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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid einer Glycosaminoglycan-Sulfotransferase,
die vom Menschen stammt, und eine DNS die für das Polypeptid kodiert.
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Das
Chondroitin-Sulfat ist ein typisches sulfatiertes Mucopolysaccharid
(Gylcosaminoglycan). Das Chondroitin-Sulfat-Proteoglycan (CSPG)
ist reichlich im Knorpel vorhanden und kommt in Betracht, in der
Expression und der Aufrechterhaltung des Phenotyps der Chondrocyte
(Tsukahara, T., Okamura, M., Suzuki, S., Iwata, H., Miura, T. und
Kimata, K. (1991) J. Cell Sci. 100, 387–395) beteiligt zu sein. Das
CSPG ist außer
im Knorpel auch in verschiedenen Geweben vorhanden und kommt in
Betracht, eine wichtige Rolle für
die interzellularen Interaktionen (Kjellen, L. und Lindahl, U. (1991)
Annu. Rev. Biochem. 60, 443–475)
zu spielen.
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Das
hauptsächlich
in Säugetier-
und Vogelgeweben gefundene Chondroitin-Sulfat weist Sulfatgruppen
an den C-6- oder C-4-Positionen der Acetylgalactosaminreste auf.
Die folgende Kenntnis ist für
das Verhältnis
der 6-Sulfatierung/4-Sulfatierung erhalten worden. (i) Das Verhältnis des
Chondroitin-6-Sulfats/Chrondroitin-4-Sulfats (6/4-Verhältnis) steigt
zusammen mit dem Fortschreiten der endgültigen Differenzierung des Knorpels
an. (ii) Das 6/4-Verhältnis
im CSPG in der Haut von Ratten fällt
zusammen mit dem Verlauf der Tage nach der Geburt ab. (iii) Wenn
das in den arteriellen glatten Muskelzellen vorhandene CSPG und
das Dermatan-Sulfat-Proteoglycan
(DSPG) zwischen einer Arteriosklerose resistenten Taube und einer
Arteriosklerose sensitiven Taube verglichen wird, ist die Hauptkomponente
der erstgenannten Spezies Chondroitin-4-Sulfat, wobei die Hauptkomponente
in der letzteren Spezies Chondroitin-6-Sulfat ist. (iv) Wenn monozytische
Leukämiezellen
(MI) unter der sich sukzessiv verändernden Kulturbedingung kultiviert
werden, um sie für
die Zellproliferation, die Inhibition der Proliferation mit hoher
Dichte und die Induzierung zur Differenzierung zum Makrophagen einzurichten,
fällt das
6/4-Verhältnis in
dem CSPG mit der sich ändernden
Bedingung in der oben definierten Reihenfolge ab, und es wird fast
nur noch Chondroitin-4-Sulfat in dem End-Dif ferenzierungs-Induzierungs-Zustand
produziert. (v) Als ein Ergebnis eines Vergleichs von einem normalen
menschlichen Colon-Gewebe mit einem menschlichen Tumor-Colon-Gewebe, sind
das Chondroitin-6-Sulfat und das Chondroitin im PG in dem Tumorgewebe
erhöht.
(vi) Wenn Maus-Osteoblasten-Zellen vor und nach der Kalzifikation verglichen
werden, ist das 6/4-Verhältnis
des DSPG's in den
Zellen nach der Kalzifikation erniedrigt. (vii) Wenn der aus Blutplättchen stammende
Wachstumsfaktor (PDGF) zu einem Kulturmedium von arteriellen glatten Muskelzellen
eines Affen hinzugefügt
wird, ist das 6/4-Verhältnis
eines Versican ähnlichen
CSPG's verglichen mit
einer Kontrolle ohne Zugabe von PDGF erhöht (Glycobiology Series (I), „Diversified
World of Saccharides", Kodansha,
pp. 164, 166).
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Es
ist auch für
das Chondroitin-Sulfat berichtet worden, dass zwei Sulfat-Gruppen
pro sich wiederholender Disaccharid-Einheit existieren. GlcAβ1-3GalNAc(4,6-bisS)
ist zum Beispiel in subkultivierten embryonalen Hühner-Chondrocyten,
in Mäuse-Mast-Zellen, die
aus knochenmarkähnlichen
Zellen differenziert wurden, die in einem Ergänzungsmedium mit einem aus
Mausmilz-Zellkulturen stammenden konditioniertem Medium kultiviert
wurden, in Ratten-Glomerulus, in Kulturflüssigkeit von organotypischer
kultivierter menschlicher Colon-Mucosa, in Ratten-Serosa-Mastzellen, in sekretorischer
Granula der menschlichen Lungen-Mastzellen, in menschlichen durch
Phorbol-Myristat-Acetat aktivierten Monocyten und von solchen Monocyten
stammenden Makrophagen, in Mäuse-Osteoblasten,
in Ratten-Glomerulus
vaskulären
Membranzellen und in Zellen der Gefäßwand von Seegurken, gefunden
worden. Das GalNAc(4,6-bisS) ist zusätzlich an dem nicht reduzierenden Ende
des Chondroitin-Sulfats aus einem epihysialen embryonalen Hühnerknorpel,
im rattenxiphoiden Knorpelfortsatz und in der durch Kultivieren
von embryonalen Hühner-Chondrocyten
erhaltenen Zellschicht gefunden worden. Des Weiteren ist GalNAc(4,6-bisS)β1-4-GlcAβ1-3GalNac(4,6-bisS)
an dem nicht reduzierenden Ende des Chondroitin-Sulfats vom Thrombomodulin
gefunden worden, das aus einer Kaninchenlunge extrahiert und gereinigt
ist. Darüber
hinaus ist GLcA(2S)-GalNAc(6S)
an dem nicht reduzierenden Ende des Chondroitin-Sulfats aus Mastzellen
gefunden worden, die aus einem Mäuse-Lymphknoten
stammen (Glycobiology Series (I), „Diversified World of Saccharides", Kodansha, p. 166).
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Es
wird in Betracht gezogen, dass die Diversifikation des wie oben
beschriebenen Sulfatierungs-Musters des Chondroitin-Sulfats eine
molekulare Grundlage der Funk tion des Chondroitin-Sulfats wiedergibt.
Es wird auch in Betracht gezogen, dass die Sulfatierung eine wichtige
Rolle in der Expression der physiologischen Aktivitäten des
Chondroitin-Sulfats spielt. In Anbetracht der Bedeutung der Sulfatierung
bei der Expression der physiologischen Aktivitäten des Chondroitin-Sulfats
wird es erwartet, dass ein Verfahren zur Sulfatierung einer speziellen
Stelle eines Chondroitin-Sulfats unentbehrlich ist, um die physiologischen
Aktivitäten
des Chondroitin-Sulfats zu analysieren und dessen Funktion zu modifizieren.
Eine Sulfatierung einer speziellen Stelle eines Zuckerrests eines
Glycosaminoglycans wird durch eine Sulfotransferase, die spezifisch
zu der Stelle ist, katalysiert.
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Wenn
ein Gen einer Sulfotransferase für
das Glycosaminoglycan geklont wird, kann die Information über die
Substratspezifiät,
die den Akzeptor betrifft, erhalten werden, wobei ein nützlicher
Ansatz bereitgestellt wird, um das Verhältnis zwischen der Struktur
und der Funktion des Glycosaminoglycans zu studieren. Es wird angenommen,
dass verschiedene Typen der Glycosaminoglycan-Sulfotransferasen
an der Synthese des Glycosaminoglycans beteiligt sind. Das Klonieren
der cDNS der Sulfotransferase ist jedoch schwierig. Tatsächlich enthalten
diejenigen, die geklont wurden, cDNSn der N-Sulfotransferase/N-Deacetylase
aus der Rattenleber, der Heparin produzierenden Zelllinie und dem
Maus-Mastzell-Tumor.
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Die
vorliegenden Erfinder haben offenbar aus einem Kulturüberstand
von Hühnerchondrocyten,
die in einem serumfreien Medium kultiviert werden, eine homogene
Chondroitin-6-Sulfotransferase (im Folgenden oftmals als „C6ST" abgekürzt) gereinigt,
die die Sulfatgruppe von dem 3'-Phosphoadenosin
5'-Phosphosulfat zu
der C-6-Position des N-Acetylgalactosaminrests des Glycosaminoglycans,
wie z. B. Chondroitin, überträgt (Habuchi,
O., Matsui, Y., Kotoya, Y., Aoyama, Y., Yasuda, Y. und Noda, M.
(1993) J. Biol. Chem. 268, 21968–21974).
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Des
Weiteren haben die vorliegenden Erfinder Oligonukleotid-Primer auf
der Basis der teilweisen Aminosäuresequenz
dieses Enzyms präpariert
und die Hühner-cDNS
mit Hilfe dieser Primer kloniert und haben überprüft, dass die C6ST-Aktivität durch
das aus dieser DNS erhaltene Polypeptid exprimiert wird. Die vorliegenden
Erfinder haben auch herausgefunden, dass dieses Enzym eine Aktivität aufweist,
um die Sulfatgruppe zu der C-6-Position des Galactoserests des Keratansulfats
zu übertragen
(Fukuta, M., Uchimura, K., Nakashima, K., Kato, M., Kimata, K.,
Shinomura, T. und Habuchi, O. (1995) J. Biol. Chem. 270, 18575–18580).
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Da
jedoch bis jetzt eine DNS unbekannt war, die für das Polypeptid der vom Menschen
stammenden Chondroitin-6-Sulfotransferase kodiert, kann die Applikation
dieser für
Pharmazeutika erwartet werden.
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In
Anbetracht der Bedeutung der Sulfatierung bei der Expression der
physiologischen Aktivitäten
des Chondroitin-Sulfats, ist das Enzym, das die Sulfatgruppe zum
Chondroitin-Sulfat transferiert, nicht nur von besonderer Bedeutung,
um eine Studie der Analyse der Funktion des Chondroitin-Sulfats
durchzuführen,
sondern auch, um einen sicheren Typ des Chondroitin-Sulfats bereitzustellen,
um Pharmazeutika zu entwerfen, die bevorzugt für den Menschen physiologische
Aktivitäten
aufweisen. Wenn darüber
hinaus ein vom Menschen stammendes Polypeptid der Chondroitin-6-Sulfotransferase
(C6ST) und eine für
das Polypeptid kodierende DNS erhalten werden, kann dessen medizinische
Anwendbarkeit, einschließlich
der Gentherapie in der Form von Pharmazeutika gegen oder Diagnostika
für menschliche
Erkrankungen, die einer niedrigen Sulfatierung an der C-6-Position
des N-Acetylgalactosaminrests des Chondroitin-Sulfats, einer niedrigen Sulfatierung an
der C-6-Position des Galactoserests des Keratansulfats und dergleichen
(die hierbei verwendete „Niedrigsulfatierung" bedeutet, dass der
Sulfatierungsgrad niedrig ist) zuordenbar sind, erwartet werden.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Der
Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Polypeptid
einer vom Menschen stammenden Glycosaminoglycan-Sulfotransferase
und ein davon teilweises Polypeptid wie auch eine dafür für mindestens
einen Teil der vom Menschen stammenden Glycosaminoglycan-Sulfotransferase
kodierende DNS, bereitzustellen.
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Die
vorliegenden Erfinder haben das Klonieren der für die Hühner-Chondroitin-6-Sulfotransferase
kodierende cDNS durchgeführt
und unter Verwendung eines von dieser cDNS erhaltenen Fragments
waren sie erfolgreich im Klonieren einer cDNS aus der menschlichen
cDNS-Bibliothek, welche für
dieses Enzym kodiert. Die vorliegenden Erfinder haben basierend
auf diesem ein vom Menschen stammendes Polypeptid einer Glycosaminoglycan-Sulfotransferase
und ein davon teilweises Polypeptid (im Folgenden zusammenfassend
als „Polypeptid
der vorliegenden Erfindung" beschrieben)
wie auch eine DNS, die für
mindestens einen Teil der vom Menschen stammenden Glycosaminoglycan-Sulfotransferase
kodiert (im Folgenden auch als „DNS der vorliegenden Erfindung" bezeichnet), bereitgestellt.
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Dementsprechend
ist gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid einer vom Menschen
stammenden und die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften
aufweisende Glycosaminoglycan-Sulfotransferase bereitgestellt:
- (i) Wirkung: Eine Sulfatgruppe wird von einem
Sulfatgruppendonor zu dem N-Acetylgalactosaminrest oder dem Galactoserest
des Glycosaminoglycans übertragen,
- (ii) Substratspezifität:
Die Sulfatgruppe wird zu der Hydroxylgruppenposition an das C-6
des N-Acetylgalactosaminrests des Chondroitins übertragen und die Sulfatgruppe
wird an die Hydroxylgruppenposition an das C-6 des Galactoserests
des Keratansulfats übertragen
und
- (iii) Molekulargewicht: Etwa von 50.000 bis 55.000 Da.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist dort eine vom Menschen
stammende und mindestens einen Teil der in der SEQ ID No: 2 gezeigten
Sequenz aufweisende Glycosaminoglyccan-Sulfotransferase mit oder
ohne einer Substitution, einer Deletion oder einer Insertion einer
oder mehrerer Aminosäurereste
bereitgestellt, welche im Wesentlichen die Aktivität, um die
Sulfatgruppe von einem Sulfatgruppendonor zu dem N-Acetylgalactosaminrest
oder dem Galactoserest des Glycosaminoglycans zu übertragen, nicht
verschlechtert. In einer bevorzugten Ausführung stellt die vorliegende
Erfindung ein vom Menschen stammendes und mindestens einen Teil
der in SEQ ID No: 2 gezeigten Aminosäuresequenz aufweisendes Polypeptid
einer Glycosaminoglycan-Sulfotransferase
bereit.
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Gemäß einem
anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid bereit,
das einen Teil des oben definierten Polypeptids enthält.
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Gemäß einem
noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist dort eine DNS
bereitgestellt, die für
mindestens einen Teil des oben definierten Polypeptids der Glycosaminoglycan-Sulfotransferase
kodiert. Die DNS der vorliegenden Erfindung enthält vorzugsweise eine für die Aminosäuresequenz
kodierende Nukleotidsequenz aufweisende DNS, die durch die von 1
bis 479 oder 20 bis 479 in der SEQ ID NO: 2 nummerierten Aminosäuren dargestellt
ist, und noch bevorzugter eine DNS, die mindestens einen Teil oder
die gesamte in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nukleotidsequenz aufweist.
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Da
eine für
eine vom Menschen stammende Glycosaminoglycan-Sulfotransferase kodierende
DNS erhalten worden ist, kann es erwartet werden, eine vom Menschen
stammende Glycosaminoglycan-Sulfotransferase in ausreichenden Mengen
herzustellen, um das Enzym industriell verfügbar zu machen. Es kann auch die
medizinische Verwendung der Applikation der vom Menschen stammenden
Glycosaminoglycan-Sulfotransferase-cDNS und des C6ST-Enzymproteins
erwartet werden.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung wird nun im Einzelnen in Verbindung mit dem
Polypeptid und der DNS der vorliegenden Erfindung sukzessiv erläutert werden.
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<1> Polypeptid
der vorliegenden Erfindung
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Das
Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthält ein Polypeptid der vom Menschen
stammenden Glycosaminoglycan-Sulfotransferase (im Folgenden auch
als menschliche Glycosaminoglycan-Sulfotransferase bezeichnet) und
weist die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften
auf:
- (i) Wirkung: Eine Sulfatgruppe wird von
einem Sulfatgruppendonor zu einem N-Acetylgalactosaminrest oder
einem Galactoserest des Glycosaminoglycans übertragen,
- (ii) Substratspezifität:
Die Sulfatgruppe wird von der Hydroxylgruppenposition des C-6 des N-Acetylgalactosaminrests
des Chondroitins übertragen,
die Sulfatgruppe wird zu der Hydroxylgruppenposition des C-6 des
Galactoserests des Keratansulfats übertragen und
- (iii) Molekulargewicht: Etwa von 50.000 bis 55.000 Da.
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Der
Sulfatgruppendonor ist vorzugsweise 3'-Phophoadenosin 5'-Phosphosulfat.
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Ein
bevorzugtes Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist ein Typ-II-Membran-Protein.
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Das
oben definierte Molekulargewicht ist ein geschätztes Molekulargewicht eines
Polypeptids, das auf der Basis einer Aminosäuresequenz berechnet ist. Von
diesem Enzym wird erwartet, dass es als Glycoprotein in der Natur
vorkommt und deshalb als ein Ergebnis des Zusatzes einer Zuckerkette
ein größeres Molekulargewicht
als das oben definierte aufweist.
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Das „Typ-II-Membran-Protein" bedeutet ein Protein,
das eine hydrophobe transmembrane Domain an der aminoterminalen
Seite enthält
und welches in einer solchen Gestalt biosynthetisiert ist, dass
das carboxyterminale Ende in das Lumen des Golgi-Körpers hineinragt.
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Das
Polypeptid der vorliegenden Erfindung hat bevorzugt, zusätzlich zu
den wie in (i) bis (iii) oben definierten physikalischen und chemischen
Eigenschaften, 460 bis 479 Aminosäurereste.
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Unter
Berücksichtigung
der oben in (ii) definierten Substratspezifität zeigt das Polypeptid der
vorliegenden Erfindung nicht nur eine Aktivität, um die Sulfatgruppe zu der
C-6-Position des N-Acetylgalactosamins (C6ST-Aktivität) zu übertragen,
sondern zeigt auch eine Aktivität,
um die Sulfatgruppe zu der C-4-Position davon zu übertragen
(C4ST-Aktivität),
und das Verhältnis
der erstgenannten Aktivität
(C6ST-Aktivität)
zu der letzteren Aktivität
(C4ST-Aktivität)
ist etwa 15 bis 20.
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In
einem weiteren Aspekt enthält
das Polypeptid der vorliegenden Erfindung das Polypeptid der menschlichen
Glycosaminoglycan-Sulfotransferase, die optional eine Substitution,
eine Deletion oder eine Insertion einer oder mehrerer Aminosäureresten
aufweisen kann, die im Wesentlichen nicht die Aktivität, um die Sulfatgruppe
von einem Sulfatgruppendonor zu einem N-Acetylgalactosaminrest oder
einem Galactoserest des Glycosaminoglacans zu übertragen, verschlechtert.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung weist vorzugsweise mindestens
einen Teil der Aminosäuresequenz
auf, die nicht weniger als 80% (noch bevorzugter nicht weniger als
90%) Homologie mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz
und noch bevorzugter mindestens einen Teil der in SEQ ID NO: 2 gezeigten
Aminosäuresequenz
aufweist, die keine Substitution, Deletion oder Insertion eines
Aminosäurerests
enthält.
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Eine
solche Substitution, Deletion oder Insertion von Aminosäureresten
kann durch Einführen
eines oder mehrerer Nukleotide, die für eine Substitution, eine Deletion
oder eine Insertion einer oder mehrerer Aminosäureresten in einer DNS verantwortlich
sind, die für
mindestens einen Teil der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenz kodiert,
und dann durch Expression der resultierenden DNS, erhalten werden.
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Eine
Substitution, eine Deletion oder eine Insertion von Nukleotiden
in eine DNS-Sequenz
kann durch das Synthetisieren einer Sequenz, die Restriktions-Enzym-Schnitt-Termini an
beiden Enden aufweist und einen Anteil enthält, der sich über beide
Seiten eines Mutationspunktes erstreckt, gefolgt vom Ersetzen des
korrespondierenden Anteils der nichtmutierten DNS-Sequenz mit der
synthetisierten Sequenz, eingeführt
werden.
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Alternativ
kann eine Substitution, eine Insertion oder eine Deletion gemäß einem
Verfahren, wie z. B. einem ortsspezifischen Mutagenese-Verfahren,
in eine DNS-Sequenz
eingeführt
werden (Kramer, W. und Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350
(1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)).
Die Aktivität,
um eine Sulfatgruppe von einem Sulfatgruppendonor zu einem N-Acetylgalactosaminrests
oder einem Galactoserest eines Glycosaminoglycans zu übertragen,
kann z. B. mit einem unten beschriebenen Enzym-Aktivitäts-Assay
bestimmt werden und infolgedessen kann eine Substitution, eine Deletion
oder eine Insertion einer oder mehrerer Aminosäurereste, die die Aktivität im Wesentlichen
nicht verschlechtern, von Fachleuten leicht erkannt werden.
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Es
ist auch möglich,
einen Teil der Struktur des Polypeptids durch natürliche oder
artifiziale Mutation ohne eine signifikante Änderung der Aktivität des Polypeptids
auszutauschen. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthält ein Polypeptid, das
eine Struktur aufweist, die homologen Varianten des Polypeptids
entspricht, das die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz
aufweist.
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Die
in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz
enthält
Methionin an der Aminosäure
Nr. 20, welches wahrscheinlich mit dem üblichen Methionin an der Aminosäure Nr.
1 den N-Terminus des Peptids der vorliegenden Erfindung ausbildet.
Infolgedessen enthält
das Polypeptid der vorliegenden Erfindung die Polypeptide der Glycosaminoglycan-Sulfotransferase,
die die Aminosäurensequenzen
aufweisen, die durch die von 1 bis 479 und von 20 bis 479 in der
SEQ ID NO: 2 nummerierten Aminosäuren
dargestellt sind, von denen beide besonders bevorzugt sind. Die
NH2-terminale Signal-Peptid-Sequenz ist
offensichtlich in der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz
nicht anwesend, aber die Gegenwart dieser Signal-Peptid-Sequenz
muss nicht immer ausgeschlossen sein. Abgesehen von einem Methionin
gebildeten N-Terminus
und abgesehen davon, ob eine NH2-Terminus-Signal-Peptid-Sequenz
vorliegt oder nicht, enthält
die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz ein Glycosaminoglycan-Sulfotransferase
Polypeptide.
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Auf
diesen Standpunkten basierend, bezieht sich das „mindestens einen Teil der
in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz
aufweisen", auf
die kürzeste
Aminosäuresequenz,
die notwendig für
ein Polypeptid ist, um eine Sulfotransferase-Aktivität aufzuweisen.
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Des
Weiteren enthält
das Polypeptid der vorliegenden Erfindung das Polypeptid, welches
einen Teil der oben definierten Polypeptide enthält. Der hierbei verwendete „Teil" bezeichnet einen
Teil, der irgendeine Aktivität
oder Funktion, wie z. B. eine Sulfotransferase-Aktivität oder eine
Antigenität
aufweist. Ein solcher Teil kann leicht von Fachleuten erkannt werden.
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Das
Polypeptid der vorliegenden Erfindung muss nicht immer als unabhängige Polypeptide
existieren, sondern kann auch einen Teil eines Fusions-Proteins
bilden. Die Fusions-Polypeptide, die genannt werden können, sind
solche, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung zusammen mit
einem oder mehreren für die
Expression benötigten
Polypeptiden enthalten.
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Das
wie oben diskutierte Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann
durch Verwendung der DNS der vorliegenden Erfindung in einer wie
unten beschriebenen Weise präpariert
werden. Die Glycosaminoglycan-Sulfotransferase (C6ST) kann noch
spezieller durch Kultivieren einer Zelle, die eine DNS der vorliegenden Erfindung
enthält,
in einem angemessenen Medium, um es zu ermöglichen, dass C6ST produziert
und in dem Medium akkumuliert wird, und dann durch Sammeln des C6ST's aus dem Medium
präpariert
werden. Die DNS der vorliegenden Erfindung kann mit Hilfe eines
gewöhnlich
für die
Herstellung von Proteinen verwendeten Wirt-Vektor-Systems exprimiert
werden. Säugetierzellen,
wie z. B. COS-7-Zellen, sind bevorzugt. Wie für die Expression der DNS der
vorliegenden Erfindung kann dieses direkt exprimiert werden, oder
es kann als ein Fusions-Protein, das ein anderes Protein enthält, exprimiert
werden. Die DNS der vorliegenden Erfindung kann in ihrer gesamten
Länge exprimiert
werden, oder ein Teil von ihr kann als teilweises Peptid exprimiert
werden.
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Ein
Antikörper
zur Bindung an C6ST kann unter Verwendung des wie unten in einer
Weise erhaltenen beschriebenen C6ST-Polypeptids, dem teilweisen
Polypeptid davon oder einem Fusions-Protein von einem von diesen
mit einem anderen Protein, hergestellt werden. Die Herstellung des
Antikörpers
kann in der gleichen Weise wie die Herstellung eines gewöhnlichen
Antikörpers
durchgeführt
werden. Ein monoklonaler Antikörper
zur Bindung an C6ST kann auch gemäß einem gewöhnlichen Verfahren präpariert
werden.
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<2> DNS
der vorliegenden Erfindung
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Die
DNS der vorliegenden Erfindung ist eine vom Menschen stammende DNS,
die für
mindestens einen Teil des Polypeptids der menschlichen Chondroitin-6-Sulfotransferase
kodiert, und ist zum ersten Mal gemäß der vorliegenden Erfindung
isoliert worden.
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Noch
spezieller enthält
die DNS der vorliegenden Erfindung eine DNS, die für mindestens
einen Teil des Polypeptids der menschlichen C6ST kodiert und die
folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweist.
- (i) Wirkung: Eine Sulfatgruppe wird von einem
Sulfatgruppendonor zu einem N-Acetylgalactosaminrest oder einem
Galactoserest des Glycosaminoglycans übertragen,
- (ii) Substratspezifität:
Eine Sulfatgruppe wird zu der Hydroxylgruppenposition des C-6 des N-Acetylgalacosaminrests
des Chondroitins übertragen,
eine Sulfatgruppe wird zu der Hydroxylgruppenposition des C-6 des
Galactoserests des Keratan-Sulfats übertragen und
- (iii) Molekulargewicht: Etwa von 50.000 bis 55.000 Da.
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Der
Sulfatgruppendonor ist vorzugsweise 3'-Phosphoadenosin 5'-Phosphosulfat.
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Ein
bevorzugtes Polypeptid ist ein Typ-II Membran-Protein.
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Um
zusätzlich
die wie oben in (i) bis (iii) definierten physikalischen und chemischen
Eigenschaften aufzuweisen, sind Polypeptide bevorzugt, die 460 bis
497 Aminosäurereste
aufweisen.
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Im
Hinblick auf die oben in (ii) definierte Substratspezifität hat das
Polypeptid der vorliegenden Erfindung nicht nur eine Aktivität, um eine
Sulfatgruppe zu der C-6-Position
des N-Acetylgalactosamins (C6ST-Aktivität) zu übertragen, sondern weist auch
eine Aktivität,
um eine Sulfatgruppe zu der C-4-Position davon (C4ST-Aktivität) zu übertragen,
und das Verhältnis
der erstgenannten Aktivität
(C6ST-Aktivität)
zu der letzteren Aktivität
(C4ST-Aktivität)
ist etwa 15 bis 20.
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Das
durch die DNS der vorliegenden Erfindung kodierte Enzym weist die
Aktivität
auf, um eine Sulfatgruppe zu der Hydroxylgruppenposition des C-6
des N-Acetylgalactosamins des Chondroitins zu übertragen, und wird infolgedessen
in geeigneter Weise als „Chondroitin-6-Sulfotransferase" benannt. Auch in
dieser Beschreibung wird das Enzym als „Chondroitin-6-Sulfotransferase" oder in abgekürzter Form
als „C6ST" bezeichnet.
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Die
Nukleotid-Sequenz der DNS der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders
eingeschränkt,
vorausgesetzt, dass sie für
mindestens einen Teil des Polypeptids der Glycosaminoglycan-Sulfotransferase
kodiert.
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Die
DNS der vorliegenden Erfindung enthält eine DNS, die für mindestens
einen Teil des Polypeptids der menschlichen Glycosaminoglycan-Sulfotransferase
kodiert, und kodiert für
den gesamten oder einen Teil der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz.
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Und
das durch die DNS der vorliegenden Erfindung kodierte Polypeptid
der menschlichen Glycosaminoglycan-Sulfotransferase kann beliebig
eine Substitution, eine Deletion oder eine Insertion von einem oder mehreren
Aminosäureresten
enthalten, welche die Aktivität,
um eine Sulfatgruppe von einem Sulfatgruppendonor zu einem N-Acetylgalactosaminrest
oder einem Galactoserest des Glycosaminoglycans zu übertragen, im
Wesentlichen nicht verschlechtert.
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Die
DNSn der vorliegenden Erfindung, die speziell genannt werden können, sind
jene, die die für
die Aminosäuresequenzen
kodierenden Nukleotid-Sequenzen aufweisen, die durch die von 1 bis
479 und von 20 bis 479 in der SEQ ID NO: 2 nummerierten Aminosäuren dargestellt
sind, von denen beide besonders bevorzugt sind. In einem anderen
Aspekt ist die DNS der vorliegenden Erfindung besonders eine, die
mindestens einen Teil oder die gesamte der in SEQ ID NO: 1 gezeigten
Nukleotid-Sequenz aufweist. Die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nukleotid-Sequenz
enthält
ein anderes Methionin-Codon (ATG) an der Position, die mit der mit
20 nummerierten Aminosäure übereinstimmt.
Von diesem Methionin-Codon ist das erste Methionin-Codon am geeignetsten,
um ein Initiierungs-Codon zu bilden, aber auch die anderen sind
dazu geeignet, als ein Initiierungs-Codon zu wirken. Dementsprechend
sind die DNSn, die speziell genannt werden können eine DNS, die eine Nukleotid-Sequenz
aufweist, die sich in einem Bereich von 147 bis 1.583 der SEQ ID
NO: 1 erstreckt, eine DNS, die eine Nukleotid-Sequenz aufweist,
die sich in einem Bereich von 204 bis 1.583 der SEQ ID NO: 1 erstreckt,
und dergleichen.
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Die
Fachleute werden leicht verstehen, dass DNSn, die eine unterschiedliche
Nukleotid-Sequenz durch Degenerieren des genetischen Codes aufweise,
auch in der DNS der vorliegenden Erfindung enthalten sind. Solche
DNSn sind alle in der DNS der vorliegenden Erfindung enthalten.
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Darüber hinaus
ist es anzunehmen, dass das chromosomale Glycosaminoglycan-Sulfotransferase-Gen
ein oder mehrere Introns in seiner kodierenden Region enthält.
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Ein
DNS-Fragment kann unter der Voraussetzung, dass es für mindestens
einen Teil eines Polypeptids der Glycosaminoglycan-Sulfotransferase
kodiert, in dem DNS-Fragment
der vorliegenden Erfindung enthalten sein, auch wenn es durch das
Vorhandensein solcher Introns in Segmente aufgeteilt ist. Noch spezieller sollte
es verstanden werden, dass der hierbei verwendete Begriff „Code" bedeutet, dass eine
DNS eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die verschiedenen Prozessen
bei der Transkription unterliegen kann, um letztendlich ein planmäßiges Polypeptid
herzustellen.
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Der
hierbei verwendete Ausdruck „für mindestens
einen Teil eines Polypeptids kodiert" bedeutet, für einen Teil kodieren, der
eine oder mehrere Aktivitäten
oder Funktionen aufweist, wie z. B. eine Sulfotransferase-Aktivität, eine
Antigenität
und dergleichen, oder für
einen Teil kodieren, dessen übereinstimmende
Nukleotid-Sequenz
spezifisch zu der Glycosaminoglycan-Sulfotransferase ist, und dementsprechend
als ein Primer oder eine Sonde verwendbar ist.
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Die
vorliegende Erfindung enthält
des Weiteren eine DNS oder eine RNS, die zu der DNS der vorliegenden
Erfindung komplementär
ist. Die DNS der vorliegenden Erfindung kann eine Einzelstrang-DNS,
die nur einen C6ST-kodierenden Strang umfasst, oder sie kann eine
Doppelstrang-DNS sein, die aus dem Einzelstrang und einer DNS oder
einem RNS-Strang besteht, welche eine komplementäre Sequenz dazu aufweisen.
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Die
DNS der vorliegenden Erfindung kann eine vollständige Länge einer kodierenden Region
aufweisen, die für
die gesamte C6ST kodiert, oder sie kann ein Fragment sein, welches
für ein
Teil-Peptid der C6ST kodiert.
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Die
DNS der vorliegenden Erfindung kann, da dessen Nukleotid-Sequenz
gemäß der vorliegenden
Erfindung bestimmt worden ist, durch Synthetisieren auf der Basis
der Nukleotid-Sequenz oder durch Amplifizieren einer menschlichen
chromosomalen DNS oder RNS gemäß dem PCR-Verfahren
(Polymerase-Ketten-Reaktions-Verfahren) unter Verwendung der auf
der Basis der Sequenz hergestellten Oligonukleotid-Primer erhalten werden.
Wie im Folgenden in den Beispielen diskutiert, ist die DNS der vorliegenden
Erfindung zum ersten Mal mittels der cDNS-Klonierung erhalten worden,
welche die folgenden Schritte umfasst:
-
(1) Klonieren einer cDNS,
die für
ein Hühner-C6ST-Polypeptid
kodiert
-
- (i) Bestimmung einer teilweisen aus einer embryonalen
Hühner-Chondrocyte
gereinigten Aminosäuresequenz
einer C6ST,
- (ii) Herstellung eines Oligonukleotid-Primers für die PCR
auf der Basis der bestimmten Aminosäuresequenz,
- (iii) Amplifikation der teilweisen cDNS der C6ST aus der aus
den embryonalen Hühner-Chondrocyten
stammenden Poly(A)+-RNS gemäß dem PCR-Verfahren
und
- (iv) Screenen der gesamten Länge
der C6ST-cDNS aus einer cDNS-Bibliothek, die aus den embryonalen Hühner-Chondrocyten
stammt.
-
(2) Klonieren der für ein Polypeptid
der menschlichen C6ST kodierenden cDNS
-
- (i) Herstellung einer Sonde zum Screenen einer
menschlichen cDNS-Bibliothek auf der Basis der Ergebnisse der Nukleotid-Sequenz-Analysen
der wie in einer oben in
- (iv) beschriebenen Weise isolierten cDNS,
- (ii) Screenen des cDNS-Klons, der für die menschliche C6ST kodiert,
unter Verwendung der wie in (i) hergestellten Sonde und
- (iii) Nukleotid-Sequenz-Analyse der erhaltenen cDNS.
-
Das
DNS-Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist auf keinen
Fall auf diese oben beschriebenen eingeschränkt, so dass das oben zitierte
PCR-Verfahren oder irgendwelche anderen bekannten cDNS-Klonierungsverfahren
verwendet werden können.
-
Ein
Verfahren, um die DNS der vorliegenden Erfindung zu erhalten, wird
unten speziell erklärt
werden.
-
(1) Bestimmung einer teilweisen
Aminosäuresequenz
einer Hühner-C6ST
und Herstellung von PCR-Primern
-
(i) Reinigung einer Hühner-C6ST
-
Die
Chondroitin-6-Sulfotransferase kann aus kultivierten Zellen, die
dieses Enzym exprimieren, wie z. B. embryonale Hühner-Chondrocyten, unter Verwendung
einer Kombination eines gewöhnlich
bekannten Protein-Reinigungs-Verfahrens und eines gewöhnlich bekannten
Sulfotransferasen-Reinigungs-Verfahrens, gereinigt werden. Vorzugsweise
kann die wie in J. Biol. Chem. 268, (29), 21968–21974 (1993) beschriebene
Reinigung durchgeführt
werden. Ein Verfahren zum Messen der Aktivität der Sulfotransferase und
ein Verfahren zum Bestimmen der Position einer übertragenen Sulfatgruppe sind
detailliert unter der Überschrift „Enzym-Aktivitäts-Assay" am Anfang der Beschreibung
der Beispiele beschrieben.
-
(ii) Bestimmung der teilweisen
Aminosäuresequenz
der Hühner-C6ST
-
Es
ist bekannt, dass eine Zuckerkette an der gereinigten C6ST gebunden
ist. Um die Zuckerkette zu entfernen, wird die gereinigte C6ST mit
einem Enzym, wie z. B. einer N-Glycanase, verdaut. Die resultierende deglycosylierte
C6ST wird einem Trennungs-Verfahren, wie z. B. einer SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese) unterzogen,
worauf die Übertragung
auf eine Polyvinyliden-Fluorid(PVDF)-Membran,
eine Nitrozellulose-Membran oder dergleichen folgt. Die Membran
wird mit einem Farbstoff zum Färben
von Proteinen, wie z. B. Coomassie-Brilliant-Blau oder Amido-Black, gefärbt. Eine
nach dem Verdau mit der N-Glycanase gebildete Proteinbande wird
ausgeschnitten und sie wird für
das Bestimmen einer Aminosäuresequenz
der deglycosylierten C6ST verwendet. Für den Fall der Bestimmung einer
inneren Aminosäuresequenz
der C6ST ist es notwendig, dass die deglycosylierte C6ST einem Trennungsprozess,
wie z. B. einem SDS-PAGE oder dergleichen, unterzogen wird. Das
Gel wird mit einem Farbstoff zum Färben von Proteinen, wie z.
B. Coomassie-Brilliant-Blau oder Amido-Black, gefärbt. Eine
nach dem Verdau mit einer N-Glycanase gebildete Proteinbande wird
ausgeschnitten und sie wird für
die Fragmentierung verwendet.
-
Das
Fragmentierungsverfahren ist nicht besonders eingeschränkt, aber
es wird bevorzugt mit der Hilfe eines proteolytischen Enzyms, wie
z. B. einer Protease V8 (Sequenzierungsqualität, hergestellt von Boehringer
Mannheim) durchgeführt.
Alternativ kann das ausgeschnittene Gel dem proteolytischen Enzym
ausgesetzt werden, gefolgt durch das Trennen mittels einer SDS-PAGE
oder dergleichen. Ein geeignetes Verfahren, das genannt werden kann,
ist ein von Cleveland, D. W., Fischer, S. G., Kirshner, M. W. und
Laemmli, U. K. (1977) in J. Biol. Chem. 252, 1102–1106, beschriebenes
Verfahren. Kurz dargestellt, umfasst dieses Verfahren die Schritte
des Ausschneidens einer Proteinbande, dessen Einführen in
die Tasche eines anderen Gels, Auftragen eines Puffers, der ein
proteolytisches Enzym enthält,
auf das eingelegte Gel, um eine SDS-PAGE durchzuführen, zeitweiliges
Stoppen der Elektrophorese durch das Ausschalten der Energiequelle
bevor ein voranlaufendes Ende eines Farbstoffs in ein Trenngel eintritt,
Durchführen
eines enzymatischen Verdaus für
etwa 30 Minuten und dann erneutes Starten der Elektrophorese. Dieses
Verfahren ist daher günstig,
da der enzymatische Verdau und die Trennung der erhaltenen Peptid-Fragmente
nach dem Verdau in einem Einschrittverfahren durchgeführt werden
können.
Die durch den Verdau mit der Protease gebildeten Peptide werden
auf eine PVDF-Membran, eine Nitrozellulose-Membran oder dergleichen übertragen.
Die Membran wird mit einem Farbstoff zum Färben von Proteinen, wie z.
B. Coomassie-Brilliant-Blau oder Amido-Black, gefärbt. Danach werden
die Peptidbanden ausgeschnitten. Die PVDF-Membran, die Nitrozellulose-Membran oder dergleichen, welche
die nach dem Verdau mit dem proteolytischen Enzym erzeugten Peptide
enthalten, können
mit dem bekannten Verfahren behandelt werden, um die aminoterminalen
Sequenzen der Peptide zu bestimmen.
-
(iii) Synthese der Oligonukleotid-Primer
-
Sobald
die teilweise Aminosäuresequenz
der C6ST bestimmt ist, können
die Oligonukleotid-Primer für die
PCR auf der Basis der Aminosäuresequenz
hergestellt werden. Es ist bevorzugt eine Region zu verwenden, in
der die Aminosäuresequenz
eine möglichst
geringe Degeneration aufweist.
-
Beispiele
für solche
Primer sind die nachstehend in den folgenden Beispielen in Tabelle
2 gezeigten „Sense"-Primer (Primer-1s
und Primer-2s) und ein „Anti-Sense"-Primer (Primer-3a). Der Sense-Primer-1s
und der Anti-Sense-Primer-3a weisen eine Sequenz auf, die jeweils
eine HindIII-Stelle und eine EcoRI-Stelle am entsprechenden 5'-Ende enthalten.
Diese erlauben noch günstiger
die Handhabung des Inserierens eines PCR-amplifizierten DNS-Fragments
in einen Vektor.
-
Die
Bestimmung einer teilweisen, von einer embryonalen Hühner-Chondrocyte
abgeleiteten, Aminosäuresequenz
der C6ST und die Synthese der Oligonukleotid-Primer für eine PCR
sind in den Dokumenten, wie z. B. J. Biol. Chem. 270, 18575–18580 (1995)
offengelegt.
-
(2) Herstellung einer
teilweisen cDNS der C6ST
-
(i) Herstellung einer
Gesamt-RNS
-
Eine
Gesamt-RNS kann entsprechend einem bekannten Verfahren (z. B., Kingston,
R. E., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl.
14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,
New York) erhalten werden. Das Material zur Herstellung einer Gesamt-RNS
ist nicht besonders eingeschränkt,
vorausgesetzt, dass die mRNS der Chondroitin-6-Sulfotransferase
in dem Material exprimiert wird. Zelllinien werden jedoch bevorzugt,
da sie einfach zu handhaben sind und sie im Stande sind zu proliferieren. Unter
den Zelllinien sind besonders Hühner-Embryo-Chondrocyten
bevorzugt. Die Chondrocyten können
entsprechend einem bekannten Verfahren (z. B. Kim. J. J. and Conrad,
H. E. (1976) J. Biol. Chem. 251, 6210–6217; Kim. J. J. and Conrad,
H. E. (1977) J. Biol. Chem. 252, 8292–8299; Kim. J. J. and Conrad,
H. E. (1980) J. Biol. Chem. 255, 1586–1597) kultiviert werden. Das
Medium ist nicht besonders eingeschränkt, vorausgesetzt, dass die
Zelllinien in dem Medium wachsen können. Jedoch wird Dulbecco's Modified-Eagle's Medium bevorzugt,
da es gut in einer gewöhnlichen
Kultur verwendbar ist, es ist leicht erhältlich und es ermöglicht den
Zelllinien darin zu wachsen.
-
Das
Medium wird bevorzugt auf einem pH in einem neutralen Bereich, speziell
auf pH 7,0 eingestellt. Bevorzugt wird D-Glucose in einer Menge
von etwa 2 g/l dem Medium hinzugefügt. Um das Wachstum von Mikroorganismen
zu verhindern, werden bevorzugt Antibiotika, wie z. B. Penicillin
und Streptomycin, dem Medium hinzugefügt. Fetales Rinderserum wird
bevorzugt in einer Menge von 10% dem Medium hinzugefügt.
-
Die
Zellen können
in der gleichen Weise wie bei gewöhnlichen Zelllinien unter Verwendung
des oben beschriebenen Mediums und unter Verwendung von Roller-Flaschen
oder aus Glas oder Plastik hergestellten Kulturschalen kultiviert
werden. Die Zellen werden bevorzugt in einem Kohlendioxidgas-Inkubator
kultiviert. Die Konzentration des Kohlendioxidgases wird bevorzugt
auf 5 bis 7% eingestellt und die Luft in dem Inkubator wird bevorzugt
auf 97 bis 93% eingestellt. Die Temperatur wird bevorzugt auf etwa
36 bis 38°C
eingestellt. Die Gesamt-RNS kann aus den wie oben be schriebenen
kultivierten Zellen entsprechend einem Verfahren erhalten werden,
das gewöhnlich
für die
Herstellung von Gesamt-RNS verwendet wird. Die Gesamt-RNS wird jedoch
bevorzugt entsprechend einem Guanidin-Thiocyanat/CsCl-Verfahren
(Kingston, R. E., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology,
Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,
New York) hergestellt.
-
(ii) Herstellung einer
Poly(A)+-RNS
-
Eine
Poly(A)+-RNS aus der, wie oben beschrieben,
erhaltenen Gesamt-RNS kann zum Beispiel mittels einer Oligo-(dT)-Zellulose-Säulenchromatographie
gereinigt werden.
-
(iii) Amplifikation der
teilweisen cDNS der C6ST durch ein PCR-Verfahren
-
Eine
teilweise cDNS der C6ST kann entsprechend einer reversen Transkriptions-PCR (Polymerase Kettenreaktion)
unter Verwendung der oben erhaltenen Poly(A)+RNA
als ein Template und unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer
amplifiziert werden. Die PCR kann in einer üblich bekannten Weise und gemäß dem im
Folgenden spezifizierten Verfahren durchgeführt werden:
-
Ein
Puffer (Endvolumen 20 μl)
der die Poly(A)+-RNS (1 μg) enthält, ein Oligonukleotid-3a (50
pmol), vier unterschiedliche Deoxynukleosid-Triphosphate (jedes
500 μm),
M-MLV-Reverse-Transkriptase (200 Units, hergestellt von Gibco BRL),
Dithiothreitol (1 mM) und ein RNase-Inhibitor (120 Units, hergestellt
von Takara Shuzo) werden bei 37°C
für 60
Minuten inkubiert, um einen primären
cDNS-Strang zu synthetisieren. Danach wird eine Reaktionslösung (Endvolumen:
100 μl),
die die oben definierte Reaktionsmischung für die reverse Transkriptase
(10 μl),
die Oligonukleotid-Primer (50 pmol jeder der Sense- und der Anti-Sense-Primer),
vier unterschiedliche Deoxynukleosid-Triphophate (jedes 100 μM) und eine
Taq-Polymerase (2,5 Units) enthält, dem
Amplifikations-Zyklus unterzogen. Jeder Zyklus setzt sich aus einer
Minute bei 94°C,
einer Minute bei 45°C
und drei Minuten bei 55°C
zusammen, und dieser Zyklus wird 30 Mal wiederholt.
-
Die
so erhaltene teilweise cDNS kann als eine Hybridisierungs-Sonde
zum Screenen einer gesamten Länge
einer cDNS (eine cDNS die die Gesamtlänge einer kodierenden Region
enthält)
aus einer cDNS-Bibliothek verwendet werden.
-
(3) Herstellung einer
cDNS-Bibliothek
-
(i)
Synthese einer cDNS und Herstellung einer rekombinanten DNS Eine
cDNS kann mittels einer reversen Transkriptase-Reaktion unter Verwendung
einer Poly(A)+-RNS als ein Template synthetisiert
werden. Es ist günstig,
ein kommerziell erhältliches
Kit für
eine cDNS-Synthese zu verwenden. Es ist z. B. möglich, unter Verwendung eines
TimeSaver-cDNS-Synthese-Kits (Pharmacia LKB Biotechnology) eine
cDNS zu synthetisieren und die cDNS in einem Klonierungsvektor (z.
B. EcoRI-geschnittenen λgt11)
zu ligieren. Auch in der vorliegenden Erfindung wird es bevorzugt,
einen EcoRI-geschnittenen λgt11
zu verwenden. Bezüglich
des Primers für
die reverse Transkriptase-Reaktion wird es bevorzugt, ein Random-Oligonukleotid-Primer
zu verwenden. Eine durch die Ligierung der cDNS in einem Klonierungsvektor
erhaltene rekombinante DNS wird in bakterielle Wirtszellen eingeführt (Transfektion).
Die bakteriellen Wirtszellen sollten in Abhängigkeit von dem ausgesuchten
Klonierungsvektor ausgesucht werden. Und eine Kombination von Escherichia
coli (E. coli) und einem Klonierungsvektor, der E. coli als einen
Wirt verwendet, wird am häufigsten
verwendet.
-
Die
Transfektion wird gewöhnlich
durch Mischen der rekombinanten DNS mit dem E. coli durchgeführt, bei
dem die Permeabilität
der Zellmembran durch die Gegenwart von 30 mM Kalziumchlorid verändert worden ist.
In dem Fall eines λ-Phagen-Vektors,
wie z. B. einem λgt11,
kann die rekombinante DNS direkt in den Kalziumchlorid behandelten
E. coli eingeführt
werden.
-
Bei
einem gewöhnlich
verwendeten Verfahren wird jedoch eine rekombinante DNS vorher in
vitro in die Außenhülle des
Phagens (als „in
vitro-Verpackung" bezeichnet)
eingekapselt, so dass der E. coli effizient damit infiziert wird.
Auch für
diesen Zweck ist ein Kit kommerziell erhältlich (z. B. Gigapack II-Verpackungs-Extrakt,
hergestellt von Stratagene). Auch bei der vorliegenden Erfindung
wird dieses Verfahren bevorzugt.
-
Eine
in vitro verpackte rekombinante DNS wird in E. coli transfiziert.
Ein geeigneter E. coli-Stamm sollte in Abhängigkeit von einem verwendeten
Klonierungsvektor ausgesucht werden. Wenn ein Klonierungsvektor
verwendet wird, der ein antibiotisches Resistenzgen enthält, kann
nämlich
ein entsprechend zu diesem Antibiotikum resistenter E. coli nicht
verwendet werden. Wenn ein Klonierungsvektor verwendet wird, der
ein Gen, wie z. B. ein β-Galactositdase-Gen
(lacZ) enthält,
ist es notwendig einen E. coli-Stamm auszuwählen, der keine β-Galactosidase-Aktivität exprimiert.
Dieses ist erforderlich, um einen mit einer rekombinanten DNS transfizierten
E. coli zu screenen. Wenn z. B. λgt11
als ein Klonierungsvektor verwendet wird, ist es angemessen einen E.
coli-Stamm, wie z. B. einen E. coli Y1088, auszuwählen, der
keine β-Galactosidase-Aktivität exprimiert.
Der mit einem rekombinanten Vektor transformierte E. coli kann auf
der Basis einer zu einem Antibiotikum erworbenen Resistenz und einer
erworbenen β-Galactosidase-Aktivität gescreent
werden. Noch spezieller werden die E. coli-Zellen auf ein Agar-Medium
platiert und die gewachsenen Kolonien können ausgewählt werden. Die gewachsenen
E. coli-Kolonien (E. coli mit der rekombinanten DNS transfiziert)
bilden eine cDNS-Bibliothek. Wenn λgt11 als ein Vektor verwendet
wird, kann er in einem Soft-Agar-Medium zusammen mit Indikator-Bakterien-Zellen
suspendiert werden und die Suspension kann in einer dünnen Schicht
auf ein Agar-Medium aufgetragen werden, um Plaques zu formen. Die
den Vektor enthaltenen Phagen-Plaques mit dem inserierten DNS-Fragment
exprimieren keine β-Galactosidase-Aktivität und können somit
leicht selektiert werden.
-
(ii) Klonieren der gesamten
cDNS-Länge
der C6ST
-
Als
nächstes
kann ein Phagen-Klon, der die gesamte cDNS-Länge der C6ST enthält mittels
einer Hybridisierung unter Verwendung einer partiellen C6ST-cDNS
als eine Sonde aus der, wie oben beschrieben, erhaltenen cDNS-Bibliothek
selektiert werden. Die Hybridisierung kann entsprechend einem gewöhnlichen
Verfahren durchgeführt
werden.
-
Die
C6ST-cDNS kann durch Präparieren
einer Phagen-cDNS aus dem selektierten positiven Klon und durch
Schneiden der Phagen-DNS mit einem geeigneten Restriktionsenzym
ausgeschnitten werden. Die erhaltene cDNS kann als solche oder nach dem
Subklonieren in ein geeignetes Plasmid verwendet werden, um die
Nukleotid-Sequenz
zu bestimmen.
-
(4) Klonieren der cDNS,
die für
das menschliche C6ST-Polypeptid kodiert
-
(i) Herstellung der Hybridisierungs-Sonden
-
Die
wie oben beschriebene erhaltene nicht-menschliche C6ST-cDNS kann
der Random-Primer-Markierung mit einem [α-32P]-dCTP
unterzogen werden, um eine radioaktive für das Screenen der cDNS-Bibliothek verwendbare
Sonde zu erhalten. Kurz dargestellt, kann die oben genannte Hühner-cDNS
zusammen mit einem [α-32P]-dCTP
(erhältlich
von Amersham) und einem DNS-Random-Markierungs-Kits (erhältlich von
Takara Shuzo Inc.) einem Random-Oligonukleotid-Primed-Markierungs-Verfahren (Feinberg,
A. P. und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6–13) unterzogen
werden, um eine radioaktiv markierte DNS-Sonde zu erhalten.
-
(ii) Errichtung einer
menschlichen cDNS-Bibliothek
-
Menschliche
Gewebe oder Zellen können
behandelt werden, um eine Gesamt-RNS herzustellen, die dann verarbeitet
werden kann, um eine Poly(A)+-RNS zu präparieren.
Die menschliche cDNS kann durch die reverse Transkriptase-Reaktion
unter Verwendung der Poly(A)+-RNS als ein
Template synthetisiert werden. Jeder Arbeitsvorgang kann entsprechend
mit irgendeinem gewöhnlich
in der Gentechnik verwendeten Verfahren durchgeführt werden. Noch spezieller
können
diese Arbeitsvorgänge
in einer Weise durchgeführt
werden, die der oben in den Abschnitten (2) und (3) beschriebenen ähnelt.
-
Die
cDNS wird in einen Klonierungs-Vektor ligiert. Ein geeigneter Klonierungs-Vektor
enthält
einen EcoRI verdaubaren λgt11,
ist aber nicht auf diesen eingeschränkt. Alternativ kann eine kommerziell
erhältliche menschliche
cDNS, die in einen Klonierungs-Vektor ligiert ist, verwendet werden.
Eine menschliche fetale Hirn-cDNS-Bibliothek (erhältlich von
Clontech), die einen λ-Vektor λgt11 integriert,
wird besonders bevorzugt.
-
(iii) Screenen des für die menschliche
C6ST codierenden cDNS-Klons
-
Unter
der, wie oben beschrieben, erhaltenen menschlichen cDNS-Bibliothek
kann ein Phagen-Klon, der die gesamte Länge der C6ST-cDNS beherbergt,
durch eine Hybridisierung unter Verwendung der [α-32P]-dCTP-markierten
radioaktiven Sonde, die entsprechend mit dem oben beschriebenen
(i) Verfahren hergestellt wird, ausgewählt werden.
-
Die
Hybridisierung kann durch übliche
in der Gentechnik verwendete Techniken, wie z. B. der Plaque-Hybridisierung,
durchgeführt
werden. Ein Plaque der einen Hybrid mit der Sonde ausbildet, kann
als ein positiver Klon durch die Detektion einer sondengebundenen
Markierung isoliert werden.
-
(iv) Nukleotid-Sequenz-Analyse
der cDNS
-
Eine
C6ST-cDNS kann durch die Herstellung einer Phagen-DNS aus dem ausgewählten positiven Klon
und durch Schneiden der Phagen-DNS mit einem geeigneten Restriktionsenzym
ausgeschnitten werden. Die erhaltene cDNS kann als solche, oder
nach dem Subklonieren in ein geeignetes Plasmid verwendet werden,
um die Nukleotid-Sequenz zu bestimmen.
-
Von
der in einer wie oben beschriebenen Weise bestimmten Nukleotid-Sequenz
der menschlichen C6ST-cDNS ist der Teil des offenen Lesenrahmens
in SEQ ID NO: 1 gezeigt und die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:
2 gezeigt. Ein einfacher offener Leserahmen, der mit dem ersten
ATG-Kolon beginnt, legt ein Protein nahe, das 479 Aminosäurereste
und ein Molekulargewicht von 54.610 aufweist.
-
Eine
DNS, die in einer wie oben beschriebenen Weise erhalten werden kann,
kann optional eine Substitution, eine Deletion oder eine Insertion
von einem oder mehreren Aminosäureresten
enthalten, vorausgesetzt, dass die durch diese DNS kodierte C6ST
im Wesentlichen nicht in der Aktivität verschlechtert wird, um eine
Sulfatgruppe von einem Sulftatgruppen-Donor zu einem N-Acetylgalacotosaminrest
oder einem Galactoserest eines Glycosaminoglycans zu übertragen.
Eine solche Substitution, Deletion oder Insertion von Aminosäureresten
kann durch Synthetisieren einer Sequenz in eine DNS-Sequenz eingeführt werden,
die Restriktions-Enzym-Schnittstellen an beiden Enden aufweist und
einen Teil enthält,
der sich über
beide Seiten eines Mutationspunktes erstreckt, worauf das Ersetzen des
entsprechenden Teils einer nicht-mutierten DNS-Sequenz mit der synthetisierten
Sequenz erfolgt. Die Substitution, die Insertion oder die Deletion
kann alternativ entsprechend einem Verfahren, wie z. B. einem ortsspezifischen
Mutagenese-Verfahren
(Kramer, W. und Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987);
Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)) in eine DNS-Sequenz
eingeführt
werden. Die Aktivität,
um eine Sulfatgruppe von einem Sulfatgruppendonor zu einem N-Acetylgalactosaminrest
oder einem Galactoserest eines Glycosaminoglycans zu übertragen,
kann z. B. durch ein wie unten erläutertes Enzym-Aktivitäts-Assay
bestimmt werden und infolgedessen kann die Substitution, die Deletion
oder die Insertion eines oder mehrerer Aminosäurereste, die die Aktivität im Wesentlichen nicht
verschlechtern, leicht durch Fachleute erkannt werden.
-
BEISPIELE
-
Die
vorliegende Erfindung wird nun noch weiter im Detail durch die nicht
eingeschränkten
erläuternden Beispiele
beschrieben werden. Ein für
alle Beispiele gewöhnliches
Assay-Verfahren wird zu Beginn erklärt. Wenn anderweitig angegeben,
bedeutet „%" „Gewichtsprozent".
-
(1) Enzym-Aktivitäts-Assay
-
Eine
Sulfotransferase-Aktivität
wurde wie folgt bestimmt. Die Reaktionslösung enthält in einem Gesamtvolumen von
50 μl, 2,5 μmol Imidazol-HCl
(pH 6,8), 1,2 μg
Protamin-Hydrochlorid, 0,1 μmol
Dithiothreitol, 25 nmol (als Glucuronsäure) Chondroitin (erhältlich von
Seikagaku Corp.), 50 pmol [35S]-PAPS (Adenosin 3'-Phosphat, 5'-Phosphosulfat) und ein Enzym.
-
Eine
Aktivität
mit einem der verschiedenen Glycosaminoglycane als ein Substrat
wurde durch Ersetzen des Chondroitins mit 25 nmol des Glycosaminoglycans
(als Galactosamin für
Chondroitin-Sulfat und Dermatan-Sulfat und als Glycosamin für Heparan-Sulfat
und Keratan-Sulfat) bestimmt.
-
Nachdem
die Reaktionslösung
bei 37°C
für 20
Minuten inkubiert wurde, wurde die Reaktion durch Eintauchen eines
Reaktions-Röhrchens
für eine
Minute in kochendes Wasser gestoppt. Nach dem Stoppen der Reaktion
wurde 0,1 μmol
(als Glucuron säure)
Chondroitin-Sulfat-A als ein Träger
hinzugefügt,
dann wurden drei Volumen Ethanol, die 1,3% Kaliumacetat enthalten,
hinzugefügt,
um das 35S-markierte Polysaccharid zu präzipitieren.
Die sich daraus ergebene Mischung wurde bei 10.000 × g für 10 Minuten
zentrifugiert und das erhaltene Präzipitat wurde in 70 μl Wasser
aufgelöst.
Die erhaltene Lösung
(50 μl)
wurde auf eine entsalzene mit 0,1 M NH4HCO3 equilibrierte Säule aufgetragen. Die ein 35S-markiertes Polysaccharid enthaltenen
eluierten Fraktionen wurden gesammelt. Ein ml des Scintillations-Cockatils
(Clearsol, hergestellt von Nakarai Tesque) wurden zu 200 μl jeder Fraktion
hinzugefügt,
um die 35S-Radioaktivität zu messen, wobei die Aufnahme
des 35S in das Polysaccharid gemessen wurde.
-
Ein
Aliquot (400 μl)
wurde von der verbleibenden Lösung
genommen, und zu dem Aliquot wurde Ethanol (800 μl), das 1,3% Kaliumacetat enthält, hinzugefügt und gemischt.
Die sich daraus ergebene Mischung wurde für 30 Minuten auf Eis platziert,
gefolgt von einer Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 Minuten, um das 35S-Polysaccharid zu präzipitieren. Das Präzipitat
wurde in einem Puffer (25 μl),
der 0,1 mg/ml BSA, 0,05 M Tris-Acetat (pH 7,5) und 10 Milliunits
einer Chondroitinase ACII (erhalten aus Arthrobacter aurescens,
hergestellt von Seikagaku Corp.) enthält, aufgelöst und es wurde ihm gestattet,
bei 37°C
für zwei
Stunden zu reagieren. Ein Reaktionsprodukt wurde zusammen mit jeweils
0,1 μmol
2-Acetamido-2-Deoxy-3-O-(β-D-Gluco-4-Enopyranosyluronsäure)-6-O-Sulfo-D-Galactose
(ΔDi-6S)
und 2-Acetamido-2-Deoxy-3-O-(β-D-Gluco-4-Enopyranosyluronsäure)-4-O-Sulfo-D-Galactose (ΔDi-4S) (beide
von Seikagaku Corp. hergestellt) auf ein Whatman-Nr.1-Filterpapier gespottet
und für
20 Stunden mit 1-Butanol/Essigsäure/1
M-Ammonium-Hydroxid
(2 : 3 : 1 (v/v/v)) entwickelt.
-
Die
Positionen der ΔDi-6S
und der ΔDi-4S
wurden mit einer ultravioletten Lampe überprüft. Die entsprechenden Stellen
wurden aus dem Filterpapier ausgeschnitten und sie wurden in einen
durch Auflösen
von Diphenyloxazol (5 g) und Dimethyl(1,4- bis (2-(5-Phenyloxazol))-Benzen (0,25
g) in 1 l Toluen hergestellten Scintillator getaucht, um die Radioaktivität zu messen.
In dem Fall einer mit Chondroitinase ACII verdauten Probe war ursprünglich verbleibende
Radioaktivität
auf dem Filterpapier nicht mehr als ein Prozent der gespotteten
Radioaktivität.
Die Chondroitin-6-Sulfotransferase-Aktivität und die
Chondroitin-4-Sulfotransferase-Aktivität wurden entsprechend der Aufnahme
des 35S's
in die ΔDi-6S
und die ΔDi-4S
berechnet. Die Menge der Aktivität,
um die Übertragung
von 1 pmol Sulfat-Gruppe/Minute zu katalysieren, wurde als 1 Unit
definiert.
-
Die
Sulfotransferase-Aktivität
wurde mit verschiedenen Substraten gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass
die in Beispiel 1 erhaltene C6ST eine Sulfatgruppe zu Chondroitin,
zu Chondroitin-Sulfat, das aus Hühnerknorpel
stammt, zu Chondroitin-Sulfat
A, zu Chondroitin-Sulfat C und Keratan-Sulfat, das aus der Hornhaut stammt, überträgt, aber
es überträgt nur schwach
eine Sulfatgruppe zu Chondroitin-Sulfat E, zu Dermatan-Sulfat und
zu Heparan-Sulfat. Die vorliegenden Erfinder konnten auch bestätigen, dass
eine C6ST der vorliegenden Erfindung eine Sulfatgruppe zu der C-6-Position eines
in Chondroitin und Chondroitin-Sulfat vorhanden N-Acetylgalactosaminrests überträgt, wie
auch eine Sulfatgruppe zu der C-6-Position eines in dem Keratan-Sulfat
vorhandenen Galactoserests überträgt.
-
Als
nächstes
werden die Herstellungsbeispiele der DNS der vorliegenden Erfindung
erklärt
werden.
-
<1> Herstellung
der embryonalen Hühner-Chondroitin-6-Sulfotransferase
und Analyse der Aminosäuresequenz
-
(1) Herstellung der Chondroitin-6-Sulfotransferase
-
Embryonale
Hühner-Chondrocyten
wurden in Zellkulturschalen inokuliert, um eine Dichte von 5,6 × 104 Zellen/Schale einzustellen, und sie wurden
bei 38°C
für 11
Tage unter einer Bedingung von 7 Volumenprozent CO2 und
93 Volumenprozent Luft in einem auf pH 7,0 eingestellten Dulbecco's-Modified-Eagle's-Medium (DMEM),
das D-Glucose (2 g/L), Penicillin (100 Units/ml), Streptomycin (50 μg/ml) und
10% fetales Rinderserum (FBS) enthält, kultiviert. Das Medium
wurde gegen ein frisches auf pH 7,4 eingestelltes Medium an dem 2.,
4., 7., 9. und 10. Tag nach dem Start der Kultivierung ausgetauscht.
-
Am
10. Tag wurde ein Medium verwendet, das ein durch Erhitzen von FBS
bei 60°C
für 60
Minuten hergestelltes Hitze inaktiviertes Serum (10%) enthält. Bis
zu dem 11. Tag wuchsen die Zellen bis zu 5,0 × 106 Zellen/Schale.
Danach wurde die Kultivierung für
10 Tage fortgesetzt, während
das Medium jeden Tag unter Verwendung ei nes mit Natriumascorbat
(50 μg/ml)
ergänzten
Cosmedium-001 (bezogen von Cosmo Bio) ausgetauscht wird.
-
Die
verwendeten Cosmedium-Medien wurden gesammelt und bei 10.000 × g für 10 Minuten
zentrifugiert, um einen Überstand
herzustellen, der eine Zusammensetzung von 10 mM Tris-HCl, pH 7,2,
0,1% Triton X-100, 20 mM MgCl2, 10 mM 2-Mercaptoethanol
und 20% Glycerol aufweist.
-
Der
Kulturüberstand
wurde auf eine mit Puffer A (10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,1% Triton
X-100, 20 mM MgCl2, 2 mM CaCl2,
10 mM 2-Mercaptoethanol und 20% Glycerol) equilibrierte Heparin-Sepharose-CL6B-Säule (hergestellt
von Pharmacia LKG Biotechnology, 2,2 × 28 cm) aufgetragen, die 0,15
M NaCl enthält.
Die Säule wurde
mit einem Puffer A, der 0,15 M NaCl enthält gewaschen, gefolgt von der
Elution mit einem linearen Gradienten des Puffers A (1 l), der 0,15
bis 0,75 M NaCl enthält,
um eine Fraktionierung mit 12 ml/Fraktionen durchzuführen.
-
Die
Fraktionen, die die Sulfotransferase-Aktivität aufweisen, wurden gesammelt
und auf eine mit einem Puffer A, der 0,15 M NaCl enthält, equilibrierte
Weizenkeim-Agglutinin-Agarose-Säule
(hergestellt von Seikagaku Corp., 1,2 × 15 cm) aufgetragen. Die Säule wurde
mit Puffer A (200 ml), der 0,15 M NaCl enthält, gewaschen, gefolgt von
der Elution mit Puffer A (200 ml), der 0,15 M NaCl und 0,3 M N-Acetylglucosamin
enthält.
Die eluierten Fraktionen wurden gesammelt und gegen Puffer A, der
0,05 M NaCl enthält,
dialysiert.
-
Die
dialysierte Lösung
der eluierten Fraktionen wurde auf eine mit Puffer A, der 0,05 M
NaCl enthält, equilibrierte
3'-5'-ADP-Agarose-Säule (hergestellt
von Sigma, 1,2 × 11,8
cm, 1,9 μmol
3'-5'-ADP/ml-Gel) aufgetragen.
Die Säule
wurde mit Puffer A (150 ml), der 0,05 M NaCl enthält, gewaschen,
gefolgt von der Elution mit einem linearen Gradienten des Puffers
A (300 ml), der 0,05 M NaCl und 0 bis 0,2 mM 3'-5'-ADP
enthält. Die
die Sulfotransferase-Aktivität
aufweisenden Fraktionen wurden gesammelt und sukzessiv gegen Puffer
A, der 1 M NaCl enthält,
und gegen Puffer A, der 0,05 M NaCl enthält, dialysiert.
-
Die
Sulfotransferase-Aktivität
des auf diese Weise gereinigten Enzyms wurde unter Verwendung des hierbei
bevor beschriebenen Enzym-Aktivitäts-Assay's gemessen.
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass die Chondroitin-6-Sulfotransferase eine
spezifische Aktivität
von 4,3 × 105 Units/mg aufwies und das Verhältnis der
Chondroitin-4-Sulfotransferase-Aktivität zu der Chondroitin-6-Sulfotransferase-Aktivität 0,02 war.
-
Für die auf
diese Weise gereinigte C6ST wurde eine Einfachbande in dem SDS-PAGE unter einer
reduzierenden Bedingung gefunden und wurde mit einem Molekulargewicht
von 75.000 bestimmt. Wenn dieses einer Superose-12-HR-10/30-Gel-Filtrations-Chromatographie
(Elutionsmittel 10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 2 M NaCL, 20 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,1%
Triton X-100 und 20% Glycerol) unterzogen wurde, zeigte das gleiche Enzym
ein Molekulargewicht von 160.000. Diese Ergebnisse zeigen an, dass
die C6ST ein Dimer in der Gegenwart von 2 M NaCl bildet.
-
Es
wurde auch beobachtet, dass die C6ST durch Protamin und MnCl2 aktiviert wurde.
-
In
dem obigen Assay-System war das pH-Optimum der C6ST etwa 6,4.
-
(2) Analyse der Aminosäuresequenz
der embryonalen Hühner-C6ST
-
Eine
gereinigte C6ST wurde mit N-Glycanase verdaut. Kurz dargestellt
wurde eine Trichloressigsäure (200 μl) zu 1 ml
der C6ST-Lösung
(10 μg bezüglich des
Proteins) hinzugefügt
und die sich daraus ergebene Mischung wurde für 30 Minuten auf Eis platziert,
worauf eine Zentrifugation bei 10.000 × g für 20 Minuten folgte. Ein Präzipitat
wurde zweimal mit 1 ml Aceton gewaschen und dann in einem Vakuum-Exikator getrocknet. Das
getrocknete C6ST-Protein wurde in 10 μl 0,15 M Tris-HCl (pH 7,8),
das 0,5% SDS enthält,
aufgelöst
und dann bei 100°C
für 3 Minuten
erhitzt. Nach dem Abkühlen
wurden 5 μl
7,5%iges (w/v) Nonidet P-40, 1,2 μl
0,25 molares EDTA (pH 8), 0,3 μl
Phenylmethansulfonyl-fluorid, 10,5 μl Wasser und 3 μl (0,75 Unit)
rekombinante N-Glycanase (hergestellt von Genzyme) hinzugefügt. Die
sich daraus ergebene Mischung wurde bei 37°C für 12 Stunden inkubiert, um
es zu ermöglichen,
eine Deglycosylierungs-Reaktion zu induzieren.
-
Danach
wurde die sich daraus ergebene Mischung für den Zweck einer Aminosäuresequenz-Analyse einem
SDS-PAGE unterzogen, und das Gel wurde auf eine Polyvinylidin-fluorid-(PVDF)-Membran
ohne Anfärbung übertragen.
Diese Membran wurde mit Coomassie-Brilliant-Blau gefärbt. Die
nach dem N-Glycanase-Verdau
erhaltenen Protein-Banden (49 und 47 kDa) und eine Bande eines nicht
verdauten Proteins (75 kDa) wurden aus der Membran ausgeschnitten
und für
die Aminosäuresequenz-Bestimmung
verwendet.
-
Um
andererseits eine innere Aminosäuresequenz
der C6ST zu bestimmen, wurde ein mit einer Protease teilweise verdautes
C6ST-Peptid hergestellt. Dieses Experiment wurde entsprechend einem
Verfahren nach Cleveland et al. (Cleveland, D. W., Fischer, S. G.,
Kirshner, M. W. und Leammli, U. K. (1977) J. Biol. Chem. 252, 1102–1106) durchgeführt. Und
zwar wurde das gereinigte Protein (30 μg) durch eine SDS-PAGE unter Verwendung
eines 10%igen Gels getrennt. Nachdem das Gel mit Coomassie-Brilliant-Blau
gefärbt
war, wurde die Protein-Bande mit 75 kDa ausgeschnitten und sie wurde
in die Tasche eines anderen 16%igen Gels eingebracht. Die Tasche
wurde mit einem Puffer überschichtet,
der eine Protease V8 (Sequenzierungsgrad, hergestellt von Boehringer
Mannheim) in einem Verhältnis
von 0,05 μg/μg des gereinigten
Proteins enthält,
um die SDS-PAGE zu starten. Die Stromquelle wurde ausgeschaltet,
wenn ein voranlaufendes Ende eines Färbemittels an einem Ende des
Trenngels ankommt. Die Elektrophorese wurde nach 30 Minuten noch
einmal gestartet. Die durch den Protease-Verdau gebildeten Peptide
wurden auf eine PVDF-Membran „transblotted". Diese Membran wurde
mit Coomassie-Brilliant-Blau gefärbt
und dann wurde eine Peptid-Bande mit 19 kDa ausgeschnitten.
-
Die
nach dem N-Glycanase-Verdau hergestellten Proteine, die intakten
Proteine und die nach dem Protease-V8-Verdau hergestellten Peptide,
die alle, wie oben beschrieben, hergestellt wurden, wurden auf PVDF-Filter
immobilisiert, um eine Aminosäuresequenz
von Amino-Terminalen Enden zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 1 gezeigt. Tabelle
1
49-kDa
Protein | LVIXXXXNNFIXXV
(SEQ ID NO: 3) |
47-kDa
Protein | XVIXEXXNNFIXXV
(SEQ ID NO: 4) |
Intaktes
Protein | LVIXEKENNFISRVSDKLKXXPXV
(SEQ ID NO: 5) |
19-kDa
Peptid | SFISPAPEEXLTA
(SEQ ID NO: 6) |
-
<2> Amplifikation
einer teilweisen cDNS einer embryonalen Hühner-C6ST durch eine PCR
-
(1) Herstellung eines
Primers für
eine PCR
-
Um
eine C6ST-cDNS aus einer cDNS-Bibliothek zu amplifizieren, wurden
Oligonukleotid-Primer für eine
PCR (Tabelle 2) auf der Basis der, wie oben beschrieben, bestimmten
Aminosäuresequenzen
hergestellt. Zwei „Sense"-Primer (Primer 1s
und 2s) wurden auf der Basis der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 5) konstruiert,
die aus dem intakten Protein (75 kDa) einer embryonalen Hühner-C6ST
stammt, wohingegen ein „Anti-Sense"-Primer (Primer 3a)
auf der Basis der Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO: 6) konstruiert wurde, die aus dem Protease verdauten
Peptid (19 kDa) stammt. Jeder der auf diese Weise konstruierten
Nukleotid-Primer wurde synthetisiert. Tabelle
2
Primer
1s | CAAAGCTTGA
RAARGARAAY AAYTTYAT (SEQ ID NO: 7) |
Primer
2s | MGKGTKWSKG
AYAARCTNAA (SEQ ID NO: 8) |
Primer
3a | AARTADWSKG
GKCGKGGKCT TCTTAAGCT (SEQ ID NO: 9) |
-
Eine
HindIII-Erkennungs-Sequenz enthaltende Nukleotid-Sequenz wurde in
das 5'-Ende des Primers 1s
eingesetzt, wohingegen eine Nukleotid-Sequenz, die eine EcoRI-Erkennungs-Sequenz
enthält,
in das 5'-Ende des
Primers 3a eingesetzt wurde.
-
(2) Herstellung einer
Poly(A)+-RNS
-
Eine
Gesamt-RNS wurde durch das Guanidin-Thiocyanat/CsCl-Verfahren (Kingston,
R. E., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl.
14, Unit 4.2 Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,
New York) ausgehend von embryonalen Hühner-Chondrocyten hergestellt,
die für
11 Tage entsprechend einem bekannten Verfahren (Kim, J. J. und Conrad,
H. E. (1976) J. Biol. Chem. 251, 6210–6217; Kim, J. J. und Conrad,
H. E. (1977) J. Biol. Chem. 252, 8292–8299; Kim, J. J. und Conrad,
H. E. (1980) J. Biol. Chem. 255, 1586–1597) in Dulbecco's-Modified-Eagle's-Medium (DMEM) kultiviert
worden sind, das 10% fetales Rinderserum enthält. Die erhaltene Gesamt-RNS
wurde durch eine Oligo(dT)-Zellulose-Säulen-Chromatographie gereinigt, um Poly(A)+-RNS zu erhalten.
-
(3) PCR (Polymerase-Kettenreaktion)
-
Unter
Verwendung der oben erhaltenen Poly(A)+-RNS
als ein Template und dem Oligonukleotid 3a als einen Primer wurde
ein primärer
cDNS-Strang durch die reverse Transkriptions-Reaktion synthetisiert.
Die Reaktion für
die reverse Transkription wurde durch Inkubieren eines Puffers bei
37°C für 60 Minuten
ausgeführt, welcher
in einem Endvolumen von 20 μl,
Poly(A)+-RNS (1 μg), Oligonukleotid 3a (50 pmol),
vier unterschiedliche Deoxynukleosid-Triphosphate (500 μm jedes),
M-MLV-reverse-Transkriptase
(200 Units, hergestellt von Gibco BRL), 1 mM Dithiothreitol und
einen RNase-Inhibitor (120 Units, hergestellt von Takara Shuzo)
enthält.
-
Die
Reaktion für
die PCR wurde in einer Reaktionslösung ausgeführt, die in einem Endvolumen
von 100 μl
die oben definierte Mischung (10 μl)
für die
reverse Transkription, Oligonukleotide 1s und 3a (50 pmol jedes),
vier unterschiedliche Deoxynukleosid-Thriphosphate (100 μm jedes)
wie auch eine Taq-Polymerase (2,5 Units, AmpliTaq-Polymerase, hergestellt
von Perkin-Elmer) enthält.
Der Amplifikations-Zyklus
wurde 30 Mal wiederholt, und jeder Zyklus setzte sich aus einer
Minute bei 94°C,
einer Minute bei 45°C
und 3 Minuten bei 55°C
zusammen.
-
<3> Herstellung
der Gesamtlängen-cDNS
der embryonalen Hühner-C6ST
-
(1) Herstellung der Hybridisierungssonde
-
Das
erhaltene PCR-amplifizierte Fragment wurde aufbereitet, mit HindIII
und EcoRI verdaut und in einen Plasmidvektor, Bluescript (hergestellt
von Stratagene), an den mit diesen Restriktionsenzymen geschnittenen
Stellen subkloniert. Ein Subklon wurde durch die Sequenzierung mit
der Hilfe eines T3-Primers oder eines M13-20-Primers bestätigt.
-
Eine
radioaktive Sonde zum Screenen einer cDNS-Bibliothek wurde durch
eine Radioaktivmarkierung des vorhergenannten PCR-Produkts entsprechend
einem Random-Oligonukleotid-Primed-Markierungsverfahren (Feinberg,
A. P. und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6–13) unter
Verwendung eines [α-32P)-dCTP (hergestellt von Amersham) und
einem DNS-Random-Markierungs-Kit (hergestellt von Takara Shuzo)
erhalten.
-
(2) Aufbau einer cDNS-Bibliothek
-
Um
eine cDNS zu erhalten, die eine Gesamtlänge der kodierenden Region
der C6ST enthält,
wurde als nächstes
ein λ-Vektor, λgt11, verwendet,
um ein cDNS-Klonieren durchzuführen.
-
Eine
Poly(A)+-RNS wurde aus embryonalen Hühner-Chondrocyten
in der gleichen Weise wie oben in <2>, (2), hergestellt
und wurde als Template zur Synthetisierung einer doppelsträngigen cDNS
verwendet. Die DNS wurde in einen EcoRI-verdauten λgt11 (hergestellt
von Pharmacia) ligiert. Ein cDNS-Synthese-Kit (TimeSaver-cDNS-Synthese-Kit, hergestellt
von Pharmacia) wurde für
die Synthese der cDNS und der Ligation in den Vektor verwendet.
Random-Oligonukleotid-Primer wurden als ein Primer für die reverse
Transkriptions-Reaktion verwendet.
-
Der
rekombinante Phagen-Vektor mit der inserierten cDNS wurde in Phagen-Partikel
unter Verwendung eines in vitro Verpackungs-Kit (Gigapack II Verpackungs-Extrakt,
hergestellt von Stratagene) verpackt. Escherichia coli Y1088 wurde
mit diesen Phagen-Partikeln infiziert und wurde auf eine Platte
plattiert, um Plaques zu bilden. Eine auf diese Weise erhaltene
Phagen-Bibliothek wurde für
das cDNS-Screenen ohne weitere Amplifikation verwendet.
-
(3) Screenen des C6ST-cDNS-Klon
-
Das
Screenen von etwa 5 × 10
Plaques der, wie oben beschrieben, erhaltenen λgt11-cDNS-Bibliothek wurde durchgeführt. Die
Plaques wurden auf eine kommerziell erhältliche Nylonmembran (Hybond
N+ Nylon-Membran, hergestellt von Amersham) übertragen und eine Phagen-DNS
wurde auf der Nylon-Membran unter Verwendung eines alkalischen Immobilisierungsverfahrens,
entsprechend der dem kommerziellen Produkt beiliegenden Gebrauchsanweisung,
immobilisiert.
-
Die
Membran, die die darauf immobilisierte Phagen-DNS aufweist, wurde
einer Prähybridisierung
bei 42°C
für 3,5
Stunden in einer Lösung,
die 50% Formamid, 5 × SSPE
(Zusammensetzung von 1 × SSPE:
10 mM NaH2PO4 (pH
7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA), 5 × Denhardt's Lösung
(Zusammensetzung von 1 × Denhardt's Lösung: 0,02%
Ficoll 400, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% BSA), 0,5% SDS, 0,04
mg/ml einer denaturierten Lachssperma-DNS und 0,004 mg/ml einer
E. coli-DNS enthält,
unterzogen. Eine Hybridisierung wurde bei 42°C für 16 Stunden in dem gleichen
wie oben beschriebenen Puffer, der die 32P-markierte
Sonde enthält,
durchgeführt.
Danach wurde der Filter bei 55°C
nacheinander in 1 × SSPE
(0,1% SDS) und in 0,1 × SSPE (0,1%
SDS) gewaschen und danach wurden Hybridisierungs positiven Klone
mittels einer Autoradiographie detektiert. Etwa 90 positive Klone
wurden aus 5 × 105 Plaques erhalten.
-
(4) Nukleotid-Sequenz-Analyse
der embryonalen Hühner-C6ST-cDNS
-
Sechzehn
unabhängige
Klone wurden aus den Hybridisierungs positiven λgt11-Klonen ausgesucht. Eine
jeweilige Phagen-DNS wurde hergestellt und mit EcoRI verdaut, um
ein cDNS-Insertions-Fragment als ein Einfachfragment aus der Vektor-DNS
auszuschneiden. Die erhaltenen DNS-Fragmente wurden in einen Bluescript
subkloniert. Unter diesen DNS-Fragmenten wurde die Nukleotid-Sequenz
des längsten
Fragments (2,3 kb) bestimmt.
-
Aus
dem durch das Subklonieren der cDNS in den Bluescript erhaltene
rekombinante Plasmid wurde ein Deletions-Klon unter Verwendung eines
DNS-Deletions-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) entsprechend einem
bekannten Verfahren (Henikoff, S. (1984) Gene 28, 351–359; Yanisch-Perron,
C., Viera, J. und Messing, J. (1985) Gene 33, 103–109) hergestellt.
Die Restriktionsenzyme SacI und XbaI wurden zum Abtrennen eines 3'-kohäsiven Endes
und entsprechend eines 5'-kohäsiven Endes
verwendet.
-
Der
erhaltene Deletions-Klon wurde einem Dideoxy-Ketten-Terminations-Verfahren
(Sanger, F., Nicklens, S. und Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463–5467)
unter Verwendung eines [α-32P]-dCTP und einer T7-DNS-Polymerase (Sequenase,
hergestellt von U. S. Biochemicals) unterzogen, um die Nukleotid-Sequenzen
beider Stränge
unabhängig
voneinander zu bestimmen.
-
<4> Klonieren
einer menschlichen C6ST-cDNS
-
(1) Herstellung einer
Hybridisierungssonde
-
Aus
einer in dem vorherigen Schritt <3>, (4), erhaltenen embryonalen
Hühner-C6ST-cDNS wurde eine [λ-32P]-dCTP markierte radioaktive Sonde zum
Screenen einer cDNS-Bibliothek durch das Random-Primer-Markierungs-Verfahren
hergestellt. Noch spezieller wurde die vorhergenannte Hühner-cDNS
entsprechend einem Random-Oligonukeotid-Primed-Markierungs-Verfahren
(Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6–13) unter
Verwendung von [α-32P]-dCTP (Hergestellt von Amersham) und
einem DNS-Random-Markierungs-Kit (hergestellt von Takara Shuzo)
radioaktiv markiert.
-
(2) Aufbau einer menschlichen
cDNS-Bibliothek
-
Um
eine cDNS, die eine Gesamtlänge
der kodierenden Region der menschlichen C6ST enthält, zu erhalten,
wurde eine menschliche fetale Hirn-cDNS-Bibliothek (erhältlich von
Clontech), die einen Lamda-Vektor, λg11, enthält, verwendet.
-
Der
rekombinante Phagen-Vektor mit der inserierten cDNS wurde in Phagen-Partikel
unter Verwendung eines in vitro Verpackungs-Kit (Gigapack II Verpackungs-Extrakt,
hergestellt von Stratagene) verpackt. Escherichia coli Y1088 wurde
mit diesen Phagen-Partikeln infiziert und wurde auf eine Platte
ausplattiert, um einen Plaque zu bilden. Eine auf diese Weise erhaltene
Phagen-Bibliothek wurde für
das cDNS-Screenen ohne weitere Amplifikation verwendet.
-
(3) Screenen des C6ST-cDNS-Klons
-
Das
Screenen der Plaques der λg11-cDNS-Bibliothek
wurde in der gleichen Weise wie in dem vorangehenden Schritt <3>, (3), beschrieben,
durchgeführt.
Und zwar wurden die Plaques auf eine kommerziell erhältliche
Nylon-Membran (Hybond N+ Nylon-Membran, hergestellt von Amersham) übertragen,
und die Phagen-DNS wurde entsprechend einem alkalischen Immobilisierungsverfahren
auf der Nylon-Membran immobilisiert.
-
Die
Membran, die die immobilisierte Phagen-DNS darauf aufweist, wurde
einer Prähybridisierung
bei 42°C
für 3,5
Stunden in einer Lösung,
die 50% Formamid, 5 × SSPE,
5 × Denhardt's Lösung, 0,5%
SDS, 0,04 mg/ml einer denaturierten Lachssperma-DNS und 0,004 mg/ml
einer E. coli-DNS enthält,
unterzogen. Die Hybridisierung wurde in dem gleichen Puffer, wie
oben beschrieben, der die 32P-markierte
Sonde enthält,
bei 42°C für 16 Stunden
durchgeführt.
Danach wurde der Filter bei 55°C
nacheinander in 1 × SSPE
(0,1% SDS) und in 0,1 × SSPE
(0,1% SDS) gewaschen und danach wurden die positiven Hybridisierungs-Klone
mittels einer Autoradiographie detektiert.
-
(4) Nukleotid-Sequenz-Analyse
der C6ST-cDNS
-
Unabhängige Klone
wurden aus den, wie oben beschrieben, erhaltenen positiven Hybridisierungs-λg11-Klonen
ausgewählt.
Jede Phagen-DNS wurde aufbereitet und mit EcoRI verdaut, um ein
cDNS-Insertions-Fragment als ein Einfach-Fragment aus der Vektor-DNS
auszuschneiden. Die erhaltenen DNS-Fragmente wurden in einen Bluescript
subkloniert.
-
Ein
durch Subklonieren einer cDNS in einen Bluescript erhaltenes rekombinantes
Plasmid wurde mit einem DNS-Deletions-Kit (hergestellt von Takara
Shuzo) entsprechend einem bekannten Verfahren (Henikoff, S. (1984)
Gene 28, 351–359;
Yanisch-Perron,
C., Viera, J. und Messing, J. (1985) Gene 33, 103–109) behandelt,
um einen Deletions-Klon herzustellen.
-
Der
erhaltene Deletions-Klon wurde mit [α-32P]-dCTP
und einer T7-DNS-Polymerase (Sequenase, hergestellt von U. S. Biochemicals)
entsprechend einem Dideoxy-Ketten-Terminations-Verfahren
(Sanger, F., Nicklens, S. und Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463–5467)
behandelt, um die Nukleotid-Sequenzen der beiden Stränge unabhängig voneinander
zu bestimmen. Die Nukleotid-Sequenz, die den offenen Leserahmen
der auf diese Weise bestimmten menschlichen C6ST- cDNS entspricht, ist in SEQ ID NO: 1
gezeigt und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:
2 gezeigt.
-
Die
bestimmte DNS-Sequenz wurde unter Verwendung eines Gene-Works-Computer-Programms (hergestellt
von IntelliGenetics) analysiert. Zwei im Rahmen befindliche ATG-Codons
sind an dem 5'-terminalen
Teil des offenen Leserahmens der C6ST-cDNS enthalten. Ein einfacher
offener Leserahmen, der an dem ersten ATG-Codon beginnt, deutet ein 479 Aminosäurereste
enthaltendes Protein mit einem Molekulargewicht von 54.610 an. Für dieses
Protein wurde gefunden, dass es eine 74%ige Aminosäuresequenz-Homologie
mit der oben genannten Hühner-C6ST
aufweist. Insbesondere hatte die entsprechend der vorliegenden Erfindung erhaltene
menschliche C6ST eine hochhydrophile, aus 17 Aminosäureresten
zusammengesetzte spezifische Insertions-Sequenz (die von 114 bis
130 der SEQ ID NO: 2 nummerierten Aminosäuren), die in der Hühner-C6ST
fehlte.
-
(5) Aufbau eines menschlichen
C6ST-Expressions-Plasmid
-
Um
die menschliche C6ST-cDNS zu exprimieren, wurde das cDNS-Fragment
in einen Expressions-Vektor eingeführt, um ein rekombinantes Plasmid
zu konstruieren. Ein Expressions-Vektor für Säugetierzellen, pCXN2 (hergestellt
von Dr. Jun-ichi Miyazaki der Universität Tokyo (Niwa, H., Yamamura,
K. und Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193–200) und freundlicherweise
von Dr. Yasuhiro Hashimoto des Tokyo Metropolitan Institute's of Medical Science
zur Verfügung
gestellt), wurde als der Expressionsvektor verwendet. pCXN2 ist ein
Vektor, der ein Streptomycin resistentes Gen und ein Penicillin
resistentes Gen aufweist und ein in eine EcoRI-Stelle inseriertes
DNS-Fragment mit der Hilfe eines β-Actin-Gen-Promotors
exprimieren kann. Das cDNS-Fragment von 2.354 bp (SEQ ID NO: 1)
wurde in die EcoRI-Stelle des pCXN2 ligiert. E. coli JM109 wurde
mit einer Reaktionslösung
nach der Ligation transformiert und es wurde auf eine LB-Platte,
die Amplicillin enthält,
aufgetragen. Rekombinante Plasmide wurden aus den Transformanten
gesammelt und sie wurden durch eine dreimalige CsCl/Ethidiumbromid-Gleichgewichts-Zentrifugation
gereinigt. Ein rekominantes Plasmid, in welchem der Promotor des
Vektors und die cDNS eine übereinstimmende
Ausrichtung hatten, wurde als pCXNhC6ST bezeichnet. Ein rekombinantes
Plasmid, in welchem die cDNS in einer entgegengesetzten Richtung inseriert
war, wurde als pCXNhC6ST2 bezeichnet. Die Richtung der cDNS wurde
durch Restriktions-Katierung unter Verwendung von BamHI analysiert.
-
(6) Transiente Expression
der menschlichen C6ST-cDNS in COS-7-Zellen
-
COS-7-Zellen
wurden als ein Wirt für
eine Expression der menschlichen C6ST-cDNS verwendet. COS-7-Zellen
(erhalten von RIKEN CELL BANK, Tsukuba) wurden in Kulturschalen,
die einen Durchmesser von 100 mm aufweisen, mit einer Dichte von
8 × 105 Zellen/Schale ausgesät. Ein Dulbecco's Modified-Eagle's-Medium (DMEM),
das Penicillin (100 Unit/ml), Streptomycin (50 μg/ml) und 10% fetales Rinderserum (hergestellt
von Gibco BRL) enthält,
wurde als Kulturflüssigkeit
in einer Menge von 10 ml pro Kulturschale verwendet. Die Zellen
wurden in 5 Volumen-% CO2 und 95 Volumen-%
Luft bei 37°C
kultiviert.
-
Die
COS-7-Zellen wurden mit pCXNh106ST oder pCXNh1606ST2 nach 48 Stunden
der Kultivierung transfiziert. Die Transfektion wurde entsprechend
dem DEAE-Dextran-Verfahren
(Aruffo, A. (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl.
14, Unit 16.13, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New
York) durchgeführt.
Vorgewärmtes
DMEM (5 ml), das ein 10% Nu-Serum (ein Serumersatzstoff, der eine niedrige
Proteinkonzentration aufweist, hergestellt von Collaborative Biomedical
Products) enthält,
wurde mit PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung, 0,2 ml), die DEAE-Dextran
(10 mg/ml) und eine Chloroquine-Lösung (2,5 mM) enthält, gemischt.
Die Lösung
wurde mit 15 μg
des rekombinanten Plasmids gemischt und eine sich daraus ergebende
Mischung wurde zu der Zellsuspension hinzugefügt.
-
Die
Zellen wurden für
4 Stunden in einem CO2 Inkubator inkubiert.
Danach wurde die Zellflüssigkeit mit
einer PBS-Lösung
(5 ml), die 10% Dimethyl-Sulfoxid enthält, ersetzt. Die Zellen wurden
für 2 Minuten
bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wurde die Dimethyl-Sulfoxid-Lösung durch
Belüftung
entfernt, gefolgt von der Zugabe von 25 ml einer DMEM, die Penicillin
(100 Units/ml), Streptomycin (50 μg/ml)
und 10% fetales Rinderserum enthält.
Die Zellen wurden für
67 Stunden inkubiert und dann wurden sie nur mit DMEM gewaschen.
Die Zellen wurden gesammelt und unter Verwendung eines Dounce-Homogenisiergeräts in einer Lösung, die
0,25 M Sucrose, 10 mM Tris-HCl, pH 7,2 und 0,5% Triton X-100 enthält, homogenisiert, wobei
die Lösung
in einer Menge von 1,5 ml für
die aus einer Kulturschale erhaltenen Zelle verwendet worden ist.
Ein erhaltenes Homogenat wurde bei 10.000 × g für 20 Minuten zentrifugiert,
um die C6ST-Aktivität,
die Chondroitin-4-Sulfotransferase(C4ST)-Aktivität und die
Keratan-Sulfat-Sulfotransferase(KSST)-Aktivität in einer Überstandsfraktion zu messen.
Diese Aktivitäten
wurden in der Gegenwart oder in der Abwesenheit von Chondroitin oder
Keratan-Sulfat als ein Sulfatgruppen-Akzeptor gemessen. Für die COS-7-Zellen,
die nicht mit dem Expressionsplasmid transfiziert worden sind, wurde
die Messung in der gleichen wie oben beschriebenen Weise durchgeführt. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
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Wie
in Tabelle 3 gezeigt, war die C6ST-Aktivität und die KSST-Aktivität der Zellen,
die den Expressionsvektor beherbergen, um die oben erwähnte isolierte
cDNS in der richtigen Richtung zu exprimieren, etwa 16-fach und
entsprechend etwa 20-fach verglichen mit den Zellen, die den Expressionvektor
mit der inserierten cDNS in der entgegengesetzten Richtung beherbergen.
Dagegen war die C4ST-Aktivität
der tranfizierten Zellen nur mäßig erhöht. Diese
Ergebnisse haben bewiesen, dass die isolierte cDNS für ein Protein
kodiert, das die C6ST-Aktiviät
und die KSST-Aktivität
aufweist.
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