩＣＳ ＸＬ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ ｖ３．０（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を用いて蛍光強度を測定した。陰性対照抗体としては抗ＦＧＦ８キメラ抗体ＫＭ３０３４（ＵＳ２００４−０２５３２３４）を用いた。
結果を図７に示した。いずれのヒト固形癌細胞株の膜型および細胞膜に結合したＨＢ−ＥＧＦに対しても、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６は結合した。
（２）抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６のヒトＨＢ−ＥＧＦに対する結合活性測定 マウス抗体ＫＭ３５６６とキメラ抗体ＫＭ３９６６のヒトＨＢ−ＥＧＦに対する結合活性を反応速度論的に解析するため、ビアコアを用いて結合活性測定を行った。以下の操作は全てＢｉａｃｏｒｅＴ−１００（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を用いて行った。ＨＢＳ−ＥＰ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を用いて５μｇ／ｍＬに調製したヒトＨＢ−ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製）を、アミンカップリング法によりＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）に８０ＲＵ（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔ）になるように固層化した。その後９ｎｍｏｌ／Ｌから５段階に希釈した各種抗体を１０μＬ／ｍｉｎの速度でチップ上に流し、各濃度におけるセンサーグラムを解析し、各抗体のヒトＨＢ−ＥＧＦに対する結合速度定数及び解離速度定数を算出した。
その結果、両抗体とも本抗体濃度域では、ヒトＨＢ−ＥＧＦと結合後、ほとんど解離反応が認められないことが明らかとなり、解離速度定数については算出できなかった。一方で結合速度定数については、算出が可能であり、その結果を表１に示した。本結果より、両抗体は、ヒトＨＢ−ＥＧＦに対してほぼ同等の結合活性を有することが確認された。
Figure 0005532401
（３）細胞膜に結合しているＨＢ−ＥＧＦに対する抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体の反応性
細胞株を０．０２％−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製）で剥離しＰＢＳで洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を加え、３００Ｇ、５分間遠心して上清を除去した。細胞に、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈したリコンビナントヒトＨＢ−ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製）を１μｇ／ｍＬで添加し、３７℃で１０分間反応させた。リコンビナントヒトＨＢ−ＥＧＦを添加しない場合は、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳのみを添加し、同様に３７℃で１０分間反応させた。１％ＢＳＡ−ＰＢＳにより２回洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに調製した抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６溶液を、５０μＬ／ウェルで分注してプレートミキサーで攪拌し、氷上に３０分間静置した。ＰＢＳにより２回洗浄後、１００倍希釈した２次抗体ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を５０μＬ／ウェルずつ添加し、プレートミキサーで攪拌して遮光し、氷上に３０分間静置した。ＰＢＳにより２回洗浄後、フローサイトメーターＥＰＩＣＳ ＸＬ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ ｖ３．０（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）にて蛍光強度を測定した。陰性対照抗体としては抗ＦＧＦ８キメラ抗体ＫＭ３０３４（ＵＳ２００４−０２５３２３４）を用いた。
その結果、全ての細胞株において、リコンビナントＨＢ−ＥＧＦを処理した細胞は、処理していない細胞に比べて、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６の反応性が増加した（図８）。従って、本発明の抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６は、膜型および細胞膜に結合したＨＢ−ＥＧＦの両方に結合することが明らかになった。
（４）ヒト固形癌細胞株に対する中和活性
実施例６で得られた、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６のＨＢ−ＥＧＦに対する中和活性を評価するため、ＨＢ−ＥＧＦ依存性増殖阻害活性を測定した。ＨＢ−ＥＧＦ依存性細胞としては、ＨＢ−ＥＧＦ陽性ヒト卵巣癌細胞株ＲＭＧ−Ｉ（ＪＣＲＢ ＩＦ０５０３１５）およびヒト胃癌細胞株ＭＫＮ−２８（ＨＳＲＲＢ ＪＣＲＢ）を用いた。
細胞株を０．０２％−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製）で剥離しＰＢＳで洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）（無血清）を加え、３００Ｇ、５分間遠心分離して上清を除去した。同培地で細胞を懸濁後、ＲＭＧ−Ｉは２．５×１０３個／５０μＬ／ウェル、ＭＫＮ−２８は１×１０４個／５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈したリコンビナントヒトＨＢ−ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製）を、ＲＭＧ−Ｉの場合は３ｎｇ／ｍＬの濃度のものを５０μＬ／ウェル、ＭＫＮ−２８の場合は３０ｎｇ／ｍＬの濃度のものを５０μＬ／ウェルで添加した後、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６を３０μｇ／ｍＬから１０倍で４段階に希釈し、５０μＬ／ウェルで添加して混合した。陰性対照抗体としてｈｕｍａｎ ＩｇＧ（三菱ウェルファーマ社製）を用いた。３７℃で７２時間培養した後、生細胞数測定試薬ＷＳＴ−１（ナカライテスク社製）１５μＬ／ウェルを添加し、２時間後にＯＤ４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｅｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
結果を図９に示した。ＲＭＧ−Ｉ、ＭＫＮ−２８ともに、ＨＢ−ＥＧＦ添加による細胞増殖が認められ、ＨＢ−ＥＧＦ依存性増殖を示した。抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６はＨＢ−ＥＧＦ依存性細胞増殖を抗体濃度依存的に抑制し、中和活性を示した。
（５）抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）
実施例６で得られた抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６のＡＤＣＣ活性を、以下に示す方法に従って測定した。
（５）−１ 標的細胞溶液の調製
ヒト卵巣癌細胞株のＭＣＡＳ、ＲＭＧ−Ｉ、ＥＳ−２、ヒト乳癌細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｔ４７Ｄ、ＳＫ−ＢＲ−３、ＺＲ−７５−１、ヒト胃癌細胞株のＭＫＮ−２８の各種細胞株を０．０２％−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製）で剥離し、１％ＦＣＳ（ＪＲＨ社製）を含むフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（以下、ＡＤＣＣ用培地と記す）で洗浄後、同培地で至適濃度に調製して標的細胞溶液とした。
（５）−２ エフェクター細胞溶液の調製
末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）は、健常人末梢血から以下に示した方法により分離した。ヘパリンナトリウム注Ｎ「シミズ」（清水製薬社製）を少量含ませたシリンジで健常人末梢血５０ｍＬを採血した。採取した末梢血に同量の生理食塩水（大塚製薬製）を加えて希釈し、良く攪拌した。１５ｍＬチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に約６．５ｍＬずつ分注したＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（ＮＹＣＯＭＥＤ社製）の上に、同量の希釈末梢血を静かに重層し、室温で８００Ｇ、３０分間遠心分離して単核球層を分離した。ＡＤＣＣ用培地を用いて２回洗浄した後、同培地により至適濃度に調製し、エフェクター細胞溶液とした。
（５）−３ ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ底プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）の各ウェルに、抗体希釈溶液を５０μＬ分注しておき、（５）−１で調製した標的細胞溶液を５０μＬ、（５）−２で調製したエフェクター細胞溶液を５０μＬ添加して（エフェクター細胞（Ｅ）と標的細胞（Ｔ）の比は２５とした）、全量を１５０μＬとし、３７℃で４時間反応させた。標的細胞自然遊離の値は、標的細胞溶液５０μＬ、培地１００μＬを加えることにより、また、標的細胞およびエフェクター細胞自然遊離の値は、標的細胞溶液５０μＬ、エフェクター細胞５０μＬ、培地５０μＬを加えることにより取得した。標的細胞全遊離の値は、標的細胞溶液５０μＬ、培地８０μＬを加え、反応終了４５分前に９％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を２０μＬ添加することにより取得した。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を、ＬＤＨ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔｅｓｔ（Ｗａｋｏ社製）を用いて、添付説明書に従って吸光度を測定することで検出した。ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。
（式）
ＡＤＣＣ活性（％）＝（［検体の吸光度］−［標的細胞およびエフェクター細胞自然遊離の吸光度］）／（［標的細胞全遊離の吸光度］−［標的細胞自然遊離の吸光度］）×１００
結果を図１０に示した。抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６はＨＢ−ＥＧＦ陽性ヒト固形癌細胞株に対して、抗体濃度依存的に細胞傷害活性を示した。
（６）マウスゼノグラフトを用いた抗腫瘍活性評価
実施例６で得られた抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６の抗腫瘍活性を評価するため、ヒト卵巣癌、ヒト乳癌のマウスゼノグラフト初期癌および進行癌モデルを用いて評価を行なった。
（６）−１ 初期癌モデルでの評価
ヒト卵巣癌細胞株のＭＣＡＳおよびＥＳ−２を０．０２％−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製）で剥離しＰＢＳで洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を加え、３００Ｇ、５分間遠心分離して上清を除去した。同培地を加えて遠心分離操作により洗浄後、至適濃度に調製した細胞懸濁液をＳＣＩＤマウス雌６−８週齢（日本クレア社製）の右脇下にそれぞれ１００μＬで皮下移植した。同日から、抗体投与群はＰＢＳで希釈した抗体溶液を、コントロール群はＰＢＳのみを１００μＬずつ尾静脈投与した（１群５−７匹）。投与は１週間に２回、計８回行い、腫瘍が観察された時点からノギスで腫瘍径を測定した。腫瘍体積は以下の式により算出した。
（式） 腫瘍体積（ｍｍ３）＝長径×短径２ ×０．５
結果を図１１に示した。抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６は、卵巣癌細胞株ＭＣＡＳおよびＥＳ−２の腫瘍増殖を有意に阻害した。従って、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６は、移初期癌モデルにおいて、抗腫瘍効果を有することが明らかになった。。
（６）−２ 進行癌モデルでの評価
ヒト卵巣癌細胞株のＭＣＡＳおよびＥＳ−２、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を０．０２％−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製）で剥離しＰＢＳで洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を加え、３００ Ｇ、５分間遠心して上清を除去した。同培地を加えて遠心分離操作により洗浄後、至適濃度に調製した細胞懸濁液をＳＣＩＤマウス雌６−８週齢（日本クレア社製）の右脇下にそれぞれ１００μＬで皮下移植した。経過を観察して、腫瘍体積が１００ｍｍ３前後になった段階でマウスを選抜し、各群の平均腫瘍体積が同等になるように群分けを行った。同日から、抗体投与群はＰＢＳで希釈した抗体溶液を、コントロール群はＰＢＳのみを１００μＬずつ尾静脈投与した（１群６−７匹）。投与は１週間に２回、計８回行い、抗体投与時点からノギスで腫瘍径を測定した。腫瘍体積は以下の式により算出した。
（式） 腫瘍体積（ｍｍ３）＝長径×短径２ ×０．５
結果を図１２に示した。その結果、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６は、卵巣癌細胞株ＭＣＡＳ、ＥＳ−２および乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の腫瘍増殖を有意に阻害した。従って、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６は、進行癌モデルでおいて、抗腫瘍活性を有することが明らかになった。
実施例８
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体のヒト血液癌細胞株に対する反応性および抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）の評価
（１）ヒト血液癌細胞株におけるＨＢ−ＥＧＦ発現解析
ヒト血液癌細胞株におけるＨＢ−ＥＧＦ発現を評価するため、蛍光抗体法により検討した。ヒト急性骨髄性白血病細胞株のＭＬ−１（ＤＳＭＺ ＡＣＣ４６４）、ＭＯＬＭ−１３（ＤＳＭＺ ＡＣＣ５５４）、ＭＶ−４−１１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ９５９１）、ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）、ＮＢ−４（ＤＳＭＺ ＡＣＣ２０７）、ＫＧ−１ａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４６．１）およびヒトＴ細胞性白血病細胞株のＫａｒｐａｓ２９９（ＤＳＭＺ ＡＣＣ３１）、Ｊｕｒｋａｔ（ＲＣＢ ＲＣＢ０８０６）をＰＢＳで洗浄後、至適濃度に調製し、９６ウェルＵ底プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に５０μＬ／ウェル（約２×１０５ｃｅｌｌｓ）で分注した。１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて２０μｇ／ｍＬに調製した抗ＨＢ−ＥＧＦマウス抗体ＫＭ３５６６溶液を５０μＬ／ウェルを分注してプレートミキサーで攪拌し、氷上に３０分間静置した。ＰＢＳにより２回洗浄後、５０倍希釈した２次抗体Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ Ｉｇｓ／ＦＩＴＣ Ｇｏａｔ Ｆ（ａｂ’）２（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで添加し、プレートミキサーで攪拌して遮光して氷上に３０分間静置した。ＰＢＳで２回洗浄後、フローサイトメーターＥＰＩＣＳ ＸＬ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ ｖ３．０（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を用いて、蛍光強度を測定した。陰性対照抗体としてはｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１（ＤＡＫＯ社製）を用いた。
結果を図１３に示した。ＫＭ３５６６は、Ｔ細胞性白血病および急性骨髄性白血病細胞株に特異的に結合した。従って、ヒト血液癌細胞株おいて、ＨＢ−ＥＧＦが発現していることが確認された。
（２）ヒト血液癌細胞株に対する抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）
ＨＢ−ＥＧＦ発現が確認された急性骨髄性白血病細胞株に対する、ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６のＡＤＣＣ活性を、以下に示す方法に従って測定した。
（２）−１ 標的細胞溶液の調製
ヒト急性骨髄性白血病細胞株のＭＬ−１、ＭＯＬＭ−１３、ＭＶ−４−１１、ＨＬ−６０、ＮＢ−４およびＫＧ−１ａをＰＢＳで洗浄後、ＡＤＣＣ用培地で洗浄後、同培地で至適濃度に調製して標的細胞溶液とした。
（２）−２ エフェクター細胞溶液の調製
末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）は、健常人末梢血から以下に示した方法により分離した。ヘパリンナトリウム注Ｎ「シミズ」（清水製薬社製）を少量含ませたシリンジで健常人末梢血５０ｍＬを採血した。採取した末梢血に同量の生理食塩水（大塚製薬製）を加えて希釈し、良く攪拌した。１５ｍＬチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に約６．５ｍＬずつ分注したＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（ＮＹＣＯＭＥＤ社製）の上に、同量の希釈末梢血を静かに重層し、室温で８００Ｇ、３０分間遠心分離して単核球層を分離した。ＡＤＣＣ用培地を用いて２回洗浄した後、同培地により至適濃度に調製し、エフェクター細胞溶液とした。
（２）−３ ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ底プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）の各ウェルに、抗体希釈溶液を５０μＬ分注しておき、（２）−１で調製した標的細胞溶液を５０μＬ、（２）−２で調製したエフェクター細胞溶液を５０μＬ添加して（エフェクター細胞（Ｅ）と標的細胞（Ｔ）の比は２５とした）、全量を１５０μＬとし、３７℃で４時間反応させた。標的細胞自然遊離の値は、標的細胞溶液５０μＬ、培地１００μＬを加えることにより、また、標的細胞およびエフェクター細胞自然遊離の値は、標的細胞溶液５０μＬ、エフェクター細胞５０μＬ、培地５０μＬを加えることにより取得した。標的細胞全遊離の値は、標的細胞溶液５０μＬ、培地８０μＬを加え、反応終了４５分前に９％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を２０μＬ添加することにより取得した。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を、ＬＤＨ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔｅｓｔ（Ｗａｋｏ社製）を用いて、添付説明書に従って吸光度を測定することで検出した。ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。
（式）
ＡＤＣＣ活性（％）＝（［検体の吸光度］−［標的細胞およびエフェクター細胞自然遊離の吸光度］）／（［標的細胞全遊離の吸光度］−［標的細胞自然遊離の吸光度］）×１００
結果を図１４に示した。抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６はＨＢ−ＥＧＦ陽性ヒト血液癌細胞株に対して、抗体濃度依存的に細胞傷害活性を示した。従って、本発明の抗ＥＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体および遺伝子組換え抗体が、ＨＢ−ＥＧＦを発現している卵巣癌などの固形癌のみならず、急性骨髄性白血病、およびＴ細胞性白血病などの血液癌に対しても有効な可能性が示唆された。
実施例９
抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体の作製
（１）抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の設計
まず、抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
配列番号１２〜１４でそれぞれ表される抗体ＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＨをそのアミノ酸配列の相同性から３種類のサブグループ（ＨＳＧ Ｉ〜ＩＩＩ）に分類し、更に、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］。それら共通配列は、ヒトにおいてより免疫原性が低下する可能性が考えられることから、それら共通配列を基に抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列を設計した。より結合活性の高い抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体を作製するために、設計にあたってはヒト抗体のＶＨの３種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、抗ＨＢ−ＥＧＦマウス抗体ＫＭ３５６６のＶＨのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を選択した。
相同性を検索した結果、ＨＳＧＩ、ＨＳＧＩＩおよびＨＳＧＩＩＩの相同性はそれぞれ７３．６％、５０．６％および５６．３％であった。従って、ＫＭ３５６６のＶＨ領域のＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩと最も高い相同性を有していた。
以上の結果から、ヒト抗体のＶＨのサブグループＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗ＨＢ−ＥＧＦマウス抗体ＫＭ３５６６のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植した。しかし、配列番号９に記載のＫＭ３５６６のＶＨのアミノ酸配列中の７４番目のＬｙｓは、カバットらがあげるヒト抗体ＦＲのアミノ酸配列の相当する部位において、最も使用される頻度が高いアミノ酸残基ではないが、比較的高い頻度で使用されるアミノ酸残基であるため、上記のＫＭ３５６６のアミノ酸配列で認められるアミノ酸残基を用いることとした。このようにして、配列番号２２で表される抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０を設計した。
次に、抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
配列番号１５〜１７でそれぞれ表される抗体ＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性から４種類のサブグループ（ＨＳＧ Ｉ〜ＩＶ）に分類し、更に、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］。そこでＶＨの場合と同様にして、ヒト抗体のＶＬの４種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、抗ＨＢ−ＥＧＦマウス抗体ＫＭ３５６６のＶＬのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を選択した。
相同性を検索した結果、ＨＳＧＩ、ＨＳＧＩＩ、ＨＳＧＩＩＩおよびＨＳＧＩＶの相同性はそれぞれ７５．０％、７５．０％、７１．３％および８１．３％であった。従って、ＫＭ３５６６のＶＬのＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩＶと最も高い相同性を有していた。
以上の結果から、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩＶの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗ＨＢ−ＥＧＦマウス抗体ＫＭ３５６６のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植した。しかし、配列番号１１に記載のＫＭ３５６６のＶＬのアミノ酸配列中の１１０番目のＬｅｕは、カバットらがあげるヒト抗体ＦＲのアミノ酸配列の相当する部位において、最も使用される頻度が高いアミノ酸残基ではないが、比較的高い頻度で使用されるアミノ酸残基であるため、上記のＫＭ３５６６のアミノ酸配列で認められるアミノ酸残基を用いることとした。このようにして、配列番号２３で表される抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０を設計した。
上記で設計した抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に抗ＨＢ−ＥＧＦマウス抗体ＫＭ３５６６のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列である。しかし、一般に、ヒト化抗体を作製する場合には、単なるヒト抗体のＦＲへのマウス抗体のＣＤＲのアミノ酸配列の移植のみでは結合活性が低下してしまうことが多い。このため、結合活性の低下を回避するため、ＣＤＲのアミノ酸配列の移植とともに、ヒト抗体とマウス抗体で異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基を改変することが行われている。そこで、本実施例でも、結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を以下のようにして同定した。
まず、上記で設計した抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０よりなる抗体Ｖ領域（ＨＶ０ＬＶ０）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製に関してはソフトウェアＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）を、三次元構造の表示についてはソフトウェアＰｒｏ−Ｅｘｐｌｏｒｅ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）、あるいはＶｉｅｗｅｒＬｉｔｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製）を用いてそれぞれ添付の使用説明書に従い、行った。また、抗ＨＢ−ＥＧＦマウスモノクローナル抗体ＫＭ３５６６のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。更に、ＨＶ０ＬＶ０のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、抗ＨＢ−ＥＧＦマウス抗体ＫＭ３５６６と異なっているアミノ酸残基を選択し、抗ＨＢ−ＥＧＦマウス抗体ＫＭ３５６６のアミノ酸残基へ改変したアミノ酸配列を作製し、同様に三次元構造モデルを構築した。これら作製した抗ＨＢ−ＥＧＦマウス抗体ＫＭ３５６６、ＨＶ０ＬＶ０および改変体のＶ領域の三次元構造を比較し、抗体の結合活性に影響を与えると予測されるアミノ酸残基を同定した。
その結果、ＨＶ０ＬＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基として、ＨＶ０では９番目のＡｌａ、２０番目のＶａｌ、３０番目のＴｈｒ、３８番目のＡｒｇ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、９５番目のＴｙｒ、および１１８番目のＶａｌを、ＬＶ０では１５番目のＬｅｕ、１９番目のＡｌａ、２１番目のＩｌｅ、４９番目のＰｒｏ、および８４番目のＬｅｕをそれぞれ選択した。これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸配列をマウス抗体ＫＭ３５６６の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ改変し、様々な改変を有するヒト化抗体のＶＨおよびＶＬを設計した。具体的には、抗体ＶＨについては、配列番号２２で表されるアミノ酸配列の９番目のＡｌａをＴｈｒに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＴｈｒをＡｒｇに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４１番目のＰｒｏをＴｈｒに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１８番目のＶａｌをＬｅｕに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。また、ＶＬについては、配列番号２３で表されるアミノ酸配列の１５番目のＬｅｕをＶａｌに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、４９番目のＰｒｏをＳｅｒに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。
（２） 抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＶＨをコードするｃＤＮＡの構築
本実施例（１）で設計した抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲを用いて以下のようにして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列と、配列番号９の１〜１９番目に表される抗ＨＢ−ＥＧＦマウス抗体ＫＭ３５６６のＨ鎖の分泌シグナル配列とを繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。１つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を設計し、更に５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計４本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、合成ＤＮＡ（配列番号２４〜２７）を合成した。
各合成ＤＮＡ（配列番号２４〜２７）を最終濃度が０．１μｍｏｌ／Ｌとなるように５０μＬの反応液に加えて、０．５μｍｏｌ／Ｌ Ｔ３プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）、０．５μｍｏｌ／Ｌ Ｔ７プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）および１単位のＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付の使用説明書に従い、ＰＣＲを行った。この際の反応条件は使用説明書に記された条件（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７４℃６０秒間のサイクルを３０サイクル）に従った。該反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、適当な制限酵素処理を行った後に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、形質転換株の株よりプラスミドＤＮＡを調製し、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列を有するプラスミドを取得した。
次に、実施例９（１）で設計したＦＲのアミノ酸残基の改変は、変異を有する合成ＤＮＡを作製し、上記のＰＣＲを行うか、上記で作製したＨＶ０をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを鋳型として変異を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、増幅遺伝子断片を単離することにより行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、抗ＨＢ−ＥＧＦマウス抗体ＫＭ３５６６に見られる遺伝子コドンとなるように行った。また、以下、特に記載の無い場合、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃６０秒間のサイクルを、３５サイクルのＰＣＲ反応で反応させた。ＰＣＲ反応はＫＯＤ−ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用して行った。また、使用した合成ＤＮＡはファスマック社製のものである。
次に、上記ＨＶ０の Ｖａｌ２０Ｔｈｒ３０Ｍｅｔ４８Ｖａｌ６８ＩＬｅ７０Ｔｙｒ９５Ｖａｌ１１８をＬｅｕ２０Ａｒｇ３０Ｉｌｅ４８Ａｌａ６８Ｌｅｕ７０Ｐｈｅ９５Ｌｅｕ１１８に改変したＶＨ（以下、ＨＶ７）を以下のように作製した。
０．１μｍｏｌ／Ｌのアミノ酸変異を有する合成ＤＮＡ（配列番号３２〜３５）と、その両端に位置するプライマーＭ１３ＲＶプライマー（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）および、Ｍ１３Ｍ４プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）を０．４μｍｏｌ／Ｌ加え、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液を、Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、０．８〜１．５％のアガロース電気泳動を行い、目的の０．４５ｋｂｐ付近の遺伝子断片をＧｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出した。特異的な制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＢｌｕｓｅｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（以下、ｐＢＳ）にサブクローニングを行い、抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ７をコードする遺伝子（配列番号３６）を含むベクターｐＢＳ／ＨＶ７を取得した。
（３）抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
本実施例（１）で設計した抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲを用いて以下のようにして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列と、配列番号１１の１〜２０番目に表される抗ＨＢ−ＥＧＦマウス抗体ＫＭ３５６６のＬ鎖の分泌シグナル配列とを繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。１つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を設計し、更に５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を、５’末端側から約１００塩基ずつ計４本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、合成ＤＮＡ（配列番号２８〜３１）を合成した。
各合成ＤＮＡ（配列番号２８〜３１）を最終濃度が０．１μｍｏｌ／Ｌとなるように５０μＬの反応液に加えて、０．５μｍｏｌ／Ｌ Ｔ３プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）、０．５μｍｏｌ／Ｌ Ｔ７プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）および１単位のＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付の使用説明書に従い、上記（２）と同様にＰＣＲを行った。反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、適当な制限酵素処理を行った後に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、形質転換株よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列を有するプラスミドｐＢＳ／ＬＶ０を取得した。
次に、本実施例（１）で設計したＦＲのアミノ酸残基の改変は、変異を有する合成ＤＮＡを作製し、上記のＰＣＲを行うか、上記で作製したＬＶ０をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを鋳型として変異を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、増幅遺伝子断片を単離することにより行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、抗ＨＢ−ＥＧＦマウス抗体ＫＭ３５６６で見られる遺伝子コドンとなるように行った。
ＰＣＲ反応は９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃６０秒間のサイクルを、３５サイクルで、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用して行った。また、使用した合成ＤＮＡはファスマック社製のものを使用した。
次に、ＬＶ０のＬｅｕ１５Ａｌａ１９Ｉｌｅ２１Ｐｒｏ４９Ｌｅｕ８４をＶａｌ１５Ｖａｌ１９Ｍｅｔ２１Ｓｅｒ４９Ｖａｌ８４に改変したＶＬ（以下、ＬＶ５）を以下のように作製した。
０．１μｍｏｌ／Ｌのアミノ酸変異を有する合成ＤＮＡ（配列番号３７〜４０）と、その両端に位置するプライマーＭ１３ＲＶプライマー（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）および、Ｍ１３Ｍ４プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）を０．４μｍｏｌ／Ｌ加え、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液を、Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、０．８−１．５％のアガロース電気泳動を行い、目的の０．４５ｋｂｐ付近の遺伝子断片をＧｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出した。特異的な制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＢＳにサブクローニングを行い、抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ５をコードする遺伝子（配列番号４１）を含むベクターｐＢＳ／ＬＶ５を取得した。
（４）抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体発現ベクターの構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の適当な位置に本実施例（２）および（３）で得られたＨＶ０およびＬＶ０をコードするそれぞれのｃＤＮＡ、あるいはそれらの改変体をコードするｃＤＮＡを挿入し、各種抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体発現ベクターを構築した。
（５）抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体の動物細胞を用いた安定発現および精製抗体の取得
抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体の動物細胞を用いた安定発現および培養上清からの抗体の精製は、実施例６（２）および（３）に記載の方法と同様にして行った。その結果、抗体のＶＨがＨＶ０、ＶＬがＬＶ０からなる抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０、抗体のＶＨがＨＶ７、ＶＬがＬＶ０からなるＨＶ７ＬＶ０、および抗体のＶＨがＨＶ７、ＶＬがＬＶ５からなるＨＶ７ＬＶ５の３種類を作製した。
実施例１０
（１）抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のヒトＨＢ−ＥＧＦに対する結合活性測定
抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のヒトＨＢ−ＥＧＦに対する結合活性を反応速度論的に解析するため、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を用いて実施例７（２）と同様にして測定した。
その結果、実施例９で作製した抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体は、実施例２（２）における抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６の結果と同様に、ヒトＨＢ−ＥＧＦと結合後、ほとんど解離反応が認められず、解離速度定数については算出できなかった。
一方で結合速度定数については算出が可能であり、その結果を表２に示した。その結果、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６のＣＤＲを単にヒトフレームワークに移植した抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０は、ヒトＨＢ−ＥＧＦに対する結合活性が抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６の約１／２近くまで減少したが、Ｈ鎖のみアミノ酸改変を加えた抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体ＨＶ７ＬＶ０、Ｈ鎖およびＬ鎖にアミノ酸改変を加えた抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体ＨＶ７ＬＶ５は、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６とほぼ同等まで結合活性が増加した。
Figure 0005532401
（２）抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＨＢ−ＥＧＦ発現細胞に対する反応性
抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＨＢ−ＥＧＦ発現癌細胞に対する反応性について実施例２（１）と同様にして測定した。細胞株はヒト卵巣癌細胞株のＭＣＡＳ（ＪＣＲＢ０２４０）を使用した。結果を図１５に示した。全てのヒト化抗体は抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６と同様にＭＣＡＳに対して反応した。
（３）抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体の中和活性
抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体の中和活性を、実施例２（４）と同様にして測定した。
結果を図１６に示した。ＨＢ−ＥＧＦ非添加時の細胞増殖を１とした時、ＭＫＮ−２８は外因性ＨＢ−ＥＧＦにより細胞増殖が認められ、ＨＢ−ＥＧＦ依存性増殖を示した。結合活性が抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６の約１／２であった抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０は抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６に比べてわずかに中和活性が低い傾向にあったが、ヒトＨＢ−ＥＧＦに対する結合活性が抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６とほぼ同等であった抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体ＨＶ７ＬＶ０およびＨＶ７ＬＶ５は、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６と同等の中和活性を示した。
（４）抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＡＤＣＣ活性
抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体のＡＤＣＣ活性を、実施例２（５）と同様にして測定した。
結果を図１７に示した。結合活性が抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６の約１／２であった抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０は抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６に比べてＡＤＣＣ活性が約１／１０まで減少したが、ヒトＨＢ−ＥＧＦに対する結合活性が抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６とほぼ同等であった抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体ＨＶ７ＬＶ０およびＨＶ７ＬＶ５は、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６と同等のＡＤＣＣ活性を示した。
実施例１１
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の結合エピトープに関する解析
ヒトＨＢ−ＥＧＦに対する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体ＫＭ３５６６、ＫＭ３５７９、及びＫＭ３９６６の結合エピトープについて、下記の解析を行った。
１）変異型ヒトＨＢ−ＥＧＦ全長遺伝子導入細胞の造成
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体 ＫＭ３５６６、ＫＭ３５７９、及びＫＭ３９６６はいずれもヒトＨＢ−ＥＧＦに反応し、マウスＨＢ−ＥＧＦには交差反応性を示さない。そこで、ヒトＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦ様ドメインのアミノ酸配列中で、マウスＨＢ−ＥＧＦと異なる１０個のアミノ酸を、各々１個ずつマウス由来のアミノ酸に置換した１０種類の変異型ヒトＨＢ−ＥＧＦ全長タンパク質（以下、変異ＨＢ−ＥＧＦと記す。）を発現する遺伝子導入細胞を造成し、これらに対する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の結合活性を測定することにより、結合エピトープの解析を行った。作製した１０種類の変異ＨＢ−ＥＧＦを以下に示す。
（１）Ｎ末端より１１５番目のフェニルアラニンをチロシンに置換した変異ＨＢ−ＥＧＦ（以下、Ｆ１１５Ｙと表記）、
（２）Ｎ末端より１２２番目のリジンをアルギニンに置換した変異ＨＢ−ＥＧＦ（以下、Ｋ１２２Ｒと表記）、
（３）Ｎ末端より１２４番目のバリンをロイシンに置換した変異ＨＢ−ＥＧＦ（以下、Ｖ１２４Ｌと表記）、
（４）Ｎ末端より１２５番目のリジンをグルタミンに置換した変異ＨＢ−ＥＧＦ（以下、Ｋ１２５Ｑと表記）、
（５）Ｎ末端より１２７番目のロイシンをフェニルアラニンに置換した変異ＨＢ−ＥＧＦ（以下、Ｌ１２７Ｆと表記）、
（６）Ｎ末端より１２９番目のアラニンをスレオニンに置換した変異ＨＢ−ＥＧＦ（以下、Ａ１２９Ｔと表記）、
（７）Ｎ末端より１３３番目のイソロイシンをリジンに置換した変異ＨＢ−ＥＧＦ（以下、Ｉ１３３Ｋと表記）、
（８）Ｎ末端より１３５番目のヒスチジンをロイシンに置換した変異ＨＢ−ＥＧＦ（以下、Ｈ１３５Ｌと表記）、
（９）Ｎ末端より１４１番目のグルタミン酸をヒスチジンに置換した変異ＨＢ−ＥＧＦ（以下、Ｅ１４１Ｈと表記）、
（１０）Ｎ末端より１４７番目のセリンをスレオニンに置換した変異ＨＢ−ＥＧＦ（以下、Ｓ１４７Ｔと表記）。
さらに陽性対照として以下のヒト／マウスキメラ型ＨＢ−ＥＧＦ全長遺伝子導入細胞を造成した。
（１１）Ｎ末端より１番目から４９番目までの配列がマウスＨＢ−ＥＧＦ由来配列、Ｎ末端より５０番目から２０８番目までの配列がヒトＨＢ−ＥＧＦ由来配列から成る、ヒト／マウスキメラ型ＨＢ−ＥＧＦ（以下、ｐＲＴＨＧＣ−６と記す。）を作製した。ＥＧＦ様ドメインは、全てヒトＨＢ−ＥＧＦ由来配列である為、陽性対照として用いた。
上記の変異ＨＢ−ＥＧＦおよびヒト／マウスキメラ型ＨＢ−ＥＧＦの一過性発現用プラスミドは、目加田らの方法（Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．２７２， ２７０８４−２７０９０， １９９７）を用いて作製した。マウスＬＭＴＫ−細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１．３）は、１００ ｕｎｉｔ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇ、１００μｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、１０ ％ウシ胎児血清を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍにて培養した。上記の各発現プラスミドをリン酸カルシウム法によりマウスＬＭＴＫ−細胞に導入後、４８時間培養したものを以降の実験に用いた。
陰性対照には、ベクターのみをマウスＬＭＴＫ−細胞に導入した細胞（以下、ｍｏｃｋと表記）を用いた。
２）変異ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子導入細胞を用いた抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の結合活性解析
まず、１×１０５個の変異ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子導入細胞、ヒト／マウスキメラ型ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子導入細胞、およびｍｏｃｋに、結合バッファー（Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２に非必須アミノ酸、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）、１０％ウシ胎児血清を添加したもの）で２ μｇ／ｍＬに希釈したビオチン標識抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体（ＫＭ３５６６、ＫＭ３５７９、ＫＭ３９６６）を４℃、２時間反応させた。反応後、氷冷した洗浄バッファー（ＰＢＳに０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ウシ胎児血清を添加したもの）で２回洗浄し、続いて１回ＰＢＳ（＋）（ＰＢＳに０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を添加したもの）で洗浄した。洗浄した細胞に、ＰＢＳ（＋）で１．８％に希釈したホルムアルデヒド溶液を加え、４℃、２０分間、細胞を固定した。次に、ＰＢＳ（＋）で１回洗浄した後、グリシン溶液（０．２Ｍ−ｇｌｙｃｉｎｅ、１００ｍＭ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．１）で４℃、２０分間処理し、続いて洗浄バッファーで４℃、２０分間インキュベートした。次に、結合バッファーで０．１μｇ／ｍＬに希釈したＨＲＰ結合ストレプトアビジンを、４℃、１時間反応させ、洗浄バッファーで２回洗浄、ＰＢＳ（＋）で２回洗浄した。ペルオキシダーゼ検出用キット（ナカライテスク社製、ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＯＰＤキット）を用いて発色を行い、４９２ｎｍにおける吸光度を測定し、細胞に結合したＨＲＰ活性を測定した。
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の各種変異ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子導入細胞、およびヒト／マウスキメラ型ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子導入細胞に対する吸光度より、ｍｏｃｋに対する吸光度を差し引いた値をＡ値とした。
次に、マウスＬＭＴＫ−細胞の細胞膜上に発現した変異ＨＢ−ＥＧＦ蛋白の発現量を解析するため、全ての変異ＨＢ−ＥＧＦに等しく結合する抗ＨＢ−ＥＧＦウサギポリクローナル抗体（抗体名称；Ｈ−６、ヒトＨＢ−ＥＧＦのＮ末端から５４番目〜７３番目までの合成ペプチドをセファロースＣＬ−６Ｂに架橋したものをウサギに免疫感作することにより作製された抗体、ＥＭＢＯ Ｊ．，１３，２３２２−２３３０，（１９９４）の変異ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子導入細胞、ヒト／マウスキメラ型ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子導入細胞、およびｍｏｃｋに対する吸光度を、上記と同様の方法により測定した。ただしビオチン標識Ｈ−６抗体は、抗体濃度１０μｇ／ｍＬで使用した。Ｈ−６抗体の各変異ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子導入細胞およびヒト／マウスキメラ型ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子導入細胞に対する吸光度より、ｍｏｃｋに対する吸光度を差し引いた値をＢ値とした。
遺伝子導入細胞の発現量の差を補正する為、Ａ値をＢ値で除することによりＡ／Ｂ値を求めた。抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の陽性対照ｐＲＴＨＧＣ−６に対するＡ／Ｂ値を１００％とした時の、各種変異型ＨＢ−ＥＧＦに対するＡ／Ｂ値の割合を算出し、これを各種変異ＨＢ−ＥＧＦに対する相対的結合活性とした。
結果を図１８に示した。抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６は、ｐＲＴＨＧＣ−６と比べて、Ｉ１３３Ｋ、Ｈ１３５ＬおよびＳ１４７Ｔに殆んど結合しなかった。従って、抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６は１３３番目のＩ（Ｉｌｅ）、１３５番目のＨ（Ｈｉｓ）および１４７番目のＳ（Ｓｅｒ）のアミノ酸を含むエピトープを認識していることが明らかになった。また、同一の抗体可変領域を有する抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６も、抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６と同様に、ｐＲＴＨＧＣ−６と比べて、Ｉ１３３ＫおよびＨ１３５Ｌには、殆んど結合せず、Ｓ１４７Ｔでは約１／３に結合活性が低下した。従って、抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６は、抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６と同様に、１３３番目のＩ（Ｉｌｅ）、１３５番目のＨ（Ｈｉｓ）および１４７番目のＳ（Ｓｅｒ）のアミノ酸を含むエピトープを認識していることが明らかになった。
抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５７９は、ｐＲＴＨＧＣ−６と比べて、Ｅ１４１Ｈのみに結合せず、他の変異ＨＢ−ＥＧＦには全て、ｐＲＴＨＧＣ−６と同等の結合活性を示した。従って、抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５７９は、１４１番目のＥ（Ｇｌｕ）のアミノ酸を含むエピトープを認識していることが、明らかになった。
以上の結果から、抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５６６および抗ＨＢ−ＥＧＦキメラ抗体ＫＭ３９６６と、抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体ＫＭ３５７９は、ＨＢ−ＥＧＦの異なるエピトープを認識していることが明らかになった。
本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。
なお、本出願は、２００７年１２月５日付けで出願された日本特許出願（特願２００７−３１５０６８）に基づいており、その全体が引用により援用される。
また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
本発明により、細胞膜に結合しているＨＢ−ＥＧＦ、膜型ＨＢ−ＥＧＦおよび分泌型ＨＢ−ＥＧＦに結合するモノクローナル抗体およびその抗体断片が提供される。
配列番号１８−人工配列の説明：ＫＭ３９６６Ｈ増幅プライマー
配列番号１９−人工配列の説明：ＫＭ３９６６Ｈ増幅プライマー
配列番号２０−人工配列の説明：ＫＭ３９６６Ｌ増幅プライマー
配列番号２１−人工配列の説明：ＫＭ３９６６Ｌ増幅プライマー
配列番号２２−人工配列の説明：抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体ＨＶ０のアミノ酸配列
配列番号２３−人工配列の説明：抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体ＬＶ０のアミノ酸配列
配列番号２４−人工配列の説明：ＨＶ０増幅プライマー
配列番号２５−人工配列の説明：ＨＶ０増幅プライマー
配列番号２６−人工配列の説明：ＨＶ０増幅プライマー
配列番号２７−人工配列の説明：ＨＶ０増幅プライマー
配列番号２８−人工配列の説明：ＬＶ０増幅プライマー
配列番号２９−人工配列の説明：ＬＶ０増幅プライマー
配列番号３０−人工配列の説明：ＬＶ０増幅プライマー
配列番号３１−人工配列の説明：ＬＶ０増幅プライマー
配列番号３２−人工配列の説明：ＨＶ７増幅プライマー
配列番号３３−人工配列の説明：ＨＶ７増幅プライマー
配列番号３４−人工配列の説明：ＨＶ７増幅プライマー
配列番号３５−人工配列の説明：ＨＶ７増幅プライマー
配列番号３６−人工配列の説明：ＨＶ７のＤＮＡ配列
配列番号３７−人工配列の説明：ＬＶ５増幅プライマー
配列番号３８−人工配列の説明：ＬＶ５増幅プライマー
配列番号３９−人工配列の説明：ＬＶ５増幅プライマー
配列番号４０−人工配列の説明：ＬＶ５増幅プライマー
配列番号４１−人工配列の説明：ＬＶ５のＤＮＡ配列
配列番号４２−人工配列の説明：抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体ＨＶ７のアミノ酸配列
配列番号４３−人工配列の説明：抗ＨＢ−ＥＧＦヒト化抗体ＬＶ５のアミノ酸配列

Claims (18)

  1. 細胞膜に結合しているヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子（ｈｅｐａｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ 以下、ＨＢ−ＥＧＦと称す。）、膜型ＨＢ−ＥＧＦおよび分泌型ＨＢ−ＥＧＦに結合する遺伝子組換えヒト化モノクローナル抗体であって、
    抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨと記す）が、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体の軽鎖可変領域（以下、ＶＬと記す）が、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合活性を有するその抗体断片。
  2. 細胞膜に結合しているＨＢ−ＥＧＦ、膜型ＨＢ−ＥＧＦおよび分泌型ＨＢ−ＥＧＦに結合する遺伝子組換えヒト化モノクローナル抗体であって、
    ＶＨが、配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合活性を有するその抗体断片。
  3. 細胞膜に結合しているＨＢ−ＥＧＦ、膜型ＨＢ−ＥＧＦおよび分泌型ＨＢ−ＥＧＦに結合する遺伝子組換えヒト化モノクローナル抗体であって、
    ＶＨが、配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合活性を有するその抗体断片。
  4. 細胞膜に結合しているＨＢ−ＥＧＦ、膜型ＨＢ−ＥＧＦおよび分泌型ＨＢ−ＥＧＦの上皮増殖因子様ドメイン（ＥＧＦ様ドメイン）に結合する請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
  5. 分泌型ＨＢ−ＥＧＦとＨＢ−ＥＧＦ受容体との結合を阻害する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
  6. 分泌型ＨＢ−ＥＧＦに対して中和活性を有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
  7. 分泌型ＨＢ−ＥＧＦと、ＨＢ−ＥＧＦ受容体またはジフテリアトキシンとの結合領域に結合する請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
  8. 配列番号２で表されるアミノ酸配列の１３３番目、１３５番目、および１４７番目のうち、少なくとも１つのアミノ酸を含むエピトープに結合する請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
  9. 配列番号２で表されるアミノ酸配列の１３３番目、１３５番目および１４７番目のアミノ酸を含むエピトープに結合する請求項８に記載の抗体または抗体断片。
  10. ハイブリドーマＫＭ３５６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４９０）が生産するモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
  11. 抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）および６個のＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体断片。
  12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片をコードするＤＮＡ。
  13. 請求項１２に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
  14. 請求項１３に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
  15. 請求項１４に記載の形質転換体を培地で培養し、培養物中に請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の製造方法。
  16. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を有効成分として含有する医薬。
  17. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を有効成分として含有する、ＨＢ−ＥＧＦが関与する疾患の治療剤。
  18. ＨＢ−ＥＧＦが関与する疾患が癌である、請求項１７に記載の治療剤。
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