JP3131322B2 - 新規α2→3シアリルトランスフェラーゼ - Google Patents
新規α2→3シアリルトランスフェラーゼInfo
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
トランスフェラーゼ、該α2→3シアリルトランスフェ
ラーゼをコードするDNA、該DNAが組み込まれた組
換え体ベクターおよび該組換え体ベクターを含有する細
胞ならびにそれらの製造法に関する。さらに、該α2→
3シアリルトランスフェラーゼを用いる糖鎖の製造法お
よび該α2→3シアリルトランスフェラーゼを形質転換
細胞内に生産させることによる糖鎖の製造法に関する。
さらには、本発明のα2→3シアリルトランスフェラー
ゼをコードするDNAを用いる該α2→3シアリルトラ
ンスフェラーゼの検出法およびその生産の抑制法に関す
る。本発明のα2→3シアリルトランスフェラーゼは、
有用生理活性を有する糖鎖とその修飾物の製造および有
用生理活性タンパク質に結合している糖鎖の改良に有用
である。
るタンパク質が糖鎖を有していないのに対し、酵母、カ
ビ、植物細胞、動物細胞等の真核生物によって生産され
るタンパク質および脂質には糖鎖が結合している場合が
多い。動物細胞の糖鎖としては、タンパク質に付加する
ものとして、タンパク質中のアスパラギン(Asn)残
基に結合するN−グリコシド結合型糖鎖(N−グリカン
とも呼ばれる)、およびセリン(Ser)またはスレオ
ニン(Thr)残基に結合するO−グリコシド結合型糖
鎖(O−グリカンとも呼ばれる)が知られている。最
近、数多くのタンパク質には糖鎖を含むある種の脂質が
共有結合しており、この脂質を介してそれらのタンパク
質は細胞膜に付着していることが明らかとなった。糖鎖
を含むこの脂質はグリコシル・ホスファチジルイノシト
ール・アンカー(glycosyl phosphatidylinositol anch
or)と呼ばれる。
ミノグリカン(Glycosaminoglycan)があげられる。タン
パク質とグリコサミノグリカンが共有結合している化合
物はプロテオグリカン(proteoglycan)と呼ばれる。プロ
テオグリカンの糖鎖を構成するグリコサミノグリカン
は、糖タンパク質糖鎖であるO−グリカンと構造が類似
しているが化学的には異なっている。グリコサミノグリ
カンは、グルコサミン(glucosamine) またはガラクトサ
ミン(galactosamine) とウロン酸〔但し、ケラタン硫酸
(keratan sulfate) はウロン酸を有していない〕を含む
2糖単位の繰り返し構造から成り、硫酸基が共有結合し
ている〔但し、ヒアルロン酸(hyaluronicacid) は硫酸
基を有していない〕という特徴を有している。
lycolipid)と呼ばれる物質に含まれる糖鎖が挙げられ
る。動物細胞の糖脂質としては、糖と長鎖脂肪酸と長鎖
塩基であるスフィンゴシン(sphingosine) が共有結合し
たスフィンゴ糖脂質(sphingoglycolipid) と、糖鎖がグ
リセロールに共有結合したグリセロ糖脂質(glyceroglyc
olipid) とが知られている。
細胞生物学の進歩とともに急速に解明が進んでおり、現
在までに糖鎖の多様な機能が明らかにされてきている。
糖鎖は血中における糖タンパク質のクリアランスに重要
な役割を果たしている。大腸菌に遺伝子を移入して作ら
れたエリスロポイエチン(erythropoietin)は、生体外(i
n vitro)では活性を示すが、生体内(in vivo) では急速
にクリアランス(clearance) されることが知られている
〔ドーダル(Dordal)ら:エンドクリノロジー(Endocrino
logy), 116, 2293 (1985) およびブローネ(Browne)ら:
コールド・スプリング・ハーバー・シンポジア・オン・
クアンティテェイティブ・バイオロジー(Cold Spr.Har
b.Symp.Quant.Biol.), 51, 693 (1986)〕。またヒト顆
粒球・マクロファージコロニー刺激因子(human granul
ocyte-macrophage colony stimulating factor;hGM
−CSF)は、天然ではN−グリコシド結合型糖鎖を2
本持っているが、糖鎖の本数を減らすとそれに比例して
ラット血漿のクリアランス速度が速まることが知られて
いる〔ドナヒュー(Donahue) ら:コールド・スプリング
・ハーバー・シンポジア・オン・クアンティテェイティ
ブ・バイオロジー(Cold Spr.Harb.Symp.Quant.Biol.),
51, 685 (1986)〕。クリアランスの速度およびクリアラ
ンスされる部位は糖鎖の構造によっても変化し、シアル
酸がついたhGM−CSFは腎臓でクリアランスされる
のに対し、シアル酸を除去したhGM−CSFはクリア
ランス速度が速まり、肝臓でクリアランスされることが
知られている。また、ラット肝初代培養の系で各種のN
−グリコシド結合型糖鎖生合成阻害剤存在下に生合成さ
れた糖鎖構造の異なるα1-acid glycoprotein につい
て、ラットの血漿中でのクリアランス速度及びラット灌
流液からのクリアランス速度を調べたところ、どちらの
場合も、高マンノース型、糖鎖欠損、ハイブリッド型、
複合型(天然型)の順でクリアランス速度が遅くなっ
た。また、血栓溶解剤としてすでに医薬品として用いら
れている組織型プラスミノーゲン活性化因子(t−P
A;tissue-type plasminogen activator )の血中での
クリアランスもその糖鎖の構造が大きく影響を与えるこ
とが知られている。
付与することが知られており、例えば、フィブロネクチ
ン(fibronectin)の糖鎖形成をツニカマイシンで阻害す
ると、得られた糖鎖欠損フィブロネクチンの細胞内タン
パク質の分解の速度が増進する。糖鎖の付加により、熱
安定性や抗凍結性が増大することも知られている。ま
た、エリスロポイエチンやβ−インターフェロンなどに
おいては、タンパク質の溶解性の増大に糖鎖が寄与して
いることが知られている。
持するのにも役立っている。水泡性口内炎ウイルスの膜
結合糖タンパク質の天然に存在する2本のN−グリコシ
ド結合型糖鎖を除去すると、タンパク質の細胞表面への
輸送が阻害されるが、そのタンパク質に新たな糖鎖が付
加されるとそれが回復することが知られている。この場
合、糖鎖の除去により、ジスルフィド結合によるタンパ
ク質分子間の会合が誘起され、その結果タンパク質の輸
送が阻害されることが明らかとなった。また新たに糖鎖
を付加すると、この会合が阻害されることによりタンパ
ク質の正しい立体構造が保持されるため、タンパク質の
輸送が可能になる。また、その際新たな糖鎖が付加され
る位置については、かなりの融通性があることが示され
ている。またその反面、導入される位置によっては天然
の糖鎖を有するタンパク質の輸送をも完全に阻害する場
合があることも明らかとなった。
している例も知られている。hGM−CSF、プロラク
チン(prolactin) 、インターフェロン−γ、ラウシャー
(Rauscher)白血病ウィルスgp70およびインフルエンザ
ヘマグルチニン(influenza hemagglutinin) において、
ポリクローナル抗体またはペプチド上の特定の領域に対
する単クローン抗体を用いた実験から、これらタンパク
の糖鎖が、抗体との反応を阻害していると考えられてい
る。また、糖鎖自身が糖タンパク質の活性発現に直接か
かわっている場合があることも知られており、例えば、
黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、絨毛性性腺刺激
ホルモン等のような糖タンパク質ホルモンの活性発現に
糖鎖が関与していると考えられている。
(G−CSF;granulocyte colony-stimulating facto
r )やプロウロキナーゼ(pro-UK; pro-urokinase )等
の有用生理活性タンパク質に、組換えDNA技術を用い
て人為的にかつ意図的に糖鎖を導入することにより、こ
れらのタンパク質の性質を改善することができることが
開示されている。
タンパク質間または細胞とタンパク質間の認識現象に関
与していることが挙げられる。例えば、糖鎖の構造の違
いにより生体内でクリアランスされる場所が異なること
が知られている。また、最近、炎症反応に対し特異的に
血管内皮細胞上に発現し、好中球との接着を促すタンパ
ク質であるELAM-1のリガンドがSialyl-Le X と呼ばれる
糖鎖〔NeuAc α2→3Galβ1→4(Fuc α1→3)GlcNAc
:NeuAc , シアル酸;Gal , ガラクトース;Fuc , フコ
ース;GlcNAc, N−アセチルグルコサミン〕であること
が判明し、糖鎖自体あるいは糖鎖の修飾物が医薬品など
に利用できる可能性がでてきた〔フィリプス (Phillip
s) ら:サイエンス(Science),250, 1130 (1990)、ゲル
ツ(Goelz)ら:トレンズ・イン・グライコサイエンス・
アンド・グライコテクノロジー(Trends in Glycoscienc
e and Glycotechnology) 4, 14 (1992)〕。さらに、一
部のTリンパ球や好中球に発現しているL-セレクチン
(L-selectin)や炎症刺激によって血小板や血管内皮細
胞の膜表面に発現するGMP-140 (P-セレクチンとも呼
ぶ)はELAM-1と同じく炎症反応に関係しており、それら
のリガンドもELAM-1のリガンドであるSialyl-Le X 糖鎖
に類似した糖鎖であることが示唆されている〔ロ−ゼン
(Rosen) ら:トレンズ・イン・グライコサイエンス・ア
ンド・グライコテクノロジー(Trends in Glycoscience
and Glycotechnology),4, 1 (1992)、ラ−セン(Larsen)
ら:トレンズ・イン・グライコサイエンス・アンド・グ
ライコテクノロジー(Trends in Glycoscience and Glyc
otechnology),4, 25 (1992) 、アルフォ(Aruffo)ら:ト
レンズ・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコ
テクノロジー(Trends in Glycoscience and Glycotechn
ology),4, 146 (1992)〕。
ELAM-1やGMP-140 は癌細胞の血管内壁への接着や癌細胞
と血小板との凝集を引き起こすことにより癌転移を促進
していることが示唆されている〔ゲルツ(Goelz) ら:ト
レンズ・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコ
テクノロジー(Trends in Glycoscience and Glycotechn
ology),4, 14 (1992) 、ラ−セン(Larsen)ら:トレンズ
・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコテクノ
ロジー(Trends in Glycoscience and Glycotechnolog
y),4, 25 (1992) 〕。このことは転移能の高い癌細胞で
はSialyl-Le X 糖鎖の発現量が高いという知見とも符合
する〔入村(Irimura) ら:実験医学(Experimental Medc
ine),6, 33 (1988) 〕。
いはその誘導体は、ELAM-1、L-セレクチンまたはGMP-14
0 に結合することにより優れた抗炎症効果を発揮するこ
と、および癌転移が抑制されることが期待される。上述
の炎症反応と癌転移の機構を考慮すると、ELAM-1、L-セ
レクチン、GMP-140 が認識するリガンド糖鎖の合成を司
る糖転移酵素の発現を抑制することによっても炎症反応
を抑制したり、癌転移を防止できることが期待される。
ある特定の遺伝子の発現を抑制するには、アンチセンス
RNA/アンチセンスDNA技術〔徳久(Tokuhisa):バ
イオサイエンスとインダストリー,50, 322 (1992) 、村
上(Murakami):化学 46, 681 (1991) 〕またはトリプル
・ヘリックス (Triple helix) 技術〔チュブ(Chubb) と
ホーガン(Hogan) :トレンズ・イン・バイオテクノジー
(Trends in Biotechnology),10, 132 (1992)〕が有用で
ある。このアンチセンスRNA/DNA技術を用いて所
望の糖転移酵素の生産を抑制するには、その遺伝子ある
いは遺伝子の塩基配列情報が必要であるため、所望の糖
転移酵素の遺伝子をクローン化すること、およびその塩
基配列情報を解析することは重要である。
糖転移酵素の発現を調べることにより、炎症性疾患や癌
の悪性度を診断することもできる。所望の糖転移酵素遺
伝子の発現を調べるには、該遺伝子を放射能などで標識
したものをプローブとするノーザンハイブリダイゼーシ
ョン法〔サンブルック(Sambrook)、フリッチ(Fritsch)
、マニアチス(Maniatis)(モレキュラー・クローニン
グ:ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Clonin
g, A laboratory manual)、第2版、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring H
arbor Laboratory Press) 、1989年刊〕やポリメラ
ーゼ・チェイン・リアクション法(以下、PCR法と略
記する)〔イニス(Innis) ら:PCRプロトコールズ
(PCR Protocols)、アカデミック・プレス(Academic Pre
ss)、1990年刊〕が有用である。これらの手法を適用す
るには、所望の糖転移酵素遺伝子あるいは遺伝子の塩基
配列情報が必要である。この点からも、所望の糖転移酵
素の遺伝子をクローン化すること、およびその塩基配列
情報を解析することは重要である。
を改変したり、特定の糖鎖あるいはその修飾物を大量に
調製することは産業上重要な課題である。糖鎖の構造を
改変する手段については近年著しく進展している。特に
糖鎖を逐次解離してゆく特異性の高い酵素(エキソグリ
コシダーゼ)やペプチド鎖との結合点をペプチド鎖と糖
鎖の双方を変化させずに解裂させるグリコペプチダーゼ
やエンド型グリコシダーゼによって、糖鎖の構造を改変
させることができ、糖鎖の生物学的な役割についても詳
細な研究ができるようになった。さらに、最近、糖脂質
の糖鎖とセラミドの間を開裂するエンドグリコセラミダ
ーゼ(endoglycoceramidase) が見出され〔伊東と山形:
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.B
iol.Chem.) 261, 14278 (1986)〕、これにより、糖脂質
の糖鎖の調製が容易になっただけでなく、糖脂質、特に
細胞表層糖脂質の機能を解明する研究が進展した。ま
た、糖転移酵素により、新たな糖鎖を付加することも可
能となってきた。例えば、シアリルトランスフェラーゼ
により、糖鎖の末端にシアル酸を新たに付加することが
できる〔サベサン (Sabesan)とポールソン (Paulson):
ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ
ー(J.Am.Chem.Soc.)108, 2068 (1986)〕。その他種々の
糖転移酵素やグリコシダーゼの阻害剤〔アランら:アニ
ュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー(Annu. R
ev. Biochem.) 56,497 (1097)]を用いることにより、
付加する糖鎖を変化させることも可能である。しかしな
がら、糖鎖の合成に用いる糖転移酵素を大量に製造する
ことは極めて困難である。そこで、組換えDNA技術を
用いて糖転移酵素をクローン化し、糖転移酵素を宿主細
胞内で効率よく発現させることにより、糖転移酵素を大
量に製造することが望まれる。
ては、タンパク質を精製後、それに対する抗体を作成
し、それを用いてイムノスクリーニングを行なう方法
〔ワインスタイン(Wienstein) ら:ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)262, 177
35 (1987) 〕、タンパク質を精製後、アミノ酸配列を決
定し、それに対応する合成DNA作成し、それをプロー
ブとしてハイブリダイゼーションを行なう方法〔成松
ら:プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci.),US
A 83, 4720 (1986) 〕が知られている。クローン化した
糖転移酵素の遺伝子をプローブにしてハイブリダイゼー
ションを行なうことにより、その糖転移酵素にホモロジ
ーのある糖転移酵素の遺伝子をクローン化する方法が知
られている〔ロウ(John.B. Lowe)ら:ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.) 266,
17467 (1991)]。糖鎖に対する抗体やレクチンを用いた
パンニング(panning) 法をスクリーニング法として用い
る直接発現クローン化法が知られている〔ロウ(John.
B.Lowe) ら:プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス (Proc.Natl.Acad.Sc
i.),USA,86,8227(1989)、ロウ(John.B.Lowe) ら:ジー
ンズ・アンド・ディベラプメント(Genes Develop.) ,
4,1288 (1990) 〕。
ローン化できた例はない。CHO細胞の各種レクチン耐
性変異株に関する研究から、それらのレクチン耐性変異
株においては、新たな糖転移酵素が発現する場合、ある
糖転移酵素の活性が消失する場合、糖ヌクレオチドの合
成やゴルジ体への移行に障害がある場合があることが明
らかになっている〔スタンレー(Pamela Stanley)ら:メ
ソッド・イン・エンザイモロジー (Methods in Enzymol
ogy),96巻,157頁〕。したがって、CHO細胞またはC
HO細胞のレクチン耐性変異株に、クローン化しようと
する糖転移酵素を発現している細胞由来の遺伝子を導入
し、レクチン耐性を指標に糖転移酵素のクローン化が可
能と考えられる〔クマー(Ravindra Kumar)ら:モレキュ
ラー・アンド・セリュラー・バイオロジー(Mol.Cell.Bi
ol.),9,5713(1989) 〕。リプカ(James Ripka) らは、C
HO細胞のレクチン耐性変異株(Lec1)に、A431細
胞由来のヒトのジェノミックDNAを導入し、コンカナ
バリンAというレクチンに対する耐性化を指標にN−ア
セチルグルコサミニルトランスフェラーゼIのクローン
化を試みている。しかしながら、彼らは、このレクチン
耐性を指標にしたスクリーニング法では糖転移酵素をク
ローン化することはできなかった〔リプカ(James Ripk
a) ら:バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・
リサーチ・コミュニケーション(Biochem.Biophys.Res.C
ommun.),159,554(1989) 〕。またヘファーナンらは、ポ
リオーマのラージT抗原を生産するようにしたCHO細
胞〔ヘファーナン(Michael Heffernan) ら:ヌクレイッ
ク・アシッド・リサーチ(NucleicAcids Res.),19,85(19
91)〕に、cDNAライブラリーを導入後、WGA(whe
at germ agglutinin )というレクチンに対する耐性化
を指標にマウスの sialicacid hyroxylase のクローン
化を行なっている〔ヘファーナン(Michael Heffernan)
ら:グライココンジュゲート・ジャーナル(Glycoconjug
ate J.),8,154(1991) 〕が、このレクチン耐性を指標に
したスクリーニング系で糖転移酵素のクローン化ができ
たという報告はない。また、宿主に関しては、スタンレ
ー、リプカ、ヘファーナンらはいずれもCHO細胞また
はCHO細胞のレクチン耐性変異株を宿主として用いて
いる。
βガラクトシドα2→6シアリルトランスフェラーゼ
(βGalactoside α2→6sialyltransferase)活性を有
する酵素をコードするcDNAが単離されており、その
塩基配列も明らかになっている〔ワインスタイン(Wiens
tein) ら:ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー(J.Biol.Chem.)262,17735(1987) 〕。βガラクト
シドα2→3シアリルトランスフェラーゼ(βGalactos
ide α2→3sialyltransferase)活性を有する酵素に関
しては、ギルスピー(Gillespie) らが、糖タンパク質の
Oグリコシド結合型糖鎖(セリンまたはスレオニン残基
に付加する糖鎖)中のガラクトースにシアル酸を付加す
る酵素をコードする遺伝子のクローン化を報告している
が、その塩基配列は明らかにされていない。〔ギルスピ
ー(Gillespie) ら:グライココンジュゲート・ジャーナ
ル(Glycoconjugate J.),7,469(1990) 〕。また、ワイン
スタイン(Weinstein) らは、ラット肝臓からβガラクト
シドα2→3シアリルトランスフェラーゼ(βGalactos
ide α2→3sialyltransferase)活性を有する酵素を精
製する方法を報告している〔ワインスタイン(Wienstei
n) ら:ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー(J.Biol.Chem.)257,13835(1982) 〕が、この方法で
は所望の酵素を極めて少量しか得ることができない。こ
れまで組換えDNA技術を用いて、タンパク質、糖脂
質、オリゴ糖などの糖鎖の所望の位置にα2→3結合で
シアル酸を付加したという報告はない。
パク質の糖鎖の改変および特定の糖鎖の効率的生産を行
うことができる新規α2→3シアリルトランスフェラー
ゼおよび該α2→3シアリルトランスフェラーゼをコー
ドするDNAおよび該DNAを含有するベクターを提供
することにある。
から抽出したmRNAを鋳型として合成したcDNAを
発現クローニングベクターに組み込むことによりcDN
Aライブラリーを構築し、該cDNAライブラリーを細
胞に導入し、得られる細胞をその細胞の増殖を抑制する
活性を有するレクチンの存在下で培養し、増殖する細胞
を単離することによりクローン化された遺伝子を宿主細
胞に導入して発現させたところ、新規なα2→3シアリ
ルトランスフェラーゼが生産されることを見出し、本発
明を完成させた。
は、配列番号2または7で示されるアミノ酸配列を有す
る新規α2→3シアリルトランスフェラーゼおよび該α
2→3シアリルトランスフェラーゼをコードするcDN
Aおよび該DNAを含有する組換え体ベクターに関す
る。本発明のα2→3シアリルトランスフェラーゼは、
βガラクトシドα2→3シアリルトランスフェラーゼ活
性を有する糖転移酵素であり、受容体である糖鎖の末端
にα2→3の結合様式でシアル酸を付加する活性を有す
る。
ーゼをコードするcDNAとしては、(a) 配列番号1ま
たは6記載の塩基配列を有するDNA、(b) 一つのアミ
ノ酸に対して複数種の遺伝暗号が存在するため、あるい
はヒトを含む動物個々に起こる自然変異などのため配列
番号1または6で示される塩基配列とは異なる塩基配列
を有するDNA、(c) (a) および(b) で定義されるDN
Aに対して、本発明のα2→3シアリルトランスフェラ
ーゼ活性を失わない範囲内で置換変異、欠失変異、挿入
変異などの変異が導入されたDNA、例えば、(a) また
は(b) で定義されるDNAがコードするα2→3シアリ
ルトランスフェラーゼに対して、ハイブリダイゼーショ
ン法によって単離できる程度に相同性を有するDNAな
どを包含する。本発明のα2→3シアリルトランスフェ
ラーゼは上記(a) 、(b) および(c) で定義されるDNA
によってコードされる全てのα2→3シアリルトランス
フェラーゼを包含する。
スフェラーゼをコードするcDNAの製造法を上記(a)
で定義されるcDNAの製造法を例にして示す。動物細
胞から抽出したmRNAを鋳型として合成したcDNA
を発現クローニングベクター(Expression Cloning Vect
or) に組み込むことにより、cDNAライブラリーを構
築する。このcDNAライブラリーを動物細胞あるいは
昆虫細胞に導入し、その細胞の増殖を抑制する活性を有
するレクチンの存在下で細胞を培養する。cDNAが導
入された細胞クローンのなかに、糖転移酵素をコードす
る遺伝子が発現したために、レクチンが認識する糖鎖構
造が変化し、レクチンに対する感受性を失い、レクチン
存在下で増殖する細胞クローンが現れる。この細胞を単
離し、該細胞から所望のα2→3シアリルトランスフェ
ラーゼをコードするcDNAを得る。
明のα2→3シアリルトランスフェラーゼを生産してい
る動物細胞であればいかなる細胞でも用いることができ
る。例えば、ヒト組織球腫細胞株TYH〔Haranakaら:
インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー(I
nt.J.Cancer),36,313(1985) 〕、ヒトメラノーマ細胞W
M266−4(ATCC CRL1676)等が用いられる。これらの
細胞から抽出したmRNAを鋳型として合成したcDN
Aを組み込むベクターは、該cDNAを組み込み発現で
きるベクターであればいかなるものでも用いることがで
きる。例えば、pAMoERC3Sc等が用いられる。
該ベクターにより構築されるcDNAライブラリーを導
入する動物細胞あるいは昆虫細胞は、該cDNAライブ
ラリーを導入し、発現できるものであればいかなるもの
でも用いることができる。例えば、ヒトナマルバ(Namal
wa) 細胞〔細井ら:サイトテクノロジー(Cytotechnolog
y),1,151(1988)〕等が用いられる。また、本発明で用い
られるレクチンは、宿主細胞の増殖を抑制できるもので
あればいかなるものでも用いることができる。例えば、
ヒママメレクチン120等が用いられる。レクチンは使
用する宿主細胞の該レクチンに対する耐性度を決定した
後に、宿主細胞の成育を阻止する濃度で使用する。レク
チン存在下で増殖する細胞から公知の方法、例えば、ハ
ート法〔ロバート・エフ・マーゴルスキー (Robert F.M
argolskee)ら:モレキュラー・アンド・セリュラー・バ
イオロジー (Mol.Cell.Biol.),8,2837(1988)〕により、
本発明のα2→3シアリルトランスフェラーゼをコード
するcDNAを有するプラスミドあるいは該cDNA部
分を含むDNA断片を回収する。本発明の酵素をコード
するcDNAを有するプラスミドとしては、例えば、p
UC119−LECおよびpUC119−WM17が挙
げられる。pUC119−LECを含む大腸菌であるEs
cherichia coli HB101/pUC119-LEC およびpUC119
−WM17を含む大腸菌であるEscherichia coli HB101
/pUC119-WM17は、それぞれ平成3年10月29日、平成4年
9月22日付で工業技術院微生物工業技術研究所にFERM B
P-3625、FERM BP-4013として寄託されている。
上記の製造法で得られるα2→3シアリルトランスフェ
ラーゼをコードするcDNAをもとに、ハイブリダイゼ
ーション法やDNAに変異を導入する方法などの周知の
組換えDNA技術を用いて製造することができる。ま
た、本発明のα2→3シアリルトランスフェラーゼをコ
ードするcDNAは化学合成法を用いても製造すること
ができる。
3シアリルトランスフェラーゼをコードするDNAを適
当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベ
クターを造成し、それを宿主細胞に導入し、得られた細
胞を培養することにより、本発明のα2→3シアリルト
ランスフェラーゼを製造することができる。ここで、用
いられる宿主細胞としては、原核細胞、動物細胞、酵
母、カビ、昆虫細胞など、これまで組換えDNA技術で
用いられた宿主細胞ならば、いかなる細胞でも用いるこ
とができる。例えば、原核細胞としては大腸菌、動物細
胞としてはチャイニーズ・ハムスターの細胞であるCH
O細胞、サルの細胞であるCOS細胞、ヒトの細胞であ
るナマルバ細胞等が挙げられる。宿主としてナマルバ細
胞を用いる直接発現クローン化系は、宿主であるナマル
バ細胞へのcDNAライブラリーの導入効率が極めて高
く、しかも導入されたプラスミド(cDNAライブラリ
ー)は、染色体外で存在可能であり、取得したレクチン
耐性株からのプラスミドの回収が容易であるという利点
を有しているため、好適に用いられる。
ーゼをコードするDNAを導入するベクターとしては、
該α2→3シアリルトランスフェラーゼをコードするD
NAを組み込むことができ、宿主細胞で発現できるもの
であればいかなるベクターでも用いることができる。例
えば、pAGE107〔特開平3-22979,Miyajiら:サイ
トテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)〕,pA
S3−3(特開平2-227075),pAMoERC3Sc,
CDM8〔ブライアン・シード(Brian Seed)ら:ネイチ
ャー(Nature),329,840(1987)〕等が挙げられる。また、
大腸菌内で本発明の酵素を生産させるためには、trp プ
ロモーターなどの強力な転写活性を有するプロモーター
の下流に外来DNAを挿入することができ、しかもシャ
イン−ダルガノ (Shine-Dalgarno) 配列(以下、SD配
列と略記する)と開始コドンの間を適当な距離(例え
ば、6〜18塩基)に調節したプラスミドを用いること
が好ましい。具体的には、pKYP10(特開昭58-110
600 )、pLSA1〔宮地ら:アグリカルチュラル・ア
ンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agric.Biol.Che
m.),53,277(1989) 〕、pGEL1〔関根ら:プロシー
ディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス (Proc.Natl.Acad.Sci.),USA, 82,4306(198
5) 〕等が挙げられる。
手法については、特開平2-227075あるいはサンブルック
(Sambrook)、フリッチ(Fritsch) 、マニアチス(Maniati
s)らの方法〔モレキュラー・クローニング:ア・ラボラ
トリー・マニュアル(Molecular Cloning, A laboratory
manual)、第2版、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory
Press) 、1989年刊〕に記載されている方法を用い
ることができる。mRNAの単離およびcDNAライブ
ラリーの合成は、上記の方法の他、市販されている多く
のキットを用いて行なうことができる。動物細胞へのD
NAの導入法としては、現在までに知られているいかな
る方法も用いることができる。例えば、エレクトロポー
レーション法〔Miyajiら:サイトテクノロジー(Cytotec
hnology) ,3 ,133(1990)〕、リン酸カルシウム法(特開
平2-227075)、リポフェクション法〔フィリップ・エル
・フェルグナー(Philip L. Felgner)ら:プロシーディ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス (Proc.Natl.Acad.Sci.),USA,84,7413 (1987) 〕
等を用いることができる。形質転換株の取得および培養
は、特開平2-227075あるいは特開平2-257891に記載され
ている方法に準じて行なうことができる。
フェラーゼの生産方法としては、宿主細胞内に生産させ
る方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細
胞外膜上に生産させる方法がある。生産部位は、使用す
る宿主細胞の種類、生産させる糖転移酵素の形によって
変わってくる。糖転移酵素をそのままの形で動物細胞を
宿主細胞として生産させる場合は、一般的に、宿主細胞
内あるいは宿主細胞外膜上に生産され、一部は、プロテ
アーゼにより切断されて細胞外に分泌される。宿主細胞
外に積極的に分泌させる場合は、ポールソンらの方法
〔C. Paulsonら:ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー(J.Biol.Chem.) ,264,17619 (198
9)〕およびロウらの方法〔John. B. Lowe ら:プロシー
ディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス (Proc.Natl.Acad.Sci.),USA,86 ,8227 (198
9)、John. B. Lowe ら:ジーンズ・アンド・ディベラプ
メント(Genes Develop.),4,1288(1990) 〕に準じて遺
伝子組換えの手法を用いて、糖転移酵素の活性部位を含
む部分にシグナルペプチドを付加した形で生産させる。
じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増
幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。この
ようにして生産させた本発明のα2→3シアリルトラン
スフェラーゼは、通常の糖転移酵素の精製方法〔J. Eva
n. Sadler ら:メソッド・イン・エンザイモロジー (Me
thods in Enzymology),83、458〕に準じて精製できる。
また、大腸菌内に生産させる場合は、上記の方法と特開
昭63-267292 に記載された方法を組み合わせることによ
り効率的に精製することができる。また、本発明の酵素
を他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融
合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニ
ティークロマトグラフィーを利用して精製することもで
きる。例えば、ロウらの方法〔John. B. Lowe ら:プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス (Proc.Natl.Acad.Sci.),USA,86,8227(1
989)、John. B. Lowe ら:ジーンズ・アンド・ディベラ
プメント(Genes Develop.),4,1288(1990) 〕に準じ
て、本発明の酵素をプロテインAとの融合タンパク質と
して生産し、イムノグロブリンGを用いるアフィニティ
ークロマトグラフィーにより精製することができる。ま
た、該酵素自身に対する抗体を用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーで精製することもできる。
知の測定法〔J. Evan. Sadler ら:メソッド・イン・エ
ンザイモロジー (Methods in Enzymology),83,458、Na
oyuki Tanigutiら:メソッド・イン・エンザイモロジー
(Methods in Enzymology),179,397 〕に準じて測定す
る。本発明のα2→3シアリルトランスフェラーゼを用
いて、イン・ビトロ(in vitro)で、糖鎖を合成すること
ができる。例えば、糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ
糖が有するラクトサミン構造(Gal β1→4GlcNAc構
造)の非還元末端にα2→3結合でシアル酸を付与する
ことができる。また、基質となる糖タンパク質、糖脂質
またはオリゴ糖に本発明のα2→3シアリルトランスフ
ェラーゼを作用させることにより、非還元末端の糖鎖の
構造をSialyl-Le X 構造にすることができる。また、非
還元末端にラクトサミン構造を有するオリゴ糖に対し
て、本発明のα2→3シアリルトランスフェラーゼを作
用させた後、公知のα1→3フコシルトランスフェラー
ゼ(α1→3Fucosyltransferase) 〔ロウ (Lowe) ら:
ジーンズ・アンド・ディベラプメント(Genes Develo
p.),4,1288(1990) 、ゲルツ(Goelz) ら:セル(Cell),6
3 、1349 (1990) 〕を用いて、Sialyl-Le X およびその
修飾物を非還元末端に有するオリゴ糖を合成することが
できる。
ーゼをコードするDNAを用いて、該α2→3シアリル
トランスフェラーゼの受容基質である糖鎖を生産してい
る動物細胞あるいは昆虫細胞の中で、該α2→3シアリ
ルトランスフェラーゼと有用生理活性を有する糖タンパ
ク質、糖脂質またはオリゴ糖とを同時に生産させること
により、生産したα2→3シアリルトランスフェラーゼ
を細胞の中で糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ糖に作
用させ、糖鎖構造が変化した糖タンパク質、糖脂質また
はオリゴ糖を細胞の中で得ることができる。
造が変化した糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ糖から
公知の酵素的手法または化学的手法によりオリゴ糖の一
部を切り出すこともできる。本発明のα2→3シアリル
トランスフェラーゼをコードするDNAは、タンパク質
や糖脂質の糖鎖の改変および特定の糖鎖の効率的生産に
用いることができるだけでなく、アンチセンスRNA/
DNA技術を用いて炎症や癌転移などの疾病の治療に利
用すること、ならびにノーザンハイブリダイゼーション
法またはPCR法を用いてそれらの疾病の診断に利用す
ることもできる。
スフェラーゼをコードするDNAを用いて、アンチセン
スRNA/DNA技術〔徳久(Tokuhisa):バイオサイエ
ンスとインダストリー,50, 322 (1992) 、村上(Murakam
i):化学,46, 681 (1991) 、ミラー(Miller):バイオテ
クノロジー(Biotechnology),9, 358 (1992) 、コーエン
(Cohen) :トレンズ・イン・バイオテクノジー(Trends
in Biotechnology),10, 87 (1992) 、アグラワル(Agraw
al) :トレンズ・イン・バイオテクノジー(Trends in B
iotechnology) 10, 152 (1992)〕あるいはトリプル・ヘ
リックス技術〔チュブ(Chubb) とホーガン(Hogan) :ト
レンズ・イン・バイオテクノジー(Trends in Biotechno
logy),10, 132 (1992)〕により該α2→3シアリルトラ
ンスフェラーゼの生産を抑制することができる。具体的
には、本発明のα2→3シアリルトランスフェラーゼを
コードするDNAの一部の塩基配列、好ましくは翻訳開
始領域内の10〜50塩基の塩基配列を基にしてオリゴヌク
レオチドを設計・調製し、生体内に投与することにより
該α2→3シアリルトランスフェラーゼの生産を抑制で
きる。合成オリゴヌクレオチドの塩基配列としては、本
発明で開示されるアンチセンス鎖の塩基配列の一部と一
致するもの、あるいは該α2→3シアリルトランスフェ
ラーゼの生産を抑制する活性を失わない範囲内で改変し
たものを利用できる。トリプル・ヘリックス技術を用い
る場合、センス鎖およびアンチセンス鎖の双方の塩基配
列の塩基配列情報をもとに、合成オリゴヌクレオチドの
塩基配列を設計する。
ション法またはPCR法により本発明のα2→3シアリ
ルトランスフェラーゼを検出することができる。ノーザ
ンハイブリダイゼーション法またはPCR法を用いて、
本発明のα2→3シアリルトランスフェラーゼの生産を
調べるには、本発明のα2→3シアリルトランスフェラ
ーゼをコードするDNAまたはそれらの塩基配列に基づ
いてDNAプローブまたは合成オリゴヌクレオチドを調
製する。ノーザンハイブリダイゼーション法およびPC
R法は、それぞれ公知の方法〔サンブルック(Sambroo
k)、フリッチ(Fritsch) 、マニアチス(Maniatis)(モレ
キュラー・クローニング:ア・ラボラトリー・マニュア
ル(Molecular Cloning, A laboratory manual)、第2
版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press) 、19
89年刊およびイニス(Innis) ら:PCRプロトコール
ズ (PCR Protocols)、アカデミック・プレス(Academic
Press)、1990年刊〕に従って行う。
ng Vector)pAMoERC3Scの造成: (1)pAGEL106の造成 (図1参照) 以下に示す方法に従って、simian virus 40 (SV40)初期
遺伝子プロモーターとヒトT細胞白血病ウイルス(human
T-cell leukemia virus type-1 : HTLV-1) のロング・
ターミナル・リピート(long terminal repeat : LTR)の
R領域とU5領域の一部を融合したプロモーターを有する
プラスミドpAGEL106の造成を行なった。すなわ
ち、R領域とU5領域の一部を含むDNA断片〔BanII-Sa
u3AI断片(0.27kb)〕をpATK03から切り出し、合成
リンカーを介してpAGE106のBglI-BamHI間に挿入
した。
pAGE106の1μg を10mM トリス−塩酸(pH7.5)
,6mM 塩化マグネシウム,100mM 塩化ナトリウム, 6mM
2−メルカプトエタノールからなる緩衝液(以下、Y
−100緩衝液と略記する)30μl に溶解し、10単位の
BglI(宝酒造社製、以下、とくに断らないかぎり制限酵
素は宝酒造社製のものを用いた)と10単位のBamHI を加
え、37℃で2時間消化反応を行なった。該反応液をアガ
ロースゲル電気泳動後、約4.9kb のDNA断片を回収し
た。
ィング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サ
イエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.),USA ,80 ,3618(1983)
〕1μg をY−100緩衝液 30 μl に溶解し、10単
位のBanII を加え、37℃で2時間消化反応を行ない、ア
ガロースゲル電気泳動後、約0.4kb のDNA 断片を回収し
た。回収したDNA断片は30μl のY−100緩衝液に
溶解し、10単位のSau3AIを加え37℃で2時間消化反応を
行ない、アガロースゲル電気泳動後、約0.27kbのDNA
断片を回収した。
を連結するためのリンカーとして以下のDNAリンカー
を合成した。
DNAはそれぞれアプライド・バイオシステムズ社38
0A・DNA合成機を用いて合成した。合成したDNA
はそれぞれ0.2 μg ずつ、50mM トリス−塩酸(pH7.5)
,10mM 塩化マグネシウム,5mM ジチオスレイトール
(以下DTT と略記する), 0.1nM EDTA および1mM アデノ
シン3リン酸(以下ATP と略記する)を含む緩衝液(以
下、T4キナーゼ緩衝液と略記する)40μl に溶解し、
T4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造社製、以下同
じ)30単位を加えて、37℃で2時間リン酸化反応を行な
った。
mHI 断片(4.9kb) 0.2 μg とpATK03由来のBanII-
Sau3AI断片(0.27kb) 0.01 μg を 66mM トリス−塩酸(p
H7.5) ,6.6mM 塩化マグネシウム,10mM DTTおよび0.1m
M ATP からなる緩衝液(以下、T4リガーゼ緩衝液と略
記する)30μl に溶解し、上記DNAリンカー0.01μg
とT4DNA リガーゼ(宝酒造社製、以下同じ)175 単位
を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。
ー(Bolivar) ら:ジーン(Gene),2,75,(1977)〕をコーエ
ンらの方法〔エス・エヌ・コーエン(S.N.Cohen) ら:プ
ロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス (Proc.Natl.Acad.Sci.),USA,69 ,211
0(1972) 〕に従って形質転換し、カナマイシン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法〔エイチ・シー・
バーンボイム (H.C.Birnboim) ら:ヌクレイック・アシ
ッド・リサーチ (Nucleic Acids Res.),7 ,1513,(197
9)〕に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドを
pAGEL106と名付けた。プラスミドpAGEL1
06の構造は制限酵素消化により確認した。
2参照) 以下に示す方法に従って、SV40初期遺伝子プロモーター
とHTLV-1のロング・ターミナル・リピート(LTR) のR 領
域とU5領域の一部を融合したプロモーターを有する、ヒ
ト顆粒球コロニー刺激因子(hG-CSF)の発現プラスミドp
ASLB3−3−1の造成を行なった。
μg を10mM トリス−塩酸(pH7.5),6mM 塩化マグネシウ
ム,20mM 塩化カリウムおよび6mM 2 −メルカプトエタ
ノールからなる緩衝液(以下、K−20緩衝液と略記す
る)30μl に溶解し、10単位のSmaIを加え、37℃で2時
間消化反応を行なった。エタノールで沈殿させた後、30
μl のT4リガーゼ緩衝液に溶解し、SalIリンカー
(5'pGGTCGACC3' :宝酒造社製)0.01μg とT4DNA
リガーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行
なった。エタノールで沈澱させた後、10mM トリス−塩
酸(pH7.5) ,6mM 塩化マグネシウム,175mM 塩化ナトリ
ウム,6mM 2 −メルカプトエタノールからなる緩衝液
(以下、Y−175緩衝液と略記する)30μl に溶解
し、10単位のSalIと10単位のMluIを加え、37℃で2時間
消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳
動後、約1.7kb のDNA断片を回収した。
られたpAS3−3の1μg をY−175緩衝液 30 μ
l に溶解し、10単位のSalIと10単位のMluIを加え、37℃
で2時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲ
ル電気泳動後、約6.7kb のDNA断片を回収した。上記
で得たpAGEL106由来のMluI-SalI 断片(1.7kb)
0.1 μg とpAS3−3由来のMluI-SalI 断片(6.7kb)
0.2 μg をT4リガーゼ緩衝液 30 μl に溶解し、T4
DNAリガーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結合反
応を行なった。
ンらの方法によって形質転換し、カナマイシン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをpASLB3−3−1
と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
照) 以下に示す方法に従って、pASLB3−3−1にアン
ピシリン耐性遺伝子を導入したプラスミドpASLB3
−3の造成を行なうため、pAS3−3のアンピシリン
耐性遺伝子を含むDNA断片〔XhoI-MluI 断片(2.58k
b)〕をpASLB3−3−1のXhoI-MluI 間に導入し
た。
1μg を10mM トリス−塩酸(pH7.5) ,6mM 塩化マグネ
シウム,150mM 塩化ナトリウム,6mM 2−メルカプトエ
タノールからなる緩衝液(以下、Y−150緩衝液と略
記する)30μl に溶解し、10単位のXhoIと10単位のMluI
を加え、37℃で2時間消化反応を行なった。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、約7.26kbのDNA断片を回
収した。
緩衝液 30 μl に溶解し、10単位のXhoIと10単位のMluI
を加え、37℃で2時間消化反応を行なった。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、約2.58kbのDNA断片を回
収した。上記で得られた、pASLB3−3−1由来の
XhoI-MluI 断片(7.26kb) 0.2μg とpAS3−3由来の
XhoI-MluI 断片(2.58kb) 0.1μg とをT4リガーゼ緩衝
液 30 μl に溶解し、T4DNAリガーゼ175 単位を加
えて、12℃で16時間結合反応を行なった。
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをpASLB3−3と名
付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
参照) 以下に示す方法に従って、pASLB3−3中のジヒド
ロ葉酸還元酵素(dhfr)発現ユニットを除去し、エプスタ
イン・バール・ウイルス(Epstein -Barr virus )の複
製開始点(oriP)とoriPにトランスに作用し複製を引き
起こす因子であるEBNA-1遺伝子を導入したプラスミドp
ASLBE3−3の造成を行なった。oriPとEBNA-1遺伝
子は、p201〔ビル・ズグデン(Bill Sugden) ら、ネ
イチャー(Nature) ,313,812(1985)〕のNarI部位にpU
C12〔メッシング(Messing) ら:メソッド・イン・エ
ンザイモロジー (Methods in Enzymology), 101, 20 (1
983)〕由来のマルチクローニングサイトを含む SmaI-Ha
eIII断片が組み込まれたプラスミドであるp220.2
から切り出して使用した。
ルチクローニングサイトを含む SmaI-HaeIII 断片が組
み込まれたプラスミドであるp220.2の1μg をY
−100緩衝液30μl に溶解し、20単位のEcoRI を加
え、37℃で2時間消化反応を行なった。エタノールで沈
殿させた後、30μl のDNAポリメラーゼI緩衝液〔50
mM トリス−塩酸(pH7.5) ,10mM 塩化マグネシウム,
0.1mM dATP(デオキシアデノシン3リン酸),0.1mM dC
TP(デオキシシチジン3リン酸),0.1mM dGTP(デオキ
シグアノシン3リン酸),0.1mM dTTP(デオキシチミジ
ン3リン酸)〕に溶解し、6単位の大腸菌DNAポリメ
ラーゼIクレノー(Klenow)断片を加え、37℃で60分間反
応させ、EcoRI 消化によって生じた5’突出末端を平滑
末端に変えた。反応をフェノールで抽出することによっ
て止め、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ
た後、20μl のT4リガーゼ緩衝液に溶解し、XhoI
リンカー(5'pCCTCGAGG3' :宝酒造社製)を0.05μg と
T4DNAリガーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結
合反応を行なった。エタノールで沈殿させた後、Y−1
00緩衝液30μl に溶解し、10単位のBamHI を加え、37
℃で2時間消化反応を行なった。エタノールで沈殿させ
た後、30μl のDNAポリメラーゼI緩衝液に溶解し、
6単位の大腸菌DNAポリメラーゼIクレノー断片を加
え、37℃で60分間反応させ、BamHI 消化によって生じた
5’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノールで
抽出することによって止め、クロロホルムで抽出し、エ
タノールで沈澱させた後、Y−100緩衝液30μl に溶
解し、10単位のXhoIを加え、37℃で2時間消化反応を行
なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約4.9k
bのDNA断片を回収した。
00緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のXhoIを加え、37
℃で2時間消化反応を行なった。エタノールで沈澱させ
た後、30μl のDNAポリメラーゼI緩衝液に溶解し、
6単位の大腸菌DNAポリメラーゼIクレノー断片を加
え、37℃で60分間反応させ、XhoI消化によって生じた
5’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノールで
抽出することによって止め、クロロホルムで抽出し、エ
タノールで沈澱させた後、10mM トリス−塩酸(pH7.5),
6mM 塩化マグネシウム, 6mM 2 −メルカプトエタノー
ルからなる緩衝液(以下、Y−0緩衝液と略記する)30
μl に溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃で2時間消化
反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、約1.3kbのDNA断片を回収した。
Miyajiら:サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133
(1990)〕の1μg をY−0緩衝液 30 μl に溶解し、20
単位のKpnIを加え、37℃で2時間消化反応を行なった。
その後、塩化ナトリウム濃度が100mM になるように塩化
ナトリウムを添加し、20単位のXhoIを加え、さらに37℃
で2時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲ
ル電気泳動後、約6.0kb のDNA断片を回収した。
(平滑末端) 断片(4.9kb) 0.2 μgとpASLB3−3
由来のXhoI(平滑末端)-KpnI断片(1.3kb) 0.1 μg とp
AGE107由来のKpnI-XhoI 断片(6.0kb) 0.2 μg を
T4リガーゼ緩衝液 30 μlに溶解し、T4DNAリガ
ーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なっ
た。
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをpASLBE3−3と
名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
遺伝子を除去し、そのかわりにマルチクローニングサイ
トを導入したプラスミドpASLBCを造成した。マル
チクローニングサイトは、合成DNAを用いて作成し
た。
g をY−175緩衝液30μl に溶解し、20単位のSalIと
20単位のMluIを加え、37℃で2時間消化反応を行なっ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約3.1kb の
DNA 断片を回収した。また、pASLB3−3の1μg
をY−0緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のKpnIを加
え、37℃で2時間消化反応を行なった。その後、塩化ナ
トリウム濃度が150mM になるように塩化ナトリウムを添
加し、20単位のMluIを加え、さらに37℃で2時間消化反
応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、
約6.0kbのDNA断片を回収した。
連結するためのリンカーとして以下のDNAリンカーを
合成した。なお、このリンカー中にはHindIII, EcoRV,
SfiI, StuI, NotIの各制限酵素切断部位が組み込まれて
いる。
本鎖DNAはそれぞれアプライド・バイオシステムズ社
製380A・DNA合成機を用いて合成した。合成した
DNAはそれぞれ0.2 μg ずつ、T4キナーゼ緩衝液20
μl に溶解し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造
社製、以下同じ)30単位を加えて、37℃で2時間リン酸
化反応を行なった。
-MluI 断片(3.1kb) 0.1 μg とKpnI-MluI 断片(6.0kb)
0.2 μg とをT4リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、上記
DNAリンカーを0.01μg とT4DNAリガーゼ175 単
位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応
液を用いて大腸菌HB101 株をコーエンらの方法によって
形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換
株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。この
プラスミドをpASLBCと名付け、その構造を制限酵
素消化により確認した。
照) 以下に示す方法に従って、pASLBC中のジヒドロ葉
酸還元酵素(dhfr)発現ユニットを除去し、oriPとEBNA-1
遺伝子を導入したプラスミドpASLBECを造成し
た。
μg をY−150緩衝液30μl に溶解し、20単位のMluI
と20単位のXhoIを加え、37℃で2時間消化反応を行なっ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約1.3kb の
DNA断片を回収した。また、pASLBE3−3の1
μg をY−0緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のKpnIを
加え、37℃で2時間消化反応を行なった。その後、塩化
ナトリウム濃度が150mM になるように塩化ナトリウムを
添加し、5単位のMluIを加え、さらに37℃で20分間部分
消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳
動後、約9.6kb のDNA断片を回収した。
μg をY−0緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のKpnIを
加え、37℃で2時間消化反応を行なった。その後、塩化
ナトリウム濃度が100mM になるように塩化ナトリウムを
添加し、20単位のXhoIを加え、さらに37℃で2時間消化
反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、約0.6kb のDNA断片を回収した。
MluI-XhoI 断片(1.3kb) 0.2 μg とKpnI-MluI 断片(9.6
kb) 0.2 μg とpASLBC由来のKpnI-XhoI 断片(0.6
kb)0.05μg とをT4リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、
T4DNAリガーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結
合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101 株を
コーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐
性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプ
ラスミドを単離した。このプラスミドをpASLBEC
と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
照) 以下に示す方法に従って、pASLBECのマルチクロ
ーニングサイト中のStuIサイトにBamHI リンカーを導入
したプラスミドpASLBEC2を造成した。pASL
BEC2では、マルチクローニングサイト中のStuIサイ
トは消失している。
をY−100緩衝液30μl に溶解し、5単位のStuIを加
え、37℃で20分間部分消化反応を行なった。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、約11.5kbのDNA断片を回
収した。回収したDNA断片を30μl のT4リガーゼ緩
衝液に溶解し、BamHIリンカー(5'pCCGGATCCGG3'
:宝酒造社製)の0.01μg とT4DNAリガーゼ175
単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。エタ
ノールで沈澱させた後、Y−100緩衝液30μlに溶解
し、20単位のBamHI を加え、37℃で2時間消化反応を行
なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約11.5
kbのDNA断片を回収した。回収したDNA断片を20μ
l のT4リガーゼ緩衝液に溶解し、T4DNAリガーゼ
175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをpASLBEC2と名
付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
照) 以下に示す方法に従って、pASLBEC2中のプロモ
ーター〔SV40初期遺伝子プロモーターとHTLV-1のロング
・ターミナル・リピート(long terminal repeat :LTR)
のR 領域とU5領域の一部を融合したプロモーター〕をモ
ロニー・マウス白血病ウイルスのロング・ターミナル・
リピート(long terminal repeat:LTR)のプロモータ
ーにすげかえたプラスミドpAMoEC2の造成を行な
った。モロニー・マウス白血病ウイルスLTR のプロモー
ターは、プラスミドMolp-1〔アキノリ・イシモト (Akin
ori Ishimoto) ら:ビロロジー(Virology),141,30(198
5)〕から切り出して使用した。
g を10mM トリス−塩酸(pH7.5),6mM 塩化マグネシウ
ム,50mM 塩化カリウム, 6mM 2−メルカプトエタノー
ルからなる緩衝液(以下、K−50緩衝液と略記する)
30μl に溶解し、20単位のHindIII と20単位のAatII
(東洋紡績社製) を加え、37℃で2時間消化反応を行な
った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約4.8kb
のDNA断片を回収した。
0緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のAatII を加え、37
℃で2時間消化反応を行なった。その後、5 単位のXhoI
を加え、さらに37℃で20分間部分消化反応を行なった。
該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約6.1kb のDN
A断片を回収した。次に、XhoI切断部位とClaI切断部位
を連結するためのリンカーとして以下のDNAリンカー
を合成した。
DNAはそれぞれアプライド・バイオシステムズ社製3
80A・DNA合成機を用いて合成した。合成したDN
Aはそれぞれ0.2 μg ずつT4キナーゼ緩衝液40μl に
溶解し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ30単位を加え
て、37℃で2時間リン酸化反応を行った。また別に、M
olp−1〔アキノリ・イシモト (Akinori Ishimoto)
ら:ビロロジ−(Virology),141,30(1985) 〕の1μg を
K−20緩衝液30μl に溶解し、20単位のSmaIを加え、
37℃で2時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリ
ウム濃度が50mMになるように塩化ナトリウムを添加し、
20単位のClaIを加え、37℃で2時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約0.6kb のDN
A断片を回収した。回収したDNA断片を30μl のT4
リガーゼ緩衝液に溶解し、上記DNAリンカー0.01μg
とHindIII リンカー(5'pCAAGCTTG3' :宝酒造社製)を
0.03μg とT4DNAリガーゼ175 単位とを加えて、12
℃で16時間結合反応を行なった。エタノールで沈澱させ
た後、10mM トリス−塩酸(pH7.5) ,6mM 塩化マグネシ
ウム,50mM 塩化ナトリウム,6mM 2−メルカプトエタ
ノールからなる緩衝液(以下、Y−50緩衝液と略記す
る)30μl に溶解し、10単位のHindIII を加え、37℃で
2時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃
度が100mM になるように塩化ナトリウムを添加し、10単
位のXhoIを加え、さらに37℃で2時間消化反応を行なっ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約0.6kb の
DNA断片を回収した。
ndIII-AatII 断片(4.8kb) 0.2 μgとAatII-XhoI断片(6.
1kb) 0.2 μg とMolp−1由来のHindIII-XhoI断片
(0.6kb) 0.05μg とをT4リガーゼ緩衝液30μl に溶解
し、T4DNAリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時
間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101
株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリ
ン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従っ
てプラスミドを単離した。このプラスミドをpAMoE
C2と名付け、その構造を制限酵素消化により確認し
た。
照) 以下に示す方法に従って、pAMoEC2のマルチクロ
ーニングサイト中のBamHI サイトに、詰め込みDNA
(Stuffer DNA)として、pBR322のテトラサイクリ
ン耐性遺伝子を含むDNA断片〔DraI - PvuII断片(2.5
kb) 〕を挿入し、プラスミドpAMoEC3を造成し
た。
をY−100緩衝液30μl に溶解し、20単位のBamHI を
加え、37℃で2時間消化反応を行なった。エタノールで
沈澱させた後、30μl のDNAポリメラーゼI緩衝液に
溶解し、6単位の大腸菌DNAポリメラーゼIクレノー
断片を加え、37℃で60分間反応させ、BamHI 消化によっ
て生じた5’突出末端を平滑末端に変えた。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、約11.5kbのDNA断片を回
収した。
ら:ジーン(Gene),2,95(1977) 〕1μg をY−50緩衝
液 30 μl に溶解し、20単位のDraIと20単位のPvuII を
加え、37℃で2時間消化反応を行なった。該反応液をア
ガロースゲル電気泳動後、約2.5kb のDNA断片を回収
した。上記で得られたpAMoEC2由来のBamHI (平
滑末端)断片(11.5kb) 0.1μg とpBR322由来のDr
aI-PvuII断片(2.5kb) 0.2 μg とをT4リガーゼ緩衝液
30μl に溶解し、T4DNAリガーゼ175 単位を加え
て、12℃で16時間結合反応を行なった。
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリンとテトラ
サイクリンに耐性である株を得た。この形質転換株から
公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラス
ミドをpAMoEC3と名付け、その構造を制限酵素消
化により確認した。
0参照) 以下に示す方法に従って、pAMoEC3中のoriPとEB
NA-1遺伝子のプラスミド上での向きを逆にしたプラスミ
ドpAMoERC3を造成した。(9)で得られたpA
MoEC3の1μg をY−100緩衝液30μl に溶解
し、20単位のXhoIを加え、37℃で2時間消化反応を行な
った。その後、1Mトリス−塩酸(pH8.0) 30μl と大腸菌
アルカリフォスファターゼ(宝酒造社製)1単位とを加
え、37℃で2時間脱リン酸化反応を行なった。エタノー
ルで沈澱させた後、10mM トリス−塩酸(pH8.0) ,1mM
EDTAからなる緩衝液(以下、TE緩衝液と略記する)30
μl に溶解し、アガロースゲル電気泳動を行ない、約9.
1kb のDNA断片を回収した。
0緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のXhoIを加え、37℃
で2時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲ
ル電気泳動後、約4.9kb のDNA断片を回収した。上記
で得られたpAMoEC3由来のXhoI断片(9.1kb) 0.1
μg とXhoI断片(4.9kb) 0.2 μg とをT4リガーゼ緩衝
液30μl に溶解し、T4DNAリガーゼ175 単位を加え
て、12℃で16時間結合反応を行なった。
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをpAMoERC3と名
付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
参照) 以下に示す方法に従って、pAGE107中のG418耐性
遺伝子をハイグロマイシン(hyg) 耐性遺伝子にすげかえ
たプラスミドpAGE207を造成した。hyg耐性遺伝
子は、p201〔ビル・ズグデン(Bill Sugden) ら、ネ
イチャー (Nature),313,812(1985) 〕より切り出して使
用した。
pAGE107の1μg をY−50緩衝液30μl に溶解
し、20単位のClaIを加え、37℃で2時間消化反応を行な
った。その後、塩化ナトリウム濃度が150 mMになるよう
に塩化ナトリウムを添加し、20単位のMluIを加え、さら
に37℃で2時間消化反応を行なった。該反応液をアガロ
ースゲル電気泳動後、約4.6kb のDNA断片を回収し
た。
udgen) ら:ネイチャー (Nature),313 ,812(1985)〕0.
5 μgをY−50緩衝液30μl に溶解し、20単位のNarI
〔ニュー・イングランド・バイオラボ (New England Bi
olab) 社製〕を加え、37℃で2時間消化反応を行なっ
た。エタノールで沈澱させた後、30μl のDNAポリメ
ラーゼI緩衝液に溶解し、6単位の大腸菌DNAポリメ
ラーゼIクレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、
NarI消化によって生じた5’突出末端を平滑末端に変え
た。反応をフェノールで抽出することによって止め、ク
ロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、20μ
l のT4リガーゼ緩衝液に溶解し、ClaIリンカー(5'pC
ATCGATG3' :宝酒造社製)を0.05μg とT4DNAリガ
ーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なっ
た。エタノールで沈澱させた後、Y−50緩衝液30μl
に溶解し、10単位のClaIを加え、37℃で2時間消化反応
を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度が150 mMにな
るように塩化ナトリウムを添加し、10単位のMluIを加
え、さらに37℃で2時間消化反応を行なった。該反応液
をアガロースゲル電気泳動後、約1.6kb のDNA断片を
回収した。
-MluI 断片(4.6kb) 0.2 μg とp201由来の ClaI-Ml
uI断片(1.6kb) 0.1 μg とをT4リガーゼ緩衝液30μl
に溶解し、T4DNAリガーゼ175 単位を加えて、12℃
で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌
HB101 株をコーエンらの方法によって形質転換し、アン
ピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法
に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをpA
GE207と名付け、その構造を制限酵素消化により確
認した。
(図12参照) 以下に示す方法に従って、ラビットβグロビン遺伝子中
に存在するSfiIサイトの類似配列を除去するため、pA
GE207のBalIサイトにScaIリンカーを挿入したプラ
スミドpAGE207ScNを造成した。pAGE20
7ScNにおいては、挿入されたScaIリンカーの数は明
らかではない。
μg をY−0緩衝液30μl に溶解し、10単位のBalIを加
え、37℃で2時間消化反応を行なった。エタノールで沈
澱させた後、20μl のT4リガーゼ緩衝液に溶解し、Sc
aIリンカー(5'pAAGTACTT3':宝酒造社製)を0.01μg
とT4DNAリガーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間
結合反応を行なった。
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをpAGE207ScN
と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
3参照) 以下に示す方法に従って、pAMoERC3中のラビッ
トβグロビン遺伝子中に存在するSfiIサイトの類似配列
を除去するため、pAMoERC3中のラビットβグロ
ビン遺伝子を、すでにその類似配列を除去してあるpA
GE207ScN中のラビットβグロビン遺伝子にすげ
かえ、プラスミドpAMoERC3Scを造成した。造
成の都合上まずpAMoC3Scを造成し、次いでpA
MoERC3Scの造成を行なった。前記のpAGE2
07ScNにおいては、SfiIサイトの類似配列を除去す
るために挿入されたScaIリンカーの数は明らかではない
が、pAMoERC3Scの場合は、造成の際にpAG
E207ScNを一度ScaIで切断しているため、挿入さ
れたScaIサイトの数は1 つであると推定される。
の1μg をY−0緩衝液30μl に溶解し、20単位のKpnI
を加え、37℃で2時間消化反応を行なった。その後、塩
化ナトリウム濃度が100mM になるように塩化ナトリウム
を添加し、20単位のScaIを加え、さらに37℃で2時間消
化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、約0.7kb のDNA断片を回収した。
−100緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のScaIと20単
位のClaIを加え、37℃で2時間消化反応を行なった。該
反応液をアガロースゲル電気泳動後、約0.9kb のDNA
断片を回収した。また別に、(10)で得られたpAM
oERC3の1μg をY−0緩衝液30μl に溶解し、20
単位のKpnIを加え、37℃で2時間消化反応を行なった。
その後、塩化ナトリウム濃度が100mM になるように塩化
ナトリウムを添加し、20単位のXhoIを加え、さらに37℃
で2時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲ
ル電気泳動後、約3.2kb のDNA断片を回収した。
られたpAGE107の1μg をY−100緩衝液 30
μl に溶解し、20単位のXhoIと20単位のClaIを加え、37
℃で2時間消化反応を行なった。該反応液をアガロース
ゲル電気泳動後、約4.3kb のDNA断片を回収した。上
記で得られたpAGE207ScN由来のKpnI -ScaI断
片(0.7kb) 0.1 μgと同プラスミド由来のScaI-ClaI 断
片(0.9kb) 0.1 μg とpAMoERC3由来のKpnI-Xho
I 断片(3.2kb) 0.3 μg とpAGE107由来のXhoI-C
laI 断片(4.3kb)0.3μg とをT4リガーゼ緩衝液30μl
に溶解し、T4DNAリガーゼ175 単位を加えて、12℃
で16時間結合反応を行なった。
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをpAMoC3Scと名
付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
(図14参照) (10)で得られたpAMoERC3の1μg をY−0
緩衝液30μl に溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃で2
時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度
が150mM になるように塩化ナトリウムを添加し、20単位
のMluIを加え、さらに37℃で2時間消化反応を行なっ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約6.8kb の
DNA断片を回収した。
50緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のXhoIと20単位の
MluIを加え、37℃で2時間消化反応を行なった。該反応
液をアガロースゲル電気泳動後、約1.3kb のDNA断片
を回収した。また別に、pAMoC3Scの1μg をY
−0緩衝液30μl に溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃
で2時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム
濃度が100mM になるように塩化ナトリウムを添加し、20
単位のXhoIを加え、さらに37℃で2時間消化反応を行な
った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約5.9kb
のDNA断片を回収した。
nI-MluI 断片(6.8kb) 0.2 μg と同プラスミド由来のXh
oI-MluI 断片(1.3kb) 0.05μg とpAMoC3Sc由来
のKpnI-XhoI 断片(5.9kb) 0.2 μg とをT4リガーゼ緩
衝液30μl に溶解し、T4DNAリガーゼ175 単位を加
えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用
いて大腸菌HB101 株をコーエンらの方法によって形質転
換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から
公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラス
ミドをpAMoERC3Scと名付け、その構造を制限
酵素消化により確認した。
用のプロモーターとして、モロニー・マウス白血病ウイ
ルスのロング・ターミナル・リピート(long terminal
repeat )を有している。また、異種遺伝子の効率良い
発現のために、ラビットβグロビン遺伝子スプライシン
グシグナル、ラビットβグロビン遺伝子ポリA付加シグ
ナルおよびSV40初期遺伝子ポリA付加シグナルが、
挿入する異種遺伝子のうしろに付加するように設計され
ている。また、動物細胞用の薬剤耐性マーカーとしてG
418耐性遺伝子を、大腸菌用の薬剤耐性マーカーとし
てカナマイシン耐性遺伝子(G418耐性遺伝子と同じ
もの)とアンピシリン耐性遺伝子をそれぞれ有してい
る。さらに、エプスタイン・バール・ウイルス(Epstei
n-Barr virus)の複製開始点(oriP)とoriPに
トランスに作用し複製を引き起こす因子であるEBNA
−1遺伝子とを有するため、ナマルバ細胞をはじめとし
て齧歯類を除く多くの細胞中で、染色体に組み込まれる
ことなくプラスミドの状態で存在することが可能であ
る。
0に対する耐性度の検討 無血清培地馴化ナマルバ細胞(KJM−1株)〔細井
ら、サイトテクノロジー(Cytotechnology),1,151(1988)
〕を種々の濃度のヒママメレクチン120存在下で培
養し、KJM−1株のヒママメレクチン120に対する
耐性度を調べた。KJM−1株をRPMI1640・I
TPSGF培地〔7.5%炭酸水素ナトリウムを1/40量、 2
00mM L−グルタミン溶液 (GIBCO 社製) を3%、ペニシ
リン・ストレプトマイシン溶液 (GIBCO 社製、5000 unit
s/ml ペニシリン、 5000μg/ml ストレプトマイシン)
を0.5%、 N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’
−2−エタンスルホン酸(N-(2-hydroxyethyl)piperazin
e-N'-2-ethanesulfonic acid; HEPES)(10mM)、インシ
ュリン(3μg/ml)、トランスフェリン(5μg/ml)、
ピルビン酸ナトリウム(5mM )、セレン酸ナトリウム
(125nM )、ガラクトース(1mg/ml)、プルロニックF
68(0.1% w/v)を含むRPMI1640培地(日水製
薬社製)〕で 5×104 細胞/ml の濃度になるように懸濁
し、96穴マイクロタイタープレートに200 μl ずつ分注
した。そこに各種濃度のヒママメレクチン120(生化
学工業社製)を 1/100量ずつ添加し、 CO2インキュベー
ター中で37℃で1〜2週間培養した。その結果、KJM
−1株の成育を完全に阻止するヒママメレクチン120
の最小濃度は50ng/ml であった。400 万個のKJM−1
株について調べたところ、この濃度において、ヒママメ
レクチン120耐性株の自然発祥的な出現は認められな
かった。
→3シアリルトランスフェラーゼcDNA(LEC)の
クローン化 (1)ヒト組織球腫細胞株であるTYH細胞からのmR
NAの取得 1×108 個のTYH細胞〔Haranakaら:インターナショ
ナル・ジャーナル・オブ・キャンサー(Int.J.Cancer),3
6,313(1985) 〕より、インビトロジェン (Invitrogen)
社製のmRNA抽出キットであるFast Track (商品番号
K1593-02) を用いて、約40μg のmRNAを取得した。
15参照) 上記で得られたmRNAの8μg から、インビトロジェ
ン (Invitrogen) 社製のcDNA合成キットであるThe
Librarian I を用いて、ランダム・プライマーをプライ
マーとして2本鎖cDNAを合成した。その後、cDN
Aの両末端にBstXIリンカーの代わりに、以下に示
すSfiI(配列番号5)リンカーを付与し、アガロー
スゲル電気泳動によりcDNAをサイズにより分画を行
ない、約1.2 kb以上のcDNA断片を回収した。
DNAはそれぞれアプライド・バイオシステムズ社製の
380A・DNA合成機を用いて合成した。合成したD
NAはそれぞれ50μg ずつ、別々にT4キナーゼ緩衝液
50μl に溶解し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒
造社製)30単位を加えて、37℃で16時間リン酸化反応を
行なった後に用いた。具体的試薬および方法は、Bst
XIリンカーの代わりに、上記のSfiIリンカーを使
用した以外は、キットに付与されている説明書に従っ
た。
pression Cloning Vector )であるpAMoERC3S
cの 24 μg をY−50緩衝液590 μl に溶解し、80単
位のSfiIを加え、37℃で16時間消化反応を行なった。こ
の反応液から5μl をとりアガロースゲル電気泳動にか
けて切断が完了したのを確認後、cDNAライブラリー
造成時のcDNAインサートが挿入されていないクロー
ンの量を減少させるために、反応液に40単位のBamHI を
加え、さらに37℃で2時間消化反応を行なった。その
後、該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約11.5kbの
DNA断片を回収した。
のSfiI断片(11.5kb) 2μg とcDNAとをT4リガーゼ
緩衝液 250μl に溶解し、T4DNAリガーゼ2000単位
を加え、12℃で16時間結合反応を行なった。その後、ト
ランスファーRNA(tRNA)5μg を添加し、エタノー
ルで沈澱させた後、TE緩衝液20μl に溶解した。該反
応液を用いて大腸菌LE392株〔マニアティス (Mani
atis) ら編集:モレキュラー・クローニング (Molecula
r Cloning), 2.58,Cold Spring Harbor 1989年刊〕をエ
レクトロポーレーション法〔ウイリアム・ジェイ・ドゥ
ワー (WilliamJ.Dower)ら:ヌクレイック・アシッド・
リサーチ (Nucleic Acids Res.),16,6127(1988) 〕によ
り形質転換し、約20万個のアンピシリン耐性株を得た。
ゼcDNA(LEC)のクローン化 (2)で得られた約20万個のアンピシリン耐性株(cD
NAライブラリー)を混合した後、キィアジェン (Qiag
en) 社製のプラスミド調製キットである>plasmid<maxi
kit (商品番号 41031 )を用いてプラスミドを調製し
た。取得したプラスミドはエタノールで沈澱させた後、
1μg/μl になるようにTE緩衝液に溶解した。
ョン法〔Miyajiら:サイトテクノロジー(Cytotechnolog
y),3,133(1990)〕により、KJM−1株に導入した。1.
6 ×106 細胞あたり4μg のプラスミドを導入後、8ml
のRPMI1640・ITPSGF培地に懸濁し、CO2
インキュベーター中で37℃で24時間培養した。その後、
G418(ギブコ社製)を0.5mg/mlになるように添加してさ
らに5〜7日培養して形質転換株を得た。得られた形質
転換株は、ヒママメレクチン120(50ng/ml) が含ま
れたRPMI1640・ITPSGF培地で5×104 細
胞/ml になるように懸濁し、96穴マイクロタイタープレ
ートに200 μl ずつ分注した。 CO2インキュベーター中
で37℃で2〜3週間培養した結果、ヒママメレクチン1
20に耐性となった株が7株得られた。この耐性株より
ハート法〔ロバート・エフ・マーゴルスキー (Robert
F.Margolskee)ら:モレキュラー・アンド・セルラー・
バイオロジー (Mol.Cell.Biol.) ,8,2837(1988) 〕に従
って、プラスミドを回収し、エレクトロポーレーション
法〔ウイリアム・ジェイ・ドゥワー (William J.Dower)
ら:ヌクレイック・アシッド・リサーチ (Nucleic Ac
ids Res.),16,6127(1988) 〕により大腸菌LE392株
を形質転換した。この形質転換株よりキィアジェン (Qi
agen) 社製のプラスミド調製キットを用いてプラスミド
を調製し、その構造を各種制限酵素で切断して調べたと
ころ、約1.9kb のcDNAを含んでいた。このcDNA
を含むプラスミドをpAMoERLと名付け、これを上
記の方法で再度KJM−1株に導入したところ、再びヒ
ママメレクチン120耐性となったことから、このcD
NAがレクチン耐性の原因遺伝子であることが明らかと
なった。pAMoERLを導入したKJM−1株は200n
g/mlのヒママメレクチン120存在下でも成育が可能で
あった。
cDNA(LEC)の塩基配列の決定 (1)α2→3シアリルトランスフェラーゼcDNA
(LEC)のpUC119への組み込み(図16参照) 3(3)で得られたpAMoERLの1μg をY−10
0緩衝液30μl に溶解し、20単位のEcoRV と20単位のAs
p718〔ベーリンガー・マンハイム(BoehringerMannheim)
社製〕を加え、37℃で2時間消化反応を行なった。該
反応液をアガロースゲル電気泳動後、約1.97kbのDNA
断片を回収した。
g) ら:メソッド・イン・エンザイモロジー (Methods i
n Enzymology),153,3(1987)〕1μg をK−20緩衝液
30 μl に溶解し、20単位のSmaIを加え、37℃で2時間
消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度が10
0mM になるように塩化ナトリウムを添加し、20単位のAs
p718を加え、さらに37℃で2時間消化反応を行なった。
該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約3.16kbのDN
A断片を回収した。
V-Asp718断片(1.97kb) 0.2μg とpUC119由来のSm
aI-Asp718 断片(3.16kb) 0.1μg とをT4リガーゼ緩衝
液30μl に溶解し、T4DNAリガーゼ175 単位を加え
て、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用い
て大腸菌HB101 株をコーエンらの方法によって形質転換
し、アンピシリンに耐性な株を得た。この形質転換株か
ら公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラ
スミドをpUC119−LECと名付け、その構造を制
限酵素消化により確認した。
ミドの造成 上記(1)で得られたpUC119−LECの2μg を
Y−150緩衝液30μl に溶解し、20単位のBamHI と20
単位のSphIを加え、37℃で2時間消化反応を行なった。
エタノールで沈澱させた後、ExoIII Buffer (宝酒造社
製のキロシークエンス用デレーションキット)100 μl
に溶解した。また、pUC119−LECの2μg をY
−0緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のSacIを加え、37
℃で2時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウ
ム濃度が150mM になるように塩化ナトリウムを添加し、
20単位のNotIを加え、さらに37℃で2時間消化反応を行
なった。エタノールで沈澱させた後、ExoIII Buffer 10
0 μl に溶解した。
の BamHI-SphI 断片およびSacI-NotI 断片より、宝酒造
社製のキロシークエンス用デレーションキットを用い
て、それぞれ数十種のデレーションプラスミドを作成し
た。上記で得られたデレーションプラスミドの塩基配列
は、アプライド・バイオシステムズ社のTaq DyeDeoxy T
erminator Cycle Sequencing Kit(商標番号401113)を
用いて決定した。決定した塩基配列を配列番号1に示し
た。またそのアミノ酸配列より、このタンパク質がグリ
コシルトランスフェラーゼ(以下、GTと略記する)に共
通な構造を有することが明らかになった。すなわち、N
末の8アミノ酸を細胞質側にだし、それに続く18アミ
ノ酸からなる疎水性に富む領域で膜に結合し、触媒部位
を含む残りの大半のC末部分をゴルジ体内腔に露出する
といった構造をとっていると考えられる。他のGTとアミ
ノ酸配列を比較したところ、ラットのα2→6シアリル
トランスフェラーゼと相同性があることも判明した。以
上のことから、ヒママメレクチン120耐性遺伝子は、
GTをコードしていると考えられる。
現プラスミドを導入したKJM−1株のα2→3シアリ
ルトランスフェラーゼ活性の測定 4で得られたpAMoERLを導入したKJM−1株を
G418を0.5mg/ml含むRPMI1640・ITPSGF培
地30mlに5×105 細胞/ml になるように懸濁し、CO2 イ
ンキュベーター中で37℃で3日間培養した。培養後、16
0 ×g で10分間遠心分離することにより細胞を集め、P
BS〔8g/l塩化ナトリウム, 0.2g/l塩化カリウム, 1.15
g/l 無水リン酸1水素ナトリウム, 0.2g/lリン酸2水素
カリウム〕10mlで洗浄後、再度遠心し分離して細胞を集
めた。
モジナイズ用緩衝液〔250mM サッカロース,10mM トリ
ス−塩酸 (pH7.4)〕100 μl を加えて懸濁した後、超音
波により細胞を破砕した。破砕液を550 × gで10分間遠
心分離し上清を取得した。また、コントロールとしてベ
クターであるpAMoERC3Scを導入したKJM−
1株を作成し、同様にして上清を取得した。
μl を用いて最終容量50μl のアッセイ溶液〔0.1Mカコ
ジル酸−塩酸 (pH6.5), 0.01M 塩化マンガン,0.45% ト
ライトンX-100, 0.08mM 基質,5mM CMP- シアル酸 (添加
あるいは無添加) 〕中で、37℃、2時間反応させた後、
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により生産物
の同定を行なうことによりそれぞれの上清中のα2→3
シアリルトランスフェラーゼ活性を測定した。活性測定
に用いた上清のタンパク質の量は200 μg であり、タン
パク質の定量はBCA Protein Assay Reagent (PIERCE 社
製) を用いて行った。基質としてはアミノピリジンで蛍
光標識した糖鎖(Gal β1→4GlcNAcβ1→3Gal β1
→4Glc- アミノピリジン)を用いた。基質の蛍光標識
は、ラクト−N−ネオテトラオース(バイオカーブ社
製)を用いて、常法〔Akimoto Kondo ら:アグリカルチ
ュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agri
c.Biol.Chem.),54,2169(1990)〕に従って行なった。そ
れぞれの上清について、糖供与体であるCMP-シアル酸を
含むアッセイ溶液と含まないアッセイ溶液を用いてそれ
ぞれ反応させた後、反応液をそれぞれHPLCで分離
し、CMP-シアル酸が含まれたアッセイ溶液でのみ出現す
るピークを生成物とした。反応の終了したアッセイ溶液
は、100 ℃で5分間処理後、10000 ×g で10分間遠心分
離し、その上清をHPLCに供した。HPLCは、TS
Kgel ODS- 80TM カラム(4.6mm ×30cm;To
soh 社製)を使用し、0.02M 酢酸アンモニウム緩衝液
(pH4.0)を用い、溶出温度50℃、流速 1ml/ 分で溶出を
行なった。生成物の検出は、島津製作所製のFluorescen
ce HPLC Monitor (RF-535T) を用いて行なった(励起波
長320nM 、放射波長400nM )。その結果、図17に示す
ように生成物としてピーク1とピーク2が検出された。
スタンダードと溶出時間が一致すること、および生成物
をシアリダーゼ処理した時に基質が再生成することか
ら、ピーク1が NeuAcα2→6Galβ1→4GlcNAcβ1
→3Gal β1→4Glc −アミノピリジンで、ピーク2が
NeuAc α2→3Gal β1→4GlcNAc β1→3Gal β1
→4Glc−アミノピリジンであることが明らかとなっ
た。生成物のシアリダーゼ処理は以下のようにして行な
った。前述の上清10μl をHPLCにかけてピーク1と
ピーク2をそれぞれ分取し、凍結乾燥後、20mM トリス
−マレイン酸 (pH6.0), 1mM クエン酸カルシウムからな
る緩衝液50μl に溶解した。次いで、その溶解液20μl
に400mU/mlシアリダーゼ(neuraminidase,シグマ社製,
N-2133)を2μl 加え、37℃で16時間反応を行なった。
また、コントロールとして、シアリダーゼの代わりに水
を2μl 加え、同様に反応を行なった。反応の終了した
溶液は、100 ℃で5 分処理後、10000 × gで10分間遠心
分離し、その上清10μl を前述のHPLCに供した。そ
の結果を図18に示す。ピーク1においてもピーク2に
おいても、シアリダーゼ処理により生成物としてピーク
3が検出された。ピーク3はその溶出時間から基質であ
るGal β1→4GlcNAc β1→3Gal β1→4Glc−アミ
ノピリジンであると考えられる。
と、ベクターであるpAMoERC3Scを導入したK
JM−1株のHPLCパターンを比較すると、ピーク1
に関してはほぼ等しいのに対し、ピーク2においては、
pAMoERLを導入したものの方が有意に高かった。
pAMoERLを導入したKJM−1株のピーク1に対
するピーク2の比は、ベクターであるpAMoERC3
Scを導入したKJM−1株の場合の比の6〜7倍であ
った(図17参照)。以上の結果から、このヒママメレ
クチン耐性遺伝子はα2→3シアリルトランスフェラー
ゼ遺伝子であること、および当該遺伝子がコードするα
2→3シアリルトランスフェラーゼを用いてシアル酸を
付加したオリゴ糖を製造できることが示された。
導入したKJM−1株におけるSialyl-Le X の合成:実
施例1の3(3)で得られたpAMoERLおよび実施
例1の1(14)で得られた直接発現クローニングベク
ターpAMoERC3Scをそれぞれ導入したKJM−
1株を、G418を0.5mg/ml含むRPMI1640・ITP
SGF培地でそれぞれ培養後、それぞれ約1×106 個の
細胞をマイクロチューブ(1.5 ml:エッペンドルフ社
製)にとり、550 ×g で7分間遠心分離し細胞を集め
た。次に、0.1 %のアジ化ナトリウムを含むPBS(以
下、A−PBSと略記する)1ml で細胞を洗浄後、Sial
yl-Le X に対する単クローン性抗体であるKM93〔設
楽ら:アンチキャンサー・リサーチ (Anticancer Re
s.),9,999(1989)〕を用いて以下のようにして間接蛍光
抗体染色を行い、それぞれの細胞におけるSialyl-Le X
の発現を調べた。
(10μg/ml) 加えて懸濁し、4℃で1時間反応させた。
次いで、細胞をA−PBSで3回洗浄後、フルオレセイ
ンイソチオシアネート(FITC)で蛍光標識した抗マウスI
gG抗体およびIgM抗体(カッペル社製、A−PBS
で20倍に希釈して使用)20μl を加えて懸濁し、4℃で
30分間反応させた。反応後、細胞をA−PBSで3回洗
浄した後、再度A−PBSに懸濁し、フローセルソータ
ーFCS−1(日本分光社製)で解析を行った。対照と
して、KM93の代わりに正常マウス血清(A−PBS
で500 倍に希釈して使用)を用いて上記と同様に解析を
行った。結果を図19に示す。直接発現クローニングベ
クターpAMoERC3Scを導入したKJM−1株に
おいて、KM93で染色した細胞の蛍光強度は、対照の
蛍光強度よりも強い(図19のa)。このことは、KJ
M−1株がもともとSialyl-Le X を発現していることを
示している。また、本発明のα2→3シアリルトランス
フェラーゼを発現するプラスミドpAMoERLを導入
したKJM−1株をKM93で染色した細胞の蛍光強度
は、pAMoERC3Scを導入したKJM−1株より
もさらに強くなっている(図19のb)。このことは、
本発明のα2→3シアリルトランスフェラーゼが、細胞
内でSialyl-Le X を合成していることを示している。
スフェラーゼの生産 1.α2→3シアリルトランスフェラーゼ分泌発現用プ
ラスミドpAMoPRSAL- 35Fの造成 (1)pAGE147の造成 (図20参照) 以下に示す方法に従って、pAGE107のSV40初期遺
伝子プロモーターをモロニー・マウス白血病ウイルスの
ロング・ターミナル・リピート(long terminal repea
t;LTR )のプロモーターにすげかえたプラスミドpA
GE147の造成を行なった。
スミドpPMOL1の2μg をY−0緩衝液30μl に溶
解し、20単位のSmaIを加え、30℃で3時間消化反応を行
った。その後、塩化ナトリウムを50mMになるように添加
し、20単位のClaIを加えて37℃で2時間消化反応を行っ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、モロニー・
マウス白血病ウイルスのLTR プロモーターを含む約0.6k
b のDNA 断片を回収した。
の2種の合成DNA
ーゼ緩衝液10μl に溶解し、5 単位のT4DNA キナーゼを
加え、37℃で30分間反応させることにより5’末端をリ
ン酸化した。上記で得られたpPMOL1由来のClaI-S
maI 断片(0.6kb)0.05 μg と5’リン酸化された2種の
合成DNA (1ピコモルずつ)およびHindIII リンカー
(5'-pCAAGCTTG-3'; 宝酒造社製) (1ピコモル)をT4リ
ガーゼ緩衝液30μl に溶解し、T4DNA リガーゼ200 単位
を加え、12℃で16時間結合反応を行った。エタノール沈
澱により該DNA 断片を回収した後、Y−100緩衝液に
溶解し、10単位のHindIII および10単位のXhoIを加えて
37℃で2時間消化反応を行った。反応をフェノール−ク
ロロホルム抽出により停止させ、エタノール沈澱により
該DNA 断片を回収した。
79、Miyajiら:サイトテクノロジー(Cytotechnolog
y)、3、133(1990)〕の1μg を30μl のY−
100緩衝液に溶解し、10単位のHindIII と10単位のXh
oIを加えて37℃で2時間消化反応を行った。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、G418耐性遺伝子およびアン
ピシリン耐性遺伝子を含む約6.0kb のDNA 断片を回収し
た。
III-XhoI断片(6.0kb)0.3μg とpPMOL1由来のHind
III-XhoI断片(0.6kb)0.01 μg とをT4リガーゼ緩衝液20
μlに溶解し、T4DNA リガーゼ200 単位を加え、12℃で1
6時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101
株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシ
リン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従
ってプラスミドを単離した。このプラスミドをpAGE
147と名付け、その構造を制限酵素消化により確認し
た。
照) 以下の示す方法に従って、pAGE207のSV40初期遺
伝子プロモーターをモロニー・マウス白血病ウイルスの
ロング・ターミナル・リピート(long terminal repea
t:LTR )のプロモーターにすげかえたプラスミドpA
GE247の造成を行なった。
g を30μl のY−100緩衝液に溶解し、10単位のHind
III と10単位のXhoIを加えて37℃で2時間消化反応を行
った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、モロニー
・マウス白血病ウイルスのLTR プロモーターを含む約0.
63kbのDNA 断片を回収した。一方、実施例1の1(1
1)で得られたpAGE207の2μg を30μl のY−
100緩衝液に溶解し、10単位のHindIII と10単位のXh
oIとを加えて37℃で2時間消化反応を行った。該反応液
をアガロースゲル電気泳動後、hyg 耐性遺伝子およびア
ンピシリン耐性遺伝子を含む約5.84kbのDNA 断片を回収
した。
III-XhoI断片(0.63kb)0.05μg とpAGE207由来の
HindIII-XhoI断片(5.84kb)0.1 μg をT4リガーゼ緩衝液
30μl に溶解し、T4DNA リガーゼ100 単位を加え、12℃
で16時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB
101 株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピ
シリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に
従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをpAG
E247と名付け、その構造を制限酵素消化により確認
した。
参照) 以下の方法に従って、モロニー・マウス白血病ウイルス
のLTR をプロモーターとし、hyg 耐性遺伝子をマーカー
として有するヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の発現
プラスミドpAMN6hygの造成を行なった。
g をY−50緩衝液30μl に溶解し、20単位のClaIを加
え、37℃で2時間消化反応を行った。その後、塩化ナト
リウムを175mM になるように添加し、20単位のSalIを加
えて37℃で2時間消化反応を行った。該反応液をアガロ
ースゲル電気泳動後、モロニー・マウス白血病ウイルス
のLTR プロモーター、アンピシリン耐性遺伝子およびhy
g 耐性遺伝子を含む約4.8kb のDNA 断片を回収した。
られたプラスミドpASN6の2μg をY−50緩衝液
30μl に溶解し、20単位のClaIを加え、37℃で2時間消
化反応を行った。その後、塩化ナトリウムを175mM にな
るように添加し、20単位のSalIと20単位のMluIを加えて
37℃で2時間消化反応を行った。該反応液をアガロース
ゲル電気泳動後、ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体遺
伝子を含む約5.0kb のDNA 断片を回収した。
-SalI 断片(4.8kb) 0.1 μg とpASN6由来のClaI-S
alI 断片(5.0kb) 0.1 μg とをT4リガーゼ緩衝液20μl
に溶解し、T4DNA リガーゼ200 単位を加え、12℃で16時
間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101 株
をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン
耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従って
プラスミドを単離した。このプラスミドをpAMN6h
ygと名付け、その構造を制限酵素消化により確認し
た。
参照) 以下の方法に従って、Staphylococcus aureus のプロテ
インAのイムノグロブリンG(IgG)との結合領域と
の融合タンパク質として任意のタンパク質を分泌発現す
るための分泌発現ベクターpAMoERSAの造成を行
なった。
μg をY−50緩衝液30μl に溶解し、20単位のSnaBI
を加え、37℃2時間消化反応を行なった。その後、塩化
ナトリウムを100mM になるように添加し、20単位のXbaI
を加えて37℃で2時間消化反応を行った。該反応液をア
ガロースゲル電気泳動後、ヒト顆粒球コロニー刺激因子
のシグナル配列を含む約0.33kbのDNA 断片を回収した。
ン・エンジニアリング (Protein Engneering) 、2、4
81(1989)〕の 2μg をY−50緩衝液 30 μl
に溶解し、20単位のClaIを加え、37℃2時間消化反応を
行なった。エタノール沈澱後、30μl のDNA ポリメラー
ゼI緩衝液に溶解し、6単位の大腸菌DNA ポリメラーゼ
Iクレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、ClaI消
化によって生じた5’突出末端を平滑末端に変えた。反
応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出と
エタノール沈澱の後、Y−100緩衝液 30 μl に溶解
し、20単位のBamHI を加え、37℃で2時間消化反応を行
なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、Staphy
lococcus aureus のプロテインAのIgGとの結合領域
を含む約0.21kbのDNA 断片を回収した。
AMoERC3Scの 2μg をY−100緩衝液 30 μ
l に溶解し、20単位のXbaIと20単位のBamHI を加え、37
℃で2時間消化反応を行なった。該反応液をアガロース
ゲル電気泳動後、約12.1kbのDNA 断片を回収した。上記
(3)で得られたpAMN6hyg由来のSnaBI - XbaI
断片(0.33kb) 0.05 μg とpPrAS1由来のClaI(平
滑末端) - BamHI断片(0.21kb) 0.05 μgとpAMoE
RC3Sc由来のXbaI - BamHI断片(12.1kb) 0.1μg と
をT4リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、 T4DNAリガーゼ
175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをpAMoERSAと名
付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
24参照) ナマルバ細胞のようにEBNA−1遺伝子をもともと発
現している細胞を宿主として用いる際には、プラスミド
pAMoERC3Sc中のEBNA−1遺伝子がなくて
も宿主に導入したプラスミドは染色体に組み込まれるこ
となくプラスミド状態で存在することが可能であると推
定される。そこで、以下に示す方法に従って、pAMo
ERC3Sc中のEBNA−1遺伝子を除去したプラス
ミドpAMoPRC3Scの造成を行なった。pAMo
PRC3Scは、pAMoERC3Scと同様にして直
接発現クローニングベクターとして使用することができ
る。
ERC3Scの 2μg をY−50緩衝液 30 μl に溶解
し、20単位のNsiI〔ニュー・イングランド・バイオラブ
ズ(New England Biolabs )社製〕を加え、37℃で2時
間消化反応を行なった。エタノール沈澱後、30μl のDN
A ポリメラーゼI緩衝液に溶解し、6単位の大腸菌DNA
ポリメラーゼIクレノー断片を加え、37℃で60分間反応
させ、NsiI消化によって生じた3’突出末端を平滑末端
に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロロ
ホルム抽出とエタノール沈澱の後、Y−100緩衝液 3
0 μl に溶解し、20単位のNotIを加え、37℃で2時間消
化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、約8.1kb のDNA 断片を回収した。
衝液 30 μl に溶解し、20単位のXhoIを加え、37℃で2
時間消化反応を行なった。エタノール沈澱後、30μl の
DNAポリメラーゼI緩衝液に溶解し、6単位の大腸菌DNA
ポリメラーゼIクレノー断片を加え、37℃で60分間反
応させ、XhoI消化によって生じた5’突出末端を平滑末
端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロ
ロホルム抽出とエタノール沈澱の後、Y−100緩衝液
30 μl に溶解し、20単位のNotIを加え、37℃で2時間
消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳
動後、約3.2kbのDNA 断片を回収した。
のNsiI (平滑末端) - NotI断片(8.1kb) 0.1 μg と同プ
ラスミド由来のXhoI (平滑末端) - NotI断片(3.2kb) 0.
1 μg とをT4リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、 T4DNA
リガーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行
なった。該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエンら
の方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得
た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミド
を単離した。このプラスミドをpAMoPRC3Scと
名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
参照) 以下に示す方法に従って、pAMoERSA中のEBN
A−1遺伝子を除去したプラスミドpAMoPRSAの
造成を行なった。pAMoPRSAは、pAMoERS
Aと同様に分泌発現ベクターとして使用することができ
る。
2μg を10mMトリス−塩酸(pH7.5),6mM 塩化マグネシウ
ム,80mM塩化ナトリウム, 6mM 2−メルカプトエタノー
ルからなる緩衝液(以下これをY−80緩衝液と略記す
る)30μl に溶解し、20単位のXbaIと20単位のAsp718
〔ベーリンガー・マンハイム(Boehringer mannheim)社
製〕を加え、37℃で2時間消化反応を行なった。該反応
液をアガロースゲル電気泳動後、約1.3kb のDNA 断片を
回収した。
−100緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のXbaIと20単
位のAsp718を加え、37℃で2時間消化反応を行なった。
該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約8.5kb のDNA
断片を回収した。上記で得られたpAMoERSA由来
のXbaI - Asp718 断片(1.3kb) 0.05μgとpAMoPR
C3Sc由来の XbaI - Asp718断片(8.5kb) 0.1 μg と
をT4リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、 T4DNAリガーゼ
175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをpAMoPRSAと名
付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
(図26参照) クローン化したα2→3シアリルトランスフェラーゼは
そのアミノ酸配列から、N末の8アミノ酸を細胞質側に
だし、それに続く18アミノ酸からなる疎水性に富む領
域で膜に結合し、残りの大半の触媒部位を含むC末部分
をゴルジ体内腔に露出するといった構造をとると推定さ
れる。そこで、以下に示す方法に従って、α2→3シア
リルトランスフェラーゼの膜結合領域を除去し、かわり
にヒト顆粒球コロニー刺激因子のシグナル配列ならびに
Staphylococcus aureus のプロテインAのIgGとの結
合領域を付加することによりα2→3シアリルトランス
フェラーゼを分泌生産させた。
結合領域以降〔35番目のPheから333 番目のPheま
で]をコードする遺伝子部分をPCR法を用いて調製
し、上記(6) で得られた分泌発現ベクターpAMoPR
SAに組み込んだ。PCR用のプライマーとして、以下
に示す2種の合成DNA[L-A(35F)(44mer)および L-3NN
(36mer)]をアプライド・バイオシステムズ社380A・
DNA合成機を用いて合成した。
p718サイトが導入されるように設計されているため、P
CRで増幅されたDNA断片はEcoRV とAsp718で切断さ
れ後に、pAMoPRSAのStuIサイトとAsp718サイト
間に組み込むことができる。PCRは、GeneAmp TM DNA
Amplification Reagent Kit with AmpliTaq TM Recomb
inant Taq DNA Polymerase(宝酒造社製)を用いて行な
った。反応液の調製はキットの方法にしたがって行な
い、PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycler (宝酒造
社製)を用いて、94℃/1分、55℃/1分、72℃
/3分のインキュベーションを30サイクル行なった
後、さらに72℃で7分間インキュベートした。鋳型と
しては、実施例1で得られたプラスミドpUC119−
LECを1ng使用した。反応終了後、クロロホルム抽出
およびエタノール沈澱を行なった後、Y−100緩衝液
30 μl に溶解し、20単位のEcoRV および20単位のAsp7
18を加え、37℃で2時間消化反応を行なった。該反応液
をアガロースゲル電気泳動後、約0.9kb のDNA 断片を回
収した。
00緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のStuIと20単位の
Asp718を加え、37℃2時間消化反応を行なった。該反応
液をアガロースゲル電気泳動後、約9.06kbのDNA 断片を
回収した。上記で得られたPCRで増幅したDNA由来
のEcoRV - Asp718断片(0.9kb) 0.1 μg とpAMoPR
SA由来のStuI - Asp718 断片(9.06kb) 0.1μg とをT
4リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、 T4DNAリガーゼ175
単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをpAMoPRSAL-
35Fと名付け、その構造を制限酵素消化により確認し
た。
α2→3シアリルトランスフェラーゼの分泌生産 上記の1(6)で得られたプラスミドpAMoPRSA
(分泌発現ベクター;コントロール)および1(7)で
得られたpAMoPRSAL−35F(α2→3シアリ
ルトランスフェラーゼ分泌発現用プラスミド)をキィア
ジェン (Qiagen) 社製のプラスミド調製キットである>p
lasmid<maxi kit (商品番号 41031)を用いて調製し
た。取得したプラスミドはエタノール沈澱後、1 μg/μ
l になるようにTE緩衝液に溶解した。その後、両プラ
スミドを、エレクトロポーレーション法〔Miyajiら:サ
イトテクノロジー(Cytotechnology)、3、133(19
90)〕により、それぞれナマルバKJM−1株に導入
した。1.6 ×106 細胞あたり4 μg のプラスミドを導入
後、8ml のRPMI1640・ITPSGF培地に懸濁
し、CO2 インキュベーターで37℃で24時間培養した。そ
の後、G418(ギブコ社製)を0.5mg/mlになるように添加
してさらに7日から14日培養し、形質転換株を得た。取
得した形質転換株は、それぞれG418を0.5mg/ml含むRP
MI1640・ITPSGF培地30mlに1 ×105 細胞/m
l になるように懸濁し、CO2 インキュベーターで37℃で
8日間培養した。その後、遠心分離(160 × g、10分
間)により細胞を除き上清を回収し、再度遠心分離(15
00× g、10分間)後、その上清を回収した。このように
して取得した培養上清は、使用するまで -80℃で保存し
た。
コードするα2→3シアリルトランスフェラーゼはStap
hylococcus aureus のプロテインAのIgGとの結合領
域との融合タンパク質として分泌生産されることになる
ため、IgGセファロース(Sepharose )を用いて、容
易に精製することができる。そこで、上記で得られた培
養上清にアジ化ナトリウムを最終濃度0.1 %になるよう
に添加した後、添付の説明書にしたがって前処理したI
gGセファロース〔ファルマシア(Pharmacia)製 ]を100
μl 添加し、4℃で1晩緩やかに攪拌した。遠心分離
(160 × g、10分間)してIgGセファロースを回収
し、RPMI1640・ITPSGF培地1mlで3回洗
浄後、このIgGセファロース 5μl を直接用いて、シ
アリルトランスフェラーゼ活性を測定した。活性測定は
30μl のアッセイ溶液〔 0.1M カコジル酸−塩酸 (pH6.
5), 0.01M 塩化マンガン, 0.45% トライトンX-100, 0.1
mM基質, 上記IgGセファロース(5μl), 5mM CMP- シ
アル酸 (添加あるいは無添加) 〕中で37℃で2時間反応
後、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により生
産物の同定を行なうことにより行なった。基質としては
各種糖鎖〔Lacto-N-neotetraose (LNnT)、Lacto-N-tetr
aose (LNT)、Lacto-N-fucopentaose III (LNFP-III) お
よび Lacto-N-fucopentaose V (LNFP-V);いずれもオッ
クスフォード・グライコシステムズ社製でそれぞれの構
造は第1表に示すとおりである〕をアミノピリジンで蛍
光標識したものを使用した。基質の蛍光標識は、常法
〔AkihiroKondo ら:アグリカルチュラル・アンド・バ
イオロジカル・ケミストリー (Agric. Biol. Chem.) ,
54, 2169 (1990) 〕に従って行なった。それぞれのIg
Gセファロースについて、CMP-シアル酸(糖供与体)の
含まれたアッセイ溶液と含まれないアッセイ溶液とを用
いて反応後、HPLCで解析し、CMP-シアル酸が含まれ
たアッセイ溶液でのみ出現するピークを生成物とした。
反応の終了したアッセイ溶液は、100 ℃で5 分処理後、
遠心分離(10000 × g、10分間)し、その上清のうち10
μl をHPLCに供した。HPLCは、TSKgel
ODS- 80T M カラム(4.6mm ×30cm;東ソー社製)
を使用し、溶出液として0.02M 酢酸アンモニウム緩衝液
(pH4.0)を用い、溶出温度50℃、流速 1ml/分で溶出を
行なった。生成物の検出は、島津製作所製のFluorescen
ce HPLC Monitor (RF-535T) を用いて行なった(励起波
長320nm 、放射波長400nm )。生成物の同定は、スタン
ダ−ドと溶出時間が一致することおよび生成物のシアリ
ダーゼ処理により基質が再生成することより行なった。
生成物の定量は、同様にしてアミノピリジル化したラク
トースをスタンダードとして用い、蛍光強度を比較する
ことにより行なった。アッセイの結果を第1表に示す。
LNnTに対する活性を100 としたときの各種糖鎖基質に対
する相対活性を合わせて示した。
マルバ細胞の培養上清由来のIgGセファロースを使用
した場合は、いずれの糖鎖を基質とした場合もα2→3
シアリルトランスフェラ−ゼ活性が検出された。一方、
ベクターであるpAMoPRSAを導入したナマルバ細
胞の培養上清由来のIgGセファロースを使用した場合
には、いずれの糖鎖を基質とした場合も活性は検出され
なかった。以上の結果から、α2→3シアリルトランス
フェラーゼがStaphylococcus aureus のプロテインAの
IgGとの結合領域との融合タンパク質として培養上清
中に分泌生産されること、また、それがIgGセファロ
ースを用いて、容易に回収、精製されることが示され
た。また、これまでに精製が報告されている公知のα2
→3シアリルトランスフェラーゼのLNT に対する活性を
100 としたときの各種糖鎖基質に対する相対活性〔ワイ
ンスタイン(Wienstein) ら:ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.),257, 13845
(1982)〕を第1表に合わせて示した。公知のα2→3シ
アリルトランスフェラーゼは、LNnTよりもLNT に対して
特異性が高いのに対し、本発明のα2→3シアリルトラ
ンスフェラーゼはLNTよりもLNnTに対して特異性が高い
ことから、本発明のα2→3シアリルトランスフェラー
ゼは、公知の酵素とは基質特異性の異なる新規な酵素で
あることが明らかとなった。また、本発明のα2→3シ
アリルトランスフェラーゼは、LNFP-IIIをも基質としう
ることが明らかになったが、これまでにこのようにLNFP
-IIIに対して酵素活性を有するα2→3シアリルトラン
スフェラーゼの報告はない。このことは、この酵素を用
いることによりin vitroでLeX 糖鎖から直接Sialyl-Le
X糖鎖を合成することができることを示している。ま
た、本発明のα2→3シアリルトランスフェラーゼは、
基質としてLNnTだけでなくLNT も利用することができる
ことから、Sialyl-Le X 糖鎖のみならずSialyl-Le a 糖
鎖も合成することができる。すなわち、本発明のα2→
3シアリルトランスフェラーゼを用いて糖鎖の末端構造
をNeuAc α2-3Galβ1-4GlcNAc あるいはNeuAc α2-3Gal
β1-3GlcNAc に変換した後、α1→3フコシルトランス
フェラーゼ(fucosyltransferase)あるいはα1→4フ
コシルトランスフェラーゼ(fucosyltransferase)を用
いて、それぞれSialyl-Le X 糖鎖あるいはSialyl-Le a
糖鎖を合成することができる。また、本発明のα2→3
シアリルトランスフェラーゼは、公知のα2→3シアリ
ルトランスフェラーゼよりもLNnTに対する基質特異性が
高いため、Sialyl-Le X 糖鎖の合成において、公知のα
2→3シアリルトランスフェラーゼよりも優れている。
2→3シアリルトランスフェラーゼの分泌生産 1.ヒト・メラノーマ細胞株WM266-4 からのα2→3シ
アリルトランスフェラーゼcDNA(WM17)のクローン
化 (1)ヒト・メラノーマ細胞株であるWM266-4 細胞から
のmRNAの取得 1 ×108 個のWM266-4 細胞(ATCC CRL1676)より、インビ
トロジェン (Invitrogen) 社製のmRNA抽出キットである
Fast Track (商品番号K1593-02) を用い、キットに添付
されている説明書に従って、約30μg のmRNAを取得し
た。
(Invitrogen) 社製のcDNA合成キットであるThe Librar
ian I を用いて、ランダム・プライマーをプライマーと
して2本鎖cDNAを合成した。その後、cDNAの両末端にBs
tXI リンカーのかわりに、実施例1の3(2)で合成し
た下記SfiIリンカー
cDNAをサイズにより分画を行ない、約1.2 kb以上のcDNA
断片を回収した。SfiIリンカー(11mer と8mer)はそれ
ぞれ100nM ずつ、別々にT4キナーゼ緩衝液50μl に溶
解し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造社製)30
単位を加えて、37℃で16時間リン酸化反応を行なった後
使用した。具体的試薬および方法は、BstXI リンカーの
代わりに、上記のSfiIリンカーを使用した以外は、キッ
トに付与されている説明書に従った。また、直接発現ク
ローニングベクター(Expression Cloning Vector )と
しては、実施例3の1(5)で得られたpAMoPRC
3Scを使用した。pAMoPRC3Scの 24 μg を
Y−50緩衝液590μl に溶解し、80単位のSfiIを加
え、37℃で16時間消化反応を行なった。その後、反応液
の5 μl をとり、アガロースゲル電気泳動にかけ、切断
が完了したのを確認後、40単位のBamHI を加え、さらに
37℃で2時間消化反応を行なった。BamHI で切断するの
は、cDNAライブラリー造成時のバックグラウンド(cDNA
インサートが挿入されていないクローン)の量を減少さ
せるためである。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、約 8.8kbのDNA 断片を回収した。
のSfiI断片(8.8kb) 2 μg と cDNAとをT4リガーゼ緩
衝液 250μl に溶解し、 T4DNAリガーゼ2000単位を加え
て、12℃で16時間結合反応を行なった。その後、トラン
スファーRNA(tRNA)5 μg を添加し、エタノール沈
澱後、TE緩衝液20μl に溶解した。該反応液を用いて
大腸菌LE392株〔マニアティス (Maniatis) ら編
集:モレキュラー・クローニング (Molecular Clonin
g)、 2.58 、Cold Spring Harbor 1989 年刊行]をエレ
クトロポーレーション法〔ウイリアム・ジェイ・ドゥワ
ー (William J.Dower)ら:ヌクレイック・アシッド・リ
サーチ (Nucleic Acids Res.),16, 6127(198
8)〕により形質転換し、約20万個のアンピシリン耐性
株を得た。 (3)α2→3シアリルトランスフェラ−ゼ遺伝子(WM
17)のクローン化 上記(2) で得られた約20万個のアンピシリン耐性株(cD
NAライブラリー)を混合後、キィアジェン (Qiagen) 社
製のプラスミド調製キットである>plasmid<maxi kit
(商品番号 41031)を用いてプラスミドを調製した。取
得したプラスミドはエタノール沈澱後、1 μg/μl にな
るようにTE緩衝液に溶解した。
ョン法〔Miyajiら:サイトテクノロジー(Cytotechnolog
y)、3、133(1990)]により、KJM−1株に
導入した。1.6 ×106 細胞あたり4 μg のプラスミドを
導入後、8ml のRPMI1640・ITPSGF培地に
懸濁し、CO2 インキュベーターで37℃で24時間培養し
た。その後、G418(ギブコ社製)を0.5mg/mlになるよう
に添加してさらに5〜7日間培養し、形質転換株を得
た。得られた形質転換株は、ヒママメレクチン120
(50ng/ml )が含まれたRPMI1640・ITPSG
F培地で 5× 104細胞/ml になるように懸濁し、96穴マ
イクロタイタープレートに200 μl ずつ分注した。 CO2
インキュベーター中で37℃で4週間培養後、ヒママメレ
クチン120耐性株を取得した。その耐性株を培養後、
約 5×106 の細胞からハ−ト法〔ロバート・エフ・マー
ゴルスキー (Robert F.Margolskee)ら:モレキュラー・
アンド・セリュラー・バイオロジー (Mol.Cell.Biol.)
、8、2837(1988)〕によりプラスミドを回
収した。回収したプラスミドは、エレクトロポーレーシ
ョン法[ウイリアム・ジェイ・ドゥワー (William J.Do
wer)ら:ヌクレイック・アシッド・リサーチ (Nucleic
Acids Res.) 、16、6127(1988)〕により大
腸菌LE392株に導入し、アンピシリン耐性株を取得
した。その形質転換株よりキィアジェン (Qiagen) 社製
のプラスミド調製キット>plasmid<maxi kit を用いてプ
ラスミドを調製し、その構造を各種制限酵素で切断して
調べたところ、約1.9kb のcDNAを含んでいることが明ら
かとなった。このプラスミドをpAMoPRWM17と
名付け、上記と同じ方法で再度KJM−1株に導入した
ところ、再びヒママメレクチン120耐性となったこと
から、このcDNAがレクチン耐性の原因遺伝子であること
が明らかとなった。pAMoPRWM17を導入したK
JM−1株は200ng/mlのヒママメレクチン120存在下
でも生育することができる。
cDNA(WM17)の塩基配列の決定 (1)α2→3シアリルトランスフェラ−ゼcDNA
(WM17)のpUC119への組み込み(図27参照) pAMoPRWM17の 1 μg をY−100緩衝液30
μl に溶解し、20単位のEcoRV と20単位のAsp718〔ベー
リンガー・マンハイム(boehringer mannheim)社製〕を
加え、37℃で2時間消化反応を行なった。該反応液をア
ガロースゲル電気泳動後、約1.9kb のDNA 断片を回収し
た。
g) ら:メソッド・イン・エンザイモロジー (Methods i
n Enzymology)、153 、3 、 (1987) 〕の1 μg をK−
20緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のSmaIを加え、37
℃で2時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウ
ム濃度が100mMになるように塩化ナトリウムを添加
し、20単位のAsp718を加え、さらに37℃で2時間消化反
応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、
約3.16kbのDNA 断片を回収した。
のEcoRV - Asp718 断片(1.9kb) 0.2 μg とpUC11
9由来の SmaI - Asp718断片(3.16kb) 0.1μg とをT4
リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、T4DNA リガーゼ175 単
位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応
液を用いて大腸菌HB101 株をコーエンらの方法によって
形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換
株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。この
プラスミドをpUC119−WM17と名付け、その構
造を制限酵素消化により確認した。
ミドの造成 pUC119−WM17の 2μg をY−150緩衝液30
μl に溶解し、20単位のBamHI と20単位のSphIを加え、
37℃で2時間消化反応を行なった。エタノール沈澱後、
Exo III 緩衝液(宝酒造社製のキロシークエンス用デレ
ーションキットに添付)100 μl に溶解した。また、同
プラスミド 2 μg をY−0緩衝液 30μl に溶解し、2
0単位のSacIを加え、37℃で2時間消化反応を行なっ
た。その後、塩化ナトリウム濃度が150mMになるよ
うに塩化ナトリウムを添加し、20単位のNotIを加え、さ
らに37℃で2時間消化反応を行なった。エタノール沈澱
後、Exo III 緩衝液100 μl に溶解した。
来の BamHI - SphI 断片および同プラスミド由来の Sac
I - NotI断片より、宝酒造社製のキロシークエンス用デ
レーションキットを用いてそれぞれ数十種のデレーショ
ンプラスミドを作成した。具体的な試薬および方法は、
キットに付与されている説明書に従った。上記で得られ
たデレーションプラスミドの塩基配列は、アプライド・
バイオシステムズ社のTaq DyeDeoxyTM Terminator Cycl
e Sequencing Kit(商品番号401113)を用いて決定し
た。決定した塩基配列を配列番号6に示した。1742ベー
スペアー(bp)後はポリAが付加している。この塩基配
列より、このDNAは、329アミノ酸からなるタンパク
質をコードしていることが明らかになった。その配列を
配列番号7に示した。また、そのアミノ酸配列は、実施
例1でTYH細胞よりクローン化したα2→3シアリル
トランスフェラーゼをコードするDNAのものと約91
%の相同性があることも判明した。以上のことから、ヒ
ママメレクチン120に対する耐性化を指標に取得され
たcDNA(WM17)は、α2→3シアリルトランスフェ
ラーゼをコードしていると推定される。
JM−1株のα2→3シアリルトランスフェラーゼ活性
の測定 実施例1の5と同様の方法で、WM17発現プラスミド
(pAMoPRWM17)を導入したKJM−1株とコ
ントロールプラスミドであるpAMoPRC3Scを導
入したKJM−1株のα2→3シアリルトランスフェラ
ーゼ活性を比較した。その結果、pAMoPRWM17
を導入したKJM−1株のα2→3シアリルトランスフ
ェラーゼ活性は、pAMoPRC3Scを導入したKJ
M−1株の活性に比べて6〜7倍高かった。
発現プラスミドを導入したKJM−1株におけるSialyl
-Le X 糖鎖の合成 実施例4の1で得られたpAMoPRWM17(α2→
3シアリルトランスフェラーゼ発現プラスミド)、およ
びpAMoPRC3Sc(コントロールプラスミド)を
導入したKJM−1株を、G418を0.5mg/ml含むRPMI
1640・ITPSGF培地で培養後、それぞれ約 1×
106 個の細胞をマイクロチューブ(1.5ml:エッペンド
ルフ社製)にとり、遠心分離(550 × g、7 分間)によ
り細胞を集めた。ついで、0.1%のアジ化ナトリウムを含
むPBS(A- PBS)1ml で細胞の洗浄した。つい
で、集めた細胞に対し、Sialyl-Le X 糖鎖に対する抗体
であるKM93〔設楽ら:アンチキャンサー・リサーチ
( Anticancer Res.) 、9 、999 (1989)〕を用いて間接
蛍光抗体染色を行ない、これらの細胞におけるSialyl-L
e X 糖鎖の生産を調べた。集めた細胞に対しKM93を
それぞれ50μl ( 10μg / ml )加えて懸濁し、4 ℃で1
時間反応させた。ついで、細胞をA−PBSで3回洗浄
後、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)で蛍光標
識した抗マウスIgG抗体およびIgM抗体(カッペル
社製、A−PBSで20倍希釈して使用)20μl を加えて
懸濁し、4 ℃で30分間反応させた。ついで、細胞をA−
PBSで3回洗浄した後、再度A−PBSに懸濁し、エ
ピックス・エリート・フローサイトメーター〔EPICS El
ite Flow Cytometer;コールター(COULTER )社製〕で
解析を行なった。
ス血清(A−PBSで500 倍希釈して使用)を用いて上
記と同様に解析を行なった。結果を図28に示す。直接
発現クローニングベクターpAMoPRC3Sc(コン
トロールプラスミド)を導入したKJM−1株におい
て、KM93で染色した細胞の蛍光強度は、対照のそれ
と比較して強いことがわかる。このことは、KJM−1
株がもともとSialyl-Le X 糖鎖を発現していることを意
味している。また、pAMoPRWM17(α2→3シ
アリルトランスフェラーゼ発現プラスミド)を導入した
KJM−1株をKM93で染色した際の蛍光強度は、p
AMoPRC3Sc(コントロールプラスミド)を導入
したKJM−1株をKM93で染色した際の蛍光強度よ
りさらに強くなっていた。このことは、WM17がコー
ドするα2→3シアリルトランスフェラーゼが、細胞内
で実際にSialyl-Le X 糖鎖を合成できることを示してい
る。
2→3シアリルトランスフェラーゼの分泌生産 (1)α2→3シアリルトランスフェラーゼ分泌生産用
プラスミドpAMoPRSAW17−31Fの造成(図
29参照) クローン化したWM17がコードするα2→3シアリル
トランスフェラーゼはそのアミノ酸配列から、N末の8
アミノ酸を細胞質側にだし、それに続く18アミノ酸か
らなる疎水性に富む領域で膜に結合し、残りの大半の触
媒部位を含むC末部分をゴルジ体内腔に露出するといっ
た構造をとると推定される。そこで、以下に示す方法に
従って、α2→3シアリルトランスフェラーゼの膜結合
領域を除去し、かわりにヒト顆粒球コロニー刺激因子の
シグナル配列ならびにStaphylococcus aureus のプロテ
インAのIgGとの結合領域を付加することによりα2
→3シアリルトランスフェラーゼを分泌生産させた。α
2→3シアリルトランスフェラーゼの膜結合領域以降
〔31番目のPheから329 番目のPheまで〕をコード
するDNAをPCR法を用いて調製し、実施例1の3
(6)で得られた分泌発現ベクターpAMoPRSAに
組み込んだ。
2種の合成DNA〔W17-A(31F) (44mer)および W17-C
(36mer)〕をアプライド・バイオシステムズ社380A
・DNA合成機を用いて合成した。
Asp718サイトが導入されるように設計されているため、
PCRで増幅されたDNA断片はEcoRV とAsp718で切断
した後に、pAMoPRSAのStuIサイトとAsp718サイ
ト間に組み込むことができる。PCRは、GeneAmp TM D
NA Amplification Reagent Kit with AmpliTaqTM Recom
binant Taq DNA Polymerase (宝酒造社製)を用いて行
なった。反応液の調製はキットに指示された方法にした
がって行ない、PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycle
r (宝酒造社製)を用いて、94℃/1分、55℃/1
分、72℃/3分のインキュベーションを30サイクル
行なった後、さらに72℃で7分間インキュベートし
た。鋳型としては、上記2(1)で造成したプラスミド
pUC119−WM17を1ng使用した。反応終了後、
クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行なった後、
Y−100緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のEcoRV お
よび20単位のAsp718を加え、37℃で2時間消化反応を行
なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約0.91
kbのDNA 断片を回収した。
00緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のStuIと20単位の
Asp718を加え、37℃2時間消化反応を行なった。該反応
液をアガロースゲル電気泳動後、約9.06kbのDNA 断片を
回収した。上記で得られたPCRで増幅したDNA由来
のEcoRV - Asp718断片(0.91kb) 0.1μg とpAMoPR
SA由来のStuI - Asp718 断片(9.06kb) 0.1μg とをT
4リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、T4DNA リガーゼ175
単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをpAMoPRSAW1
7- 31Fと名付け、その構造を制限酵素消化により確
認した。 (2)ナマルバKJM−1細胞を宿主としたα2→3シ
アリルトランスフェラーゼの分泌生産 実施例3の1(6)で得られたプラスミドpAMoPR
SA(分泌発現ベクター;コントロール)および上記
(1)で造成したpAMoPRSAW17- 31F(α
2→3シアリルトランスフェラーゼ分泌発現用プラスミ
ド)をキィアジェン (Qiagen) 社製のプラスミド調製キ
ットである>plasmid<maxi kit (商品番号41031)を用い
て調製した。取得したプラスミドはエタノール沈澱後、
1 μg/μl になるようにTE緩衝液に溶解した。その
後、両プラスミドを、エレクトロポーレーション法〔Mi
yajiら:サイトテクノロジー(Cytotechnology)、3、1
33(1990)〕により、それぞれナマルバKJM−
1株に導入した。1.6 ×106細胞あたり4 μg のプラス
ミドを導入後、8ml のRPMI1640・ITPSGF
培地に懸濁し、CO2 インキュベーターで37℃で24時間培
養した。その後、G418(ギブコ社製)を0.5mg/mlになる
ように添加してさらに7〜14日間培養し、形質転換株を
得た。取得した形質転換株は、それぞれG418を0.5mg/ml
含むRPMI1640・ITPSGF培地30mlに1 ×10
5 細胞/ml になるように懸濁し、CO2 インキュベーター
で37℃で8日間培養した。その後、遠心分離(160 ×
g、10分間)により細胞を除き上清を回収し、再度遠心
分離(1500× g、10分間)後、その上清を回収した。こ
のようにして取得した培養上清は、使用するまで -80℃
で保存した。
Fのコードするα2→3シアリルトランスフェラーゼは
Staphylococcus aureus のプロテインAのIgGとの結
合領域との融合タンパク質として分泌生産されることに
なるため、IgGセファロース(Sepharose )を用い
て、容易に精製することができる。そこで、上記で得ら
れた培養上清にアジ化ナトリウムを最終濃度0.1 %にな
るように添加した後、製品説明書にしたがって前処理し
たIgGセファロース〔ファルマシア(Pharmacia) 製 ]
を100 μl 添加し、4℃で1晩緩やかに攪拌した。その
後、遠心分離(160 × g、10分間)によりIgGセファ
ロースを回収し、RPMI1640・ITPSGF培地
1mlで3回洗浄後、このIgGセファロース 5μl を直
接用いて、α2→3シアリルトランスフェラーゼ活性を
測定した。活性測定は30μl のアッセイ溶液〔 0.1M カ
コジル酸−塩酸 (pH6.5), 0.01M 塩化マンガン, 0.45%
トライトンX-100, 0.1mM基質, 上記IgGセファロース
(5μl), 5mM CMP−シアル酸(添加あるいは無添加) 〕
中で37℃で2 時間反応後、高速液体クロマトグラフィー
(HPLC)により生産物の同定を行なうことにより行
なった。基質としては各種糖鎖[Lacto-N-neotetraose
(LNnT)、Lacto-N-tetraose (LNT)、Lacto-N-fucopentao
se III (LNFP-III) および Lacto-N-fucopentaose V (L
NFP-V);いずれもオックスフォード・グライコシステム
ズ社製でそれぞれの構造は第2表に示すとおりである〕
をアミノピリジンで蛍光標識したものを使用した。基質
の蛍光標識は、常法〔Akihiro Kondo ら:アグリカルチ
ュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー (Agri
c. Biol. Chem.) 、54, 2169 (1990) 〕に従って行なっ
た。それぞれのIgGセファロースについて、CMP-シア
ル酸(糖供与体)の含まれたアッセイ溶液と含まれない
アッセイ溶液を用いて反応後、HPLCで解析し、CMP-
シアル酸が含まれたアッセイ溶液でのみ出現するピーク
を生成物とした。反応の終了したアッセイ溶液は、100
℃で5 分処理後、遠心分離(10000 × g、10分間)し、
その上清のうち10μl をHPLCに供した。HPLC
は、TSKgel ODS- 80TM カラム(4.6mm ×
30cm;東ソー社製)を使用し、溶出液として0.02M 酢酸
アンモニウム緩衝液 (pH4.0)を用い、溶出温度50℃、流
速 1ml/分で溶出を行なった。生成物の検出は、島津製
作所製のFluorescence HPLC Monitor (RF-535T) を用い
て行なった(励起波長320nm 、放射波長400nm )。生成
物の同定は、スタンダードと溶出時間が一致すること、
および生成物のシアリダーゼ処理により基質が再生成す
ることより行なった。生成物の定量は、同様にしてアミ
ノピリジル化したラクトースをスタンダードとして用
い、蛍光強度を比較することにより行なった。アッセイ
の結果を第2表に示す。LNnTに対する活性を100 とした
ときの各種糖鎖基質に対する相対活性を合わせて示し
た。
たナマルバ細胞の培養上清由来のIgGセファロースを
使用した場合には、いずれの糖鎖を基質とした場合もα
2→3シアリルトランスフェラーゼ活性が検出された。
一方、ベクターであるpAMoPRSAを導入したナマ
ルバ細胞の培養上清由来のIgGセファロースを使用し
た場合には、いずれの糖鎖を基質とした場合も活性は検
出されなかった。以上の結果から、α2→3シアリルト
ランスフェラーゼがStaphylococcus aureus のプロテイ
ンAのIgGとの結合領域との融合タンパク質として培
養上清中に分泌生産されること、また、それがIgGセ
ファロースを用いて、容易に回収、精製されることが示
された。また、これまでに精製が報告されている公知の
α2→3シアリルトランスフェラーゼのLTN に対する活
性を100 としたときの各種糖鎖基質に対する相対活性
〔ワインスタイン(Wienstein) ら:ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.) 257,
13845 (1982)〕を第2表に合わせて示した。公知のα2
→3シアリルトランスフェラーゼは、LNnTよりもLNTに
対して特異性が高いのに対し、本発明のWM17のコー
ドするα2→3シアリルトランスフェラーゼはLNT より
もLNnTに対して特異性が高いことから、このα2→3シ
アリルトランスフェラーゼは、公知の酵素とは基質特異
性の異なる新規な酵素であることが明らかとなった。ま
た、本発明のWM17のコードするα2→3シアリルト
ランスフェラーゼは、LNFP-IIIも基質とし得るが、これ
までにこのようにLNFP-IIIに対して酵素活性を有するα
2→3シアリルトランスフェラーゼの報告はない。この
ことは、この酵素を用いることによりin vitroでLeX 糖
鎖から直接Sialyl-Le X 糖鎖を合成することができるこ
とを示している。また、本発明のWM17のコードする
α2→3シアリルトランスフェラーゼは、基質としてLN
nTだけでなくLNT も利用可能なことから、Sialyl-Le X
糖鎖のみならずSialyl-Le a 糖鎖も合成することができ
る。すなわち本発明のWM17のコードするα2→3シ
アリルトランスフェラーゼを用いて糖鎖の末端構造をNe
uAc α2-3Galβ1-4GlcNAc あるいはNeuAc α2-3Galβ1-
3GlcNAc に変換した後、α1→3フコシルトランスフェ
ラーゼ(fucosyltransferase)あるいはα1→4フコシ
ルトランスフェラーゼ(fucosyltransferase)を用い
て、それぞれSialyl-Le X 糖鎖またはSialyl-Le a 糖鎖
を合成することができる。また、本発明のWM17のコ
ードするα2→3シアリルトランスフェラーゼは、公知
のα2→3シアリルトランスフェラーゼよりもLNnTに対
する基質特異性が強いので、Sialyl-Le X 糖鎖の合成に
おいて、公知のα2→3シアリルトランスフェラーゼよ
りも優れている。
鎖とその修飾物の製造および有用生理活性タンパク質に
結合している糖鎖の改良に有用な新規α2→3シアリル
トランスフェラーゼが提供される。
示す図である。
程を示す図である。
示す図である。
を示す図である。
図である。
す図である。
示す図である。
す図である。
す図である。
を示す図である。
示す図である。
工程を示す図である。
を示す図である。
工程を示す図である。
図である。
工程を示す図である。
ラーゼ活性測定の結果を示す図である。a、bはpAM
oERLを導入したKJM−1株の、c、dはベクター
であるpAMoERC3Scを導入したKJM−1株の
HPLCのパターンをそれぞれ示す。a、cは糖供与体
であるCMP-シアル酸を含むアッセイ溶液を用いた時の、
b、dはCMP-シアル酸を含まないアッセイ溶液を用いた
時のHPLCのパターンをそれぞれ示す。
ーゼ処理後、HPLCにより解析した結果を示す図であ
る。a、cはそれぞれシアリダーゼで未処理のピーク1
およびピーク2のHPLCのパターンを示す。b、dは
それぞれシアリダーゼ処理後のピーク1およびピーク2
のHPLCのパターンを示す。
ーFCS−1(日本分光社製)で解析を行った結果を示
す図である。aはpAMoERC3Scを導入したKJ
M−1株について、KM−93あるいは正常マウス血清
を用いて間接蛍光抗体染色を行った結果を示す。点線が
正常マウス血清を用いた場合のパターン、実線がKM9
3を用いた場合のパターンをそれぞれ示す。bはpAM
oERLを導入したKJM−1株について、KM−93
あるいは正常マウス血清を用いて間接蛍光抗体染色を行
った結果を示す。点線が正常マウス血清を用いた場合の
パターン、実線がKM93を用いた場合のパターンをそ
れぞれ示す。
である。
である。
である。
である。
図である。
である。
示す図である。
す図である。
ート フローサイトメーター〔EPICS Elite Flow Cytom
eter;コールター(COULTER )社製〕で解析を行なった
結果を示す図である。pAMoPRC3Sc(コントロールプラス
ミド)を導入したKJM−1株について、正常マウス血
清を用いて間接蛍光抗体染色を行なった結果を対照とし
て示した。また、pAMoPRC3Sc(コントロールプラスミ
ド)あるいはpAMoPRWM17(α2→3シアリルトランスフ
ェラーゼ発現プラスミド)を導入したKJM−1株につ
いてKM93を用いて間接蛍光抗体染色を行なった結果
をそれぞれpAMoPRC3Sc、pAMoPRWM17として示した。
を示す図である。
イシン耐性遺伝子 hyg ハイグロマイシン耐性遺伝子 Ap pBR322由来アンピシリン耐性遺伝子 Tc pBR322由来テトラサイクリン耐性遺伝子 P1 pBR322由来P1プロモーター Ptk Herpes simplex virus (HSV)チミジンキナ
ーゼ(tk)遺伝子プロモーター Sp. βG ラビットβグロビン遺伝子スプライシング
シグナル A.βG ラビットβグロビン遺伝子ポリA付加シグ
ナル A. SE simian virus 40 (SV40)初期遺伝子ポリA
付加シグナル Atk Herpes simplex virus (HSV)チミジンキナ
ーゼ(tk)遺伝子のポリA付加シグナル Pse simian virus 40 (SV40)初期遺伝子プロモ
ーター Pmo モロニー・マウス白血病ウイルスのロング
・ターミナル・リピート(long terminal repeat : LT
R)プロモーター HTLV-1 ヒトT細胞白血病ウイルス(human T-cell
leukemia virus type-1:HTLV-1) 遺伝子 EBNA-1 エプスタイン・バール・ウイルス(Epstei
n-Barr virus)EBNA-1遺伝子 oriP エプスタイン・バール・ウイルス(Epstei
n-Barr virus) の複製開始点 ori pUC119の複製開始点 lac'Z 大腸菌のβガラクトシダーゼ遺伝子の一部 IG M13 ファージDNA のintergenic region
Claims (24)
- 【請求項1】 以下の(a)、(b)および(c)から
なる群より選ばれるポリペプチド。 (a)配列番号2または7記載のアミノ酸配列からなる
ポリペプチド (b)配列番号2記載のアミノ酸配列の35〜333番
目のアミノ酸配列または配列番号7記載のアミノ酸配列
の31〜329番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド (c)(a)または(b)のポリペプチドの有するアミ
ノ酸配列において1個以上のアミノ酸が欠失、置換若し
くは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα2→3シ
アリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド - 【請求項2】 以下の(a)、(b)、(c)、(d)
および(e)からなる群より選ばれるDNA。 (a)請求項1に記載のポリペプチドをコードするDN
A (b)配列番号1または6で表される塩基配列を有する
DNA (c)配列番号1で表される塩基配列の129〜112
7番目の塩基配列または配列番号6で表される塩基配列
の163〜1149番目の塩基配列を有するDNA (d)配列番号1で表される塩基配列の231〜112
7番目の塩基配列または配列番号6で表される塩基配列
の253〜1149番目の塩基配列を有するDNA (e)(a)〜(d)いずれかに記載のDNAとストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα2→3
シアリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド
をコードするDNA - 【請求項3】 請求項2記載のDNAが組み込まれた組
換え体ベクター。 - 【請求項4】 動物細胞から抽出したmRNAを鋳型と
して合成したcDNAを発現クローニングベクターに組
み込むことによりcDNAライブラリーを構築し、該c
DNAライブラリーを細胞に導入し、得られる細胞を、
その細胞の増殖を抑制する活性を有するレクチンの存在
下で培養し、増殖する細胞を単離し、該細胞より請求項
1記載のポリペプチドをコードするcDNAを採取する
ことを特徴とする請求項2記載のDNAの製造法。 - 【請求項5】 動物細胞から抽出したmRNAを鋳型と
して合成したcDNAを発現クローニングベクターに組
み込むことによりcDNAライブラリーを構築し、該c
DNAライブラリーを細胞に導入し、得られる細胞を、
その細胞の増殖を抑制する活性を有するレクチンの存在
下で培養し、増殖する細胞を単離し、該細胞より請求項
1記載のポリペプチドをコードするcDNAをベクター
中のプロモーターの下流に導入することを特徴とする請
求項3記載の組換え体ベクターの製造法。 - 【請求項6】 請求項3記載の組換え体ベクターを保有
する細胞を培地に培養し、培養物中に請求項1記載のポ
リペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチ
ドを採取することを特徴とする請求項1記載のポリペプ
チドの製造法。 - 【請求項7】 動物細胞がTYH細胞またはヒトメラノ
ーマWM266−4細胞である請求項4記載のDNAの
製造法。 - 【請求項8】 動物細胞がTYH細胞またはヒトメラノ
ーマWM266−4細胞である請求項5記載の組換え体
ベクターの製造法。 - 【請求項9】 レクチンがヒママメレクチン120であ
る請求項4記載のDNAの製造法。 - 【請求項10】 レクチンがヒママメレクチン120で
ある請求項5記載の組換え体ベクターの製造法。 - 【請求項11】 組換え体ベクターがプラスミドpUC
119−LECである請求項3記載の組換え体ベクタ
ー。 - 【請求項12】 組換え体ベクターがプラスミドpUC
119−WM17である請求項3記載の組換え体ベクタ
ー。 - 【請求項13】 請求項3、11または12に記載の組
換え体ベクターを含有する細胞。 - 【請求項14】 請求項13記載の細胞を用いて糖タン
パク質、糖脂質またはオリゴ糖が有するラクトサミン構
造の非還元末端にα2→3結合でシアル酸を付与する方
法。 - 【請求項15】 請求項13記載の細胞を用いて糖タン
パク質、糖脂質またはオリゴ糖の非還元末端をSialyl-L
eX構造に変換する方法。 - 【請求項16】 請求項1記載のポリペプチドを用いて
糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ糖が有するラクトサ
ミン構造の非還元末端にα2→3結合でシアル酸を付与
する方法。 - 【請求項17】 請求項1記載のポリペプチドを用いて
糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ糖の非還元末端をSi
alyl-LeX構造に変換する方法。 - 【請求項18】 請求項2記載のDNAの有する塩基配
列の連続した10〜50塩基と同じ塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドと相補
的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項19】 請求項2記載のDNAまたは請求項1
8記載のオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼー
ション法により、請求項1記載のポリペプチドの発現を
検出する方法。 - 【請求項20】 請求項18記載のオリゴヌクレオチド
を用いるポリメラーゼ・チェイン・リアクション法によ
り請求項1記載のポリペプチドの発現を検出する方法。 - 【請求項21】 請求項18記載のオリゴヌクレオチド
の塩基配列において、翻訳開始領域内の10〜50塩基
の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて請求項1
記載のポリペプチドの生産を抑制する方法。 - 【請求項22】 請求項3、11または12記載の組換
え体ベクターを含有する大腸菌。 - 【請求項23】 大腸菌がEscherichia coli HB101/pUC
119-LEC(FERM BP-3625)である請求項22記載の大腸
菌。 - 【請求項24】 大腸菌がEscherichia coli HB101/pUC
119-WM17(FERM BP-4013)である請求項22記載の大腸
菌。
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