JP4571242B2 - ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼ（グリコサミノグリカン硫酸基転移酵素）のポリペプチド、及びそれをコードするＤＮＡに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
コンドロイチン硫酸は、代表的な硫酸化ムコ多糖（グリコサミノグリカン）である。コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）は軟骨に豊富に存在し、軟骨細胞(chondrocyte)の表現型の発現および維持に寄与していると考えられている(Tsukahara, T., Okamura, M., Suzuki, S., Iwata, H., Miura, T., and Kimata, K. (1991) J. Cell Sci. 100, 387-395)。ＣＳＰＧは、また軟骨以外のさまざまな組織中に存在しており、細胞間相互作用に重要な役割を果たしていると考えられる(Kjellen, L., and Lindahl, U. (1991) Annu. Rev. Biochem. 60, 443-475)。
【０００３】
ほ乳類や鳥類の組織に見られる主要なコンドロイチン硫酸は、アセチルガラクトサミン残基の６位または４位に硫酸基を有している。６−硫酸化／４−硫酸化の割合については、次のような知見が得られている。▲１▼軟骨の最終分化に伴い、コンドロイチン６−硫酸／コンドロイチン４−硫酸の比（６／４比）が増加する。▲２▼ラットの皮膚においては、出生後の日齢とともにＣＳＰＧで６／４比が減少する。▲３▼アテローム性動脈硬化症に抵抗性と感受性のハトの品種から得られた各々の動脈平滑筋細胞を比較した結果、ＣＳＰＧ、デルマタン硫酸プロテオグリカン（ＤＳＰＧ）いずれにおいても抵抗性品種ではコンドロイチン４−硫酸が主成分であるが、感受性品種ではコンドロイチン６−硫酸が主である。▲４▼単球性白血病細胞(M1)において、培養条件を細胞増殖、高密度での増殖阻害、マクロファージへの分化誘導が起きる条件へと変化させてみると、増殖、増殖阻害、分化誘導と変化するにつれてＣＳＰＧにおける６／４比が減少し、分化誘導状態ではほとんどコンドロイチン４−硫酸が合成される。▲５▼ヒト正常結腸組織とヒト結腸癌組織を比較した結果、癌組織のＰＧでは正常組織に比べてコンドロイチン６−硫酸とコンドロイチンが増加する。▲６▼マウス骨芽細胞において、石灰化が起きる前後で比較した結果、石灰化後は石灰化前に比べてＤＳＰＧの６／４比が減少する。
▲７▼サル動脈平滑筋細胞の培養培地に血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を添加すると、バーシカン様ＣＳＰＧにおける６／４比がＰＤＧＦ無添加の対照よりも増加する（グリコバイオロジーシリーズ▲１▼ 糖鎖の多様な世界 講談社 第１６４、１６６頁）。
【０００４】
またコンドロイチン硫酸においては、１つの繰り返し２糖単位あたり２つの硫酸基の存在も報告されている。例えば、GlcAβ1→3GalNAc(4,6-bisS)は、継代培養したニワトリ胚軟骨細胞、マウス脾臓細胞を培養して得たコンディションドメディウム添加培地で培養することにより骨髄細胞から分化したマウス肥満細胞、ラット糸球体、器官培養したヒト結腸粘膜の培養液、ラット漿膜肥満細胞、ヒト肺肥満細胞の分泌顆粒、ホルボールミリステートアセテートで活性化されたヒト単球および単球由来のマクロファージ、マウス骨芽細胞、ラット糸球体脈管膜細胞、ナマコ体壁から見つかっている。また非還元末端GalNAc(4,6-bisS)が、ニワトリ胚骨端軟骨およびラット剣状突起軟骨、ニワトリ胚軟骨細胞を培養したときの細胞層から、また非還元末端GalNAc(4,6-bisS)β1→4GlcAβ1→3GalNAc(4,6-bisS)が、ウサギ肺から抽出精製したトロンボモジュリンから見つかっている。さらに、GlcA(2S)-GalNAc(6S)は、マウスリンパ節由来の肥満細胞から見つかっている（グリコバイオロジーシリーズ▲１▼ 糖鎖の多様な世界 講談社 第１６６頁）。
【０００５】
このようなコンドロイチン硫酸の硫酸化のパターンの多様性は、コンドロイチン硫酸の機能の分子的な基盤を反映していると思われる。また、コンドロイチン硫酸の生理活性発現には、硫酸化が重要な役割を果たしていると考えられる。コンドロイチン硫酸の生理活性発現における硫酸化の重要性を考えると、コンドロイチン硫酸の特異的な部位を硫酸化する方法は、コンドロイチン硫酸の生理活性の解析や機能改変に必須であると考えられる。グリコサミノグリカンの糖残基の特異的な部位の硫酸化は、その部位に特異的なスルホトランスフェラーゼにより触媒される。
【０００６】
グリコサミノグリカンのスルホトランスフェラーゼ遺伝子がクローニングされれば、受容体の基質特異性についての情報が得られ、グリコサミノグリカンの構造-機能関係の研究に有用なアプローチを提供すると思われる。グリコサミノグリカンの合成には、さまざまなグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼが関与しているようである。しかしながら、スルホトランスフェラーゼのcDNAのクローニングは困難なものであり、ラットの肝臓、ヘパリン産生細胞系(cell line)、及びマウスの肥満細胞腫からのN-スルホトランスフェラーゼ／N-デアセチラーゼのcDNAがクローニングされているのみである。
【０００７】
本発明者らは、既に3'-ホスホアデノシン5'-ホスホ硫酸からコンドロイチン等のグリコサミノグリカンのN-アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移するコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ（以下「Ｃ６ＳＴ」と略記することもある）を、無血清培地で培養したニワトリの軟骨細胞の培養上清から見かけ上均一に精製した(Habuchi, O., Matsui, Y., Kotoya, Y., Aoyama, Y., Yasuda, Y., and Noda, M. (1993) J. Biol. Chem. 268, 21968-21974)。更に、その部分アミノ酸配列よりオリゴヌクレオチドプライマーを作成し、ニワトリのｃＤＮＡをクローニングし、そのＤＮＡから得られたポリペプチドがＣ６ＳＴ活性を発現することも証明した。また、該酵素が、ケラタン硫酸のガラクトース残基の６位にも硫酸基を転移する活性も有することを見い出した（Fukuta, M., Uchimura. K.,Nakashima, K., Kato, M., Kimata, K., Shinomura, T., and Habuchi, O. (1995) J. Biol. Chem. 270, 18575-18580）。
【０００８】
しかし、医薬品への応用が期待できるヒト由来のコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼのポリペプチドをコードするＤＮＡについては、いまだ知られていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
コンドロイチン硫酸の生理活性発現における硫酸化の重要性を考えると、コンドロイチン硫酸に硫酸基を転移する酵素は、コンドロイチン硫酸の機能解析の研究のみならず、ヒトに好ましい生理活性を有する医薬品の創造を目的としたコンドロイチン硫酸を提供するためにも非常に重要である。さらに、ヒト由来のコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ（Ｃ６ＳＴ）のポリペプチドやそれをコードするＤＮＡが得られれば、コンドロイチン硫酸のＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位低硫酸化（本明細書中で、「低硫酸化」とは硫酸化度が低いことを意味する）、及びケラタン硫酸のガラクトース残基の６位低硫酸化等に起因するヒトの疾患に対する、遺伝子治療を含む医薬あるいは診断薬としての利用が期待される。
【００１０】
すなわち本発明が解決しようとする課題は、ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチド及びその部分ポリペプチド、並びにヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼの少なくとも一部をコードするＤＮＡを提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ニワトリ由来のコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡをクローニングし、該ｃＤＮＡに由来する断片を用いて、ヒトのｃＤＮＡライブラリーより該酵素をコードするｃＤＮＡのクローニングに成功し、ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチド及びその部分ポリペプチド（以下、まとめて「本発明ポリペプチド」ともいう）、並びにヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼの少なくとも一部をコードするＤＮＡ（以下、「本発明ＤＮＡ」ともいう）を提供するに至った。
【００１２】
本発明ポリペプチドは、下記の理化学的性質を有する、ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドを含む。
▲１▼作用：
硫酸基供与体から硫酸基を、グリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移する。
【００１３】
▲２▼ 基質特異性：
コンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移する。
ケラタン硫酸のガラクトース残基の６位に硫酸基を転移する。
【００１４】
▲３▼分子量：
約５００００〜５５０００ダルトン
【００１５】
また、本発明ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を有し、硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基及び／またはガラクトース残基に転移する活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有していてもよいヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドを含む。好ましくは、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を有するヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドである。
【００１６】
さらに、本発明ポリペプチドは、上記のポリペプチドの部分を含むポリペプチドを含む。
本発明ＤＮＡは、上記グリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドの少なくとも一部をコードするＤＮＡである。好ましくは、配列番号２においてアミノ酸番号１〜４７９またはアミノ酸番号２０〜４７９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、さらに好ましくは、配列番号１に示す塩基配列の少なくとも一部またはすべてを有する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を、本発明ポリペプチド、本発明ＤＮＡの順に詳細に説明する。
＜１＞本発明ポリペプチド
本発明ポリペプチドは、下記の理化学的性質を有する、ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドを含む。
【００１８】
▲１▼作用：
硫酸基供与体から硫酸基を、グリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移する。
【００１９】
▲２▼ 基質特異性：
コンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移する。
ケラタン硫酸のガラクトース残基の６位に硫酸基を転移する。
【００２０】
▲３▼分子量：
約５００００〜５５０００ダルトン
【００２１】
なお、上記硫酸基供与体としては３’−ホスホアデノシン ５’−ホスホ硫酸が好ましい。
また、本発明ポリペプチドはII型膜タンパク質であることが好ましい。
【００２２】
上記の分子量は、アミノ酸配列から計算した、ポリペプチドの推定分子量である。この酵素は天然では糖タンパク質であると予想され、糖鎖の付加により上記分子量よりも分子量が増加すると考えられる。
【００２３】
また、II型膜タンパク質とは、アミノ末端側に疎水性の膜貫通ドメインがあり、カルボキシル末端側がゴルジ膜内腔に突き出された形状で生合成されるタンパク質を意味する。
【００２４】
好ましくは、上記▲１▼〜▲４▼の理化学的性質に加え、さらにアミノ酸残基が４６０〜４７９残基である。
また、本発明のポリペプチドは、上記の理化学的性質▲２▼の基質特異性において、コンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位のみでなく、４位にも硫酸基を転移する活性を持ち、コンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移する活性（C6ST活性）と、４位に硫酸基を転移する活性（C4ST活性）との比の値（C6ST活性／C4ST活性）は、１５〜２０程度である。
【００２５】
さらに、本発明ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を有し、硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移する活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有していてもよいヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドを含む。好ましくは、アミノ酸残基の置換、欠失または挿入を含まない、配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を有するヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドである。
【００２６】
このようなアミノ酸残基の置換、欠失または挿入は、配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも一部をコードするＤＮＡに１つ又は２以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を起こすようなヌクレオチドの置換、欠失又は挿入を導入して得られるＤＮＡを発現させることによって得ることができる。ＤＮＡ配列へのヌクレオチドの置換、欠失又は挿入は、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未変異ＤＮＡ配列の相当する部分と入れ換える事により、導入することができる。また、部位特異的変異法（Kramer,W. and Frits,H.J.,Meth. in Enzymol.,154,350 (1987); Kunkel,T.A. et al.,Meth. in Enzymol.,154,367(1987)）などの方法によっても、ＤＮＡ配列に置換、挿入又は欠失を導入することができる。硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移する活性は、例えば、後記の酵素活性測定法によって測定することができ、当業者は活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を容易に識別することができる。
【００２７】
配列番号２に示すアミノ酸配列にはアミノ酸番号２０にメチオニンが含まれており、アミノ酸番号１のメチオニンと共に、いずれも本発明ポリペプチドのＮ末端となる可能性がある。従って、本発明ポリペプチドには、配列番号２に示すアミノ酸配列においてアミノ酸番号１〜４７９及びアミノ酸番号２０〜４７９で表されるアミノ酸配列を有するグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドが包含され、かつ好ましい。さらに、配列番号２に示すアミノ酸配列には、見かけ上NH2-ターミナルシグナルペプチド配列は含まれていないが、NH2-ターミナルシグナルペプチド配列の存在が完全に排除されるものではない。いずれのメチオニンがＮ末端であるにしても、また、NH2-ターミナルシグナルペプチド配列の存在の有無に拘わらず、配列番号２に示すアミノ酸配列は、グリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドを含んでいる。
【００２８】
本明細書において、「配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を有する」とは、これらの観点から、スルホトランスフェラーゼ活性を有する必要かつ最小のポリペプチドのアミノ酸配列を有することを意味するものである。
【００２９】
さらにまた、本発明ポリペプチドは、上記のポリペプチドの部分を含むポリペプチドを含む。ここで、「部分」とは、好ましくは、スルホトランスフェラーゼ活性を有する、抗原性を有する等の何らかの活性ないし機能を有する部分を意味する。このような部分を識別することは当業者であれば容易である。
【００３０】
なお、本発明ポリペプチドは必ずしも単独のポリペプチドでなくてもよく、必要により、融合タンパク質の一部となっていてもよい。例えば、本発明ポリペプチドと、発現に必要な他のポリペプチドを含む融合ポリペプチドが例示される。
【００３１】
上記の本発明ポリペプチドは、後記の本発明ＤＮＡを用いて得ることができる。すなわち、本発明ＤＮＡを保持する細胞を、好適な培地で培養し、グリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼを培地中に生成蓄積させ、その培地からグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼを採取することによって、グリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼを製造することができる。本発明のＤＮＡの発現は、通常タンパク質の製造に用いられる宿主−ベクター系を使用することができるが、ＣＯＳ−７細胞等の哺乳類細胞が好ましい。発現は、本発明のＤＮＡを直接発現させてもよいし、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させてもよい。また、本発明のＤＮＡは全長を発現させてもよいし、一部を部分ペプチドとして発現させてもよい。
【００３２】
上記のようにして製造されたグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドもしくはその部分ポリペプチドまたはこれらと他のタンパク質との融合タンパク質を用いて、グリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼに結合する抗体を調製することができる。抗体の調製は、通常の抗体の調製と同様にして行えばよい。また、常法によってグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼに結合するモノクローナル抗体を調製することもできる。
【００３３】
＜２＞本発明ＤＮＡ
本発明ＤＮＡは、本発明により初めて単離されたヒト由来のＤＮＡであり、上記のヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドの少なくとも一部をコードしている。
【００３４】
すなわち、本発明ＤＮＡは、下記の理化学的性質を有するヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドの少なくとも一部をコードしているＤＮＡを含む。
【００３５】
▲１▼作用：
硫酸基供与体から硫酸基を、グリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移する。
【００３６】
▲２▼ 基質特異性：
コンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移する。
ケラタン硫酸のガラクトース残基の６位に硫酸基を転移する。
【００３７】
▲３▼分子量：
約５００００〜５５０００ダルトン
【００３８】
なお、上記硫酸基供与体としては３’−ホスホアデノシン ５’−ホスホ硫酸が好ましい。
【００３９】
またこのポリペプチドはII型膜タンパク質であることが好ましい。
また上記ポリペプチドは、上記▲１▼〜▲４▼の理化学的性質に加え、さらにアミノ酸残基が４６０〜４７９残基であるものが好ましい。
【００４０】
また、本発明のポリペプチドは、上記の理化学的性質▲２▼の基質特異性において、コンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位のみでなく、４位にも硫酸基を転移する活性を持ち、コンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移する活性（C6ST活性）と、４位に硫酸基を転移する活性（C4ST活性）との比の値（C6ST活性／C4ST活性）は、１５〜２０程度である。
【００４１】
なお、本発明のＤＮＡがコードしているグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼは、コンドロイチンのＮ−アセチルグルコサミン残基の６位に硫酸基を転移する作用をもつことから、「コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ」とも呼ばれることもあり、本明細書中でも「コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ」または単に「Ｃ６ＳＴ」と略記することもある。
【００４２】
本発明ＤＮＡの塩基配列は、前記理化学的性質を有するグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドの少なくとも一部をコードしていれば、その塩基配列は特に限定されない。
【００４３】
また本発明ＤＮＡは、ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドの少なくとも一部をコードするＤＮＡであって、配列番号２に示すアミノ酸配列の全部または一部をコードするＤＮＡを含む。
【００４４】
そして、本発明ＤＮＡがコードするヒト由来のスルホトランスフェラーゼのポリペプチドは、硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移する活性を実質的に害さないアミノ酸残基の置換、欠失、挿入を有するものであってもよい。
【００４５】
本発明のＤＮＡとして具体的には、配列番号２においてアミノ酸番号１〜４７９または２０〜４７９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましい。また本発明ＤＮＡとしてより具体的には、配列番号１に示される塩基配列の少なくとも一部またはすべてを有するＤＮＡが挙げられ、かつ特に好ましい。配列番号１に示す塩基配列には、２０番目のアミノ酸に対応する位置にもメチオニンコドン(ATG)が含まれている。これらのメチオニンコドンのうち、最初のメチオニンコドンが開始コドンである可能性が強いが、他のメチオニンコドンが開始コドンである可能性も残っている。従って、このようなＤＮＡとして具体的には、配列番号１に示す塩基配列における１４７位〜１５８３位の塩基配列を有するＤＮＡ、及び配列番号１に示す塩基配列における２０４位〜１５８３位の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００４６】
なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列のＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含されることは、当業者であれば容易に理解されるところである。これらのＤＮＡのいずれもが本発明ＤＮＡに包含される。
【００４７】
さらに、染色体由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼ遺伝子は、コード領域にイントロンを含むことが予想されるが、そのようなイントロンで分断されているＤＮＡ断片であっても、グリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドの少なくとも一部をコードする限り、本発明のＤＮＡ断片に含まれる。すなわち、本明細書において「コードする」とは、転写時にプロッセッシング等を受けて最終的に目的のポリペプチドを生じ得る塩基配列を有することも包含すると理解されたい。
【００４８】
また、本明細書において「ポリペプチドの少なくとも一部をコードする」とは、好ましくは、スルホトランスフェラーゼ活性を有する、抗原性を有する等の何らかの活性ないし機能を有する部分、あるいは、その部分に相当する塩基配列がそのグルコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼに特異的であってプライマーやプローブとして使用できる部分をコードすることを意味する。
【００４９】
なお、本発明には、本発明ＤＮＡに相補的なＤＮＡまたはＲＮＡが包含される。さらに本発明のＤＮＡは、Ｃ６ＳＴをコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよいし、この一本鎖及びこれと相補的な配列を有するＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とからなる二本鎖であってもよい。
【００５０】
また、本発明のＤＮＡは、Ｃ６ＳＴ全体をコードするコード領域全長を有していてもよいし、Ｃ６ＳＴの一部のペプチドをコードするものであってもよい。
本発明のＤＮＡは、その塩基配列が本発明により明らかにされたので、その配列に基づいて合成し、あるいはその配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法）によってヒト染色体ＤＮＡあるいはｍＲＮＡから本発明ＤＮＡを増幅することによって、取得することも可能である。なお、本発明ＤＮＡは、後記実施例に示すように、以下に示す各工程からなるｃＤＮＡクローニングによって、初めて得られたものである。
【００５１】
（１）ニワトリのＣ６ＳＴのポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニング
▲１▼ニワトリ胚軟骨細胞から精製したＣ６ＳＴの部分アミノ酸配列の決定
▲２▼そのアミノ酸配列に基づいたＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマーの作製
▲３▼ニワトリ胚の軟骨細胞由来のポリ(A)+RNAからのＣ６ＳＴ部分ｃＤＮＡのＰＣＲ法による増幅
▲４▼ニワトリ胚の軟骨細胞由来のｃＤＮＡライブラリーからのＣ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡの選択
【００５２】
（２）ヒト由来のＣ６ＳＴのポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニング
▲１▼上記（１）▲４▼で単離されたｃＤＮＡの塩基配列解析結果に基づくヒトｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング用プローブの作製
▲２▼そのプローブを用いた、ヒト由来のＣ６ＳＴをコードするｃＤＮＡクローンのスクリーニング
▲３▼得られたｃＤＮＡの塩基配列解析
【００５３】
しかし本発明のＤＮＡの製造方法はこれに限定されるものではなく、上記のＰＣＲ法や、他の公知のｃＤＮＡクローニングの手法によっても本発明ＤＮＡを製造することができる。
【００５４】
以下に、本発明のＤＮＡを得る方法を具体的に説明する。
（１）ニワトリＣ６ＳＴの部分アミノ酸配列の決定及びＰＣＲ用プライマーの調製
▲１▼ニワトリＣ６ＳＴの精製
コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼは、ニワトリ胚由来の軟骨細胞等、コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼを発現する培養細胞から、通常のタンパク質の精製方法、及び通常のスルホトランスフェラーゼの精製方法を組み合わせることによって精製することができる。具体的には、J. Biol. Chem. 268,(29),21968-21974,(1993)に記載された方法に従って行うことが好ましい。
尚、スルホトランスフェラーゼ活性の測定法、及び硫酸基を転移する位置を調べる方法は、実施例中の酵素活性測定法に詳述した。
【００５５】
▲２▼ニワトリＣ６ＳＴの部分アミノ酸配列の決定
精製したＣ６ＳＴには糖鎖が結合していることが知られているので、この糖鎖を除去するために精製Ｃ６ＳＴをＮ−グリカナーゼ等の糖鎖分解酵素で消化する。これにより脱グリコシル化されたＣ６ＳＴをSDS-PAGE（SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）等に付して分離し、ポリビニリデンフルオリド(polyvinylidene fluoride; PVDF)膜やニトロセルロース膜等に転写する。この膜をクマシー・ブリリアント・ブルーやアミドブラック等のタンパク質を染色する色素で染色し、Ｎ−グリカナーゼ消化後に形成したタンパク質バンドを切り出して、脱グリコシル化されたＣ６ＳＴのアミノ酸配列決定に用いる。また、Ｃ６ＳＴの内部アミノ酸配列を決定する場合は、脱グリコシル化されたＣ６ＳＴをSDS-PAGE等に付して分離し、ゲルをクマシー・ブリリアント・ブルーやアミドブラックのようなタンパク質を染色する色素で染色し、Ｎ−グリカナーゼ消化後に形成したタンパク質バンドを切り出して断片化に用いる。
【００５６】
断片化の方法は特に限定されないが、プロテアーゼＶ８(protease V8、sequencing grade, ベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)製)等のタンパク質分解酵素を用いることが好ましい。また、切り出したゲルをタンパク質分解酵素に接触させ、その後SDS-PAGE等で分離しても良い。簡便な操作としては、Cleveland, D. W., Fischer, S. G., Kirshner, M. W., and Laemmli, U. K.(1977) J. Biol. Chem. 252, 1102-1106 の方法がある。すなわち、タンパク質バンドを切り出して別のゲルのウェルに挿入し、タンパク質分解酵素を含む緩衝液を、挿入したゲルにのせてSDS-PAGEを行い、色素の先端が分離ゲルに入る前に電源を切ることによって泳動を一時中止し、約30分間酵素消化を行い、その後電気泳動を再開するという方法である。この方法によれば酵素消化と消化後のペプチド断片の分離がワンステップでできるので便利である。プロテアーゼ消化により形成したペプチドはPVDF膜やニトロセルロース膜等に転写する。この膜をクマシー・ブリリアント・ブルーやアミドブラック等のタンパク質を染色する色素で染色した後、ペプチドバンドを切り出す。タンパク質分解酵素消化後に生じたペプチドを含むPVDF膜やニトロセルロース膜等は、公知の方法でペプチドのアミノ末端配列決定を行うことができる。
【００５７】
▲３▼オリゴヌクレオチドプライマーの合成
Ｃ６ＳＴの部分的アミノ酸配列が決定されたら、そのアミノ酸配列に基づいてＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマーを作製することができる。アミノ酸配列のうち、なるべくコドンの縮重の少ない部位を用いるとよい。
【００５８】
このようなプライマーの例として、実施例中の表２に示すような、センスプライマー（プライマー１ｓ，プライマー２ｓ）およびアンチセンスプライマー（プライマー３ａ）があげられる。尚、センスプライマー１ｓはHindIII部位を含む配列を、アンチセンスプライマー３ａはEcoRI部位を含む配列を、それぞれ５’末端に有する。これは、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片をベクターに挿入する操作を簡便にするためである。
【００５９】
以上のニワトリ胚の軟骨細胞由来のＣ６ＳＴの部分的アミノ酸配列の決定とオリゴヌクレオチドプライマーの作成は例えば J. Biol. Chem. 270, 18575-18580 (1995) に記載されている。
【００６０】
（２）Ｃ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡの調製
▲１▼全ＲＮＡの調製
全RNAは、公知の方法(Kingston, R. E., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York 等)で得ることができる。材料は、コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼのｍＲＮＡを発現している材料であれば限定されないが、取扱いの容易さ、および増殖可能な点で培養細胞が好ましい。培養細胞の中でも特にニワトリ胚の軟骨細胞(chondrocyte)が好ましい。軟骨細胞は、公知の方法（Kim, J. J., and Conrad, H. E. (1976) J. Biol. Chem. 251, 6210-6217、Kim, J. J., and Conrad, H. E. (1977) J.Biol. Chem. 252, 8292-8299、Kim, J. J., and Conrad, H. E. (1980) J. Biol. Chem. 255, 1586-1597等)で培養することができる。培地としては、培養細胞が生育可能な培地であれば特に限定されないが、ダルベッコ改変イーグル培地等が通常の培養で良く用いられ、入手も容易であり、なおかつ該培養細胞が生育可能であることから好ましい。
培地のpHは中性域、特にpH7.0に調整することが好ましい。培地には２g/l程度の D-グルコースを加えることが好ましい。また、微生物の生育を防ぐため、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加することが好ましい。また、培地に10％のウシ胎仔血清を加えることが好ましい。
【００６１】
上記のような培地を用い、ローラボトルやガラス製あるいはプラスチック製の培養皿を使用して通常の培養細胞と同様にして培養すれば良い。培養は、炭酸ガスインキュベーター中で行うことが好ましく、インキュベーター中の炭酸ガス濃度が５〜７％、空気が９７〜９３％となるように調整することが好ましい。また、温度は３６〜３８℃程度に調整することが好ましい。
【００６２】
全ＲＮＡは、前述のように培養した培養細胞から通常用いられる全ＲＮＡの調製方法により得ることができるが、グアニジンチオシアネート／CsCl法(Kingston, R. E., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York)で調製するのが好ましい。
【００６３】
▲２▼poly(A)+RNAの調製
poly(A)+RNAは、上記のようにして得られた全RNAから、オリゴdT（oligo-(dT)）セルロースカラムクロマトグラフィーなどによって精製することができる。
【００６４】
▲３▼ＰＣＲ法によるＣ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡの増幅
上記ポリ(A)+RNAを鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーを用いた逆転写ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）により、Ｃ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡを増幅することができる。ＰＣＲは、通常の方法と同様にして行えばよいが、具体的方法を示せば以下の通りである。１μｇのポリ(A)+RNA、50pmolのオリゴヌクレオチド３ａ、それぞれ500μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、200単位のM-MLV逆転写酵素（ギブコＢＲＬ(Gibco BRL)）、１mM ジチオスレイトール、120単位のＲＮａｓｅインヒビター(宝酒造(株)製)を含む緩衝液（終体積20μｌ）を、37℃で60分間インキュベートし、ｃＤＮＡ一次鎖を合成する。次に、上記の逆転写反応混合液10μｌ、オリゴヌクレオチドプライマー（センス、アンチセンスそれぞれ50pmol）、それぞれ100μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、2.5単位のTaqポリメラーゼを含む反応液（終体積100μｌ）に対し、94℃１分間、45℃１分間、55℃３分間からなる反応サイクルを30サイクル行う。
【００６５】
このようにして得られた部分的ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーから完全長ｃＤＮＡ（コード領域全長を含むｃＤＮＡ）をスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして用いられる。
【００６６】
（３）ｃＤＮＡライブラリーの作製
▲１▼cDNAの合成と組換えＤＮＡの作製
cDNAは、poly(A)+RNAを鋳型とした逆転写酵素反応により合成することができる。市販のcDNA合成用キットを用いるのが便利である。例えばTimeSaver cDNA synthesis kit(ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー)を用いると、cDNAの合成、およびcDNAをクローニングベクター（例えばEcoRI消化したλｇｔ１１）に連結させることができる。本発明においてもEcoRI消化したλｇｔ１１を用いることが好ましい。なお、逆転写酵素反応のプライマーとしては、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いることが好ましい。cDNAをクローニングベクターに結合させることによって得られた組換えＤＮＡは、宿主細菌細胞中に導入（トランスフェクション）する。用いる宿主細菌細胞は、用いるクローニングベクターにより選択する必要があるが、通常は大腸菌（エシェリキア・コリ：Escherichia coli(E. coli)）を宿主とするクローニングベクターと大腸菌との組み合わせが頻用されている。
【００６７】
トランスフェクションは、通常、組換えＤＮＡと30mM塩化カルシウムの存在下で細胞膜の透過性を変化させた大腸菌とを混合することにより行われる。λｇｔ１１のようなλファージベクターの場合、組換えＤＮＡを直接塩化カルシウム処理した大腸菌に導入できるが、あらかじめ試験管中でファージ外殻に入れて（in vitroパッケージングという）、大腸菌に効率よく感染させる方法が一般に使用されており、そのためのキットも市販されている（Gigapack II packaging extract、ストラタジーン(Stratagene) 製等)。本発明でもこの方法を用いることが好ましい。
in vitroパッケージングした組換えＤＮＡは、大腸菌にトランスフェクションするが、用いるクローニングベクターによって用いる大腸菌株を選択する必要がある。すなわち、抗生物質耐性遺伝子を含むクローニングベクターを用いる場合は、大腸菌に抗生物質に耐性の性質があってはいけない。また、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）等の遺伝子を含むクローニングベクターを用いる場合は、β−ガラクトシダーゼ活性を発現しない大腸菌を選択する必要がある。このことは、組換えＤＮＡがトランスフェクションされた大腸菌をスクリーニングするために必要なことである。例えば、クローニングベクターにλｇｔ１１を用いる場合、E. coli Y1088等のβ−ガラクトシダーゼ活性を発現しない大腸菌株を選択すれば良い。組換えベクターが導入された大腸菌は、抗生物質に対する耐性の獲得や、β−ガラクトシダーゼ活性の獲得等によりスクリーニングできる。具体的には、大腸菌を寒天培地にまき、生育したコロニーを選択すれば良い。生育した大腸菌（組換えＤＮＡがトランスフェクションされた大腸菌）は、ｃＤＮＡライブラリーを構成する。ベクターにλｇｔ１１を用いた場合は、指示菌とともに軟寒天培地に懸濁し、寒天培地上に重層してプラークを形成させればよい。ＤＮＡ断片が挿入されたベクターを保持するファージプラークは、β−ガラクトシダーゼ活性を発現しないので、容易に選択することができる。
【００６８】
▲２▼Ｃ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡクローニング
次に、上記のようにして得られたｃＤＮＡライブラリーから、Ｃ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡを有するファージクローンを、Ｃ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションにより選択することができる。ハイブリダイゼーションは、通常の方法に従って行えばよい。
【００６９】
選択された陽性クローンから、ファージＤＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断することによって、Ｃ６ＳＴｃＤＮＡを切り出すことができる。得られたｃＤＮＡは、そのまま、あるいは適当なプラスミドにサブクローニングして、塩基配列を決定する。
【００７０】
（４）ヒト由来のＣ６ＳＴのポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニング
▲１▼ハイブリダイゼーション用プローブの作成
上記のようにして得られたヒト以外の生物由来のＣ６ＳＴのｃＤＮＡを用いて、ランダムプライマーラベル法により［32Ｐ］ｄＣＴＰで標識した cDNAライブラリースクリーニングのための放射性プローブを作成できる。すなわち、上記のニワトリｃＤＮＡを、［α-32Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャム(Amersham)製）およびＤＮＡランダムラベリングキット（宝酒造（株）製）を用いたランダムオリゴヌクレオチドプライムドラベリング法(random oligonucleotide-primed labeling method(Feinberg, A.P., and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6-13)を用いて放射性標識ＤＮＡプローブを得ることができる。
【００７１】
▲２▼ヒト由来ｃＤＮＡライブラリーの作成
ヒト由来の組織あるいは細胞から全ＲＮＡを調製し、該全ＲＮＡからpoly(A)+ＲＮＡを調製し、該poly(A)+ＲＮＡを鋳型とした逆転写酵素反応により、ヒト由来ｃＤＮＡは合成することができる。これらは全て、遺伝子工学分野で通常用いられている方法により行うことができる。具体的には、前記（２）及び（３）に記載したのと同様に行ええばよい。
【００７２】
ｃＤＮＡはクローニングベクターに連結する。クローニングベクターは特に限定されないが、例えばEcoRI消化したλｇｔ１１を用いることが好ましい。なお、市販されているクローニングベクターに連結されたヒトｃＤＮＡを用いてもよい。具体的には、ラムダベクターλｇｔ１１が組み込まれたヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Clontech）が好ましい。
【００７３】
▲３▼ヒト由来のＣ６ＳＴをコードするｃＤＮＡクローンのスクリーニング
上記のようにして得られたヒト由来ｃＤＮＡライブラリーから、Ｃ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡを有するファージクローンを上記▲１▼で作成した［32Ｐ］ｄＣＴＰで標識した放射性プローブを用いたハイブリダイゼーションにより選択することができる。ハイブリダイゼーションは遺伝子工学分野で通常用いられる手法、例えばプラークハイブリダイゼーション等により行うことができる。プローブとハイブリッドを形成したプラークは、プローブに結合した標識物質を検出することにより、陽性クローンとして単離することができる。
【００７４】
▲４▼ｃＤＮＡの塩基配列解析
選択された陽性クローンから、ファージＤＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断することによって、Ｃ６ＳＴｃＤＮＡを切り出すことができる。得られたｃＤＮＡは、そのまま、あるいは適当なプラスミドにサブクローニングして、塩基配列を決定することができる。
【００７５】
上記のようにして決定されたヒト由来Ｃ６ＳＴをコードするｃＤＮＡの塩基配列のオープンリーディングフレーム部分を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。最初のATGコドンで始まる単一のオープンリーディングフレームからは、479アミノ酸残基からなり、分子量 54,610 のタンパク質が予想される。
【００７６】
上記のようにして得られるＤＮＡは、このＤＮＡによってコードされるＣ６ＳＴが、硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に転移する活性を実質的に害されない限り、１つ又は２以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を起こすようなヌクレオチドの置換、欠失又は挿入を有していてもよい。ＤＮＡ配列へのヌクレオチドの置換、欠失又は挿入は、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未変異ＤＮＡ配列の相当する部分と入れ換える事により、導入することができる。また、部位特異的変異法（Kramer,W. and Frits,H.J.,Meth. in Enzymol.,154,350 (1987); Kunkel,T.A. et.al.,Meth. in Enzymol.,154,367(1987)）などの方法によっても、ＤＮＡ配列に置換、挿入又は欠失を導入することができる。硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基及び／またはガラクトース残基に転移する活性は、例えば、前記の酵素活性測定法によって測定することができ、当業者は活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を容易に識別することができる。
【００７７】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、この実施例は本発明の一例を示すものであり、これに限定されるものではない。はじめに、実施例中で共通して用いる方法に関して説明する。なお、特記しない限り「％」は重量％である。
【００７８】
１．酵素活性測定法
スルホトランスフェラーゼ活性は次のようにして測定した。反応液組成は以下の通りとした。2.5μmolのイミダゾール−塩酸，pH6.8，1.25μgのプロタミン塩酸、0.1μmolのジチオスライトール、25nmol（グルクロン酸の量として）のコンドロイチン（生化学工業（株））、50pmolの[35S]PAPS（アデノシン３’-リン酸，５’-ホスホ硫酸）、及び酵素を含む50μl。
【００７９】
基質としての種々のグリコサミノグリカンに対する活性は、コンドロイチンの代わりに、25nmol（コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸についてはガラクトサミンの量として、ヘパラン硫酸及びケラタン硫酸についてはグルコサミンの量として）のグリコサミノグリカンを用いて測定した。
【００８０】
反応液を３７℃で２０分インキュベートした後、反応チューブを沸騰水に１分浸けることによって反応を停止させた。反応停止後、0.1μmol（グルクロン酸の量として）のコンドロイチン硫酸Ａをキャリアとして加え、1.3%酢酸カリウムを含むエタノールを３体積加えて、35S-標識された多糖類を沈澱させた。混合液を10,000×gで10分遠心し、得られた沈澱を70μlの水に溶解させた。この溶液50μlを0.1M NH4HCO3で平衡化した脱塩カラムに注入し、35S-標識された多糖類を含む溶出分画を集めた。得られた分画の200μlにシンチレーションカクテル（クリアゾル(Clearsol)、ナカライテスク社製）１mlを加え、35S放射活性を測定することにより、多糖類への35Sの取り込みを測定した。
【００８１】
残りの溶液から400μl取り、1.3%酢酸カリウムを含むエタノール800μlを加えて混合した。混合液を30分氷上に置いた後、10,000×gで10分遠心して35S-多糖類を沈澱させた。沈澱を0.1mg/mlのBSA、0.05Mトリス−酢酸，pH7.5、10ミリユニットのコンドロイチナーゼACII（アースロバクター・アウレッセンス(Arthrobacter aurescens)由来、生化学工業(株)）を含む緩衝液25μlに溶解し、37℃で２時間反応させた。反応物を、0.1μmolづつの2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O-(β-D-グルコ-4-エンピラノシルロン酸)-6-O-スルホ-D-ガラクトース（△Di-6S）、及び2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O-(β-D-グルコ-4-エンピラノシルロン酸)-4-O-スルホ-D-ガラクトース（△Di-4S）（いずれも生化学工業(株)製）とともに、ワットマン(Whatman)No.1濾紙にスポットし、1-ブタノール／酢酸／1M 水酸化アンモニウム（2:3:1(V/V/V)）で20時間展開した。
【００８２】
△Di-6S及び△Di-4Sの位置を紫外線ランプで調べ、それぞれの部位を濾紙から切り出し、１Ｌのトルエンにジフェニルオキサゾール5g、ジメチル１，４−ビス(2-(5-フェニルオキサゾール))ベンゼン0.25gを溶解させたシンチレーターに入れ、放射活性を測定した。コンドロイチナーゼACIIで消化した試料では、濾紙の原点に残った放射活性はスポットした放射活性の1%以下であった。△Di-6S及び△Di-4Sへの35Sの取り込みから、それぞれコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ活性及びコンドロイチン４−トランスフェラーゼ活性を算出した。1pmol硫酸基／分の転移を触媒する活性を１ユニットとした。
【００８３】
様々な基質に対してスルホトランスフェラーゼ活性を測定したところ、以下の実施例の＜１＞で得られたコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ（Ｃ６ＳＴ）は、コンドロイチン、ニワトリ胚軟骨由来のコンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、角膜由来のケラタン硫酸には硫酸基を転移するが、コンドロイチン硫酸Ｅ、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸には硫酸基をわずかにしか転移しないことが示された。なお、本Ｃ６ＳＴは、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸には、そのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転位し、ケラタン硫酸の場合は、そのガラクトース残基の６位に硫酸基を転移することが本発明者らにより確認されている。
【００８４】
次に、本発明ＤＮＡの製造例を説明する。
＜１＞ニワトリ胚由来のコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼの調製およびアミノ酸配列分析
（１）コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼの調製
ニワトリ胚の軟骨細胞を、培養皿に5.6×104 個細胞／皿となるように接種し、２ｇ／ＬのＤ−グルコース、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、10％ウシ胎仔血清（FBS）を含むｐＨ７．０に調整したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で、７ vol％CO2、93 vol％空気、38℃の条件下で11日間培養した。培養開始から２、４、７、９、１０日目に、pH7.4の新鮮な培地に交換した。
【００８５】
１０日目に、FBSを60℃で60分加熱して調製した熱不活化血清を10%含む培地を用いた。１１日目には5.0×106 個細胞／皿にまで生育した。それ以後は、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸ナトリウムを添加したコスメディウム(Cosmedium)−００１（コスモバイオ社から購入）を用い、毎日培地を交換しながら１０日間培養を続けた。
【００８６】
使用したコスメディウム培地を集め、10,000×gで10分遠心し、上清の組成が10mM Tris-HCl,pH7.2、0.1％ Triton X-100、20mM MgCl2、10mM 2-メルカプトエタノール、20％グリセロールとなるように調製した。
【００８７】
上記培養上清を、0.15M NaClを含む緩衝液Ａ(10mM Tris-HCl,pH7.2、0.1％ Triton X-100、20mM MgCl2、2mM CaCl2、10mM 2-メルカプトエタノール、20％グリセロール)で平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂカラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製、2.2×28cm）にアプライした。カラムを0.15M NaClを含む緩衝液Ａで洗浄した後、0.15〜0.75MのＮａＣｌを含む緩衝液Ａの直線グラジエント１Ｌで溶出し、12ml／フラクションで分画した。
【００８８】
スルホトランスフェラーゼ活性を有する分画を集め、0.15MのNaClを含む緩衝液Ａで平衡化したコムギ胚芽アグルチニン−アガロースカラム（生化学工業（株）製、1.2×15cm）にアプライした。カラムを0.15MのNaClを含む緩衝液Ａ200mlで洗浄した後、0.15MのNaCl及び0.3MのＮ−アセチルグルコサミンを含む緩衝液Ａ200mlで溶出した。溶出分画を集め、0.05MのNaClを含む緩衝液Ａに対して透析した。
【００８９】
上記溶出分画を、0.05MのNaClを含む緩衝液Ａで平衡化した3',5'-ADP-アガロースカラム（シグマ社製、1.2×11.8cm、1.9μmol 3',5'-ADP／mlゲル）にアプライした。カラムを0.05MのNaClを含む緩衝液Ａ150mlで洗浄した後、０〜0.2mMの3',5'-ADPを含む0.05M NaClを含む緩衝液Ａの直線グラジエント300mlで溶出した。スルホトランスフェラーゼ活性を有する分画を集め、1M NaClを含む緩衝液Ａ、続いて0.05M NaClを含む緩衝液Ａに対して透析した。
【００９０】
上記精製工程において、前記酵素活性測定法に記載した方法で、スルホトランスフェラーゼ活性を測定した。
その結果、コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼの比活性は4.3×105ユニット／mgであり、コンドロイチン４−スルホトランスフェラーゼ活性／コンドロイチン６−トランスフェラーゼ活性の比は0.02であった。
【００９１】
上記のようにして精製されたＣ６ＳＴは、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを形成し、分子量は75,000と決定された。また、スーパロース12 HR 10/30ゲル濾過クロマトグラフィー（溶出液：10mM Tris-HCl,pH7.2、2M NaCl、20mM MgCl2、2mM CaCl2、0.1% Triton X-100、20％グリセロール）で測定したところ、160,000であった。このことから、2M NaCl存在下ではダイマーを形成していることが示唆された。
【００９２】
また、本Ｃ６ＳＴは、プロタミンおよびMnCl2により活性化された。
上記測定系におけるＣ６ＳＴの至適反応ｐＨはおよそ6.4であった。
【００９３】
（２）ニワトリ胚由来Ｃ６ＳＴのアミノ酸配列分析
精製したＣ６ＳＴをＮ−グリカナーゼで消化した。すなわち、１ｍｌ（タンパク質として１０μｇ）のＣ６ＳＴ溶液に２００μｌのトリクロロ酢酸を加え、氷上に３０分置いた後、１０，０００×ｇで２０分遠心分離した。沈澱を１ｍｌのアセトンで２回洗浄し、真空デシケータで乾燥した。乾燥されたＣ６ＳＴタンパク質を０．５％ ＳＤＳを含む０．１５Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．８）１０μｌに溶解し、１００℃で３分加熱した後、冷却し、５μｌの７．５％（ｗ／ｖ）ノニデットＰ−４０，１．２μｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８），０．３μｌのフェニルメタンスルホフォニルフルオライド，１０．５μｌの水，及び３μｌ（０．７５単位）のリコンビナントＮ−グリカナーゼ（ジェンザイム(Genzyme)社製）を加えた。混合液を３７℃で１２時間インキュベートし、脱グリコシル化反応を行った。
【００９４】
アミノ酸配列分析のためには、SDS-PAGE後、ゲルを染色せずにポリビニリデンフルオリド(polyvinylidene fluoride; PVDF)膜に転写した。この膜をクマシーブルーで染色した。Ｎ−グリカナーゼ消化後のタンパク質のバンド（49および47kDa）および未消化のタンパク質のバンド（75kDa）を膜から切り出して、アミノ酸配列決定に用いた。
【００９５】
一方、Ｃ６ＳＴの内部アミノ酸配列を決定するため、プロテアーゼで部分消化したＣ６ＳＴペプチドの調製を行った。これは、クリーブランドらの方法（Cleveland, D. W., Fischer, S. G., Kirshner, M. W., and Laemmli, U. K.(1977) J. Biol. Chem. 252, 1102-1106）に従って行った。すなわち、精製したタンパク質（30μｇ）を10％ゲルによるSDS-PAGEで分離した。ゲルをクマシーブルーで染色した後、75kDaのタンパク質バンドを切り出して、別の16％ゲルのウェルに挿入した。このウェルに、プロテアーゼＶ８(protease V8、sequencing grade, ベーリンガーマンハイム製)を0.05μｇ／μｇ精製タンパク質の比で含む緩衝液を重層し、SDS-PAGEを開始した。色素の先端が分離ゲルの端に到達した時に電源を切った。30分後、電気泳動を再開した。プロテアーゼ消化により形成したペプチドは、PVDF膜にトランスブロットした。この膜をクマシーブルーで染色した後、19kDaのペプチドバンドを切り出した。
【００９６】
上記のようにして調製した、Ｎ−グリカナーゼ消化後に生じたタンパク質、完全なタンパク質、プロテアーゼＶ８消化後に生じたペプチドをPVDFフィルターに固定化し、アミノ末端のアミノ酸配列を決定した。結果を表１に示す。
【００９７】
【表１】
【００９８】
＜２＞ニワトリ胚由来のＣ６ＳＴ部分ｃＤＮＡのＰＣＲによる増幅
（１）ＰＣＲ用プライマーの作製
上記のようにして決定されたアミノ酸配列に基づいて、ｃＤＮＡライブラリーからＣ６ＳＴｃＤＮＡクローンをＰＣＲにより増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを作製した（表２）。２種類のセンスプライマー（プライマー１ｓ及び２ｓ）は完全なニワトリ胚Ｃ６ＳＴタンパク質（75kDa）から得られたアミノ配列（配列番号５）に基づいてデザインし、アンチセンスプライマー（プライマー3a）はプロテアーゼ消化で得られたペプチド（19kDa）から得られたアミノ酸配列（配列番号６）に基づいてデザインし、各ヌクレオトドプライマーを合成した。
【００９９】
【表２】
【０１００】
なお、プライマー１ｓの５’末端にはHindIII認識配列を含むヌクレオチド配列を、プライマー３ａの５’末端にはEcoRI認識配列を含むヌクレオチド配列を導入した。
【０１０１】
（２）ポリ(A)+RNAの調製
全RNAは、公知の方法(Kim, J. J., and Conrad, H. E. (1976) J. Biol. Chem. 251, 6210-6217、Kim, J. J., and Conrad, H. E. (1977) J.Biol. Chem. 252, 8292-8299、Kim, J. J., and Conrad, H. E. (1980) J. Biol. Chem. 255, 1586-1597)で10％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で11日間培養したニワトリ胚の軟骨細胞(chondrocyte)から、グアニジンチオシアネート／CsCl法(Kingston, R. E., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York)により調製した。得られた全RNAからポリ(A)+RNAを、オリゴ(dT)セルロースカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【０１０２】
（３）ＰＣＲ反応
上記ポリ(A)+RNAを鋳型とし、オリゴヌクレオチド３ａをプライマーとして用いた逆転写反応によりｃＤＮＡ一次鎖を合成した。逆転写反応は、終体積20μｌに１μｇのポリ(A)+RNA、50pmolのオリゴヌクレオチド３ａ、それぞれ500μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、200単位のM-MLV逆転写酵素(ギブコBRL(Gibco BRL)製)、１mM ジチオスレイトール、120単位のRNase インヒビター(宝酒造(株)製)を含む緩衝液を、37℃で60分間インキュベートすることにより行った。
【０１０３】
ＰＣＲ反応は、上記の逆転写反応混合液10μｌ、オリゴヌクレオチド１ｓ及び３ａをそれぞれ50pmol、それぞれ100μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、2.5単位のTaqポリメラーゼ（AmpliTaq polymerase、パーキン−エルマー(Perkin-Elmer)製)を含む反応液（終体積100μｌ）中で行った。増幅反応は、94℃１分間、45℃１分間、55℃３分間からなる反応サイクルを30サイクル行った。
【０１０４】
＜３＞ニワトリ胚由来Ｃ６ＳＴの完全長ｃＤＮＡの取得
（１）ハイブリダイゼーション用プローブの作製
上記ＰＣＲ増幅断片を回収し、HindIIIおよびEcoRIで消化し、プラスミドベクターであるブルースクリプト(Bluescript、ストラタジーン(Stratagene)製)のこれらの制限酵素切断部位にサブクローニングした。サブクローンはＴ３プライマー(T3 primer)もしくはM13-20プライマーを用いた配列決定により確認した。
【０１０５】
cDNAライブラリースクリーニングのための放射性プローブは、上記のＰＣＲ生成物を、［α-32P］dCTP（アマシャム(Amersham)製）およびDNAランダムラベリングキット（宝酒造（株）製）を用いたランダムオリゴヌクレオチドプライムドラベリング法(random oligonucleotide-primed labeling method(Feinberg, A.P., and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6-13)を用いて放射性標識することによって得た。
【０１０６】
（２）ｃＤＮＡライブラリーの構築
次に、Ｃ６ＳＴのコード領域全長を含むｃＤＮＡを得るために、ラムダベクターλｇｔ１１を用いてｃＤＮＡクローニングを行った。
【０１０７】
前記＜２＞（２）と同様にして、ニワトリ胚の軟骨細胞(chondrocyte)からポリ(A)+RNAを調製し、これを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成し、EcoRI消化したλｇｔ１１(EcoRI-digested λｇｔ１１、ファルマシア(Pharmacia)社製)に連結した。ｃＤＮＡの合成とベクターへの連結には、ｃＤＮＡ合成キット（TimeSaver cDNA synthesis kit、ファルマシア社製)を使用した。逆転写反応のプライマーには、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
【０１０８】
ｃＤＮＡが挿入された組換えファージベクターは、インビトロパッケージングキット（Gigapack II packaging extract、ストラタジーン製）を用いてファージ粒子にパッケージした。このファージ粒子を、Escherichia coli Y1088に感染させ、プレートに重層し、プラークを形成させた。こうして得られたファージライブラリーはさらに増幅させることなしに、cDNAスクリーニングに用いた。
【０１０９】
（３）Ｃ６ＳＴｃＤＮＡクローンのスクリーニング
上記のようにして得られたλｇｔ１１cDNAライブラリーのプラーク約５×１０5 個について、スクリーニングを行った。プラークを市販のナイロン膜(Hybond N+ nylon membrane、アマシャム社製)に転写し、製品に添付されている説明書中で推奨されているアルカリ固定法によりファージＤＮＡをナイロン膜に固定した。
【０１１０】
ファージＤＮＡを固定した膜を、50％ホルムアミド、５×SSPE（１×SSPEの組成：10mM NaH2PO4(pH7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA）、５×Denhardt's solution（１×Denhardt's solutionの組成：0.02%フィコール４００、0.02%ポリビニルピロリドン、0.02% BSA）、0.5％ SDS、0.04mg／mlの変性サケ精子DNA、0.004mg／mlの E. coli DNAを含む溶液中で、3.5時間、42℃でプレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、32Ｐ標識したプローブを含む上記と同じ緩衝液中で16時間、42℃で行った。続いて、フィルターを１×SSPE、0.1％ SDS中、次いで0.1×SSPE、0.1％ SDS中で、55℃で洗浄した後、オートラジオグラフィーによりハイブリダイゼーション陽性クローンを検出した。５×105個のプラークから約90個の陽性クローンが得られた。
【０１１１】
（４）ニワトリ胚由来Ｃ６ＳＴｃＤＮＡの塩基配列解析
ハイブリダイゼーション陽性λｇｔ１１クローンから16個の独立クローンを選択し、各々ファージＤＮＡを調製し、ベクターＤＮＡからcDNA挿入断片を単一断片で切り出すEcoRIで切断した。これらのｃＤＮＡ断片をブルースクリプトにサブクローニングした。これらのｃＤＮＡ断片のうち、もっとも長い断片(2.3kb)のヌクレオチド配列を決定した。
【０１１２】
ブルースクリプトにｃＤＮＡをサブクローニングした組換えプラスミドから、欠失クローンをDNA deletion kit（宝酒造（株）製）を用いて既知の方法(Henikoff, S.(1984) Gene 28, 351-359、Yanisch-Perron, C., Viera, J., and Messing, J. (1985) Gene 33, 103-109)により調製した。その際、3'-突出末端を残す制限酵素、及び5'-突出末端を残す制限酵素として、それぞれSacI及びXbaIを用いた。
【０１１３】
得られた欠失クローンを用いて、［α-32Ｐ］dCTP及びＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（Sequenase、U.S.バイオケミカル(U.S. Biochemical)製)を用いたジデオキシチェーンターミネーション法(Sanger, F., Nicklens, S., and Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467)により、両方の鎖のヌクレオチド配列を独立に決定した。
【０１１４】
＜４＞ヒト由来Ｃ６ＳＴｃＤＮＡのクローニング
（１）ハイブリダイゼーション用プローブの作製
前記＜３＞（４）で得られた、ニワトリ胚由来ＣＳ６ＴのｃＤＮＡをランダムプライマーラベル法により［32Ｐ］ｄＣＴＰで標識した cDNAライブラリースクリーニングのための放射性プローブを作成した。すなわち、上記のニワトリｃＤＮＡを、［α-32Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャム(Amersham)製）およびＤＮＡランダムラベリングキット（宝酒造（株）製）を用いたランダムオリゴヌクレオチドプライムドラベリング法(random oligonucleotide-primed labeling method(Feinberg, A.P., and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6-13)を用いて放射性標識することによって得た。
【０１１５】
（２）ヒト由来ｃＤＮＡライブラリー
ヒトＣ６ＳＴのコード領域全長を含むｃＤＮＡを得るために、ラムダベクターλｇｔ１１が組み込まれたヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Clontech）を用いた。
【０１１６】
ｃＤＮＡが挿入された組換えファージベクターは、インビトロパッケージングキット（Gigapack II packaging extract、ストラタジーン製）を用いてファージ粒子にパッケージした。このファージ粒子を、Escherichia coli Y1088に感染させ、プレートに重層し、プラークを形成させた。こうして得られたファージライブラリーはさらに増幅させることなしに、cDNAスクリーニングに用いた。
【０１１７】
（３）Ｃ６ＳＴｃＤＮＡクローンのスクリーニング
ｃＤＮＡクローニングは前記＜３＞（３）と同様にして、λｇｔ１１cDNAライブラリーのプラークから行った。すなわち、プラークを市販のナイロン膜(Hybond N+ nylon membrane、アマシャム社製)に転写し、アルカリ固定法によりファージＤＮＡをナイロン膜に固定した。
【０１１８】
ファージＤＮＡを固定した膜を、50％ホルムアミド、５×SSPE、５×Denhardt's solution、0.5％ SDS、0.04mg／mlの変性サケ精子DNA、0.004mg／mlの E. coli DNAを含む溶液中で、3.5時間、42℃でプレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、32Ｐ標識したプローブを含む上記と同じ緩衝液中で16時間、42℃で行った。続いて、フィルターを１×SSPE、0.1％ SDS中、次いで0.1×SSPE、0.1％ SDS中で、55℃で洗浄した後、オートラジオグラフィーによりハイブリダイゼーション陽性クローンを検出した。
【０１１９】
（４）Ｃ６ＳＴｃＤＮＡの塩基配列解析
上記により得られた陽性λｇｔ１１クローンから独立クローンを選択し、各々ファージＤＮＡを調製し、ベクターＤＮＡからcDNA挿入断片を単一断片で切り出すEcoRIで切断した。これらのｃＤＮＡ断片をブルースクリプトにサブクローニングした。
【０１２０】
ブルースクリプトにｃＤＮＡをサブクローニングした組換えプラスミドから、欠失クローンをDNA deletion kit（宝酒造（株）製）を用いて既知の方法(Henikoff, S.(1984) Gene 28, 351-359、Yanisch-Perron, C., Viera, J., and Messing, J. (1985) Gene 33, 103-109)により調製した。
【０１２１】
得られた欠失クローンを用いて、［α-32Ｐ］ｄＣＴＰ及びＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（Sequenase、U.S.バイオケミカル(U.S. Biochemical)製）を用いたジデオキシチェーンターミネーション法(Sanger, F., Nicklens, S., and Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467)により、両方の鎖のヌクレオチド配列を独立に決定した。こうして決定されたヒトＣ６ＳＴ ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム(open reading frame)に相当するヌクレオチド配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示した。
【０１２２】
決定されたDNA配列について、ジーンワークス コンピュータープログラム(Gene Works computer programs、インテリジェネティクス(IntelliGenetics)製)を用いて解析した。Ｃ６ＳＴｃＤＮＡのオープンリーディングフレームの５’末端部には、２つのイン・フレームのATGコドンが含まれている。最初のATGコドンで始まる単一のオープンリーディングフレーム(open reading frame)からは、479アミノ酸残基からなり、分子量 54,610 のタンパク質が予測される。前記ニワトリＣ６ＳＴとのアミノ酸配列の相同性は７４％であった。特に本発明で得られたヒトＣ６ＳＴにはニワトリ由来のＣ６ＳＴにはみられなかった親水性に富む１７アミノ酸よりなる特異な挿入配列が存在していた（配列番号２のアミノ酸番号114〜130 のアミノ酸配列）。
【０１２３】
（５）ヒト由来Ｃ６ＳＴ発現プラスミドの構築
ヒトＣ６ＳＴｃＤＮＡを発現させるために、発現ベクターにｃＤＮＡ断片を挿入し、組換えプラスミドを構築した。発現ベクターには、哺乳類細胞用発現ベクターｐＣＸＮ２（東京大学の宮崎純一博士により構築され(Niwa, H., Yamamura, K., and Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193-200)、東京都臨床医学総合研究所の橋本康弘博士より恵与された）を用いた。ｐＣＸＮ２は、ストレプトマイシン耐性遺伝子及びペニシリン耐性遺伝子を有し、EcoRI部位に挿入されたＤＮＡ断片をβ−アクチン遺伝子プロモーターにより発現させることができるベクターである。ｐＣＸＮ２のEcoRI部位へ2354bpのcDNA断片（配列番号１に示す塩基配列を含む）を連結させた。E. coli JM109を、この連結反応液を用いて形質転換し、アンピシリンを含むLB プレートに塗布した。形質転換体から組換えプラスミドを回収し、３回のCsCl／エチジウムブロマイド平衡遠心により精製した。ベクターのプロモーターの向きとｃＤＮＡの向きが一致している組換えプラスミドをｐＣＸＮｈＣ６ＳＴ、ｃＤＮＡが逆向きに挿入されている組換えプラスミドをｐＣＸＮｈＣ６ＳＴ２と名付けた。ｃＤＮＡの向きは、BamHIを用いた制限マッピングにより解析した。
【０１２４】
（６）ＣＯＳ−７細胞中でのヒトＣ６ＳＴｃＤＮＡの一過性な発現
ヒトＣ６ＳＴｃＤＮＡの発現の宿主にはＣＯＳ−７細胞を用いた。ＣＯＳ−７細胞（理研細胞バンク(筑波)から入手した）を８×１０5 細胞／皿の密度で直径100 mmの培養皿にまいた。培養液には、ペニシリン(100単位／ml)、ストレプトマイシン(50μｇ／ml)及び10％ウシ胎仔血清(ギブコBRL製）を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を培養皿１枚当たり10ml用い、５vol％ＣＯ2、95vol％空気中で37℃で培養した。
【０１２５】
培養48時間後、ＣＯＳ−７細胞をｐＣＸＮｈＣ６ＳＴもしくはｐＣＸＮｈＣ６ＳＴ２でトランスフェクトした。トランスフェクションは、DEAE-デキストラン法(Aruffo, A.(1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 16.13, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York)により行った。10％のNu serum（低タンパク質濃度の血清代用品：コラボレーティブ・バイオメディカル・プロダクツ(Collaborative Biomedical Products)）を含む予め加温しておいた５mlのDMEMを、10mg／ml DEAE-デキストランと2.5mMクロロキン(chloroquine)溶液を含む0.2ml のＰＢＳ(リン酸緩衝生理食塩水）と混合した。この溶液と15μｇの組換えプラスミドを混合し、その混合液を細胞懸濁液に添加した。
上記細胞を、ＣＯ2インキュベーター中で４時間インキュベートした後、培養液を５mlの10％ジメチルスルホキシドを含むＰＢＳ溶液で置換した。この細胞を室温で２分間放置した後、ジメチルスルホキシド溶液をアスピレートにより除去し、ペニシリン(100単位／ml)、ストレプトマイシン(50μｇ／ml)及び10％ウシ胎仔血清を含む25mlのDMEMを加えた。この細胞を67時間インキュベートした後、DMEMのみで洗浄した。細胞を集めて、培養皿１枚分の細胞当たり1.5mlの0.25M スクロース、10mM Tris-HCl,pH7.2、及び0.5％ Triton X-100中でダウンスホモジナイザー(Dounce homogenizer)によりホモジナイズした。得られたホモジネートを10,000×ｇで20分間遠心し、上清分画中のＣ６ＳＴ活性、コンドロイチン４−スルホトランスフェラーゼ（Ｃ４ＳＴ）活性及びケラタン硫酸スルホトランスフェラーゼ（ＫＳＳＴ）活性を測定した。これらの活性は、硫酸基受容体としてのコンドロイチンまたはケラタン硫酸の存在下または非存在下で測定した。また、発現プラスミドでトランスフェクトしてないＣＯＳ−７細胞についても同様に行った。結果を表３に示す。
【０１２６】
【表３】
【０１２７】
表３に示したように、上記で単離されたｃＤＮＡを正しい方向で発現させる発現ベクターを保持する細胞のＣ６ＳＴ活性及びＫＳＳＴ活性は、ｃＤＮＡが逆向きに挿入された発現ベクターを保持する細胞のそれぞれ約16倍、約20倍であった。これに対して、トランスフェクション細胞のＣ４ＳＴ活性はわずかに増加しただけであった。これらの結果から、単離されたｃＤＮＡがＣ６ＳＴ活性およびＫＳＳＴ活性を持つタンパク質をコードしていることが証明された。
【０１２８】
【発明の効果】
本発明により、ヒト由来のコンドロイチンのN-アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移するコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ（Ｃ６ＳＴ）をコードするＤＮＡ、および該ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片から発現されるポリペプチドが得られる。
【０１２９】
本発明により、ヒト由来のＣ６ＳＴをコードするＤＮＡが得られたので、ヒト由来Ｃ６ＳＴを工業的に使用可能な程度まで大量生産できることが期待される。
このヒト由来Ｃ６ＳＴのＤＮＡ及びＣ６ＳＴ酵素蛋白を用いた医薬用途への利用が期待される。
【０１３０】
【配列表】
【０１３１】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【０１３５】
【０１３６】
【０１３７】
【０１３８】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼ（グリコサミノグリカン硫酸基転移酵素）のポリペプチド、及びそれをコードするＤＮＡに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
コンドロイチン硫酸は、代表的な硫酸化ムコ多糖（グリコサミノグリカン）である。コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）は軟骨に豊富に存在し、軟骨細胞(chondrocyte)の表現型の発現および維持に寄与していると考えられている(Tsukahara, T., Okamura, M., Suzuki, S., Iwata, H., Miura, T., and Kimata, K. (1991) J. Cell Sci. 100, 387-395)。ＣＳＰＧは、また軟骨以外のさまざまな組織中に存在しており、細胞間相互作用に重要な役割を果たしていると考えられる(Kjellen, L., and Lindahl, U. (1991) Annu. Rev. Biochem. 60, 443-475)。
【０００３】
ほ乳類や鳥類の組織に見られる主要なコンドロイチン硫酸は、アセチルガラクトサミン残基の６位または４位に硫酸基を有している。６−硫酸化／４−硫酸化の割合については、次のような知見が得られている。▲１▼軟骨の最終分化に伴い、コンドロイチン６−硫酸／コンドロイチン４−硫酸の比（６／４比）が増加する。▲２▼ラットの皮膚においては、出生後の日齢とともにＣＳＰＧで６／４比が減少する。▲３▼アテローム性動脈硬化症に抵抗性と感受性のハトの品種から得られた各々の動脈平滑筋細胞を比較した結果、ＣＳＰＧ、デルマタン硫酸プロテオグリカン（ＤＳＰＧ）いずれにおいても抵抗性品種ではコンドロイチン４−硫酸が主成分であるが、感受性品種ではコンドロイチン６−硫酸が主である。▲４▼単球性白血病細胞(M1)において、培養条件を細胞増殖、高密度での増殖阻害、マクロファージへの分化誘導が起きる条件へと変化させてみると、増殖、増殖阻害、分化誘導と変化するにつれてＣＳＰＧにおける６／４比が減少し、分化誘導状態ではほとんどコンドロイチン４−硫酸が合成される。▲５▼ヒト正常結腸組織とヒト結腸癌組織を比較した結果、癌組織のＰＧでは正常組織に比べてコンドロイチン６−硫酸とコンドロイチンが増加する。▲６▼マウス骨芽細胞において、石灰化が起きる前後で比較した結果、石灰化後は石灰化前に比べてＤＳＰＧの６／４比が減少する。
▲７▼サル動脈平滑筋細胞の培養培地に血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を添加すると、バーシカン様ＣＳＰＧにおける６／４比がＰＤＧＦ無添加の対照よりも増加する（グリコバイオロジーシリーズ▲１▼ 糖鎖の多様な世界 講談社 第１６４、１６６頁）。
【０００４】
またコンドロイチン硫酸においては、１つの繰り返し２糖単位あたり２つの硫酸基の存在も報告されている。例えば、GlcAβ1→3GalNAc(4,6-bisS)は、継代培養したニワトリ胚軟骨細胞、マウス脾臓細胞を培養して得たコンディションドメディウム添加培地で培養することにより骨髄細胞から分化したマウス肥満細胞、ラット糸球体、器官培養したヒト結腸粘膜の培養液、ラット漿膜肥満細胞、ヒト肺肥満細胞の分泌顆粒、ホルボールミリステートアセテートで活性化されたヒト単球および単球由来のマクロファージ、マウス骨芽細胞、ラット糸球体脈管膜細胞、ナマコ体壁から見つかっている。また非還元末端GalNAc(4,6-bisS)が、ニワトリ胚骨端軟骨およびラット剣状突起軟骨、ニワトリ胚軟骨細胞を培養したときの細胞層から、また非還元末端GalNAc(4,6-bisS)β1→4GlcAβ1→3GalNAc(4,6-bisS)が、ウサギ肺から抽出精製したトロンボモジュリンから見つかっている。さらに、GlcA(2S)-GalNAc(6S)は、マウスリンパ節由来の肥満細胞から見つかっている（グリコバイオロジーシリーズ▲１▼ 糖鎖の多様な世界 講談社 第１６６頁）。
【０００５】
このようなコンドロイチン硫酸の硫酸化のパターンの多様性は、コンドロイチン硫酸の機能の分子的な基盤を反映していると思われる。また、コンドロイチン硫酸の生理活性発現には、硫酸化が重要な役割を果たしていると考えられる。コンドロイチン硫酸の生理活性発現における硫酸化の重要性を考えると、コンドロイチン硫酸の特異的な部位を硫酸化する方法は、コンドロイチン硫酸の生理活性の解析や機能改変に必須であると考えられる。グリコサミノグリカンの糖残基の特異的な部位の硫酸化は、その部位に特異的なスルホトランスフェラーゼにより触媒される。
【０００６】
グリコサミノグリカンのスルホトランスフェラーゼ遺伝子がクローニングされれば、受容体の基質特異性についての情報が得られ、グリコサミノグリカンの構造-機能関係の研究に有用なアプローチを提供すると思われる。グリコサミノグリカンの合成には、さまざまなグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼが関与しているようである。しかしながら、スルホトランスフェラーゼのcDNAのクローニングは困難なものであり、ラットの肝臓、ヘパリン産生細胞系(cell line)、及びマウスの肥満細胞腫からのN-スルホトランスフェラーゼ／N-デアセチラーゼのcDNAがクローニングされているのみである。
【０００７】
本発明者らは、既に3'-ホスホアデノシン5'-ホスホ硫酸からコンドロイチン等のグリコサミノグリカンのN-アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移するコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ（以下「Ｃ６ＳＴ」と略記することもある）を、無血清培地で培養したニワトリの軟骨細胞の培養上清から見かけ上均一に精製した(Habuchi, O., Matsui, Y., Kotoya, Y., Aoyama, Y., Yasuda, Y., and Noda, M. (1993) J. Biol. Chem. 268, 21968-21974)。更に、その部分アミノ酸配列よりオリゴヌクレオチドプライマーを作成し、ニワトリのｃＤＮＡをクローニングし、そのＤＮＡから得られたポリペプチドがＣ６ＳＴ活性を発現することも証明した。また、該酵素が、ケラタン硫酸のガラクトース残基の６位にも硫酸基を転移する活性も有することを見い出した（Fukuta, M., Uchimura. K.,Nakashima, K., Kato, M., Kimata, K., Shinomura, T., and Habuchi, O. (1995) J. Biol. Chem. 270, 18575-18580）。
【０００８】
しかし、医薬品への応用が期待できるヒト由来のコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼのポリペプチドをコードするＤＮＡについては、いまだ知られていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
コンドロイチン硫酸の生理活性発現における硫酸化の重要性を考えると、コンドロイチン硫酸に硫酸基を転移する酵素は、コンドロイチン硫酸の機能解析の研究のみならず、ヒトに好ましい生理活性を有する医薬品の創造を目的としたコンドロイチン硫酸を提供するためにも非常に重要である。さらに、ヒト由来のコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ（Ｃ６ＳＴ）のポリペプチドやそれをコードするＤＮＡが得られれば、コンドロイチン硫酸のＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位低硫酸化（本明細書中で、「低硫酸化」とは硫酸化度が低いことを意味する）、及びケラタン硫酸のガラクトース残基の６位低硫酸化等に起因するヒトの疾患に対する、遺伝子治療を含む医薬あるいは診断薬としての利用が期待される。
【００１０】
すなわち本発明が解決しようとする課題は、ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチド及びその部分ポリペプチド、並びにヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼの少なくとも一部をコードするＤＮＡを提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ニワトリ由来のコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡをクローニングし、該ｃＤＮＡに由来する断片を用いて、ヒトのｃＤＮＡライブラリーより該酵素をコードするｃＤＮＡのクローニングに成功し、ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチド及びその部分ポリペプチド（以下、まとめて「本発明ポリペプチド」ともいう）、並びにヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼの少なくとも一部をコードするＤＮＡ（以下、「本発明ＤＮＡ」ともいう）を提供するに至った。
【００１２】
本発明ポリペプチドは、下記の理化学的性質を有する、ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドを含む。
▲１▼作用：
硫酸基供与体から硫酸基を、グリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移する。
【００１３】
▲２▼ 基質特異性：
コンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移する。
ケラタン硫酸のガラクトース残基の６位に硫酸基を転移する。
【００１４】
▲３▼分子量：
約５００００〜５５０００ダルトン
【００１５】
また、本発明ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を有し、硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基及び／またはガラクトース残基に転移する活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有していてもよいヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドを含む。好ましくは、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を有するヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドである。
【００１６】
さらに、本発明ポリペプチドは、上記のポリペプチドの部分を含むポリペプチドを含む。
本発明ＤＮＡは、上記グリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドの少なくとも一部をコードするＤＮＡである。好ましくは、配列番号２においてアミノ酸番号１〜４７９またはアミノ酸番号２０〜４７９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、さらに好ましくは、配列番号１に示す塩基配列の少なくとも一部またはすべてを有する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を、本発明ポリペプチド、本発明ＤＮＡの順に詳細に説明する。
＜１＞本発明ポリペプチド
本発明ポリペプチドは、下記の理化学的性質を有する、ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドを含む。
【００１８】
▲１▼作用：
硫酸基供与体から硫酸基を、グリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移する。
【００１９】
▲２▼ 基質特異性：
コンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移する。
ケラタン硫酸のガラクトース残基の６位に硫酸基を転移する。
【００２０】
▲３▼分子量：
約５００００〜５５０００ダルトン
【００２１】
なお、上記硫酸基供与体としては３’−ホスホアデノシン ５’−ホスホ硫酸が好ましい。
また、本発明ポリペプチドはII型膜タンパク質であることが好ましい。
【００２２】
上記の分子量は、アミノ酸配列から計算した、ポリペプチドの推定分子量である。この酵素は天然では糖タンパク質であると予想され、糖鎖の付加により上記分子量よりも分子量が増加すると考えられる。
【００２３】
また、II型膜タンパク質とは、アミノ末端側に疎水性の膜貫通ドメインがあり、カルボキシル末端側がゴルジ膜内腔に突き出された形状で生合成されるタンパク質を意味する。
【００２４】
好ましくは、上記▲１▼〜▲４▼の理化学的性質に加え、さらにアミノ酸残基が４６０〜４７９残基である。
また、本発明のポリペプチドは、上記の理化学的性質▲２▼の基質特異性において、コンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位のみでなく、４位にも硫酸基を転移する活性を持ち、コンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移する活性（C6ST活性）と、４位に硫酸基を転移する活性（C4ST活性）との比の値（C6ST活性／C4ST活性）は、１５〜２０程度である。
【００２５】
さらに、本発明ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を有し、硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移する活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有していてもよいヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドを含む。好ましくは、アミノ酸残基の置換、欠失または挿入を含まない、配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を有するヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドである。
【００２６】
このようなアミノ酸残基の置換、欠失または挿入は、配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも一部をコードするＤＮＡに１つ又は２以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を起こすようなヌクレオチドの置換、欠失又は挿入を導入して得られるＤＮＡを発現させることによって得ることができる。ＤＮＡ配列へのヌクレオチドの置換、欠失又は挿入は、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未変異ＤＮＡ配列の相当する部分と入れ換える事により、導入することができる。また、部位特異的変異法（Kramer,W. and Frits,H.J.,Meth. in Enzymol.,154,350 (1987); Kunkel,T.A. et al.,Meth. in Enzymol.,154,367(1987)）などの方法によっても、ＤＮＡ配列に置換、挿入又は欠失を導入することができる。硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移する活性は、例えば、後記の酵素活性測定法によって測定することができ、当業者は活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を容易に識別することができる。
【００２７】
配列番号２に示すアミノ酸配列にはアミノ酸番号２０にメチオニンが含まれており、アミノ酸番号１のメチオニンと共に、いずれも本発明ポリペプチドのＮ末端となる可能性がある。従って、本発明ポリペプチドには、配列番号２に示すアミノ酸配列においてアミノ酸番号１〜４７９及びアミノ酸番号２０〜４７９で表されるアミノ酸配列を有するグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドが包含され、かつ好ましい。さらに、配列番号２に示すアミノ酸配列には、見かけ上NH2-ターミナルシグナルペプチド配列は含まれていないが、NH2-ターミナルシグナルペプチド配列の存在が完全に排除されるものではない。いずれのメチオニンがＮ末端であるにしても、また、NH2-ターミナルシグナルペプチド配列の存在の有無に拘わらず、配列番号２に示すアミノ酸配列は、グリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドを含んでいる。
【００２８】
本明細書において、「配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を有する」とは、これらの観点から、スルホトランスフェラーゼ活性を有する必要かつ最小のポリペプチドのアミノ酸配列を有することを意味するものである。
【００２９】
さらにまた、本発明ポリペプチドは、上記のポリペプチドの部分を含むポリペプチドを含む。ここで、「部分」とは、好ましくは、スルホトランスフェラーゼ活性を有する、抗原性を有する等の何らかの活性ないし機能を有する部分を意味する。このような部分を識別することは当業者であれば容易である。
【００３０】
なお、本発明ポリペプチドは必ずしも単独のポリペプチドでなくてもよく、必要により、融合タンパク質の一部となっていてもよい。例えば、本発明ポリペプチドと、発現に必要な他のポリペプチドを含む融合ポリペプチドが例示される。
【００３１】
上記の本発明ポリペプチドは、後記の本発明ＤＮＡを用いて得ることができる。すなわち、本発明ＤＮＡを保持する細胞を、好適な培地で培養し、グリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼを培地中に生成蓄積させ、その培地からグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼを採取することによって、グリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼを製造することができる。本発明のＤＮＡの発現は、通常タンパク質の製造に用いられる宿主−ベクター系を使用することができるが、ＣＯＳ−７細胞等の哺乳類細胞が好ましい。発現は、本発明のＤＮＡを直接発現させてもよいし、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させてもよい。また、本発明のＤＮＡは全長を発現させてもよいし、一部を部分ペプチドとして発現させてもよい。
【００３２】
上記のようにして製造されたグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドもしくはその部分ポリペプチドまたはこれらと他のタンパク質との融合タンパク質を用いて、グリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼに結合する抗体を調製することができる。抗体の調製は、通常の抗体の調製と同様にして行えばよい。また、常法によってグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼに結合するモノクローナル抗体を調製することもできる。
【００３３】
＜２＞本発明ＤＮＡ
本発明ＤＮＡは、本発明により初めて単離されたヒト由来のＤＮＡであり、上記のヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドの少なくとも一部をコードしている。
【００３４】
すなわち、本発明ＤＮＡは、下記の理化学的性質を有するヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドの少なくとも一部をコードしているＤＮＡを含む。
【００３５】
▲１▼作用：
硫酸基供与体から硫酸基を、グリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移する。
【００３６】
▲２▼ 基質特異性：
コンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移する。
ケラタン硫酸のガラクトース残基の６位に硫酸基を転移する。
【００３７】
▲３▼分子量：
約５００００〜５５０００ダルトン
【００３８】
なお、上記硫酸基供与体としては３’−ホスホアデノシン ５’−ホスホ硫酸が好ましい。
【００３９】
またこのポリペプチドはII型膜タンパク質であることが好ましい。
また上記ポリペプチドは、上記▲１▼〜▲４▼の理化学的性質に加え、さらにアミノ酸残基が４６０〜４７９残基であるものが好ましい。
【００４０】
また、本発明のポリペプチドは、上記の理化学的性質▲２▼の基質特異性において、コンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位のみでなく、４位にも硫酸基を転移する活性を持ち、コンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移する活性（C6ST活性）と、４位に硫酸基を転移する活性（C4ST活性）との比の値（C6ST活性／C4ST活性）は、１５〜２０程度である。
【００４１】
なお、本発明のＤＮＡがコードしているグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼは、コンドロイチンのＮ−アセチルグルコサミン残基の６位に硫酸基を転移する作用をもつことから、「コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ」とも呼ばれることもあり、本明細書中でも「コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ」または単に「Ｃ６ＳＴ」と略記することもある。
【００４２】
本発明ＤＮＡの塩基配列は、前記理化学的性質を有するグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドの少なくとも一部をコードしていれば、その塩基配列は特に限定されない。
【００４３】
また本発明ＤＮＡは、ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドの少なくとも一部をコードするＤＮＡであって、配列番号２に示すアミノ酸配列の全部または一部をコードするＤＮＡを含む。
【００４４】
そして、本発明ＤＮＡがコードするヒト由来のスルホトランスフェラーゼのポリペプチドは、硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移する活性を実質的に害さないアミノ酸残基の置換、欠失、挿入を有するものであってもよい。
【００４５】
本発明のＤＮＡとして具体的には、配列番号２においてアミノ酸番号１〜４７９または２０〜４７９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましい。また本発明ＤＮＡとしてより具体的には、配列番号１に示される塩基配列の少なくとも一部またはすべてを有するＤＮＡが挙げられ、かつ特に好ましい。配列番号１に示す塩基配列には、２０番目のアミノ酸に対応する位置にもメチオニンコドン(ATG)が含まれている。これらのメチオニンコドンのうち、最初のメチオニンコドンが開始コドンである可能性が強いが、他のメチオニンコドンが開始コドンである可能性も残っている。従って、このようなＤＮＡとして具体的には、配列番号１に示す塩基配列における１４７位〜１５８３位の塩基配列を有するＤＮＡ、及び配列番号１に示す塩基配列における２０４位〜１５８３位の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００４６】
なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列のＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含されることは、当業者であれば容易に理解されるところである。これらのＤＮＡのいずれもが本発明ＤＮＡに包含される。
【００４７】
さらに、染色体由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼ遺伝子は、コード領域にイントロンを含むことが予想されるが、そのようなイントロンで分断されているＤＮＡ断片であっても、グリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドの少なくとも一部をコードする限り、本発明のＤＮＡ断片に含まれる。すなわち、本明細書において「コードする」とは、転写時にプロッセッシング等を受けて最終的に目的のポリペプチドを生じ得る塩基配列を有することも包含すると理解されたい。
【００４８】
また、本明細書において「ポリペプチドの少なくとも一部をコードする」とは、好ましくは、スルホトランスフェラーゼ活性を有する、抗原性を有する等の何らかの活性ないし機能を有する部分、あるいは、その部分に相当する塩基配列がそのグルコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼに特異的であってプライマーやプローブとして使用できる部分をコードすることを意味する。
【００４９】
なお、本発明には、本発明ＤＮＡに相補的なＤＮＡまたはＲＮＡが包含される。さらに本発明のＤＮＡは、Ｃ６ＳＴをコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよいし、この一本鎖及びこれと相補的な配列を有するＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とからなる二本鎖であってもよい。
【００５０】
また、本発明のＤＮＡは、Ｃ６ＳＴ全体をコードするコード領域全長を有していてもよいし、Ｃ６ＳＴの一部のペプチドをコードするものであってもよい。
本発明のＤＮＡは、その塩基配列が本発明により明らかにされたので、その配列に基づいて合成し、あるいはその配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法）によってヒト染色体ＤＮＡあるいはｍＲＮＡから本発明ＤＮＡを増幅することによって、取得することも可能である。なお、本発明ＤＮＡは、後記実施例に示すように、以下に示す各工程からなるｃＤＮＡクローニングによって、初めて得られたものである。
【００５１】
（１）ニワトリのＣ６ＳＴのポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニング
▲１▼ニワトリ胚軟骨細胞から精製したＣ６ＳＴの部分アミノ酸配列の決定
▲２▼そのアミノ酸配列に基づいたＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマーの作製
▲３▼ニワトリ胚の軟骨細胞由来のポリ(A)+RNAからのＣ６ＳＴ部分ｃＤＮＡのＰＣＲ法による増幅
▲４▼ニワトリ胚の軟骨細胞由来のｃＤＮＡライブラリーからのＣ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡの選択
【００５２】
（２）ヒト由来のＣ６ＳＴのポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニング
▲１▼上記（１）▲４▼で単離されたｃＤＮＡの塩基配列解析結果に基づくヒトｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング用プローブの作製
▲２▼そのプローブを用いた、ヒト由来のＣ６ＳＴをコードするｃＤＮＡクローンのスクリーニング
▲３▼得られたｃＤＮＡの塩基配列解析
【００５３】
しかし本発明のＤＮＡの製造方法はこれに限定されるものではなく、上記のＰＣＲ法や、他の公知のｃＤＮＡクローニングの手法によっても本発明ＤＮＡを製造することができる。
【００５４】
以下に、本発明のＤＮＡを得る方法を具体的に説明する。
（１）ニワトリＣ６ＳＴの部分アミノ酸配列の決定及びＰＣＲ用プライマーの調製
▲１▼ニワトリＣ６ＳＴの精製
コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼは、ニワトリ胚由来の軟骨細胞等、コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼを発現する培養細胞から、通常のタンパク質の精製方法、及び通常のスルホトランスフェラーゼの精製方法を組み合わせることによって精製することができる。具体的には、J. Biol. Chem. 268,(29),21968-21974,(1993)に記載された方法に従って行うことが好ましい。
尚、スルホトランスフェラーゼ活性の測定法、及び硫酸基を転移する位置を調べる方法は、実施例中の酵素活性測定法に詳述した。
【００５５】
▲２▼ニワトリＣ６ＳＴの部分アミノ酸配列の決定
精製したＣ６ＳＴには糖鎖が結合していることが知られているので、この糖鎖を除去するために精製Ｃ６ＳＴをＮ−グリカナーゼ等の糖鎖分解酵素で消化する。これにより脱グリコシル化されたＣ６ＳＴをSDS-PAGE（SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）等に付して分離し、ポリビニリデンフルオリド(polyvinylidene fluoride; PVDF)膜やニトロセルロース膜等に転写する。この膜をクマシー・ブリリアント・ブルーやアミドブラック等のタンパク質を染色する色素で染色し、Ｎ−グリカナーゼ消化後に形成したタンパク質バンドを切り出して、脱グリコシル化されたＣ６ＳＴのアミノ酸配列決定に用いる。また、Ｃ６ＳＴの内部アミノ酸配列を決定する場合は、脱グリコシル化されたＣ６ＳＴをSDS-PAGE等に付して分離し、ゲルをクマシー・ブリリアント・ブルーやアミドブラックのようなタンパク質を染色する色素で染色し、Ｎ−グリカナーゼ消化後に形成したタンパク質バンドを切り出して断片化に用いる。
【００５６】
断片化の方法は特に限定されないが、プロテアーゼＶ８(protease V8、sequencing grade, ベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)製)等のタンパク質分解酵素を用いることが好ましい。また、切り出したゲルをタンパク質分解酵素に接触させ、その後SDS-PAGE等で分離しても良い。簡便な操作としては、Cleveland, D. W., Fischer, S. G., Kirshner, M. W., and Laemmli, U. K.(1977) J. Biol. Chem. 252, 1102-1106 の方法がある。すなわち、タンパク質バンドを切り出して別のゲルのウェルに挿入し、タンパク質分解酵素を含む緩衝液を、挿入したゲルにのせてSDS-PAGEを行い、色素の先端が分離ゲルに入る前に電源を切ることによって泳動を一時中止し、約30分間酵素消化を行い、その後電気泳動を再開するという方法である。この方法によれば酵素消化と消化後のペプチド断片の分離がワンステップでできるので便利である。プロテアーゼ消化により形成したペプチドはPVDF膜やニトロセルロース膜等に転写する。この膜をクマシー・ブリリアント・ブルーやアミドブラック等のタンパク質を染色する色素で染色した後、ペプチドバンドを切り出す。タンパク質分解酵素消化後に生じたペプチドを含むPVDF膜やニトロセルロース膜等は、公知の方法でペプチドのアミノ末端配列決定を行うことができる。
【００５７】
▲３▼オリゴヌクレオチドプライマーの合成
Ｃ６ＳＴの部分的アミノ酸配列が決定されたら、そのアミノ酸配列に基づいてＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマーを作製することができる。アミノ酸配列のうち、なるべくコドンの縮重の少ない部位を用いるとよい。
【００５８】
このようなプライマーの例として、実施例中の表２に示すような、センスプライマー（プライマー１ｓ，プライマー２ｓ）およびアンチセンスプライマー（プライマー３ａ）があげられる。尚、センスプライマー１ｓはHindIII部位を含む配列を、アンチセンスプライマー３ａはEcoRI部位を含む配列を、それぞれ５’末端に有する。これは、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片をベクターに挿入する操作を簡便にするためである。
【００５９】
以上のニワトリ胚の軟骨細胞由来のＣ６ＳＴの部分的アミノ酸配列の決定とオリゴヌクレオチドプライマーの作成は例えば J. Biol. Chem. 270, 18575-18580 (1995) に記載されている。
【００６０】
（２）Ｃ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡの調製
▲１▼全ＲＮＡの調製
全RNAは、公知の方法(Kingston, R. E., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York 等)で得ることができる。材料は、コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼのｍＲＮＡを発現している材料であれば限定されないが、取扱いの容易さ、および増殖可能な点で培養細胞が好ましい。培養細胞の中でも特にニワトリ胚の軟骨細胞(chondrocyte)が好ましい。軟骨細胞は、公知の方法（Kim, J. J., and Conrad, H. E. (1976) J. Biol. Chem. 251, 6210-6217、Kim, J. J., and Conrad, H. E. (1977) J.Biol. Chem. 252, 8292-8299、Kim, J. J., and Conrad, H. E. (1980) J. Biol. Chem. 255, 1586-1597等)で培養することができる。培地としては、培養細胞が生育可能な培地であれば特に限定されないが、ダルベッコ改変イーグル培地等が通常の培養で良く用いられ、入手も容易であり、なおかつ該培養細胞が生育可能であることから好ましい。
培地のpHは中性域、特にpH7.0に調整することが好ましい。培地には２g/l程度の D-グルコースを加えることが好ましい。また、微生物の生育を防ぐため、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加することが好ましい。また、培地に10％のウシ胎仔血清を加えることが好ましい。
【００６１】
上記のような培地を用い、ローラボトルやガラス製あるいはプラスチック製の培養皿を使用して通常の培養細胞と同様にして培養すれば良い。培養は、炭酸ガスインキュベーター中で行うことが好ましく、インキュベーター中の炭酸ガス濃度が５〜７％、空気が９７〜９３％となるように調整することが好ましい。また、温度は３６〜３８℃程度に調整することが好ましい。
【００６２】
全ＲＮＡは、前述のように培養した培養細胞から通常用いられる全ＲＮＡの調製方法により得ることができるが、グアニジンチオシアネート／CsCl法(Kingston, R. E., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York)で調製するのが好ましい。
【００６３】
▲２▼poly(A)+RNAの調製
poly(A)+RNAは、上記のようにして得られた全RNAから、オリゴdT（oligo-(dT)）セルロースカラムクロマトグラフィーなどによって精製することができる。
【００６４】
▲３▼ＰＣＲ法によるＣ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡの増幅
上記ポリ(A)+RNAを鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーを用いた逆転写ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）により、Ｃ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡを増幅することができる。ＰＣＲは、通常の方法と同様にして行えばよいが、具体的方法を示せば以下の通りである。１μｇのポリ(A)+RNA、50pmolのオリゴヌクレオチド３ａ、それぞれ500μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、200単位のM-MLV逆転写酵素（ギブコＢＲＬ(Gibco BRL)）、１mM ジチオスレイトール、120単位のＲＮａｓｅインヒビター(宝酒造(株)製)を含む緩衝液（終体積20μｌ）を、37℃で60分間インキュベートし、ｃＤＮＡ一次鎖を合成する。次に、上記の逆転写反応混合液10μｌ、オリゴヌクレオチドプライマー（センス、アンチセンスそれぞれ50pmol）、それぞれ100μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、2.5単位のTaqポリメラーゼを含む反応液（終体積100μｌ）に対し、94℃１分間、45℃１分間、55℃３分間からなる反応サイクルを30サイクル行う。
【００６５】
このようにして得られた部分的ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーから完全長ｃＤＮＡ（コード領域全長を含むｃＤＮＡ）をスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして用いられる。
【００６６】
（３）ｃＤＮＡライブラリーの作製
▲１▼cDNAの合成と組換えＤＮＡの作製
cDNAは、poly(A)+RNAを鋳型とした逆転写酵素反応により合成することができる。市販のcDNA合成用キットを用いるのが便利である。例えばTimeSaver cDNA synthesis kit(ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー)を用いると、cDNAの合成、およびcDNAをクローニングベクター（例えばEcoRI消化したλｇｔ１１）に連結させることができる。本発明においてもEcoRI消化したλｇｔ１１を用いることが好ましい。なお、逆転写酵素反応のプライマーとしては、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いることが好ましい。cDNAをクローニングベクターに結合させることによって得られた組換えＤＮＡは、宿主細菌細胞中に導入（トランスフェクション）する。用いる宿主細菌細胞は、用いるクローニングベクターにより選択する必要があるが、通常は大腸菌（エシェリキア・コリ：Escherichia coli(E. coli)）を宿主とするクローニングベクターと大腸菌との組み合わせが頻用されている。
【００６７】
トランスフェクションは、通常、組換えＤＮＡと30mM塩化カルシウムの存在下で細胞膜の透過性を変化させた大腸菌とを混合することにより行われる。λｇｔ１１のようなλファージベクターの場合、組換えＤＮＡを直接塩化カルシウム処理した大腸菌に導入できるが、あらかじめ試験管中でファージ外殻に入れて（in vitroパッケージングという）、大腸菌に効率よく感染させる方法が一般に使用されており、そのためのキットも市販されている（Gigapack II packaging extract、ストラタジーン(Stratagene) 製等)。本発明でもこの方法を用いることが好ましい。
in vitroパッケージングした組換えＤＮＡは、大腸菌にトランスフェクションするが、用いるクローニングベクターによって用いる大腸菌株を選択する必要がある。すなわち、抗生物質耐性遺伝子を含むクローニングベクターを用いる場合は、大腸菌に抗生物質に耐性の性質があってはいけない。また、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）等の遺伝子を含むクローニングベクターを用いる場合は、β−ガラクトシダーゼ活性を発現しない大腸菌を選択する必要がある。このことは、組換えＤＮＡがトランスフェクションされた大腸菌をスクリーニングするために必要なことである。例えば、クローニングベクターにλｇｔ１１を用いる場合、E. coli Y1088等のβ−ガラクトシダーゼ活性を発現しない大腸菌株を選択すれば良い。組換えベクターが導入された大腸菌は、抗生物質に対する耐性の獲得や、β−ガラクトシダーゼ活性の獲得等によりスクリーニングできる。具体的には、大腸菌を寒天培地にまき、生育したコロニーを選択すれば良い。生育した大腸菌（組換えＤＮＡがトランスフェクションされた大腸菌）は、ｃＤＮＡライブラリーを構成する。ベクターにλｇｔ１１を用いた場合は、指示菌とともに軟寒天培地に懸濁し、寒天培地上に重層してプラークを形成させればよい。ＤＮＡ断片が挿入されたベクターを保持するファージプラークは、β−ガラクトシダーゼ活性を発現しないので、容易に選択することができる。
【００６８】
▲２▼Ｃ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡクローニング
次に、上記のようにして得られたｃＤＮＡライブラリーから、Ｃ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡを有するファージクローンを、Ｃ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションにより選択することができる。ハイブリダイゼーションは、通常の方法に従って行えばよい。
【００６９】
選択された陽性クローンから、ファージＤＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断することによって、Ｃ６ＳＴｃＤＮＡを切り出すことができる。得られたｃＤＮＡは、そのまま、あるいは適当なプラスミドにサブクローニングして、塩基配列を決定する。
【００７０】
（４）ヒト由来のＣ６ＳＴのポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニング
▲１▼ハイブリダイゼーション用プローブの作成
上記のようにして得られたヒト以外の生物由来のＣ６ＳＴのｃＤＮＡを用いて、ランダムプライマーラベル法により［32Ｐ］ｄＣＴＰで標識した cDNAライブラリースクリーニングのための放射性プローブを作成できる。すなわち、上記のニワトリｃＤＮＡを、［α-32Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャム(Amersham)製）およびＤＮＡランダムラベリングキット（宝酒造（株）製）を用いたランダムオリゴヌクレオチドプライムドラベリング法(random oligonucleotide-primed labeling method(Feinberg, A.P., and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6-13)を用いて放射性標識ＤＮＡプローブを得ることができる。
【００７１】
▲２▼ヒト由来ｃＤＮＡライブラリーの作成
ヒト由来の組織あるいは細胞から全ＲＮＡを調製し、該全ＲＮＡからpoly(A)+ＲＮＡを調製し、該poly(A)+ＲＮＡを鋳型とした逆転写酵素反応により、ヒト由来ｃＤＮＡは合成することができる。これらは全て、遺伝子工学分野で通常用いられている方法により行うことができる。具体的には、前記（２）及び（３）に記載したのと同様に行ええばよい。
【００７２】
ｃＤＮＡはクローニングベクターに連結する。クローニングベクターは特に限定されないが、例えばEcoRI消化したλｇｔ１１を用いることが好ましい。なお、市販されているクローニングベクターに連結されたヒトｃＤＮＡを用いてもよい。具体的には、ラムダベクターλｇｔ１１が組み込まれたヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Clontech）が好ましい。
【００７３】
▲３▼ヒト由来のＣ６ＳＴをコードするｃＤＮＡクローンのスクリーニング
上記のようにして得られたヒト由来ｃＤＮＡライブラリーから、Ｃ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡを有するファージクローンを上記▲１▼で作成した［32Ｐ］ｄＣＴＰで標識した放射性プローブを用いたハイブリダイゼーションにより選択することができる。ハイブリダイゼーションは遺伝子工学分野で通常用いられる手法、例えばプラークハイブリダイゼーション等により行うことができる。プローブとハイブリッドを形成したプラークは、プローブに結合した標識物質を検出することにより、陽性クローンとして単離することができる。
【００７４】
▲４▼ｃＤＮＡの塩基配列解析
選択された陽性クローンから、ファージＤＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断することによって、Ｃ６ＳＴｃＤＮＡを切り出すことができる。得られたｃＤＮＡは、そのまま、あるいは適当なプラスミドにサブクローニングして、塩基配列を決定することができる。
【００７５】
上記のようにして決定されたヒト由来Ｃ６ＳＴをコードするｃＤＮＡの塩基配列のオープンリーディングフレーム部分を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。最初のATGコドンで始まる単一のオープンリーディングフレームからは、479アミノ酸残基からなり、分子量 54,610 のタンパク質が予想される。
【００７６】
上記のようにして得られるＤＮＡは、このＤＮＡによってコードされるＣ６ＳＴが、硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に転移する活性を実質的に害されない限り、１つ又は２以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を起こすようなヌクレオチドの置換、欠失又は挿入を有していてもよい。ＤＮＡ配列へのヌクレオチドの置換、欠失又は挿入は、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未変異ＤＮＡ配列の相当する部分と入れ換える事により、導入することができる。また、部位特異的変異法（Kramer,W. and Frits,H.J.,Meth. in Enzymol.,154,350 (1987); Kunkel,T.A. et.al.,Meth. in Enzymol.,154,367(1987)）などの方法によっても、ＤＮＡ配列に置換、挿入又は欠失を導入することができる。硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基及び／またはガラクトース残基に転移する活性は、例えば、前記の酵素活性測定法によって測定することができ、当業者は活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を容易に識別することができる。
【００７７】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、この実施例は本発明の一例を示すものであり、これに限定されるものではない。はじめに、実施例中で共通して用いる方法に関して説明する。なお、特記しない限り「％」は重量％である。
【００７８】
１．酵素活性測定法
スルホトランスフェラーゼ活性は次のようにして測定した。反応液組成は以下の通りとした。2.5μmolのイミダゾール−塩酸，pH6.8，1.25μgのプロタミン塩酸、0.1μmolのジチオスライトール、25nmol（グルクロン酸の量として）のコンドロイチン（生化学工業（株））、50pmolの[35S]PAPS（アデノシン３’-リン酸，５’-ホスホ硫酸）、及び酵素を含む50μl。
【００７９】
基質としての種々のグリコサミノグリカンに対する活性は、コンドロイチンの代わりに、25nmol（コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸についてはガラクトサミンの量として、ヘパラン硫酸及びケラタン硫酸についてはグルコサミンの量として）のグリコサミノグリカンを用いて測定した。
【００８０】
反応液を３７℃で２０分インキュベートした後、反応チューブを沸騰水に１分浸けることによって反応を停止させた。反応停止後、0.1μmol（グルクロン酸の量として）のコンドロイチン硫酸Ａをキャリアとして加え、1.3%酢酸カリウムを含むエタノールを３体積加えて、35S-標識された多糖類を沈澱させた。混合液を10,000×gで10分遠心し、得られた沈澱を70μlの水に溶解させた。この溶液50μlを0.1M NH4HCO3で平衡化した脱塩カラムに注入し、35S-標識された多糖類を含む溶出分画を集めた。得られた分画の200μlにシンチレーションカクテル（クリアゾル(Clearsol)、ナカライテスク社製）１mlを加え、35S放射活性を測定することにより、多糖類への35Sの取り込みを測定した。
【００８１】
残りの溶液から400μl取り、1.3%酢酸カリウムを含むエタノール800μlを加えて混合した。混合液を30分氷上に置いた後、10,000×gで10分遠心して35S-多糖類を沈澱させた。沈澱を0.1mg/mlのBSA、0.05Mトリス−酢酸，pH7.5、10ミリユニットのコンドロイチナーゼACII（アースロバクター・アウレッセンス(Arthrobacter aurescens)由来、生化学工業(株)）を含む緩衝液25μlに溶解し、37℃で２時間反応させた。反応物を、0.1μmolづつの2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O-(β-D-グルコ-4-エンピラノシルロン酸)-6-O-スルホ-D-ガラクトース（△Di-6S）、及び2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O-(β-D-グルコ-4-エンピラノシルロン酸)-4-O-スルホ-D-ガラクトース（△Di-4S）（いずれも生化学工業(株)製）とともに、ワットマン(Whatman)No.1濾紙にスポットし、1-ブタノール／酢酸／1M 水酸化アンモニウム（2:3:1(V/V/V)）で20時間展開した。
【００８２】
△Di-6S及び△Di-4Sの位置を紫外線ランプで調べ、それぞれの部位を濾紙から切り出し、１Ｌのトルエンにジフェニルオキサゾール5g、ジメチル１，４−ビス(2-(5-フェニルオキサゾール))ベンゼン0.25gを溶解させたシンチレーターに入れ、放射活性を測定した。コンドロイチナーゼACIIで消化した試料では、濾紙の原点に残った放射活性はスポットした放射活性の1%以下であった。△Di-6S及び△Di-4Sへの35Sの取り込みから、それぞれコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ活性及びコンドロイチン４−トランスフェラーゼ活性を算出した。1pmol硫酸基／分の転移を触媒する活性を１ユニットとした。
【００８３】
様々な基質に対してスルホトランスフェラーゼ活性を測定したところ、以下の実施例の＜１＞で得られたコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ（Ｃ６ＳＴ）は、コンドロイチン、ニワトリ胚軟骨由来のコンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、角膜由来のケラタン硫酸には硫酸基を転移するが、コンドロイチン硫酸Ｅ、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸には硫酸基をわずかにしか転移しないことが示された。なお、本Ｃ６ＳＴは、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸には、そのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転位し、ケラタン硫酸の場合は、そのガラクトース残基の６位に硫酸基を転移することが本発明者らにより確認されている。
【００８４】
次に、本発明ＤＮＡの製造例を説明する。
＜１＞ニワトリ胚由来のコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼの調製およびアミノ酸配列分析
（１）コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼの調製
ニワトリ胚の軟骨細胞を、培養皿に5.6×104 個細胞／皿となるように接種し、２ｇ／ＬのＤ−グルコース、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、10％ウシ胎仔血清（FBS）を含むｐＨ７．０に調整したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で、７ vol％CO2、93 vol％空気、38℃の条件下で11日間培養した。培養開始から２、４、７、９、１０日目に、pH7.4の新鮮な培地に交換した。
【００８５】
１０日目に、FBSを60℃で60分加熱して調製した熱不活化血清を10%含む培地を用いた。１１日目には5.0×106 個細胞／皿にまで生育した。それ以後は、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸ナトリウムを添加したコスメディウム(Cosmedium)−００１（コスモバイオ社から購入）を用い、毎日培地を交換しながら１０日間培養を続けた。
【００８６】
使用したコスメディウム培地を集め、10,000×gで10分遠心し、上清の組成が10mM Tris-HCl,pH7.2、0.1％ Triton X-100、20mM MgCl2、10mM 2-メルカプトエタノール、20％グリセロールとなるように調製した。
【００８７】
上記培養上清を、0.15M NaClを含む緩衝液Ａ(10mM Tris-HCl,pH7.2、0.1％ Triton X-100、20mM MgCl2、2mM CaCl2、10mM 2-メルカプトエタノール、20％グリセロール)で平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂカラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製、2.2×28cm）にアプライした。カラムを0.15M NaClを含む緩衝液Ａで洗浄した後、0.15〜0.75MのＮａＣｌを含む緩衝液Ａの直線グラジエント１Ｌで溶出し、12ml／フラクションで分画した。
【００８８】
スルホトランスフェラーゼ活性を有する分画を集め、0.15MのNaClを含む緩衝液Ａで平衡化したコムギ胚芽アグルチニン−アガロースカラム（生化学工業（株）製、1.2×15cm）にアプライした。カラムを0.15MのNaClを含む緩衝液Ａ200mlで洗浄した後、0.15MのNaCl及び0.3MのＮ−アセチルグルコサミンを含む緩衝液Ａ200mlで溶出した。溶出分画を集め、0.05MのNaClを含む緩衝液Ａに対して透析した。
【００８９】
上記溶出分画を、0.05MのNaClを含む緩衝液Ａで平衡化した3',5'-ADP-アガロースカラム（シグマ社製、1.2×11.8cm、1.9μmol 3',5'-ADP／mlゲル）にアプライした。カラムを0.05MのNaClを含む緩衝液Ａ150mlで洗浄した後、０〜0.2mMの3',5'-ADPを含む0.05M NaClを含む緩衝液Ａの直線グラジエント300mlで溶出した。スルホトランスフェラーゼ活性を有する分画を集め、1M NaClを含む緩衝液Ａ、続いて0.05M NaClを含む緩衝液Ａに対して透析した。
【００９０】
上記精製工程において、前記酵素活性測定法に記載した方法で、スルホトランスフェラーゼ活性を測定した。
その結果、コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼの比活性は4.3×105ユニット／mgであり、コンドロイチン４−スルホトランスフェラーゼ活性／コンドロイチン６−トランスフェラーゼ活性の比は0.02であった。
【００９１】
上記のようにして精製されたＣ６ＳＴは、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを形成し、分子量は75,000と決定された。また、スーパロース12 HR 10/30ゲル濾過クロマトグラフィー（溶出液：10mM Tris-HCl,pH7.2、2M NaCl、20mM MgCl2、2mM CaCl2、0.1% Triton X-100、20％グリセロール）で測定したところ、160,000であった。このことから、2M NaCl存在下ではダイマーを形成していることが示唆された。
【００９２】
また、本Ｃ６ＳＴは、プロタミンおよびMnCl2により活性化された。
上記測定系におけるＣ６ＳＴの至適反応ｐＨはおよそ6.4であった。
【００９３】
（２）ニワトリ胚由来Ｃ６ＳＴのアミノ酸配列分析
精製したＣ６ＳＴをＮ−グリカナーゼで消化した。すなわち、１ｍｌ（タンパク質として１０μｇ）のＣ６ＳＴ溶液に２００μｌのトリクロロ酢酸を加え、氷上に３０分置いた後、１０，０００×ｇで２０分遠心分離した。沈澱を１ｍｌのアセトンで２回洗浄し、真空デシケータで乾燥した。乾燥されたＣ６ＳＴタンパク質を０．５％ ＳＤＳを含む０．１５Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．８）１０μｌに溶解し、１００℃で３分加熱した後、冷却し、５μｌの７．５％（ｗ／ｖ）ノニデットＰ−４０，１．２μｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８），０．３μｌのフェニルメタンスルホフォニルフルオライド，１０．５μｌの水，及び３μｌ（０．７５単位）のリコンビナントＮ−グリカナーゼ（ジェンザイム(Genzyme)社製）を加えた。混合液を３７℃で１２時間インキュベートし、脱グリコシル化反応を行った。
【００９４】
アミノ酸配列分析のためには、SDS-PAGE後、ゲルを染色せずにポリビニリデンフルオリド(polyvinylidene fluoride; PVDF)膜に転写した。この膜をクマシーブルーで染色した。Ｎ−グリカナーゼ消化後のタンパク質のバンド（49および47kDa）および未消化のタンパク質のバンド（75kDa）を膜から切り出して、アミノ酸配列決定に用いた。
【００９５】
一方、Ｃ６ＳＴの内部アミノ酸配列を決定するため、プロテアーゼで部分消化したＣ６ＳＴペプチドの調製を行った。これは、クリーブランドらの方法（Cleveland, D. W., Fischer, S. G., Kirshner, M. W., and Laemmli, U. K.(1977) J. Biol. Chem. 252, 1102-1106）に従って行った。すなわち、精製したタンパク質（30μｇ）を10％ゲルによるSDS-PAGEで分離した。ゲルをクマシーブルーで染色した後、75kDaのタンパク質バンドを切り出して、別の16％ゲルのウェルに挿入した。このウェルに、プロテアーゼＶ８(protease V8、sequencing grade, ベーリンガーマンハイム製)を0.05μｇ／μｇ精製タンパク質の比で含む緩衝液を重層し、SDS-PAGEを開始した。色素の先端が分離ゲルの端に到達した時に電源を切った。30分後、電気泳動を再開した。プロテアーゼ消化により形成したペプチドは、PVDF膜にトランスブロットした。この膜をクマシーブルーで染色した後、19kDaのペプチドバンドを切り出した。
【００９６】
上記のようにして調製した、Ｎ−グリカナーゼ消化後に生じたタンパク質、完全なタンパク質、プロテアーゼＶ８消化後に生じたペプチドをPVDFフィルターに固定化し、アミノ末端のアミノ酸配列を決定した。結果を表１に示す。
【００９７】
【表１】
＜２＞ニワトリ胚由来のＣ６ＳＴ部分ｃＤＮＡのＰＣＲによる増幅
（１）ＰＣＲ用プライマーの作製
上記のようにして決定されたアミノ酸配列に基づいて、ｃＤＮＡライブラリーからＣ６ＳＴｃＤＮＡクローンをＰＣＲにより増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを作製した（表２）。２種類のセンスプライマー（プライマー１ｓ及び２ｓ）は完全なニワトリ胚Ｃ６ＳＴタンパク質（75kDa）から得られたアミノ配列（配列番号５）に基づいてデザインし、アンチセンスプライマー（プライマー3a）はプロテアーゼ消化で得られたペプチド（19kDa）から得られたアミノ酸配列（配列番号６）に基づいてデザインし、各ヌクレオトドプライマーを合成した。
【００９９】
【表２】
なお、プライマー１ｓの５’末端にはHindIII認識配列を含むヌクレオチド配列を、プライマー３ａの５’末端にはEcoRI認識配列を含むヌクレオチド配列を導入した。
【０１０１】
（２）ポリ(A)+RNAの調製
全RNAは、公知の方法(Kim, J. J., and Conrad, H. E. (1976) J. Biol. Chem. 251, 6210-6217、Kim, J. J., and Conrad, H. E. (1977) J.Biol. Chem. 252, 8292-8299、Kim, J. J., and Conrad, H. E. (1980) J. Biol. Chem. 255, 1586-1597)で10％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で11日間培養したニワトリ胚の軟骨細胞(chondrocyte)から、グアニジンチオシアネート／CsCl法(Kingston, R. E., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York)により調製した。得られた全RNAからポリ(A)+RNAを、オリゴ(dT)セルロースカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【０１０２】
（３）ＰＣＲ反応
上記ポリ(A)+RNAを鋳型とし、オリゴヌクレオチド３ａをプライマーとして用いた逆転写反応によりｃＤＮＡ一次鎖を合成した。逆転写反応は、終体積20μｌに１μｇのポリ(A)+RNA、50pmolのオリゴヌクレオチド３ａ、それぞれ500μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、200単位のM-MLV逆転写酵素(ギブコBRL(Gibco BRL)製)、１mM ジチオスレイトール、120単位のRNase インヒビター(宝酒造(株)製)を含む緩衝液を、37℃で60分間インキュベートすることにより行った。
【０１０３】
ＰＣＲ反応は、上記の逆転写反応混合液10μｌ、オリゴヌクレオチド１ｓ及び３ａをそれぞれ50pmol、それぞれ100μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、2.5単位のTaqポリメラーゼ（AmpliTaq polymerase、パーキン−エルマー(Perkin-Elmer)製)を含む反応液（終体積100μｌ）中で行った。増幅反応は、94℃１分間、45℃１分間、55℃３分間からなる反応サイクルを30サイクル行った。
【０１０４】
＜３＞ニワトリ胚由来Ｃ６ＳＴの完全長ｃＤＮＡの取得
（１）ハイブリダイゼーション用プローブの作製
上記ＰＣＲ増幅断片を回収し、HindIIIおよびEcoRIで消化し、プラスミドベクターであるブルースクリプト(Bluescript、ストラタジーン(Stratagene)製)のこれらの制限酵素切断部位にサブクローニングした。サブクローンはＴ３プライマー(T3 primer)もしくはM13-20プライマーを用いた配列決定により確認した。
【０１０５】
cDNAライブラリースクリーニングのための放射性プローブは、上記のＰＣＲ生成物を、［α-32P］dCTP（アマシャム(Amersham)製）およびDNAランダムラベリングキット（宝酒造（株）製）を用いたランダムオリゴヌクレオチドプライムドラベリング法(random oligonucleotide-primed labeling method(Feinberg, A.P., and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6-13)を用いて放射性標識することによって得た。
【０１０６】
（２）ｃＤＮＡライブラリーの構築
次に、Ｃ６ＳＴのコード領域全長を含むｃＤＮＡを得るために、ラムダベクターλｇｔ１１を用いてｃＤＮＡクローニングを行った。
【０１０７】
前記＜２＞（２）と同様にして、ニワトリ胚の軟骨細胞(chondrocyte)からポリ(A)+RNAを調製し、これを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成し、EcoRI消化したλｇｔ１１(EcoRI-digested λｇｔ１１、ファルマシア(Pharmacia)社製)に連結した。ｃＤＮＡの合成とベクターへの連結には、ｃＤＮＡ合成キット（TimeSaver cDNA synthesis kit、ファルマシア社製)を使用した。逆転写反応のプライマーには、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
【０１０８】
ｃＤＮＡが挿入された組換えファージベクターは、インビトロパッケージングキット（Gigapack II packaging extract、ストラタジーン製）を用いてファージ粒子にパッケージした。このファージ粒子を、Escherichia coli Y1088に感染させ、プレートに重層し、プラークを形成させた。こうして得られたファージライブラリーはさらに増幅させることなしに、cDNAスクリーニングに用いた。
【０１０９】
（３）Ｃ６ＳＴｃＤＮＡクローンのスクリーニング
上記のようにして得られたλｇｔ１１cDNAライブラリーのプラーク約５×１０5 個について、スクリーニングを行った。プラークを市販のナイロン膜(Hybond N+ nylon membrane、アマシャム社製)に転写し、製品に添付されている説明書中で推奨されているアルカリ固定法によりファージＤＮＡをナイロン膜に固定した。
【０１１０】
ファージＤＮＡを固定した膜を、50％ホルムアミド、５×SSPE（１×SSPEの組成：10mM NaH2PO4(pH7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA）、５×Denhardt's solution（１×Denhardt's solutionの組成：0.02%フィコール４００、0.02%ポリビニルピロリドン、0.02% BSA）、0.5％ SDS、0.04mg／mlの変性サケ精子DNA、0.004mg／mlの E. coli DNAを含む溶液中で、3.5時間、42℃でプレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、32Ｐ標識したプローブを含む上記と同じ緩衝液中で16時間、42℃で行った。続いて、フィルターを１×SSPE、0.1％ SDS中、次いで0.1×SSPE、0.1％ SDS中で、55℃で洗浄した後、オートラジオグラフィーによりハイブリダイゼーション陽性クローンを検出した。５×105個のプラークから約90個の陽性クローンが得られた。
【０１１１】
（４）ニワトリ胚由来Ｃ６ＳＴｃＤＮＡの塩基配列解析
ハイブリダイゼーション陽性λｇｔ１１クローンから16個の独立クローンを選択し、各々ファージＤＮＡを調製し、ベクターＤＮＡからcDNA挿入断片を単一断片で切り出すEcoRIで切断した。これらのｃＤＮＡ断片をブルースクリプトにサブクローニングした。これらのｃＤＮＡ断片のうち、もっとも長い断片(2.3kb)のヌクレオチド配列を決定した。
【０１１２】
ブルースクリプトにｃＤＮＡをサブクローニングした組換えプラスミドから、欠失クローンをDNA deletion kit（宝酒造（株）製）を用いて既知の方法(Henikoff, S.(1984) Gene 28, 351-359、Yanisch-Perron, C., Viera, J., and Messing, J. (1985) Gene 33, 103-109)により調製した。その際、3'-突出末端を残す制限酵素、及び5'-突出末端を残す制限酵素として、それぞれSacI及びXbaIを用いた。
【０１１３】
得られた欠失クローンを用いて、［α-32Ｐ］dCTP及びＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（Sequenase、U.S.バイオケミカル(U.S. Biochemical)製)を用いたジデオキシチェーンターミネーション法(Sanger, F., Nicklens, S., and Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467)により、両方の鎖のヌクレオチド配列を独立に決定した。
【０１１４】
＜４＞ヒト由来Ｃ６ＳＴｃＤＮＡのクローニング
（１）ハイブリダイゼーション用プローブの作製
前記＜３＞（４）で得られた、ニワトリ胚由来ＣＳ６ＴのｃＤＮＡをランダムプライマーラベル法により［32Ｐ］ｄＣＴＰで標識した cDNAライブラリースクリーニングのための放射性プローブを作成した。すなわち、上記のニワトリｃＤＮＡを、［α-32Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャム(Amersham)製）およびＤＮＡランダムラベリングキット（宝酒造（株）製）を用いたランダムオリゴヌクレオチドプライムドラベリング法(random oligonucleotide-primed labeling method(Feinberg, A.P., and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6-13)を用いて放射性標識することによって得た。
【０１１５】
（２）ヒト由来ｃＤＮＡライブラリー
ヒトＣ６ＳＴのコード領域全長を含むｃＤＮＡを得るために、ラムダベクターλｇｔ１１が組み込まれたヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Clontech）を用いた。
【０１１６】
ｃＤＮＡが挿入された組換えファージベクターは、インビトロパッケージングキット（Gigapack II packaging extract、ストラタジーン製）を用いてファージ粒子にパッケージした。このファージ粒子を、Escherichia coli Y1088に感染させ、プレートに重層し、プラークを形成させた。こうして得られたファージライブラリーはさらに増幅させることなしに、cDNAスクリーニングに用いた。
【０１１７】
（３）Ｃ６ＳＴｃＤＮＡクローンのスクリーニング
ｃＤＮＡクローニングは前記＜３＞（３）と同様にして、λｇｔ１１cDNAライブラリーのプラークから行った。すなわち、プラークを市販のナイロン膜(Hybond N+ nylon membrane、アマシャム社製)に転写し、アルカリ固定法によりファージＤＮＡをナイロン膜に固定した。
【０１１８】
ファージＤＮＡを固定した膜を、50％ホルムアミド、５×SSPE、５×Denhardt's solution、0.5％ SDS、0.04mg／mlの変性サケ精子DNA、0.004mg／mlの E. coli DNAを含む溶液中で、3.5時間、42℃でプレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、32Ｐ標識したプローブを含む上記と同じ緩衝液中で16時間、42℃で行った。続いて、フィルターを１×SSPE、0.1％ SDS中、次いで0.1×SSPE、0.1％ SDS中で、55℃で洗浄した後、オートラジオグラフィーによりハイブリダイゼーション陽性クローンを検出した。
【０１１９】
（４）Ｃ６ＳＴｃＤＮＡの塩基配列解析
上記により得られた陽性λｇｔ１１クローンから独立クローンを選択し、各々ファージＤＮＡを調製し、ベクターＤＮＡからcDNA挿入断片を単一断片で切り出すEcoRIで切断した。これらのｃＤＮＡ断片をブルースクリプトにサブクローニングした。
【０１２０】
ブルースクリプトにｃＤＮＡをサブクローニングした組換えプラスミドから、欠失クローンをDNA deletion kit（宝酒造（株）製）を用いて既知の方法(Henikoff, S.(1984) Gene 28, 351-359、Yanisch-Perron, C., Viera, J., and Messing, J. (1985) Gene 33, 103-109)により調製した。
【０１２１】
得られた欠失クローンを用いて、［α-32Ｐ］ｄＣＴＰ及びＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（Sequenase、U.S.バイオケミカル(U.S. Biochemical)製）を用いたジデオキシチェーンターミネーション法(Sanger, F., Nicklens, S., and Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467)により、両方の鎖のヌクレオチド配列を独立に決定した。こうして決定されたヒトＣ６ＳＴ ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム(open reading frame)に相当するヌクレオチド配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示した。
【０１２２】
決定されたDNA配列について、ジーンワークス コンピュータープログラム(Gene Works computer programs、インテリジェネティクス(IntelliGenetics)製)を用いて解析した。Ｃ６ＳＴｃＤＮＡのオープンリーディングフレームの５’末端部には、２つのイン・フレームのATGコドンが含まれている。最初のATGコドンで始まる単一のオープンリーディングフレーム(open reading frame)からは、479アミノ酸残基からなり、分子量 54,610 のタンパク質が予測される。前記ニワトリＣ６ＳＴとのアミノ酸配列の相同性は７４％であった。特に本発明で得られたヒトＣ６ＳＴにはニワトリ由来のＣ６ＳＴにはみられなかった親水性に富む１７アミノ酸よりなる特異な挿入配列が存在していた（配列番号２のアミノ酸番号114〜130 のアミノ酸配列）。
【０１２３】
（５）ヒト由来Ｃ６ＳＴ発現プラスミドの構築
ヒトＣ６ＳＴｃＤＮＡを発現させるために、発現ベクターにｃＤＮＡ断片を挿入し、組換えプラスミドを構築した。発現ベクターには、哺乳類細胞用発現ベクターｐＣＸＮ２（東京大学の宮崎純一博士により構築され(Niwa, H., Yamamura, K., and Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193-200)、東京都臨床医学総合研究所の橋本康弘博士より恵与された）を用いた。ｐＣＸＮ２は、ストレプトマイシン耐性遺伝子及びペニシリン耐性遺伝子を有し、EcoRI部位に挿入されたＤＮＡ断片をβ−アクチン遺伝子プロモーターにより発現させることができるベクターである。ｐＣＸＮ２のEcoRI部位へ2354bpのcDNA断片（配列番号１に示す塩基配列を含む）を連結させた。E. coli JM109を、この連結反応液を用いて形質転換し、アンピシリンを含むLB プレートに塗布した。形質転換体から組換えプラスミドを回収し、３回のCsCl／エチジウムブロマイド平衡遠心により精製した。ベクターのプロモーターの向きとｃＤＮＡの向きが一致している組換えプラスミドをｐＣＸＮｈＣ６ＳＴ、ｃＤＮＡが逆向きに挿入されている組換えプラスミドをｐＣＸＮｈＣ６ＳＴ２と名付けた。ｃＤＮＡの向きは、BamHIを用いた制限マッピングにより解析した。
【０１２４】
（６）ＣＯＳ−７細胞中でのヒトＣ６ＳＴｃＤＮＡの一過性な発現
ヒトＣ６ＳＴｃＤＮＡの発現の宿主にはＣＯＳ−７細胞を用いた。ＣＯＳ−７細胞（理研細胞バンク(筑波)から入手した）を８×１０5 細胞／皿の密度で直径100 mmの培養皿にまいた。培養液には、ペニシリン(100単位／ml)、ストレプトマイシン(50μｇ／ml)及び10％ウシ胎仔血清(ギブコBRL製）を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を培養皿１枚当たり10ml用い、５vol％ＣＯ2、95vol％空気中で37℃で培養した。
【０１２５】
培養48時間後、ＣＯＳ−７細胞をｐＣＸＮｈＣ６ＳＴもしくはｐＣＸＮｈＣ６ＳＴ２でトランスフェクトした。トランスフェクションは、DEAE-デキストラン法(Aruffo, A.(1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 16.13, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York)により行った。10％のNu serum（低タンパク質濃度の血清代用品：コラボレーティブ・バイオメディカル・プロダクツ(Collaborative Biomedical Products)）を含む予め加温しておいた５mlのDMEMを、10mg／ml DEAE-デキストランと2.5mMクロロキン(chloroquine)溶液を含む0.2ml のＰＢＳ(リン酸緩衝生理食塩水）と混合した。この溶液と15μｇの組換えプラスミドを混合し、その混合液を細胞懸濁液に添加した。
上記細胞を、ＣＯ2インキュベーター中で４時間インキュベートした後、培養液を５mlの10％ジメチルスルホキシドを含むＰＢＳ溶液で置換した。この細胞を室温で２分間放置した後、ジメチルスルホキシド溶液をアスピレートにより除去し、ペニシリン(100単位／ml)、ストレプトマイシン(50μｇ／ml)及び10％ウシ胎仔血清を含む25mlのDMEMを加えた。この細胞を67時間インキュベートした後、DMEMのみで洗浄した。細胞を集めて、培養皿１枚分の細胞当たり1.5mlの0.25M スクロース、10mM Tris-HCl,pH7.2、及び0.5％ Triton X-100中でダウンスホモジナイザー(Dounce homogenizer)によりホモジナイズした。得られたホモジネートを10,000×ｇで20分間遠心し、上清分画中のＣ６ＳＴ活性、コンドロイチン４−スルホトランスフェラーゼ（Ｃ４ＳＴ）活性及びケラタン硫酸スルホトランスフェラーゼ（ＫＳＳＴ）活性を測定した。これらの活性は、硫酸基受容体としてのコンドロイチンまたはケラタン硫酸の存在下または非存在下で測定した。また、発現プラスミドでトランスフェクトしてないＣＯＳ−７細胞についても同様に行った。結果を表３に示す。
【０１２６】
【表３】
表３に示したように、上記で単離されたｃＤＮＡを正しい方向で発現させる発現ベクターを保持する細胞のＣ６ＳＴ活性及びＫＳＳＴ活性は、ｃＤＮＡが逆向きに挿入された発現ベクターを保持する細胞のそれぞれ約16倍、約20倍であった。これに対して、トランスフェクション細胞のＣ４ＳＴ活性はわずかに増加しただけであった。これらの結果から、単離されたｃＤＮＡがＣ６ＳＴ活性およびＫＳＳＴ活性を持つタンパク質をコードしていることが証明された。
【０１２８】
【発明の効果】
本発明により、ヒト由来のコンドロイチンのN-アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移するコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ（Ｃ６ＳＴ）をコードするＤＮＡ、および該ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片から発現されるポリペプチドが得られる。
【０１２９】
本発明により、ヒト由来のＣ６ＳＴをコードするＤＮＡが得られたので、ヒト由来Ｃ６ＳＴを工業的に使用可能な程度まで大量生産できることが期待される。
このヒト由来Ｃ６ＳＴのＤＮＡ及びＣ６ＳＴ酵素蛋白を用いた医薬用途への利用が期待される。
【０１３０】
【配列表】
Claims (11)
- 下記の理化学的性質を有する、ヒト胎児脳由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチド。
（１）作用：硫酸基供与体から硫酸基を、グリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移する。
（２）基質特異性：コンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移する。ケラタン硫酸のガラクトース残基の６位に硫酸基を転移する。
（３）分子量：約５００００〜５５０００ダルトン
（４）アミノ末端側に疎水性の膜貫通ドメインを有する。 - 配列番号２においてアミノ酸番号１〜４７９で表されるアミノ酸配列を有し、硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移する作用を有し、且つコンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移し、ケラタン硫酸のガラクトース残基の６位に硫酸基を転移する活性を有する、ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチド。
- 配列番号２においてアミノ酸番号２０〜４７９で表されるアミノ酸配列を有し、硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移する作用を有し、且つコンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移し、ケラタン硫酸のガラクトース残基の６位に硫酸基を転移する活性を有する、ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチド。
- 配列番号２に示すアミノ酸番号１〜４７９又はアミノ酸番号２０〜４７９で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有し、硫酸基供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移する作用を有し、且つコンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移し、ケラタン硫酸のガラクトース残基の６位に硫酸基を転移する基質特異性を有する、ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチド。
- さらにコンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の４位に硫酸基を転移する活性を有し、且つＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移する活性の、コンドロイチンのＮ−アセチルガラクトサミン残基の４位に硫酸基を転移する活性に対する比が１５〜２０程度である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- II型膜タンパク質である請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドと、発現に必要な他のポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
- 配列番号１において塩基番号１４７〜１５８３で表される塩基配列を有する請求項８に記載のＤＮＡ。
- 配列番号１において塩基番号２０４〜１５８３で表される塩基配列を有する請求項８に記載のＤＮＡ。
- 配列番号２に示す塩基番号１４７〜１５８３又は塩基番号２０４〜１５８３において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を起こすヌクレオチドの置換、欠失又は挿入を有する塩基配列を有する請求項８に記載のＤＮＡ。
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