DE69728936T2 - Polypeptid menschlicher Glykosaminglykan Sulfotransferase und dafür kodierende DNS - Google Patents

Polypeptid menschlicher Glykosaminglykan Sulfotransferase und dafür kodierende DNS Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid einer Glycosaminoglycan-Sulfotransferase, die vom Menschen stammt, und eine DNS die für das Polypeptid kodiert.
  • Das Chondroitin-Sulfat ist ein typisches sulfatiertes Mucopolysaccharid (Gylcosaminoglycan). Das Chondroitin-Sulfat-Proteoglycan (CSPG) ist reichlich im Knorpel vorhanden und kommt in Betracht, in der Expression und der Aufrechterhaltung des Phenotyps der Chondrocyte (Tsukahara, T., Okamura, M., Suzuki, S., Iwata, H., Miura, T. und Kimata, K. (1991) J. Cell Sci. 100, 387–395) beteiligt zu sein. Das CSPG ist außer im Knorpel auch in verschiedenen Geweben vorhanden und kommt in Betracht, eine wichtige Rolle für die interzellularen Interaktionen (Kjellen, L. und Lindahl, U. (1991) Annu. Rev. Biochem. 60, 443–475) zu spielen.
  • Das hauptsächlich in Säugetier- und Vogelgeweben gefundene Chondroitin-Sulfat weist Sulfatgruppen an den C-6- oder C-4-Positionen der Acetylgalactosaminreste auf. Die folgende Kenntnis ist für das Verhältnis der 6-Sulfatierung/4-Sulfatierung erhalten worden. (i) Das Verhältnis des Chondroitin-6-Sulfats/Chrondroitin-4-Sulfats (6/4-Verhältnis) steigt zusammen mit dem Fortschreiten der endgültigen Differenzierung des Knorpels an. (ii) Das 6/4-Verhältnis im CSPG in der Haut von Ratten fällt zusammen mit dem Verlauf der Tage nach der Geburt ab. (iii) Wenn das in den arteriellen glatten Muskelzellen vorhandene CSPG und das Dermatan-Sulfat-Proteoglycan (DSPG) zwischen einer Arteriosklerose resistenten Taube und einer Arteriosklerose sensitiven Taube verglichen wird, ist die Hauptkomponente der erstgenannten Spezies Chondroitin-4-Sulfat, wobei die Hauptkomponente in der letzteren Spezies Chondroitin-6-Sulfat ist. (iv) Wenn monozytische Leukämiezellen (MI) unter der sich sukzessiv verändernden Kulturbedingung kultiviert werden, um sie für die Zellproliferation, die Inhibition der Proliferation mit hoher Dichte und die Induzierung zur Differenzierung zum Makrophagen einzurichten, fällt das 6/4-Verhältnis in dem CSPG mit der sich ändernden Bedingung in der oben definierten Reihenfolge ab, und es wird fast nur noch Chondroitin-4-Sulfat in dem End-Dif ferenzierungs-Induzierungs-Zustand produziert. (v) Als ein Ergebnis eines Vergleichs von einem normalen menschlichen Colon-Gewebe mit einem menschlichen Tumor-Colon-Gewebe, sind das Chondroitin-6-Sulfat und das Chondroitin im PG in dem Tumorgewebe erhöht. (vi) Wenn Maus-Osteoblasten-Zellen vor und nach der Kalzifikation verglichen werden, ist das 6/4-Verhältnis des DSPG's in den Zellen nach der Kalzifikation erniedrigt. (vii) Wenn der aus Blutplättchen stammende Wachstumsfaktor (PDGF) zu einem Kulturmedium von arteriellen glatten Muskelzellen eines Affen hinzugefügt wird, ist das 6/4-Verhältnis eines Versican ähnlichen CSPG's verglichen mit einer Kontrolle ohne Zugabe von PDGF erhöht (Glycobiology Series (I), „Diversified World of Saccharides", Kodansha, pp. 164, 166).
  • Es ist auch für das Chondroitin-Sulfat berichtet worden, dass zwei Sulfat-Gruppen pro sich wiederholender Disaccharid-Einheit existieren. GlcAβ1-3GalNAc(4,6-bisS) ist zum Beispiel in subkultivierten embryonalen Hühner-Chondrocyten, in Mäuse-Mast-Zellen, die aus knochenmarkähnlichen Zellen differenziert wurden, die in einem Ergänzungsmedium mit einem aus Mausmilz-Zellkulturen stammenden konditioniertem Medium kultiviert wurden, in Ratten-Glomerulus, in Kulturflüssigkeit von organotypischer kultivierter menschlicher Colon-Mucosa, in Ratten-Serosa-Mastzellen, in sekretorischer Granula der menschlichen Lungen-Mastzellen, in menschlichen durch Phorbol-Myristat-Acetat aktivierten Monocyten und von solchen Monocyten stammenden Makrophagen, in Mäuse-Osteoblasten, in Ratten-Glomerulus vaskulären Membranzellen und in Zellen der Gefäßwand von Seegurken, gefunden worden. Das GalNAc(4,6-bisS) ist zusätzlich an dem nicht reduzierenden Ende des Chondroitin-Sulfats aus einem epihysialen embryonalen Hühnerknorpel, im rattenxiphoiden Knorpelfortsatz und in der durch Kultivieren von embryonalen Hühner-Chondrocyten erhaltenen Zellschicht gefunden worden. Des Weiteren ist GalNAc(4,6-bisS)β1-4-GlcAβ1-3GalNac(4,6-bisS) an dem nicht reduzierenden Ende des Chondroitin-Sulfats vom Thrombomodulin gefunden worden, das aus einer Kaninchenlunge extrahiert und gereinigt ist. Darüber hinaus ist GLcA(2S)-GalNAc(6S) an dem nicht reduzierenden Ende des Chondroitin-Sulfats aus Mastzellen gefunden worden, die aus einem Mäuse-Lymphknoten stammen (Glycobiology Series (I), „Diversified World of Saccharides", Kodansha, p. 166).
  • Es wird in Betracht gezogen, dass die Diversifikation des wie oben beschriebenen Sulfatierungs-Musters des Chondroitin-Sulfats eine molekulare Grundlage der Funk tion des Chondroitin-Sulfats wiedergibt. Es wird auch in Betracht gezogen, dass die Sulfatierung eine wichtige Rolle in der Expression der physiologischen Aktivitäten des Chondroitin-Sulfats spielt. In Anbetracht der Bedeutung der Sulfatierung bei der Expression der physiologischen Aktivitäten des Chondroitin-Sulfats wird es erwartet, dass ein Verfahren zur Sulfatierung einer speziellen Stelle eines Chondroitin-Sulfats unentbehrlich ist, um die physiologischen Aktivitäten des Chondroitin-Sulfats zu analysieren und dessen Funktion zu modifizieren. Eine Sulfatierung einer speziellen Stelle eines Zuckerrests eines Glycosaminoglycans wird durch eine Sulfotransferase, die spezifisch zu der Stelle ist, katalysiert.
  • Wenn ein Gen einer Sulfotransferase für das Glycosaminoglycan geklont wird, kann die Information über die Substratspezifiät, die den Akzeptor betrifft, erhalten werden, wobei ein nützlicher Ansatz bereitgestellt wird, um das Verhältnis zwischen der Struktur und der Funktion des Glycosaminoglycans zu studieren. Es wird angenommen, dass verschiedene Typen der Glycosaminoglycan-Sulfotransferasen an der Synthese des Glycosaminoglycans beteiligt sind. Das Klonieren der cDNS der Sulfotransferase ist jedoch schwierig. Tatsächlich enthalten diejenigen, die geklont wurden, cDNSn der N-Sulfotransferase/N-Deacetylase aus der Rattenleber, der Heparin produzierenden Zelllinie und dem Maus-Mastzell-Tumor.
  • Die vorliegenden Erfinder haben offenbar aus einem Kulturüberstand von Hühnerchondrocyten, die in einem serumfreien Medium kultiviert werden, eine homogene Chondroitin-6-Sulfotransferase (im Folgenden oftmals als „C6ST" abgekürzt) gereinigt, die die Sulfatgruppe von dem 3'-Phosphoadenosin 5'-Phosphosulfat zu der C-6-Position des N-Acetylgalactosaminrests des Glycosaminoglycans, wie z. B. Chondroitin, überträgt (Habuchi, O., Matsui, Y., Kotoya, Y., Aoyama, Y., Yasuda, Y. und Noda, M. (1993) J. Biol. Chem. 268, 21968–21974).
  • Des Weiteren haben die vorliegenden Erfinder Oligonukleotid-Primer auf der Basis der teilweisen Aminosäuresequenz dieses Enzyms präpariert und die Hühner-cDNS mit Hilfe dieser Primer kloniert und haben überprüft, dass die C6ST-Aktivität durch das aus dieser DNS erhaltene Polypeptid exprimiert wird. Die vorliegenden Erfinder haben auch herausgefunden, dass dieses Enzym eine Aktivität aufweist, um die Sulfatgruppe zu der C-6-Position des Galactoserests des Keratansulfats zu übertragen (Fukuta, M., Uchimura, K., Nakashima, K., Kato, M., Kimata, K., Shinomura, T. und Habuchi, O. (1995) J. Biol. Chem. 270, 18575–18580).
  • Da jedoch bis jetzt eine DNS unbekannt war, die für das Polypeptid der vom Menschen stammenden Chondroitin-6-Sulfotransferase kodiert, kann die Applikation dieser für Pharmazeutika erwartet werden.
  • In Anbetracht der Bedeutung der Sulfatierung bei der Expression der physiologischen Aktivitäten des Chondroitin-Sulfats, ist das Enzym, das die Sulfatgruppe zum Chondroitin-Sulfat transferiert, nicht nur von besonderer Bedeutung, um eine Studie der Analyse der Funktion des Chondroitin-Sulfats durchzuführen, sondern auch, um einen sicheren Typ des Chondroitin-Sulfats bereitzustellen, um Pharmazeutika zu entwerfen, die bevorzugt für den Menschen physiologische Aktivitäten aufweisen. Wenn darüber hinaus ein vom Menschen stammendes Polypeptid der Chondroitin-6-Sulfotransferase (C6ST) und eine für das Polypeptid kodierende DNS erhalten werden, kann dessen medizinische Anwendbarkeit, einschließlich der Gentherapie in der Form von Pharmazeutika gegen oder Diagnostika für menschliche Erkrankungen, die einer niedrigen Sulfatierung an der C-6-Position des N-Acetylgalactosaminrests des Chondroitin-Sulfats, einer niedrigen Sulfatierung an der C-6-Position des Galactoserests des Keratansulfats und dergleichen (die hierbei verwendete „Niedrigsulfatierung" bedeutet, dass der Sulfatierungsgrad niedrig ist) zuordenbar sind, erwartet werden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Der Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Polypeptid einer vom Menschen stammenden Glycosaminoglycan-Sulfotransferase und ein davon teilweises Polypeptid wie auch eine dafür für mindestens einen Teil der vom Menschen stammenden Glycosaminoglycan-Sulfotransferase kodierende DNS, bereitzustellen.
  • Die vorliegenden Erfinder haben das Klonieren der für die Hühner-Chondroitin-6-Sulfotransferase kodierende cDNS durchgeführt und unter Verwendung eines von dieser cDNS erhaltenen Fragments waren sie erfolgreich im Klonieren einer cDNS aus der menschlichen cDNS-Bibliothek, welche für dieses Enzym kodiert. Die vorliegenden Erfinder haben basierend auf diesem ein vom Menschen stammendes Polypeptid einer Glycosaminoglycan-Sulfotransferase und ein davon teilweises Polypeptid (im Folgenden zusammenfassend als „Polypeptid der vorliegenden Erfindung" beschrieben) wie auch eine DNS, die für mindestens einen Teil der vom Menschen stammenden Glycosaminoglycan-Sulfotransferase kodiert (im Folgenden auch als „DNS der vorliegenden Erfindung" bezeichnet), bereitgestellt.
  • Dementsprechend ist gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid einer vom Menschen stammenden und die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweisende Glycosaminoglycan-Sulfotransferase bereitgestellt:
    • (i) Wirkung: Eine Sulfatgruppe wird von einem Sulfatgruppendonor zu dem N-Acetylgalactosaminrest oder dem Galactoserest des Glycosaminoglycans übertragen,
    • (ii) Substratspezifität: Die Sulfatgruppe wird zu der Hydroxylgruppenposition an das C-6 des N-Acetylgalactosaminrests des Chondroitins übertragen und die Sulfatgruppe wird an die Hydroxylgruppenposition an das C-6 des Galactoserests des Keratansulfats übertragen und
    • (iii) Molekulargewicht: Etwa von 50.000 bis 55.000 Da.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist dort eine vom Menschen stammende und mindestens einen Teil der in der SEQ ID No: 2 gezeigten Sequenz aufweisende Glycosaminoglyccan-Sulfotransferase mit oder ohne einer Substitution, einer Deletion oder einer Insertion einer oder mehrerer Aminosäurereste bereitgestellt, welche im Wesentlichen die Aktivität, um die Sulfatgruppe von einem Sulfatgruppendonor zu dem N-Acetylgalactosaminrest oder dem Galactoserest des Glycosaminoglycans zu übertragen, nicht verschlechtert. In einer bevorzugten Ausführung stellt die vorliegende Erfindung ein vom Menschen stammendes und mindestens einen Teil der in SEQ ID No: 2 gezeigten Aminosäuresequenz aufweisendes Polypeptid einer Glycosaminoglycan-Sulfotransferase bereit.
  • Gemäß einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid bereit, das einen Teil des oben definierten Polypeptids enthält.
  • Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist dort eine DNS bereitgestellt, die für mindestens einen Teil des oben definierten Polypeptids der Glycosaminoglycan-Sulfotransferase kodiert. Die DNS der vorliegenden Erfindung enthält vorzugsweise eine für die Aminosäuresequenz kodierende Nukleotidsequenz aufweisende DNS, die durch die von 1 bis 479 oder 20 bis 479 in der SEQ ID NO: 2 nummerierten Aminosäuren dargestellt ist, und noch bevorzugter eine DNS, die mindestens einen Teil oder die gesamte in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nukleotidsequenz aufweist.
  • Da eine für eine vom Menschen stammende Glycosaminoglycan-Sulfotransferase kodierende DNS erhalten worden ist, kann es erwartet werden, eine vom Menschen stammende Glycosaminoglycan-Sulfotransferase in ausreichenden Mengen herzustellen, um das Enzym industriell verfügbar zu machen. Es kann auch die medizinische Verwendung der Applikation der vom Menschen stammenden Glycosaminoglycan-Sulfotransferase-cDNS und des C6ST-Enzymproteins erwartet werden.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung wird nun im Einzelnen in Verbindung mit dem Polypeptid und der DNS der vorliegenden Erfindung sukzessiv erläutert werden.
  • <1> Polypeptid der vorliegenden Erfindung
  • Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthält ein Polypeptid der vom Menschen stammenden Glycosaminoglycan-Sulfotransferase (im Folgenden auch als menschliche Glycosaminoglycan-Sulfotransferase bezeichnet) und weist die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften auf:
    • (i) Wirkung: Eine Sulfatgruppe wird von einem Sulfatgruppendonor zu einem N-Acetylgalactosaminrest oder einem Galactoserest des Glycosaminoglycans übertragen,
    • (ii) Substratspezifität: Die Sulfatgruppe wird von der Hydroxylgruppenposition des C-6 des N-Acetylgalactosaminrests des Chondroitins übertragen, die Sulfatgruppe wird zu der Hydroxylgruppenposition des C-6 des Galactoserests des Keratansulfats übertragen und
    • (iii) Molekulargewicht: Etwa von 50.000 bis 55.000 Da.
  • Der Sulfatgruppendonor ist vorzugsweise 3'-Phophoadenosin 5'-Phosphosulfat.
  • Ein bevorzugtes Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist ein Typ-II-Membran-Protein.
  • Das oben definierte Molekulargewicht ist ein geschätztes Molekulargewicht eines Polypeptids, das auf der Basis einer Aminosäuresequenz berechnet ist. Von diesem Enzym wird erwartet, dass es als Glycoprotein in der Natur vorkommt und deshalb als ein Ergebnis des Zusatzes einer Zuckerkette ein größeres Molekulargewicht als das oben definierte aufweist.
  • Das „Typ-II-Membran-Protein" bedeutet ein Protein, das eine hydrophobe transmembrane Domain an der aminoterminalen Seite enthält und welches in einer solchen Gestalt biosynthetisiert ist, dass das carboxyterminale Ende in das Lumen des Golgi-Körpers hineinragt.
  • Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung hat bevorzugt, zusätzlich zu den wie in (i) bis (iii) oben definierten physikalischen und chemischen Eigenschaften, 460 bis 479 Aminosäurereste.
  • Unter Berücksichtigung der oben in (ii) definierten Substratspezifität zeigt das Polypeptid der vorliegenden Erfindung nicht nur eine Aktivität, um die Sulfatgruppe zu der C-6-Position des N-Acetylgalactosamins (C6ST-Aktivität) zu übertragen, sondern zeigt auch eine Aktivität, um die Sulfatgruppe zu der C-4-Position davon zu übertragen (C4ST-Aktivität), und das Verhältnis der erstgenannten Aktivität (C6ST-Aktivität) zu der letzteren Aktivität (C4ST-Aktivität) ist etwa 15 bis 20.
  • In einem weiteren Aspekt enthält das Polypeptid der vorliegenden Erfindung das Polypeptid der menschlichen Glycosaminoglycan-Sulfotransferase, die optional eine Substitution, eine Deletion oder eine Insertion einer oder mehrerer Aminosäureresten aufweisen kann, die im Wesentlichen nicht die Aktivität, um die Sulfatgruppe von einem Sulfatgruppendonor zu einem N-Acetylgalactosaminrest oder einem Galactoserest des Glycosaminoglacans zu übertragen, verschlechtert. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung weist vorzugsweise mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz auf, die nicht weniger als 80% (noch bevorzugter nicht weniger als 90%) Homologie mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz und noch bevorzugter mindestens einen Teil der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz aufweist, die keine Substitution, Deletion oder Insertion eines Aminosäurerests enthält.
  • Eine solche Substitution, Deletion oder Insertion von Aminosäureresten kann durch Einführen eines oder mehrerer Nukleotide, die für eine Substitution, eine Deletion oder eine Insertion einer oder mehrerer Aminosäureresten in einer DNS verantwortlich sind, die für mindestens einen Teil der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenz kodiert, und dann durch Expression der resultierenden DNS, erhalten werden.
  • Eine Substitution, eine Deletion oder eine Insertion von Nukleotiden in eine DNS-Sequenz kann durch das Synthetisieren einer Sequenz, die Restriktions-Enzym-Schnitt-Termini an beiden Enden aufweist und einen Anteil enthält, der sich über beide Seiten eines Mutationspunktes erstreckt, gefolgt vom Ersetzen des korrespondierenden Anteils der nichtmutierten DNS-Sequenz mit der synthetisierten Sequenz, eingeführt werden.
  • Alternativ kann eine Substitution, eine Insertion oder eine Deletion gemäß einem Verfahren, wie z. B. einem ortsspezifischen Mutagenese-Verfahren, in eine DNS-Sequenz eingeführt werden (Kramer, W. und Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)). Die Aktivität, um eine Sulfatgruppe von einem Sulfatgruppendonor zu einem N-Acetylgalactosaminrests oder einem Galactoserest eines Glycosaminoglycans zu übertragen, kann z. B. mit einem unten beschriebenen Enzym-Aktivitäts-Assay bestimmt werden und infolgedessen kann eine Substitution, eine Deletion oder eine Insertion einer oder mehrerer Aminosäurereste, die die Aktivität im Wesentlichen nicht verschlechtern, von Fachleuten leicht erkannt werden.
  • Es ist auch möglich, einen Teil der Struktur des Polypeptids durch natürliche oder artifiziale Mutation ohne eine signifikante Änderung der Aktivität des Polypeptids auszutauschen. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthält ein Polypeptid, das eine Struktur aufweist, die homologen Varianten des Polypeptids entspricht, das die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
  • Die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz enthält Methionin an der Aminosäure Nr. 20, welches wahrscheinlich mit dem üblichen Methionin an der Aminosäure Nr. 1 den N-Terminus des Peptids der vorliegenden Erfindung ausbildet. Infolgedessen enthält das Polypeptid der vorliegenden Erfindung die Polypeptide der Glycosaminoglycan-Sulfotransferase, die die Aminosäurensequenzen aufweisen, die durch die von 1 bis 479 und von 20 bis 479 in der SEQ ID NO: 2 nummerierten Aminosäuren dargestellt sind, von denen beide besonders bevorzugt sind. Die NH2-terminale Signal-Peptid-Sequenz ist offensichtlich in der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz nicht anwesend, aber die Gegenwart dieser Signal-Peptid-Sequenz muss nicht immer ausgeschlossen sein. Abgesehen von einem Methionin gebildeten N-Terminus und abgesehen davon, ob eine NH2-Terminus-Signal-Peptid-Sequenz vorliegt oder nicht, enthält die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz ein Glycosaminoglycan-Sulfotransferase Polypeptide.
  • Auf diesen Standpunkten basierend, bezieht sich das „mindestens einen Teil der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz aufweisen", auf die kürzeste Aminosäuresequenz, die notwendig für ein Polypeptid ist, um eine Sulfotransferase-Aktivität aufzuweisen.
  • Des Weiteren enthält das Polypeptid der vorliegenden Erfindung das Polypeptid, welches einen Teil der oben definierten Polypeptide enthält. Der hierbei verwendete „Teil" bezeichnet einen Teil, der irgendeine Aktivität oder Funktion, wie z. B. eine Sulfotransferase-Aktivität oder eine Antigenität aufweist. Ein solcher Teil kann leicht von Fachleuten erkannt werden.
  • Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung muss nicht immer als unabhängige Polypeptide existieren, sondern kann auch einen Teil eines Fusions-Proteins bilden. Die Fusions-Polypeptide, die genannt werden können, sind solche, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung zusammen mit einem oder mehreren für die Expression benötigten Polypeptiden enthalten.
  • Das wie oben diskutierte Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann durch Verwendung der DNS der vorliegenden Erfindung in einer wie unten beschriebenen Weise präpariert werden. Die Glycosaminoglycan-Sulfotransferase (C6ST) kann noch spezieller durch Kultivieren einer Zelle, die eine DNS der vorliegenden Erfindung enthält, in einem angemessenen Medium, um es zu ermöglichen, dass C6ST produziert und in dem Medium akkumuliert wird, und dann durch Sammeln des C6ST's aus dem Medium präpariert werden. Die DNS der vorliegenden Erfindung kann mit Hilfe eines gewöhnlich für die Herstellung von Proteinen verwendeten Wirt-Vektor-Systems exprimiert werden. Säugetierzellen, wie z. B. COS-7-Zellen, sind bevorzugt. Wie für die Expression der DNS der vorliegenden Erfindung kann dieses direkt exprimiert werden, oder es kann als ein Fusions-Protein, das ein anderes Protein enthält, exprimiert werden. Die DNS der vorliegenden Erfindung kann in ihrer gesamten Länge exprimiert werden, oder ein Teil von ihr kann als teilweises Peptid exprimiert werden.
  • Ein Antikörper zur Bindung an C6ST kann unter Verwendung des wie unten in einer Weise erhaltenen beschriebenen C6ST-Polypeptids, dem teilweisen Polypeptid davon oder einem Fusions-Protein von einem von diesen mit einem anderen Protein, hergestellt werden. Die Herstellung des Antikörpers kann in der gleichen Weise wie die Herstellung eines gewöhnlichen Antikörpers durchgeführt werden. Ein monoklonaler Antikörper zur Bindung an C6ST kann auch gemäß einem gewöhnlichen Verfahren präpariert werden.
  • <2> DNS der vorliegenden Erfindung
  • Die DNS der vorliegenden Erfindung ist eine vom Menschen stammende DNS, die für mindestens einen Teil des Polypeptids der menschlichen Chondroitin-6-Sulfotransferase kodiert, und ist zum ersten Mal gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert worden.
  • Noch spezieller enthält die DNS der vorliegenden Erfindung eine DNS, die für mindestens einen Teil des Polypeptids der menschlichen C6ST kodiert und die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweist.
    • (i) Wirkung: Eine Sulfatgruppe wird von einem Sulfatgruppendonor zu einem N-Acetylgalactosaminrest oder einem Galactoserest des Glycosaminoglycans übertragen,
    • (ii) Substratspezifität: Eine Sulfatgruppe wird zu der Hydroxylgruppenposition des C-6 des N-Acetylgalacosaminrests des Chondroitins übertragen, eine Sulfatgruppe wird zu der Hydroxylgruppenposition des C-6 des Galactoserests des Keratan-Sulfats übertragen und
    • (iii) Molekulargewicht: Etwa von 50.000 bis 55.000 Da.
  • Der Sulfatgruppendonor ist vorzugsweise 3'-Phosphoadenosin 5'-Phosphosulfat.
  • Ein bevorzugtes Polypeptid ist ein Typ-II Membran-Protein.
  • Um zusätzlich die wie oben in (i) bis (iii) definierten physikalischen und chemischen Eigenschaften aufzuweisen, sind Polypeptide bevorzugt, die 460 bis 497 Aminosäurereste aufweisen.
  • Im Hinblick auf die oben in (ii) definierte Substratspezifität hat das Polypeptid der vorliegenden Erfindung nicht nur eine Aktivität, um eine Sulfatgruppe zu der C-6-Position des N-Acetylgalactosamins (C6ST-Aktivität) zu übertragen, sondern weist auch eine Aktivität, um eine Sulfatgruppe zu der C-4-Position davon (C4ST-Aktivität) zu übertragen, und das Verhältnis der erstgenannten Aktivität (C6ST-Aktivität) zu der letzteren Aktivität (C4ST-Aktivität) ist etwa 15 bis 20.
  • Das durch die DNS der vorliegenden Erfindung kodierte Enzym weist die Aktivität auf, um eine Sulfatgruppe zu der Hydroxylgruppenposition des C-6 des N-Acetylgalactosamins des Chondroitins zu übertragen, und wird infolgedessen in geeigneter Weise als „Chondroitin-6-Sulfotransferase" benannt. Auch in dieser Beschreibung wird das Enzym als „Chondroitin-6-Sulfotransferase" oder in abgekürzter Form als „C6ST" bezeichnet.
  • Die Nukleotid-Sequenz der DNS der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders eingeschränkt, vorausgesetzt, dass sie für mindestens einen Teil des Polypeptids der Glycosaminoglycan-Sulfotransferase kodiert.
  • Die DNS der vorliegenden Erfindung enthält eine DNS, die für mindestens einen Teil des Polypeptids der menschlichen Glycosaminoglycan-Sulfotransferase kodiert, und kodiert für den gesamten oder einen Teil der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz.
  • Und das durch die DNS der vorliegenden Erfindung kodierte Polypeptid der menschlichen Glycosaminoglycan-Sulfotransferase kann beliebig eine Substitution, eine Deletion oder eine Insertion von einem oder mehreren Aminosäureresten enthalten, welche die Aktivität, um eine Sulfatgruppe von einem Sulfatgruppendonor zu einem N-Acetylgalactosaminrest oder einem Galactoserest des Glycosaminoglycans zu übertragen, im Wesentlichen nicht verschlechtert.
  • Die DNSn der vorliegenden Erfindung, die speziell genannt werden können, sind jene, die die für die Aminosäuresequenzen kodierenden Nukleotid-Sequenzen aufweisen, die durch die von 1 bis 479 und von 20 bis 479 in der SEQ ID NO: 2 nummerierten Aminosäuren dargestellt sind, von denen beide besonders bevorzugt sind. In einem anderen Aspekt ist die DNS der vorliegenden Erfindung besonders eine, die mindestens einen Teil oder die gesamte der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nukleotid-Sequenz aufweist. Die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nukleotid-Sequenz enthält ein anderes Methionin-Codon (ATG) an der Position, die mit der mit 20 nummerierten Aminosäure übereinstimmt. Von diesem Methionin-Codon ist das erste Methionin-Codon am geeignetsten, um ein Initiierungs-Codon zu bilden, aber auch die anderen sind dazu geeignet, als ein Initiierungs-Codon zu wirken. Dementsprechend sind die DNSn, die speziell genannt werden können eine DNS, die eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die sich in einem Bereich von 147 bis 1.583 der SEQ ID NO: 1 erstreckt, eine DNS, die eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die sich in einem Bereich von 204 bis 1.583 der SEQ ID NO: 1 erstreckt, und dergleichen.
  • Die Fachleute werden leicht verstehen, dass DNSn, die eine unterschiedliche Nukleotid-Sequenz durch Degenerieren des genetischen Codes aufweise, auch in der DNS der vorliegenden Erfindung enthalten sind. Solche DNSn sind alle in der DNS der vorliegenden Erfindung enthalten.
  • Darüber hinaus ist es anzunehmen, dass das chromosomale Glycosaminoglycan-Sulfotransferase-Gen ein oder mehrere Introns in seiner kodierenden Region enthält.
  • Ein DNS-Fragment kann unter der Voraussetzung, dass es für mindestens einen Teil eines Polypeptids der Glycosaminoglycan-Sulfotransferase kodiert, in dem DNS-Fragment der vorliegenden Erfindung enthalten sein, auch wenn es durch das Vorhandensein solcher Introns in Segmente aufgeteilt ist. Noch spezieller sollte es verstanden werden, dass der hierbei verwendete Begriff „Code" bedeutet, dass eine DNS eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die verschiedenen Prozessen bei der Transkription unterliegen kann, um letztendlich ein planmäßiges Polypeptid herzustellen.
  • Der hierbei verwendete Ausdruck „für mindestens einen Teil eines Polypeptids kodiert" bedeutet, für einen Teil kodieren, der eine oder mehrere Aktivitäten oder Funktionen aufweist, wie z. B. eine Sulfotransferase-Aktivität, eine Antigenität und dergleichen, oder für einen Teil kodieren, dessen übereinstimmende Nukleotid-Sequenz spezifisch zu der Glycosaminoglycan-Sulfotransferase ist, und dementsprechend als ein Primer oder eine Sonde verwendbar ist.
  • Die vorliegende Erfindung enthält des Weiteren eine DNS oder eine RNS, die zu der DNS der vorliegenden Erfindung komplementär ist. Die DNS der vorliegenden Erfindung kann eine Einzelstrang-DNS, die nur einen C6ST-kodierenden Strang umfasst, oder sie kann eine Doppelstrang-DNS sein, die aus dem Einzelstrang und einer DNS oder einem RNS-Strang besteht, welche eine komplementäre Sequenz dazu aufweisen.
  • Die DNS der vorliegenden Erfindung kann eine vollständige Länge einer kodierenden Region aufweisen, die für die gesamte C6ST kodiert, oder sie kann ein Fragment sein, welches für ein Teil-Peptid der C6ST kodiert.
  • Die DNS der vorliegenden Erfindung kann, da dessen Nukleotid-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt worden ist, durch Synthetisieren auf der Basis der Nukleotid-Sequenz oder durch Amplifizieren einer menschlichen chromosomalen DNS oder RNS gemäß dem PCR-Verfahren (Polymerase-Ketten-Reaktions-Verfahren) unter Verwendung der auf der Basis der Sequenz hergestellten Oligonukleotid-Primer erhalten werden. Wie im Folgenden in den Beispielen diskutiert, ist die DNS der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal mittels der cDNS-Klonierung erhalten worden, welche die folgenden Schritte umfasst:
  • (1) Klonieren einer cDNS, die für ein Hühner-C6ST-Polypeptid kodiert
    • (i) Bestimmung einer teilweisen aus einer embryonalen Hühner-Chondrocyte gereinigten Aminosäuresequenz einer C6ST,
    • (ii) Herstellung eines Oligonukleotid-Primers für die PCR auf der Basis der bestimmten Aminosäuresequenz,
    • (iii) Amplifikation der teilweisen cDNS der C6ST aus der aus den embryonalen Hühner-Chondrocyten stammenden Poly(A)+-RNS gemäß dem PCR-Verfahren und
    • (iv) Screenen der gesamten Länge der C6ST-cDNS aus einer cDNS-Bibliothek, die aus den embryonalen Hühner-Chondrocyten stammt.
  • (2) Klonieren der für ein Polypeptid der menschlichen C6ST kodierenden cDNS
    • (i) Herstellung einer Sonde zum Screenen einer menschlichen cDNS-Bibliothek auf der Basis der Ergebnisse der Nukleotid-Sequenz-Analysen der wie in einer oben in
    • (iv) beschriebenen Weise isolierten cDNS,
    • (ii) Screenen des cDNS-Klons, der für die menschliche C6ST kodiert, unter Verwendung der wie in (i) hergestellten Sonde und
    • (iii) Nukleotid-Sequenz-Analyse der erhaltenen cDNS.
  • Das DNS-Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist auf keinen Fall auf diese oben beschriebenen eingeschränkt, so dass das oben zitierte PCR-Verfahren oder irgendwelche anderen bekannten cDNS-Klonierungsverfahren verwendet werden können.
  • Ein Verfahren, um die DNS der vorliegenden Erfindung zu erhalten, wird unten speziell erklärt werden.
  • (1) Bestimmung einer teilweisen Aminosäuresequenz einer Hühner-C6ST und Herstellung von PCR-Primern
  • (i) Reinigung einer Hühner-C6ST
  • Die Chondroitin-6-Sulfotransferase kann aus kultivierten Zellen, die dieses Enzym exprimieren, wie z. B. embryonale Hühner-Chondrocyten, unter Verwendung einer Kombination eines gewöhnlich bekannten Protein-Reinigungs-Verfahrens und eines gewöhnlich bekannten Sulfotransferasen-Reinigungs-Verfahrens, gereinigt werden. Vorzugsweise kann die wie in J. Biol. Chem. 268, (29), 21968–21974 (1993) beschriebene Reinigung durchgeführt werden. Ein Verfahren zum Messen der Aktivität der Sulfotransferase und ein Verfahren zum Bestimmen der Position einer übertragenen Sulfatgruppe sind detailliert unter der Überschrift „Enzym-Aktivitäts-Assay" am Anfang der Beschreibung der Beispiele beschrieben.
  • (ii) Bestimmung der teilweisen Aminosäuresequenz der Hühner-C6ST
  • Es ist bekannt, dass eine Zuckerkette an der gereinigten C6ST gebunden ist. Um die Zuckerkette zu entfernen, wird die gereinigte C6ST mit einem Enzym, wie z. B. einer N-Glycanase, verdaut. Die resultierende deglycosylierte C6ST wird einem Trennungs-Verfahren, wie z. B. einer SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese) unterzogen, worauf die Übertragung auf eine Polyvinyliden-Fluorid(PVDF)-Membran, eine Nitrozellulose-Membran oder dergleichen folgt. Die Membran wird mit einem Farbstoff zum Färben von Proteinen, wie z. B. Coomassie-Brilliant-Blau oder Amido-Black, gefärbt. Eine nach dem Verdau mit der N-Glycanase gebildete Proteinbande wird ausgeschnitten und sie wird für das Bestimmen einer Aminosäuresequenz der deglycosylierten C6ST verwendet. Für den Fall der Bestimmung einer inneren Aminosäuresequenz der C6ST ist es notwendig, dass die deglycosylierte C6ST einem Trennungsprozess, wie z. B. einem SDS-PAGE oder dergleichen, unterzogen wird. Das Gel wird mit einem Farbstoff zum Färben von Proteinen, wie z. B. Coomassie-Brilliant-Blau oder Amido-Black, gefärbt. Eine nach dem Verdau mit einer N-Glycanase gebildete Proteinbande wird ausgeschnitten und sie wird für die Fragmentierung verwendet.
  • Das Fragmentierungsverfahren ist nicht besonders eingeschränkt, aber es wird bevorzugt mit der Hilfe eines proteolytischen Enzyms, wie z. B. einer Protease V8 (Sequenzierungsqualität, hergestellt von Boehringer Mannheim) durchgeführt. Alternativ kann das ausgeschnittene Gel dem proteolytischen Enzym ausgesetzt werden, gefolgt durch das Trennen mittels einer SDS-PAGE oder dergleichen. Ein geeignetes Verfahren, das genannt werden kann, ist ein von Cleveland, D. W., Fischer, S. G., Kirshner, M. W. und Laemmli, U. K. (1977) in J. Biol. Chem. 252, 1102–1106, beschriebenes Verfahren. Kurz dargestellt, umfasst dieses Verfahren die Schritte des Ausschneidens einer Proteinbande, dessen Einführen in die Tasche eines anderen Gels, Auftragen eines Puffers, der ein proteolytisches Enzym enthält, auf das eingelegte Gel, um eine SDS-PAGE durchzuführen, zeitweiliges Stoppen der Elektrophorese durch das Ausschalten der Energiequelle bevor ein voranlaufendes Ende eines Farbstoffs in ein Trenngel eintritt, Durchführen eines enzymatischen Verdaus für etwa 30 Minuten und dann erneutes Starten der Elektrophorese. Dieses Verfahren ist daher günstig, da der enzymatische Verdau und die Trennung der erhaltenen Peptid-Fragmente nach dem Verdau in einem Einschrittverfahren durchgeführt werden können. Die durch den Verdau mit der Protease gebildeten Peptide werden auf eine PVDF-Membran, eine Nitrozellulose-Membran oder dergleichen übertragen. Die Membran wird mit einem Farbstoff zum Färben von Proteinen, wie z. B. Coomassie-Brilliant-Blau oder Amido-Black, gefärbt. Danach werden die Peptidbanden ausgeschnitten. Die PVDF-Membran, die Nitrozellulose-Membran oder dergleichen, welche die nach dem Verdau mit dem proteolytischen Enzym erzeugten Peptide enthalten, können mit dem bekannten Verfahren behandelt werden, um die aminoterminalen Sequenzen der Peptide zu bestimmen.
  • (iii) Synthese der Oligonukleotid-Primer
  • Sobald die teilweise Aminosäuresequenz der C6ST bestimmt ist, können die Oligonukleotid-Primer für die PCR auf der Basis der Aminosäuresequenz hergestellt werden. Es ist bevorzugt eine Region zu verwenden, in der die Aminosäuresequenz eine möglichst geringe Degeneration aufweist.
  • Beispiele für solche Primer sind die nachstehend in den folgenden Beispielen in Tabelle 2 gezeigten „Sense"-Primer (Primer-1s und Primer-2s) und ein „Anti-Sense"-Primer (Primer-3a). Der Sense-Primer-1s und der Anti-Sense-Primer-3a weisen eine Sequenz auf, die jeweils eine HindIII-Stelle und eine EcoRI-Stelle am entsprechenden 5'-Ende enthalten. Diese erlauben noch günstiger die Handhabung des Inserierens eines PCR-amplifizierten DNS-Fragments in einen Vektor.
  • Die Bestimmung einer teilweisen, von einer embryonalen Hühner-Chondrocyte abgeleiteten, Aminosäuresequenz der C6ST und die Synthese der Oligonukleotid-Primer für eine PCR sind in den Dokumenten, wie z. B. J. Biol. Chem. 270, 18575–18580 (1995) offengelegt.
  • (2) Herstellung einer teilweisen cDNS der C6ST
  • (i) Herstellung einer Gesamt-RNS
  • Eine Gesamt-RNS kann entsprechend einem bekannten Verfahren (z. B., Kingston, R. E., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York) erhalten werden. Das Material zur Herstellung einer Gesamt-RNS ist nicht besonders eingeschränkt, vorausgesetzt, dass die mRNS der Chondroitin-6-Sulfotransferase in dem Material exprimiert wird. Zelllinien werden jedoch bevorzugt, da sie einfach zu handhaben sind und sie im Stande sind zu proliferieren. Unter den Zelllinien sind besonders Hühner-Embryo-Chondrocyten bevorzugt. Die Chondrocyten können entsprechend einem bekannten Verfahren (z. B. Kim. J. J. and Conrad, H. E. (1976) J. Biol. Chem. 251, 6210–6217; Kim. J. J. and Conrad, H. E. (1977) J. Biol. Chem. 252, 8292–8299; Kim. J. J. and Conrad, H. E. (1980) J. Biol. Chem. 255, 1586–1597) kultiviert werden. Das Medium ist nicht besonders eingeschränkt, vorausgesetzt, dass die Zelllinien in dem Medium wachsen können. Jedoch wird Dulbecco's Modified-Eagle's Medium bevorzugt, da es gut in einer gewöhnlichen Kultur verwendbar ist, es ist leicht erhältlich und es ermöglicht den Zelllinien darin zu wachsen.
  • Das Medium wird bevorzugt auf einem pH in einem neutralen Bereich, speziell auf pH 7,0 eingestellt. Bevorzugt wird D-Glucose in einer Menge von etwa 2 g/l dem Medium hinzugefügt. Um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern, werden bevorzugt Antibiotika, wie z. B. Penicillin und Streptomycin, dem Medium hinzugefügt. Fetales Rinderserum wird bevorzugt in einer Menge von 10% dem Medium hinzugefügt.
  • Die Zellen können in der gleichen Weise wie bei gewöhnlichen Zelllinien unter Verwendung des oben beschriebenen Mediums und unter Verwendung von Roller-Flaschen oder aus Glas oder Plastik hergestellten Kulturschalen kultiviert werden. Die Zellen werden bevorzugt in einem Kohlendioxidgas-Inkubator kultiviert. Die Konzentration des Kohlendioxidgases wird bevorzugt auf 5 bis 7% eingestellt und die Luft in dem Inkubator wird bevorzugt auf 97 bis 93% eingestellt. Die Temperatur wird bevorzugt auf etwa 36 bis 38°C eingestellt. Die Gesamt-RNS kann aus den wie oben be schriebenen kultivierten Zellen entsprechend einem Verfahren erhalten werden, das gewöhnlich für die Herstellung von Gesamt-RNS verwendet wird. Die Gesamt-RNS wird jedoch bevorzugt entsprechend einem Guanidin-Thiocyanat/CsCl-Verfahren (Kingston, R. E., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York) hergestellt.
  • (ii) Herstellung einer Poly(A)+-RNS
  • Eine Poly(A)+-RNS aus der, wie oben beschrieben, erhaltenen Gesamt-RNS kann zum Beispiel mittels einer Oligo-(dT)-Zellulose-Säulenchromatographie gereinigt werden.
  • (iii) Amplifikation der teilweisen cDNS der C6ST durch ein PCR-Verfahren
  • Eine teilweise cDNS der C6ST kann entsprechend einer reversen Transkriptions-PCR (Polymerase Kettenreaktion) unter Verwendung der oben erhaltenen Poly(A)+RNA als ein Template und unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer amplifiziert werden. Die PCR kann in einer üblich bekannten Weise und gemäß dem im Folgenden spezifizierten Verfahren durchgeführt werden:
  • Ein Puffer (Endvolumen 20 μl) der die Poly(A)+-RNS (1 μg) enthält, ein Oligonukleotid-3a (50 pmol), vier unterschiedliche Deoxynukleosid-Triphosphate (jedes 500 μm), M-MLV-Reverse-Transkriptase (200 Units, hergestellt von Gibco BRL), Dithiothreitol (1 mM) und ein RNase-Inhibitor (120 Units, hergestellt von Takara Shuzo) werden bei 37°C für 60 Minuten inkubiert, um einen primären cDNS-Strang zu synthetisieren. Danach wird eine Reaktionslösung (Endvolumen: 100 μl), die die oben definierte Reaktionsmischung für die reverse Transkriptase (10 μl), die Oligonukleotid-Primer (50 pmol jeder der Sense- und der Anti-Sense-Primer), vier unterschiedliche Deoxynukleosid-Triphophate (jedes 100 μM) und eine Taq-Polymerase (2,5 Units) enthält, dem Amplifikations-Zyklus unterzogen. Jeder Zyklus setzt sich aus einer Minute bei 94°C, einer Minute bei 45°C und drei Minuten bei 55°C zusammen, und dieser Zyklus wird 30 Mal wiederholt.
  • Die so erhaltene teilweise cDNS kann als eine Hybridisierungs-Sonde zum Screenen einer gesamten Länge einer cDNS (eine cDNS die die Gesamtlänge einer kodierenden Region enthält) aus einer cDNS-Bibliothek verwendet werden.
  • (3) Herstellung einer cDNS-Bibliothek
  • (i) Synthese einer cDNS und Herstellung einer rekombinanten DNS Eine cDNS kann mittels einer reversen Transkriptase-Reaktion unter Verwendung einer Poly(A)+-RNS als ein Template synthetisiert werden. Es ist günstig, ein kommerziell erhältliches Kit für eine cDNS-Synthese zu verwenden. Es ist z. B. möglich, unter Verwendung eines TimeSaver-cDNS-Synthese-Kits (Pharmacia LKB Biotechnology) eine cDNS zu synthetisieren und die cDNS in einem Klonierungsvektor (z. B. EcoRI-geschnittenen λgt11) zu ligieren. Auch in der vorliegenden Erfindung wird es bevorzugt, einen EcoRI-geschnittenen λgt11 zu verwenden. Bezüglich des Primers für die reverse Transkriptase-Reaktion wird es bevorzugt, ein Random-Oligonukleotid-Primer zu verwenden. Eine durch die Ligierung der cDNS in einem Klonierungsvektor erhaltene rekombinante DNS wird in bakterielle Wirtszellen eingeführt (Transfektion). Die bakteriellen Wirtszellen sollten in Abhängigkeit von dem ausgesuchten Klonierungsvektor ausgesucht werden. Und eine Kombination von Escherichia coli (E. coli) und einem Klonierungsvektor, der E. coli als einen Wirt verwendet, wird am häufigsten verwendet.
  • Die Transfektion wird gewöhnlich durch Mischen der rekombinanten DNS mit dem E. coli durchgeführt, bei dem die Permeabilität der Zellmembran durch die Gegenwart von 30 mM Kalziumchlorid verändert worden ist. In dem Fall eines λ-Phagen-Vektors, wie z. B. einem λgt11, kann die rekombinante DNS direkt in den Kalziumchlorid behandelten E. coli eingeführt werden.
  • Bei einem gewöhnlich verwendeten Verfahren wird jedoch eine rekombinante DNS vorher in vitro in die Außenhülle des Phagens (als „in vitro-Verpackung" bezeichnet) eingekapselt, so dass der E. coli effizient damit infiziert wird. Auch für diesen Zweck ist ein Kit kommerziell erhältlich (z. B. Gigapack II-Verpackungs-Extrakt, hergestellt von Stratagene). Auch bei der vorliegenden Erfindung wird dieses Verfahren bevorzugt.
  • Eine in vitro verpackte rekombinante DNS wird in E. coli transfiziert. Ein geeigneter E. coli-Stamm sollte in Abhängigkeit von einem verwendeten Klonierungsvektor ausgesucht werden. Wenn ein Klonierungsvektor verwendet wird, der ein antibiotisches Resistenzgen enthält, kann nämlich ein entsprechend zu diesem Antibiotikum resistenter E. coli nicht verwendet werden. Wenn ein Klonierungsvektor verwendet wird, der ein Gen, wie z. B. ein β-Galactositdase-Gen (lacZ) enthält, ist es notwendig einen E. coli-Stamm auszuwählen, der keine β-Galactosidase-Aktivität exprimiert. Dieses ist erforderlich, um einen mit einer rekombinanten DNS transfizierten E. coli zu screenen. Wenn z. B. λgt11 als ein Klonierungsvektor verwendet wird, ist es angemessen einen E. coli-Stamm, wie z. B. einen E. coli Y1088, auszuwählen, der keine β-Galactosidase-Aktivität exprimiert. Der mit einem rekombinanten Vektor transformierte E. coli kann auf der Basis einer zu einem Antibiotikum erworbenen Resistenz und einer erworbenen β-Galactosidase-Aktivität gescreent werden. Noch spezieller werden die E. coli-Zellen auf ein Agar-Medium platiert und die gewachsenen Kolonien können ausgewählt werden. Die gewachsenen E. coli-Kolonien (E. coli mit der rekombinanten DNS transfiziert) bilden eine cDNS-Bibliothek. Wenn λgt11 als ein Vektor verwendet wird, kann er in einem Soft-Agar-Medium zusammen mit Indikator-Bakterien-Zellen suspendiert werden und die Suspension kann in einer dünnen Schicht auf ein Agar-Medium aufgetragen werden, um Plaques zu formen. Die den Vektor enthaltenen Phagen-Plaques mit dem inserierten DNS-Fragment exprimieren keine β-Galactosidase-Aktivität und können somit leicht selektiert werden.
  • (ii) Klonieren der gesamten cDNS-Länge der C6ST
  • Als nächstes kann ein Phagen-Klon, der die gesamte cDNS-Länge der C6ST enthält mittels einer Hybridisierung unter Verwendung einer partiellen C6ST-cDNS als eine Sonde aus der, wie oben beschrieben, erhaltenen cDNS-Bibliothek selektiert werden. Die Hybridisierung kann entsprechend einem gewöhnlichen Verfahren durchgeführt werden.
  • Die C6ST-cDNS kann durch Präparieren einer Phagen-cDNS aus dem selektierten positiven Klon und durch Schneiden der Phagen-DNS mit einem geeigneten Restriktionsenzym ausgeschnitten werden. Die erhaltene cDNS kann als solche oder nach dem Subklonieren in ein geeignetes Plasmid verwendet werden, um die Nukleotid-Sequenz zu bestimmen.
  • (4) Klonieren der cDNS, die für das menschliche C6ST-Polypeptid kodiert
  • (i) Herstellung der Hybridisierungs-Sonden
  • Die wie oben beschriebene erhaltene nicht-menschliche C6ST-cDNS kann der Random-Primer-Markierung mit einem [α-32P]-dCTP unterzogen werden, um eine radioaktive für das Screenen der cDNS-Bibliothek verwendbare Sonde zu erhalten. Kurz dargestellt, kann die oben genannte Hühner-cDNS zusammen mit einem [α-32P]-dCTP (erhältlich von Amersham) und einem DNS-Random-Markierungs-Kits (erhältlich von Takara Shuzo Inc.) einem Random-Oligonukleotid-Primed-Markierungs-Verfahren (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6–13) unterzogen werden, um eine radioaktiv markierte DNS-Sonde zu erhalten.
  • (ii) Errichtung einer menschlichen cDNS-Bibliothek
  • Menschliche Gewebe oder Zellen können behandelt werden, um eine Gesamt-RNS herzustellen, die dann verarbeitet werden kann, um eine Poly(A)+-RNS zu präparieren. Die menschliche cDNS kann durch die reverse Transkriptase-Reaktion unter Verwendung der Poly(A)+-RNS als ein Template synthetisiert werden. Jeder Arbeitsvorgang kann entsprechend mit irgendeinem gewöhnlich in der Gentechnik verwendeten Verfahren durchgeführt werden. Noch spezieller können diese Arbeitsvorgänge in einer Weise durchgeführt werden, die der oben in den Abschnitten (2) und (3) beschriebenen ähnelt.
  • Die cDNS wird in einen Klonierungs-Vektor ligiert. Ein geeigneter Klonierungs-Vektor enthält einen EcoRI verdaubaren λgt11, ist aber nicht auf diesen eingeschränkt. Alternativ kann eine kommerziell erhältliche menschliche cDNS, die in einen Klonierungs-Vektor ligiert ist, verwendet werden. Eine menschliche fetale Hirn-cDNS-Bibliothek (erhältlich von Clontech), die einen λ-Vektor λgt11 integriert, wird besonders bevorzugt.
  • (iii) Screenen des für die menschliche C6ST codierenden cDNS-Klons
  • Unter der, wie oben beschrieben, erhaltenen menschlichen cDNS-Bibliothek kann ein Phagen-Klon, der die gesamte Länge der C6ST-cDNS beherbergt, durch eine Hybridisierung unter Verwendung der [α-32P]-dCTP-markierten radioaktiven Sonde, die entsprechend mit dem oben beschriebenen (i) Verfahren hergestellt wird, ausgewählt werden.
  • Die Hybridisierung kann durch übliche in der Gentechnik verwendete Techniken, wie z. B. der Plaque-Hybridisierung, durchgeführt werden. Ein Plaque der einen Hybrid mit der Sonde ausbildet, kann als ein positiver Klon durch die Detektion einer sondengebundenen Markierung isoliert werden.
  • (iv) Nukleotid-Sequenz-Analyse der cDNS
  • Eine C6ST-cDNS kann durch die Herstellung einer Phagen-DNS aus dem ausgewählten positiven Klon und durch Schneiden der Phagen-DNS mit einem geeigneten Restriktionsenzym ausgeschnitten werden. Die erhaltene cDNS kann als solche, oder nach dem Subklonieren in ein geeignetes Plasmid verwendet werden, um die Nukleotid-Sequenz zu bestimmen.
  • Von der in einer wie oben beschriebenen Weise bestimmten Nukleotid-Sequenz der menschlichen C6ST-cDNS ist der Teil des offenen Lesenrahmens in SEQ ID NO: 1 gezeigt und die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 2 gezeigt. Ein einfacher offener Leserahmen, der mit dem ersten ATG-Kolon beginnt, legt ein Protein nahe, das 479 Aminosäurereste und ein Molekulargewicht von 54.610 aufweist.
  • Eine DNS, die in einer wie oben beschriebenen Weise erhalten werden kann, kann optional eine Substitution, eine Deletion oder eine Insertion von einem oder mehreren Aminosäureresten enthalten, vorausgesetzt, dass die durch diese DNS kodierte C6ST im Wesentlichen nicht in der Aktivität verschlechtert wird, um eine Sulfatgruppe von einem Sulftatgruppen-Donor zu einem N-Acetylgalacotosaminrest oder einem Galactoserest eines Glycosaminoglycans zu übertragen. Eine solche Substitution, Deletion oder Insertion von Aminosäureresten kann durch Synthetisieren einer Sequenz in eine DNS-Sequenz eingeführt werden, die Restriktions-Enzym-Schnittstellen an beiden Enden aufweist und einen Teil enthält, der sich über beide Seiten eines Mutationspunktes erstreckt, worauf das Ersetzen des entsprechenden Teils einer nicht-mutierten DNS-Sequenz mit der synthetisierten Sequenz erfolgt. Die Substitution, die Insertion oder die Deletion kann alternativ entsprechend einem Verfahren, wie z. B. einem ortsspezifischen Mutagenese-Verfahren (Kramer, W. und Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)) in eine DNS-Sequenz eingeführt werden. Die Aktivität, um eine Sulfatgruppe von einem Sulfatgruppendonor zu einem N-Acetylgalactosaminrest oder einem Galactoserest eines Glycosaminoglycans zu übertragen, kann z. B. durch ein wie unten erläutertes Enzym-Aktivitäts-Assay bestimmt werden und infolgedessen kann die Substitution, die Deletion oder die Insertion eines oder mehrerer Aminosäurereste, die die Aktivität im Wesentlichen nicht verschlechtern, leicht durch Fachleute erkannt werden.
  • BEISPIELE
  • Die vorliegende Erfindung wird nun noch weiter im Detail durch die nicht eingeschränkten erläuternden Beispiele beschrieben werden. Ein für alle Beispiele gewöhnliches Assay-Verfahren wird zu Beginn erklärt. Wenn anderweitig angegeben, bedeutet „%" „Gewichtsprozent".
  • (1) Enzym-Aktivitäts-Assay
  • Eine Sulfotransferase-Aktivität wurde wie folgt bestimmt. Die Reaktionslösung enthält in einem Gesamtvolumen von 50 μl, 2,5 μmol Imidazol-HCl (pH 6,8), 1,2 μg Protamin-Hydrochlorid, 0,1 μmol Dithiothreitol, 25 nmol (als Glucuronsäure) Chondroitin (erhältlich von Seikagaku Corp.), 50 pmol [35S]-PAPS (Adenosin 3'-Phosphat, 5'-Phosphosulfat) und ein Enzym.
  • Eine Aktivität mit einem der verschiedenen Glycosaminoglycane als ein Substrat wurde durch Ersetzen des Chondroitins mit 25 nmol des Glycosaminoglycans (als Galactosamin für Chondroitin-Sulfat und Dermatan-Sulfat und als Glycosamin für Heparan-Sulfat und Keratan-Sulfat) bestimmt.
  • Nachdem die Reaktionslösung bei 37°C für 20 Minuten inkubiert wurde, wurde die Reaktion durch Eintauchen eines Reaktions-Röhrchens für eine Minute in kochendes Wasser gestoppt. Nach dem Stoppen der Reaktion wurde 0,1 μmol (als Glucuron säure) Chondroitin-Sulfat-A als ein Träger hinzugefügt, dann wurden drei Volumen Ethanol, die 1,3% Kaliumacetat enthalten, hinzugefügt, um das 35S-markierte Polysaccharid zu präzipitieren. Die sich daraus ergebene Mischung wurde bei 10.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert und das erhaltene Präzipitat wurde in 70 μl Wasser aufgelöst. Die erhaltene Lösung (50 μl) wurde auf eine entsalzene mit 0,1 M NH4HCO3 equilibrierte Säule aufgetragen. Die ein 35S-markiertes Polysaccharid enthaltenen eluierten Fraktionen wurden gesammelt. Ein ml des Scintillations-Cockatils (Clearsol, hergestellt von Nakarai Tesque) wurden zu 200 μl jeder Fraktion hinzugefügt, um die 35S-Radioaktivität zu messen, wobei die Aufnahme des 35S in das Polysaccharid gemessen wurde.
  • Ein Aliquot (400 μl) wurde von der verbleibenden Lösung genommen, und zu dem Aliquot wurde Ethanol (800 μl), das 1,3% Kaliumacetat enthält, hinzugefügt und gemischt. Die sich daraus ergebene Mischung wurde für 30 Minuten auf Eis platziert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 Minuten, um das 35S-Polysaccharid zu präzipitieren. Das Präzipitat wurde in einem Puffer (25 μl), der 0,1 mg/ml BSA, 0,05 M Tris-Acetat (pH 7,5) und 10 Milliunits einer Chondroitinase ACII (erhalten aus Arthrobacter aurescens, hergestellt von Seikagaku Corp.) enthält, aufgelöst und es wurde ihm gestattet, bei 37°C für zwei Stunden zu reagieren. Ein Reaktionsprodukt wurde zusammen mit jeweils 0,1 μmol 2-Acetamido-2-Deoxy-3-O-(β-D-Gluco-4-Enopyranosyluronsäure)-6-O-Sulfo-D-Galactose (ΔDi-6S) und 2-Acetamido-2-Deoxy-3-O-(β-D-Gluco-4-Enopyranosyluronsäure)-4-O-Sulfo-D-Galactose (ΔDi-4S) (beide von Seikagaku Corp. hergestellt) auf ein Whatman-Nr.1-Filterpapier gespottet und für 20 Stunden mit 1-Butanol/Essigsäure/1 M-Ammonium-Hydroxid (2 : 3 : 1 (v/v/v)) entwickelt.
  • Die Positionen der ΔDi-6S und der ΔDi-4S wurden mit einer ultravioletten Lampe überprüft. Die entsprechenden Stellen wurden aus dem Filterpapier ausgeschnitten und sie wurden in einen durch Auflösen von Diphenyloxazol (5 g) und Dimethyl(1,4- bis (2-(5-Phenyloxazol))-Benzen (0,25 g) in 1 l Toluen hergestellten Scintillator getaucht, um die Radioaktivität zu messen. In dem Fall einer mit Chondroitinase ACII verdauten Probe war ursprünglich verbleibende Radioaktivität auf dem Filterpapier nicht mehr als ein Prozent der gespotteten Radioaktivität. Die Chondroitin-6-Sulfotransferase-Aktivität und die Chondroitin-4-Sulfotransferase-Aktivität wurden entsprechend der Aufnahme des 35S's in die ΔDi-6S und die ΔDi-4S berechnet. Die Menge der Aktivität, um die Übertragung von 1 pmol Sulfat-Gruppe/Minute zu katalysieren, wurde als 1 Unit definiert.
  • Die Sulfotransferase-Aktivität wurde mit verschiedenen Substraten gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass die in Beispiel 1 erhaltene C6ST eine Sulfatgruppe zu Chondroitin, zu Chondroitin-Sulfat, das aus Hühnerknorpel stammt, zu Chondroitin-Sulfat A, zu Chondroitin-Sulfat C und Keratan-Sulfat, das aus der Hornhaut stammt, überträgt, aber es überträgt nur schwach eine Sulfatgruppe zu Chondroitin-Sulfat E, zu Dermatan-Sulfat und zu Heparan-Sulfat. Die vorliegenden Erfinder konnten auch bestätigen, dass eine C6ST der vorliegenden Erfindung eine Sulfatgruppe zu der C-6-Position eines in Chondroitin und Chondroitin-Sulfat vorhanden N-Acetylgalactosaminrests überträgt, wie auch eine Sulfatgruppe zu der C-6-Position eines in dem Keratan-Sulfat vorhandenen Galactoserests überträgt.
  • Als nächstes werden die Herstellungsbeispiele der DNS der vorliegenden Erfindung erklärt werden.
  • <1> Herstellung der embryonalen Hühner-Chondroitin-6-Sulfotransferase und Analyse der Aminosäuresequenz
  • (1) Herstellung der Chondroitin-6-Sulfotransferase
  • Embryonale Hühner-Chondrocyten wurden in Zellkulturschalen inokuliert, um eine Dichte von 5,6 × 104 Zellen/Schale einzustellen, und sie wurden bei 38°C für 11 Tage unter einer Bedingung von 7 Volumenprozent CO2 und 93 Volumenprozent Luft in einem auf pH 7,0 eingestellten Dulbecco's-Modified-Eagle's-Medium (DMEM), das D-Glucose (2 g/L), Penicillin (100 Units/ml), Streptomycin (50 μg/ml) und 10% fetales Rinderserum (FBS) enthält, kultiviert. Das Medium wurde gegen ein frisches auf pH 7,4 eingestelltes Medium an dem 2., 4., 7., 9. und 10. Tag nach dem Start der Kultivierung ausgetauscht.
  • Am 10. Tag wurde ein Medium verwendet, das ein durch Erhitzen von FBS bei 60°C für 60 Minuten hergestelltes Hitze inaktiviertes Serum (10%) enthält. Bis zu dem 11. Tag wuchsen die Zellen bis zu 5,0 × 106 Zellen/Schale. Danach wurde die Kultivierung für 10 Tage fortgesetzt, während das Medium jeden Tag unter Verwendung ei nes mit Natriumascorbat (50 μg/ml) ergänzten Cosmedium-001 (bezogen von Cosmo Bio) ausgetauscht wird.
  • Die verwendeten Cosmedium-Medien wurden gesammelt und bei 10.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert, um einen Überstand herzustellen, der eine Zusammensetzung von 10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,1% Triton X-100, 20 mM MgCl2, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 20% Glycerol aufweist.
  • Der Kulturüberstand wurde auf eine mit Puffer A (10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,1% Triton X-100, 20 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 20% Glycerol) equilibrierte Heparin-Sepharose-CL6B-Säule (hergestellt von Pharmacia LKG Biotechnology, 2,2 × 28 cm) aufgetragen, die 0,15 M NaCl enthält. Die Säule wurde mit einem Puffer A, der 0,15 M NaCl enthält gewaschen, gefolgt von der Elution mit einem linearen Gradienten des Puffers A (1 l), der 0,15 bis 0,75 M NaCl enthält, um eine Fraktionierung mit 12 ml/Fraktionen durchzuführen.
  • Die Fraktionen, die die Sulfotransferase-Aktivität aufweisen, wurden gesammelt und auf eine mit einem Puffer A, der 0,15 M NaCl enthält, equilibrierte Weizenkeim-Agglutinin-Agarose-Säule (hergestellt von Seikagaku Corp., 1,2 × 15 cm) aufgetragen. Die Säule wurde mit Puffer A (200 ml), der 0,15 M NaCl enthält, gewaschen, gefolgt von der Elution mit Puffer A (200 ml), der 0,15 M NaCl und 0,3 M N-Acetylglucosamin enthält. Die eluierten Fraktionen wurden gesammelt und gegen Puffer A, der 0,05 M NaCl enthält, dialysiert.
  • Die dialysierte Lösung der eluierten Fraktionen wurde auf eine mit Puffer A, der 0,05 M NaCl enthält, equilibrierte 3'-5'-ADP-Agarose-Säule (hergestellt von Sigma, 1,2 × 11,8 cm, 1,9 μmol 3'-5'-ADP/ml-Gel) aufgetragen. Die Säule wurde mit Puffer A (150 ml), der 0,05 M NaCl enthält, gewaschen, gefolgt von der Elution mit einem linearen Gradienten des Puffers A (300 ml), der 0,05 M NaCl und 0 bis 0,2 mM 3'-5'-ADP enthält. Die die Sulfotransferase-Aktivität aufweisenden Fraktionen wurden gesammelt und sukzessiv gegen Puffer A, der 1 M NaCl enthält, und gegen Puffer A, der 0,05 M NaCl enthält, dialysiert.
  • Die Sulfotransferase-Aktivität des auf diese Weise gereinigten Enzyms wurde unter Verwendung des hierbei bevor beschriebenen Enzym-Aktivitäts-Assay's gemessen.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die Chondroitin-6-Sulfotransferase eine spezifische Aktivität von 4,3 × 105 Units/mg aufwies und das Verhältnis der Chondroitin-4-Sulfotransferase-Aktivität zu der Chondroitin-6-Sulfotransferase-Aktivität 0,02 war.
  • Für die auf diese Weise gereinigte C6ST wurde eine Einfachbande in dem SDS-PAGE unter einer reduzierenden Bedingung gefunden und wurde mit einem Molekulargewicht von 75.000 bestimmt. Wenn dieses einer Superose-12-HR-10/30-Gel-Filtrations-Chromatographie (Elutionsmittel 10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 2 M NaCL, 20 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,1% Triton X-100 und 20% Glycerol) unterzogen wurde, zeigte das gleiche Enzym ein Molekulargewicht von 160.000. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die C6ST ein Dimer in der Gegenwart von 2 M NaCl bildet.
  • Es wurde auch beobachtet, dass die C6ST durch Protamin und MnCl2 aktiviert wurde.
  • In dem obigen Assay-System war das pH-Optimum der C6ST etwa 6,4.
  • (2) Analyse der Aminosäuresequenz der embryonalen Hühner-C6ST
  • Eine gereinigte C6ST wurde mit N-Glycanase verdaut. Kurz dargestellt wurde eine Trichloressigsäure (200 μl) zu 1 ml der C6ST-Lösung (10 μg bezüglich des Proteins) hinzugefügt und die sich daraus ergebene Mischung wurde für 30 Minuten auf Eis platziert, worauf eine Zentrifugation bei 10.000 × g für 20 Minuten folgte. Ein Präzipitat wurde zweimal mit 1 ml Aceton gewaschen und dann in einem Vakuum-Exikator getrocknet. Das getrocknete C6ST-Protein wurde in 10 μl 0,15 M Tris-HCl (pH 7,8), das 0,5% SDS enthält, aufgelöst und dann bei 100°C für 3 Minuten erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden 5 μl 7,5%iges (w/v) Nonidet P-40, 1,2 μl 0,25 molares EDTA (pH 8), 0,3 μl Phenylmethansulfonyl-fluorid, 10,5 μl Wasser und 3 μl (0,75 Unit) rekombinante N-Glycanase (hergestellt von Genzyme) hinzugefügt. Die sich daraus ergebene Mischung wurde bei 37°C für 12 Stunden inkubiert, um es zu ermöglichen, eine Deglycosylierungs-Reaktion zu induzieren.
  • Danach wurde die sich daraus ergebene Mischung für den Zweck einer Aminosäuresequenz-Analyse einem SDS-PAGE unterzogen, und das Gel wurde auf eine Polyvinylidin-fluorid-(PVDF)-Membran ohne Anfärbung übertragen. Diese Membran wurde mit Coomassie-Brilliant-Blau gefärbt. Die nach dem N-Glycanase-Verdau erhaltenen Protein-Banden (49 und 47 kDa) und eine Bande eines nicht verdauten Proteins (75 kDa) wurden aus der Membran ausgeschnitten und für die Aminosäuresequenz-Bestimmung verwendet.
  • Um andererseits eine innere Aminosäuresequenz der C6ST zu bestimmen, wurde ein mit einer Protease teilweise verdautes C6ST-Peptid hergestellt. Dieses Experiment wurde entsprechend einem Verfahren nach Cleveland et al. (Cleveland, D. W., Fischer, S. G., Kirshner, M. W. und Leammli, U. K. (1977) J. Biol. Chem. 252, 1102–1106) durchgeführt. Und zwar wurde das gereinigte Protein (30 μg) durch eine SDS-PAGE unter Verwendung eines 10%igen Gels getrennt. Nachdem das Gel mit Coomassie-Brilliant-Blau gefärbt war, wurde die Protein-Bande mit 75 kDa ausgeschnitten und sie wurde in die Tasche eines anderen 16%igen Gels eingebracht. Die Tasche wurde mit einem Puffer überschichtet, der eine Protease V8 (Sequenzierungsgrad, hergestellt von Boehringer Mannheim) in einem Verhältnis von 0,05 μg/μg des gereinigten Proteins enthält, um die SDS-PAGE zu starten. Die Stromquelle wurde ausgeschaltet, wenn ein voranlaufendes Ende eines Färbemittels an einem Ende des Trenngels ankommt. Die Elektrophorese wurde nach 30 Minuten noch einmal gestartet. Die durch den Protease-Verdau gebildeten Peptide wurden auf eine PVDF-Membran „transblotted". Diese Membran wurde mit Coomassie-Brilliant-Blau gefärbt und dann wurde eine Peptid-Bande mit 19 kDa ausgeschnitten.
  • Die nach dem N-Glycanase-Verdau hergestellten Proteine, die intakten Proteine und die nach dem Protease-V8-Verdau hergestellten Peptide, die alle, wie oben beschrieben, hergestellt wurden, wurden auf PVDF-Filter immobilisiert, um eine Aminosäuresequenz von Amino-Terminalen Enden zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
    49-kDa Protein LVIXXXXNNFIXXV (SEQ ID NO: 3)
    47-kDa Protein XVIXEXXNNFIXXV (SEQ ID NO: 4)
    Intaktes Protein LVIXEKENNFISRVSDKLKXXPXV (SEQ ID NO: 5)
    19-kDa Peptid SFISPAPEEXLTA (SEQ ID NO: 6)
  • <2> Amplifikation einer teilweisen cDNS einer embryonalen Hühner-C6ST durch eine PCR
  • (1) Herstellung eines Primers für eine PCR
  • Um eine C6ST-cDNS aus einer cDNS-Bibliothek zu amplifizieren, wurden Oligonukleotid-Primer für eine PCR (Tabelle 2) auf der Basis der, wie oben beschrieben, bestimmten Aminosäuresequenzen hergestellt. Zwei „Sense"-Primer (Primer 1s und 2s) wurden auf der Basis der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 5) konstruiert, die aus dem intakten Protein (75 kDa) einer embryonalen Hühner-C6ST stammt, wohingegen ein „Anti-Sense"-Primer (Primer 3a) auf der Basis der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 6) konstruiert wurde, die aus dem Protease verdauten Peptid (19 kDa) stammt. Jeder der auf diese Weise konstruierten Nukleotid-Primer wurde synthetisiert. Tabelle 2
    Primer 1s CAAAGCTTGA RAARGARAAY AAYTTYAT (SEQ ID NO: 7)
    Primer 2s MGKGTKWSKG AYAARCTNAA (SEQ ID NO: 8)
    Primer 3a AARTADWSKG GKCGKGGKCT TCTTAAGCT (SEQ ID NO: 9)
  • Eine HindIII-Erkennungs-Sequenz enthaltende Nukleotid-Sequenz wurde in das 5'-Ende des Primers 1s eingesetzt, wohingegen eine Nukleotid-Sequenz, die eine EcoRI-Erkennungs-Sequenz enthält, in das 5'-Ende des Primers 3a eingesetzt wurde.
  • (2) Herstellung einer Poly(A)+-RNS
  • Eine Gesamt-RNS wurde durch das Guanidin-Thiocyanat/CsCl-Verfahren (Kingston, R. E., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2 Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York) ausgehend von embryonalen Hühner-Chondrocyten hergestellt, die für 11 Tage entsprechend einem bekannten Verfahren (Kim, J. J. und Conrad, H. E. (1976) J. Biol. Chem. 251, 6210–6217; Kim, J. J. und Conrad, H. E. (1977) J. Biol. Chem. 252, 8292–8299; Kim, J. J. und Conrad, H. E. (1980) J. Biol. Chem. 255, 1586–1597) in Dulbecco's-Modified-Eagle's-Medium (DMEM) kultiviert worden sind, das 10% fetales Rinderserum enthält. Die erhaltene Gesamt-RNS wurde durch eine Oligo(dT)-Zellulose-Säulen-Chromatographie gereinigt, um Poly(A)+-RNS zu erhalten.
  • (3) PCR (Polymerase-Kettenreaktion)
  • Unter Verwendung der oben erhaltenen Poly(A)+-RNS als ein Template und dem Oligonukleotid 3a als einen Primer wurde ein primärer cDNS-Strang durch die reverse Transkriptions-Reaktion synthetisiert. Die Reaktion für die reverse Transkription wurde durch Inkubieren eines Puffers bei 37°C für 60 Minuten ausgeführt, welcher in einem Endvolumen von 20 μl, Poly(A)+-RNS (1 μg), Oligonukleotid 3a (50 pmol), vier unterschiedliche Deoxynukleosid-Triphosphate (500 μm jedes), M-MLV-reverse-Transkriptase (200 Units, hergestellt von Gibco BRL), 1 mM Dithiothreitol und einen RNase-Inhibitor (120 Units, hergestellt von Takara Shuzo) enthält.
  • Die Reaktion für die PCR wurde in einer Reaktionslösung ausgeführt, die in einem Endvolumen von 100 μl die oben definierte Mischung (10 μl) für die reverse Transkription, Oligonukleotide 1s und 3a (50 pmol jedes), vier unterschiedliche Deoxynukleosid-Thriphosphate (100 μm jedes) wie auch eine Taq-Polymerase (2,5 Units, AmpliTaq-Polymerase, hergestellt von Perkin-Elmer) enthält. Der Amplifikations-Zyklus wurde 30 Mal wiederholt, und jeder Zyklus setzte sich aus einer Minute bei 94°C, einer Minute bei 45°C und 3 Minuten bei 55°C zusammen.
  • <3> Herstellung der Gesamtlängen-cDNS der embryonalen Hühner-C6ST
  • (1) Herstellung der Hybridisierungssonde
  • Das erhaltene PCR-amplifizierte Fragment wurde aufbereitet, mit HindIII und EcoRI verdaut und in einen Plasmidvektor, Bluescript (hergestellt von Stratagene), an den mit diesen Restriktionsenzymen geschnittenen Stellen subkloniert. Ein Subklon wurde durch die Sequenzierung mit der Hilfe eines T3-Primers oder eines M13-20-Primers bestätigt.
  • Eine radioaktive Sonde zum Screenen einer cDNS-Bibliothek wurde durch eine Radioaktivmarkierung des vorhergenannten PCR-Produkts entsprechend einem Random-Oligonukleotid-Primed-Markierungsverfahren (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6–13) unter Verwendung eines [α-32P)-dCTP (hergestellt von Amersham) und einem DNS-Random-Markierungs-Kit (hergestellt von Takara Shuzo) erhalten.
  • (2) Aufbau einer cDNS-Bibliothek
  • Um eine cDNS zu erhalten, die eine Gesamtlänge der kodierenden Region der C6ST enthält, wurde als nächstes ein λ-Vektor, λgt11, verwendet, um ein cDNS-Klonieren durchzuführen.
  • Eine Poly(A)+-RNS wurde aus embryonalen Hühner-Chondrocyten in der gleichen Weise wie oben in <2>, (2), hergestellt und wurde als Template zur Synthetisierung einer doppelsträngigen cDNS verwendet. Die DNS wurde in einen EcoRI-verdauten λgt11 (hergestellt von Pharmacia) ligiert. Ein cDNS-Synthese-Kit (TimeSaver-cDNS-Synthese-Kit, hergestellt von Pharmacia) wurde für die Synthese der cDNS und der Ligation in den Vektor verwendet. Random-Oligonukleotid-Primer wurden als ein Primer für die reverse Transkriptions-Reaktion verwendet.
  • Der rekombinante Phagen-Vektor mit der inserierten cDNS wurde in Phagen-Partikel unter Verwendung eines in vitro Verpackungs-Kit (Gigapack II Verpackungs-Extrakt, hergestellt von Stratagene) verpackt. Escherichia coli Y1088 wurde mit diesen Phagen-Partikeln infiziert und wurde auf eine Platte plattiert, um Plaques zu bilden. Eine auf diese Weise erhaltene Phagen-Bibliothek wurde für das cDNS-Screenen ohne weitere Amplifikation verwendet.
  • (3) Screenen des C6ST-cDNS-Klon
  • Das Screenen von etwa 5 × 10 Plaques der, wie oben beschrieben, erhaltenen λgt11-cDNS-Bibliothek wurde durchgeführt. Die Plaques wurden auf eine kommerziell erhältliche Nylonmembran (Hybond N+ Nylon-Membran, hergestellt von Amersham) übertragen und eine Phagen-DNS wurde auf der Nylon-Membran unter Verwendung eines alkalischen Immobilisierungsverfahrens, entsprechend der dem kommerziellen Produkt beiliegenden Gebrauchsanweisung, immobilisiert.
  • Die Membran, die die darauf immobilisierte Phagen-DNS aufweist, wurde einer Prähybridisierung bei 42°C für 3,5 Stunden in einer Lösung, die 50% Formamid, 5 × SSPE (Zusammensetzung von 1 × SSPE: 10 mM NaH2PO4 (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA), 5 × Denhardt's Lösung (Zusammensetzung von 1 × Denhardt's Lösung: 0,02% Ficoll 400, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% BSA), 0,5% SDS, 0,04 mg/ml einer denaturierten Lachssperma-DNS und 0,004 mg/ml einer E. coli-DNS enthält, unterzogen. Eine Hybridisierung wurde bei 42°C für 16 Stunden in dem gleichen wie oben beschriebenen Puffer, der die 32P-markierte Sonde enthält, durchgeführt. Danach wurde der Filter bei 55°C nacheinander in 1 × SSPE (0,1% SDS) und in 0,1 × SSPE (0,1% SDS) gewaschen und danach wurden Hybridisierungs positiven Klone mittels einer Autoradiographie detektiert. Etwa 90 positive Klone wurden aus 5 × 105 Plaques erhalten.
  • (4) Nukleotid-Sequenz-Analyse der embryonalen Hühner-C6ST-cDNS
  • Sechzehn unabhängige Klone wurden aus den Hybridisierungs positiven λgt11-Klonen ausgesucht. Eine jeweilige Phagen-DNS wurde hergestellt und mit EcoRI verdaut, um ein cDNS-Insertions-Fragment als ein Einfachfragment aus der Vektor-DNS auszuschneiden. Die erhaltenen DNS-Fragmente wurden in einen Bluescript subkloniert. Unter diesen DNS-Fragmenten wurde die Nukleotid-Sequenz des längsten Fragments (2,3 kb) bestimmt.
  • Aus dem durch das Subklonieren der cDNS in den Bluescript erhaltene rekombinante Plasmid wurde ein Deletions-Klon unter Verwendung eines DNS-Deletions-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) entsprechend einem bekannten Verfahren (Henikoff, S. (1984) Gene 28, 351–359; Yanisch-Perron, C., Viera, J. und Messing, J. (1985) Gene 33, 103–109) hergestellt. Die Restriktionsenzyme SacI und XbaI wurden zum Abtrennen eines 3'-kohäsiven Endes und entsprechend eines 5'-kohäsiven Endes verwendet.
  • Der erhaltene Deletions-Klon wurde einem Dideoxy-Ketten-Terminations-Verfahren (Sanger, F., Nicklens, S. und Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463–5467) unter Verwendung eines [α-32P]-dCTP und einer T7-DNS-Polymerase (Sequenase, hergestellt von U. S. Biochemicals) unterzogen, um die Nukleotid-Sequenzen beider Stränge unabhängig voneinander zu bestimmen.
  • <4> Klonieren einer menschlichen C6ST-cDNS
  • (1) Herstellung einer Hybridisierungssonde
  • Aus einer in dem vorherigen Schritt <3>, (4), erhaltenen embryonalen Hühner-C6ST-cDNS wurde eine [λ-32P]-dCTP markierte radioaktive Sonde zum Screenen einer cDNS-Bibliothek durch das Random-Primer-Markierungs-Verfahren hergestellt. Noch spezieller wurde die vorhergenannte Hühner-cDNS entsprechend einem Random-Oligonukeotid-Primed-Markierungs-Verfahren (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6–13) unter Verwendung von [α-32P]-dCTP (Hergestellt von Amersham) und einem DNS-Random-Markierungs-Kit (hergestellt von Takara Shuzo) radioaktiv markiert.
  • (2) Aufbau einer menschlichen cDNS-Bibliothek
  • Um eine cDNS, die eine Gesamtlänge der kodierenden Region der menschlichen C6ST enthält, zu erhalten, wurde eine menschliche fetale Hirn-cDNS-Bibliothek (erhältlich von Clontech), die einen Lamda-Vektor, λg11, enthält, verwendet.
  • Der rekombinante Phagen-Vektor mit der inserierten cDNS wurde in Phagen-Partikel unter Verwendung eines in vitro Verpackungs-Kit (Gigapack II Verpackungs-Extrakt, hergestellt von Stratagene) verpackt. Escherichia coli Y1088 wurde mit diesen Phagen-Partikeln infiziert und wurde auf eine Platte ausplattiert, um einen Plaque zu bilden. Eine auf diese Weise erhaltene Phagen-Bibliothek wurde für das cDNS-Screenen ohne weitere Amplifikation verwendet.
  • (3) Screenen des C6ST-cDNS-Klons
  • Das Screenen der Plaques der λg11-cDNS-Bibliothek wurde in der gleichen Weise wie in dem vorangehenden Schritt <3>, (3), beschrieben, durchgeführt. Und zwar wurden die Plaques auf eine kommerziell erhältliche Nylon-Membran (Hybond N+ Nylon-Membran, hergestellt von Amersham) übertragen, und die Phagen-DNS wurde entsprechend einem alkalischen Immobilisierungsverfahren auf der Nylon-Membran immobilisiert.
  • Die Membran, die die immobilisierte Phagen-DNS darauf aufweist, wurde einer Prähybridisierung bei 42°C für 3,5 Stunden in einer Lösung, die 50% Formamid, 5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5% SDS, 0,04 mg/ml einer denaturierten Lachssperma-DNS und 0,004 mg/ml einer E. coli-DNS enthält, unterzogen. Die Hybridisierung wurde in dem gleichen Puffer, wie oben beschrieben, der die 32P-markierte Sonde enthält, bei 42°C für 16 Stunden durchgeführt. Danach wurde der Filter bei 55°C nacheinander in 1 × SSPE (0,1% SDS) und in 0,1 × SSPE (0,1% SDS) gewaschen und danach wurden die positiven Hybridisierungs-Klone mittels einer Autoradiographie detektiert.
  • (4) Nukleotid-Sequenz-Analyse der C6ST-cDNS
  • Unabhängige Klone wurden aus den, wie oben beschrieben, erhaltenen positiven Hybridisierungs-λg11-Klonen ausgewählt. Jede Phagen-DNS wurde aufbereitet und mit EcoRI verdaut, um ein cDNS-Insertions-Fragment als ein Einfach-Fragment aus der Vektor-DNS auszuschneiden. Die erhaltenen DNS-Fragmente wurden in einen Bluescript subkloniert.
  • Ein durch Subklonieren einer cDNS in einen Bluescript erhaltenes rekombinantes Plasmid wurde mit einem DNS-Deletions-Kit (hergestellt von Takara Shuzo) entsprechend einem bekannten Verfahren (Henikoff, S. (1984) Gene 28, 351–359; Yanisch-Perron, C., Viera, J. und Messing, J. (1985) Gene 33, 103–109) behandelt, um einen Deletions-Klon herzustellen.
  • Der erhaltene Deletions-Klon wurde mit [α-32P]-dCTP und einer T7-DNS-Polymerase (Sequenase, hergestellt von U. S. Biochemicals) entsprechend einem Dideoxy-Ketten-Terminations-Verfahren (Sanger, F., Nicklens, S. und Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463–5467) behandelt, um die Nukleotid-Sequenzen der beiden Stränge unabhängig voneinander zu bestimmen. Die Nukleotid-Sequenz, die den offenen Leserahmen der auf diese Weise bestimmten menschlichen C6ST- cDNS entspricht, ist in SEQ ID NO: 1 gezeigt und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 2 gezeigt.
  • Die bestimmte DNS-Sequenz wurde unter Verwendung eines Gene-Works-Computer-Programms (hergestellt von IntelliGenetics) analysiert. Zwei im Rahmen befindliche ATG-Codons sind an dem 5'-terminalen Teil des offenen Leserahmens der C6ST-cDNS enthalten. Ein einfacher offener Leserahmen, der an dem ersten ATG-Codon beginnt, deutet ein 479 Aminosäurereste enthaltendes Protein mit einem Molekulargewicht von 54.610 an. Für dieses Protein wurde gefunden, dass es eine 74%ige Aminosäuresequenz-Homologie mit der oben genannten Hühner-C6ST aufweist. Insbesondere hatte die entsprechend der vorliegenden Erfindung erhaltene menschliche C6ST eine hochhydrophile, aus 17 Aminosäureresten zusammengesetzte spezifische Insertions-Sequenz (die von 114 bis 130 der SEQ ID NO: 2 nummerierten Aminosäuren), die in der Hühner-C6ST fehlte.
  • (5) Aufbau eines menschlichen C6ST-Expressions-Plasmid
  • Um die menschliche C6ST-cDNS zu exprimieren, wurde das cDNS-Fragment in einen Expressions-Vektor eingeführt, um ein rekombinantes Plasmid zu konstruieren. Ein Expressions-Vektor für Säugetierzellen, pCXN2 (hergestellt von Dr. Jun-ichi Miyazaki der Universität Tokyo (Niwa, H., Yamamura, K. und Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193–200) und freundlicherweise von Dr. Yasuhiro Hashimoto des Tokyo Metropolitan Institute's of Medical Science zur Verfügung gestellt), wurde als der Expressionsvektor verwendet. pCXN2 ist ein Vektor, der ein Streptomycin resistentes Gen und ein Penicillin resistentes Gen aufweist und ein in eine EcoRI-Stelle inseriertes DNS-Fragment mit der Hilfe eines β-Actin-Gen-Promotors exprimieren kann. Das cDNS-Fragment von 2.354 bp (SEQ ID NO: 1) wurde in die EcoRI-Stelle des pCXN2 ligiert. E. coli JM109 wurde mit einer Reaktionslösung nach der Ligation transformiert und es wurde auf eine LB-Platte, die Amplicillin enthält, aufgetragen. Rekombinante Plasmide wurden aus den Transformanten gesammelt und sie wurden durch eine dreimalige CsCl/Ethidiumbromid-Gleichgewichts-Zentrifugation gereinigt. Ein rekominantes Plasmid, in welchem der Promotor des Vektors und die cDNS eine übereinstimmende Ausrichtung hatten, wurde als pCXNhC6ST bezeichnet. Ein rekombinantes Plasmid, in welchem die cDNS in einer entgegengesetzten Richtung inseriert war, wurde als pCXNhC6ST2 bezeichnet. Die Richtung der cDNS wurde durch Restriktions-Katierung unter Verwendung von BamHI analysiert.
  • (6) Transiente Expression der menschlichen C6ST-cDNS in COS-7-Zellen
  • COS-7-Zellen wurden als ein Wirt für eine Expression der menschlichen C6ST-cDNS verwendet. COS-7-Zellen (erhalten von RIKEN CELL BANK, Tsukuba) wurden in Kulturschalen, die einen Durchmesser von 100 mm aufweisen, mit einer Dichte von 8 × 105 Zellen/Schale ausgesät. Ein Dulbecco's Modified-Eagle's-Medium (DMEM), das Penicillin (100 Unit/ml), Streptomycin (50 μg/ml) und 10% fetales Rinderserum (hergestellt von Gibco BRL) enthält, wurde als Kulturflüssigkeit in einer Menge von 10 ml pro Kulturschale verwendet. Die Zellen wurden in 5 Volumen-% CO2 und 95 Volumen-% Luft bei 37°C kultiviert.
  • Die COS-7-Zellen wurden mit pCXNh106ST oder pCXNh1606ST2 nach 48 Stunden der Kultivierung transfiziert. Die Transfektion wurde entsprechend dem DEAE-Dextran-Verfahren (Aruffo, A. (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 16.13, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York) durchgeführt. Vorgewärmtes DMEM (5 ml), das ein 10% Nu-Serum (ein Serumersatzstoff, der eine niedrige Proteinkonzentration aufweist, hergestellt von Collaborative Biomedical Products) enthält, wurde mit PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung, 0,2 ml), die DEAE-Dextran (10 mg/ml) und eine Chloroquine-Lösung (2,5 mM) enthält, gemischt. Die Lösung wurde mit 15 μg des rekombinanten Plasmids gemischt und eine sich daraus ergebende Mischung wurde zu der Zellsuspension hinzugefügt.
  • Die Zellen wurden für 4 Stunden in einem CO2 Inkubator inkubiert. Danach wurde die Zellflüssigkeit mit einer PBS-Lösung (5 ml), die 10% Dimethyl-Sulfoxid enthält, ersetzt. Die Zellen wurden für 2 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wurde die Dimethyl-Sulfoxid-Lösung durch Belüftung entfernt, gefolgt von der Zugabe von 25 ml einer DMEM, die Penicillin (100 Units/ml), Streptomycin (50 μg/ml) und 10% fetales Rinderserum enthält. Die Zellen wurden für 67 Stunden inkubiert und dann wurden sie nur mit DMEM gewaschen. Die Zellen wurden gesammelt und unter Verwendung eines Dounce-Homogenisiergeräts in einer Lösung, die 0,25 M Sucrose, 10 mM Tris-HCl, pH 7,2 und 0,5% Triton X-100 enthält, homogenisiert, wobei die Lösung in einer Menge von 1,5 ml für die aus einer Kulturschale erhaltenen Zelle verwendet worden ist. Ein erhaltenes Homogenat wurde bei 10.000 × g für 20 Minuten zentrifugiert, um die C6ST-Aktivität, die Chondroitin-4-Sulfotransferase(C4ST)-Aktivität und die Keratan-Sulfat-Sulfotransferase(KSST)-Aktivität in einer Überstandsfraktion zu messen. Diese Aktivitäten wurden in der Gegenwart oder in der Abwesenheit von Chondroitin oder Keratan-Sulfat als ein Sulfatgruppen-Akzeptor gemessen. Für die COS-7-Zellen, die nicht mit dem Expressionsplasmid transfiziert worden sind, wurde die Messung in der gleichen wie oben beschriebenen Weise durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
  • Tabelle 3
    Figure 00370001
  • Wie in Tabelle 3 gezeigt, war die C6ST-Aktivität und die KSST-Aktivität der Zellen, die den Expressionsvektor beherbergen, um die oben erwähnte isolierte cDNS in der richtigen Richtung zu exprimieren, etwa 16-fach und entsprechend etwa 20-fach verglichen mit den Zellen, die den Expressionvektor mit der inserierten cDNS in der entgegengesetzten Richtung beherbergen. Dagegen war die C4ST-Aktivität der tranfizierten Zellen nur mäßig erhöht. Diese Ergebnisse haben bewiesen, dass die isolierte cDNS für ein Protein kodiert, das die C6ST-Aktiviät und die KSST-Aktivität aufweist.
  • SEQUENZAUFLISTUNG
    Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001

Claims (10)

  1. Polypeptid einer Glycosaminoglycan-Sulfotransferase, die vom Menschen stammt und mindestens einen Teil der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz aufweist, mit einer oder ohne eine Substitution, Deletion oder Insertion eines oder mehrerer Aminosäurereste, die die Aktivität, eine Sulfatgruppe von einem Sulfatgruppendonor zu einem N-Acetylgalactosaminrest oder einem Galactoserest eines Glycosaminoglycans zu übertragen, nicht wesentlich verschlechtern.
  2. Polypeptid nach Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch die Aminosäure-Nummern 1 bis 479 in der SEQ ID NO: 2 dargestellt ist.
  3. Polypeptid nach Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch die Aminosäure-Nummern 20 bis 479 in der SEQ ID NO: 2 dargestellt ist.
  4. Polypeptidverbindung, die das in einem der Ansprüche 1 bis 3 definierte Polypeptid zusammen mit einem anderen für die Expression essentiellen Polypeptid umfasst.
  5. DNS, die für mindestens einen Teil des nach einem der Ansprüche 1 bis 4 definierten Polypeptids kodiert, wobei der Teil des Polypeptids die Sulfotransferaseaktivität oder eine Antigenität aufweist.
  6. DNS nach Anspruch 5, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die für die Aminosäuresequenz kodiert, die durch die Aminosäure-Nummern 1 bis 479 in der SEQ ID NO: 2 dargestellt ist.
  7. DNS nach Anspruch 5, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die für die Aminosäuresequenz kodiert, die durch die Aminosäure-Nummern 20 bis 479 in der SEQ ID NO: 2 dargestellt ist.
  8. DNS nach einem der Ansprüche 5 bis 7, die mindestens einen Teil oder die Gesamtheit der Nukleotidsequenz aufweist, die durch die Nukleotid-Nummern 147 bis 1583 in der SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, wobei der Teil des Polypeptids die Sulfotransferaseaktivität oder die Antigenität aufweist.
  9. DNS nach einem der Ansprüche 5 bis 11, die mindestens einen Teil oder die Gesamtheit der Nukleotidsequenz aufweist, die durch die Nukleotid-Nummern 204 bis 1583 in der SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, wobei der Teil des Polypeptids die Sulfotransferaseaktivität oder die Antigenität aufweist.
  10. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei ein Verhältnis der Aktivität, die Sulfatgruppe zu der C-6-Position des N-Acetylgalactosaminrestes zu übertragen, zu der Aktivität, die Sulfatgruppe zu der C-4-Position des N-Acetylgalactosaminrestes zu übertragen, 15 bis 20 ist.
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