JP3170369B2 - β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、β1,3-ガラクトシルト
ランスフェラーゼ、該β1,3-ガラクトシルトランスフェ
ラーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれた組
換え体ベクターおよび該組換え体ベクターを含有する細
胞ならびにそれらの製造法に関する。さらに、該β1,3-
ガラクトシルトランスフェラーゼを用いる糖鎖の製造法
および該β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼを形質
転換細胞内に生産させることによる糖鎖の製造法に関す
る。また、本発明のβ1,3-ガラクトシルトランスフェラ
ーゼをコードするＤＮＡを用いる該β1,3-ガラクトシル
トランスフェラーゼの検出方法および生産の抑制方法に
関する。本発明のβ1,3-ガラクトシルトランスフェラー
ゼは、有用生理活性を有する糖鎖とその修飾物の製造お
よび有用生理活性タンパク質に結合している糖鎖の改良
に有用である。

【０００２】

【従来の技術】大腸菌などの原核生物によって生産され
るタンパク質が糖鎖を有していないのに対し、酵母、カ
ビ、植物細胞、動物細胞等の真核生物によって生産され
るタンパク質および脂質には糖鎖が結合している場合が
多い。動物細胞の糖鎖としては、タンパク質に付加する
ものとして、タンパク質中のアスパラギン（Ａｓｎ）残
基に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖（Ｎ−グリカン
とも呼ばれる）、およびセリン（Ｓｅｒ）またはスレオ
ニン（Ｔｈｒ）残基に結合するＯ−グリコシド結合型糖
鎖（Ｏ−グリカンとも呼ばれる）が知られている。最
近、数多くのタンパク質には糖鎖を含むある種の脂質が
共有結合しており、この脂質を介してそれらのタンパク
質は細胞膜に付着していることが明らかとなった。糖鎖
を含むこの脂質はグリコシル・ホスファチジルイノシト
ール・アンカー（glycosyl phosphatidylinositol anch
or）と呼ばれる。他に、動物細胞の糖鎖としては、グリ
コサミノグリカン(Glycosaminoglycan) があげられる。
タンパク質とグリコサミノグリカンが共有結合している
化合物はプロテオグリカン(proteoglycan)と呼ばれる。
プロテオグリカンの糖鎖を構成するグリコサミノグリカ
ンは、糖タンパク質糖鎖であるＯ−グリカンと構造が類
似しているが化学的には異なっている。グリコサミノグ
リカンは、グルコサミン(glucosamine) またはガラクト
サミン(galactosamine) とウロン酸〔但し、ケラタン硫
酸(keratan sulfate) はウロン酸を有していない〕を含
む２糖単位の繰り返し構造から成り、硫酸基が共有結合
している〔但し、ヒアルロン酸(hyaluronic acid) は硫
酸基を有していない〕という特徴を有している。さら
に、動物細胞の糖鎖として、糖脂質(glycolipid)と呼ば
れる物質に含まれる糖鎖が挙げられる。動物細胞の糖脂
質としては、糖と長鎖脂肪酸と長鎖塩基であるスフィン
ゴシン(sphingosine) が共有結合したスフィンゴ糖脂質
(sphingoglycolipid) と、糖鎖がグリセロールに共有結
合したグリセロ糖脂質(glyceroglycolipid) とが知られ
ている。

【０００３】最近、糖鎖の機能については分子生物学や
細胞生物学の進歩とともに急速に解明が進んでおり、現
在までに糖鎖の多様な機能が明らかにされてきている
〔西および伊藤(Nishi and Itoh)：トレンズ・イン・グ
ライコサイエンス・アンド・グライコテクノロジー(Tre
nds in Glycoscience and Glycotechnology) ,4 , 336-
344 (1992) 〕。まず、血中における糖タンパク質のク
リアランスに糖鎖は重要な役割を果たしている。大腸菌
に遺伝子を移入して作られたエリスロポイエチン(eryth
ropoietin)は、生体外(in vitro)では活性を示すが、生
体内(in vivo) では急速にクリアランス(clearance) さ
れることが知られている〔ドーダル(Dordal)ら：エンド
クリノロジー(Endocrinology), 116, 2293 (1985) およ
びブローネ(Browne)ら：コールド・スプリング・ハーバ
ー・シンポジア・オン・クアンティテェイティブ・バイ
オロジー(Cold Spr.Harb.Symp.Quant.Biol.), 51, 693
(1986)〕。またヒト顆粒球・マクロファージコロニー刺
激因子（human granulocyte-macrophage colony stimul
ating factor；ｈＧＭ−ＣＳＦ）は、天然ではＮ−グリ
コシド結合型糖鎖を２本持っているが、糖鎖の本数を減
らすとそれに比例してラット血漿中でのクリアランス速
度が速まることが知られている〔ドナヒュー(Donahue)
ら：コールド・スプリング・ハーバー・シンポジア・オ
ン・クアンティテェイティブ・バイオロジー(Cold Spr.
Harb.Symp.Quant.Biol.), 51, 685 (1986)〕。クリアラ
ンスの速度およびクリアランスされる部位は糖鎖の構造
によっても変化し、シアル酸がついたｈＧＭ−ＣＳＦは
腎臓でクリアランスされるのに対し、シアル酸を除去し
たｈＧＭ−ＣＳＦはクリアランス速度が速まり、肝臓で
クリアランスされることが知られている。また、ラット
肝初代培養の系で各種のＮ−グリコシド型糖鎖生合成阻
害剤存在下に生合成された糖鎖構造の異なるα1-acid g
lycoprotein について、ラットの血漿中でのクリアラン
ス速度及びラット灌流液でのクリアランス速度を調べた
ところ、どちらの場合も、高マンノース型、糖鎖欠損
型、ハイブリッド型、複合型（天然型）の順でクリアラ
ンス速度が遅くなった。また、血栓溶解剤としてすでに
医薬品として用いられている組織型プラスミノーゲン活
性化因子（ｔ−ＰＡ；tissue-type plasminogen activa
tor ）の血中でのクリアランスもその糖鎖の構造が大き
く影響を与えることが知られている。

【０００４】糖鎖がタンパク質にプロテアーゼ抵抗性を
付与することが知られており、例えば、フィブロネクチ
ン（fibronectin)の糖鎖形成をツニカマイシンで阻害す
ると、得られた糖鎖欠損フィブロネクチンの細胞内タン
パク質の分解の速度が増進する。糖鎖の付加により、熱
安定性や抗凍結性が増大することも知られている。ま
た、エリスロポイエチンやβ−インターフェロンなどに
おいては、タンパク質の溶解性の増大に糖鎖が寄与して
いることが知られている。

【０００５】糖鎖は、タンパク質が正しい立体構造を保
持するのにも役立っている。水泡性口内炎ウイルスの膜
結合糖タンパク質の天然に存在する２本のＮ−グリコシ
ド結合型糖鎖を除去すると、タンパク質の細胞表面への
輸送が阻害されるが、そのタンパク質に新たな糖鎖が付
加されるとそれが回復することが知られている。この場
合、糖鎖の除去により、ジスルフィド結合によるタンパ
ク質分子間の会合が誘起され、その結果タンパク質の輸
送が阻害されることが明らかとなった。また新たに糖鎖
を付加すると、この会合が阻害されることによりタンパ
ク質の正しい立体構造が保持されるため、タンパク質の
輸送が可能になる。また、その際新たな糖鎖が付加され
る位置については、かなりの融通性があることが示され
ている。またその反面、導入される位置によっては天然
の糖鎖を有するタンパク質の輸送をも完全に阻害する場
合があることも明らかとなった。

【０００６】糖鎖がポリペプチド上の抗原部位をマスク
している例も知られている。ｈＧＭ−ＣＳＦ、プロラク
チン(prolactin) 、インターフェロン−γ、ラウシャー
（Rauscher）白血病ウィルスgp70およびインフルエンザ
ヘマグルチニン(influenza hemagglutinin) において、
ポリクローナル抗体またはペプチド上の特定の領域に対
する単クローン抗体を用いた実験から、これらタンパク
の糖鎖が、抗体との反応を阻害していると考えられてい
る。また、糖鎖自身が糖タンパク質の活性発現に直接か
かわっている場合があることも知られており、例えば、
黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、絨毛性性腺刺激
ホルモン等のような糖タンパク質ホルモンの活性発現に
糖鎖が関与していると考えられている。

【０００７】糖鎖の重要な機能として、糖鎖が、細胞
間、タンパク質間または細胞とタンパク質間の認識現象
に関与していることが挙げられる。例えば、糖鎖の構造
の違いにより生体内でクリアランスされる場所が異なる
ことが知られている。最近、炎症反応に対し特異的に血
管内皮細胞上に発現し、好中球との接着を促すタンパク
質ELAM-1のリガンドがシアリル・ルイスＸ(Sialyl-Lewi
s-X)と呼ばれる糖鎖〔NeuAc α2-3Galβ1-4(Fuc α1-3)
GlcNAc、NeuAc ：シアル酸；Gal ：ガラクトース；Fuc
：フコース；GlcNAc：Ｎ−アセチルグルコサミン〕で
あることが判明し、糖鎖自体あるいは糖鎖の修飾物が医
薬品などに利用できる可能性が出てきた〔フィリプス
(Phillips) ら：サイエンス(Science),250, 1130 (199
0)、ゲルツ(Goelz) ら：トレンズ・イン・グライコサイ
エンス・アンド・グライコテクノロジー(Trends in Gly
coscience and Glycotechnology), 4 , 14 -24 (1992)
〕。さらに、一部のＴリンパ球や好中球に発現してい
るL-セレクチン（L-selectin）や炎症刺激によって血小
板や血管内皮細胞の膜表面に発現するGMP-140 （P-セレ
クチンとも呼ぶ）はELAM-1と同じく炎症反応に関係して
おり、それらのリガンドもELAM-1のリガンドであるシア
リル・ルイスＸ糖鎖に類似した糖鎖であることが示唆さ
れている〔ロ−ゼン(Rosen) ら：トレンズ・イン・グラ
イコサイエンス・アンド・グライコテクノロジー(Trend
s in Glycoscience and Glycotechnology), 4,1 -13 (1
992) 、ラ−セン(Larsen)ら：トレンズ・イン・グライ
コサイエンス・アンド・グライコテクノロジー(Trends
in Glycoscience and Glycotechnology),4, 25 -31 (19
92) 、アルフォ(Aruffo)ら：トレンズ・イン・グライコ
サイエンス・アンド・グライコテクノロジー(Trends in
Glycoscience and Glycotechnology),4, 146 -151 (19
92) 〕。

【０００８】炎症反応と同様に、癌の転移においても、
ELAM-1やGMP-140 は癌細胞の血管内壁への接着や癌細胞
と血小板との凝集を引き起こすことにより癌転移を促進
していることが示唆されている〔ゲルツ(Goelz) ら：ト
レンズ・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコ
テクノロジー(Trends in Glycoscience and Glycotechn
ology),4, 14 -24 (1992) 、ラ−セン(Larsen)ら：トレ
ンズ・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコテ
クノロジー(Trends in Glycoscience and Glycotechnol
ogy),4, 25 -31 (1992) 、神奈木(Kannagi) および高田
(Takada)：実験医学(Experimental Medicine),10, 96 -
107 (1992) 〕。このことは転移能の高い癌細胞ではシ
アリル・ルイスＸ糖鎖の発現量が高いという知見とも符
合する〔入村(Irimura) ら：実験医学(Experimental Me
dicine),6, 33 - 39 (1988) 〕。シアリル・ルイスａ(S
ialyl-Lewis-a)と呼ばれる糖鎖〔NeuAc α2-3Galβ1-3
(Fuc α1-4)GlcNAc、NeuAc ：シアル酸；Gal ：ガラク
トース；Fuc ：フコース；GlcNAc：Ｎ−アセチルグルコ
サミン〕も癌の悪性度との相関関係が報告されている
〔神奈木(Kannagi) および高田(Takada)：実験医学(Exp
erimental Medicine),10, 96- 107 (1992)〕。セレクチ
ン族遺伝子の中で少なくともELAM-1はシアリル・ルイス
ａ糖鎖と強く結合することが知られている〔バーグ(Ber
g)ら：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー (J. Biol. Chem.),265, 14869 - 14872(1991) 、高
田(Takada)ら：バイオケミカル・アンド・バイオフィジ
カル・リサーチ・コミュニケーションズ (Biochemical
and Biophysical Research Communications),179, 713-
719 (1991)、ラーキン(Larkin)ら：ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー (J. Biol. Chem.),267,
13661 - 13668 (1992) 〕。ELAM-1のシアリル・ルイス
ａ糖鎖に対する親和性はシアリル・ルイスＸ糖鎖に対す
る親和性よりもむしろ高いことが報告されている〔バー
グ(Berg)ら：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー (J. Biol. Chem.),265, 14869 - 14872 (199
1) 〕。

【０００９】これらの知見から、シアリル・ルイスａ糖
鎖、シアリル・ルイスＸ糖鎖、およびそれらの誘導体
は、ELAM-1、L-セレクチンまたはGMP-140 に結合するこ
とにより優れた抗炎症効果を発揮すること、および癌転
移が抑制されることが期待される。上述の炎症反応と癌
転移の機構を考慮すると、ELAM-1、L-セレクチン、GMP-
140 が認識するリガンド糖鎖の合成をつかさどる糖転移
酵素の発現を抑制することによっても炎症反応を抑制し
たり、癌転移を防止できることが期待される。ある特定
の遺伝子の発現を抑制するには、アンチセンスＲＮＡ／
アンチセンスＤＮＡ技術〔徳久(Tokuhisa)：バイオサイ
エンスとインダストリー,50, 322 - 326 (1992) 、村上
(Murakami)：化学,46, 681 - 684 (1991) 〕またはトリ
プル・ヘリックス (Triple helix) 技術〔チュブ(Chub
b) とホーガン(Hogan) ：トレンズ・イン・バイオテク
ノジー(Trends in Biotechnology),10, 132 -136 (199
2) 〕が有用である。このアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ
技術を用いて所望の糖転移酵素の発現を抑制するには、
その遺伝子あるいは遺伝子の塩基配列情報が必要である
ため、所望の糖転移酵素の遺伝子をクローン化するこ
と、およびその塩基配列情報を解析することは重要であ
る。

【００１０】さらに、炎症性白血球や癌細胞での特定の
糖転移酵素の発現を調べることにより、炎症性疾患や癌
の悪性度を診断することもできる。所望の糖転移酵素遺
伝子の発現を調べるには、該遺伝子を放射能などで標識
したものをプローブとするノーザンハイブリダイゼーシ
ョン法〔サンブルック(Sambrook)、フリッチ(Fritsch)
、マニアチス(Maniatis)（モレキュラー・クローニン
グ：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Clonin
g, A laboratory manual)、第２版、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring H
arbor Laboratory Press) 、１９８９年刊〕やポリメラ
ーゼ・チェイン・リアクション法（以下、ＰＣＲ法と略
記する）〔イニス(Innis) ら：ＰＣＲプロトコールズ
(PCR Protocols)、アカデミック・プレス(Academic Pre
ss)、1990年刊〕が有用である。これらの手法を適用す
るには、所望の糖転移酵素遺伝子あるいは遺伝子の塩基
配列情報が必要である。この点からも、所望の糖転移酵
素の遺伝子をクローン化すること、およびその塩基配列
情報を解析することは重要である。

【００１１】特開平2-227075に顆粒球コロニー刺激因子
（Ｇ−ＣＳＦ；granulocyte colony-stimulating facto
r ）やプロウロキナーゼ（pro-UK; pro-urokinase ）等
の有用生理活性タンパク質に、組換えＤＮＡ技術を用い
て人為的にかつ意図的に糖鎖を導入することにより、こ
れらのタンパク質の性質を改善することができることが
開示されている。

【００１２】以上のように、糖タンパク質の糖鎖の構造
を改変したり、特定の糖鎖あるいはその修飾物を大量に
調製することは産業上重要な課題である。糖鎖の構造を
改変する手段については近年著しく進展している。特に
糖鎖を逐次解離してゆく特異性の高い酵素（エキソグリ
コシダーゼ）やペプチド鎖との結合点をペプチド鎖と糖
鎖の双方を変化させずに解裂させるグリコペプチダーゼ
やエンド型グリコシダーゼによって、糖鎖の構造を改変
させることができ、糖鎖の生物学的な役割についても詳
細な研究ができるようになった。さらに、最近、糖脂質
の糖鎖とセラミドの間を開裂するエンドグリコセラミダ
ーゼ(endoglycoceramidase) が見いだされ〔伊東と山
形：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(J.Biol.Chem.),261, 14278 (1986)〕、これにより、糖
脂質の糖鎖の調製が容易になっただけでなく、糖脂質、
特に細胞表層糖脂質の機能を解明する研究が進展した。
また、糖転移酵素により、新たな糖鎖を付加することも
可能となってきた。例えば、シアリルトランスフェラー
ゼにより、糖鎖の末端にシアル酸を新たに付加すること
ができる〔サベサン (Sabesan)とポールソン (Paulso
n)：ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエ
ティー(J.Am.Chem.Soc.),108, 2068 (1986) 〕。その他
種々の糖転移酵素やグリコシダーゼの阻害剤〔アラン
ら：アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー
(Annu. Rev. Biochem.),56, 497 (1097) ］を用いるこ
とにより、付加する糖鎖を変化させることも可能であ
る。しかしながら、糖鎖の合成に用いる糖転移酵素を大
量に製造することは極めて困難である。そこで、組換え
ＤＮＡ技術を用いて糖転移酵素をクローン化し、糖転移
酵素を宿主細胞内または培養上清中に効率よく発現させ
ることにより、糖転移酵素を大量に製造することが望ま
れる。

【００１３】これまでに用いられた糖転移酵素遺伝子の
クローニング法としては、タンパク質を精製後、それに
対する抗体を作成し、それを用いてイムノスクリーニン
グを行なう方法〔ワインスタイン(Wienstein) ら：ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.
Chem.),262, 17735 (1987)〕、タンパク質を精製後、ア
ミノ酸配列を決定し、それに対応する合成ＤＮＡを作製
し、それをプローブにハイブリダイゼーションを行う方
法〔成松ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス (Proc. Natl. Acad.
Sci.),USA, 83,4720 (1986)〕が知られている。クロー
ン化した糖転移酵素の遺伝子をプローブにしてハイブリ
ダイゼーションを行うことにより、その糖転移酵素にホ
モロジーのある糖転移酵素の遺伝子をクローン化する方
法も知られている〔ロウ(John.B.Lowe)ら：ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Che
m.),266, 17467 (1991)］。糖鎖に対する抗体やレクチ
ンを用いたパンニング(panning) 法をスクリーニング法
として用いる直接発現クローン化法が知られている〔ロ
ウ(John. B. Lowe) ら：プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス (Proc.Nat
l.Acad.Sci.),USA,86,8227(1989)、ロウ(John.B.Lowe)
ら：ジーンズ・アンド・ディベラプメント（Genes Deve
lop.) ,4,1288 （1990) 〕。

【００１４】レクチン耐性を指標にして糖転移酵素をク
ローン化できた例はない。ＣＨＯ細胞の各種レクチン耐
性変異株に関する研究から、それらのレクチン耐性変異
株においては、新たな糖転移酵素が発現する場合、ある
糖転移酵素の活性が消失する場合、糖ヌクレオチドの合
成やゴルジ体への移行に障害がある場合があることが明
らかになっている〔スタンレー(Pamela Stanley)ら：メ
ソッド・イン・エンザイモロジー (Methods in Enzymol
ogy)，96巻,157頁〕。したがって、ＣＨＯ細胞またはＣ
ＨＯ細胞のレクチン耐性変異株に、クローン化しようと
する糖転移酵素を発現している細胞由来の遺伝子を導入
し、レクチン耐性を指標に糖転移酵素のクローン化が可
能であると考えられる〔クマー(Ravindra Kumar)ら：モ
レキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー(Mol.C
ell.Biol.),9,5713(1989) 〕。リプカ(James Ripka) ら
は、ＣＨＯ細胞のレクチン耐性変異株（Lec1）に、Ａ４
３１細胞由来のヒトのジェノミックＤＮＡを導入し、コ
ンカナバリンＡというレクチンに対する耐性化を指標に
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩのク
ローン化を試みている。しかしながら、彼らは、このレ
クチン耐性を指標にしたスクリーニング法では糖転移酵
素をクローン化することはできなかった〔リプカ(James
Ripka) ら：バイオケミカル・アンド・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コミュニケーション(Biochem.Biophys.R
es.Commun.),159,554(1989) 〕。ヘファーナンらは、ポ
リオーマのラージＴ抗原を生産するようにしたＣＨＯ細
胞〔ヘファーナン(Michael Heffernan) ら：ヌクレイッ
ク・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Res.),19,85(1
991)〕に、ｃＤＮＡライブラリーを導入後、ＷＧＡ（wh
eat germ agglutinin ）というレクチンに対する耐性化
を指標にマウスの sialic acid hyroxylase のクローン
化を行なっている〔ヘファーナン(Michael Heffernan)
ら：グライココンジュゲート・ジャーナル(Glycoconjug
ate J.),8,154(1991) 〕が、このレクチン耐性を指標に
したスクリーニング系で糖転移酵素のクローン化ができ
たという報告はない。また、宿主に関しては、スタンレ
ー、リプカ、ヘファーナンらはいずれもＣＨＯ細胞また
はＣＨＯ細胞のレクチン耐性変異株を宿主として用いて
いる。

【００１５】ガラクトシルトランスフェラーゼに関して
は、Ｎ−アセチルグルコサミニドβ1,4-ガラクトシルト
ランスフェラーゼ（N-acetylglucosaminide β1,4-gala
ctosyltransferase; EC 2.4.1.38) の遺伝子〔シェイパ
ー(Shaper)ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス (Proc.Natl.Acad.S
ci.),USA,83, 1573 (1986)、成松(Narimatsu) ら：プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス (Proc.Natl.Acad.Sci.),USA,83, 4720
(1986)、マスリ(Masri) ら：バイオケミカル・アンド・
バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション(Bio
chem.Biophys.Res.Commun.),157, 657 (1988) 、シェイ
パー(Shaper)ら：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー(J.Biol.Chem.),263, 10420 (1988) 〕、
血液型Ｂ抗原の合成に関与するα1,3-ガラクトシルトラ
ンルフェラーゼ（α1,3-galactosyltransferase; EC 2.
4.1.37）の遺伝子〔山本(Yamamoto)ら：ネイチャー(Nat
ure),345, 229 (1990)〕、およびII型ラクト系糖鎖の非
還元末端にα1,3 結合でガラクトースを転移するα1,3-
ガラクトシルトランルフェラーゼ（α1,3-galactosyltr
ansferase; EC 2.4.1.151 ）の遺伝子〔ラーセン(Larse
n)ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス (Proc.Natl.Acad.Sci.),US
A,86, 8227 (1989)〕が単離されており、その塩基配列
も明らかになっている。β1,3-ガラクトシルトランスフ
ェラーゼ活性を有する酵素に関しては、その酵素の性質
や精製およびその遺伝子のクローン化については全く報
告がない。したがってβ1,3-ガラクトシルトランスフェ
ラーゼ活性を有する酵素を大量に調製する手段はなく、
該酵素の発現を検出および抑制する方法も確立されてい
ない。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、タン
パク質の糖鎖の改変および特定の糖鎖の効率的生産を行
うことができる新規β1,3-ガラクトシルトランスフェラ
ーゼおよび該β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼを
コードするｃＤＮＡおよび該ＤＮＡを含有するベクター
を提供することにある。さらに、癌転移や炎症などの疾
病を診断、治療するために有用な該β1,3-ガラクトシル
トランスフェラーゼの活性発現を検出する方法および該
β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を抑制す
る方法を提供することにある。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、動物細胞
から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを
発現クローニングベクターに組み込むことによりｃＤＮ
Ａライブラリーを構築し、該ｃＤＮＡライブラリーを細
胞に導入し、得られる細胞をその細胞の増殖を抑制する
活性を有するレクチンの存在下で培養し、増殖する細胞
を単離することによりクローン化された遺伝子を宿主細
胞に導入して発現させたところ、新規なβ1,3-ガラクト
シルトランスフェラーゼが生産されることを見出し、本
発明を完成させた。

【００１８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明
は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する新規β
1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼおよび該β1,3-ガ
ラクトシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡおよ
び該ＤＮＡを含有する組換え体ベクターに関する。本発
明のβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｎ−ア
セチルガラクトサミニドβ1,3-ガラクトシルトランスフ
ェラーゼ活性を有する糖転移酵素であり、受容体である
糖鎖の非還元末端のＮ−アセチルガラクトサミンにβ１
→３の結合様式でウリジン二リン酸(UDP)-ガラクトース
からガラクトースを転移する活性を有する。

【００１９】本発明のβ1,3-ガラクトシルトランスフェ
ラーゼをコードするｃＤＮＡとしては、(a) 配列番号１
で示される記載の塩基配列を有するＤＮＡ、(b) 一つの
アミノ酸に対して複数種の遺伝暗号が存在するため、あ
るいはヒトを含む動物個々に起こる自然変異などのため
配列番号１で示される塩基配列とは異なる塩基配列を有
するＤＮＡ、(c) (a) および(b) で定義されるＤＮＡに
対して、本発明のβ1,3-ガラクトシルトランスフェラー
ゼ活性を失わない範囲内で置換変異、欠失変異、挿入変
異などの変異が導入されたＤＮＡ、例えば、(a) または
(b) で定義されるＤＮＡがコードするβ1,3-ガラクトシ
ルトランスフェラーゼに対して、ハイブリダイゼーショ
ン法によって単離できる程度に相同性を有するＤＮＡな
どを包含する。本発明のβ1,3-ガラクトシルトランスフ
ェラーゼは上記(a) 、(b) および(c) で定義されるＤＮ
Ａによってコードされる全てのβ1,3-ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼを包含する。

【００２０】以下に、本発明のβ1,3-ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼをコードするｃＤＮＡの製造法を上記
(a) で定義されるｃＤＮＡの製造法を例にして示す。動
物細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤ
ＮＡを発現クローニングベクター(Expression Cloning
Vector) に組み込むことにより、ｃＤＮＡライブラリー
を構築する。このｃＤＮＡライブラリーを動物細胞ある
いは昆虫細胞に導入し、その細胞の増殖を抑制する活性
を有するレクチンの存在下で細胞を培養する。ｃＤＮＡ
が導入された細胞クローンのなかに、糖転移酵素をコー
ドする遺伝子が発現したために、レクチンが認識する糖
鎖構造が変化し、レクチンに対する感受性を失い、レク
チン存在下で増殖する細胞クローンが現れる。この細胞
を単離し、該細胞から所望のβ1,3-ガラクトシルトラン
スフェラーゼをコードするｃＤＮＡを得る。

【００２１】上記の方法で用いられる動物細胞は、本発
明のβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼを生産して
いる動物細胞であればいかなる細胞でも用いることがで
きる。例えば、ヒト・メラノーマ細胞株WM266-4 (ATCC
CRL 1676) 等が用いられる。これらの細胞から抽出した
ｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベク
ターは、該ｃＤＮＡを組み込み発現できるベクターであ
ればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐ
ＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ等が用いられる。該ベクターにより
構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する動物細胞あ
るいは昆虫細胞は、該ｃＤＮＡライブラリーを導入し、
発現できるものであればいかなるものでも用いることが
できる。例えば、ヒト・ナマルバ(Namalwa) 細胞〔細井
ら：サイトテクノロジー(Cytotechnology),1,151(198
8)〕等が用いられる。また、本発明で用いられるレクチ
ンは、宿主細胞の増殖を抑制できるものであればいかな
るものでも用いることができる。例えば、ヒママメレク
チン１２０等が用いられる。レクチンは使用する宿主細
胞の該レクチンに対する耐性度を決定した後に、宿主細
胞の成育を阻止する濃度で使用する。レクチン存在下で
増殖する細胞から公知の方法、例えば、ハート法〔ロバ
ート・エフ・マーゴルスキー (Robert F.Margolskee)
ら：モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー
(Mol.Cell.Biol.),8,2837(1988)〕により、本発明のβ
1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするｃＤ
ＮＡを有するプラスミドあるいは該ｃＤＮＡ部分を含む
ＤＮＡ断片を回収する。本発明の酵素をコードするｃＤ
ＮＡを有するプラスミドとしては、例えば、pUC119-WM1
が挙げられる。pUC119-WM1を含む大腸菌であるEscheric
hiacoli HB101/pUC119-WM1 は、平成４年９月22日付で
工業技術院微生物工業技術研究所にFERM BP-4011として
寄託されている。

【００２２】上記(b) および(c) で定義されるＤＮＡは
上記の製造法で得られるβ1,3-ガラクトシルトランスフ
ェラーゼをコードするｃＤＮＡをもとに、ハイブリダイ
ゼーション法やＤＮＡに変異を導入する方法などの周知
の組換えＤＮＡ技術を用いて製造することができる。ま
た、本発明のβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼを
コードするＤＮＡは化学合成法を用いても製造すること
ができる。

【００２３】上記の方法により得られる本発明のβ1,3-
ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを
適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体
ベクターを造成し、それを宿主細胞に導入し、得られた
細胞を培養することにより、本発明のβ1,3-ガラクトシ
ルトランスフェラーゼを製造することができる。ここ
で、用いられる宿主細胞としては、原核細胞、動物細
胞、酵母、カビ、昆虫細胞など、これまで組換えＤＮＡ
技術で用いられた宿主細胞ならばいかなる細胞でも用い
ることができる。例えば、原核細胞としては大腸菌、動
物細胞としてはチャイニーズ・ハムスターの細胞である
ＣＨＯ細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、ヒトの細胞
であるナマルバ細胞等が挙げられる。宿主としてナマル
バ細胞を用いる直接発現クローン化系は、宿主であるナ
マルバ細胞へのｃＤＮＡライブラリーの導入効率が極め
て高く、しかも導入されたプラスミド（ｃＤＮＡライブ
ラリー）は、染色体外で存在可能であり、取得したレク
チン耐性株からのプラスミドの回収が容易であるという
利点を有しているため好適に用いられる。

【００２４】本発明のβ1,3-ガラクトシルトランスフェ
ラーゼをコードするＤＮＡを導入するベクターとして
は、該β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼをコード
するＤＮＡを組み込むことができ、宿主細胞で発現でき
るものであればいかなるベクターでも用いることができ
る。例えば、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22979,Miyaji
ら：サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(199
0)〕，ｐＡＳ３−３（特開平2-227075），ｐＡＭｏＥＲ
Ｃ３Ｓｃ，ＣＤＭ８〔ブライアン・シード(Brian Seed)
ら：ネイチャー(Nature),329,840(1987)〕等が挙げられ
る。また、大腸菌内で本発明の酵素を生産するために
は、trp プロモーターなどの強力な転写活性を有するプ
ロモーターの下流に外来ＤＮＡを挿入することができ、
しかもシャイン−ダルガノ (Shine-Dalgarno) 配列（以
下、ＳＤ配列と略記する）と開始コドンの間を適当な距
離（例えば、６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用
いることが好ましい。具体的には、ｐＫＹＰ１０（特開
昭58-110600 ）、ｐＬＳＡ１〔宮地ら：アグリカルチュ
ラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agric.B
iol.Chem.),53,277(1989) 〕、ｐＧＥＬ１〔関根ら：プ
ロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス (Proc.Natl.Acad.Sci.),USA, 82,430
6(1985) 〕等が挙げられる。

【００２５】本発明で用いる組換えＤＮＡ技術の一般的
手法については、特開平2-227075あるいはサンブルック
(Sambrook)、フリッチ(Fritsch) 、マニアチス(Maniati
s)らの方法〔モレキュラー・クローニング：ア・ラボラ
トリー・マニュアル(Molecular Cloning, A laboratory
manual)、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory
Press) 、１９８９年刊〕に記載されている方法を用い
ることができる。ｍＲＮＡの単離およびｃＤＮＡライブ
ラリーの合成は、上記の方法の他、市販されている多く
のキットを用いて行なうことができる。動物細胞へのＤ
ＮＡの導入法としては、現在までに知られているいかな
る方法も用いることができる。例えば、エレクトロポー
レーション法〔Miyajiら：サイトテクノロジー(Cytotec
hnology) ,3 ,133(1990)〕、リン酸カルシウム法（特開
平2-227075）、リポフェクション法〔フィリップ・エル
・フェルグナー（Philip L. Felgner)ら：プロシーディ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス (Proc.Natl.Acad.Sci.),USA,84,7413 (1987) 〕
等を用いることができる。形質転換株の取得および培養
は、特開平2-227075あるいは特開平2-257891に記載され
ている方法に準じて行なうことができる。

【００２６】クローン化したβ1,3-ガラクトシルトラン
スフェラーゼの生産方法としては、宿主細胞内に生産さ
せる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主
細胞外膜上に生産させる方法がある。生産部位は、使用
する宿主細胞の種類、生産させる糖転移酵素の形によっ
て変わってくる。糖転移酵素をその形を変えずに動物細
胞を宿主細胞として生産させる場合は、一般的に、宿主
細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産され、一部は、プ
ロテアーゼにより切断されて細胞外に分泌される。宿主
細胞外に積極的に分泌させる場合は、ポールソンらの方
法〔C. Paulsonら：ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J.Biol.Chem.) ，264,17619 (198
9)〕およびロウらの方法〔John. B. Lowe ら：プロシー
ディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス (Proc.Natl.Acad.Sci.),USA,86 ,8227 (198
9)、John. B. Lowe ら：ジーンズ・アンド・ディベラプ
メント（Genes Develop.),4,1288（1990) 〕に準じて遺
伝子組換えの手法を用いて、糖転移酵素の活性部位を含
む部分にシグナルペプチドを付加した形で生産させる。

【００２７】特開平2-227075に記載されている方法に準
じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増
幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。この
ようにして生産させた本発明のβ1,3-ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼは、通常の糖転移酵素の精製方法〔J. E
van. Sadler ら：メソッド・イン・エンザイモロジー
(Methods in Enzymology)，83,458〕に準じて精製でき
る。また、大腸菌内に生産させる場合は、上記の方法と
特開昭63-267292 に記載された方法を組み合わせること
により効率的に精製することができる。また、本発明の
酵素を他のタンパク質との融合タンパク質として生産
し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたア
フィニティークロマトグラフィーを利用して精製するこ
ともできる。例えば、ロウらの方法〔John. B. Lowe
ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス (Proc.Natl.Acad.Sci.),USA,8
6,8227(1989)、John. B. Lowe ら：ジーンズ・アンド・
ディベラプメント（Genes Develop.),4,1288（1990) 〕
に準じて、本発明の酵素をプロテインＡとの融合タンパ
ク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィ
ニティークロマトグラフィーにより精製することができ
る。また、該酵素自身に対する抗体を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーで精製することもできる。

【００２８】β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼの
活性は、公知の測定法〔Naoyuki Tanigutiら：メソッド
・イン・エンザイモロジー (Methods in Enzymology),
179,397 〕に準じて測定する。本発明のβ1,3-ガラクト
シルトランスフェラーゼを用いて、イン・ビトロ(invit
ro)で、糖鎖を合成することができる。例えば、糖タン
パク質、糖脂質またはオリゴ糖に含まれるＮ−アセチル
ガラクトサミンにβ１→３結合でガラクトースを付与す
ることができる。また、本発明のβ1,3-ガラクトシルト
ランスフェラーゼをα2,3-シアリルトランスフェラーゼ
とα1,3/1,4-フコシルトランスフェラーゼ〔ロウ (Low
e) ら：ジーンズ・アンド・ディベラプメント（Genes D
evelop.),4,1288（1990) 〕の存在下、基質となる糖タ
ンパク質、糖脂質またはオリゴ糖に作用させることによ
り、糖鎖上にルイスａまたはシアリル・ルイスａ構造を
導入することができる。

【００２９】本発明のβ1,3-ガラクトシルトランスフェ
ラーゼをコードするＤＮＡを用いて、該β1,3-ガラクト
シルトランスフェラーゼの受容基質である糖鎖を生産し
ている動物細胞あるいは昆虫細胞の中で、該β1,3-ガラ
クトシルトランスフェラーゼと有用生理活性を有する糖
タンパク質、糖脂質またはオリゴ糖とを同時に生産させ
ることにより、生産されたβ1,3-ガラクトシルトランス
フェラーゼを細胞の中で糖タンパク質、糖脂質またはオ
リゴ糖に作用させ、糖鎖構造が変化した糖タンパク質、
糖脂質またはオリゴ糖を細胞の中で得ることができる。

【００３０】さらに、上記の方法により得られる糖鎖構
造が変化した糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ糖から
公知の酵素的手法または化学的手法によりオリゴ糖の一
部を切り出すこともできる。本発明のβ1,3-ガラクトシ
ルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、タンパク
質や糖脂質の糖鎖の改変および特定の糖鎖の効率的生産
に用いることができるだけでなく、アンチセンスＲＮＡ
／ＤＮＡ技術を用いて炎症や癌転移などの疾病の治療に
利用すること、ならびにノーザンハイブリダイゼーショ
ン法またはＰＣＲ法を用いてそれらの疾病の診断に利用
することもできる。

【００３１】例えば、本発明のβ1,3-ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼをコードするＤＮＡを用いて、アンチセ
ンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術〔徳久(Tokuhisa)：バイオサイ
エンスとインダストリー ,50, 322 - 326 (1992)、村上
(Murakami)：化学,46, 681 -684 (1991) 、ミラー(Mill
er)：バイオテクノロジー(Biotechnology),9, 358 -362
(1992) 、コーエン(Cohen) ：トレンズ・イン・バイオ
テクノジー(Trendsin Biotechnology),10, 87 -91 (199
2) 、アグラワル(Agrawal) ：トレンズ・イン・バイオ
テクノジー(Trends in Biotechnology),10, 152 -158
(1992) 〕あるいはトリプル・ヘリックス技術〔チュブ
(Chubb) とホーガン(Hogan) ：トレンズ・イン・バイオ
テクノジー(Trends in Biotechnology),10, 132 -136
(1992) 〕により、該β1,3-ガラクトシルトランスフェ
ラーゼの活性発現を抑制することができる。具体的に
は、本発明のβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼを
コードするＤＮＡの一部の塩基配列、好ましくは翻訳開
始領域内の10〜50塩基の塩基配列を基にしてオリゴヌク
レオチドを設計・調製し、生体内に投与するにより、該
β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼの生産を抑制す
ることができる。合成オリゴヌクレオチドの塩基配列と
しては、本発明のβ1,3-ガラクトシルトランスフェラー
ゼをコードするｃＤＮＡのアンチセンス鎖の塩基配列の
一部と一致するもの、あるいは該β1,3-ガラクトシルト
ランスフェラーゼの活性発現を抑制する活性を失わない
範囲内で改変したものを利用できる。トリプル・ヘリッ
クス技術を用いる場合、センス鎖およびアンチセンス鎖
の双方の塩基配列の塩基配列情報をもとに合成オリゴヌ
クレオチドの塩基配列を設計する。

【００３２】また、ハイブリダイゼーション法またはＰ
ＣＲ法により本発明のβ1,3-ガラクトシルトランスフェ
ラーゼの発現を検出することができる。ノーザンハイブ
リダイゼーション法またはＰＣＲ法を用いて、本発明の
β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を検出す
るために、本発明のβ1,3-ガラクトシルトランスフェラ
ーゼをコードするＤＮＡまたはそれらの塩基配列に基づ
いてＤＮＡプローブまたは合成オリゴヌクレオチドを調
製する。ノーザンハイブリダイゼーション法およびＰＣ
Ｒ法は、それぞれ公知の方法〔モレキュラー・クローニ
ング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloni
ng, A laboratory manual)、第２版、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring H
arbor Laboratory Press) ，１９８９年刊行；ＰＣＲプ
ロトコールズ (PCR Protocols)、アカデミック・プレス
(Academic Press)、1990年刊行〕に従って行う。

【００３３】以下、本発明の実施例を示す。

【００３４】

【実施例】

実施例１ １．直接発現クローニングベクター（Expression Cloni
ng Vector ）ｐＡＭｏＥＲＣ３ＳｃおよびｐＡＭｏＰＲ
Ｃ３Ｓｃの造成：ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃを以下に示す
(1) 〜(14)の工程に従って造成した。 （１）ｐＡＧＥＬ１０６の造成 （図１参照） シミアン・ウィルス (simian virus) 40 (SV40) 初期遺
伝子プロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルス(human T
-cell leukemia virus type-1 : HTLV-1) のロング・タ
ーミナル・リピート(long terminal repeat : LTR)のR
領域とU5領域の一部を融合したプロモーターを有するプ
ラスミドpAGEL106の造成を以下のようにして行なった。
R 領域とU5領域の一部を含むDNA 断片［BanII-Sau3A 断
片(0.27kb)］はpATK03から切り出し、合成リンカーを介
してpAGE106 のBglI-BamHI間に挿入した。

【００３５】ｐＡＧＥ１０６（特開平2-227075）の1 μ
g を10mMトリス−塩酸(pH7.5), 6mM塩化マグネシウム,
100mM 塩化ナトリウム, 6mM 2- メルカプトエタノール
からなる緩衝液（以下、Ｙ−１００緩衝液と略記する）
30μl に溶解し、10単位のBglI（宝酒造社製、以下、と
くに断らないかぎり制限酵素は宝酒造社製のものを使用
した）と10単位のBamHI を加え、37℃で２時間消化反応
を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約
4.9kb のDNA 断片を回収した。

【００３６】また、ｐＡＴＫ０３〔清水ら：プロシーデ
ィング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. ),USA, 69,2110(19
72)〕1 μg をＹ−１００緩衝液 30 μl に溶解し、10
単位のBanII を加え、37℃で２時間消化反応を行ない、
アガロースゲル電気泳動後、約0.4kb のDNA 断片を回収
した。回収したDNA 断片は30μl のＹ−１００緩衝液に
溶解し、10単位のSau3AIを加え37℃で２時間消化反応を
行ない、アガロースゲル電気泳動後、約0.27kbのDNA 断
片を回収した。

【００３７】また別に、BglI切断部位と BanII切断部位
を連結するためのリンカーとして以下のＤＮＡリンカー
を合成した。

【００３８】

【化１】

【００３９】このＤＮＡリンカーの5merと6merの１本鎖
ＤＮＡはそれぞれアプライド・バイオシステムズ (Appl
ied Biosystems) 社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合
成した。合成したＤＮＡはそれぞれ0.2 μg ずつ、50mM
トリス−塩酸(pH7.5), 10mM塩化マグネシウム，5mM ジ
チオスレイトール（以下DTT と略記する）, 0.1nMEDTA,
および1mM アデノシン３リン酸（以下、ATP と略記す
る) を含む緩衝液（以下、Ｔ４キナーゼ緩衝液と略記す
る）40μl に溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
（宝酒造社製、以下同じ）30単位を加えて、37℃で２時
間リン酸化反応を行なった。

【００４０】上記で得られたｐＡＧＥ１０６由来のBglI
-BamHI 断片(4.9kb) 0.2 μg とｐＡＴＫ０３由来のBa
nII-Sau3A 断片(0.27kb) 0.01 μg を 66mM トリス−塩
酸(pH7.5), 6.6mM 塩化マグネシウム，10mM DTTおよび
0.1mM ATP からなる緩衝液（以下、T4リガーゼ緩衝液と
略記する）30μl に溶解し、上記ＤＮＡリンカーを0.01
μg とT4DNA リガーゼ（宝酒造社製、以下同じ）175 単
位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。

【００４１】該反応液を用いて大腸菌HB101株〔ボリバ
ー(Bolivar) ら：ジーン(Gene), 2,75 (1988)〕をコー
エンらの方法〔エス・エヌ・コーエン(S.N.Cohen) ら：
プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス (Proc.Natl. Acad. Sci. )USA., 6
9, 2110 (1972)〕（以下、大腸菌の形質転換にはこの方
法を用いた）によって形質転換し、カナマイシン耐性株
を得た。この形質転換株から公知の方法〔エイチ・シー
・バーンボイム (H.C.Birnboim)ら：ヌクレイック・ア
シッド・リサーチ (Nucleic Acids Res.),7, 1513 (197
9)〕（以下、プラスミドの単離はこの方法を用いた）に
従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＧ
ＥＬ１０６と名付け、その構造を制限酵素消化により確
認した。

【００４２】（２）ｐＡＳＬＢ３−３−１の造成 （図
２参照） SV40初期遺伝子プロモーターとHTLV-1のロング・ターミ
ナル・リピート(LTR)のR 領域とU5領域の一部を融合し
たプロモーターを有する、ヒト顆粒球コロニー刺激因子
(hG-CSF)の発現プラスミドpASLB3-3-1の造成を以下のよ
うにして行なった。

【００４３】（１）で得られたｐＡＧＥＬ１０６の 0.5
μg を10mMトリス−塩酸(pH7.5),6mM 塩化マグネシウ
ム，20mM 塩化カリウム, 6mM 2- メルカプトエタノー
ルからなる緩衝液（以下、Ｋ−２０緩衝液と略記する）
30μl に溶解し、10単位のSmaIを加え、37℃で２時間消
化反応を行なった。エタノール沈殿後、30μl のＴ４リ
ガーゼ緩衝液に溶解し、ＳａｌＩリンカー（5'-pGGTCGA
CC-3' ：宝酒造社製）を0.01μg とT4DNA リガーゼ175
単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。エタ
ノール沈殿後、10mMトリス−塩酸(pH7.5), 6mM 塩化マ
グネシウム，175mM 塩化ナトリウム, 6mM 2- メルカプ
トエタノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−１７５緩衝液
と略記する）30μl に溶解し、10単位のSalIと10単位の
MluIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応
液をアガロースゲル電気泳動後、約1.7kb のDNA 断片を
回収した。

【００４４】一方、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）の
１μgをＹ−１７５緩衝液30μlに溶解し、10単位のSalI
と10単位のMluIを加え、37℃で２時間消化反応を行なっ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約6.7kbのD
NA断片を回収した。上記で得られたｐＡＧＥＬ１０６由
来のMluI-SalI断片(1.7kb) 0.1μgとｐＡＳ３−３由来
のMluI-SalI断片(6.7kb) 0.2μgをＴ４リガーゼ緩衝液
30μlに溶解し、T4DNAリガーゼ175単位を加えて、12℃
で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌
HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、カナ
マイシン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法
に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡ
ＳＬＢ３−３−１と名付け、その構造を制限酵素消化に
より確認した。

【００４５】（３）ｐＡＳＬＢ３−３の造成 （図３参
照） pASLB3-3-1にアンピシリン耐性遺伝子を導入したプラス
ミドpASLB3-3の造成を行なうため、以下のようにしてpA
S3-3のアンピシリン耐性遺伝子を含むDNA 断片〔XhoI-M
luI 断片(7.26kb)〕をpASLB3-3-1のXhoI-MluI 間に導入
した。

【００４６】（２）で得られたｐＡＳＬＢ３−３−１の
1 μg を10mMトリス−塩酸(pH7.5),6mM 塩化マグネシウ
ム，150mM 塩化ナトリウム， 6mM 2- メルカプトエタノ
ールからなる緩衝液（以下、Ｙ−１５０緩衝液と略記す
る）30μl に溶解し、10単位のXhoIと10単位のMluIを加
え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガ
ロースゲル電気泳動後、約7.26kbのDNA 断片を回収し
た。

【００４７】一方、ｐＡＳ３−３の1 μg をＹ−１５０
緩衝液 30 μl に溶解し、10単位のXhoIと10単位のMluI
を加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、約2.58kbのDNA 断片を回収
した。上記で得られたｐＡＳＬＢ３−３−１由来のXhoI
-MluI 断片(7.26kb) 0.2μgとｐＡＳ３−３由来のXhoI-
MluI 断片(2.58kb) 0.1μg とをＴ４リガーゼ緩衝液30
μl に溶解し、 T4DNAリガーゼ175 単位を加えて、12℃
で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌
HB101 株をコーエンらの方法によって形質転換し、アン
ピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法
に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡ
ＳＬＢ３−３と名付け、その構造を制限酵素消化により
確認した。

【００４８】（４）ｐＡＳＬＢＥ３−３の造成 （図４
参照） pASLB3-3中のジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)発現ユニット
を除去し、エプシュタイン・バール・ウイルス（Epstei
n -Barr virus ）の複製開始点（oriP）とEBNA-1遺伝子
（oriPにトランスに作用し、複製を引き起こす働きを有
する遺伝子）を導入したプラスミドpASLBE3-3 の造成を
以下のようにして行なった。oriPとEBNA-1遺伝子は、p2
01〔ビル・ズグデン(Bill Sugden) ら、ネイチャー (Na
ture) ,313, 812 (1985)〕のＮａｒＩ部位にｐＵＣ１２
〔メッシング(Messing) ら：メソッド・イン・エンザイ
モロジー (Methods in Enzymology)，101, 20 (1983)〕
由来のマルチクローニングサイトを含む SmaI-HaeIII断
片が組み込まれたプラスミドであるp220.2から切り出し
て使用した。

【００４９】ｐ２２０．２の1 μg をＹ−１００緩衝液
30μl に溶解し、20単位のEcoRI を加え、37℃で２時間
消化反応を行なった。エタノール沈殿後、30μl のDNA
ポリメラーゼＩ緩衝液［50mMトリス−塩酸(pH7.5), 10
mM 塩化マグネシウム，0.1mM dATP（デオキシアデノシ
ン３リン酸），0.1mM dCTP（デオキシシチジン３リン
酸），0.1mM dGTP（デオキシグアノシン３リン酸），0.
1mM TTP （チミジン３リン酸）］に溶解し、６単位の大
腸菌DNA ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、37℃で60
分間反応させ、EcoRI 消化によって生じた５’突出末端
を平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止
め、クロロホルム抽出とエタノール沈殿の後、20μl の
Ｔ４リガーゼ緩衝液に溶解し、ＸｈｏＩリンカー（5'-p
ＣＣＴＣＧＡＧＧ-3' ：宝酒造社製）を0.05μg とT4DN
A リガーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を
行なった。エタノール沈殿後、Ｙ−１００緩衝液30μl
に溶解し、10単位のBamHI を加え、37℃で２時間消化反
応を行なった。エタノール沈殿後、30μl のDNA ポリメ
ラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌DNA ポリメラ
ーゼＩ・クレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、
BamHI 消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変
えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホル
ム抽出とエタノール沈殿の後、Ｙ−１００緩衝液30μl
に溶解し、10単位のXhoIを加え、37℃で２時間消化反応
を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約
4.9kb のDNA 断片を回収した。

【００５０】また、（３）で得られたｐＡＳＬＢ３−３
(1 μg)をＹ−１００緩衝液 30 μl に溶解し、20単位
XhoIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタノ
ール沈殿の後、30μl のDNA ポリメラーゼＩ緩衝液に溶
解し、６単位の大腸菌DNA ポリメラーゼＩ・クレノー断
片を加え、37℃で60分間反応させ、XhoI消化によって生
じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノー
ル抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈
殿の後、10mMトリス−塩酸(pH7.5), 6mM 塩化マグネシ
ウム, 6mM 2-メルカプトエタノールからなる緩衝液（以
下、Ｙ−０緩衝液と略記する）30μl に溶解し、20単位
のKpnIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反
応液をアガロースゲル電気泳動後、約1.3kb のDNA 断片
を回収した。

【００５１】また、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９
７９、Miyajiら：サイトテクノロジー(Cytotechnolog
y)，３，１３３（１９９０）〕1 μg をＹ−０緩衝液 3
0 μlに溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃で２時間消
化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度が１０
０ｍＭになるように塩化ナトリウムを添加し、20単位の
XhoIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行なった。
該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約6.0kb のDNA
断片を回収した。

【００５２】上記で得られたｐ２２０・２由来のXhoI-B
amHI (平滑末端) 断片(4.9kb) 0.2μg とｐＡＳＬＢ３
−３由来のXhoI (平滑末端)-KpnI 断片(1.3kb) 0.1 μ
g とｐＡＧＥ１０７由来のKpnI - XhoI 断片(6.0kb) 0.
2 μg とをＴ４リガーゼ緩衝液 30 μl に溶解し、 T4D
NAリガーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を
行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエン
らの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得
た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミド
を単離した。このプラスミドをｐＡＳＬＢＥ３−３と名
付け、その構造を制限酵素消化により確認した。

【００５３】（５）ｐＡＳＬＢＣの造成 （図５参照） pASLB3-3中のhG-CSF遺伝子を除去し、そのかわりにマル
チクローニングサイトを導入したプラスミドpASLBCを以
下のように造成した。マルチクローニングサイトは、合
成DNA を用いて作成した。

【００５４】（３）で得られたｐＡＳＬＢ３−３の 1μ
g をＹ−１７５緩衝液30μl に溶解し、20単位のSalIと
20単位のMluIを加え、37℃で２時間消化反応を行なっ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約3.1kb の
DNA 断片を回収した。また、同プラスミド1 μg をＹ−
０緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃
で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム
濃度が１５０ｍＭになるように塩化ナトリウムを添加
し、20単位のMluIを加え、さらに37℃で２時間消化反応
を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約
6.0kb のDNA 断片を回収した。

【００５５】また別に、SalI切断部位と KpnI 切断部位
を連結するためのリンカーとして以下のＤＮＡリンカー
を合成した。なお、このリンカー中にはHindIII, EcoR
V, SfiI, StuI, NotIの各制限酵素切断部位が組み込ま
れている。

【００５６】

【化２】

【００５７】このＤＮＡリンカーの52mer （配列番号
３）と44mer （配列番号４）の１本鎖ＤＮＡはそれぞれ
アプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成
機を用いて合成した。合成したＤＮＡはそれぞれ0.2 μ
g ずつ、Ｔ４キナーゼ緩衝液20μl に溶解し、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製、以下同じ）30単位
を加えて、37℃で２時間リン酸化反応を行なった。

【００５８】上記で得られたｐＡＳＬＢ３−３由来のSa
lI - MluI 断片(3.1kb) 0.1 μg と同プラスミド由来の
KpnI - MluI 断片(6.0kb) 0.2 μg とをＴ４リガーゼ緩
衝液30μl に溶解し、上記ＤＮＡリンカー0.01μg とT4
DNA リガーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応
を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエ
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをｐＡＳＬＢＣと名付
け、その構造を制限酵素消化により確認した。

【００５９】（６）ｐＡＳＬＢＥＣの造成 （図６参
照） pASLBC中のジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)発現ユニットを
除去し、oriPとEBNA-1遺伝子を導入したプラスミドpASL
BEC を以下のようにして造成した。

【００６０】（４）で得られたｐＡＳＬＢＥ３−３の1
μg をＹ−１５０緩衝液30μl に溶解し、20単位のMluI
と20単位のXhoIを加え、37℃で２時間消化反応を行なっ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約1.3kb の
DNA 断片を回収した。また、同プラスミド1 μg をＹ−
０緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃
で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム
濃度が１５０ｍＭになるように塩化ナトリウムを添加
し、5 単位のMluIを加え、さらに37℃で20分間部分消化
反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、約9.6kb のDNA 断片を回収した。

【００６１】また別に、（５）で得られたｐＡＳＬＢＣ
の1 μg をＹ−０緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のKp
nIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、
塩化ナトリウム濃度が１００ｍＭになるように塩化ナト
リウムを添加し、20単位のXhoIを加え、さらに37℃で２
時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電
気泳動後、約0.6kb のDNA 断片を回収した。

【００６２】上記で得られたｐＡＳＬＢＥ３−３由来の
MluI - XhoI 断片(1.3kb) 0.2 μgと同プラスミド由来
のKpnI - MluI 断片(9.6kb) 0.2 μg とｐＡＳＬＢＣ由
来のKpnI - XhoI 断片(0.6kb) 0.05μg とをＴ４リガー
ゼ緩衝液30μl に溶解し、T4DNA リガーゼ175 単位を加
えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用
いて大腸菌HB101 株をコーエンらの方法によって形質転
換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から
公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラス
ミドをｐＡＳＬＢＥＣと名付け、その構造を制限酵素消
化により確認した。

【００６３】（７）ｐＡＳＬＢＥＣ２の造成 （図７参
照） pASLBEC のマルチクローニングサイト中のStuIサイトに
BamHI リンカーを導入したプラスミドpASLBEC2を以下の
ようにして造成した。pASLBEC2では、マルチクローニン
グサイト中のStuIサイトは消失している。

【００６４】（６）で得られたｐＡＳＬＢＥＣの1 μg
をＹ−１００緩衝液30μl に溶解し、5 単位のStuIを加
え、37℃で20分間部分消化反応を行なった。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、約11.5kbのDNA 断片を回収
した。回収したDNA 断片を30μl のＴ４リガーゼ緩衝液
に溶解し、ＢａｍＨＩリンカー（5'-pＣＣＧＧＡＴＣＣ
ＧＧ-3' ：宝酒造社製）を0.01μg とT4DNA リガーゼ17
5 単位とを加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。
エタノール沈殿後、Ｙ−１００緩衝液30μl に溶解し、
20単位のBamHI を加え、37℃で２時間消化反応を行なっ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約11.5kbの
DNA 断片を回収した。回収したDNA 断片を20μl のＴ４
リガーゼ緩衝液に溶解し、T4DNA リガーゼ175 単位を加
えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用
いて大腸菌HB101 株をコーエンらの方法によって形質転
換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から
公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラス
ミドをｐＡＳＬＢＥＣ２と名付け、その構造を制限酵素
消化により確認した。

【００６５】（８）ｐＡＭｏＥＣ２の造成 （図８参
照） pASLBEC2 中のプロモーター［SV40初期遺伝子プロモー
ターとHTLV-1のロング・ターミナル・リピート(long te
rminal repeat ：LTR)のR 領域とU5領域の一部を融合し
たプロモーター］をモロニー・マウス白血病ウイルスの
ロング・ターミナル・リピート（long terminal repea
t：LTR ）のプロモーターにすげかえたプラスミドpAMoE
C2 の造成を以下のようにして行なった。なお、モロニ
ー・マウス白血病ウイルスLTR のプロモーターは、プラ
スミドMolp-1［アキノリ・イシモト(Akinori Ishimoto)
ら、ビロロジ−(Virology)，１４１，３０（１９８
５）］から切り出して使用した。

【００６６】（７）で得られたｐＡＳＬＢＥＣ２の1 μ
g を10mMトリス−塩酸(pH7.5),6mM塩化マグネシウム，5
0mM塩化カリウム,6mM 2- メルカプトエタノールからな
る緩衝液（以下、Ｋ−５０緩衝液と略記する）30μl に
溶解し、20単位のHindIII と20単位のAatII ( 東洋紡績
社製) を加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反
応液をアガロースゲル電気泳動後、約4.8kb のDNA 断片
を回収した。

【００６７】また、同プラスミド1 μg をＫ−５０緩衝
液 30 μl に溶解し、20単位のAatII を加え、37℃で２
時間消化反応を行なった。その後、5 単位のXhoIを加
え、さらに37℃で２０分間部分消化反応を行なった。該
反応液をアガロースゲル電気泳動後、約6.1kb のDNA 断
片を回収した。次に、XhoI切断部位と ClaI 切断部位を
連結するため、以下のＤＮＡリンカーを合成した。

【００６８】

【化３】

【００６９】上記ＤＮＡリンカーの9merと7merの１本鎖
ＤＮＡはそれぞれアプライド・バイオシステムズ社３８
０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。合成したＤＮＡ
はそれぞれ0.2 μg ずつ、Ｔ４キナーゼ緩衝液40μl に
溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ30単位を加え
て、37℃で２時間リン酸化反応を行なった。また別に、
Ｍｏｌｐ−１［アキノリ・イシモト (Akinori Ishimot
o) ら、ビロロジ−(Virology)，１４１，３０（１９８
５）］1 μg をＹ−５０緩衝液30μlに溶解し、20単位
のClaIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタ
ノール沈殿後、30μl のT4リガーゼ緩衝液に溶解し、上
記ＤＮＡリンカー0.01μg とT4DNA リガーゼ175 単位を
加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。エタノール
沈殿後、Ｋ−２０緩衝液30μl に溶解し、20単位のSmaI
を加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、約0.6kb のDNA 断片を回収
した。回収したDNA 断片を30μl のＴ４リガーゼ緩衝液
に溶解し、HindIII リンカー（5'-pＣＡＡＧＣＴＴＧ-
3' ：宝酒造社製）を0.03μg とT4DNA リガーゼ175 単
位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。エタノ
ール沈殿後、10mMトリス−塩酸（pH7.5), 6mM 塩化マグ
ネシウム, 50mM塩化ナトリウム, 6mM2-メルカプトエタ
ノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−５０緩衝液と略記す
る）30μl に溶解し、10単位のHindIII を加え、37℃で
２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃
度が１００ｍＭになるように塩化ナトリウムを添加し、
10単位のXhoIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行
なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約0.6k
b のDNA 断片を回収した。

【００７０】上記で得られたｐＡＳＬＢＥＣ２由来のHi
ndIII - AatII 断片(4.8kb) 0.2 μg と同プラスミド由
来のAatII - XhoI断片(6.1kb) 0.2 μg とＭｏｌｐ−１
由来のHindIII - XhoI断片(0.6kb) 0.05μg とをＴ４リ
ガーゼ緩衝液30μl に溶解し、T4DNA リガーゼ175 単位
を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液
を用いて大腸菌HB101 株をコーエンらの方法によって形
質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株
から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプ
ラスミドをｐＡＭｏＥＣ２と名付け、その構造を制限酵
素消化により確認した。

【００７１】（９）ｐＡＭｏＥＣ３の造成 （図９参
照） pAMoEC2 のマルチクローニングサイト中のBamHI サイト
に、詰め込みDNA (Stuffer DNA)として、pBR322のテト
ラサイクリン耐性遺伝子を含むDNA 断片［DraI- PvII
断片(2.5kb) ］を以下のようにして挿入し、プラスミド
pAMoEC3 を造成した。

【００７２】（８）で得られたｐＡＭｏＥＣ２の1 μg
をＹ−１００緩衝液30μl に溶解し、20単位のBamHI を
加え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタノール沈
殿後、30μl のDNA ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６
単位の大腸菌DNA ポリメラーゼＩ・クレノー断片を加
え、37℃で60分間反応させ、BamHI 消化によって生じた
５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応液をアガロー
スゲル電気泳動後、約11.5kbのDNA 断片を回収した。

【００７３】また、ｐＢＲ３２２［ボリバー(Bolivar)
ら：ジーン(Gene)，2, 95 (1977)］1 μg をＹ−５０緩
衝液 30 μl に溶解し、20単位のDraIと20単位のPvuII
を加え、3 ℃で２時間消化反応を行なった。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、約2.5kb のDNA 断片を回収
した。上記で得られたｐＡＭｏＥＣ２由来のBamHI （平
滑末端) 断片(11.5kb) 0.1μg とｐＢＲ３２２由来のDr
aI - PvuII断片(2.5kb) 0.2 μg とをＴ４リガーゼ緩衝
液30μl に溶解し、 T4DNAリガーゼ175 単位を加えて、
12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大
腸菌HB101 株をコーエンらの方法によって形質転換し、
アンピシリンとテトラサイクリンに耐性である株を得
た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミド
を単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＥＣ３と名付
け、その構造を制限酵素消化により確認した。

【００７４】（１０）ｐＡＭｏＥＲＣ３の造成 （図１
０参照） pAMoEC3 中のoriPとEBNA-1遺伝子のユニットの向きを逆
にしたプラスミドpAMoERC3を以下のようにして造成し
た。

【００７５】（９）で得られたｐＡＭｏＥＣ３の1 μg
をＹ−１００緩衝液30μl に溶解し、20単位のXhoIを加
え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、１Ｍト
リス−塩酸(pH8.0) を30μl と大腸菌アルカリフォスフ
ァターゼ（宝酒造社製）１単位を加え、37℃で２時間脱
リン酸化反応を行なった。エタノール沈殿後、10mMトリ
ス−塩酸(pH8.0), 1mM EDTA (エチレンジアミン４酢酸
ナトリウム) からなる緩衝液（以下、ＴＥ緩衝液と略記
する）30μl に溶解し、アガロースゲル電気泳動後、約
9.1kb のDNA 断片を回収した。

【００７６】また、同プラスミド1 μg をＹ−１００緩
衝液 30 μl に溶解し、20単位のXhoIを加え、37℃で２
時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電
気泳動後、約4.9kb のDNA 断片を回収した。上記で得ら
れたｐＡＭｏＥＣ３由来のXhoI断片(9.1kb) 0.1 μg と
同プラスミド由来のXhoI断片(4.9kb) 0.2 μg をＴ４リ
ガーゼ緩衝液30μl に溶解し、T4DNA リガーゼ175 単位
を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液
を用いて大腸菌HB101 株をコーエンらの方法によって形
質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株
から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプ
ラスミドをｐＡＭｏＥＲＣ３と名付け、その構造を制限
酵素消化により確認した。

【００７７】（１１）ｐＡＧＥ２０７の造成 （図１１
参照） pAGE107 中のG418耐性遺伝子をハイグロマイシン(hyg)
耐性遺伝子にすげかえたプラスミドpAGE207 を以下のよ
うにして造成した。なお、hyg 耐性遺伝子は、p201〔ビ
ル・ズグデン(Bill Sugden) ら、ネイチャー (Nature)
，３１３，８１２（１９８５）〕より切り出して使用
した。

【００７８】ｐＡＧＥ１０７（特開平3-22979 ）の1 μ
g をＹ−５０緩衝液30μl に溶解し、20単位のClaIを加
え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナ
トリウム濃度が１５０ｍＭになるように塩化ナトリウム
を添加し、20単位のMluIを加え、さらに37℃で２時間消
化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、約4.6kb のDNA 断片を回収した。

【００７９】ｐ２０１［ビル・ズグデン (Bill Sugden)
ら：ネイチャー (Nature) ，３１３，８１２（１９８
５）］0.5 μｇをＹ−５０緩衝液30μl に溶解し、20単
位のNarI〔ニュー・イングランド・バイオラボ (New En
gland Biolab) 社製〕を加え、37℃で２時間消化反応を
行なった。エタノール沈殿後、30μl のDNA ポリメラー
ゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌DNA ポリメラーゼ
Ｉ・クレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、NarI
消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。
反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出
とエタノール沈殿後、20μl のＴ４リガーゼ緩衝液に溶
解し、ClaIリンカー（5'−p ＣＡＴＣＧＡＴＧ−3'：宝
酒造社製）を0.05μg とT4DNA リガーゼ175 単位を加え
て、12℃で16時間結合反応を行なった。エタノール沈殿
後、Ｙ−５０緩衝液30μl に溶解し、10単位のClaIを加
え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナ
トリウム濃度が１５０ｍＭになるように塩化ナトリウム
を添加し、10単位のMluIを加え、さらに37℃で２時間消
化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、約1.6kb のDNA 断片を回収した。

【００８０】上記で得られたｐＡＧＥ１０７由来のClaI
- MluI 断片(4.6kb) 0.2 μg とｐ２０１由来の ClaI
- MluI断片(1.6kb) 0.1 μg とをＴ４リガーゼ緩衝液30
μlに溶解し、T4DNA リガーゼ175 単位を加えて、12℃
で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌
HB101 株をコーエンらの方法によって形質転換し、アン
ピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法
に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡ
ＧＥ２０７と名付け、その構造を制限酵素消化により確
認した。

【００８１】（１２）ｐＡＧＥ２０７ＳｃＮの造成
（図１２参照） ラビットβグロビン遺伝子中に存在するSfiIサイトの類
似配列を除去するため、pAGE207 のBalIサイトにScaIリ
ンカーを挿入したプラスミドpAGE207ScNを以下のように
して造成した。なお、pAGE207ScNにおいては、挿入され
たScaIリンカーの数は明らかではない。

【００８２】（１１）で得られたｐＡＧＥ２０７の0.5
μg をＹ−０緩衝液30μl に溶解し、10単位のBalIを加
え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタノール沈殿
後、20μl のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、ScaIリンカ
ー（5'-pＡＡＧＴＡＣＴＴ-3' ：宝酒造社製）を0.01μ
g とT4DNA リガーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結
合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101 株を
コーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐
性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプ
ラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＧＥ２０７
ＳｃＮと名付け、その構造を制限酵素消化により確認し
た。

【００８３】（１３）ｐＡＭｏＣ３Ｓｃの造成（図１３
参照） pAMoERC3中のラビットβグロビン遺伝子中に存在するSf
iIサイトの類似配列を除去するため、以下のようにして
pAMoERC3 中のラビットβグロビン遺伝子を、すでにそ
の類似配列を除去してあるpAGE207ScN中のラビットβグ
ロビン遺伝子にすげかえ、プラスミドpAMoERC3Scを造成
した。造成の都合上、まずpAMoC3Scを造成し、次いでpA
MoERC3Scの造成を行なった。前記のpAGE207ScNにおいて
は、SfiIサイトの類似配列を除去するために挿入された
ScaIリンカーの数は明らかではないが、pAMoERC3Scの場
合は、造成の際にpAGE207ScNを一度ScaIで切断している
ため、挿入されたScaIサイトの数は1 つであると推定さ
れる。

【００８４】（１２）で得られたｐＡＧＥ２０７ＳｃＮ
の1 μg をＹ−０緩衝液30μl に溶解し、20単位のKpnI
を加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩
化ナトリウム濃度が１００ｍＭになるように塩化ナトリ
ウムを添加し、20単位のScaIを加え、さらに37℃で２時
間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気
泳動後、約0.7kb のDNA 断片を回収した。

【００８５】また、同プラスミド1 μg をＹ−１００緩
衝液 30 μl に溶解し、20単位のScaIと20単位のClaIを
加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をア
ガロースゲル電気泳動後、約0.9kb のDNA 断片を回収し
た。また、別に（１０）で得られたｐＡＭｏＥＲＣ３の
1 μg をＹ−０緩衝液30μl に溶解し、20単位のKpnIを
加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化
ナトリウム濃度が１００ｍＭになるように塩化ナトリウ
ムを添加し、20単位のXhoIを加え、さらに37℃で２時間
消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳
動後、約3.2kb のDNA 断片を回収した。

【００８６】次に、ｐＡＧＥ１０７（特開平2-227075）
の１μg をＹ−１００緩衝液 30 μl に溶解し、20単位
のXhoIと20単位のClaIを加え、37℃で２時間消化反応を
行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約4.
3kb のDNA 断片を回収した。上記で得られたｐＡＧＥ２
０７ＳｃＮ由来のKpnI -ScaI断片(0.7kb) 0.1 μgと同
プラスミド由来のScaI - ClaI 断片(0.9kb) 0.1 μg と
ｐＡＭｏＥＲＣ３由来のKpnI - XhoI 断片(3.2kb) 0.3
μg とｐＡＧＥ１０７由来のXhoI - ClaI 断片(4.3kb)
0.3μg とをＴ４リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、 T4DN
Aリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行
なった。該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエンら
の方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得
た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミド
を単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＣ３Ｓｃと名付
け、その構造を制限酵素消化により確認した。

【００８７】（１４）ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃの造成
（図１４参照） （１０）で得られたｐＡＭｏＥＲＣ３の1 μg をＹ−０
緩衝液30μl に溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃で２
時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度
が１５０ｍＭになるように塩化ナトリウムを添加し、20
単位のMluIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行な
った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約6.8kb
のDNA 断片を回収した。

【００８８】また、同プラスミド1 μg をＹ−１５０緩
衝液 30 μl に溶解し、20単位のXhoIと20単位のMluIを
加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をア
ガロースゲル電気泳動後、約1.3kb のDNA 断片を回収し
た。また別に、（３）で得られたｐＡＭｏＣ３Ｓｃの1
μg をＹ−０緩衝液30μlに溶解し、20単位のKpnIを加
え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナ
トリウム濃度が１００ｍＭになるように塩化ナトリウム
を添加し、20単位のXhoIを加え、さらに37℃で２時間消
化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、約5.9kb のDNA 断片を回収した。

【００８９】上記で得られたｐＡＭｏＥＲＣ３由来のKp
nI -MluI断片(6.8kb) 0.2 μg と同プラスミド由来のXh
oI - MluI 断片(1.3kb) 0.05μg とｐＡＭｏＣ３Ｓｃ由
来のKpnI - XhoI 断片(5.9kb) 0.2 μg とをＴ４リガー
ゼ緩衝液30μl に溶解し、 T4DNAリガーゼ175 単位を加
えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用
いて大腸菌HB101 株をコーエンらの方法によって形質転
換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から
公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラス
ミドをｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃと名付け、その構造を制限
酵素消化により確認した。

【００９０】ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃは、異種遺伝子発現
用のプロモーターとして、モロニー・マウス白血病ウイ
ルスのロング・ターミナル・リピート（long terminal
repeat）を有している。また、異種遺伝子の効率良い発
現のために、ラビットβグロビン遺伝子スプライシング
シグナル、ラビットβグロビン遺伝子ポリＡ付加シグナ
ルおよびＳＶ４０初期遺伝子ポリＡ付加シグナルが、挿
入した異種遺伝子の後ろに付加するように構築されてい
る。また、動物細胞用の薬剤耐性マーカーとしてＧ４１
８耐性遺伝子を、大腸菌用の薬剤耐性マーカーとしてカ
ナマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性遺伝子と同じも
の）とアンピシリン耐性遺伝子をそれぞれ有している。
さらに、エプシュタイン・バール・ウイルス（Epstein
-Barr virus ）の複製開始点（ｏｒｉＰ）とｏｒｉＰに
トランスに作用し複製を引き起こす働きをもつＥＢＮＡ
−１遺伝子を有するため、ナマルバ細胞をはじめとして
齧歯類を除く多くの細胞中で、染色体に組み込まれるこ
となくプラスミド状態で存在することができる。

【００９１】ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃを用いたｃＤＮＡラ
イブラリーの造成は、ｃＤＮＡの両末端にＳｆｉＩリン
カーを付加した後、ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ中のＳｆｉＩ
部位に組み込むことにより行なうことができる。

【００９２】（１５）ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃの造成
（図１５参照） ナマルバ細胞のようにＥＢＮＡ−１遺伝子をもともと発
現している細胞を宿主として用いる際には、プラスミド
ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ中のＥＢＮＡ−１遺伝子がなくて
も、宿主に導入したプラスミドは染色体に組み込まれる
ことなくプラスミド状態で存在することができると考え
られる。そこで、ｐＡＭｏＥＲＣ３ＳｃからＥＢＮＡ−
１遺伝子を除去したプラスミドｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃの
造成を以下のようにして行なった。ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓ
ｃは、ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃと同様に、直接発現クロー
ニングベクターとして使用することができる。

【００９３】（１４）で得られたｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ
の2 μg をＹ−５０緩衝液 30 μlに溶解し、20単位のN
siI［ニュー・イングランド・バイオラブズ（New Engla
ndBiolabs ）社製］を加え、37℃で２時間消化反応を行
なった。エタノール沈殿後、30μl のDNA ポリメラーゼ
Ｉ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌DNA ポリメラーゼＩ
・クレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、NsiI消
化によって生じた３’突出末端を平滑末端に変えた。反
応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出と
エタノール沈殿の後、Ｙ−１００緩衝液 30 μl に溶解
し、20単位のNotIを加え、37℃で２時間消化反応を行な
った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約8.1kb
のDNA 断片を回収した。

【００９４】また、同プラスミド 2μg をＹ−１００緩
衝液 30 μl に溶解し、20単位のXhoIを加え、37℃で２
時間消化反応を行なった。エタノール沈殿後、30μl の
DNAポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌DNA
ポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、37℃で60分間
反応させ、XhoI消化によって生じた５’突出末端を平滑
末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、ク
ロロホルム抽出とエタノール沈殿の後、Ｙ−１００緩衝
液 30 μl に溶解し、20単位のNotIを加え、37℃で２時
間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気
泳動後、約3.2kb のDNA 断片を回収した。

【００９５】上記で得られたｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ由来
のNsiI (平滑末端) - NotI断片(8.1k b) 0.1μg と同プ
ラスミド由来のXhoI (平滑末端) - NotI断片(3.2kb) 0.
1 μg とをＴ４リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、 T4DNA
リガーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行
なった。該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエンら
の方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得
た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミド
を単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃと
名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。

【００９６】２．ナマルバ細胞のヒママメレクチン１２
０に対する耐性度の検討 無血清培地馴化ナマルバ細胞（ＫＪＭ−１株）［細井
ら、サイトテクノロジー(Cytotechnology) ，１，１５
１（１９８８）］を種々の濃度のヒママメレクチン１２
０存在下で培養し、ＫＪＭ−１株のヒママメレクチン１
２０に対する耐性度を調べた。ＫＪＭ−１株をＲＰＭＩ
１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地［7.5%炭酸水素ナトリウム
を1/40量、 200mM L-グルタミン溶液 (GIBCO 社製) を
3%、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液 (GIBCO 社
製、5000 ユニット/ml ペニシリン、5000μg/mlストレプ
トマイシン含有) を0.5%、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピ
ペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸〔N-(2-hydroxy
ethyl)piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid; HEPES〕
（10mM）、インシュリン（3 μg/ml）、トランスフェリ
ン（5 μg/ml）、ピルビン酸ナトリウム（5mM ）、アセ
レン酸ナトリウム（125nM ）、ガラクトース（1mg/m
l）、プルロニック(Pluronic)Ｆ６８（0.1%w/v ）を添
加したＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）］で 5×
10⁴ 細胞/ml の濃度になるように懸濁し、96穴マイクロ
タイタープレートに200 μl ずつ分注した。そこに各種
濃度のヒママメレクチン１２０（生化学工業社製）を 1
/100量ずつ添加し、 CO₂インキュベーターで37℃で３週
間培養した。その結果、ＫＪＭ−１株の成育を完全に阻
止するヒママメレクチン１２０の最小濃度は50ng/ml で
あった。400 万個のＫＪＭ−１株について調べたとこ
ろ、この濃度において、ヒママメレクチン１２０耐性株
の自然発生的な出現は見られなかった。

【００９７】３．ヒト・メラノ−マ細胞であるWM266-4
細胞からのβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝
子（WM1 ）のクロ−ン化 （１）ヒト・メラノ−マ細胞株であるWM266-4 細胞から
のmRNAの取得 1 ×10⁸ 個のWM266-4 細胞（ATCC CRL1676）より、イン
ビトロジェン (Invitrogen)社製のmRNA抽出キットであ
るファーストトラック(Fast Track ；商品番号K1593-0
2) を用いて、約30μg のmRNAを取得した。具体的試薬
および方法はキットに付与されている説明書に従った。

【００９８】（２）cDNAライブラリーの作製 上記で得られた mRNA の 8μg から、インビトロジェン
(Invitrogen) 社製のcDNA合成キット（The Librarian
I ）を用いて、ランダム・プライマーをプライマーとし
て２本鎖cDNAを合成した。その後、cDNAの両末端にBstX
I リンカーの代わりに、以下に示すSfiIリンカーを付与
し、アガロースゲル電気泳動によりcDNAをサイズにより
分画を行ない、約1.2 kb以上のcDNA断片を回収した。

【００９９】

【化４】

【０１００】上記SfiIリンカーの11mer （配列番号５）
と8merの１本鎖ＤＮＡはそれぞれアプライド・バイオシ
ステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
合成したＤＮＡはそれぞれ50μg ずつ、別々にＴ４キナ
ーゼ緩衝液50μl に溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（宝酒造社製）30単位を加えて、37℃で16時間リン
酸化反応を行なった後使用した。具体的試薬および方法
は、BstXI リンカーの代わりに、上記のSfiIリンカーを
使用した以外は、キットに付与されている説明書に従っ
た。また、直接発現クローニングベクター（Expression
Cloning Vector ）としては、１項の(15)で造成したｐ
ＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃを使用した。

【０１０１】ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃの 24 μg をＹ−５
０緩衝液590 μl に溶解し、80単位のSfiIを加え、37℃
で16時間消化反応を行なった。この反応液から5 μl を
とり、アガロースゲル電気泳動にかけて切断が完了した
ことを確認後、cDNAライブラリー造成時のcDNAインサー
トが挿入されていないクローンの量を減少させるため、
40単位のBamHI を加え、さらに37℃で２時間消化反応を
行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約
8.8kbのDNA 断片を回収した。

【０１０２】上記で得られたｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ由来
のSfiI断片(8.8kb) 2 μg とcDNA断片とをＴ４リガーゼ
緩衝液 250μl に溶解し、 T4DNAリガーゼ2000単位を加
えて、12℃で16時間結合反応を行なった。その後、トラ
ンスファーＲＮＡ（tRNA）5μg を添加し、エタノール
沈殿後、ＴＥ緩衝液20μl に溶解した。該反応液を用い
て大腸菌ＬＥ３９２株［マニアティス (Maniatis) ら編
集：モレキュラー・クローニング (Molecular Clonin
g)， 2.58 ，Cold Spring Harbor， 1989 年刊行］をエ
レクトロポーレーション法［ウイリアム・ジェイ・ドゥ
ワー (William J.Dower)ら：ヌクレイック・アシッド・
リサーチ (Nucleic Acids Res.) ，１６，６１２７（１
９８８）］により形質転換し、約20万個のアンピシリン
耐性株を得た。

【０１０３】上記で得られた約20万個のアンピシリン耐
性株（cDNAライブラリー）を混合した後、キィアジェン
(Qiagen) 社製のプラスミド調製キットである>plasmid
<maxi kit ( 商品番号 41031)を用いてプラスミドを調
製した。取得したプラスミドはエタノール沈殿後、1 μ
g/μl になるようにＴＥ緩衝液に溶解した。上記プラス
ミドは、エレクトロポーレーション法［Miyajiら：サイ
トテクノロジー(Cytotechnology)，３，１３３（１９９
０）］により、ＫＪＭ−１株に導入した。1.6 ×10⁶ 細
胞あたり4 μg のプラスミドを導入した後、8ml のＲＰ
ＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地に懸濁し、CO₂ インキ
ュベーターで37℃で24時間培養した。その後、G418( ギ
ブコ社製）を0.5mg/mlになるように添加して、さらに７
日培養し、形質転換株を得た。得られた形質転換株は、
ヒママメレクチン１２０( 50ng/ml ) が含まれたＲＰＭ
Ｉ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地で 5×10⁴ 細胞/ml にな
るように懸濁し、96穴マイクロタイタープレートに200
μl ずつ分注した。

【０１０４】CO₂ インキュベーター中で37℃で４週間培
養した後、ヒママメレクチン１２０耐性株を取得した。
その耐性株を培養した後、約 5×10⁶ の細胞からハート
法［ロバート・エフ・マーゴルスキー (Robert F.Margo
lskee)ら：モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロ
ジー (Mol.Cell.Biol.) ，８，２８３７（１９８８）］
によりプラスミドを回収した。回収したプラスミドは、
エレクトロポーレーション法［ウイリアム・ジェイ・ド
ゥワー (William J.Dower)ら：ヌクレイック・アシッド
・リサーチ (Nucleic Acids Res.) ，１６，６１２７
（１９８８）］により大腸菌ＬＥ３９２株に導入し、ア
ンピシリン耐性株を取得した。その形質転換株よりキィ
アジェン (Qiagen) 社製のプラスミド調製キットを用い
てプラスミドを調製し、その構造を各種制限酵素で切断
して調べたところ、約1.8kb のcDNAを含んでいることが
明らかとなった。このcDNAを含むプラスミドをｐＡＭｏ
ＰＲＷＭ１と名付け、これを上記と同様の方法で再度Ｋ
ＪＭ−１株に導入したところ、再びヒママメレクチン１
２０耐性となったことから、このcDNAがβ1,3-ガラクト
シルトランスフェラーゼ遺伝子(WM1) であると推定され
る。

【０１０５】４．β1,3-ガラクトシルトランスフェラー
ゼ遺伝子(WM1) の塩基配列の決定 （１）β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子(W
M1) のｐＵＣ１１９への組み込み（図１６参照） ３項の（３）で得られたｐＡＭｏＰＲＷＭ１の1 μg を
Ｙ−１００緩衝液30μl に溶解し、20単位のAsp718［ベ
ーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim) 社製］
を加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、5
単位のEcoRV を加え、さらに37℃で10分間部分消化反応
を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約
1.8kb のDNA 断片を回収した。

【０１０６】また、ｐＵＣ１１９［メッシング(Messin
g) ら：メソッド・イン・エンザイモロジー (Methods i
n Enzymology)，153, 3 (1987) ］の1 μg をＫ−２０
緩衝液30 μl に溶解し、20単位のSmaIを加え、37℃で
２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃
度が１００ｍＭになるように塩化ナトリウムを添加し、
20単位のAsp718を加え、さらに37℃で２時間消化反応を
行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約3.
16kbのDNA 断片を回収した。

【０１０７】上記で得られたｐＡＭｏＰＲＷＭ１由来の
EcoRV - Asp718 断片(1.8kb) 0.05μg とｐＵＣ１１９
由来の SmaI - Asp718断片(3.16kb) 0.05 μg とをＴ４
リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、T4DNA リガーゼ175 単
位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応
液を用いて大腸菌HB101 株をコーエンらの方法によって
形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換
株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。この
プラスミドをｐＵＣ１１９−ＷＭ１と名付け、その構造
を制限酵素消化により確認した。 （２）塩基配列決定用欠失変異プラスミド（デレーショ
ンプラスミド）の造成 ３項の（１）で得られたｐＵＣ１１９−ＷＭ１の2 μg
をＹ−１５０緩衝液30μl に溶解し、20単位のBamHI と
20単位のSphIを加え、37℃で２時間消化反応を行なっ
た。エタノール沈殿後、Exo III 緩衝液（宝酒造社製の
キロシークエンス用デレーションキットに添付されてい
る）100 μl に溶解した。また、同プラスミド2 μg を
Ｙ−０緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のSacIを加え、
37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリ
ウム濃度が１５０ｍＭになるように塩化ナトリウムを添
加し、20単位のNotIを加え、さらに37℃で２時間消化反
応を行なった。エタノール沈殿後、Exo III 緩衝液100
μl に溶解した。

【０１０８】上記で得られたｐＵＣ１１９−ＷＭ１由来
の BamHI - SphI 断片および同プラスミド由来の SacI
- NotI断片より、宝酒造社製のキロシークエンス用デレ
ーションキットを用いてそれぞれ数十種の欠失変異プラ
スミドを作製した。具体的な試薬および方法はキットに
付与されている説明書に従った。上記で得られたデレー
ションプラスミドの塩基配列は、アプライド・バイオシ
ステムズ社の塩基配列決定キット（Taq DyeDeoxy Termi
nator Cycle SequencingKit；商品番号401113）を用い
て決定した。決定した塩基配列を配列番号１に示した。
その結果、β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝
子（WM1 ）は、326 アミノ酸からなるタンパク質をコー
ドしていることが明らかになった。またそのアミノ酸配
列より、このタンパク質がグリコシルトランスフェラー
ゼ（以下、GTと略記する）に共通な構造を有することが
明らかになった。すなわち、Ｎ末端の４アミノ酸を細胞
質側に出し、それに続く２２アミノ酸からなる疎水性に
富む領域で膜に結合し、残りの大半のＣ末端部分（触媒
部位を含む）をゴルジ体内腔に露出する構造をとってい
ると考えられる。

【０１０９】実施例２．動物細胞によるβ1,3-ガラクト
シルトランスフェラーゼの生産 １．β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼを動物細胞
で発現させるためのプラスミドｐＡＭｏＥＲＳＡＷ１の
造成 （１）ｐＡＧＥ１４７の造成 （図１７参照） ｐＡＧＥ１０７のSV40初期遺伝子プロモーターをモロニ
ー・マウス白血病ウイルスのロング・ターミナル・リピ
ート（long terminal repeat；LTR ）のプロモーターに
すげかえたプラスミドｐＡＧＥ１４７の造成を以下のよ
うにして行なった。

【０１１０】プラスミドｐＰＭＯＬ１（特開平1-63394
）の２μg をＹ−０緩衝液30μl に溶解し、20単位のS
maIを加え、30℃で３時間消化反応を行った。その後、
塩化ナトリウムを50mMになるように添加し、20単位のCl
aIを加えて37℃で２時間消化反応を行った。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、モロニー・マウス白血病ウ
イルスのLTR プロモーターを含む約0.6kb のDNA 断片を
回収した。

【０１１１】次に、実施例１の１項の（８）で合成した
下記の２種の合成ＤＮＡ

【０１１２】

【化５】

【０１１３】をそれぞれ25ピコモル(pmoles)ずつT4キナ
ーゼ緩衝液10μl に溶解し、5 単位のT4DNA キナーゼを
加え、37℃で30分間反応させることにより５’末端をリ
ン酸化した。上記で得られたｐＰＭＯＬ１由来のClaI-S
maI 断片(0.6kb)0.05 μg と５’リン酸化された２種の
合成DNA （１ピコモルずつ）とHindIII リンカー(5'-pC
AAGCTTG-3'; 宝酒造社製) （１ピコモル）とをT4リガー
ゼ緩衝液30μl に溶解し、T4DNA リガーゼ200 単位を加
え、12℃で16時間結合反応を行った。エタノール沈殿に
より該DNA 断片を回収した後、Ｙ−１００緩衝液に溶解
し、10単位のHindIIIおよび10単位のXhoIを加えて37℃
で２時間消化反応を行った。反応をフェノール−クロロ
ホルム抽出により停止させ、エタノール沈殿により該DN
A 断片を回収した。

【０１１４】一方、ｐＡＧＥ１０７（特開平3-22979 、
Miyajiら：サイトテクノロジー(Cytotechnology)，３，
１３３（１９９０）］の１μg を30μl のＹ−１００緩
衝液に溶解し、10単位のHindIII と10単位のXhoIを加え
て37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロー
スゲル電気泳動後、G418耐性遺伝子およびアンピシリン
耐性遺伝子を含む約6.0kb のDNA 断片を回収した。

【０１１５】上記で得られたｐＡＧＥ１０７由来のHind
III-XhoI断片(6.0kb)0.3μg とｐＰＭＯＬ１由来のHind
III-XhoI断片(0.6kb)0.01 μg とをT4リガーゼ緩衝液20
μlに溶解し、T4DNA リガーゼ200 単位を加え、12℃で1
6時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101
株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシ
リン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従
ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＧＥ
１４７と名付け、その構造を制限酵素消化により確認し
た。

【０１１６】（２）ｐＡＧＥ２４７の造成 （図１８参
照） ｐＡＧＥ２０７のSV40初期遺伝子プロモーターをモロニ
ー・マウス白血病ウイルスのロング・ターミナル・リピ
ート（long terminal repeat：LTR ）のプロモーターに
すげかえたプラスミドｐＡＧＥ２４７の造成を以下のよ
うにして行なった。

【０１１７】（１）で得られたｐＡＧＥ１４７の２μg
を30μl のＹ−１００緩衝液に溶解し、10単位のHindII
I と10単位のXhoIを加えて37℃で２時間消化反応を行っ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、モロニー・
マウス白血病ウイルスのLTRプロモーターを含む約0.63k
bのDNA 断片を回収した。一方、実施例１の１項の（１
１）で構築したｐＡＧＥ２０７の２μg を30μlのＹ−
１００緩衝液に溶解し、10単位のHindIII と10単位のXh
oIを加えて37℃で２時間消化反応を行った。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、hyg 耐性遺伝子およびアン
ピシリン耐性遺伝子を含む約5.84kbのDNA 断片を回収し
た。

【０１１８】上記で得られたｐＡＧＥ１４７由来のHind
III-XhoI断片(0.63kb)0.05μg とｐＡＧＥ２０７由来の
HindIII-XhoI断片(5.84kb)0.1 μg をT4リガーゼ緩衝液
30μl に溶解し、T4DNA リガーゼ100 単位を加え、12℃
で16時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB
101 株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピ
シリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に
従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＧ
Ｅ２４７と名付け、その構造を制限酵素消化により確認
した。

【０１１９】（３）ｐＡＭＮ６ｈｙｇの造成 （図１９
参照） モロニー・マウス白血病ウイルスのLTR をプロモーター
とし、hyg 耐性遺伝子をマーカーとして有する、ヒト顆
粒球コロニー刺激因子誘導体の発現プラスミドｐＡＭＮ
６ｈｙｇの造成を以下のようにして行なった。

【０１２０】上記で得られたｐＡＧＥ２４７の２μg を
Ｙ−５０緩衝液30μl に溶解し、20単位のClaIを加え、
37℃で２時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウ
ムを175mM になるように添加し、20単位のSalIを加えて
37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロース
ゲル電気泳動後、モロニー・マウス白血病ウイルスのLT
R プロモーター、アンピシリン耐性遺伝子およびhyg 耐
性遺伝子を含む約4.8kb のDNA 断片を回収した。

【０１２１】一方、特開平2-227075記載の方法により得
られたプラスミドｐＡＳＮ６の２μg をＹ−５０緩衝液
30μl に溶解し、20単位のClaIを加え、37℃で２時間消
化反応を行った。その後、塩化ナトリウムを175mM にな
るように添加し、20単位のSalIと20単位のMluIを加えて
37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロース
ゲル電気泳動後、ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体遺
伝子を含む約5.0kb のDNA 断片を回収した。

【０１２２】上記で得られたｐＡＧＥ２４７由来のClaI
-SalI 断片(4.8kb) 0.1 μg とｐＡＳＮ６由来のClaI-S
alI 断片(5.0kb) 0.1 μg とをT4リガーゼ緩衝液20μl
に溶解し、T4DNA リガーゼ200 単位を加え、12℃で16時
間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101 株
をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン
耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従って
プラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＭＮ６ｈ
ｙｇと名付け、その構造を制限酵素消化により確認し
た。

【０１２３】（４）ｐＡＭｏＥＲＳＡの造成 （図２０
参照） 任意のタンパク質が、プロテインＡの免疫グロブリンＧ
（ＩｇＧ）と黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus
）が結合する領域との融合タンパク質として分泌発現
するためのベクターｐＡＭｏＥＲＳＡの造成を以下のよ
うにして行なった。

【０１２４】（３）で得られたｐＡＭＮ６ｈｙｇの2 μ
g をＹ−５０緩衝液30μl に溶解し、20単位のSnaBI を
加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化
ナトリウムを100mM になるように添加し、20単位のXbaI
を加えて37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をア
ガロースゲル電気泳動後、ヒト顆粒球コロニー刺激因子
のシグナル配列を含む約0.33kbのDNA 断片を回収した。

【０１２５】また、ｐＰｒＡＳ１［Saito ら：プロテイ
ン・エンジニアリング (Protein Engineering)，２，４
８１（１９８９）］の 2μg をＹ−５０緩衝液 30 μl
に溶解し、20単位のClaIを加え、37℃で２時間消化反応
を行なった。エタノール沈殿後、30μl のDNA ポリメラ
ーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌DNA ポリメラー
ゼＩ・クレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、Cl
aI消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変え
た。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム
抽出とエタノール沈殿後、Ｙ−１００緩衝液 30 μl に
溶解し、20単位のBamHI を加え、37℃で２時間消化反応
を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、プ
ロテインＡのＩｇＧとの結合領域を含む約0.21kbのDNA
断片を回収した。

【０１２６】また、実施例１の１項の(13)で得られたｐ
ＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃの 2μg をＹ−１００緩衝液 30 μ
l に溶解し、20単位のXbaIと20単位のBamHI を加え、37
℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロース
ゲル電気泳動後、約12.1kbのDNA 断片を回収した。上記
で得られたｐＡＭＮ６ｈｙｇ由来のSnaBI - XbaI断片
(0.33kb) 0.05 μgとｐＰｒＡＳ１由来のClaI(blunt) -
BamHI 断片(0.21kb) 0.05 μg とｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓ
ｃ由来のXbaI - BamHI断片(12.1kb) 0.1μg とをＴ４リ
ガーゼ緩衝液30μl に溶解し、 T4DNAリガーゼ175 単位
を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液
を用いて大腸菌HB101 株をコーエンらの方法によって形
質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株
から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプ
ラスミドをｐＡＭｏＥＲＳＡと名付け、その構造を制限
酵素消化により確認した。

【０１２７】（５）ｐＡＭｏＥＲＳＡＷ１の造成 （図
２１参照） クローン化したβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ
はその一次配列から、Ｎ末の４アミノ酸を細胞質側に出
し、それに続く２２アミノ酸からなる疎水性に富む領域
で膜に結合し、残りの大半のＣ末部分（触媒部位を含
む）をゴルジ体内腔に露出する構造をとると推定され
る。そこで、以下のようにして膜結合領域と推定される
部分を除去し、代わりにヒト顆粒球コロニー刺激因子の
シグナル配列およびプロテインＡのＩｇＧとの結合領域
を付加することによりβ1,3-ガラクトシルトランスフェ
ラーゼを生産させた。

【０１２８】膜結合領域と推定される部分以降〔配列番
号１の35番目のＳｅｒから326番目のＣｙｓまで〕をコ
ードするＤＮＡをＰＣＲ法を用いて調製し、上記（４）
で造成した分泌発現ベクターｐＡＭｏＥＲＳＡに組み込
んだ。ＰＣＲ用のプライマーとして、以下に示す２種の
合成ＤＮＡ〔W-AN (40mer；配列番号６）およびW-C(39m
er；配列番号７）]をアプライド・バイオシステムズ社
３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。

【０１２９】

【化６】

【０１３０】W-ANには StuI サイトが、 W-CにはAsp718
サイトがそれぞれ導入されるように構築されているた
め、ＰＣＲ法で増幅されたＤＮＡ断片は StuI とAsp718
で切断した後に、ｐＡＭｏＥＲＳＡのStuI切断部位とAs
p718切断部位間に組み込むことができる。ＰＣＲ反応
は、宝酒造社製のキット（GeneAmp^TMNA Amplification
Reagent Kit with AmpliTaq^TM Recombinant Taq DNA Po
lymerase）を用いて行なった。反応液の調製はキットに
添付の説明書に従って行ない、パーキン・エルマー・シ
ータス社のサーマル・サイクラー（PERKIN ELMER CETUS
DNA Thermal Cycler ；宝酒造社が販売）を用いて、９
４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で３分間の反応
を３０サイクル行なった後、さらに７２℃で７分間反応
させた。鋳型としては、１ngのプラスミドｐＵＣ１１９
−ＷＭ１を使用した。反応終了後、クロロホルム抽出お
よびエタノール沈殿を行なった後、Ｙ−１００緩衝液 3
0 μlに溶解し、20単位のStuIおよび20単位のAsp718を
加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をア
ガロースゲル電気泳動後、約0.89kbのDNA 断片を回収し
た。

【０１３１】また、ｐＡＭｏＥＲＳＡの２μg をＹ−１
００緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のStuIと20単位の
Asp718を加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反
応液をアガロースゲル電気泳動後、約11.8kbのDNA 断片
を回収した。上記で得られたＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ
由来の StuI - Asp718断片(0.89kb)0.1μg とｐＡＭｏ
ＥＲＳＡ由来のStuI - Asp718 断片(11.8kb) 0.1μg と
をＴ４リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、 T4DNAリガーゼ
175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。
該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエンらの方法に
よって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形
質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離し
た。このプラスミドをｐＡＭｏＥＲＳＡＷ１と名付け、
その構造を制限酵素消化により確認した。

【０１３２】２．ナマルバＫＪＭ−１細胞を宿主とした
β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼの分泌発現 上記１項の（４）および（５）で得られたプラスミドｐ
ＡＭｏＥＲＳＡ（分泌発現ベクター；コントロール）お
よびｐＡＭｏＥＲＳＡＷ１（β1,3-ガラクトシルトラン
スフェラーゼ分泌発現用プラスミド）をキィアジェン
(Qiagen) 社製のプラスミド調製キットである>plasmid<
maxi kit （商標番号 41031)を用いて調製した。取得
したプラスミドはエタノール沈殿後、1 μg/μl になる
ようにＴＥ緩衝液に溶解した。その後、両プラスミド
を、エレクトロポーレーション法［Miyajiら：サイトテ
クノロジー(Cytotechnology)，３，１３３（１９９
０）］により、それぞれナマルバＫＪＭ−１株に導入し
た。1.6 ×10⁶ 細胞あたり4 μg のプラスミドを導入
後、8ml のＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地に懸濁
し、CO ₂ インキュベーターで37℃で24時間培養した。そ
の後、G418（ギブコ社製）を0.5mg/mlになるように添加
して７日間培養した。その後、22mlのＲＰＭＩ１６４０
・ＩＴＰＳＧＦ培地（0.5mg/mlのG418を含む）を添加
し、さらに５日間培養し形質転換株を得た。取得した形
質転換株は、それぞれG418を0.5mg/ml含むＲＰＭＩ１６
４０・ＩＴＰＳＧＦ培地30mlに5 ×10⁴ 細胞/ml になる
ように懸濁し、CO₂インキュベーターで37℃で８日間培
養した。その後、遠心分離（160 × g、10分間）により
細胞を除き上清を回収し、再度遠心分離（1500× g、10
分間）後、その上清を回収した。このようにして取得し
た培養上清は、使用するまで -80℃で保存した。

【０１３３】プラスミドｐＡＭｏＥＲＳＡＷ１がコード
するタンパク質は、プロテインＡがＩｇＧと結合する領
域との融合タンパクとして分泌発現されるため、ＩｇＧ
セファロース（Sepharose)を用いて、容易に精製するこ
とができる。そこで、上記で取得した培養上清にアジ化
ナトリウムを最終濃度0.1％になるように添加した後、
添付の説明書にしたがって前処理したＩｇＧセファロー
ス[ファルマシア(Pharmacia)製]を100μl添加し、４℃
で一晩緩やかに攪拌した。その後、遠心分離（160 ×
g、10分間）によりＩｇＧセファロースを回収し、ＲＰ
ＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地１mlで３回洗浄後、こ
のＩｇＧセファロース 5μlを直接用いて、シアリルト
ランスフェラーゼ活性、フコシルトランスフェラーゼ活
性およびガラクトシルトランスフェラーゼ活性を測定し
た。シアリルトランスフェラーゼ活性の測定は30μlの
アッセイ溶液［0.1Mカコジル酸−塩酸 (pH6.5)、0.01M
塩化マンガン、0.45%トライトンX-100 (Triton X-10
0)、0.1mM 基質、上記ＩｇＧセファロース(5μl)、5mM
CMP−シアル酸 (添加あるいは無添加) ］中で37℃、2時
間の反応を行った後、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）により生産物を分離・同定することにより行な
った。基質糖鎖としてはラクト−Ｎ−ネオテトラオース
（ Lacto-N-neotetraose；LNnT）およびラクト−Ｎ−テ
トラオース（ Lacto-N-tetraose ；LNT ）（いずれもオ
ックスフォード・グライコシステムズ社製）をアミノピ
リジンで蛍光標識したものを使用した。基質の蛍光標識
は、常法［Akihiro Kondo ら：アグリカルチュラル・ア
ンド・バイオロジカル・ケミストリー (Agric. Biol. C
hem.),54, 2169 (1990)］に従って行なった。それぞれ
のＩｇＧセファロースについて、CMP-シアル酸（糖供与
体）を含むアッセイ溶液と含まないアッセイ溶液を用い
て反応を行った後、ＨＰＬＣで解析し、CMP-シアル酸を
含むアッセイ溶液でのみ出現するピークを生成物とし
た。反応の終了したアッセイ溶液は、100℃、5分間の熱
処理を行った後、10000 × gで10分間遠心分離し、その
上清のうち10μlをＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣは、Ｔ
ＳＫｇｅｌＯＤＳ-８０Ｔ _M カラム（4.6mm ×30cm；東ソ
ー社製）を使用し、溶出温度50℃，流速1ml/分の条件で
0.02M 酢酸アンモニウム緩衝液 (pH4.0)を用いて溶出を
行なった。生成物の検出は、島津製作所製の蛍光検出器
（Fluorescence HPLC Monitor RF-535T ）を用いて行な
った（励起波長320nm、放射波長400nm ）。測定の結
果、いずれのＩｇＧセファロースもシアリルトランスフ
ェラーゼ活性は検出されなかった。

【０１３４】フコシルトランスフェラーゼ活性の測定
は、常法［ロウ（John. B. Lowe ）ら：ジーンズ・アン
ド・ディベラプメント（Genes Develop.) ，４，1288
（1990)］に従って以下のように行なった。30μl のア
ッセイ溶液〔 50mM ３−( Ｎ−モルホリノ) プロパンス
ルホン酸（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid;ＭＯ
ＰＳ) (pH6.5), 25mM 塩化マンガン, 5mM ATP, 6 μ
M GDP-[¹⁴C] フコース (60,000 cpm /アッセイ),2.0mM
基質, 上記ＩｇＧセファロース(5μl)〕中で37℃、2 時
間反応させた後、30μl のエタノールを加えて反応を停
止させた。ついで、750 μl の水を加え遠心分離（15,0
00g, 5分）後、その上清をDowex-1 を用いたクロマトグ
ラフィーに供し、通過画分を集めた。その後、750 μl
の水で再度カラムを洗浄し、先の通過画分と合わせて液
体シンチレーターにより放射活性を測定した。基質糖鎖
としてはラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−
テトラオースおよびシアリルラクト−Ｎ−テトラオース
（Sialyllacto-N-tetraose；IV³NeuAc-LcOse4 ）（いず
れもオックスフォード・グライコシステムズ社製）を使
用した。測定の結果、いずれのＩｇＧセファロースもフ
コシルトランスフェラーゼ活性は検出されなかった。

【０１３５】ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の測
定は30μlのアッセイ溶液〔120mMトリス−塩酸(pH7.
9)、10mM塩化マンガン、0.45% トライトンX-100、2mMβ
-メルカプトエタノール、0.1mM 基質、上記ＩｇＧセフ
ァロース(5μl)、5mM UDP-ガラクトース (添加あるいは
無添加)〕中で37℃、2 時間反応後、高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）により生成物を分離・同定する
ことにより行なった。基質糖鎖としては、上記で調製し
たアミノピリジンで蛍光標識したラクト−Ｎ−ネオテト
ラオースをβ- ガラクトシダーゼ処理して末端のガラク
トース残基を除去したものを使用した。具体的には約60
nmolのアミノピリジンで蛍光標識したラクト−Ｎ−ネオ
テトラオースに対し、100 ミリユニットのβ- ガラクト
シダーゼ（生化学工業）を加え、37℃で16時間反応後、
100℃で5分間の熱処理によりβ-ガラクトシダーゼを失
活させたものを基質糖鎖として使用した。それぞれのＩ
ｇＧセファロースについて、UDP-ガラクトース（糖供与
体）を含むアッセイ溶液と含まないアッセイ溶液を用い
て反応を行った後、ＨＰＬＣで解析し、 UDP-ガラクト
ースを含むアッセイ溶液でのみ出現するピークを生成物
とした。反応が終了したアッセイ溶液は、100℃で5分間
の熱処理を行った後、10000 × gで10分間遠心分離し、
その上清のうち10μlをＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣ
は、ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ-８０Ｔ _M カラム（4.6mm ×30c
m；Tosoh 社製）を使用し溶出温度50℃、流速1ml/分の
条件で、0.02M 酢酸アンモニウム緩衝液 (pH4.0)を用い
て溶出を行なった。生成物の検出は、島津製作所製の蛍
光検出器（Fluorescence HPLC Monitor RF-535T ）を用
いて行なった（励起波長320nm、放射波長400nm）。生成
物の同定は、スタンダード［アミノピリジンで蛍光標識
したラクト−Ｎ−ネオテトラオース(LNT) またはラクト
−Ｎ−ネオテトラオース］と溶出時間を比較することに
より行なった。HPLCの結果を図２２に示す。ｐＡＭｏＥ
ＲＳＡＷ１を導入したナマルバ細胞の培養上清由来のＩ
ｇＧセファロースを使用した場合には、アミノピリジン
で蛍光標識したLNT と同じ位置に生成物のピークが検出
された。一方、ベクターであるｐＡＭｏＥＲＳＡを導入
したナマルバ細胞の培養上清由来のＩｇＧセファロース
を使用した場合は、生成物は検出されなかった。

【０１３６】以上の結果から、クローン化した遺伝子(W
M1) がβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼをコード
していることが明らかとなった。また、β1,3-ガラクト
シルトランスフェラーゼが、プロテインＡがＩｇＧと結
合する領域との融合タンパク質として培養上清中に分泌
生産されること、およびその分泌生産物がＩｇＧセファ
ロースを用いて容易に回収、精製されることが示され
た。

【０１３７】実施例３．β1,3-ガラクトシルトランスフ
ェラーゼ発現プラスミドを導入したＫＪＭ−１株におけ
るシアリル・ルイスａ（Sialyl Lewis-a) 糖鎖の合成 実施例２で得られたｐＡＭｏＰＲＷＭ１（β1,3-ガラク
トシルトランスフェラーゼ発現プラスミド）、またはｐ
ＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（コントロールプラスミド）を導入
したＫＪＭ−１株を、G418を0.5mg/ml含むＲＰＭＩ１６
４０・ＩＴＰＳＧＦ培地で培養した後、それぞれ約 1×
10⁶ 個の細胞をマイクロチューブ（1.5ml ：エッペンド
ルフ社製）にとり、遠心分離（550 × g、7 分間）によ
り細胞を集めた。ついで、0.1%のアジ化ナトリウムを含
むリン酸緩衝生理食塩水液（8 g/l 塩化ナトリウム, 0.
2 g/l 塩化カリウム， 1.15 g/l 無水リン酸２水素ナト
リウム， 0.2 g/lリン酸２水素カリウム， 0.1% アジ化
ナトリウム；以下、Ａ−ＰＢＳと略記する）1ml で細胞
の洗浄を行なった。ついで、集めた細胞に対し、シアリ
ル・ルイスａ糖鎖に対する抗体であるＫＭ２３１［花井
ら：アンチキャンサー・リサーチ ( Anticancer Res.)
，10，1579 (1990) ］を用いて、以下のようにして間
接蛍光抗体染色を行ない、これらの細胞におけるシアリ
ル・ルイスａ糖鎖の発現を調べた。

【０１３８】集めた細胞に対しＫＭ２３１をそれぞれ50
μl ( 10μg / ml )加えて懸濁し、4 ℃で１時間反応さ
せた。ついで、細胞をＡ−ＰＢＳで３回洗浄した後、フ
ルオレセインイソチオシアネート(FITC)で蛍光標識した
抗マウスＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体（カッペル社製、
Ａ−ＰＢＳで16倍希釈して使用）20μl を加えて懸濁
し、4 ℃で30分間反応させた。ついで、細胞をＡ−ＰＢ
Ｓで３回洗浄した後、再度Ａ−ＰＢＳに懸濁し、エピッ
クス・エリート・フローサイトメーター［EPICSElite F
low Cytometer；コールター（COULTER ）社製］で解析
を行なった。対照として、ＫＭ２３１の代わりに正常マ
ウス血清（Ａ−ＰＢＳで500 倍希釈して使用）を用いて
上記と同様に解析を行なった。

【０１３９】結果を図２３に示す。直接発現クローニン
グベクターｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（コントロールプラス
ミド）を導入したＫＪＭ−１株において、ＫＭ２３１で
染色した細胞の蛍光強度は、対照の蛍光強度と比較して
強かった。このことは、ＫＪＭ−１株がもともとシアリ
ル・ルイスａ糖鎖を発現していることを示している。ま
た、ＫＭ２３１による染色処理を施したｐＡＭｏＰＲＷ
Ｍ１（β1,3-ガラクトシルトランスフェラ−ゼ発現プラ
スミド）を含有するＫＪＭ−１株の蛍光強度は、ＫＭ２
３１による染色処理を施したｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（コ
ントロールプラスミド）を含有するＫＪＭ−１株の蛍光
強度よりさらに強くなっていた。このことは、ＷＭ１が
コードするβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼが、
細胞内でシアリル・ルイスａ糖鎖の合成に関与している
ことを示している。

【０１４０】

【発明の効果】本発明により、有用生理活性を有する糖
鎖とその修飾物の製造および有用生理活性タンパク質に
結合している糖鎖の改良に有用な新規β1,3-ガラクトシ
ルトランスフェラーゼが提供される。

【０１４１】

【配列表】

配列番号： 1 配列の長さ： 1739 配列の型： 核酸 鎖の数： 二本鎖 配列の種類： cDNA to mRNA 起源： 生物名： ヒト 株名： WM266-4細胞 細胞の種類： メラノ−マ 配列： GCGGCCGAGA GAGCGGAGCA CGAGGAGGCG GGGGCGGCAG AGAAGTGATG CTGGCGCCGG 60 GGATCGGGGC AGCGGCAGCG GAGCAGCAGC ATCTTCGGGA CCCTGGCTGC AGCGTCCCTG 120 TGGCCCGCGC GCCAGCCCAG CGGCCGGAGA CCACGCGCCC CGCGGACCCA TTAGAAACGC 180 TTCAAGAGCT GCTCAGTCCA GGAGTGGAGG GATTTTGTGA AGACACAGAT GCTCCCTAAA 240 AGGAGTGCAG AAATTTTCAT CATAGGTTCT CTTGCTGTGC TGCTGGGTCC TCAGAAGTGT 300 TCTGGAGATC GCCTCTTTGA AAGCGGCTAC GCAGCTTGCT CCTGGCACGG GCACCTTGAA 360 TCTCCTCCTC ACACAGATGG AGACCATGCT TGATTTCCTG AACTTGTAGT AAGAAGAAGG 420 AAAACACAGC ACGCTGGAGC CAACAGAGTT AAGAGGAAGA TTTATGAGTC ATGGAACCCT 480 CCATCAGATT TGGAAGAAAG TAGAATGAGC GCAGAGGTGA CAGACAGCCA CTGAGGCCCA 540 TGGACAATCT CCACCTCACG CTTCTCTATC AAACTTGAAG ATTTATTAGT AATATGCTGC 600 CTTTGGAAGA TGAAAACAAA CTAGTGCCAA GGAGGCGTAT TCTTCAATAT TTGGAATAGA 660 CGTGTTCTCA AGACA ATG GCT TCA AAG GTC TCC TGT TTG TAT GTT TTG ACA 711 Met Ala Ser Lys Val Ser Cys Leu Tyr Val Leu Thr 1 5 10 GTT GTG TGC TGG GCC AGC GCT CTC TGG TAC TTG AGT ATA ACT CGC CCT 759 Val Val Cys Trp Ala Ser Ala Leu Trp Tyr Leu Ser Ile Thr Arg Pro 15 20 25 ACT TCT TCT TAC ACT GGC TCC AAA CCA TTC AGC CAC CTA ACA GTT GCC 807 Thr Ser Ser Tyr Thr Gly Ser Lys Pro Phe Ser His Leu Thr Val Ala 30 35 40 AGG AAA AAC TTC ACC TTT GGC AAC ATA AGA ACT CGA CCT ATC AAC CCA 855 Arg Lys Asn Phe Thr Phe Gly Asn Ile Arg Thr Arg Pro Ile Asn Pro 45 50 55 60 CAT TCT TTT GAA TTT CTT ATC AAC GAG CCC AAT AAA TGT GAG AAA AAC 903 His Ser Phe Glu Phe Leu Ile Asn Glu Pro Asn Lys Cys Glu Lys Asn 65 70 75 ATT CCT TTT CTT GTT ATC CTC ATC AGC ACC ACT CAC AAG GAA TTT GAT 951 Ile Pro Phe Leu Val Ile Leu Ile Ser Thr Thr His Lys Glu Phe Asp 80 85 90 GCC CGT CAG GCA ATC AGA GAG ACG TGG GGG GAT GAG AAC AAC TTT AAG 999 Ala Arg Gln Ala Ile Arg Glu Thr Trp Gly Asp Glu Asn Asn Phe Lys 95 100 105 GGG ATC AAG ATA GCC ACC CTG TTC CTC CTG GGC AAG AAT GCT GAT CCT 1047 Gly Ile Lys Ile Ala Thr Leu Phe Leu Leu Gly Lys Asn Ala Asp Pro 110 115 120 GTT CTC AAT CAG ATG GTG GAG CAA GAG AGC CAA ATC TTC CAT GAT ATC 1095 Val Leu Asn Gln Met Val Glu Gln Glu Ser Gln Ile Phe His Asp Ile 125 130 135 140 ATC GTG GAG GAC TTT ATT GAC TCC TAC CAT AAC CTT ACC CTC AAA ACA 1143 Ile Val Glu Asp Phe Ile Asp Ser Tyr His Asn Leu Thr Leu Lys Thr 145 150 155 TTA ATG GGG ATG AGA TGG GTG GCC ACT TTT TGT TCA AAA GCC AAG TAT 1191 Leu Met Gly Met Arg Trp Val Ala Thr Phe Cys Ser Lys Ala Lys Tyr 160 165 170 GTC ATG AAA ACA GAC AGC GAC ATT TTT GTA AAC ATG GAC AAT CTT ATT 1239 Val Met Lys Thr Asp Ser Asp Ile Phe Val Asn Met Asp Asn Leu Ile 175 180 185 TAT AAA TTA CTG AAA CCC TCC ACC AAG CCA CGA AGA AGG TAT TTT ACT 1287 Tyr Lys Leu Leu Lys Pro Ser Thr Lys Pro Arg Arg Arg Tyr Phe Thr 190 195 200 GGC TAT GTC ATT AAT GGA GGA CCG ATT CGG GAT GTC CGC AGT AAG TGG 1335 Gly Tyr Val Ile Asn Gly Gly Pro Ile Arg Asp Val Arg Ser Lys Trp 205 210 215 220 TAT ATG CCC AGG GAT TTG TAC CCA GAC AGT AAC TAC CCA CCT TTC TGT 1383 Tyr Met Pro Arg Asp Leu Tyr Pro Asp Ser Asn Tyr Pro Pro Phe Cys 225 230 235 TCG GGG ACT GGC TAC ATC TTT TCA GCC GAT GTA GCT GAA CTC ATT TAC 1431 Ser Gly Thr Gly Tyr Ile Phe Ser Ala Asp Val Ala Glu Leu Ile Tyr 240 245 250 AAG ACC TCA CTC CAC ACA AGG CTG CTT CAC CTT GAA GAC GTA TAT GTG 1479 Lys Thr Ser Leu His Thr Arg Leu Leu His Leu Glu Asp Val Tyr Val 255 260 265 GGA CTG TGT CTT CGA AAG CTG GGC ATA CAT CCT TTC CAG AAC AGT GGC 1527 Gly Leu Cys Leu Arg Lys Leu Gly Ile His Pro Phe Gln Asn Ser Gly 270 275 280 TTC AAT CAC TGG AAA ATG GCC TAC AGT TTG TGT AGG TAT CGC CGA GTT 1575 Phe Asn His Trp Lys Met Ala Tyr Ser Leu Cys Arg Tyr Arg Arg Val 285 290 295 300 ATC ACT GTG CAT CAG ATC TCT CCA GAA GAA ATG CAC AGA ATC TGG AAT 1623 Ile Thr Val His Gln Ile Ser Pro Glu Glu Met His Arg Ile Trp Asn 305 310 315 GAC ATG TCA AGC AAG AAA CAT CTC AGA TGT TAG GATTTTTACC AATGTAAATA 1676 Asp Met Ser Ser Lys Lys His Leu Arg Cys TER 320 325 TGTTTCTTTT CTTTTTTTAA GAAATGGGAC CTAAGGTGTT GGTATTTTCC AGGTGTCGGG 1736 GGG 1739

【０１４２】配列番号： 2 配列の長さ： 326 配列の型 ： アミノ酸 トポロジー： 直鎖状 配列の種類： タンパク質 起源： 生物名： ヒト 株名： WM266-4 細胞 細胞の種類： メラノ−マ 配列： Met Ala Ser Lys Val Ser Cys Leu Tyr Val Leu Thr Val Val Cys Trp 1 5 10 15 Ala Ser Ala Leu Trp Tyr Leu Ser Ile Thr Arg Pro Thr Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Gly Ser Lys Pro Phe Ser His Leu Thr Val Ala Arg Lys Asn Phe 35 40 45 Thr Phe Gly Asn Ile Arg Thr Arg Pro Ile Asn Pro His Ser Phe Glu 50 55 60 Phe Leu Ile Asn Glu Pro Asn Lys Cys Glu Lys Asn Ile Pro Phe Leu 65 70 75 80 Val Ile Leu Ile Ser Thr Thr His Lys Glu Phe Asp Ala Arg Gln Ala 85 90 95 Ile Arg Glu Thr Trp Gly Asp Glu Asn Asn Phe Lys Gly Ile Lys Ile 100 105 110 Ala Thr Leu Phe Leu Leu Gly Lys Asn Ala Asp Pro Val Leu Asn Gln 115 120 125 Met Val Glu Gln Glu Ser Gln Ile Phe His Asp Ile Ile Val Glu Asp 130 135 140 Phe Ile Asp Ser Tyr His Asn Leu Thr Leu Lys Thr Leu Met Gly Met 145 150 155 160 Arg Trp Val Ala Thr Phe Cys Ser Lys Ala Lys Tyr Val Met Lys Thr 165 170 175 Asp Ser Asp Ile Phe Val Asn Met Asp Asn Leu Ile Tyr Lys Leu Leu 180 185 190 Lys Pro Ser Thr Lys Pro Arg Arg Arg Tyr Phe Thr Gly Tyr Val Ile 195 200 205 Asn Gly Gly Pro Ile Arg Asp Val Arg Ser Lys Trp Tyr Met Pro Arg 210 215 220 Asp Leu Tyr Pro Asp Ser Asn Tyr Pro Pro Phe Cys Ser Gly Thr Gly 225 230 235 240 Tyr Ile Phe Ser Ala Asp Val Ala Glu Leu Ile Tyr Lys Thr Ser Leu 245 250 255 His Thr Arg Leu Leu His Leu Glu Asp Val Tyr Val Gly Leu Cys Leu 260 265 270 Arg Lys Leu Gly Ile His Pro Phe Gln Asn Ser Gly Phe Asn His Trp 275 280 285 Lys Met Ala Tyr Ser Leu Cys Arg Tyr Arg Arg Val Ile Thr Val His 290 295 300 Gln Ile Ser Pro Glu Glu Met His Arg Ile Trp Asn Asp Met Ser Ser 305 310 315 320 Lys Lys His Leu Arg Cys TER 325 326

【０１４３】配列番号：３ 配列の長さ：52 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCGACAAGCT TGATATCGGC CTGTGAGGCC TCACTGGCCG CGGCCGCGGT AC 52

【０１４４】配列番号：４ 配列の長さ：44 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGCGGCCGCG GCCAGTGAGG CCTCACAGGC CGATATCAAG CTTG 44

【０１４５】配列番号：５ 配列の長さ：11 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTTAGAGCA C 11

【０１４６】配列番号：６ 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTCACTGCGC AGGCCTCCAA ACCATTCAGC CACCTAACAG 40

【０１４７】配列番号：７ 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTCAACGGTA CCATCCTAAC ATCTGAGATG TTTCTTGCT 39

【図面の簡単な説明】

【図１】は、プラスミドpAGEL106の造成工程を示す図で
ある。

【図２】は、プラスミドpASLB3-3-1の造成工程を示す図
である。

【図３】は、プラスミドpASLB3-3の造成工程を示す図で
ある。

【図４】は、プラスミドpASLBE3-3 の造成工程を示す図
である。

【図５】は、プラスミドpASLBCの造成工程を示す図であ
る。

【図６】は、プラスミドpASLBEC の造成工程を示す図で
ある。

【図７】は、プラスミドpASLBEC2の造成工程を示す図で
ある。

【図８】は、プラスミドpAMoEC2 の造成工程を示す図で
ある。

【図９】は、プラスミドpAMoEC3 の造成工程を示す図で
ある。

【図１０】は、プラスミドpAMoERC3の造成工程を示す図
である。

【図１１】は、プラスミドpAGE207 の造成工程を示す図
である。

【図１２】は、プラスミドpAGE207ScNの造成工程を示す
図である。

【図１３】は、プラスミドpAMoC3Scの造成工程を示す図
である。

【図１４】は、プラスミドpAMoERC3Scの造成工程を示す
図である。

【図１５】は、プラスミドpAMoPRC3Scの造成工程を示す
図である。

【図１６】は、プラスミドpUC119-WM1の造成工程を示す
図である。

【図１７】は、プラスミドpAGE147 の造成工程を示す図
である。

【図１８】は、プラスミドpAGE247 の造成工程を示す図
である。

【図１９】は、プラスミドpAMN6hygの造成工程を示す図
である。

【図２０】は、プラスミドpAMoERSAの造成工程を示す図
である。

【図２１】は、プラスミドpAMoERSAW1の造成工程を示す
図である。

【図２２】は、HPLCを用いたガラクトシルトランスフェ
ラ−ゼ活性測定の結果を示す図である。ａ、ｂはｐＡＭ
ｏＥＲＳＡＷ１（β1,3-ガラクトシルトランスフェラー
ゼ発現用プラスミド）を導入したＫＪＭ−１株の培養上
清よりＩｇＧセファロースにより精製したβ1,3-ガラク
トシルトランスフェラーゼのガラクトシルトランスフェ
ラーゼ活性を測定した際のHPLCパターンである。ｃ、ｄ
はｐＡＭｏＥＲＳＡ（コントロールプラスミド）を導入
したＫＪＭ−１株の培養上清について同様の操作を行っ
た場合のHPLCパターンである。ａ、ｃは糖供与体である
UDP-ガラクトースを含まないアッセイ溶液を用いた時
の、ｂ、ｄはUDP-ガラクトースを含むアッセイ溶液を用
いた時のHPLCパターンである。アミノピリジンで蛍光標
識したラクト−Ｎ−テトラオースおよびラクト−Ｎ−ネ
オテトラオースの溶出時間をそれぞれ矢印１、２として
図中に示した。

【図２３】は、間接蛍光抗体染色後、エピックス・エリ
ート・フローサイトメーター［EPICS Elite Flow Cytom
eter；コールター（COULTER ）社製］で解析を行なった
結果を示す図である。pAMoPRC3Sc（コントロールプラス
ミド）を導入したＫＪＭ−１株について、正常マウス血
清を用いて間接蛍光抗体染色を行なった結果を対照とし
て示した。また、pAMoPRC3Sc（コントロールプラスミ
ド）あるいはpAMoPRWM1 （β1,3-ガラクトシルトランス
フェラーゼ発現プラスミド）を導入したＫＪＭ−１株に
ついてＫＭ２３１を用いて間接蛍光抗体染色を行なった
結果をそれぞれpAMoPRC3Sc、pAMoPRWM1 として示した。

【符号の説明】

dhfr ： ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子 hG-CSF ： ヒト顆粒球コロニー刺激因子遺伝子 bp ： 塩基対 (base pairs) kb ： キロ塩基対 (kilobase pairs) G418 / Km ： トランスポゾン５(Tn5) 由来G418、カ
ナマイシン耐性遺伝子 hyg ： ハイグロマイシン耐性遺伝子 Ap ： pBR322由来アンピシリン耐性遺伝子 Tc ： pBR322由来テトラサイクリン耐性遺伝
子 P1 ： pBR322由来P1プロモーター Ptk ： ヘルペス・シンプレックス・ウイルス
(Herpes simplexvirus;HSV)チミジンキナーゼ(tk)遺伝
子プロモーター Sp. βG ： ラビットβグロビン遺伝子スプライシ
ングシグナル A.βG ： ラビットβグロビン遺伝子ポリＡ付加
シグナル A. SE ： シミアン・ウィルス (simian virus)
40 (SV40) 初期遺伝子ポリＡ付加シグナル Atk ： ヘルペス・シンプレックス・ウイルス
(Herpes simplex virus;HSV) チミジンキナーゼ(tk)遺
伝子のポリＡ付加シグナル Pse ： シミアン・ウィルス (simian virus)
40 (SV40) 初期遺伝子プロモーター Pmo ： モロニー・マウス白血病ウイルスのロ
ング・ターミナル・リピート（long terminal repeat :
LTR）プロモーター HTLV-1 ： ヒトＴ細胞白血病ウイルス(human T-c
ell leukemia virus type-1 :HTLV-1)遺伝子 EBNA-1 ： エプシュタイン・バール・ウイルス
（Epstein-Barr virus）のEBNA-1遺伝子 oriP ： エプシュタイン・バール・ウイルス
（Epstein-Barr virus）の複製開始点 ori ： pUC119の複製開始点 lac'Z ： 大腸菌のβガラクトシダーゼ遺伝子の
一部 IG ： M13 ファージDNA のインタージェニッ
ク領域(intergenicregion) G-CSF der. ： ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の
遺伝子 S ： ヒト顆粒球コロニー刺激因子のシグナ
ルペプチドをコードする遺伝子部分 A またはProA： 黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aure
us) のプロテインＡのＩｇＧとの結合領域をコードする
遺伝子部分 WM1 ： WM266-4細胞より取得したβ1,3-ガラ
クトシルトランスフェラーゼ遺伝子（全長あるいは活性
領域部分の遺伝子）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 19/18 Ｃ１２Ｒ 1:19） 審査官 上條 肇 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/54 C12N 1/21 C12N 5/10 C12N 9/10 C12P 19/18 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｐ ＩＲ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (21)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から
   なる群より選ばれるポリペプチド。 （ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプ
   チド （ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列の３５〜３２６番
   目のアミノ酸配列を含むポリペプチド （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの有するアミ
   ノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換若し
   くは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ1,3-ガラ
   クトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド
2. 【請求項２】 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）
   および（ｅ）からなる群より選ばれるＤＮＡ。 （ａ）請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮ
   Ａ （ｂ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ （ｃ）配列番号１で表される塩基配列の６７６〜１６５
   ３番目の塩基配列を有するＤＮＡ （ｄ）配列番号１で表される塩基配列の７７８〜１６５
   ３番目の塩基配列を有するＤＮＡ （ｅ）（ａ）〜（ｄ）いずれかに記載のＤＮＡとストリ
   ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであ
   り、かつβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を
   有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
3. 【請求項３】 請求項２記載のＤＮＡが組み込まれた組
   換え体ベクター。
4. 【請求項４】 動物細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型と
   して合成したｃＤＮＡを発現クローニングベクターに組
   み込むことによりｃＤＮＡライブラリーを構築し、該ｃ
   ＤＮＡライブラリーを細胞に導入し、得られる細胞を、
   その細胞の増殖を抑制する活性を有するレクチンの存在
   下で培養し、増殖する細胞を単離し、該細胞より請求項
   １記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを採取する
   ことを特徴とする請求項２記載のＤＮＡの製造法。
5. 【請求項５】 動物細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型と
   して合成したｃＤＮＡを発現クローニングベクターに組
   み込むことによりｃＤＮＡライブラリーを構築し、該ｃ
   ＤＮＡライブラリーを細胞に導入し、得られる細胞を、
   その細胞の増殖を抑制する活性を有するレクチンの存在
   下で培養し、増殖する細胞を単離し、該細胞より得られ
   る請求項１記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを
   ベクター中のプロモーターの下流に導入することを特徴
   とする請求項３記載の組換え体ベクターの製造法。
6. 【請求項６】 請求項３記載の組換え体ベクターを保有
   する細胞を培地に培養し、培養物中に請求項１記載のポ
   リペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチ
   ドを採取することを特徴とする請求項１記載のポリペプ
   チドの製造法。
7. 【請求項７】 動物細胞がヒト・メラノーマWM266-4 細
   胞である請求項４記載のＤＮＡの製造法。
8. 【請求項８】 動物細胞がヒト・メラノーマWM266-4 細
   胞である請求項５記載の組換え体ベクターの製造法。
9. 【請求項９】 レクチンがヒママメレクチン１２０であ
   る請求項４記載のＤＮＡの製造法。
10. 【請求項１０】 レクチンがヒママメレクチン１２０で
    ある請求項５記載の組換え体ベクターの製造法。
11. 【請求項１１】 組換え体ベクターがプラスミドｐＵＣ
    １１９−ＷＭ１である請求項３記載の組換え体ベクタ
    ー。
12. 【請求項１２】 請求項３記載の組換え体ベクターを含
    有する細胞。
13. 【請求項１３】 請求項１２記載の細胞を用いて糖タン
    パク質、糖脂質またはオリゴ糖に含まれるＮ−アセチル
    グルコサミンにβ１→３結合でガラクトースを付与する
    方法。
14. 【請求項１４】 α2,3-シアリルトランスフェラーゼお
    よびα1,3/1,4-フコシルトランスフェラーゼ存在下、請
    求項１２記載の細胞を用いて糖タンパク質、糖脂質また
    はオリゴ糖の糖鎖上にルイスａ（Lewis-a ）またはシア
    リル・ルイスａ（Sialyl-Lewis-a）構造を導入する方
    法。
15. 【請求項１５】 請求項１記載のポリペプチドを用いて
    糖タンパク質、糖脂質、またはオリゴ糖に含まれるＮ−
    アセチルグルコサミンにβ１→３結合でガラクトースを
    付与する方法。
16. 【請求項１６】 α2,3-シアリルトランスフェラーゼお
    よびα1,3/1,4-フコシルトランスフェラーゼ存在下、請
    求項１記載のポリペプチドを用いて糖タンパク質、糖脂
    質、またはオリゴ糖の糖鎖上にルイスａ（Lewis-a ）ま
    たはシアリル・ルイスａ（Sialyl-Lewis-a）構造を導入
    する方法。
17. 【請求項１７】 請求項２記載のＤＮＡの有する塩基配
    列の連続した１０〜５０塩基と同じ塩基配列を有するオ
    リゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドと相補
    的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
18. 【請求項１８】 請求項２記載のＤＮＡまたは請求項１
    ７記載のオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼー
    ション法により、請求項１記載のポリペプチドを検出す
    る方法。
19. 【請求項１９】 請求項１７記載のオリゴヌクレオチド
    を用いるポリメラーゼ・チェイン・リアクション法によ
    り、請求項１記載のポリペプチドの生産を検出する方
    法。
20. 【請求項２０】 請求項３または１１記載の組換え体ベ
    クターを含有する大腸菌。
21. 【請求項２１】 大腸菌がEscherichia coli HB101/pUC
    119-WM1(FERM BP-4011)である請求項２０記載の大腸
    菌。