DE69736261T2

DE69736261T2 - Alpha-1-6-fucosyltransferasen

Info

Publication number: DE69736261T2
Application number: DE69736261T
Authority: DE
Inventors: Naoyuki Taniguchi; Naofumi Uozumi; Tetsuo Shiba; Shusaku Toyo Boseki Kabushiki Kaisha YANAGIDANI
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1996-01-24
Filing date: 1997-01-23
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2017-01-24
Also published as: US6054304A; EP0816503A4; WO1997027303A1; US20020081694A1; US20040259137A1; US6291219B1; EP0816503A1; EP0816503B1; US7264955B2; DE69736261D1

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine α1-6-Fucosyltransferase, die vom Schwein oder vom Menschen stammt. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine neue, vom Menschen stammende α1-6-Fucosyltransferase, die ein Enzym ist, das Fucose von Guanosindiphosphat (GDP)-Fucose über eine α1→6 Bindung auf N-Acetylglucosamin (GlcNAc), das an ein Asn am Stamm der Zuckerkette vom Asparagin-Typ (Zuckerkette vom Asn-Typ) gebunden ist, überträgt und das auf dem Gebiet der Glyco-Technologie für die Modifikation und Synthese einer Zuckerkette und/oder für die Diagnose von Erkrankungen wie z.B. einem bösartigen Tumor nützlich ist, und ein Gen, das dieses Enzym codiert.
Hintergrund des Fachgebiets
Die Struktur und Funktion der Zuckerketteneinheit von komplexen Kohlenhydraten wie z.B. einem Glycoprotein und Glycolipid, die von höheren Organismen stammen, haben in den letzten Jahren viel Aufmerksamkeit erregt und viele Studien werden zur Zeit durchgeführt. Während eine Zuckerkette durch die Aktivität einer Glycohydrolase und einer Glycosyltransferase erzeugt wird, trägt die Glycosyltransferase deutlich zu ihrer Erzeugung bei.
Unter Verwendung eines Zuckernucleotids als Zuckerspender überträgt die Glycosyltransferase einen Zucker auf eine Empfängerzuckerkette, wodurch die Zuckerkette verlängert wird. Die Spezifität für die Struktur der Empfängerzuckerkette ist eng, so dass eine Glycosidbindung durch die eine entsprechende Transferase erzeugt wird. Daher werden Glycosyltransferasen für Strukturuntersuchungen von Zuckereinheiten von komplexen Kohlenhydraten, zur Erleichterung der Synthese einer bestimmten Zuckerkettenstruktur und zur Modifikation einer nativen Zuckerkettenstruktur verwendet.
Außerdem wird erwartet, dass Glycosyltransferasen für die Modifikation der Natur von komplexen Kohlenhydraten und Zellen mittels der künstlichen Veränderung der Zuckerkette nutzbar sind. Für diese Verwendung wurde die Entwicklung von verschiedenen Glycosyltransferasen, deren Substratspezifität identifiziert wurde, erwartet.
Eine α1-6-Fucosyltransferase ist ein wichtiges Enzym, das in der Organelle des Golgi-Apparat gefunden wird und das als eines der Enzyme gilt, welche die Prozessierung der Asparagin-gebundenen Zuckerkette kontrollieren. Daher wird das Enzym für die Aufklärung des Kontrollmechanismus und der Kontrolle der Erzeugung der Zuckerkettenstruktur nützlich sein, wenn es auf eine Asparagin-gebundene Zuckerkette wirkt.
Zusätzlich sind die Aktivität der α1-6-Fucosyltransferase und der Anteil der Reaktionsprodukte dieses Enzyms dafür bekannt, dass sie in bestimmten Erkrankungen wie z.B. Leberkrebs und Mukoviszidose erhöht sind. Daher wurde eine schnelle Entwicklung des Verfahrens zur Diagnose dieser Erkrankungen erwünscht, das die Bestimmung der Aktivität dieses Enzyms, Northern-Blot unter Verwendung einer cDNA, welche die α1-6-Fucosyltransferase codiert, oder RT-PCR-Analyse der mRNA-Menge, die in dem lebenden Körper transkribiert und exprimiert wird, umfasst.
Die Aktivität von α1-6-Fucosyltransferasen wurde in Körperflüssigkeiten oder in Organen von verschiedenen Tieren und ihrer Kulturzellen nachgewiesen und es war ein Enzym, das von menschlichen Zellhomogenaten der Mukoviszidose stammte, als ein gereinigtes Enzymprodukt bekannt [Journal of Biological Chemistry, Bd. 266, S. 21572–21577 (1991)). Gemäß diesem Bericht wird dieses Enzym jedoch mit Nachteilen assoziiert, weil (1) sein pH-Optimum 5,6 beträgt, was sich von dem physiologischen pH-Wert unterscheidet, (2) es ein ziemlich niedriges Molekulargewicht (34.000 und 39.000) bei der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese besitzt, (3) die Bereitstellung einer großen und stabilen Menge davon praktisch unerreichbar ist, weil es von menschlichen Zellen stammt, und aus anderen Gründen.
Dieses Enzym wird als ein membrangebundenes Enzym erhalten und benötigt Rinderserum zur Züchtung der Zellen, welches wiederum zu einer schwierigen Reinigung des Enzyms und zu einer großen Summe von Geld, das für die Züchtung der Zellen benötigt wird, führt, um als Ausgangsmaterial zu dienen. Dementsprechend ist eine stabile Bereitstellung dieser Enzymherstellung so gut wie unmöglich.
Während eine chemische Synthese häufig für das Synthetisieren einer Zuckerkette verwendet wird, benötigt die Synthese von Oligosacchariden viele Schritte, die durch die komplizierte Syntheseroute und die Spezifität der Reaktion notwendig sind, so dass sie verschiedene praktische Probleme umfasst. Insbesondere die Bindung der Fucose an GlcNAc, das an Asn der Asparagingebundenen Zuckerkette gebunden ist, durch eine α1→6 Bindung ist aufgrund der Instabilität der Fucose sehr schwierig.
Offenbarung der Erfindung
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine α1-6-Fucosyltransferase in großen Mengen stabil zur Verfügung zu stellen, die als ein Reagens für die Strukturanalyse einer Zuckerkette oder für die Glyco-Technologie oder als ein Diagnosemittel nützlich ist.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung von α1-6-Fucosyltransferase in großen Mengen durch die Verwendung eines vom Menschen oder vom Schwein stammenden α1-6-Fucosyltransferasegens zur Verfügung zu stellen. Man beabsichtigt, solche spezifischen Gene zu verwenden, um die Entwicklung eines Verfahrens zur Diagnose von Erkrankungen durch Northern-Blot unter Verwendung einer DNA, die dieses Enzym codiert, oder durch RT-PCR-Analyse von der mRNA-Menge, die im lebenden Körper transkribiert und exprimiert wird, zu ermöglichen.
In einem Versuch, die vorstehend erwähnten Aufgaben zu erfüllen, haben die hier genannten Erfinder mit der Untersuchung eines Enzyms begonnen, das in der Lage ist, Fucose an GlcNAc, das an Asn einer Zuckerkette vom Asparagin-Typ gebunden ist, durch eine α1→6-Bindung zu binden, wobei ein Fluoreszenz markiertes Substratanalogon zu einer Zuckerkette vom Asparagin-Typ, die ein Rezeptor dieses Enzyms ist, verwendet wurde. Als ein Ergebnis fand man die Aktivität dieses Enzyms in den Extraktfraktionen von Schweinehirn, das als Ausgangsmaterial für die Reinigung leicht erhältlich ist, und das Enzym wurde von den Fraktionen gereinigt und die enzymatischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften wurden ermittelt, was zu der Vervollständigung der Erfindung führte.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung eine vom Schwein stammende α1-6-Fucosyltransferase, welche die nachfolgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften besitzt (nachfolgend wird dieses Enzym als Schweine-α1-6-Fucosyltransferase bezeichnet).

(1) Aktivität: überträgt Fucose von Guanosindiphosphat-Fucose auf die Hydroxygruppe in der 6-Position von GlcNAc nächstgelegen zu R eines Rezeptors (GlcNAcβ1-2Manα1-6)(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-R, wobei R ein Asparaginrest oder eine Peptidkette ist, welche diesen Rest trägt, wobei (GlcNAcβ1-2Manα1-6)(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc-R gebildet wird. In der vorstehenden Formel ist der Asparaginrest bei R ein Rest, in dem die saure Amidgruppe an der Seitenkette des Asparagins an die Hydroxygruppe an der Anomerposition des reduzierenden Endes der Zuckerkette gebunden ist, und eine Peptidkette, die den Rest besitzt, ist eine Peptidkette, die den Rest in dem Peptid hat, an dem zwei oder mehr Aminosäuren gebunden sind, und die vorzugsweise eine Peptidkette ist, die -Asn-(X)-Ser/Thr- besitzt.
(2) pH-Optimum: etwa 7,0
(3) pH-Stabilität: stabil in dem pH-Bereich von 4,0 bis 10,0 bei einer Behandlung bei 4°C für 5 Stunden
(4) Temperaturoptimum: etwa 30–37°C
(5) Hemmung oder Aktivierung: kein Erfordernis für ein zweiwertiges Metallion zur Ausprägung der Aktivität; keine Hemmung der Aktivität auch in Gegenwart von 5 mM EDTA
(6) Molekulargewicht: etwa 60.000 in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.

Die hier genannten Erfinder haben ausschließlich α1-6-Fucosyltransferase vom Schweinehirn gereinigt, die Aminosäuresequenz dieses Proteins analysiert und basierend auf der Aminosäureteilsequenz ein Gen cloniert, um die vorliegende Erfindung auszuführen.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt ein Gen, das Schweine-α1-6-Fucosyltransferase codiert, zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls einen Expressionsvektor, der ein Gen enthält, das Schweine-α1-6-Fucosyltransferase codiert, zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren eine Transformantenzelle zur Verfügung, die durch die Transformierung einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein Gen enthält, das Schweine-α1-6-Fucosyltransferase codiert, erhalten wird.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten α1-6-Fucosyltransferase zur Verfügung, welches die Züchtung einer Transformantenzelle, die durch die Transformierung einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein Gen enthält, das Schweine-α1-6-Fucosyltransferase codiert, erhalten wird, und die Ernte der α1-6-Fucosyltransferase aus der Kultur umfasst.
Die hier genannten Erfinder haben die vorliegende Erfindung durch die Reinigung des Proteins, das eine α1-6-Fucosyltransferase-Aktivität besitzt, aus dem Kulturmedium menschlicher Zellen erreicht und haben seine enzymatischen Eigenschaften ermittelt.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung eine vom Menschen stammende α1-6-Fucosyltransferase, welche die nachfolgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften besitzt (nachfolgend wird dieses Enzym als Mensch-α1-6-Fucosyltransferase bezeichnet).

(1) Aktivität: überträgt Fucose von Guanosindiphosphat-Fucose auf die Hydroxygruppe in der 6-Position von GlcNAc nächstgelegen zu R eines Rezeptors (GlcNAcβ1-2Manα1-6)(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-R, wobei R ein Asparaginrest oder eine Peptidkette ist, welche diesen Rest trägt, wobei (GlcNAcβ1-2Manα1-6)(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc-R gebildet wird. In der vorstehenden Formel ist der Asparaginrest bei R ein Rest, in dem die saure Amidgruppe an der Seitenkette des Asparagins an die reduzierende, endständige Hydroxygruppe der Zuckerkette gebunden ist, und eine Peptidkette, die den Rest besitzt, ist eine Peptidkette, die den Rest in dem Peptid hat, an dem zwei oder mehr Aminosäuren gebunden sind, und die vorzugsweise eine Peptidkette ist, ein -Asn-(X)-Ser/Thr- besitzt.
(2) pH-Optimum: etwa 7,5
(3) pH-Stabilität: stabil in dem pH-Bereich von 4,0 bis 10,0 bei einer Behandlung bei 4°C für 5 Stunden
(4) Temperaturoptimum: etwa 30–37°C
(5) Hemmung oder Aktivierung: kein Erfordernis für ein zweiwertiges Metallion zur Ausprägung der Aktivität; keine Hemmung der Aktivität auch in Gegenwart von 5 mM EDTA
(6) Molekulargewicht: etwa 60.000 in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.

Die hier genannten Erfinder haben ausschließlich α1-6-Fucosyltransferase von menschlichen Kulturzellen gereinigt, die Aminosäuresequenz dieses Proteins analysiert und basierend auf der Aminosäureteilsequenz ein Gen cloniert, um die vorliegende Erfindung auszuführen.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt ein Gen, das Mensch-α1-6-Fucosyltransferase codiert, zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls einen Expressionsvektor, der ein Gen enthält, das Mensch-α1-6-Fucosyltransferase codiert, zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren eine Transformantenzelle zur Verfügung, die durch die Transformierung einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein Gen enthält, das Mensch-α1-6-Fucosyltransferase codiert, erhalten wird.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten α1-6-Fucosyltransferase zur Verfügung, welches die Züchtung einer Transformantenzelle, die durch die Transformierung einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein Gen enthält, das Mensch-α1-6-Fucosyltransferase codiert, erhalten wird, und das Ernten der α1-6-Fucosyltransferase aus der Kultur umfasst.
Als Ausgangsmaterial zur Reinigung des Enzyms der vorliegenden Erfindung dient zum Beispiel das Organ und die Körperflüssigkeit vom Schwein, die eine α1-6-Fucosyltransferase-Aktivität besitzen. Beispiele des Organs schließen Gehirn, Hoden, Bauchspeicheldrüse, Lunge, Nieren und dergleichen ein. Die Körperflüssigkeit des Schweins wie z.B. Blut und Serum kann ebenfalls verwendet werden.
Die Schweine-α1-6-Fucosyltransferase der vorliegenden Erfindung kann durch das Herstellen eines Rohextrakts, der zum Beispiel das Enzym von Homogenaten von Schweinehirn enthält, und durch die Trennung des Enzyms von diesem Extrakt erhalten werden. Da die α1-6-Fucosyltransferase im Schweinehirn ein membrangebundenes Enzym ist, wird diesem Fall eine Rohextraktlösung, die das Enzym enthält, im Allgemeinen von dem Gehirnlysat unter Verwendung eines geeigneten grenzflächenaktiven Mittels erhalten. Dieser Extrakt wird verschiedenen bekannten Reinigungsschritten unterzogen, um ein gereinigtes Enzymprodukt zu erhalten. Die Reinigung kann zum Beispiel eine Konzentration unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran, Entsalzen, Affinitätssäulenchromatographie, in der ein Substratanalogon immobilisiert wird, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Säulenchromatographie und der gleichen in einer geeigneten Kombination einschließen, um ein im Wesentlichen homogenes Enzymprodukt zu ergeben, das frei von kontaminierenden Proteinen wie z.B. anderen Transferasen ist. Schweinehirn wird zum Beispiel in einem Waring-Mixer in einem Phosphatpuffer aufgebrochen und die Membranfraktionen werden durch Ultrazentrifugation gesammelt. Das vorliegende Enzym wird mit einem Phosphatpuffer, der ein grenzflächenaktives Mittel (Triton X-100) enthält, extrahiert und die Überstände werden durch Ultrazentrifugation gesammelt, um einen Rohextrakt zu erhalten, welcher das Enzym enthält. Durch die Anwendung einer Affinitätssäulenchromatographie unter Verwendung einer Guanosindiphosphat (GDP)-Hexanolamin-Sepharose, einer GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-Asparagin-Sepharose und dergleichen werden die Fraktionen, die eine Fucosyltransferase-Aktivität besitzen, gesammelt und gereinigt.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaft einer vom Schweinehirn stammenden α1-6-Fucosyltransferase, die ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, ist wie nachfolgend.

(1) Aktivität: überträgt Fucose von Guanosindiphosphat-Fucose auf die Hydroxygruppe in der 6-Position von GlcNAc nächstgelegen zu R eines Rezeptors (GlcNAcβ1-2Manα1-6)(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-R, wobei R eine Asparaginrest oder eine Peptidkette ist, welche diesen Rest trägt, wobei (GlcNAcβ1-2Manα1-6)(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc-R gebildet wird.
(2) Bestimmung der Aktivität: Die Aktivität der Schweine-α1-6-Fucosyltransferase wurde wie nachfolgend bestimmt. Das heißt, eine Verbindung der folgenden Formel, in der das Zuckerkettenende Asparagin mit 4-(2-Pyridylamino)butylamin [PABA: -NH₂(CH₂)₄-NH-Pyridin] markiert war, wurde als ein Substrat zur Bestimmung der Enzymaktivität verwendet:
wobei PA Pyridylamino bedeutet. Durch die Verwendung dieses Substrats kann das Produkt der Enzymreaktion, in der Fucose über eine α1→6 Bindung übertragen wurde, durch den Nachweis der Fluoreszenz durch eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie untersucht werden.

Der Nachweis schließt insbesondere die nachfolgenden Schritte ein. Eine Probenlösung (10 μl) und 1,25% Triton X-100 werden zu einem 250 mM MES-Puffer, der 62,5 μM des fluoreszenzmarkierten Rezeptorsubstrats der vorstehenden Formel und 625 μM eines Spendensubstrats (GDP-Fucose), pH-Wert 7,0, 40 μl, enthält, zugegeben und gemischt. Man lässt das Gemisch bei 37°C für eine Stunde reagieren und lässt es für 5 Minuten kochen, um die Reaktion zu beenden. Das Reaktionsgemisch wird einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterzogen und der Peak des Reaktionsprodukts wird mit einem Fluoreszenzdetektor untersucht. Eine Einheit der Enzymmenge entspricht der Menge, die in der Lage ist, 1 pMol von GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc-R (wobei R Asn-NH-(CH₂)₄-NH-Pyridin ist) in einer Minute unter diesen Bedingungen umzusetzen.

(3) pH-Optimum: Die vom Schweinehirn stammende α1-6-Fucosyltransferase (nachfolgend wird dieses Enzym als Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase bezeichnet) zeigt eine hohe Aktivität bei einem ungefähren pH-Wert von 7,0–7,5.
(4) pH-Stabilität: Die Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase ist bei einem pH-Wert von 4–10 relativ stabil und stabiler bei einem pH-Wert von 5–9.
(5) Temperaturoptimum: Die Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase besitzt ein Temperaturoptimum bei etwa 37°C und behält eine ausreichende Aktivität bei 20–40°C.
(6) Erfordernis eines zweiwertigen Metallions: Die Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase zeigt eine ausreichende Aktivität auch beim Fehlen eines zweiwertigen Metallions wie z.B. Magnesium, Mangan und dergleichen. Sie zeigt ebenfalls eine ausreichende Aktivität in Gegenwart von 5 mM EDTA, das ein Chelat ist.
(7) Molekulargewicht: Ein gereinigtes Produkt der Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase zeigt eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 60.000 in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.

Nach der Beurteilung der vorstehenden Eigenschaften ist die Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase ein neues Enzym, das sich anscheinend von der allgemein bekannten α1-6-Fucosyltransferase, die von menschlichen Zellen von Patienten mit Mukoviszidose (pH-Optimum 5,6, Molekulargewicht 34.000 und 39.000) stammt, bezüglich des pH-Optimums, der Erfordernisses eines Metallions und des Molekulargewichts unterscheidet.
Von der erfindungsgemäßen Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase wird erwartet, dass sie äußerst nützlich ist für (1) die Synthese von Zuckerkettenverbindungen, in denen die Zuckerkettenverbindungen, die eine 1-6-Fucose besitzen, unter Verwendung des Enzyms der vorliegenden Erfindung synthetisiert werden, (2) die Modifikation einer Zuckerkettenstruktur und die funktionelle Analyse, in der eine Fucose neu in die Zuckerkette vom Asparagin-Typ eingeführt wird, um die Zuckerkettenstruktur künstlich zu verändern, wobei Veränderungen in der Zellfunktion und des Kontrollmechanismus der Prozessierung von komplexen Kohlenhydraten so wie die Rolle der Zuckerkette aufgeklärt werden kann, (3) die Diagnose von Läsionen, die auf einer Enzymaktivität beruhen, wobei die Erkrankungen wie z.B. Krebs durch den Nachweis der Aktivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung diagnostiziert werden können, die verschiedene Läsionen widerspiegelt, die durch karzinogene Transformation hervorgerufen werden, (4) die Diagnose von verschiedenen Erkrankungen, wobei ein spezifischer Antikörper gegen das Enzym der vorliegenden Erfindung hergestellt und zur Diagnose verwendet wird, und dergleichen.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Gen, das die Schweine-α1-6-Fucosyltransferase codiert, welches ein Gen einschließt, das die α1-6-Fucosyltransferase codiert, und das ein Gen einschließt, das die Aminosäuresequenz codiert, die im Sequenzprotokoll, SEQ ID Nr.: 2, dargestellt wird. Eine andere Ausführungsform davon ist ein Gen, das eine α1-6-Fucosyltransferase codiert und das eine Nucleotidsequenz einschließt, die im Sequenzprotokoll, SEQ ID Nr.: 1, dargestellt wird.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Gen, das die Schweine-α1-6-Fucosyltransferase codiert und das ein Gen einschließt, das die Aminosäuresequenz codiert, welche sich durch Austausch, Insertion, Deletion oder Hinzufügen hinsichtlich mindestens einer Aminosäure der im Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr.: 2 dargestellten Aminosäuresequenz ergibt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Gen, das die Schweine-α1-6-Fucosyltransferase codiert und das eine Nucleotidsequenz einschließt, welche sich durch Austausch, Insertion, Deletion oder Hinzufügen hinsichtlich mindestens eines Nucleotids der im Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Nucleotidsequenz ergibt.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls als einen Aspekt davon ein Gen ein, das an mindestens einen Teil eines Gens hybridisiert, das die Schweine-α1-6-Fucosyltransferase codiert und das eine Nucleotidsequenz, die im Sequenzprotokoll, SEQ ID Nr.: 1, dargestellt wird, einschließt.
Der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung enthält ein Gen, das die vorstehend erwähnte Schweine-α1-6-Fucosyltransferase codiert.
Die Transformantenwirtszelle der vorliegenden Erfindung wurde mit dem vorstehend erwähnten Expressionsvektor transformiert.
Die Wirtszelle wird durch Mikroorganismen wie z.B. Escherichia coli, Hefe, Bakterienzellen und dergleichen beispielhaft erläutert. Sie schließt ebenfalls Tierzellen wie z.B. Insektenzellen, COS-1-Zellen, CHO-Zellen und dergleichen und Pflanzenzellen wie z.B. Tabakzellen, Arabidopsis-Zellen und dergleichen ein.
Es kann jeder Vektor verwendet werden, der gemäß dem Wirt, der transformiert werden soll, ausgewählt wird. Im Fall von Escherichia coli kann zum Beispiel pUC19 verwendet werden, im Fall von Hefe kann pYEUra3^TM verwendet werden; im Fall von Insektenzellen kann pBLUE Bac4 verwendet werden; im Fall von COS-1-Zellen kann pSVK3 verwendet werden; und im Fall von Tabakzellen und Arabidopsis-Zellen kann pBI verwendet werden.
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen rekombinanten α1-6-Fucosyltransferase schließt das Züchten der vorstehend erwähnten Transformantenzellen und das Ernten der α1-6-Fucosyltransferase aus der Kultur ein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ausschließlich α1-6-Fucosyltransferase vom Schweinehirn gereinigt und einer Aminosäurenanalyse dieses Proteins unterzogen. Ihre partielle Aminosäuresequenz wird bestimmt und ein Primer für die PCR wird basierend auf der Aminosäuresequenz hergestellt. Unter Verwendung dieses Primers wird die PCR durchgeführt, wobei vom Schweinhirn stammende cDNAs als eine Matrize verwendet werden, um ein Gen, das die α1-6-Fucosyltransferase codiert, zu amplifizieren, um eine Sonde herzustellen. Diese Sonde wird verwendet, um nach Clonen, die eine cDNA, welche die α1-6-Fucosyltransferase codiert, enthalten, in der vom Schweinehirn stammenden cDNA-Bibliothek zu suchen. Die cDNA, welche die α1-6-Fucosyltransferase codiert, wird isoliert und verwendet, um die α1-6-Fucosyltransferase zu exprimieren.
Insbesondere wird die gereinigte Schweine-α1-6-Fucosyltransferase verwendet, um Aminosäuresequenzen zu untersuchen. Zum Beispiel wird eine SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese angewendet, nach der das Protein durch ein Elektroblot-Verfahren auf eine PVDF-Membran übertragen wird, und die PVDF-Membran, welche die etwa 60 kDa-Bande enthält, wird ausgeschnitten und unter Verwendung eines Proteinsequenziergeräts einer Sequenzierung unterzogen. Als ein Ergebnis wird die Aminosäuresequenz des Amino-Endes der α1-6- Fucosyltransferase, die im Sequenzprotokoll, SEQ ID Nr.: 3, dargestellt wird, erhalten.
Gereinigte α1-6-Fucosyltransferase wird getrennt einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen und die durch die Elektrophorese getrennten Peptidfragmente werden durch ein Elektroblot-Verfahren auf eine PVDF-Membran übertragen. Die PVDF-Membran, welche die 60-kDa-Bande enthält, wird anschließend ausgeschnitten und die Bande wird unter Verwendung von zum Beispiel einer Protease wie z.B. die Lysylendopeptidase auf der PVDF-Membran lysiert. Das Lysat wird von den ausgeschnittenen Stücken der PVDF-Membran extrahiert und der Extrakt wird einer Umkehrphasenhochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unterzogen, um das Lysat aufzutrennen.
Anschließend wird unter Verwendung der Aminosäurensequenzen ein Mischprimer für die PCR hergestellt. Ein Mischprimer, der eine Nucleotidsequenz besitzt, die in SEQ ID Nr.: 7 dargestellt ist, wird zum Beispiel von der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 3 dargestellt ist, synthetisiert beziehungsweise ein Mischprimer, der die Nucleotidsequenz besitzt, die in SEQ ID Nr.: 8 dargestellt ist, wird von einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 4 dargestellt ist, synthetisiert, und zwar unter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts, und für das Absuchen von cDNA der α1-6-Fucosyltransferase verwendet.
Es werden zum Beispiel 25 Zyklen der PCR durchgeführt, um DNA-Fragmente mit einer Größe von ca. 1,45 kbp zu vervielfältigen, wobei cDNA von Schweinehirn als eine Matrize und Mischprimer der SEQ ID Nr.: 7 und SEQ ID Nr.: 8 verwendet werden, wobei PCR bei 94°C (1 min), 55°C (2 min) und 72°C (3 min) einen Zyklus darstellt.
Anschließend wird nach Clonen, welche die α1-6-Fucosyltransferase codierende cDNA enthalten, in der von dem Schweinhirn stammenden cDNA-Bibliothek durch ein Plaque-Hybridisierungsverfahren gesucht, wobei die vervielfältigten DNA-Fragmente als eine Sonde verwendet werden. Die cDNA, welche die α1-6-Fucosyltransferase codiert, kann von den erhaltenen Clonen isoliert werden. Die Nucleotidsequenz der erhaltenen cDNA und die von der Nucleotidsequenz abgeleiteten Aminasäuresequenz werden in SEQ ID Nr.: 1 und SEQ ID Nr.: 2 gezeigt.
Die cDNA wird in einen Expressionsvektor wie z.B. pSVK3 subcloniert. Die Wirtszellen wie z.B. COS-1-Zellen, die mit dem subclonierten Plasmid transformiert wurden, werden gezüchtet und die α1-6-Fucosyltransferase wird von der Kultur erhalten.
In der vorliegenden Erfindung werden die vorstehend erwähnten Transformantenzellen gezüchtet und α1-6-Fucosyltransferase wird von der Kultur geerntet, wobei rekombinante α1-6-Fucosyltransferase erhalten wird. Das Verfahren zur Ernte des Enzyms aus der Kultur ist ein konventionelles Verfahren.
Das Gen, das die Schweine-α1-6-Fucosyltransferase der vorliegenden Erfindung codiert, und die DNA-Fragmente (die Lysate davon sind) können für den Nachweis der Expression von α1-6-Fucosyltransferase im lebenden Körper verwendet werden und sind daher für die genetische Diagnose von bestimmten Erkrankungen wie z.B. Leberkrebs und Mukoviszidose nützlich.
Zusätzlich kann das Polypeptid, das durch diese Gene codiert wird, verwendet werden, um immunologisch verschiedene Antikörper herzustellen, die für die Diagnose und Reinigung von α1-6-Fucosyltransferase nützlich sind.
Das Ausgangsmaterial für die Reinigung des Enzyms in dieser Erfindung kann jedes Zellkulturmedium sein, solange es ein menschliches Zellkulturmedium ist, das eine α1-6-Fucosyltransferase-Aktivität zeigt. Zum Beispiel können menschliche Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, menschliche Magenkrebszellen, menschliche Myelomkrebszellen und dergleichen verwendet werden, wenn die Zellen eine α1-6-Fucosyltransferase-Aktivität besitzen.
Während die Mensch-α1-6-Fucosyltransferase in der Zellmembran als ein membrangebundenes Enzym vorliegt, wird sie durch eine Protease an einer Stelle gespalten, welche die Enzymaktivität nicht beeinflusst, und in das Kulturmedium als ein lösliches Enzym entlassen. Das Kulturmedium kann daher als eine Rohenzymlösung ohne komplizierte Schritte wie z.B. das Zerstören der Zellen und das Solubilisieren des Enzyms verwendet werden. Außerdem ermöglicht die Verwendung von Zellen, die in der Lage sind, im serumfreien Medium zu wachsen, eine ökonomische Herstellung einer Rohenzymlösung, die eine hohe Reinheit besitzt. Das Kulturmedium wird konzentriert und entsalzt und einer Ionenaustauschchromatographie, einer Affinitätschromatographie und dergleichen unterzogen, um ein gereinigtes Enzymprodukt zu ergeben, das frei von einer kontaminierenden Transferase- und Glycosidaseaktivität ist.
α1-6-Fucosyltransferase wird von menschlichen Magenkrebszellen zum Beispiel durch die Züchtung der menschlichen Magenkrebszelle MKN45 ohne Serum und durch die Reinigung des Enzyms von dem so erhaltenen Kulturmedium gereinigt. In diesem Fall wird die α1-6-Fucosyltransferase der menschlichen Magenkrebszelle MKN45 in den Zellen durch eine Protease an einer Stelle gespalten, welche die Enzymaktivität nicht beeinflußt, und in das Kulturmedium als eine lösliche α1-6-Fucosyltransferase entlassen. Das Kulturmedium kann daher als eine Rohenzymlösung ohne komplizierte Schritte wie z.B. das Zerstören der Zellen und das Solubilisieren des Enzyms mit einem grenzflächenaktiven Mittel verwendet werden. Die Rohenzymlösung wird bekannten Reinigungsschritten unterzogen, um ein gereinigtes Enzymprodukt zu ergeben.
In der vorliegenden Erfindung wird ein serumfreies Kulturmedium der menschlichen Magenkrebszelle MKN45 durch Filtration durch eine Ultrafiltrationsmembran konzentriert und anschließend wird der Puffer durch einen Tris-HCl-Puffer, der 5 mM 2-Mercaptoethanol und 0,1 % CHAPS [3-((3-Cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propansulfonat], pH-Wert 7,5, enthält, ausgetauscht, um eine Rohenzymlösung zu ergeben.
Diese Enzymlösung wird einer Säulenchromatographie unter Verwendung von Q-Sepharose, GDP-Hexanolamin-Sepharose, GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-Asparagin-Sepharose und dergleichen unterzogen, um aktive Fraktionen zu sammeln, von denen die Fucosyltransferase der vorliegenden Erfindung gereinigt werden kann.
Die physikalisch-chemische Eigenschaft der Mensch-α1-6-Fucosyltransferase der vorliegenden Erfindung ist wie nachfolgend.

(1) Aktivität: überträgt Fucose von Guanosindiphosphat-Fucose auf die Hydroxygruppe in der 6-Position von GlcNAc nächstgelegen zu R eines Rezeptors (GlcNAcβ1-2Manα1-6)(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-R, wobei R ein Asparaginrest oder eine Peptidkette ist, welche diesen Rest trägt, wobei (GlcNAcβ1-2Manα1-6)(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc-R gebildet wird.
(2) Bestimmung der Enzymaktivität: Die Aktivität der Mensch-α1-6-Fucosyltransferase wurde wie nachfolgend bestimmt. Das heißt, eine Verbindung der vorstehend erwähnten Formel, in der das Asparagin am Ende der Zuckerkette mit 4-(2-Pyridylamino)butylamin [PABA: -NH₂(CH₂)₄-NH-Pyridin] fluoreszenzmarkiert war, wurde als ein Substrat zur Bestimmung der Enzymaktivität verwendet. Durch die Verwendung dieses Substrats konnte das Produkt der Enzymreaktion, in der Fucose über eine α1→6-Bindung übertragen wird, durch den Nachweis der Fluoreszenz durch eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie untersucht werden.

Der Nachweis schließt insbesondere die nachfolgenden Schritte ein. Eine Enzymlösung (10 μl) wurde zu einem 250 mM MES-Puffer, der 62,5 μM des fluoreszenzmarkierten Rezeptorsubstrats der vorstehenden Formel und 625 μM eines Spendensubstrats (GDP-Fucose), pH-Wert 7,0, 40 μl, enthält, zugegeben und gemischt. Man lässt das Gemisch bei 37°C für eine Stunde reagieren und lässt es für 5 Minuten kochen, um die Reaktion zu beenden. Das Reaktionsgemisch wird einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterzogen und der Peak des Reaktionsprodukts wird mit einem Fluoreszenzdetektor untersucht.
Eine Einheit der Enzymmenge entspricht der Menge, die in der Lage ist, 1 pMol von GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc-R (wobei R Asn-NH-(CH₂)₄-NH-Pyridin ist) in einer Minute unter diesen Bedingungen zu produzieren.

(3) pH-Optimum: Die Mensch-α1-6-Fucosyltransferase zeigt eine hohe Aktivität bei einem ungefähren pH-Wert von 7,0–7,5, wie durch eine Kurve in 1 gezeigt wird. In 1 wurde die Bestimmung unter Verwendung eines 500 mM MES-Puffers (schwarze Kreise) bei einem pH-Wert von 4,5–7,5 und eines 100 mM Tris-HCl-Puffers (weiße Kreise) bei einem pH-Wert von 7,0–9,0 durchgeführt.
(4) pH-Stabilität: Die Mensch-α1-6-Fucosyltransferase ist bei einem pH-Wert von etwa 4–10 stabil, besonders bei einem pH-Wert von 5–9, wie in 2 gezeigt wird. Die für die Bestimmung verwendeten Puffer waren 50 mM Acetat-Puffer (schwarze Dreiecke) mit einem pH-Wert von 3,5–5,5, 50 mM MES-Puffer (schwarze Kreise) mit einem pH-Wert von 5,5–7,5, 50 mM Tris-HCl-Puffer (weiße Kreise) mit einem pH-Wert von 7,5–9,0 und Natriumhydrogencarbonatpuffer (weiße Dreiecke) mit einem pH-Wert von 9,0–11,5. Das Enzym der vorliegenden Erfindung wurde in jedem Puffer bei jedem pH-Wert bei 4°C für 5 Stunden behandelt und die Restaktivität wurde bestimmt. 1 ist ein Graph, der das Verhältnis zwischen pH-Wert (Abszisse) und der relativen Aktivität (%, Ordinate) der Mensch-α1-6-Fucosyltransferase, die durch die vorliegende Erfindung erhalten wurde, zeigt, und 2 ist ein Graph, der den pH-Wert (Abszisse) und die Restaktivität (%, Ordinate) zeigt.
(5) Temperaturoptimum: Die Mensch-α1-6-Fucosyltransferase besitzt ein Temperaturoptimum bei etwa 37°C, wie in 3 gezeigt wird, und ist bei 20–40°C verwendbar. Ein gefrorenes Produkt davon ist bei –20°C für mindestens mehrere Monate stabil.
(6) Erfordernis eines zweiwertigen Metallions: Viele Glycosyltransferasen benötigen für ihre Aktivität ein zweiwertiges Metallion wie z.B. Magnesium, Mangan und dergleichen. Diese Mensch-α1-6-Fucosyltransferase zeigt auch beim Fehlen eines zweiwertigen Metallions oder in Gegenwart von 5 EDTA, das ein Chelatbildner ist, eine ausreichende Aktivität und benötigt kein zweiwertiges Metallion.
(7) Molekulargewicht: Ein gereinigtes Produkt der Mensch-α1-6-Fucosyltransferase der vorliegenden Erfindung zeigt eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 60.000 in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.
(8) Morphologie: Während die Mensch-α1-6-Fucosyltransferase eigentlich im Zellmembran als ein membrangebundenes Enzym vorliegt, wird sie durch eine Protease in der gezüchteten Zelle an einer Stelle gespalten, welche die Enzymaktivität nicht beeinflusst, und in ein Kulturmedium als ein lösliches Enzym entlassen, was eine einfache Handhabung anders als die der vom Schwein stammenden α1-6-Fucosyltransferase und der von menschlichen Mukoviszidosezellen stammenden α1-6-Fucosyltransferase, die vorstehend beschrieben wurden, erlaubt.

Nach der Beurteilung der vorstehenden Eigenschaften ist die Mensch-α1-6-Fucosyltransferase ein neues Enzym, das sich anscheinend von der allgemein bekannten α1-6-Fucosyltransferase, die von menschlichen Zellen von Patienten mit Mukoviszidose (pH-Optimum 6,5, Molekulargewicht 34.000 und 39.000) stammt, bezüglich des pH-Optimums, der Erfordernis von Metallionen und dem Molekulargewicht unterscheidet.
Die menschliche α1-6-Fucosyltransferase wird für die nachfolgenden Ziele verwendet.

(1) Die künstliche Modifikation einer Zuckerkettenstruktur durch das neue Einführen einer Fucose in die Zuckerkette vom Asparagin-Typ, wobei der Zellapparat und der Kontrollmechanismus der Prozessierung der Zuckerkette von komplexen Kohlenhydraten so wie die Rolle der Zuckerkette aufgeklärt werden kann.
(2) Die Diagnose von verschiedenen Erkrankungen, die auf der Aktivität des Erfindungsenzyms basieren.
(3) Die Diagnose von verschiedenen Erkrankungen, wobei ein spezifischer Antikörper gegen das Enzym der vorliegenden Erfindung hergestellt und zur Diagnose verwendet wird.

Die vorliegende Erfindung ist ein Gen, das die menschliche α1-6-Fucosyltransferase codiert, und als eine Ausführungsform ein Gen einschließt, das die α1-6-Fucosyltransferase codiert, und ein Gen einschließt, das eine Aminosäuresequenz codiert, die im Sequenzprotokoll, SEQ ID Nr.: 10, dargestellt wird. Eine andere Ausführungsform davon ist ein Gen, das eine α1-6-Fucosyltransferase einschließlich einer Nucleotidsequenz codiert, die im Sequenzprotokoll, SEQ ID Nr.: 9, dargestellt wird. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Gen, das eine α1-6-Fucosyltransferase codiert und das eine Nucleotidsequenz vom 198. Adenin bis zum 1919. Guanin einschließt, wie im Sequenzprotokoll, SEQ ID Nr.: 9, dargestellt wird.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Gen, das die α1-6-Fucosyltransferase codiert und das ein Gen einschließt, das eine Aminosäuresequenz codiert, welche sich durch Austausch, Insertion, Deletion oder Hinzufügen hinsichtlich mindestens einer Aminosäure der im Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr.: 10 dargestellten Aminosäuresequenz ergibt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Gen, das die α1-6-Fucosyltransferase codiert und das eine Nucleotidsequenz einschließt, die sich durch Austausch, Insertion, Deletion oder Hinzufügen hinsichtlich mindestens eines Nucleotids der im Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr.: 9 dargestellten Nucleotidsequenz ergibt.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls als eine Ausführungsform ein Gen ein, das an mindestens einen Teil eines Gens hybridisiert, das die α1-6-Fucosyltransferase codiert und das eine Nucleotidsequenz, die im Sequenzprotokoll, SEQ ID Nr.: 9, dargestellt wird, einschließt.
Der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung enthält ein Gen, das die vorstehend erwähnte α1-6-Fucosyltransferase codiert.
Die Transformantenwirtszelle der vorliegenden Erfindung wurde mit dem vorstehend erwähnten Expressionsvektor transformiert.
Die Wirtszelle wird durch Mikroorganismen wie z.B. Escherichia coli, Hefe, Bakterienzellen und dergleichen beispielhaft erläutert. Sie schließt ebenfalls Tierzellen wie z.B. Insektenzellen, COS-1-Zellen, CHO-Zellen und dergleichen und Pflanzenzellen wie z.B. Tabakzellen, Arabidopsis-Zellen und dergleichen ein.
Es kann jeder Vektor verwendet werden, der gemäß dem Wirt, der transformiert werden soll, ausgewählt wird. Im Fall von Escherichia coli kann zum Beispiel pUC19 verwendet werden, im Fall von Hefe kann pYEUra3^TM verwendet werden; im Fall von Insektenzellen kann pBLUE Bac4 verwendet werden; im Fall von COS-1-Zellen kann pSVK3 verwendet werden; und im Fall von Tabakzellen und Arabidopsis-Zellen kann pBI verwendet werden.
Das Verfahren zur Herstellung der rekombinanten α1-6-Fucosyltransferase schließt die Züchtung der vorstehend erwähnten Transformantenzellen und die Ernte der α1-6-Fucosyltransferase aus der Kultur ein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ausschließlich α1-6-Fucosyltransferase von menschlichen Magenkrebszellen gereinigt und einer Aminosäurenanalyse dieses Proteins unterzogen. Seine partielle Aminosäuresequenz wird bestimmt und ein Primer für die PCR wird basierend auf der Aminosäuresequenz hergestellt. Unter Verwendung dieses Primers wird die PCR durchgeführt, wobei von menschlichen Magenkrebszellen stammende cDNAs als eine Matrize verwendet werden, um ein Gen, das die α1-6-Fucosyltransferase codiert, zu amplifizieren, um eine Sonde herzustellen. Diese Sonde wird verwendet, um nach Clonen, die eine cDNA enthalten, welche die α1-6-Fucosyltransferase codiert, in der von menschlichen Magenkrebszellen stammenden cDNA-Bibliothek abzusuchen. Die cDNA, welche die α1-6-Fucosyltransferase codiert, wird isoliert und verwendet, um die α1-6-Fucosyltransferase zu exprimieren.
Insbesondere wird die gereinigte α1-6-Fucosyltransferase verwendet, um Aminosäuresequenzen zu untersuchen. Zum Beispiel wird eine SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese angewendet, nach der das Protein durch ein Elektroblot-Verfahren auf eine PVDF-Membran übertragen wird, und die PVDF-Membran, welche die etwa 60 kDa-Bande enthält, wird ausgeschnitten und unter Verwendung eines Proteinsequenziergeräts einer Sequenzierung unterzogen. Als ein Ergebnis wird die Aminosäuresequenz des Amino-Endes der α1-6-Fucosyltransferase, die im Sequenzprotokoll, SEQ ID Nr.: 11, dargestellt wird, erhalten.
Getrennt davon wird gereinigte α1-6-Fucosyltransferase zusammen mit einer Protease wie z.B. der Lysylendopeptidase einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen und die durch die Elektrophorese getrennten Peptidfragmente werden durch ein Elektroblot-Verfahren auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Bande, welche die Peptidfragmente enthält, wird anschließend ausgeschnitten und sie wird unter Verwendung eines Proteinsequenziergeräts einer Sequenzierung unterzogen. Die Teilaminosäuresequenzen der α1-6-Fucosyltransferase, wie sie im Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr.: 12 und SEQ ID Nr.: 13 dargestellt sind, werden erhalten. Anschließend wird unter Verwendung dieser Aminosäuresequenzen ein Mischprimer für die PCR hergestellt. Ein Mischprimer, der eine Nucleotidsequenz besitzt, die in SEQ ID Nr.: 14 dargestellt ist, wird zum Beispiel von der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 12 dargestellt ist, synthetisiert beziehungsweise ein Mischprimer, der die Nucleotidsequenz besitzt, die in SEQ ID Nr.: 15 dargestellt ist, wird von einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 13 dargestellt ist, synthetisiert, und zwar unter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts, und für das Absuchen von cDNA der α1-6-Fucosyltransferase verwendet.
Es werden zum Beispiel 36 Zyklen der PCR durchgeführt, um DNA-Fragmente mit einer Größe von ca. 200 bp zu vervielfältigen, wobei cDNA von menschlichen Magenkrebszellen als eine Matrize und Mischprimer der SEQ ID Nr.: 14 und SEQ ID Nr.: 15 verwendet werden, wobei die PCR bei 94°C (30 sec), 46°C (30 sec) und 72°C (1,5 min) einen Zyklus darstellt.
Anschließend wird nach Clonen, welche die α1-6-Fucosyltransferase codierende cDNA enthalten, in der von menschlichen Magenkrebszellen stammenden cDNA-Bibliothek durch ein Plaque-Hybridisierungsverfahren abgesucht, wobei die vervielfältigten DNA-Fragmente als eine Sonde verwendet werden. Die cDNA, welche die α1-6-Fucosyltransferase codiert, kann von den erhaltenen Clonen isoliert werden. Die Nucleotidsequenz der erhaltenen cDNA und die von der Nucleotidsequenz abgeleiteten Aminosäuresequenzen werden in SEQ ID Nr.: 9 und SEQ ID Nr.: 10 gezeigt.
Die cDNA wird in einen Expressionsvektor wie z.B. pSVK3 subcloniert. Die Wirtszellen wie z.B. COS-1-Zellen, die mit dem subclonierten Plasmid transformiert werden, werden gezüchtet und α1-6-Fucosyltransferase wird von der Kultur erhalten.
In der vorliegenden Erfindung werden die vorstehend erwähnten Transformantenzellen gezüchtet und α1-6-Fucosyltransferase wird von der Kultur geerntet, wobei eine rekombinante α1-6-Fucosyltransferase erhalten wird.
Das Verfahren zur Ernte des Enzyms aus der Kultur ist ein konventionelles Verfahren.
Das Gen, das die menschliche α1-6-Fucosyltransferase der vorliegenden Erfindung codiert, und die DNA-Fragmente (die Lysate davon sind) können für den Nachweis der Expression von α1-6-Fucosyltransferase im lebenden Körper verwendet werden und sind daher für die genetische Diagnose von bestimmten Erkrankungen wie z.B. Leberkrebs und Mucoviszidose nützlich.
Zusätzlich kann das Polypeptid, das durch diese Gene codiert wird, verwendet werden, um immunologisch verschiedene Antikörper herzustellen, die für die Diagnose und Reinigung von α1-6-Fucosyltransferase nützlich sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das pH-Optimum der Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt die pH-Stabilität der Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase der vorliegenden Erfindung.
3 zeigt das Temperaturoptimum der Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase der vorliegenden Erfindung.
4 zeigt das pH-Optimum der menschlichen α1-6-Fucosyltransferase der vorliegenden Erfindung.
5 zeigt die pH-Stabilität der menschlichen α1-6-Fucosyltransferase der vorliegenden Erfindung.
6 zeigt das Temperaturoptimum der menschlichen α1-6-Fucosyltransferase der vorliegenden Erfindung.
Ausführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird durch Beispiele detaillierter beschrieben.
In der vorliegenden Erfindung wird die Enzymaktivität, wie nachfolgend beschrieben wird, bestimmt.
Eine Verbindung der folgenden Formel, in der das Asparagin am Ende der Zuckerkette mit 4-(2-Pyridylamino)butylamin [PABA: -NH₂(CH₂)₄-NH-Pyridin] durch Fluoreszenz markiert war, wurde als ein Substrat zur Bestimmung der Enzymaktivität verwendet:
Durch die Verwendung dieses Substrats kann das Produkt der Enzymreaktion, in der Fucose über eine α1→6 Bindung übertragen wurde, durch den Nachweis der Fluoreszenz durch eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie untersucht werden.
Der Nachweis schließt genau gesagt die nachfolgenden Schritte ein. Eine Probenlösung (10 μl) und 1,25% Triton X-100 werden zu einem 250 mM MES-Puffer, der 62,5 μM des fluoreszenzmarkierten Rezeptorsubstrats der vorstehenden Formel und 625 μM eines Spendensubstrats (GDP-Fucose), pH-Wert 7,0, 40 μl, enthält, zugegeben und gemischt. Man lässt das Gemisch bei 37°C für eine Stunde reagieren und lässt es für 5 Minuten kochen, um die Reaktion zu beenden. Das Reaktionsgemisch wird einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterzogen und der Peak des Reaktionsprodukts wird mit einem Fluoreszenzdetektor untersucht.
Eine Einheit der Enzymmenge entspricht der Menge, die in der Lage ist, 1 pMol von GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc-R (wobei R Asn-NH-(CH₂)₄-NH-Pyridin ist) in einer Minute unter diesen Bedingungen zu produzieren.
Beispiel 1
(1) Herstellung von Schweinehirnlysat und Rohextraktlösung
Schweinehirn (100 g) wurde in einem Waring-Mixer in einem 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0, aufgebrochen und die Membranfraktionen wurden durch Ultrazentrifugation gesammelt. Die Membranfraktionen wurden mit dem gleichen Puffer, der Triton X-100 (Konzentration 0,5%) enthielt, extrahiert, um das Enzym zu extrahieren. Nach der Extraktion wurden die Überstände durch Zentrifugation gesammelt, um einen Extrakt zu erhalten, der ein Rohenzym enthielt.
(2) Reinigung des Enzyms aus der Rohextraktlösung
Eine GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-Asparagin-Sepharose-Säule (Säule von von Transferrin stammendem Asialoagalactoglycopeptid) wurde mit einem 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,0), der 0,05% Triton X-100 und 50 mM KCl enthielt, äquilibriert und die in vorstehend (1) hergestellte Rohextraktlösung wurde verwendet. Die Säule wurde mit dem Puffer gewaschen, bis das Protein in den nicht adsorbierten Fraktionen nicht nachgewiesen wurde. Die aktiven Fraktionen wurden mit dem gleichen Puffer, der 1 M KCl enthielt, eluiert. Die aktiven Fraktionen des Enzyms wurden anschließend unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert und entsalzt und auf eine GDP-Hexanolamin-Sepharose-Säule gegeben, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert wurde. Die Elution wurde unter Verwendung des gleichen Puffers, der 100 mM GDP enthielt, durchgeführt. Anschließend wurden die aktiven Fraktionen gesammelt und unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert und entsalzt, um Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase zu ergeben. Die so erhaltene Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase zeigte eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 60.000 in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese. Keine anderen Banden, die auf Unreinheiten zurückzuführen gewesen wären, wurden gefunden und das Enzym war frei von anderen Transferaseaktivitäten, was darauf hinweist, dass das erhaltene Enzym hoch gereinigt vorlag.
Das pH-Optimum (bestimmt durch den Wechsel des pH-Werts des Puffers) des Enzyms der vorliegenden Erfindung wird in 1 gezeigt. Das Enzym zeigt eine hohe Aktivität bei einem ungefähren pH-Wert von 7,0–7,5. Der verwendete Puffer war 200 mM MES-Puffer (schwarzer Kreis). In diesem Graph zeigt die Abszisse den pH-Wert von α1-6-Fucosyltransferase, die in der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, und die Ordinate zeigt die relative Aktivität (%).
Die pH-Stabilität des Enzyms der vorliegenden Erfindung wurde in der gleichen Weise untersucht. 2 zeigt die Restaktivität nach der Behandlung des Enzyms in jedem Puffer bei jedem pH-Wert bei 4°C für 5 Stunden. Das Enzym war bei einem pH-Wert von 4–10 relativ stabil und war besonders stabil bei einem pH-Wert von 5–9. Die verwendeten Puffer waren 50 mM Acetat-Puffer (schwarzes Dreieck) mit einem pH-Wert von 3,5–5,5, 50 mM MES-Puffer (schwarzer Kreis) mit einem pH-Wert von 5,5–7,5, 50 mM Tris-HCl-Puffer (weißer Kreis) mit einem pH-Wert von 7,5–9,0 und Natriumhydrogencarbonatpuffer (weißes Dreieck) mit einem pH-Wert von 9,0–11,5. Die Abszisse der Graphik zeigt den pH-Wert von α1-6-Fucosyltransferase, die in der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, und die Ordinate zeigt die Restaktivität (%).
Wie in 3 gezeigt wird, besaß das Enzym der vorliegenden Erfindung ein Temperaturoptimum von etwa 37°C und es wurde angenommen, dass es eine ausreichende Aktivität in dem Bereich von 20–40°C behält. Ein gefrorenes Produkt davon war bei –20°C für mindestens mehrere Monate stabil. Der verwendete Puffer war 200 mM MES-Puffer (schwarzer Kreis), pH-Wert 7,0. Die Abszisse der Graphik zeigt die Behandlungstemperatur (°C) und die Ordinate zeigt die relative Aktivität (%) der α1-6-Fucosyltransferase, die in der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.
Während viele Glycosyltransferasen ein zweiwertiges Metallion wie z.B. Magnesium, Mangan und dergleichen für ihre Aktivität benötigen, zeigte das Enzym eine ausreichende Aktivität beim Fehlen eines solchen zweiwertigen Metallions. Da es auch eine ausreichende Aktivität in der Gegenwart von 5 mM EDTA, das ein Chelatbildner ist, zeigte, wird geschlossen, dass das Enzym ein zweiwertiges Metallion nicht benötigt.
Beispiel 2
Bestimmung der Aminosäurensequenz des Aminoendes von Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase
Gereinigte Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase (5 μg) wurde einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen, wonach das Protein mittels eines Elektroblot-Verfahrens auf eine PVDF-Membran (Millipore) übertragen wurde. Die PVDF-Membran wurde mit Coomassie Brilliant Blue G250 gefärbt und eine einzelne Bande der Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase wurde bei 60 kDa nachgewiesen.
Anschließend wurde die PVDF-Membran, welche die Bande enthielt, ausgeschnitten und nach der Entfärbung in 50% Methanol für die Untersuchung in einem Biosystem 473A Protein-Sequenziergerät (Applied Biosystems) verwendet, um die Aminosäuresequenz des Aminoendes von α1-6-Fucosyltransferase zu bestimmen. Die Aminosäuresequenz, die bestimmt wurde, wird im Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr.: 3 dargestellt.
Beispiel 3
Bestimmung der Teilaminosäurensequenz von Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase
Gereinigte Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase (13 μg) wurde einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen, wonach das Protein mittels eines Elektroblot-Verfahrens auf eine PVDF-Membran (Millipore) übertragen wurde. Die PVDF-Membran wurde mit Coomassie Brilliant Blue G250 gefärbt und eine einzelne Bande der Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase wurde bei 60 kDa nachgewiesen.
Anschließend wurde die PVDF-Membran, welche die Bande enthielt, ausgeschnitten und in 50% Methanol entfärbt. Der Ausschnitt der PVDF-Membran wurde in 100 mM Tris-HCl-Puffer-5%-Acetonitril (pH-Wert 8,2), das 1 μg der Lysinendopeptidase enthielt, bei 37°C für 12 Stunden für Proteolyse behandelt. Der Ausschnitt der PVDF-Membran, bei dem eine Proteolyse stattfand, wurde mit Ultraschall behandelt, um das Proteolyseprodukt zu extrahieren. Das so erhaltene Proteolyseprodukt wurde durch eine Umkehrphasenhochleistungs-Flüssigkeitschromatographie getrennt, wobei eine C-18-Säule verwendet wurde, um 3 Peptidfragmente zu erhalten. Die Substanz; welche die Peptidfragmente enthielt, die durch die Umkehrphasenhochleistungs-Flüssigkeitschromatographie getrennt wurden, wurde auf einen Polybrene beschichteten Glasfaserfilter, der zuvor einem Zyklus unterworfen worden war ("precycled"), angewendet, der mit Trifluoracetat aktiviert und getrocknet wurde, und anschließend für ein Biosystem 473A-Protein-Sequenziergerät (Applied Biosystems) verwendet, um die Teilaminosäuresequenz von Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase zu bestimmen. Die bestimmte Aminosäuresequenz wird im Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr.: 4–6 dargestellt.
Beispiel 4
Herstellung der Sonden-DNA durch PCR
Mischprimer, die in SEQ ID Nr.: 7 und SEQ ID Nr.: 8 gezeigt werden, wurden von den Aminosäuresequenzen, die in den Beispielen 2 und 3 erhalten wurden, synthetisiert. Der Mischprimer, der in SEQ ID Nr.: 7 gezeigt wird, wurde als ein Sense-Primer verwendet und der Mischprimer, der in SEQ ID Nr.: 8 gezeigt wird, wurde als ein Antisense-Primer für die PCR verwendet. Insbesondere wurden 25 Zyklen der PCR durchgeführt, wobei ein Zyklus der PCR bei 94°C (1 min), 55°C (2 min) und 72°C (3 min) unter Verwendung von 2 μg Schweinehirn cDNA, 25 pMol Sense-Primer (der in SEQ ID Nr.: 7 gezeigte Mischprimer), 25 pMol Antisense-Primer (der in SEQ ID Nr.: 8 gezeigte Mischprimer) und eines Reaktionsgemisches (50 μl) von 50 mM Kaliumchlorid-10 mM Tis-HCl-Puffer (pH-Wert 8,3)–1,5 mM Magnesiumchlorid-0,001 % Gelatine-200 μM dNTP, das 2,5 Einheiten der Taq-DNA-Polymerase enthielt, war.
Das Reaktionsgemisch (10 μl) wurde nach der PCR einer 0,7% Agarosegelelektrophorese unterzogen, um die DNA-Fragmente des PCR-Reaktionsprodukts zu bestätigen. Als ein Ergebnis der durchgeführten PCR unter Verwendung einer Kombination eines Mischprimers, der in SEQ ID Nr.: 7 gezeigt wird, und eines Mischprimers, der in SEQ ID Nr.: 8 gezeigt wird, wurde ein 1,45 kbp großes DNA-Fragment durch die Agarosegelelektrophorese nachgewiesen.
Dieses DNA-Fragment wurde in den Plasmid-pT7BLUEt-Vektor (Novagen) subcloniert und die Nucleotidsequenz wurde bestätigt. Als ein Ergebnis wurde eine DNA, die der Aminosäuresequenz entspricht, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr.: 3–6 dargestellt wird, nachgewiesen, wobei bestätigt wurde, dass das DNA-Fragment ein Teil des α1-6-Fucosyltransferase-Gens war.
Beispiel 5
Isolation des Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase-Gens
Das DNA-Fragment, das in Beispiel 4 erhalten wurde, wurde mit α-³²P-dCTP (3000 Ci/mMol, Amersham) markiert und als eine Sonde verwendet, um nach Clonen, welche die α1-6-Fucosyltransferase codierende cDNA enthielten, in der von Schweinhirn stammenden λgt11-cDNA-Bibliothek (Clonetech) durch ein Plaque-Hybridisierungsverfahren zu suchen.
Als ein Ergebnis der Durchmusterung von etwa 400.000 Plaques wurden die 5 positiven Clone c1, c2, c3, c4 und c5 erhalten. Es wurde postuliert, dass die Clone c1 und c2 aufgrund ihrer Länge das α1-6-Fucosyltransferase-Gen in vollständiger Länge enthielten. Daher wurden die Nucleotidsequenzen von c1 und c2 bestimmt und eine Nucleotidsequenz, die in SEQ ID Nr.: 1 dargestellt wird, wurde erhalten.
Beispiel 6
Expression des Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase-Gens
Die codierende Region des α1-6-Fucosyltransferase-Gens wurde in den Expressionsvektor pSVK3 von Clonen, welche die cDNA enthielten, welche die in Beispiel 5 erhaltene Schweinehirn-α1-6-Fucosyltransferase codierte, subcloniert. Der Expressionsvektor, der das α1-6-Fucosyltransferase-Gen enthielt, wurde in COS-1-Zellen eingeführt. Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden, wurden die gezüchteten Zellen gesammelt und die Zellen wurden aufgebrochen. Die Enzymaktivität der α1-6-Fucosyltransferase wurde in dem erhaltenen Lysat bestimmt.
Als eine Kontrolle wurde die Enzymaktivität von α1-6-Fucosyltransferase in dem Lysat von COS-1-Zellen bestimmt, in denen Schein-pSVK3 eingeführt wurde. Ein Ergebnis war, dass die Kontrolle fast keine Aktivität zeigte, währen die COS-Zellen, in die der Expressionsvektor eingeführt wurde, der das α1-6-Fucosyltransferase-Gen enthielt, eine hohe Aktivität von 2360 nMol/h/mg Protein zeigten.
Beispiel 7
(1) Herstellung einer Rohenzymlösung von serumfreien Kulturmedium der menschlichen Magenkrebszelle MKN45
Die menschlichen Magenkrebszelle MKN45 wurde in einem serumfreien Medium (RPM11640-Medium:Ham-F-12-Medium = 1:1), das Natriumselenit und Kanamycin enthielt, bei 37°C in 5% CO₂ gezüchtet. Das so erhaltene, serumfreie Kulturmedium (100 l) wurde auf 2 l durch Ultrafiltration konzentriert. Der Puffer wurde durch einen Tris-HCl-Puffer, der 5 mM 2-Mercaptoethanol und 0,1 % CHAPS [3-((3-Cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propansulfonat], pH-Wert 7,5 enthielt, ausgetauscht, um eine Rohenzymlösung zu ergeben. Diese Rohenzymlösung wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung von Q-Sepharose, GDP-Hexanolamin-Sepharose, GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-Asparagin-Sepharose und dergleichen unterzogen, um aktive Fraktionen zu sammeln, von denen die menschliche α1-6-Fucosyltransferase der vorliegenden Erfindung gereinigt werden konnte.
(2) Reinigung des Enzyms
Die vorstehend in (1) erhaltene Rohenzymlösung wurde den nachfolgenden Reinigungsschritten unterzogen. Das heißt, die Lösung wurde für eine Q-Sepharose-Säule, die mit Tris-HCl-Puffer äquilibriert wurde, der 5 mM 2-Mercaptoethanol und 0,1% CHAPS, pH-Wert 7,5, enthielt, verwendet. Die Säule wurde mit einer fünffachen Menge des selben Puffers gewaschen und die aktiven Fraktionen, die mit dem gleichen Puffer eluiert wurden, der 0,1 M NaCl enthielt, wurden gesammelt. Die aktiven Fraktionen wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert und der Puffer wurde durch Tris-HCl-Puffer, der 5 mM 2-Mercaptoethanol und 0,7 % CHAPS, pH-Wert 7,5 enthielt, ausgetauscht, wonach die Fraktionen auf eine GDP-Hexanolamin-Sepharose-Säule aufgetragen wurden, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert wurde. Die Elution wurde durch den linearen Gradienten von NaCl von 0 M bis zu 0,5 M durchgeführt.
Die aktiven Fraktionen von 0,15 M bis 0,3 M wurden gesammelt und unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Nach der Entsalzung wurden die Fraktionen auf eine GlcNAcβ1-2Manα1-6 (GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-Asparagin-Sepharose-Säule aufgetragen, die mit Tris-HCl-Puffer, der 5 mM 2-Mercaptoethanol und 0,7 % CHAPS, pH-Wert 7,5 enthielt, äquilibriert wurde. Die Elution wurde durch den linearen Gradienten von NaCl von 0 M bis zu 0,5 M durchgeführt.
Die aktiven Fraktionen von 0,2 M bis 0,5 M wurden gesammelt und unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Die Entsalzung ergab α1-6-Fucosyltransferase.
Die so erhaltenen Fraktionen der menschlichen α1-6-Fucosyltransferase zeigten eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 60.000 bei der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese. Keine anderen Aktivitäten wie z.B. solche von Transferase und Glycosidase wurden gefunden und dieses gereinigte Enzym war als ein Reagens für die Untersuchungen von Zuckerketten ausreichend nutzbar.
Das pH-Optimum (bestimmt durch den Wechsel des pH-Werts des Puffers) des Enzyms der vorliegenden Erfindung wird in 4 gezeigt. Das Enzym zeigte eine hohe Aktivität bei einem ungefähren pH-Wert von 7,0–7,5. In diesem Graph zeigt der schwarze Kreis, wenn MES-Puffer verwendet wurde, und der weiße Kreis zeigt, wenn Tris-HCl-Puffer verwendet wurde.
Die pH-Stabilität des Enzyms der vorliegenden Erfindung wurde in der gleichen Weise untersucht. 5 zeigt die Restaktivität nach der Behandlung des Enzyms in jedem Puffer bei jedem pH-Wert bei 4°C nach 5 Stunden. Das Enzym war bei einem pH-Wert von 4–10 relativ stabil und besonders stabil bei einem pH-Wert von 5–9. In diesem Graph zeigt das schwarze Dreieck, wenn Acetat-Puffer verwendet wurde, der schwarze Kreis zeigt, wenn MES-Puffer verwendet wurde, der weiße Kreis zeigt, wenn Tris-HCl-Puffer verwendet wurde, und das weiße Dreieck zeigt, wenn Natriumhydrogencarbonatpuffer verwendet wurde.
Wie in 6 gezeigt wird, besitzt das Enzym der vorliegenden Erfindung ein Temperaturoptimum von etwa 37°C und man geht davon aus, dass es eine ausreichende Aktivität bei 20–40°C behält. Das gefrorenes Produkt war bei –20°C für mindestens mehrere Monate stabil.
Das Enzym zeigte eine ausreichende Aktivität beim Fehlen eines zweiwertigen Metallions. Da es sogar eine ausreichende Aktivität in der Gegenwart von 5 mM EDTA, das ein Chelatbildner ist, zeigte, wird geschlossen, dass das Enzym ein zweiwertiges Metallion nicht benötigt.
Beispiel 8
Bestimmung der Aminosäuresequenz von menschlicher α1-6-Fucosyltransferase Gereinigte menschliche α1-6-Fucosyltransferase (1 μg) wurde einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen, wonach das Protein mittels des Elektroblot-Verfahrens auf eine PVDF-Membran (Millipore) übertragen wurde. Die PVDF-Membran wurde mit Coomassie Brilliant Blue G250 gefärbt und eine einzelne Bande der α1-6-Fucosyltransferase wurde bei etwa 60 kDa nachgewiesen. Anschließend wurde die PVDF-Membran, welche die Bande enthielt, ausgeschnitten und nach der Entfärbung in 50% Methanol einer Sequenzierung in einem Biosystem 473A Protein-Sequenziergerät (Applied Biosystems) unterworfen, um die Aminosäuresequenz des Aminoendes der menschlichen α1-6-Fucosyltransferase zu bestimmen. Die Aminosäuresequenz, die bestimmt wurde, wird im Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr.: 11 dargestellt.
Beispiel 9
Bestimmung der Teilaminosäurensequenz von menschlicher α1-6-Fucosyltransferase
Gereinigte menschliche α1-6-Fucosyltransferase (5 μg) wurde mit der Lysylendopeptidase gemischt und einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen, wonach die Peptidfragmente mittels des Elektroblot-Verfahrens auf eine PVDF-Membran (Millipore) übertragen wurden. Die PVDF-Membran wurde mit Coomassie Brilliant Blue G250 gefärbt und mehrere Banden, welche Peptidfragmente enthielten, einschließlich zweier Hauptbanden, wurden nachgewiesen. Anschließend wurde die PVDF-Membran, welche jeweils eine Hauptbande enthielt, ausgeschnitten und in 50% Methanol entfärbt. Die Membran wurde einer Sequenzierung in einem Biosystem 473A Protein-Sequenziergerät (Applied Biosystems) verwendet, um die innere Teilaminosäuresequenz von Menschen-α1-6-Fucosyltransterase zu bestimmen. Die bestimmten Aminosäuresequenzen werden im Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr.: 12 und SEQ ID Nr.: 13 dargestellt.
Beispiel 10
Herstellung der Sonden-DNA durch PCR
Mischprimer, die in SEQ ID Nr.: 14 und SEQ ID Nr.: 15 gezeigt werden, wurden von den Aminosäuresequenzen, die in Beispiel 9 erhalten wurden, synthetisiert. Der Mischprimer, der in SEQ ID Nr.: 14 gezeigt wird, wurde als ein Sense-Primer verwendet und der Mischprimer, der in SEQ ID Nr.: 15 gezeigt wird, wurde als ein Antisense-Primer für die PCR verwendet. Insbesondere wurden 36 Zyklen der PCR durchgeführt, wobei ein Zyklus der PCR bei 94°C (30 sec), 46°C (30 sec) und 72°C (1,5 min) als ein Zyklus unter Verwendung von 2 μg vom Menschen stammender cDNA, 25 pMol Sense-Primer (der in SEQ ID Nr.: 14 gezeigte Mischprimer), 25 pMol Antisense-Primer (der in SEQ ID Nr.: 15 gezeigte Mischprimer) und eines Reaktionsgemisches (50 μl) von 50 mM Kaliumchlorid-10 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,3)-1,5 mM Magnesiumchlorid-0,001% Gelatine-200 μM dNTP, das 2,5 Einheiten der Taq-DNA-Polymerase enthielt, war.
Das Reaktionsgemisch (10 μl) wurde nach der PCR einer 2,0% Agarosegelelektrophorese unterzogen, um die DNA-Fragmente des PCR-Reaktionsprodukts zu bestätigen. Als ein Ergebnis wurde ein etwa 200 bp großes DNA-Fragment durch die Agarosegelelektrophorese bestätigt.
Dieses DNA-Fragment wurde in das Plasmid-pT7BLUEt-Vektor (Novagen) subcloniert und die Nucleotidsequenz wurde bestätigt. Als ein Ergebnis wurde das DNA-Fragment nachgewiesen, das die Aminosäuresequenz codiert, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr.: 12 und SEQ ID Nr.: 13 dargestellt wird, wobei bestätigt wurde, dass das DNA-Fragment ein Teil des α1-6-Fucosyltransferase-Gens war.
Beispiel 11
Isolation des menschlichen α1-6-Fucosyltransferase-Gens
Das DNA-Fragment, das in Beispiel 10 erhalten wurde, wurde mit [α-³²P]-dCTP (3000 Ci/mMol, Amersham) markiert und als eine Sonde verwendet, um nach Clonen, welche die menschliche α1-6-Fucosyltransferase codierende cDNA enthielten, in der von der menschlichen Magenkrebszelle MKN45 stammenden λZAP-cDNA-Bibliothek durch ein Plaque-Hybridisierungsverfahren zu suchen. Als ein Ergebnis der Durchmusterung von etwa 2.000.000 Plaques wurden die 8 positiven Clone c1 bis c8 erhalten. Es wurde aufgrund der Restriktionsenzymsspaltungsstellen und ihrer Länge postuliert, dass die Clone c1 bis c7 das α1-6-Fucosyltransferase-Gen in vollständiger Länge enthielten. Die Nucleotidsequenzen von c1 und c2 wurden bestimmt und als ein Ergebnis wurde eine Nucleotidsequenz, die in SEQ ID Nr.: 9 dargestellt wird, erhalten.
Beispiel 12
Expression der menschlichen α1-6-Fucosyltransferase
Die codierende Region des menschlichen α1-6-Fucosyltransferase-Gens wurde in den Expressionsvektor pSVK3 von Clonen, welche die cDNA enthielten, welche die in Beispiel 11 erhaltene menschliche α1-6-Fucosyltransferase codierten, subcloniert. Ein Expressionsvektor, der das α1-6-Fucosyltransferase-Gen enthielt, wurde in COS-1-Zellen eingeführt. Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden wurden die gezüchteten Zellen gesammelt und zerstört. Die Enzymaktivität der α1-6-Fucosyltransferase wurde in dem erhaltenen Lysat bestimmt. Als eine Kontrolle wurde die Enzymaktivität von α1-6-Fucosyltransferase in dem Lysat von COS-1-Zellen bestimmt, in denen Schein-pSVK3 eingeführt wurde. Ein Ergebnis war, dass die Kontrolle fast keine Aktivität zeigte, während die COS-Zellen, in denen der Expressionsvektor eingeführt wurde, der das α1-6-Fucosyltransferase-Gen enthielt, eine hohe Aktivität von 2130 nMol/h/mg Protein zeigten.
Anwendbarkeit in der Industrie
Die Schweine-α1-6-Fucosyltransferase der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich deutlich von der bekannten menschlichen α1-6-Fucosyltransferase in den physikalisch-chemischen Eigenschaften und zeigt unter optimalen Reaktionsbedingungen, die näher an den physiologischen Bedingungen liegen, Aktivität.
Die vom Menschen stammende α1-6-Fucosyltransferase zeigt ebenfalls physikalisch-chemische Eigenschaften, die sich deutlich von denen der bekannten menschlichen α1-6-Fucosyltransferase unterscheiden, wobei sie unter optimalen Reaktionsbedingungen, die näher an den physiologischen Bedingungen liegen, Aktivität zeigten. Daher ermöglicht die vorliegende Erfindung die Entwicklung von Glyco-Technologie, einschließlich der Modifikation und der Synthese einer Zuckerkette, und ein Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen wie z.B. Krebs, welches die Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch für das Enzym der vorliegenden Erfindung ist, oder des Gens davon einschließt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Vom Schwein stammende α1-6-Fucosyltransferase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften: (1) Aktivität: überträgt Fucose von Guanosindiphosphat-Fucose auf eine Hydroxygruppe in der 6-Position von GlcNAc nächstgelegen zu R eines Rezeptors (GlcNAcβ1-2Manα1-6)(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-R, wobei R ein Asparaginrest oder eine Peptidkette ist, welche diesen Rest trägt, wobei (GlcNAcβ1-2Manα1-6)(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc-R gebildet wird (2) pH-Optimum: etwa 7,0 (3) pH-Stabilität: stabil in dem pH-Bereich von 4,0 bis 10,0 bei einer Behandlung bei 4°C für 5 Stunden (4) Temperaturoptimum: etwa 30 bis 37°C (5) Hemmung oder Aktivierung: kein Erfordernis für ein zweiwertiges Metall zur Ausprägung der Aktivität; keine Hemmung der Aktivität in Gegenwart von 5 mM EDTA (6) Molekulargewicht: etwa 60.000 in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.
Vom Schwein stammende α1-6-Fucosyltransferase gemäß Anspruch 1, welche aus Schweinehirn gereinigt wurde.
Gen, das die vom Schwein stammende α1-6-Fucosyltransferase gemäß Anspruch 1 codiert.
Gen gemäß Anspruch 3, umfassend ein Gen, das eine Aminosäuresequenz wie im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:2 dargestellt codiert.
Gen gemäß Anspruch 3, umfassend eine Nucleotidsequenz wie im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:1 dargestellt.
Gen gemäß Anspruch 3, umfassend ein Gen, das eine Aminosäuresequenz codiert, welche sich durch Austausch, Insertion, Deletion oder Hinzufügung hinsichtlich mindestens einer Aminosäure der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ergibt.
Gen gemäß Anspruch 3, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche sich durch Austausch, Insertion, Deletion oder Hinzufügung hinsichtlich mindestens eines Nucleotids der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:1 dargestellten Nucleotidsequenz ergibt.
Gen gemäß Anspruch 3, welches an ein Gen hybridisiert, das eine α1-6-Fucosyltransferase codiert und die Nucleotidsequenz wie im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:1 dargestellt umfasst.
Expressionsvektor, umfassend ein Gen gemäß einem der Ansprüche 3 bis 8, welches α1-6-Fucosyltransferase codiert.
Transformantenzelle, erhalten durch Transformieren einer Wirtszelle mit dem Expressionsvektor gemäß Anspruch 9.
Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten α1-6-Fucosyltransferase, umfassend das Züchten der Transformantenzelle gemäß Anspruch 10 und das Ernten der α1-6-Fucosyltransferase aus einer Kultur davon.
Rekombinante α1-6-Fucosyltransferase, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 11.
Vom Menschen stammende α1-6-Fucosyltransferase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften: (1) Aktivität: überträgt Fucose von Guanosindiphosphat-Fucose auf eine Hydroxygruppe in der 6-Position von GlcNAc nächstgelegen zu R eines Rezeptors (GlcNAcβ1-2Manα1-6)(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-R, wobei R ein Asparaginrest oder eine Peptidkette ist, welche diesen Rest trägt, wobei (GlcNAcβ1-2Manα1-6)(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc-R gebildet wird (2) pH-Optimum: etwa 7,5 (3) pH-Stabilität: stabil in dem pH-Bereich von 4,0 bis 10,0 bei einer Behandlung bei 4°C für 5 Stunden (4) Temperaturoptimum: etwa 30 bis 37°C (5) Hemmung oder Aktivierung: kein Erfordernis für ein zweiwertiges Metall zur Ausprägung der Aktivität; keine Hemmung der Aktivität in Gegenwart von 5 mM EDTA (6) Molekulargewicht: etwa 60.000 in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.
α1-6-Fucosyltransferase gemäß Anspruch 13, welche aus einem Kulturmedium menschlicher Zellen gereinigt wurde.
α1-6-Fucosyltransferase gemäß Anspruch 14, wobei das Kulturmedium menschlicher Zellen ein serumfreies Medium menschlicher Magenkrebszellen ist.
Gen, das die vom Menschen stammende α1-6-Fucosyltransferase gemäß Anspruch 13 codiert.
Gen gemäß Anspruch 16, umfassend ein Gen, das eine Aminosäuresequenz wie im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 10 dargestellt codiert.
Gen gemäß Anspruch 16, umfassend eine Nucleotidsequenz wie im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 9 dargestellt.
Gen gemäß Anspruch 16, umfassend eine Nucleotidsequenz von Position 198, Adenin, zur Position 1919, Guanin, wie im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 9 dargestellt.
Gen gemäß Anspruch 16, umfassend ein Gen, das eine Aminosäuresequenz codiert, welche sich durch Austausch, Insertion, Deletion oder Hinzufügung hinsichtlich mindestens einer Aminosäure der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenz ergibt.
Gen gemäß Anspruch 16, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche sich durch Austausch, Insertion, Deletion oder Hinzufügung hinsichtlich mindestens eines Nucleotids der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 9 dargestellten Nucleotidsequenz ergibt.
Gen gemäß Anspruch 16, welches an ein Gen hybridisiert, das eine α1-6-Fucosyltransferase codiert und die Nucleotidsequenz wie im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 9 dargestellt umfasst.
Expressionsvektor, umfassend ein Gen gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22, welches menschliche α1-6-Fucosyltransferase codiert.
Transformantenzelle, erhalten durch Transformieren einer Wirtszelle mit dem Expressionsvektor gemäß Anspruch 23.
Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten α1-6-Fucosyltransferase, umfassend das Züchten der Transformantenzelle gemäß Anspruch 24 und das Ernten der α1-6-Fucosyltransferase aus einer Kultur davon.
Rekombinante α1-6-Fucosyltransferase, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 25.