DE69735694T2

DE69735694T2 - Polypeptide mit L-Asparaginase Aktivität

Info

Publication number: DE69735694T2
Application number: DE69735694T
Authority: DE
Inventors: Takeshi Okayama-shi Ario; Madoka Okayama-shi Taniai; Kozo Okayama-shi Yamamoto; Masashi Okayama-shi Kurimoto
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1996-06-07
Filing date: 1997-06-06
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2017-06-07
Also published as: EP0811687B1; EP1321519A1; EP0811687A2; US6537547B1; DE69735694D1; EP0811687A3; US6140101A; US6368845B1; US6436396B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft L-Asparagin-amidohydrolytische Enzyme, genauer Polypeptide mit L-Asparaginaseaktivität, welche von einem Säuger stammen.
L-Asparaginase (EC 3.5.1.1) ist ein Enzym, welches die hydrolytische Umsetzung von L-Asparagin zu L-Asparaginsäure und Ammoniak katalysiert. Die Untersuchungen über die Antitumoraktivität von L-Asparaginase begannen mit den folgenden Berichten: J.G. Kidd et al. beschrieben die inhibitorische Wirkung von Meerschweinchensera auf Zellen von Lymphomen in „The Journal of Experimental Medicine", Bd. 98, S. 565-582 (1953) und J.D. Broome et al. bewiesen in „Nature", Bd. 191, S. 1.114-1.115 (1961), dass die L-Asparaginaseaktivität der Meerschweinchensera für die inhibitorische Wirkung verantwortlich war. Es gilt nun als selbstverständlich, dass die inhibitorische Wirkung durch den Mangel an L-Asparagin verursacht wird, ein wesentlicher Nährstoff zur Proliferierung und zum Überleben für einige Tumorzellen, welche einen Fehler in der L-Asparaginsynthetaseaktivität aufweisen, wie akute lymphatische Leukämie, aber nicht für normale Zellen. Die Hydrolyse von L-Asparagin durch L-Asparaginase in Patienten mit solchen Tumorzellen induziert einen selektiven Tod der Tumorzellen, was in der Behandlung von malignen Tumoren resultiert.
Mit viel Energie wurde L-Asparaginase auf ihre wirkliche Verwendung als ein Antitumoragens untersucht und eine, welche von Escherichia coli abgeleitet ist, wird nun als ein therapeutisches Agens für Leukämie und Lymphom verwendet. Jedoch ist L-Asparaginase von Escherichia coli nur ein externes Protein für den Menschen und eine wiederholte Verabreichung von herkömmlichen Zusammensetzungen mit einer solchen L-Asparaginase kann schwerwiegende Nebenwirkungen wie anaphylaktischen Schock, Nesselsucht, Ödem, Keuchen und Atemnot verursachen. Diese Zusammensetzungen sind bezüglich der Verabreichungsdosis und -frequenz unweigerlich eingeschränkt. Deshalb wurden einige Vorschläge zur Verringerung oder auch Abschwächung von solchen Nebenwirkungen gemacht.
Als ein erster Vorschlag offenbart das Japanische Patent, Kokai Nr. 119,082/79 eine chemisch modifizierte L-Asparaginase von Escherichia coli, in welcher mindestens 65 % der Aminosäuren mit 2-O-substituiertem Polyethylenglycol-4,6-dichlor-S-triazin blockiert sind.
Als ein zweiter Vorschlag werden in den Japanischen Patenten, Kokai Nr. 320,684/92 und 19,018/80 menschliche L-Asparaginasen offenbart, wobei die L-Asparaginasen jeweils aus Kulturen von menschlichen Zelllinien und menschlichem Harn erhalten werden. Obwohl der erste Vorschlag einen Vorteil aufweist, der darin liegt, dass die L-Asparaginase von Escherichia coli einfach in einem industriellen Maßstab erhalten werden kann, weist er einen Nachteil auf, der darin liegt, dass die Modifizierungsumsetzung schwierig zu kontrollieren ist und die Nebenwirkungen nicht vollständig beseitigt werden können. Obwohl der zweite Vorschlag einen Vorteil aufweist, der darin liegt, dass es sein kann, dass ungleich L-Asparaginase von Escherichia coli die L-Asparaginasen des Menschen im Wesentlichen keine Antikörper induzieren, sogar wenn sie an Patienten verabreicht werden, weist er einen Nachteil auf, der darin liegt, dass es nicht einfach ist, die L-Asparaginasen in einer gewünschten Menge durch die in den Japanischen Patenten, Kokai Nr. 320,684/92 und 19,018/80 offenbarten Verfahren zu erhalten.
In letzter Zeit machte die rekombinante DNA-Technologie beträchtliche Fortschritte. Wenn eine DNA, welche ein gewünschtes Polypeptid codiert, einmal isoliert wurde, ist es relativ einfach, ein Transformationsvehikel zu erhalten, welches das Polypeptid durch Aufbauen einer rekombinanten DNA, welche die DNA und einen zur Selbstreplikation befähigten Vektor umfasst, gefolgt von Einbringen der rekombinanten DNA in einen Wirt, wie einen Mikroorganismus, eine Tier- oder Pflanzenzelle, herstellt. Das Polypeptid kann in einer gewünschten Menge von der Kultur des Tranformationsvehikels erhalten werden. Jedoch wurde keine DNA, welche eine Säuger-L-Asparaginase codiert, isoliert und keine Säuger-L-Asparaginase wurde durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt.
Deshalb besteht ein großer Bedarf, DNAs zu isolieren, welche aktive L-Asparaginasen codieren, die von einem Säuger stammen, und Verfahren zur Herstellung der L-Asparaginasen in einem großen Maßstab durch Anwenden der rekombinante DNA-Techniken auf die isolierten DNAs zu etablieren.
Angesichts des Vorstehenden ist die erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Polypeptid mit L-Asparaginaseaktivität bereit zu stellen, welches von einem Säuger stammt.
Die zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, eine DNA bereit zu stellen, welche das Polypeptid codiert.
Die dritte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Agens für suszeptive Krankheiten bereit zu stellen, welches das Polypeptid als einen wirksamen Bestandteil enthält.
Die erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch Polypeptide mit L-Asparaginaseaktivität erreicht, welche von einem Säuger stammen.
Die zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch DNAs erreicht, welche die Polypeptide codieren.
Die dritte Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch Agenzien für suszeptive Krankheiten erreicht, welche die Polypeptide als wirksame Bestandteile enthalten.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, welches L-Asparaginaseaktivität und eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nos: 6 bis 9 und Mutanten davon, aufweist, welche eine Deletion und/oder eine Addition einer oder mehrerer Aminosäuren an den N- und/oder C-Termini der SEQ ID Nos: 6 bis 9 aufweisen, wobei besagte mutante Polypeptide keine Fehler in ihrer L-Asparaginaseaktivität im Vergleich zu den Polypeptiden der SEQ ID Nos: 6 bis 9 aufweisen, und eine DNA, welche dieses Polypeptid codiert, bereit. Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Agens für suszeptive Krankheiten bereit, welches das Polypeptid umfasst.
1 ist ein Schema des Überlappungsextensionsverfahrens.
2 ist eine Restriktionskarte der vorliegenden rekombinanten DNA pKGPA/WT.
3 ist ein Schema der Herstellung der vorliegenden rekombinanten DNA pBIgGPA/WT.
4 ist eine Restriktionskarte der vorliegenden rekombinanten DNA pBIgGPA/WT.
5 ist eine Restriktionskarte der vorliegenden rekombinanten DNA pKGPA/D364stp.
6 ist eine Restriktionskarte der vorliegenden rekombinanten DNA pKHA/MUT1.
7 ist eine Restriktionskarte der vorliegenden rekombinanten DNA pKHA/MUT2.
8 ist eine Restriktionskarte der vorliegenden rekombinanten DNA pKHA/MUT3.
9 ist eine Restriktionskarte der vorliegenden rekombinanten DNA pKHA/MUT3.
9 ist eine Restriktionskarte der vorliegenden rekombinanten DNA pKHA/MUT5.
10 ist eine Restriktionskarte der vorliegenden rekombinanten DNA pBIgGPA/D364stp.
11 ist eine Restriktionskarte der vorliegenden rekombinanten DNA pBIgHA/MUT1.
12 ist eine Restriktionskarte der vorliegenden rekombinanten DNA pBIgHA/MUT2.
13 ist eine Restriktionskarte der vorliegenden rekombinanten DNA pBIgHA/MUT3.
14 ist eine Restriktionskarte der vorliegenden rekombinanten DNA pBIgHA/MUT4.
Die Erklärung der Symbole ist wie folgt:

Die Symbole „Eco RI", „Hin dIII", „Not I" und „Xho I" zeigen Spaltungsstellen durch die Restriktionsenzyme Eco RI, Hin dIII, Not I bzw. Xho I.
Die Symbole „D364stp", „HA/MUT1", „HA/MUT2", „HA/MUT3" und „HA/MUT5" zeigen DNAs, welche die vorliegenden Polypeptide codieren.
Das Symbol „Ptac" zeigt einen Tac-Promotor.
Das Symbol „rrnBT1T2" zeigt einen Bereich für Transkriptionstermination, welcher von einem ribosomalen RNA-Operon abgeleitet ist.
Das Symbol „AmpR" zeigt ein Ampicillinresistenzgen.
Das Symbol „pBR322ori" zeigt einen Replikationsursprung in Escherichia coli.
Das Symbol „Ig sec" zeigt eine DNA, welche ein Polypeptid mit einer Signalsequenz zur Sekretion von Immunglobulin codiert.
Das Symbol „Emsv" zeigt einen Enhancer von langen terminalen Wiederholungen eines Moloney-Maussarkomvirus.
Das Symbol „Pmti" zeigt einen Promotor für das Maus-Metallothionein I-Gen.
Das Symbol „Poly (A)" zeigt ein Polyadenylierungssignal, welches vom SV40-Virus abgeleitet ist.
Das Symbol „BPVI" zeigt ein Genom eines Rinder-Papillomavirus.

Die Erfinder isolierten zum ersten Mal auf der Welt Säuger-DNAs, welche L-Asparaginasen codieren, vom Meerschweinchen und vom Menschen und waren bei der Aufklärung ihrer Nucleotidsequenzen erfolgreich. Die Nucleotidsequenzen der DNAs von einem Meerschweinchen und einem Menschen sind in SEQ ID Nos: 15 bzw. 16 dargestellt. Diese Informationen werden in der Japanischen Patentanmeldung Nr. 42,564/95 (Japanisches Patent, Kokai Nr. 214,885/96) durch den selben Anmelder wie diese Anmeldung offenbart. Die vorliegende Erfindung wurde basierend auf den vorstehenden Informationen gemacht und stellt die Polypeptide bereit, welche von einem Säuger stammen und L-Asparaginaseaktivität und eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nos: 6 bis 9 und Mutanten davon, aufweisen, welche eine Deletion und/oder eine Addition einer oder mehrerer Aminosäuren an den N- und/oder C-Termini der SEQ ID Nos: 6 bis 9 aufweisen, wobei besagte mutante Polypeptide keine Fehler in ihrer L-Asparaginaseaktivität im Vergleich zu den Polypeptiden der SEQ ID Nos: 6 bis 9 aufweisen.
Die verwendeten Polypeptide sind nicht auf ihre Quellen oder Ursprünge einschränkt, solange sie von einem Säuger stammen und eine L-Asparaginaseaktivität aufweisen. Die Polypeptide können normalerweise durch die Expression von Genen, welche von einem Säuger stammen, erhalten werden und enthalten normalerweise Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nos: 1 bis 3, wobei das Symbol „Xaa" in SEQ ID No: 3 „Glutamin" oder „Arginin" bedeutet. Zum Beispiel können die Polypeptide jedwede der Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nos: 6 bis 9 aufweisen. Angesichts des technischen Standes auf diesem Gebiet kann einer oder mehrere der Aminosäurereste in SEQ ID Nos: 4 bis 9 relativ einfach durch unterschiedliche Reste ohne wesentliche Fehler in der Aktivität ersetzt werden. Obwohl sie von der selben DNA abgeleitet sind, kann eine Vielzahl von Polypeptiden mit einer L-Asparaginaseaktivität als ein Ergebnis von Modifizierungen durch endogene Enzyme der Wirte nach der DNA-Expression oder Modifizierungen während der Reinigung der Polypeptide, abhängig von den Typen der Vektoren und der Wirte, welche zum Erhalten von Transformationsvehikeln verwendet werden, oder von den Kulturbedingungen der Transformationsvehikel, wie Bestandteile, Zusammensetzungen, Temperaturen oder pH-Werte, erhalten werden. Die Formulierung „eine Vielzahl von Polypeptiden" schließt die Polypeptide mit Deletionen und/oder Additionen einer oder mehrerer Aminosäuren an den N- und/oder C-Termini davon oder mit Glycosylierungen ein. Angesichts dessen schließen die vorliegenden Polypeptide nicht nur das Polypeptid mit jedweder Aminosäuresequenz von SEQ ID Nos: 6 bis 9 ein, sondern auch ihre Homologen mit Deletionen und/oder Additionen einer oder mehrerer Aminosäuren an den N- und/oder C-Termini davon oder mit Glycosylierungen, solange sie eine L-Asparaginaseaktivität aufweisen. Die vorliegenden Polypeptide zeigen die Aktvität, wenn sie in multiplen Formen, bevorzugt Tetrameren, vorliegen.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können normalerweise durch die rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden. Im Allgemeinen können die Polypeptide durch Kultivieren von Transformationsvehikeln, welche DNAs enthalten, die Polypeptide codieren, und Sammeln der hergestellten Polypeptide in den resultierenden Kulturen erhalten werden. Die Transformationsvehikel können durch Einbringen von solchen rekombinanten DNAs, welche eine beliebige der Nucleotidsequenzen SEQ ID Nos: 11 bis 14 und einen zur Selbstreplikation befähigten Vektor enthalten, in geeignete Wirte erhalten werden. Ein oder mehrere Nucleotide in den SEQ ID Nos: 11 bis 14 können durch unterschiedliche Nucleotide ohne wesentliche Veränderungen der codierenden Aminosäuresequenzen bezüglich der Degeneration des genetischen Codes ersetzt werden. Um die Expression der DNA in den Wirten zu ermöglichen, können ein oder mehrere Nucleotide in Nucleotidsequenzen, welche die Polypeptide oder ihre Homologen codieren, in geeigneter Weise durch unterschiedliche Nucleotide ersetzt werden. Darüber hinaus können Nucleotidsequenzen, welche eine oder mehrere Aminosäuren codieren und/oder nicht codieren, an die 5'- und/oder 3'-Termini der Nucleotidsequenzen addiert werden.
Die DNAs, welche die Polypeptide dieser Erfindung codieren, schließen jene von natürlichen Quellen und jene, welche künstlich synthetisiert werden, ein, solange die Polypeptide, welche durch sie exprimiert werden, eine L-Asparaginaseaktivität aufweisen. Die DNAs können Homologe von Wildtyp-DNAs sein, welche die gleichen Nucleotidsequenzen wie jene von natürlichen Quellen enthalten.
Beispiele von Wildtyp-DNAs schließen DNAs ein, welche die Nucleotidsequenzen von SEQ ID Nos: 15 enthalten. Die Wildtyp-DNA kann aus natürlichen Quellen wie Meerschweinchenlebern erhalten werden, wie in der Japanischen Patentanmeldung Nr. 42,564/95 (Japanisches Patent, Kokai Nr. 214,885/96) durch den selben Anmelder wie diese Erfindung offenbart wird: (a) Aufbauen einer cDNA-Bibliothek durch Anwenden von normalen Verfahren auf gereinigte Poly-(A)⁺-RNAs von einer Meerschweinchen- oder menschlichen Leber als Materialien, (b) Anwenden des Plaque-Hybridisierungsverfahrens auf die cDNA-Bibliothek unter Verwendung von Oligonucleotiden als Proben, welche chemisch synthetisiert wurden, basierend auf Teilaminosäuresequenzen von L-Asparaginase, welche aus einem Meerschweinchenserum gereinigt wurden, (c) Sammeln der Phagenclone, welche die DNAs enthalten, die die Polypeptide dieser Erfindung codieren, und (d) Manipulieren der gesammelten Phagenclone in einer herkömmlichen Weise. Die Wildtyp-DNA kann basierend auf SEQ ID No: 15 chemisch synthetisiert werden.
Beispiele von DNA-Homogen zu den Wildtyp-DNAs schließen DNAs ein, welche eine beliebige Nucleotidsequenz von SEQ ID Nos: 11 bis 14 einschließen. DNA-Homologe, welche eine beliebige Nucleotidsequenz von SEQ ID Nos: 11 bis 14 einschließen, können durch die Verfahren erhalten werden, wie folgt: Zuerst wird eine Wildtyp-DNA mit der Nucleotidsequenz SEQ ID No: 16 durch die Verfahren, wie in der Japanischen Patentanmeldung Nr. 42, 564/95 (Japanisches Patent, Kokai Nr. 214,885/96) durch den selben Anmelder wie diese Erfindung offenbart, d.h. durch Durchmustern (Screening) einer cDNA-Bibliothek der menschlichen Leber, erhalten. Darauffolgend wird die Wildtyp-DNA herkömmlichen Verfahren, wie vorstehend erwähnt, bezüglich gewünschter Sequenzen unterzogen, um die DNA-Homologen zu erhalten. Die DNA-Homologen können basierend auf den Nucleotidsequenzen SEQ ID Nos: 11 bis 14 chemisch synthetisiert werden.
Die vorliegenden DNAs können im Allgemeinen als in Formen von rekombinanten DNAs in Wirte eingebracht werden. Im Allgemeinen umfasst jede rekombinante DNA eine der vorliegenden DNAs und einen zur Selbstreplikation befähigten Vektor. Die rekombinanten DNAs können einfach durch allgemeine rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden, wenn die DNAs verfügbar sind. Beispiele von solchen zur Selbstreplikation befähigten Vektoren schließen pKK223-3, pGEX-2T, pRL-λ, pBTrp2 DNA, pUB110, YEp13, Ti-Plasmid, Ri-Plasmid, pBI121, pCDM8, pBPV und BCMGSneo ein. Unter diesen Vektoren werden geeigneterweise pKK223-3, pGEX-2T, pRL-λ, pBTrp2 DNA und pUB110 verwendet, um die vorliegenden DNAs in prokaryotischen Zellen wie Escherichia coli und Bacillus sp. zu exprimieren, während YEp13, Ti-Plasmid, Ri-Plasmid, pBI121, pCDM8, pBPV und BCMGSneo geeigneterweise zur Expression der vorliegenden DNAs in eukaryotischen Zellen wie Hefen und Tier- und Pflanzenzellen verwendet werden.
Zum Einsetzen der vorliegenden DNAs in die Vektoren können beliebig herkömmliche Verfahren auf diesem Gebiet verwendet werden. Beispiele von solchen Verfahren enthalten die Schritte (a) Spalten von zur Selbstreplikation befähigten Vektoren mit Restriktionsenzymen, (b) Einbringen der gleichen Spaltungsstellen an den 5'- und 3'-Termini der vorliegenden DNAs durch die gleichen Restriktionsenzyme wie zur Spaltung der Vektoren verwendet wurden durch Verwendung der Polymerasekettenreaktion, um Doppelstrang-DNAs zu bilden, (c) Spalten der Doppelstrang-DNAs durch die Restriktionsenzyme und (d) Ligieren der gespaltenen Vektoren mit gespaltenen DNAs durch die Wirkung von DNA-Ligasen. Die so erhaltenen rekombinanten DNAs können einfach in geeignete Wirte eingebracht werden, was in einer unbegrenzten Replikation der DNAs durch Kultivieren der Transformationsvehikel resultiert.
Die rekombinanten DNAs gemäß der vorliegenden Erfindung können in geeignete Wirte wie Escherichia coli, Bacillus sp., Actinomyceten, Hefen und Pflanzen- und Tierzellen eingebracht werden. Um die DNAs in Escherichia coli einzubringen, können sie in der Gegenwart der rekombinanten DNAs und Calciumion kultiviert werden. Um sie in Bacillus sp. einzubringen, können funktionsfähige Zellverfahren oder Protoplastverfahren verwendet werden. Um sie in Tierzellen einzubringen, können DEAE-Dextran-Verfahren oder Elektroporationsverfahren verwendet werden. Gewünschte Transformationsvehikel können durch Verwenden von Hybridisierungsverfahren oder durch Selektieren von L-Asparaginase herstellenden Zellen aus den Kulturen cloniert werden.
Die so erhaltenen Transformationsvehikel stellen die vorliegenden Polypeptide intrazellulär oder extrazellulär her, wenn sie in Nährstoffkulturmedien kultiviert werden. Beispiele von solchen Medien sind normalerweise flüssige Nährstoffkulturmedien, die im Allgemeinen Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Mineralien enthalten und ferner bei Bedarf Spurennährstoffe wie Aminosäuren und/oder Vitamine enthalten. Die Kohlenstoffquellen, welche bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Saccharide wie Stärke, Stärkehydrolysate, Glucose, Fructose und Saccharose ein. Die Stickstoffquellen, welche bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen organische und anorganische Verbindungen, welche Stickstoff enthalten, wie Ammoniak und seine Salze, Harnstoff, Nitrate, Pepton, Hefeextrakt, entfettete Sojabohnenzubereitung, Cornsteep-Lösung und Rinderextrakt ein. Kulturen, welche die vorliegenden Polypeptide enthalten, können durch Überimpfen der Transformationsvehikel in die vorstehenden Medien, diese Kultivieren bei Temperaturen von 25 bis 65°C bei pH-Werten von 5 bis 8 für etwa 1 bis 10 Tage unter aeroben Bedingungen durch das Begasungs-Bewegungs-Verfahren, usw. erhalten werden.
Die Kulturen können intakt als Agenzien für suszeptive Krankheiten verwendet werden. Jedoch werden die Kulturen normalerweise mit Ultraschall oder für die Zellwand lytische Enzyme behandelt, um die Zellen aufzubrechen, und die vorliegenden Polypeptide werden unter Verwendung von Techniken wie Filtration und Zentrifugation von dem aufgebrochenen Zellmaterial abgetrennt und gereinigt. Alternativ können die Polypeptide von den Kulturüberständen, welche durch Entfernen der Zellen aus den Kulturen durch Filtration oder Zentrifugation, usw. erhalten werden, gereinigt werden. Die vorliegenden Polypeptide können durch Verwenden von Techniken, welche im Allgemeinen auf diesem Gebiet für Proteinreinigungen verwendet werden, wie Aussalzen, Dialyse, Filtration, Konzentration, Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophobe Chromatographie, isoelektrische Fokussierung und Gelelektrophorese, gereinigt werden, und wenn notwendig können zwei oder mehr von ihnen in Kombination auf die Überstände, die von unlöslichen Substanzen des aufgebrochenen Zellmaterials abgetrennt werden, oder auf die Kulturüberstände angewendet werden. Die resultierenden gereinigten Polypeptidlösungen können abhängig von ihren Endverwendungen zu Flüssigkeiten oder Feststoffen konzentriert und/oder gefriergetrocknet werden.
Die folgenden Versuche erklären die vorliegende Erfindung detaillierter und die darin verwendeten Techniken sind auf diesem Gebiet herkömmliche Techniken: Zum Beispiel werden die Techniken von J. Sambrook et al. in „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2. Ausgabe (1989), veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, U.S.A und von Masami MATSUMURA in „Laboratory Manual for Genetic Engineering" (1988), veröffentlicht von Maruzen Co., Ltd., Tokio, Japan offenbart.
Versuch 1
Expression von Wildtyp-DNA
Versuch 1-1
Expression von Meerschweinchen-Wildtyp-DNA
Versuch 1-1(a)
Herstellung von Meerschweinchen-Wildtyp-DNA
Eine Meerschweinchen-Wildtyp-DNA, welche L-Asparaginase codiert, wurde durch das im Japanischen Patent, Kokai Nr. 214,885/96 durch den selben Anmelder wie diese Erfindung offenbarte Verfahren hergestellt. Die DNA wies die Nucleotidsequenz SEQ ID No: 15 auf.
Eine DNA mit einem Polypeptid codierenden Bereich in SEQ ID No: 15, d.h. einer Sequenz, welche die Nucleotide 20 bis 1.714 in SEQ ID No: 15 enthält, wird hier nachstehend „GPA/WT DNA" genannt, und das Expressionsprodukt davon mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No: 15 wird „Meerschweinchen-Wildtyp-L-Asparaginase" genannt. SEQ ID No: 17 gezeigt parallel die Nucleotidsequenz von GPA/WT DNA und die dabei codierte Aminosäuresequenz.
Versuch 1-1(b)
Herstellung von rekombinanter DNA
Zehn μl 10 × PCR-Puffer, ein μl 25 mM dNTP mix, ein ng der menschlichen Wildtyp-DNA, welche in Versuch 1-1(a) erhalten wurde, als ein Templat wurden in ein 0,5 ml-Reaktionsröhrchen gegeben. Das Gemisch wurde als Sense- und Antisense-Primer mit einer adäquaten Menge eines Oligonucleotids, welches chemisch basierend auf den Aminosäuresequenzen nahe den N- und C-Termini von SEQ ID No: 15 synthetisiert wurde, gemischt, das Volumen wurde mit sterilisiertem destilliertem Wasser aufgefüllt, um ein Gesamtvolumen von 99,5 μl zu ergeben, und es wurde mit 0,5 μl 2,5 Einheiten/μl AmpliTaq-DNA-Polymerase gemischt. Die Nucleotidsequenz des Sense-Primers war 5'-AATCTCGAGCCACCATGGCGCGCGCATCA-3', eine Nucleotidsequenz, welche durch Addieren einer allgemeinen Nucleotidsequenz in Tierzellen, wie von M. Kozak in „Nucleic Acid Research", Bd. 15, S. 8, 125-8, 148 (1987) gezeigt, an den Bereich, der oberhalb eines Bereiches liegt, welcher die N-terminale Aminosäuresequenz von SEQ ID No: 15 codiert, und dann Hinzufügen einer Spaltungsstelle an dem weiter oberhalb liegenden Bereich durch ein Restriktionsenzym Xho I erhalten wird. Die Nucleotidsequenz des Antisense-Primers war 5'-CTGCGGCCGCTTATCAGATGGCAGGCGGCAC-3' als ein Komplement zu einer Nucleotidsequenz, welche durch Addieren von zwei Terminationscodons an den Bereich, der unterhalb eines Bereichs liegt, welcher den C-Terminus der Aminosäuresequenz SEQ ID No: 15 codiert, und Hinzufügen einer Spaltungsstelle an dem weiter unterhalb liegenden Bereich durch ein Restriktionsenzym Not I erhalten wird. Das resultierende Gemisch wurde aufeinanderfolgend bei 94°C für eine min, bei 55°C für eine min und bei 72°C für 3 min inkubiert und die Inkubationsreihe wurde für PCR 40 Mal wiederholt, um die DNA zu amplifizieren. So wurde eine DNA, welche GPA/WT DNA enthält, erhalten und dann durch die Restriktionsenzyme Xho I und Not I gespalten, um ein DNA-Fragment mit etwa 1,7 Kbp zu erhalten. Fünfundzwanzig ng des DNA-Fragments wurden eingewogen und mit 10 ng eines Plasmidvektors „pCDM8", welcher kommerziell von Invitrogen Corporation, San Diego, U.S.A. vertrieben wird und welcher mit den Restriktionsenzymen Xho I und Not I gespalten worden war, gemischt. Zu dem so erhaltenen DNA-Gemisch wurde ein gleiches Volumen der Lösung I in „LIGATION KIT VERSION 2", welcher kommerziell von Takara Shuzo, Tokio, Japan vertrieben wird, gegeben und es wurde bei 16°C für 2 Stunden inkubiert, wobei eine zur Replikation befähigte rekombinante DNA „pCGPA/WT" erhalten wurde.
Die rekombinante DNA pCGPA/WT wurde in einen Escherichia coli-Stamm MC1061/P3, welcher kommerziell von Invitrogen Corporation, San Diego, U.S.A. vertrieben wird, durch ein funktionsfähiges Zellverfahren eingebracht. Das so erhaltene Transformationsvehikel wurde in L-Bouillonmedium (pH-Wert 7,2), welches 20 μg/ml Ampicillin und 10 μg/ml Tetracyclin enthielt, überimpft, gefolgt von Kultivieren bei 37°C für 18 Stunden unter Schüttelbedingungen. Die Transformationsvehikel wurden aus der Kultur durch Zentrifugation gesammelt und einem herkömmlichen Alkali-SDS-Verfahren unterzogen, um die rekombinante DNA pCGPA/WT zu extrahieren. Die Analyse der pCGPA/WT durch eine automatische Sequenziervorrichtung, welche mit einem Fluorophotometer ausgestattet war, bestätigte, dass sie GPA/WT DNA DNA enthielt, deren Terminationscodons an den 3'-Terminus ligiert waren und die an dem Bereich ligiert war, welcher unterhalb eines CMV-Promotors von den 5'- zu 3'-Termini liegt.
Das System, das COS-1 (ATCC CRL-1650) als einen Wirt verwendet, welche eine von einer Affenniere abgeleitete Zelllinie ist, wurde in den folgenden Versuchen 1 und 2 zur Expression der DNA verwendet. Da das System für eine transiente Expression ist, weist es einen Nachteil auf, der darin liegt, dass DNAs, welche in Transformationsvehikel eingebracht werden, über mehrere Tage nicht stabil sein könnten und dass die Transformationsvehikel nicht wiederholt die gewünschten Polypeptide herstellen. Jedoch ist bekannt, dass die Anzahl an Kopien der gewünschten DNA pro Zelle mit der Zeit auf 10⁵ ansteigt, wenn Plasmidvektoren mit einem vom SV40-Virus abgeleiteten Replikationsursprung, wie der vorstehend erwähnte pCDM8, in die COS-1-Zellen eingebracht werden. In dieser Hinsicht weist das System einen Vorteil auf, der darin liegt, dass es ziemlich einfach das gewünschte DNA-Expressionsprodukt analysiert.
Versuch 1-1(c)
Rekombinante DNA-Expression in COS-1-Zellen
Gemäß dem DEAE-Dextran-Verfahren, welches von Frederick M. Ausubel et al. in „Current Protocols in Molecular Biology" (1987), Kapitel 9.2.1-9.2.3 und 9.2.5-9.2.6, veröffentlicht von John Wiley and Sons Inc., New York, U.S.A. berichtet wurde, wurde die rekombinante DNA pCGPA/WT von Versuch 1-1(b) in COS-1-Zellen für ihre Expression eingebracht. In jedes Well von „3046", eine Multiwell-Kunststoffplatte mit 6 Wells von 3,5 cm Durchmesser, welche kommerziell von Becton Dickinson Labware, New Jersey, U.S.A. vertrieben wird, wurden 2,5 ml DME-Medium, welches 10 % (v/v) fötales Kälberserum enthielt, und 1,8 × 10⁵ COS-1-Zellen gegeben. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in einem Inkubator mit 5 % (v/v) CO₂ kultiviert. Nach dem Entfernen des Kulturüberstandes durch eine Absaugvorrichtung und Waschen der zurückbleibenden Zellen mit DME-Medium, welches 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,4) enthielt, wurde jedes Well mit 2,5 ml DME-Medium, welches 2,8 μg/ml PCGPA/WT, 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 0,4 mg/ml DEAE-Dextran und 0,1 mM Chloroquin enthielt, beladen und bei 37°C für 4 Stunden in einem Inkubator mit 5 % (v/v) CO₂ inkubiert. Danach wurde der Kulturüberstand entfernt und die zurückbleibenden Zellen in jedem Well wurden mit 2,5 ml 10 mM Phosphat-gepufferter Salzlösung (hier nachstehend als „PBS" abgekürzt), welche 10 % (v/v) DMSO enthielt, erhalten, vor dem Inkubieren bei Umgebungstemperatur für 2 Minuten. Nach dem Entfernen des Überstandes und Waschen der zurückbleibenden Zellen mit DME-Medium, welches 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4) enthielt, wurde jedes Well mit 2,5 ml „COS MEDIUM", welches kommerziell von COSMO BIO CO. LTD., Tokio, Japan vertrieben wird, beladen, gefolgt von Kultivieren bei 37°C für 3 Tage in einem Inkubator mit 5 % (v/v) CO₂, um die gewünschte DNA zu exprimieren. Als eine Kontrolle wurde der gleiche Versuch unter Verwendung eines Plasmidvektors pCDM8 durchgeführt.
Nach einer Kultivierung für 3 Tage wurden die Multiwell-Platten mit den Kulturen dreimal einer Behandlung von Gefrieren bei –80°C und Auftauen bei Umgebungstemperatur ausgesetzt, um die Zellen aufzubrechen. Die ganzen Kulturen wurden in Zentrifugenröhrchen überführt und zentrifugiert, um unlösliche Komponenten nachdem sie sich abgeschieden hatten zu entfernen, gefolgt vom Erhalten der gesamten löslichen Fraktionen, Konzentrieren der Fraktionen unter Verwendung von Membranen und Einstellen des Volumens der gesamten löslichen Fraktion pro Well, um 0,5 ml für die folgenden Analysen zu ergeben.
Versuch 1-1(d)
Test auf L-Asparaginaseaktivität
L-Asparaginaseaktivität wurde durch die Einheit ausgedrückt, welche wie folgt getestet wurde: Proben von jeweils 50 μl wurden in 1,5 ml-Reaktionsröhrchen gegeben und mit 200 μl 50 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0), welcher 1,4 mg/ml L-Asparagin enthielt, gemischt. Nach Stehen bei 37°C für 0, 1, 2, 4, 6 und 16 Stunden wurde L-Asparaginsäure in den Reaktionsgemischen durch eine Aminosäureanalysevorrichtung quantifiziert. Parallel wurden Verdünnungen einer L-Asparaginase von Escherichia coli mit 1,0, 0,5 und 0,25 Einheiten/ml bereitgestellt und L-Asparaginsäure wurde nach Inkubieren bei 37°C für 0 und eine Stunde quantifiziert und bezogen auf die erhöhte Menge an L-Asparaginsäure wurde eine Kalibrierungskurve gezeichnet. Durch Zeichnen der erhöhten Mengen an L-Asparaginsäure der Proben in die Kalibrierungskurve wurden die L-Asparaginaseaktivitäten der Proben abgeschätzt. Die Aktivität von Proben mit einer niedrigeren Aktivität wurde bezogen auf die, welche nach einer Inkubation von 2 Stunden oder mehr getestet wurden, abgeschätzt. Eine Einheit Aktivität von L-Asparaginase wurde als die Menge definiert, welche ein μMol Ammoniak von L-Asparagin pro Minute unter den vorstehenden Bedingungen freisetzt.
Die gesamten löslichen Fraktionen, welche in Versuch 1-1(c) erhalten wurden, wurden in einer ähnlichen Weise wie vorstehend behandelt und ihre Aktivitäten wurden als L-Asparaginasegesamtaktivitäten ausgedrückt, die in den löslichen Fraktionen von 1,8 × 10⁵ COS-1-Zellen nachgewiesen wurden. Als ein Ergebnis betrug die Aktivität der gesamten löslichen Fraktion in Versuch 1-1(c) 0,083 Einheiten und die Kontrolle ergab keine Aktivität.
Versuch 1-1(e)
Western-Blotting
Ein anti-L-Asparaginase-Antikörper wurde wie folgt hergestellt: Ein Oligopeptid mit einer Sequenz Gly-Ser-Gly-Asn-Gly-Pro-Thr-Lys-Pro-Asp-Leu-Leu-Gln-Glu-Leu-Arg-Cys wurde chemisch in einer herkömmlichen Weise hergestellt. Keyhole Limped Hemocyanin wurde an den C-Terminus des Oligopeptids gebunden. Das resultierende Material wurde gereinigt und zur Immunisierung von Kaninchen in einer herkömmlichen Weise verwendet. Die Kaninchen wurden etwa 6 Mal 2 Wochen immunisiert, dann wurde das Vollblut gesammelt und Aussalzen mit 50 % (w/v) Ammoniumsulfat unterzogen, um ein anti-L-Asparaginase-Antiserum zu erhalten.
Gemäß dem Verfahren, welches von U.K. Laemli et al. in „Nature", Bd. 227, S. 680-685 (1970) berichtet wurde, wurden 0,2 ml der gesamten löslichen Fraktion von Versuch 1-1(c) 12,5 % (w/v) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (hier nachstehend als „SDS-PAGE" abgekürzt) unterzogen. Die migrierten Polypeptide wurden auf eine Nitrocellulosemembran überführt und Western-Blotting unter Verwendung des vorstehenden anti-L-Asparaginase-Antiserums gemäß dem Verfahren, welches von H. Towbin in „Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A.", Bd. 76, S. 4.350-4.354 (1979) berichtet wurde, unterzogen. Zur Farbentwicklung wurde das alkalische Phosphatase-System verwendet. Im Vergleich mit der Kontrolle und mit Molekulargewichtsmarkern wurden sowohl die Identifizierung von Banden, welche speziell in der Probe angefärbt wurden, als auch die Messung des Molekulargewichts von jeder Untereinheit der L-Asparaginase durchgeführt. Die verwendeten Molekulargewichtsmarker waren Rinderserumalbumin (67 kDa), Ovalbumin (45 kDa), Sojabohnentrypsininhibitor (20,1 kDa) und α-Lactalbumin (14,4 kDa) und wurden mit Amidschwarz angefärbt. Die gesamte lösliche Fraktion von Versuch 1-1(c) ergab keine klare Bande.
Versuch 1-1(f)
Messung des Molekulargewichts durch Gelfiltration
Zwei ml der gesamten löslichen Fraktion von Versuch 1-1(c) wurden Gelfiltrationssäulenchromatographie unter Verwendung einer „HILOAD SUPERDEX 200 COLUMN" mit einem Innendurchmesser von 16 mm und einer Länge von 60 cm, welche kommerziell von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden vertrieben wird und mit PBS äquilibriert worden war, unterzogen. Basierend auf der L-Asparaginaseaktivität der eluierten Fraktionen wurde das Molekulargewicht der Meerschweinchen-Wildtyp-L-Asparaginase in einer nativen Form untersucht. Die verwendeten Molekulargewichtsmarker waren Thyroglobulin (699 kDa), Femtin (440 kDa), Catalase (232 kDa), Aldolase (158 kDa), Rinderserumalbumin (67 kDa) und Ovalbumin (43 kDa). Die Spitze der L-Asparaginaseaktivität in den eluierten Fraktionen wurde bei einer Position beobachtet, welche einem Molekulargewicht von etwa 300 kDa entspricht.
Da durch Western-Blotting keine klare Bande gemessen wurde, konnte das Molekulargewicht der Wildtyp-L-Asparaginase in einer dissoziierten Form nicht gemessen werden, während das Molekulargewicht in einer nativen Form basierend auf dem Ergebnis der Gelfiltration als etwa 300 kDa abgeschätzt wurde. Die Molekulargewichte von L-Asparaginase in einer nativen und dissoziierten Form, gereinigt von Meerschweinchen-L-Asparaginase in Serum, wurden jeweils als etwa 190 kDa über Gelfiltration und als etwa 43 kDa über SDS-PAGE abgeschätzt. Wie im Japanischen Patent, Kokai Nr. 214,885/96 durch den selben Anmelder wie die vorliegende Erfindung offenbart wird, wurden in einem Bereich der Aminosäuren 10 bis 236 in der Sequenz der Meerschweinchen-Wildtyp-L-Asparaginase 3 Teilaminosäuresequenzen einer Meerschweinchen-L-Asparaginase im Serum beobachtet. Gleichzeitig entsprechen zwei Consensus-Aminosäuresequenzen, welche für die Expression von L-Asparaginaseaktivität wesentlich sind, d.h. SEQ ID Nos: 1 und 2, wie von E. Harms in „FEBS letters", Bd. 285, S. 55-58 (1991) bezogen auf die Ergebnisse von Versuchen an von Escherichia coli abgeleiteter L-Asparaginase vorgeschlagen, den Sequenzen der Aminosäuren 16 bis 19 und 114 bis 118 in der Aminosäuresequenz der Meerschweinchen-Wildtyp-L-Asparaginase. Angesichts dessen und der Ergebnisse von Versuch 1-1 schätzten die Erfinder, dass die Meerschweinchen-Wildtyp-L-Asparaginase einen Bereich von Aminosäuren von etwa 1 bis 400 in der Aminosäuresequenz erfordern könnte, um die Aktivität zu zeigen. Im Versuch 2-1 zur Untersuchung der L-Asparaginaseaktivitäten von Mutanten mit Fehlern am C-Terminus als Homologe der Meerschweinchen-Wildtyp-L-Asparaginase wurden die Expressionsprodukte von DNA-Homologen von einem Meerschweinchen auf ihre Eigenschaften und Merkmale getestet.
Versuch 1-2
Expression von menschlicher Wildtyp-DNA
Eine menschliche Wildtyp-DNA, welche L-Asparaginase codiert, wurde gemäß dem Verfahren im Japanischen Patent, Kokai Nr. 214,855/96 durch den selben Anmelder wie die vorliegende Erfindung hergestellt. Die DNA hatte die Nucleotidsequenz SEQ ID No: 16. Hier nachstehend wurde eine DNA mit einem Polypeptid codierenden Bereich in SEQ ID No: 16, d.h. eine Sequenz der Nucleotide 93 bis 1.811 in SEQ ID No: 16, „HA/WT DNA" genannt und ein Polypeptid als das Expressionsprodukt von HA/WT DNA mit der Aminosäuresequenz SEQ ID No: 16 kann „menschliche Wildtyp-L-Asparaginase" genannt werden. SEQ ID No: 18 zeigt die Nucleotidsequenz von GPA/WT DNA und die dadurch codierte Aminosäuresequenz.
Außer für das Templat und die Sense- und Antisense-Primer wurde PCR unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wie in Versuch 1-1(b) verwendet. Als ein Templat wurde die menschliche Wildtyp-DNA in Versuch 1-2 verwendet. Als Sense- und Antisense-Primer wurden Oligonucleotide mit den Sequenzen 5'-AATCTCGAGCCACCATGGCGCGCGCGGTG-3' bzw. 5'-CTGCGGCCGCTTATCAGACACCAGGCAGCAC-3' verwendet. Die so amplifizierte DNA wurde kontinuierlich mit dem selben Verfahren, wie in Versuch 1-1(b) verwendet, behandelt, um eine rekombinante DNA „pCHA/WT" herzustellen. Nach Sequenzieren wurde die pCHA/WT in COS-1-Zellen eingebracht und exprimiert, gefolgt von Analysieren des Expressionsprodukts in einer ähnlichen Weise wie in Versuch 1-1.
Im Gegensatz zur Meerschweinchen-Wildtyp-L-Asparaginase konnte das Versuchssystem keine menschliche Wildtyp-L-Asparaginaseaktivität nachweisen. Dies war wahrscheinlich deshalb, weil die menschliche Wildtyp-L-Asparaginase eine niedrigere spezifische Aktivität hatte als die Asparaginase des Meerschweinchen-Wildtyps, und dies machte die Untersuchung der Eigenschaften von Expressionsprodukten durch DNA-Homologe vom Menschen in Versuch 2-2 erforderlich.
Versuch 2
Expression eines DNA-Homologen
Versuch 2-1
Expression eines DNA-Homologen, welches vom Meerschweinchen stammt Die Nucleotidsequenz in einer speziellen Position der Meerschweinchen-Wildtyp-DNA wurde durch ein Terminationscodon ersetzt, um ein DNA-Homologes zu erhalten: Eine DNA wurde durch ein PCR-Verfahren durch Ersetzen eines Codons der Nucleotide 1.090 bis 1.092 oder 1.012 bis 1.014 in SEQ ID No: 17 mit einem Terminationscodon erhalten. Außer für die Nucleotidsequenz des Antisense-Primers wurde PCR unter den gleichen Bedingungen, wie in Versuch 1-1(b) verwendet, durchgeführt. Als ein Antisense-Primer wurde ein Oligonucleotid mit einer Sequenz 5'-CTGCGGCCGCTTATCATGCCGTGGGCAGTGT-3' oder 5'-CTGCGGCCGCTTATCAGCCCAACACGTAGGA-3' verwendet, um die zwei Typen von DNAs herzustellen. Die amplifizierten DNAs wurden in einer ähnlichen Weise wie in Versuch 1-1(b) behandelt, wobei die rekombinanten DNAs „pCGPA/D364stp" und „pCGPAlL338stp" erhalten wurden. Durch Sequenzieren in einer ähnlichen Weise wurde bestätigt, dass pCGPA/D364stp und pCGPA/L338stp DNAs aufwiesen, welche die Sequenzen der Aminosäuren 1 bis 363 bzw. 1 bis 337 in der Meerschweinchen-Wildtyp-L-Asparaginase codierten und ein Terminationscodon an ihren 3'-Termini, die frei von Introns waren, aufwiesen. Hier nachstehend werden die Polypeptid codierenden Bereiche der DNAs jeweils „GPA/D364stp DNA" und „GPA/L338stp DNA" genannt. GPA/D364stp DNA und GPA/L338stp DNA wurden in den Bereich, welcher unterhalb eines CMV-Promotors in der Richtung von den 5'- zu 3'-Termini liegt, ligiert. Die Expressionsprodukte der DNAs können „Meerschweinchen-L-Asparaginase-Homologe" genannt werden.
Die vorstehenden rekombinanten DNAs wurden in COS-1-Zellen eingebracht und in einer ähnlichen Weise wie in Versuch 1-1 untersucht. Als Kontrollen wurden pCGPA/WT und pCDM8 von Versuch 1-1(b) in einer ähnlichen Weise behandelt und untersucht. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurden die Aktivitäten der Expressionsprodukte von GPA/WT DNA und GPA/D364stp DNA nachgewiesen, aber nicht für GPA/L338stp DNA. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass ein Bereich von Aminosäuren 1 bis 363 in der Meerschweinchen-Wildtyp-L-Asparaginase für eine ausreichende Expression der L-Asparaginaseaktivität ausreichend sein könnte. Diese Aminosäuresequenz, die Aminosäuren 1 bis 363 im Meerschweinchen-Wildtyp, ist SEQ ID No: 4 und eine Nucleotidsequenz, welche die Aminosäuresequenz codiert, ist SEQ ID No: 10. Die Aminosäuresequenz der Meerschweinchen-Wildtyp-L-Asparaginase ist SEQ IG No: 5.
Versuch 2-2
Expression eines DNA-Homologen welches vom Menschen stammt
DNA-Homologe wurden durch Ersetzen von speziellen Codons in der menschlichen Wildtyp-DNA mit Terminationscodons oder Codons für unterschiedliche Aminosäuren hergestellt: Die DNA-Homologen wurden durch Ersetzen der Nucleotide 1096 bis 1098 in SEQ ID No: 18 mit Terminationscodons unter Verwendung eines PCR-Verfahrens hergestellt. Außer für das Templat und die Sense- und Antisense-Primer wurde PCR unter den gleichen Bedingungen, wie in Versuch 1-1(b) verwendet, durchgeführt. Als ein Templat wurde die menschliche Wildtyp-DNA von Versuch 1-2 verwendet. Als Sense- und Antisense-Primer wurden die Oligonucleotide mit den Sequenzen 5'-AATCTCGAGCCACCATGGCGCGCGCGGTG-3' bzw. 5'-CTGCGGCCGCTCATTACACCGAGGGTGGCGT-3' verwendet. Die amplifizierte DNA wurde in einer ähnlichen Weise wie in Versuch 1-1 behandelt, wobei eine rekombinante DNA „pCHA/E366stp" erhalten wurde, und sequenziert. Es wurde bestätigt, dass pCHA/E366stp eine DNA, welche die Aminosäuren 1 bis 365 in SED ID No: 6 codiert, und ein Terminationscodon am 3'-Terminus, welcher frei von Introns war, enthielt. Der Polypeptid codierende Bereich wurde hier nachstehend „HA/E366stp DNA" genannt. HA/E366stp DNA wurde in den Bereich, welcher unterhalb eines CMV-Promotors in der Richtung von den 5'- zu 3'-Termini liegt, ligiert.
Um spezielle Codons in DNAs mit anderen Codons für unterschiedliche Aminosäuren auszutauschen, wurde das Überlappungsextensionsverfahren verwendet, welches von Robert M. Horton et al. in „Methods in Enzymology", Bd. 217, S. 270-279 (1993), veröffentlicht von Academic Press, Inc., San Diego, U.S.A., beschrieben wird. Das Verfahren ist in 1 zusammengefasst und wird wie folgt erklärt: Zuerst wurden mutagene Primer A und B hergestellt, wobei die Nucleotide, welche mutagenisiert wurden, durch gewünschte unterschiedliche Nucleotide, die komplementär zueinander waren, ersetzt wurden. Der mutagene Primer A war ein Sense-Strang und der mutagene Primer B war ein Antisense-Strang. Ein Satz von 5'- und 3'-terminalen Primern, welche den gesamten Bereich der gewünschten DNA amplifizieren, wurden hergestellt und sie waren jeweils Sense- und Antisense-Stränge. Zweitens wurde herkömmliche PCR unter Verwendung des 5'-terminalen Primers, des mutagenen Primers A, und als ein Templat, einer DNA mit der ursprünglichen Nucleotidsequenz durchgeführt. Parallel wurde eine andere PCR unter Verwendung der gleichen DNA als ein Templat, des 3'-terminalen Primers und des mutagenen Primers B durchgeführt. Diese beiden PCRs wurden „PCRs des ersten Schritts" genannt. Drittens wurden beide DNAs, welche in den PCRs des ersten Schritts amplifiziert worden waren, mit den 5'- und 3'-terminalen Primern, wie in den PCRs des ersten Schritts verwendet, gemischt, gefolgt von Durchführen einer PCR als eine PCR des zweiten Schritts. Die beiden DNA-Fragmente, welche in den PCRs des ersten Schritts amplifiziert worden waren, wurden als Primer und Template verwendet, um mutagenisierte DNAs zu erzeugen, während die 5'- und 3'-terminalen Primer als Primer verwendet wurden, um die mutagenisierten DNAs zu amplifizieren. Durch dieses Verfahren wurden DNAs, in welche 7 Typen von Nucleotidsubstituenten eingebracht worden waren, d.h. 7 DNA-Homologe, hergestellt. Die 7 Typen von Nucleotidsubstituenten und die daraus folgenden Veränderungen der codierten Aminosäuresequenzen sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Die Templat-DNA und die mutagenen Primer A und B, welche zur Herstellung der 7 DNA-Homologen verwendet worden waren, wurden in Tabelle 3 zusammengefasst. Die 5'- und 3'-terminalen Primer waren jeweils gleich mit den Sense- und Antisense-Primern, wie sie zur Herstellung von pCHA/E366stp in Versuch 2-2 verwendet worden waren.
Die erhaltenen DNA-Homologen vom Menschen wurden in einer ähnlichen Weise wie in Versuch 1-1 behandelt, wobei die rekombinanten DNAs „pCHA/MUT1", „pCHA/MUT2", „pCHA/MUT3", „pCHA/MUT4", „pCHA/MUT5", „pCHA/MUT6" und „pCHA/MUT7" erhalten wurden. Die Expressionsprodukte der DNA-Homologen, welche in Versuch 2-2 erhalten wurden, können hier nachstehend „menschliche L-Asparaginase-Homologe" genannt werden. Nach Sequenzieren wurden diese DNA-Homologen in COS-1-Zellen eingebracht, gefolgt von Expression und Test. Als Kontrollen wurden in Versuch 1-2 erhaltene pCHA/WT und pCDM8 behandelt und untersucht. Die Signalintensitäten von Banden, welche durch Western-Blotting nachgewiesen wurden, wurden durch Schwärzungsmessung bewertet, wobei quantitativ die exprimierten Produkte verglichen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.
Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, dass menschliche L-Asparaginasen, sowohl im Wildtyp als auch in der im C-Terminus einen Fehler aufweisenden Mutante, d.h. im Expressionsprodukt von HA/E366stp DNA als die eine der Homologen, eine niedrigere spezifische Aktivität als die von Meerschweinchen aufwiesen. Zusätzlich zeigen diese Ergebnisse, dass die spezifische Aktivität von L-Asparaginasen unter jenen von Punktmutanten, wobei einige der für die menschliche Wildtyp-L-Asparaginase inhärenten Aminosäuren durch unterschiedliche Aminosäuren ersetzt wurden, auf einen nachweisbaren Level anstiegen. Die menschlichen DNA-Homologen wie HA/MUT1, HA/MUT2, HA/MUT3 und HA/MUT5, wobei die Expressionsprodukte einen nachweisbaren Aktivitätslevel ergeben, weisen jeweils die SEQ ID Nos: 11 bis 14 auf und codieren jeweils die SEQ ID Nos: 6 bis 9.
Basierend auf den Ergebnissen in den vorstehenden Versuchen fanden die Erfinder, dass Polypeptide von einem Säuger die Aminosäuresequenz SEQ ID No: 3 (wobei das Symbol „Xaa" „Glutamin" oder „Arginin" bedeutet) erfordern können, um bei der Expression und den Testsystemen in den Versuchen 1 und 2 einen nachweisbaren Level von L-Asparaginaseaktivität zu exprimieren, zusätzlich zu herkömmlich bekannten, wie die Aminosäuresequenzen SEQ ID Nos: 1 und 2. Die Aminosäuresequenz der Meerschweinchen-Wildtyp-L-Asparaginase enthält die SEQ ID No: 3 im Bereich der Aminosäuren 298 bis 302. Beispiele von solchen Polypeptiden, welche alle die Aminosäurensequenzen SEQ ID Nos: 1 bis 3 aufweisen, schließen jene mit SEQ ID Nos: 4 und 5 von Meerschweinchen und jene mit SEQ ID Nos: 6 bis 9 vom Menschen ein.
Basierend auf den vorstehenden Befunden erfanden die Erfinder die Polypeptide mit L-Asparaginaseaktivität. Die folgenden Beispiele erklären die vorliegende Erfindung und die dabei verwendeten Techniken sind herkömmliche auf dem Fachgebiet verwendete Techniken und natürlich schränken sie die vorliegende Erfindung nicht ein:
Beispiel A-1
Polypeptide mit L-Asparaginaseaktivität
Beispiel A-1(a)
Herstellung eines Transformationsvehikels
Zehn μl 10 × PCR-Puffer, ein μl 25 mM dNTP mix, ein ng der rekombinanten DNA pCGPA/WT DNA, welche in Versuch 1-1 erhalten wurde, als ein Templat und eine adäquate Menge an Oligonucleotiden als Sense- und Antisense-Primer, welche chemisch basierend auf den 5'- und 3'-terminalen Sequenzen von GPA/WT DNA synthetisiert worden waren, wurden in ein 0,5 ml-Reaktionsröhrchen gegeben. Das Gemisch wurde mit sterilisiertem destilliertem Wasser gemischt, um ein Gesamtvolumen von 99,5 μl zu ergeben, und 0,5 μl 2,5 Einheiten/μl AmpliTaq DNA-Polymerase wurden ferner zugegeben. Die Sequenz des Sense-Primers war 5'-GCGAATTCATGGCGCGCGCATCA-3', welche eine Nucleotidsequenz war, die durch Hinzufügen einer Spaltungsstelle durch ein Restriktionsenzym Eco RI in dem Bereich, der oberhalb des 5'-Terminus von GPA/WT DNA liegt, erhalten wurde. Die Sequenz des Antisense-Primers war 5'-GCAAGCTTTCAGATGGCAGGCGGCAC-3', welche komplementär zu einer Nucleotidsequenz war, die durch Addition eines Terminationscodons an den 3'-Terminus von GPA/WT DNA und dann Hinzufügen einer Spaltungsstelle durch ein Restriktionsenzym Hin dIII in dem Bereich, der unterhalb liegt, erhalten wurde. Das vorstehende Gemisch wurde 40 Cyclen von aufeinanderfolgenden Inkubationen bei 94°C für eine min, bei 55°C für eine min und 72°C für 3 min unterzogen, um eine PCR durchzuführen. Durch Spalten der amplifizierten DNA durch die Restriktionsenzyme Eco RI und Hin dIII wurde ein Eco RI-Hin dIII-Fragment mit einer Länge von 1,7 Kbp erhalten. Fünfundzwanzig ng der DNA wurden mit 10 ng Plasmidvektor „pKK223-3" gemischt, welcher kommerziell von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden vertrieben wird und durch die Restriktionsenzyme Eco RI und Hin dIII gespalten worden war, und dann mit der Lösung I von „LIGATION KIT VERSION 2", welcher kommerziell von Takara Shuzo Inc., Tokio, Japan vertrieben wird, in einem gleichen Volumen des DNA-Gemisches gemischt, gefolgt von einer Inkubation bei 16°C für 2 Stunden, wobei eine zur Replikation befähigte rekombinante DNA „pKGPA/WT" erhalten wurde.
Die rekombinante DNA pKGPA/WT wurde durch das funktionsfähige Zellverfahren in einen Escherichia coli-Stamm „JM105" eingebracht. Das resultierende Transformationsvehikel „J-GPA/WT" wurde in L-Bouillonmedium (pH-Wert 7,2), welches 50 μg/ml Ampicillin enthielt, überimpft, und bei 37°C für 18 Stunden unter Schüttelbedingungen kultiviert. Die Transformationsvehikel, welche aus der Kultur durch Zentrifugation gesammelt worden waren, wurden einem herkömmlichen Alkali-SDS-Verfahren unterzogen, um die rekombinante DNA pKGPA/WT zu extrahieren. Wie in 2 gezeigt, enthüllte eine Analyse unter Verwendung einer automatischen Sequenziervorrichtung, welche mit einem Fluorophotometer ausgestattet war, dass GPA/WT DNA von SEQ ID No: 17 an dem Bereich ligierte, welcher unterhalb eines Tac-Promotors in der Richtung von den 5'- zu 3'-Termini liegt. Zusätzlich wurde bestätigt, dass ein Terminationscodon an dem Bereich ligiert war, welcher unterhalb der GPA/WT DNA ohne Introns liegt.
Beispiel A-1(b)
Herstellung eines Polypeptids
Das Transformationsvehikel J-GPA/WT wurde in L-Bouillonmedium (pH-Wert 7,2), welches 50 μg/ml Ampicillin enthielt, überimpft und bei 37°C für 18 Stunden unter Schüttelbedingungen kultiviert, um eine Impfkultur zu erhalten. Achtzehn 1 einer frischen Zubereitung des gleichen Mediums wurden in einen Glasfermenter mit 30 1 gegeben, mit einem % (v/v) der Impfkultur überimpft und bei 37°C unter Begasungs-Bewegungs-Bedingungen kultiviert. Ein Teil der Kultur wurde in eine Küvette mit 1 cm Dicke gegeben, inkubiert, bis die Extinktion bei einer Wellenlänge von 650 nm etwa 1,5 erreichte, mit IPTG gemischt, um eine Endkonzentration von 0,1 mM zu ergeben, und für 5 Stunden inkubiert. Die durch Zentrifugation aus der Kultur gesammelten Zellen wurden in einem Lösungsgemisch (pH-Wert 7,2), welches 139 mM NaCl, 7 mM Na₂HPO₄ und 3 mM NaH₂PO₄ enthielt, suspendiert und Ultraschall ausgesetzt, um die Zellen aufzubrechen, gefolgt von Zentrifugieren des resultierenden Materials, um einen Überstand zu erhalten.
Ammoniumsulfat wurde zu dem Überstand unter Eiskühlungsbedingungen gegeben, um eine Konzentration von 50 % (w/v) zu ergeben, und dann wurde zur Homogenität gelöst. Nach Stehen für mehrere Minuten wurden die Niederschläge durch Zentrifugation gesammelt, in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0) gelöst und gegen eine frische Zubereitung des gleichen Puffers dialysiert, gefolgt von Verwenden der dialysierten Lösung auf einer „Q SEPHAROSE FF COLUMN", welche kommerziell von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden vertrieben wird und mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Nach ausreichendem Waschen mit dem gleichen Puffer, wurde die Säule mit einem linearen Gradientenpuffer von NaCl, welcher von 0 M auf 0,5 M in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0) anstieg, beschickt. Die Fraktionen, welche bei etwa 0,1 bis 0,3 M NaCl eluierten, wurden gesammelt und das Lösungsmittel wurde mit 10 mM Natriumphosphat-Puffer (pH-Wert 7,5) ersetzt, während mit Membranen konzentriert wurde. Die konzentrierte Lösung wurde dann an „L-ASPARAGINE AGAROSE", welche kommerziell von Sigma Chemical Co., St. Louis, U.S.A. vertrieben wird und mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, verwendet. Nach Waschen mit dem gleichen Puffer, wurde die Säule zur Elution mit 10 mM Natriumphosphat-Puffer (pH-Wert 7,5), welcher 0,5 M NaCl enthielt, beschickt. Die eluierten Fraktionen wurden vereinigt und unter Verwendung einer Membran konzentriert. Das Konzentrat wurde auf eine „HILOAD SUPERDEX 200 COLUMN", welche kommerziell von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden vertrieben wird und mit Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0), welcher 10 % (v/v) Glycerol enthielt, äquilibriert worden war, aufgebracht und von der Säule eluiert. Die eluierten Fraktionen, welche Substanzen mit einem Molekulargewicht von etwa 300 kDa enthielten, wurden gesammelt, wobei ein gereinigtes Polypeptid mit einer Reinheit von 90 % oder höher in einer Ausbeute von etwa 0,1 mg/ml Kultur erhalten wurde.
Beispiel A-1(c)
Physikochemische Eigenschaft eines Polypeptids
Das vorstehende gereinigte Polypeptid wurde analysiert, wobei physikochemische Eigenschaften bestimmt wurden: Das Molekulargewicht des gereinigten Polypeptids in einer nativen Form wurde durch Gelfiltration in einer ähnlichen Weise wie in Versuch 1-1(e) bestimmt. Die Spitze der L-Asparaginaseaktivität der eluierten Fraktionen wurde bei einer Position gefunden, welche einem Molekulargewicht von etwa 300 kDa entspricht. Das Molekulargewicht des gereinigten Polypeptids in einer dissoziierten Form wurde durch SDS-PAGE, wie in Versuch 1-1(e) verwendet, bestimmt. Die Hauptbande wurde bei einer Position beobachtet, welche einem Molekulargewicht von etwa 50 ± 10 kDa entspricht. Die Ergebnisse zeigen, dass das gereinigte Polypeptid als eine native Form als ein Multimer vorliegt. Unter Berücksichtigung von Fehlern bei der Messung durch die vorstehenden Verfahren und der Tatsache, dass alle bekannten L-Asparaginasen von Escherichia coli usw., verschieden von einem Säuger, in einer tetrameren Form vorliegen, kann abgeschätzt werden, dass das gereinigte Polypeptid in einer tetrameren Form vorliegt. Das Verfahren, wie in Versuch 1-1(d) verwendet, bestätigte, dass das gereinigte Polypeptid eine L-Asparaginaseaktivität aufwies.
Beispiel A-2(a)
Herstellung eines Transformationsvehikels
3 fasst die Verfahren zur Herstellung von Transformationsvehikeln zusammen. PCR wurde unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel A-1(a) verwendet, durchgeführt, außer für die Nucleotidsequenzen von Sense- und Antisense-Primern. Als die Sense- und Antisense-Primer wurden jeweils Oligonucleotide mit den Nucleotidsequenzen 5'-GTGAATTCGGAGGTTCAGATGGCGCGCGCATCA-3' und 5'-CTGCGGCCGCTCAGATGGCAGGCGGCAC-3' verwendet. Die so amplifizierte DNA wurde durch die Restriktionsenzyme Eco RI und Not I gespalten, wobei ein Eco RI-Not I-Fragment mit etwa 1,7 Kbp erhalten wurde. Siebzig ng des DNA-Fragments wurden mit 50 ng eines Plasmidvektors „pBPV", welcher kommerziell von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden vertrieben wird und vorher durch die Restriktionsenzyme Xho I und Not I gespalten worden war, und jeweils 25 ng von 4 Oligonucleotiden als Linker mit Nucleotidsequenzen 5'-TCGAGCCACCATGAAGTGTTCGTGGGTTATT-3', 5'-TTCTTCCTGATGGCCGTAGTGACAGGAGTG-3', 5'-AATTCACTCCTGTCACTACGGCCATCAGGA-3' und 5'-AGAAAATAACCCACGAACACTTCATGGTGGC-3' gemischt. Die Oligonucleotide für die Linker wurden in einer herkömmlichen Weise synthetisiert und nach Umsetzen mit T4-Polynucleotidkinase, welche kommerziell von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden vertrieben wird, verwendet und durch Ethanolfällung gereinigt. Zu dem DNA-Gemisch wurde die Lösung I von „LIGATION KIT VERSION 2", welcher kommerziell von Takara Shuzo, Tokio, Japan vertrieben wird, gegeben. Das Gemisch wurde bei 16°C für 2 Stunden inkubiert, wobei eine zur Replikation befähigte rekombinante DNA „pBIgGPA/WT" erhalten wurde.
Die rekombinante DNA pBIgGPA/WT wurde durch das funktionsfähige Zellverfahren in einen Escherichia coli-Stamm HB101 eingebracht. Das so erhaltene Transformationsvehikel wurde in L-Bouillonmedium (pH-Wert 7,2), welches 50 μg/ml Ampicillin enthielt, überimpft, gefolgt von Kultivieren bei 37°C für 18 Stunden unter Schüttelbedingungen. Die Transformationsvehikel, welche durch Zentrifugieren der resultierenden Kultur gesammelt wurden, wurden einem herkömmlichen Alkali-SDS-Verfahren unterzogen, um die rekombinante DNA pBIgGPA/WT zu extrahieren. Die Nucleotidsequenzanalyse unter Verwendung einer automatischen Sequenziervorrichtung bestätigte, dass die rekombinante DNA pBIgGPA/WT die Struktur von 4 aufwies: Eine DNA, welche ein Polypeptid codiert, das eine Signalsequenz für Immunglobulinsekretion enthält, wie durch D.F. Stern et al. in „Science", Bd. 235, S. 321-324 (1984) gezeigt, d.h. „Ig sec DNA" wurde in den Bereich ligiert, welcher unterhalb eines Bereichs für Transkriptionsregulierung liegt, der einen Enhancer, welcher von langen terminalen Wiederholungen des Moloney-Maussarkomvirus (Emsv) abgeleitet war, und einen Promotor, welcher vom Maus-Metallothionein I-Gen (Pmti) abgeleitet war, umfasste. Darüber hinaus wurde GPA/WT DNA im gleichen Rahmen in den Bereich ligiert, welcher unterhalb der Ig sec DNA in der Richtung von den 5'- zu 3'-Termini von GPA/WT DNA liegt. Es wurde auch bestätigt, dass ein Terminationscodon im 3'-Terminus der GPA/WT DNA ohne Introns vorliegt.
Die rekombinante DNA pBIgGPA/WT wurde in eine Zelllinie C127 (ATCC CRL-1616), welche von einer Maus abgeleitet ist, unter Verwendung eines Lipofectin^®-Reagenzes, welches kommerziell von Life Technologies, Inc., Gaitherburg, U.S.A. vertrieben wird, gemäß dem angefügten Protokoll eingebracht. Die Transformationsvehikel mit der rekombinanten DNA wurden als eine erste Selektion basierend auf dem Mangel an Proliferations-Regulations-Vermögen, d.h. Fokus bildendem Vermögen, selektiert. Die Zellen um jene, welche Fokusse enthielten, wurden unter Verwendung von sterilisiertem Filterpapier gesammelt und einem herkömmlichen einschränkenden Verdünnungsverfahren unterzogen, um einzelne Zellen zu bilden, die dann als eine Endselektion abhängig von der Produktivität der L-Asparaginase selektiert wurden. So wurde ein Transformationsvehikel „C-GPA/WT" erhalten.
Beispiel A-2(b)
Herstellung eines Polypeptids
Das Transformationsvehikel C-GPA/WT wurde in ein Well von „3046", eine Multiwell-Kunststoffplatte mit 6 Wells von 3,5 cm Durchmesser, welche kommerziell von Becton Dickinson Labware, New Jersey, U.S.A. vertrieben wird, mit DME-Medium, welches 10 % (v/v) fötales Kälberserum enthielt, überimpft und kultiviert, bis es als eine Impfkultur konfluent war. Einige der Zellen, welche durch Behandlung mit Trypsin aufgebrochen worden waren, wurden als Impfzellen in jede der Multiwell-Platten, welche mit der frischen Zubereitung des gleichen Mediums beschickt worden waren, überimpft und kultiviert. Nach sich wiederholenden Manipulationen in einer ähnlichen Weise wie vorstehend und mit einer Maßstabsvergrößerung, um die Zellanzahl zu erhöhen, wurden die Zellen in einer herkömmlichen kontinuierlichen Kultur unter Verwendung von 50 Kulturflaschen mit 150 cm² kultiviert. Die resultierenden Kulturüberstände mit einem Volumen von 100 1 wurden gesammelt und mit ähnlichen Verfahren zur Behandlung des Überstandes von dem aufgebrochenen Zellmaterial wie in Beispiel A-1(b) behandelt: Aussalzen mit Ammoniumsulfat, die Chromatographie der Lösung der Niederschläge unter Verwendung der Q SEPHAROSE FF COLUMN, die Chromatographie der eluierten Fraktionen unter Verwendung von L-ASPARAGINE AGAROSE und die Chromatographie der eluierten Fraktionen unter Verwendung der HILOAD SUPERDEX 200 COLUMN. Folglich wurde ein gereinigtes Polypeptid mit einer Reinheit von 90 % oder höher in einer Ausbeute von etwa einem μg/ml Kultur erhalten.
Beispiel A-2(c)
Physikochemische Eigenschaft eines Polypeptids
Durch Testen in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel A-1(c) wurde bestätigt, dass das so erhaltene gereinigte Polypeptid äquivalente physikochemische Eigenschaften mit dem in Beispiel A-1(b) erhaltenen aufwies.
Beispiel A-3(a)
Herstellung eines Transformationsvehikels
PCRs wurden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel A-1(a) durchgeführt, außer für das Templat und die Sense- und Antisense-Primer. Die so erhaltene DNA wurde in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel A-1(a) behandelt, wobei die rekombinanten DNAs „pKGPA/D364stp", „pKHA/MUT1", „pKHA/MUT2", „pKHA/MUT3" und „pKHA/MUT5" hergestellt wurden. Tabelle 5 fasst die Templat-DNAs und die Nucleotidsequenzen der Sense- und Antisense-Primer, welche zur Herstellung der jeweiligen rekombinanten DNAs verwendet wurden, zusammen. Durch Sequenzieren in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel A-1(a) wurden die Strukturen dieser rekombinanten DNAs wie in den 5 bis 9 gezeigt bestätigt.
Die rekombinanten DNAs wurden gemäß den Verfahren wie in Beispiel A-1(a) behandelt, wobei die Transformationsvehikel „J-GPA/D364stp", „J-HA/MUT1", „J-HA/MUT2", „J-HA/MUT3" und „J-HA/MUT5" erhalten wurden.
Beispiel A-3(b)
Herstellung eines Polypeptids
Die in Beispiel A-3(a) erhaltenen Transformationsvehikel wurden gemäß den Verfahren in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel A-1(b) behandelt: Kultivieren, Aufbrechen der resultierenden Zellen, die Fällungen des aufgebrochenen Zellmaterials mit Ammoniumsulfat, die Chromatographie der gefällten Lösungen unter Verwendung der Q SEPHAROSE FF COLUMN und die Chromatographie der eluierten Fraktionen unter Verwendung von L-ASPARAGINE AGAROSE in dieser Reihenfolge. Die so erhaltenen eluierten Fraktionen wurden unter Verwendung von Membranen in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel A-1(b) konzentriert, gefolgt von Unterziehen der Chromatographie unter Verwendung der HILOAD SUPERDEX 200 COLUMN, wobei die eluierten Fraktionen mit einem Molekulargewicht von etwa 140 kDa gesammelt wurden. Jedes System ergab die gereinigten Polypeptide mit einer Reinheit von 90 % oder höher in einer Ausbeute von etwa 0,1 mg/ml Kultur. Diese gereinigten Polypeptide wurden durch die Verfahren wie in Beispiel A-1(c) analysiert, um ihre physikochemischen Eigenschaften zu untersuchen. Tabelle 6 zeigt die Ergebnisse, kombiniert mit jenen von Beispiel A-1(c).
Tabelle 6 zeigt, dass alle vorliegenden Polypeptide, welche in Escherichia coli exprimiert und gereinigt wurden, eine L-Asparaginaseaktivität zeigten. Darüber hinaus zeigt Tabelle 6, dass die Polypeptide Tetramere bildeten.
Beispiel A-4(a)
Herstellung eines Transformationsvehikels
PCRs wurden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel A-1(a) durchgeführt, außer für das Templat und die Sense- und Antisense-Primer. Die so erhaltenen DNAs wurden mit den gleichen Linkern, wie in Beispiel A-2(a) verwendet, unter den selben Bedingungen wie in Beispiel A-2(a) ligiert, wobei die rekombinanten DNAs „pBIgGPA/D364stp", „pBIgHA/MUT1", „pBIgHA/MUT2", „pBIgHA/MUT3" und „pBIgHA/MUT5" erhalten wurden. Tabelle 7 fasst die Templat-DNAs und die Nucleotidsequenzen der Sense- und Antisense-Primer, welche zur Herstellung der jeweiligen rekombinanten DNAs verwendet wurden, zusammen. Durch Sequenzieren in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel A-1(a) wurden die Strukturen dieser rekombinanten DNAs wie in den 10 bis 14 gezeigt bestätigt.
Die so erhaltenen rekombinanten DNAs wurden in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel A-2(a) behandelt, wobei die Transformationsvehikel „C-GPA/D364stp", „C-HA/MUT1", „C-HA/MUT2", „C-HA/MUT3" und „C-HA/MUT5" erhalten wurden.
Beispiel A-4(b)
Herstellung eines Polypeptids
Die in Beispiel A-4(a) erhaltenen Transformationsvehikel wurden gemäß den Verfahren wie in Beispiel A-2(b) kultiviert und die resultierenden Kulturüberstände wurden mit ähnlichen Verfahren zur Behandlung der Überstände von dem aufgebrochenen Zellmaterial wie in Beispiel A-1(b) behandelt: die Fällungen der Kulturüberstände mit Ammoniumsulfat, die Chromatographie der gefällten Lösungen unter Verwendung der Q SEPHAROSE FF COLUMN und die Chromatographie der eluierten Fraktionen unter Verwendung von L-ASPARAGINE AGAROSE in dieser Reihenfolge. Die so erhaltenen eluierten Fraktionen wurden unter Verwendung von Membranen in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel A-1(b) konzentriert, gefolgt von Unterziehen der Chromatographie unter Verwendung der HILOAD SUPERDEX 200 COLUMN, wobei die eluierten Fraktionen mit einem Molekulargewicht von etwa 140 kDa gesammelt wurden. Jedes dieser Systeme ergab die gereinigten Polypeptide mit einer Reinheit von 90 % oder höher in einer Ausbeute von etwa einem μg/ml Kultur. Diese gereinigten Polypeptide wurden durch die Verfahren wie in Beispiel A-1(c) analysiert, um ihre physikochemischen Eigenschaften zu untersuchen. Tabelle 8 zeigt die Ergebnisse, kombiniert mit jenen von Beispiel A-3.
Tabelle 8 zeigt, dass alle der vorliegenden Polypeptide, welche in Säugerzellen exprimiert und gereinigt wurden, eine L-Asparaginaseaktivität zeigten. Darüber hinaus zeigt Tabelle 8, dass die Polypeptide Tetramere bildeten.
Wie im vorstehenden Beispiel A gezeigt, zeigt jedes der Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung eine L-Asparaginaseaktivität. Deshalb hydrolysiert das vorliegende Agens für suszeptive Krankheiten L-Asparagin in Patienten, wobei therapeutische und vorbeugende Wirkungen auf L-Asparaginase-suszeptive Krankheiten ausgeübt werden, wenn es an einen Menschen verabreicht wird. Die Formulierung „suszeptive Krankheiten", wie in der vorliegenden Beschreibung bezeichnet, bedeutet im Allgemeinen Krankheiten, welche durch das Vorhandensein von Tumorzellen abhängig von L-Asparagin verursacht werden: Zum Beispiel Leukämien wie akute Leukämie, eine akute Transformation von chronischer Leukämie und T-lymphatischer Leukämie, und maligne Tumore wie Hodgkin-Krankheiten und non-Hodgkin-Krankheiten. Das vorliegende Agens für suszeptive Krankheiten kann folglich als Antitumoragens zur Behandlung und/oder Vorbeugung von solchen suszeptiven Krankheiten wie vorstehend verwendet werden. Obwohl es abhängig von den Typen von Agenzien_; welche für solche Zwecke verwendet werden, und den suszeptiven Krankheiten, die behandelt werden, variiert, wird das vorliegende Agens im Allgemeinen zu einem Agens in der Form einer Flüssigkeit, einer Paste oder eines Feststoffes verarbeitet, welche die Polypeptide in einer Menge von 0,000001 bis 100 % (w/w), bevorzugt 0,0001 bis 100 % (w/w) auf der Basis eines trockenen Feststoffes enthalten.
Das vorliegende Agens kann intakt oder verarbeitet zu Zusammensetzungen durch Mischen mit einem oder mehreren, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus physiologisch verträglichen Trägern, Exzipienten, Lösungsmitteln, Puffern und Stabilisatoren und ferner, wenn notwendig, anderen biologisch aktiven Substanzen und anderen Agenzien besteht, verwendet werden. Zum Beispiel erwähnen „Iyakuhin-Tenkabutsu-Jiten (The Dictionary of Pharmaceutical Excipients)" (1994), herausgegeben von Japan Pharmaceutical Excipients Council, Tokio, Japan, veröffentlicht von Yakujinippo LTD., Tokio, Japan und „Iyakuhin-Tenkabutsu-Jiten-Tsuiho 1995 (Supplement for The Dictionary of Pharmaceutical Excipients)" (1995), herausgegeben von Japan Pharmaceutical Excipients Council, Tokio, Japan, veröffentlicht von Yakujinippo LTD., Tokio, Japan, die Ausführungsformen von solchen Trägern, Exzipienten, Lösungsmitteln, Puffern und Stabilisatoren. Beispiele von solchen anderen biologisch aktiven Substanzen und anderen Agenzien schließen Interferon-α, Interferon-β, Interferon-γ, Interleukin 1, Interleukin 2, Interleukin 3, TNF-α, TNF-β, GM-CSF, Carboquon, Cyclophosphamid, Aclarbicin, Thiotepa, Busulfan, Ancitabin, Cytarabin, Fluorouracil, 5-Fluor-1-(tetrahydro-2-furyl)uracil, Methotrexat, Actinomycin D, Chromomycin A3, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Mercaptopurin, Prednisolon, Mitomycin C, Vincristin, Vinblastin, kolloidales Radiogold, Krestin^®, Picibanil, Lentinan und Maruyama-Vakzin ein.
Das vorliegende Agens für suszeptive Krankheiten schließt jene in einer Einheitsdosisform ein, was ein physikalisch getrenntes und geformtes Medikament bedeutet, welches zur Verabreichung geeignet ist und die Polypeptide in einer täglichen Dosis oder in einer Dosis von 1/40 bis zum Mehrfachen (bis zu 4-fach) der täglichen Dosis enthält. Beispiele von solchen Medikamenten sind Injektionen, Flüssigkeiten, Pulver, Granula, Tabletten, Kapseln, Lutschtabletten, Augenlösungen, Nasentropfen und Zäpfchen.
Das vorliegende Agens kann an Patienten oral oder parenteral verabreicht werden. Bei beiden Verabreichungen übt das Agens eine zufriedenstellende Wirkung bei der Behandlung und/oder der Vorbeugang der suszeptiven Krankheiten aus. Obwohl es abhängig von den Typen von suszeptiven Krankheiten und ihren Symptomen variiert, kann das Agens oral an Patienten verabreicht werden oder parenteral in intradermale Gewebe, subkutane Gewebe, Muskeln und Venen von Patienten verabreicht werden, in einer Dosis als Mengen der Polypeptide im Bereich von etwa 0,1 μg bis 500 mg/Verabreichung, bevorzugt etwa 0,1 bis 100 mg/Verabreichung, 1 bis 4 Mal/Tag oder 1 bis 7 Mal/Woche, für einen Tag bis zu einem Jahr. Das vorliegende Agens für suszeptive Krankheiten schließt ferner die Formen von Verwenden von Gentherapie ein. Wenn ein Transformationsvehikel, in welches die DNAs eingebracht wurden, die die Polypeptide dieser Erfindung codieren, an Patienten verabreicht wird, um in ihnen zu exprimieren, üben sie äquivalente Wirkungen wie die vorstehenden Verabreichungen aus. Zum Beispiel „Jikken-Igaku Bessatsu, Bio-manual Up Series, Idenshi-Chiryo-No-Kisogijutsu (Basic Techniques for Gene Therapy)" (1996), herausgegeben von Takashi SHIMADA, Izumi SAITO und Takaya OZAWA, veröffentlicht von Yodosha, Tokio, Japan, Details der allgemeinen Verfahren für die Gentherapie.
Die biologischen Aktivitäten und die akute Toxizität der vorliegenden Polypeptide werden basierend auf dem Versuch 3 bzw. 4 nachstehend erklärt.
Versuch 3
Biologische Aktivität
Versuch 3-1
Antitumorwirkung in vitro
Eine menschliche histiocytische Lymphomzelllinie U937 (ATCC CRL-1593) und eine Zelllinie Molt4 (ATCC CRL-1582), welche von menschlichen T-Lymphoblasten abgeleitet ist, wurden in RPMI 1640-Medium, welches 10 % (v/v) fötales Kälberserum enthielt, subkultiviert. Die Zellen, welche durch Zentrifugation von jedem Subkultursystem in der logarithmischen Phase gesammelt wurden, wurden im gleichen Medium suspendiert, um eine Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen/ml zu erhalten. Jeweils ein ml von jeder Zellsuspension wurde in jedes von 13 Wells von Multiwell-Platten mit 24 Wells „3047", welche kommerziell von Becton Dickinson Labware, New Jersey, U.S.A. vertrieben werden, gegeben. Nachdem jede der Verdünnungen von 12 Typen der in den Beispielen A-1 bis A-4 hergestellten gereinigten Polypeptide mit PBS ferner in jedes Well gegeben worden war, wurden die Zellen bei 37°C für 72 Stunden in einem Inkubator mit 5 % (v/v) CO₂ inkubiert. Die Endkonzentration von jedem der gereinigten Polypeptide war eine Einheit/ml als eine L-Asparaginaseaktivität. Als eine Kontrolle, nachdem ein äquivalentes Volumen an PBS zugegeben worden war, wurden die Zellen entsprechend kultiviert. Nach dem Kultivieren wurden die Zellen gesammelt, um abgestorbene Zellen mit Trypanblau anzufärben. Das Verhältnis des Überlebens der Zellen in jedem der Systeme mit den gereinigten Polypeptiden wurde mit dem in der Kontrolle verglichen. Alle Verhältnisse des Überlebens der Zellen mit den gereinigten Polypeptiden waren signifikant niedriger als das in der Kontrolle. Diese Ergebnisse zeigen, dass alle der in den Beispielen A-1 bis A-4 erhaltenen vorliegenden Polypeptide Cytotoxizität bei U937 und Molt4 aufweisen.
Versuch 3-2
Antitumorwirkung in vivo
Als Modellmäuse wurden C3H-Mäuse verwendet, wobei eine Mauslymphomzelllinie 6C3HED, welche im Cell Resource Center for Biomedical Research, Institute of Development Aging and Cancer, Tohoku Universität, Sendai, Japan registriert ist, mit Passagen durch subkutane Injektionen in ihre Seiten in einem Bereich von 1 × 10⁷ Zellen/Körper alle 8 Tage in einer herkömmlichen Weise transplantiert wurde. An die Modellmäuse wurden die in den Beispielen A-1 bis A-4 erhaltenen gereinigten Polypeptide im Bereich von 400 Einheiten/Körper durch intravenöse Injektion jeden Tag vom vierten bis zum siebten Tag, nachdem die Zellen transplantiert worden waren, verabreicht. Die Ausmaße der Tumore wurden mit bloßem Auge am vierten und achten Tag nach den Transplantationen beobachtet. Die gereinigten Polypeptide wurden verabreicht, nachdem sie mit 0,15 M NaCl verdünnt und mit Membranfiltern mit 0,45 μm Porengröße, welche kommerziell von Millipore Corp., Bedford, U.S.A. vertrieben werden, filtriert worden waren. Als eine Kontrolle wurde entsprechend mit 0,15 M NaCl behandelt. Während signifikante Vergrößerungen der Tumore bei der Kontrolle beobachtet wurden, wurden signifikante Rückbildungen oder ein Verschwinden der Tumore bei Mäusen beobachtet, welchen die Polypeptide verabreicht wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass alle der in den Beispielen A-1 bis A-4 erhaltenen vorliegenden Polypeptide in der Lage sind, die Tumore von Modellmäusen zu heilen.
Versuch 4
Akute Toxizität
Die in den Beispielen A-1 bis A-4 erhaltenen gereinigten Polypeptide wurden getrennt perkutan, peroral oder intraperitoneal gemäß einer herkömmlichen Weise an 8 Wochen alte Mäuse verabreicht. Die LD₅₀-Werte von allen Polypeptiden betrugen unabhängig von den Verabreichungswegen etwa 100 mg/kg oder mehr. Diese Ergebnisse bewiesen, dass die vorliegenden Polypeptide sicher in Apothekerwaren zur Verabreichung an einen Menschen eingebracht werden können.
Die folgenden Beispiele erklären das vorliegende Agens für suszeptive Krankheiten.
Beispiel B-1
Lösug
Die in den Beispielen A-1 bis A-4 erhaltenen gereinigten Polypeptide wurden getrennt gelöst, um eine Konzentration von 0,1 mg/ml in physiologischer Salzlösung, welche ein % (w/v) menschliches Serumalbumin als einen Stabilisator enthielt, zu ergeben, und mit Membranfiltern gemäß einer herkömmlichen Weise sterilisiert, um Lösungen zu erhalten.
Alle Produkte weisen zufriedenstellende Stabilitäten als und können als Injektionen, Augenlösungen, Nasenspülung bei der Behandlung und/oder der Vorbeugung von suszeptiven Krankheiten, einschließlich einem malignen Tumor, akuter Leukämie, einem malignen Lymphom, einer akuten Transformation von chronischer Leukämie, T-lymphatischer Leukämie, verwendet werden.
Beispiel B-2
Lösung
Die in den Beispielen A-1 bis A-4 erhaltenen gereinigten Polypeptide wurden getrennt gelöst, um eine Konzentration von 0,1 mg/ml in physiologischer Salzlösung, welche ein % (w/v) Glycerol als einen Stabilisator enthielt, zu ergeben, und mit Membranfiltern gemäß einer herkömmlichen Weise sterilisiert, um Lösungen zu erhalten.
Alle Produkte weisen zufriedenstellende Stabilitäten auf und können als Injektionen, Augenlösungen, Nasenspülung zur Behandlung und/oder zur Vorbeugung von suszeptiven Krankheiten, einschließlich einem malignen Tumor, akuter Leukämie, einem malignen Lymphom, einer akuten Transformation von chronischer Leukämie und T-lymphatischer Leukämie, verwendet werden.
Beispiel B-3
Trockeninjektion
Die in den Beispielen A-1 bis A-4 erhaltenen gereinigten Polypeptide wurden getrennt gelöst, um eine Konzentration von 50 mg/ml in physiologischer Salzlösung, welche ein % (w/v) gereinigte Gelatine als einen Stabilisator enthielt, zu ergeben, und die Lösungen wurden mit Membranfiltern gemäß einer herkömmlichen Weise sterilisiert. Ein ml-Aliquote der sterilisierten Lösungen wurden auf Fläschchen verteilt, gefriergetrocknet und mit einem Deckel verschlossen.
Alle Produkte weisen zufriedenstellende Stabilitäten auf und können als Trockeninjektionen zur Behandlung und/oder zur Vorbeugung von suszeptiven Krankheiten, einschließlich einem malignen Tumor, akuter Leukämie, einem malignen Lymphom, einer akuten Transformation von chronischer Leukämie und T-lymphatischer Leukämie, verwendet werden.
Beispiel B-4
Salbe
„HI-BIS-WAKO 104", ein Carboxyvinylpolymer, welches kommerziell von Wako Pure Chemicals, Tokio, Japan vertrieben wird, und eine gereinigte Trehalose wurden in sterilisiertem destilliertem Wasser gelöst, um Konzentrationen von 1,4 % (w/w) bzw. 2,0 % (w/w) zu ergeben, und die in den Beispielen A-1 bis A-4 erhaltenen gereinigten Polypeptide wurden getrennt in die Lösungen bis zur Homogenität gemischt, gefolgt von Einstellen des pH-Wertes der resultierenden Lösungen auf einen pH-Wert von 7,2, um Pasten zu erhalten, welche etwa ein mg/g der Polypeptide enthalten.
Alle Produkte weisen zufriedenstellende Ausbreitungsfähigkeiten und Stabilitäten auf und können als Salben zur Behandlung und/oder Vorbeugung von suszeptiven Krankheiten, einschließlich einem malignen Tumor, akuter Leukämie, einem malignen Lymphom, einer akuten Transformation von chronischer Leukämie und T-lymphatischer Leukämie, verwendet werden.
Beispiel B-5
Tablette
Jedes der in den Beispielen A-1 bis A-4 erhaltenen gereinigten Polypeptide und LUMIN, d.h. [Bis-4-(1-ethylchinolin)][γ-4'-(1-ethylchinolin]pentamethionincyanin, als ein Zellaktivierungsmittel wurden bis zur Homogenität mit „FINETOSE^®", eine wasserhaltige kristalline α-Maltose, welche kommerziell von Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japan vertrieben wird, gemischt und die Gemische wurden durch eine Tablettiermaschine tablettiert, um Tabletten mit jeweils einem Gewicht von etwa 200 mg zu erhalten, welche jeweils etwa 5 mg des Polypeptids und des LUMIN enthalten.
Alle Produkte weisen zufriedenstellende Schluckvermögen, Stabilitäten und Zellaktivierungsaktivitäten auf und können zur Behandlung und/oder Vorbeugung von suszeptiven Krankheiten, einschließlich einem malignen Tumor, akuter Leukämie, einem malignen Lymphom, einer akuten Transformation von chronischer Leukämie und T-lymphatischer Leukämie, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung basiert auf den Befunden von Polypeptiden, welche von einem Säuger stammen und L-Asparaginaseaktivität aufweisen. Die Polypeptide sind Substanzen, von welchen die Aminosäuresequenzen vollständig enthüllt wurden und weisen stabile Aktivitäten zur Hydrolyse von L-Asparagin auf. Deshalb üben die Polypeptide zufriedenstellende Wirkungen bei der Behandlung und/oder der Vorbeugung von Krankheiten, welche durch Tumorzellen abhängig von L-Asparagin verursacht werden, aus.
Die Polypeptide stammen von einem Säuger, so dass sie niedrige Antigeneigenschaften für den Menschen aufweisen und keine schwerwiegenden Nebenwirkungen verursachen, sogar wenn sie in großen Mengen oder kontinuierlich verabreicht werden. Deshalb weisen die Polypeptide den Vorteil auf, dass sie gewünschte Wirkungen ausüben können, ohne eingeschränkte Kontrollen auf Empfindlichkeiten des Patienten.
Die so nützlichen Polypeptide können in gewünschten Mengen unter Verwendung der vorliegenden DNAs, welche sie codieren, hergestellt werden.
Folglich ist die vorliegende Erfindung eine wesentliche Erfindung, welche eine beträchtliche Wirkung hat und einen großen Beitrag auf diesem Gebiet leistet.
Obwohl beschrieben wurde, was momentan als bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betrachtet wird, gilt es als selbstverständlich, dass verschiedene Modifizierungen dabei durchgeführt werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, welches L-Asparaginaseaktivität und eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nos: 6 bis 9 und Mutanten davon, aufweist, welche eine Deletion und/oder eine Addition einer oder mehrerer Aminosäuren an den N- und/oder C-Termini der SEQ ID Nos: 6 bis 9 aufweisen, wobei besagte mutante Polypeptide keine Fehler in ihrer L-Asparaginaseaktivität im Vergleich zu den Polypeptiden der SEQ ID Nos: 6 bis 9 aufweisen.
DNA, welche das Polypeptide, wie in Anspruch 1 beansprucht, codieren.
Agens für suszeptive Krankheiten, welches das Polypeptide des Anspruch 1 als einen wirksamen Bestandteil umfasst.
Das Agens nach Anspruch 3, wobei besagte Krankheiten maligne Tumore, Leukämien und Lymphome sind.