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TECHNISCHES
GEBIET
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Die
gegenwärtige
Erfindung betrifft eine neue N-Acetylglucosaminyltransferase
(GlcNAc-Transferase), die eine spezifische Zuckerkettenstruktur
in einem Saccharid erkennt und darin eine GlcNAc-β-1→4-Verzweigungsstruktur
einführt.
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STAND DER TECHNIK
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1. GLYCOPROTEINE
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Die
meisten Proteine, die in der Natur auftreten, sind nicht einfache
Proteine, die nur aus Aminosäuren bestehen,
sondern "reife" Proteine mit Zuckerketten
und anderen Substanzen, z.B. Phosphaten und Lipiden, die daran angebunden
sind. Daher hat die Entwicklung von einfachen proteinartigen Produkten,
erzeugt durch Escherichia coli als Wirt verschiedene Probleme mit
sich gebracht, da solchen Produkten der Reifungsprozess der Proteine
fehlt. Da alle physiologisch aktiven Proteine vom Sekretionstyp
(z.B. Cytokine) Glycoproteine sind, mit nur einigen Ausnahmen, haben
Funktion und Rolle der Zuckerketten die Aufmerksamkeit als besonders
wichtigen Punkt bei der Entwicklung biologischer Pharmazeutika auf
sich gezogen.
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Zuckerketten
in Glycoproteinen werden grob in den Asn-gebundenen Typ, den Mucin-Typ, den O-gebundenen
GlcNAc-Typ, den GPI-Ankertyp und den Proteoglycan-Typ klassifiziert
[Makoto Takeuchi, "Glycobiology
Series 5: Glycotechnology",
Kihata, Hakomori und Nagai (Autoren), Kodansha Scientific Co., (1994), 191–208]. Jeder
dieser Typen von Zuckerketten hat seinen eigenen Biosyntheseweg
und eine diskrete physiologische Funktion. Asn-gebundene Zuckerketten
sind weit verbreitet in Schimmelpilzen, Hefen, Insekten, Pflanzen
und Tieren. Der zugrundeliegende Biosyntheseweg für Asn-gebundene
Zuckerketten ist zwischen den Arten konserviert (1).
Eine Zuckerkette(ketten), die für
eine spezifische Art charakteristisch ist (sind), wird auf der äußeren Seite
(die als die "nicht-reduzierende
Endseite" bezeichnet
wird) des Kernzuckerkettenbestandteils, die in der Biosynthese von
Asn-gebundenen Zuckerketten üblich ist,
gebildet. Eine Mannanartige Zuckerkette, worin α-1,3- und α-1,2-verzweigte Mannosereste
sich an eine Hauptkette anbinden, die über α-1,6-Bindungen fortgeführt wird,
ist eine Zuckerkettenstruktur, die für Pilze, wie z.B. Hefen charakteristisch
ist (siehe Panel a in 2) [Hiroshi Nakajima, Sugar
Chain Technology, Industry Survey Association (1992), 384–397]. Andererseits
wird bei Insekten, Pflanzen und Tieren die Verlängerungen von Mannoseresten
nicht beobachtet; stattdessen wird eine hoch Mannose-haltige Zuckerkette
gebildet, worin eine Zuckerkette von einem Dolicholintermediat übertragen
und nur getrimmt wird (siehe Panel c in 2). Eine
einzigartige Struktur mit einer charakteristischen Xylose oder ähnlichem
(siehe Panel b in 2) wird ebenfalls bei Insekten,
Pflanzen und Mollusken beobachtet. Bei Tieren werden charakteristische
Zuckerkettenstrukturen, wie z.B. Zuckerketten mit komplexer Struktur
(Panel e in 2) und Zuckerketten mit einer
Hybridstruktur (Panel d in 2) beobachtet;
bei der letzteren werden GlcNAc-Verzweigungsstrukturen in einer
früher
getrimmten Zuckerkette gebildet und die Zugabe anderer Arten von
Monosaccariden, wie z.B. Galactose und Sialinsäuren bildet komplizierte Strukturen;
bei der letzteren liegen sowohl eine Zuckerkette vom komplexen Typ
als auch eine Zuckerkette vom hoch Mannose-haltigen Typ vor [Kiyoshi Furukawa,
Sugar Chain Technology, Industry Survey Association (1992), 64–75].
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Solche
Zuckerketten, wie oben beschrieben, werden auf den meisten Zellenoberflächenproteinen
und Sekretionsproteinen ausgebildet und man nimmt an, dass sie wichtige
Rollen spielen, die die Natur und Eigenschaften der Zellen und Proteine
bestimmen. Unter allen wird der Teil einer Zuckerkettenstruktur,
der eine Verzweigung bildet, und der sich wie Antennen von der gemeinsamen
Kernzuckerkette erstreckt, eine Zuckerkettenverzweigungsstruktur
genannt. Man nimmt an, dass diese Struktur die Funktion ausübt, einen
Organismuserkennungsliganden (d.h., dem Endbereich der Zuckerkette)
einen hohen Grad einer Freiheit zu verleihen, um dadurch Chancen
für eine
Multipunkterkennung und andere Funktionen bereitzustellen um die
Schutzfähigkeit
für den
Proteinbestandteil durch deutliche Erhöhung des raumeinnehmenden Volumens
zu maximieren (Takeuchi et al., supra). Durch Kontrolle der Verzweigungsstruktur
von Zuckerketten ist es daher möglich,
die physiologischen Funktionen, wie z.B. die in vivo Stabilität, die in
vivo Kinetik und die Organ-Zielführungseigenschaften
von Glycoproteinen auf verschiedene Weisen zu modifizieren. Im Hinblick
hierauf wird angenommen, dass eine Technologie zur Kontrolle der
Verzweigungsstrukturen von Zuckerketten eine Biotechnologie der nächsten Generation
für die
Entwicklung von Glycoprotein-artigen Pharmazeutika ist, die "für den Menschen sanft sind".
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2. PHYSIOLOGISCHE
BEDEUTUNG VON GLYCOPROTEINZUCKERKETTEN
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Zuckerketten
der Glycoproteine vom Sekretionstyp zeigen exzellente Funktionen
in der Biosynthese, der intrazellulären Sortierung, der Maskierung
der Antigenizität,
der in vivo Stabilität
und der Organ-Zielfüllungseigenschaften
von Glycoproteinen. Zuckerketten von Zelloberflächenproteinen verändern sich
bekanntlich als Reaktion auf Veränderungen
bei Zellen (wie z.B. eine Differenzierung, eine Veränderung
in einen morbiden Zustand, eine Krebsbildung). Insbesondere wurde
berichtet, dass es eine enge Beziehung zwischen der Metastase von
Krebs und der Verzweigungsstruktur von Zuckerketten gibt.
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(1) Maskierung der Antigenizität
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Es
wird angenommen, dass Zuckerketten einen hohen Freiheitsgrad im
Hinblick auf ihre sterische Struktur aufweisen und sich so frei
wie Propeller bewegen. Daher werden Proteinmoleküle, wie z.B. Proteasen und
Antikörper
gegen Proteine, die keine Affinität für Zuckerketten aufweisen, durch
die Zuckerketten abgeschüttelt
und können
daher nicht Zugang zu dem Proteinbestandteil gewinnen. Selbst wenn
es eine Antigenizität
in dem Peptidbestandteil nahe der Zuckerkettenbindungsstellen gibt,
können
im Ergebnis daher Antikörpermoleküle keinen
Zugang zu dem Peptidbestandteil gewinnen. So kann eine Antigen-Antikörperreaktion kaum
auftreten. Wenn weiter ein Glycoprotein durch einen Macrophagen
gefangen wurde und die Abbauprodukte als Antigen präsentiert
werden, ist es für
die Peptide um die Zuckerkettenbindungsstelle schwierig Zugang zu
den Rezeptoren zu gewinnen. Daher tritt eine antigene Stimulierung
nur schwierig auf. Tatsächlich wird
berichtet, dass wenn Zuckerketten in den zentralen Bereich des antigenen
Peptids von Ovalbuminlysozym eingeführt wurden, die Bindung von
MHC-Klasse-II-Molekülen an das
Antigen deutlich inhibiert ist [Mouritsen, S., Meldal, M., Christiansen-Brams,
I., Elsner, H. und Werdelin, O., Eur. J. Immunol., (1994), 24, 1066–1072].
Die Wirkung einer solchen Maskierung der Antigenizität wird größer, wenn
das von den Zuckerketten besetzte Volumen größer ist. Daher wird angenommen,
dass die Entwicklung einer Verzweigungsstruktur zu der Wirkung einer
solchen Maskierung deutlich beiträgt.
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(2) In vivo Stabilität
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Im
Hinblick auf Erythropoietin, wobei es sich um das erste Pharmazeutikum
vom Glycoproteintyp handelt, das jemals aus einer transgenen tierischen
Zelle als Wirt erzeugt wurde, wurden die Funktionen seiner Zuckerketten
intensiv untersucht. Im Ergebnis wurde gezeigt, dass die Zuckerketten
von Erythropoietin inhibitorisch gegen seine Bindung an seinen Rezeptor
wirken, jedoch einen entscheidenden Beitrag zum Erhalt der aktiven
Struktur und der Verbesserung der in vivo Kinetik leisten; insgesamt
wurde gezeigt, dass die Zuckerketten für die Expression der pharmakologischen
Aktivität
von Erythropoietin essentiell sind. [Takeuchi, M. und Kobata, A.,
Glycobiology 81991), 1, 337–346].
Insbesondere wurde eine enge Korrelation zwischen der Anzahl der
Antennen der Zuckerketten und der pharmakologischen Wirkung von
Erythropoietin angetroffen und so wurde die Wichtigkeit der Verzweigungsstruktur
(einer Verzweigungsstruktur, gebildet durch GlcNAc-Reste, die sich
an die Kernzuckerkette anheften), die früher niemals Aufmerksamkeit
auf sich gezogen hatte, zum ersten mal deutlich gemacht [Takeuchi,
M., Inoue, N., Strickland, T. W., Kobata, M., Wada, M., Shimizu,
R., Hoshi, S., Kozutsumi, H., Takasaki S. und Kobata, A., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, (1989), 86, 819–22] Der Hauptgrund für das obige
Phänomen
wird wie folgt erklärt:
Erythropoietin ohne eine entwickelte Verzweigungsstruktur wird sehr
schnell in der Niere entsorgt und im Ergebnis wird die in vivo Aufenthaltszeit
eines solchen Erythropoietins kürzer
[Misaizu, T., Matsuki, S., Strickland, T. W., Takeuchi, M., Kobata,
A. und Takasaki, S., Blood, (1995), 86, 4097–4104].
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(3) Organ-Zielführungseigenschaft
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Die
meisten biologischen Gewebe weisen Lectinähnliche Rezeptoren auf und
verwenden sie in Zell-Zell-Wechselwirkungen
oder zur Aufnahme von Glycoproteinen aus Blut. Das Asialoprotein-bindende
Lectin in der Leber ist ein repräsentatives
Beispiel für
ein Clearance-System für
gealterte Glycoproteine [Toshihiro Kawasaki, Sugar Chain Technology,
Industry Survey Association (1992), 125–136]. Zusätzlich sind Selectin, enthalten
in den vaslulären
Endothelzellen, Thrombocyten und Leucocyten (Kawasaki, supra) und
der Lectin-Rezeptor, der auf der Oberfläche von Macrophagen und NK-Zellen
vorliegt (Kawasaki, supra) wohl bekannt. Weiterhin ist bekannt,
dass sich nicht nur Glycoproteine sondern auch Zellen in spezifischen
Geweben unter Verwendung von Zuckerketten als Liganden ansammeln.
Fälle eines
Heranführens
von Knochenmarkzellen [Tatsuo Irimua, "Glycobiology Series 3: Glycobiology
in Cell Society",
Katsutaka Nagai, Senichiro Hakomori und Akira Kobata (Hrsg.), Kodansha
Scientific Co., (1993), 127–175]
und des Heranführens
von Neutrophilen zu entzündlichen
Stellen (Irimura, supra) wurden im Detail untersucht. Wenn man all
diese Dinge zusammen betrachtet, kann wohl angenommen werden, dass
Glycoproteine und Zellen über
ihre Zuckerkettenstrukturen eine zielführende Eigenschaft zu spezifischen
Organen oder Geweben, die einen Lectinrezeptor aufweisen, in der
Blutzirkulation aufweisen, obwohl ein solches Zielführungssystem
nicht in allen Organen angetroffen wird. Dies bedeutet, dass die
Arzneimittelzufuhr durch Zuckerketten möglich ist. Bei einer solchen Arzneimittelzufuhr
wird die Affinität
des Lectins für
die Zuckerketten durch den Grad der Freiheit und die Anzahl der
Zuckerkettenliganden stark beeinflusst. Daher wird die Verzweigungsstruktur
von Zuckerketten ein sehr wichtiger Punkt bei einer solchen Arzneimittelzufuhr
sein.
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(4) Korrelation zwischen
der Veränderung
von Zellen zu einem morbiden Zustand und ihrer Zuckerkettenverzweigungsstruktur
[Junko Kato, Naoko Suzuki, "Sugar
Chain Technology and Development for Pharmaceutical", Foundation for
the Relief and Study of Injury Caused by Pharmaceutical Side Effect
(Hrsg.), Yakugyo-Jiho-Sha, (1994), 107–13214].
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Es
wurde früher
ein Pflanzenlectin, das als L-PHA bezeichnet wurde, als Sonde zum
Nachweis einer sich vielfach verzweigenden Zuckerkettenstruktur
entwickelt und es wurde dadurch möglich, verschiedene Proben
von kranken Geweben zu überprüfen. Im
Ergebnis wurde eine Tendenz angetroffen, dass einige Arten von Krebszellen,
insbesondere Krebszellen mit einer hohen Metastasefähigkeit
gut mit L-PHA angefärbt
werden. So wurden die Forscher auf eine Korrelation zwischen der
Verzweigungsstruktur von Zuckerketten und der Metastasefähigkeit
von Krebszellen aufmerksam. Menschliches Choriongonadotropin (hCG)
ist ein Glycoproteinhormon, das Villusgeweben kräftig in einen frühen Zustand
einer Schwangerschaft biosynthetisch hergestellt wurde. Da eine
deutliche Menge hCG in den Urin abgegeben wird, wird hCG klinische
als Indikator für eine
Schwangerschaft verwendet. Die Asn-gebundenen Zuckerketten, die
im wesentlichen durch die mono- und biantennären Komplextypketten gebildet
werden, sind für
hCG charakteristisch. Wenn sich Krebs zu einer Malignität von einem
Trophoblastom zu einem invasiven Tumor erhöht und von einem invasiven
Tumor zu einem Chorionkarcinom wurde berichtet, dass 2,4,2-Typ tri-antennäre Zuckerketten
und abnormale biantennäre Zuckerketten
(beide werden durch die Wirkung von GnT-IV auf normale biantennäre bzw.
mono-antennäre
Zuckerketten gebildet) in den Zuckerketten von hCG auftreten [Katsuko
Yamashita, Protein, Nucleic Acid and Enzyme (1992), 37, 1880–1888].
Als Grund für
dieses Phänomen
wird vorgeschlagen, dass die Aktivität von GnT-IV ansteigt, wenn
die Malignität
des Chorionkarcinoms fortschreitet.
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γ-Glutamyltranspeptidase
(γ-GTP)
ist ein Glycoprotein, das insbesondere im Überfluss in der Leber vorliegt.
Da das Serum γ-GTP-Niveau
drastisch ansteigt, wenn es eine Lebererkrankung gibt, wird dieses
Niveau als klinischer Indikator einer Lebererkrankung verwendet.
Weiterhin haben Yamashita et al. [Yamashita, K., Totani, K., Iwaki,
Y., Takamisawa, I., Takeishi, N., Higashi, T., Sakamoto, Y. und
Kobata, A., J. Biochem., (1989), 05, 728–735] festgestellt, dass die
Zuckerkettenstruktur von γ-GTP
als Ergebnis einer Krebsbildung von Zellen sich abnormal in ihrer
Verzweigungsstruktur ähnlich
wie diejenige bei abnormalem hCG verändert; so haben sie über eine
Korrelation zwischen einer Krebsbildung und der Aktivierung von
GnT-IV berichtet. Die Asn-gebundenen Zuckerketten von γ-GTP, abgeleitet
von gesunden menschlichen Leberzellen, bestehen im wesentlichen
aus einer Zuckerkette vom biantennären Komplextyp mit geringen
Mengen tri-antennärer
und tetra-antennärer
Zuckerketten die damit vermischt sind. Demgegenüber wurde ein deutlicher Anstieg
im Grad der Verzweigung bei den Asn-gebundenen Zuckerketten von γ-GTP, abgeleitet
von menschlichen Hepatomzellen beobachtet. Gleichzeitig traten,
wenn auch in geringen Mengen, Zuckerketten vom hoch Mannose-haltigen
Typ und Zuckerketten mit abnormal biantennären Zuckerketten auf (die beide
bei γ-GTP
aus normalen Zellen nicht beobachtet wurden). Als Grund für diese
Veränderungen
in der Zuckerkettenstruktur wurde die Möglichkeit vorgeschlagen, dass
N-Acetylglucosaminyltransferase IV (GnT-IV) und V (GnT-V) in bezug
auf die Krebsbildung von Leberzellen aktiviert werden (Yamashita
et al., supra).
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Es
wird auch berichtet, dass die Zuckerkettenverzweigungsstruktur eines
Glycoproteins in Zellen deutlich durch eine virale Infektion verändert wird
(Yamashita et al., supra). BHK-Zellen weisen eine Zuckerkettenstruktur
mit einer Verzweigung bis zum tetraantennären Typ auf. Wenn BHK-Zellen
mit einem Polyomavirus transformiert werden, nehmen die Zuckerketten
vom biantennären
Typ in den von den Zellen erzeugten Glycoprotein-Zuckerketten ab, während die Zuckerketten vom
tetraantennären
Typ und die N-Acetyllactosamin-Wiederholungsstrukturen
ansteigen. Insgesamt wird ein deutlich Anstieg der Zahl von Verzweigungen
erkannt [Takasaki, S., Ikehira, H. und Kobata, A., Biochem. Biophys.
Res. Commun., (1980), 90, (3), 735–742]. Als Grund für diese
obige Veränderung
kann eine Aktivierung von GnT-IV, GnT-V und i-GnT in betracht gezogen
werden.
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3. ENZYME, DIE DIE ZUCKERKETTENVERZWEIGUNGSSTRUKTUREN
VON GLYCOPROTEINEN BETREFFEN
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Die
Zuckerkette vom komplexen Typ, wobei es sich um eine Glycoprotein-Zuckerkettenstruktur
handelt, die für
Tiere charakteristisch ist, weist eine komplizierte Verzweigungsstruktur
auf, worin sich N-Acetylglucosamin (GlcNAc)-Reste an die gemeinsame
Kernstruktur auf verschiedene Weisen anbinden (Kiyoshi Furukawa,
supra) (1). Da diese Verzweigungsstruktur
in enger Beziehung mit der in vivo und in vito Stabilität, der Lokalisierung,
der biologischen Aktivität
und der pharmakologischen Eigenschaft der Glycoproteine steht (Makoto
Takeuchi, supra), wurde der Biosyntheseprozess der Verzweigungsstruktur
im Detail untersucht. Durch Verwendung von erfinderischen Substraten
haben H. Schachter et al. die verschiedenen Enzymaktivitäten im Hennen-Oviduct
unterschieden um dadurch die Gegenwart von GlcNAc-verzweigungsbildenden
Enzymen von GnT-I bis GnT-VI vorherzusagen (Gruppe der GlcNAc-Gylcosyltransferasen; 3)
[Glesson, P. A. und Schachter, H., J. Biol. Chem., (1983), 258,
6162–6173].
Danach wurden GnT-I [Kumar, R., Yang, J., Larsen, R. D. und Stanley,
P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1990), 87, 9948–9952; Sarkar, M., Hull, E.,
Nishikawa, Y., Simpson, R. J., Moritz, R. L., Dunn, R. und Schachter,
H., Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1991), 88, 234–238], GnT-II [D'Agostaro, GA., Zingoni,
A., Moritz, RL., Simpson, RJ:, Schachter, H. und Bendiak, BG., J. Biol.
Chem., (1995), 270, 15211–21],
GnT-III [Nishikawa, A., Ihara, Y., Hatakeyama, M., Kangawa, K. und
Taniguchi, N., J. Biol. Chem., (1992), 267, 18199–18204]
und GnT-V [Shorebah, M. G., Hindsgaul, O. und Pierce, M., J. Biol.
Chem., (1992), 267, 2920–2927;
Gu, J., Nishikawa, A., Turuoka, N., Ono, M., Yamaguchi, N., Kangawa,
K. und Taniguchi, N., J. Biochem., (1993), 113, 614–619] aufeinanderfolgend
gereinigt und die Gene hierfür
wurden kloniert. Mit diesen bekannten GlcNAc-Transferasen allein
ist es jedoch unmöglich
die Hauptzuckerkette zu bilden (tetraantennärer Typ; siehe unten stehende
Formel) die in einem α 1-Säureglycoprotein angetroffen
wird, das als repräsentatives
menschliches Blutglycoprotein bekannte ist [Yoshima, K., Tsuji,
T., Irimura, T. und Osawa, T., J. Biol. Chem., (1984), 256, 10834–10840]
und Erythropoietin [Takeuchi, M., Takasaki, S., Shimada, M. und
Kobata, A., J. Biol. Chem., (1990), 265, 12127–12130]. Daher wurde nach einer
N-Acetylglucosaminyltransferase mit einer solchen Substratspezifität und Reaktionsspezifität, die bei
GnT-IV erwartet werden, als fehlendes Bindeglied gesucht.
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Zuckerkettenstruktur
vom Tetraantennen-Typ
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Zusätzlich zu
den oben erwähnten
wurden die folgenden N-Acetylglucosaminyltransferasen gereinigt oder
ihre Gene kloniert: eine Transferase, die auf Zuckerketten vom Mucin-Typ
wirkt [Bierhuizen, M. F., Maemura, K. und Fukuda, M., J. Biol. Chem.,
(1994), 269, 44473–4479],
eine Transferase, die auf Glycolipide wirkt und eine Transferase,
die das Zuckerkettenepitop bildet, das als I-i-Antigenstruktur bekannt
ist [Kawashima, H., Yamamoto, K., Osawa, T. und Irimura, T., J.
Biol. Chem., (1993), 268, 27118–27126;
Bierhuizen, M. F., Mattei, M. G. und Fukuda, M., Genes Dev., (1993),
7, 468–478].
Die Substratspezifität
der Transferasen und ihre Bindungsweise der GlcNAc- Gruppe, übertragen
durch diese Transferasen, unterscheiden sich jedoch von denjenigen
von GnT-IV. Keiner dieser Transferasen ergab Produkte, die den GnT-IV-Produkten ähnelten.
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OFFENBARUNG
DER ERFINDUNG
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Enzym mit einer β 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase
(hiernach bezeichnet als "GnT-IV") -Aktivität bereitzustellen;
ein Gen, das dieses Enzym kodiert; eine rekombinante DNA, umfassend
das Gen; eine Zelle, die die rekombinante DNA enthält; ein
Verfahren zur Erzeugung eines Enzymproteins mit einer GnT-IV-Aktivität, umfassend
das Kultivieren der Zellen in einem Medium; und ein Saccharid, worin
die Zuckerketten durch GnT-IV modifiziert werden.
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Um
die obigen Aufgaben zu lösen,
haben die gegenwärtigen
Erfinder intensive und ausgedehnte Forschungen durchgeführt. Im
Ergebnis haben die Erfinder ein GnT-IV-Enzymprotein aus dem Dünndarm von
Rindern isoliert und gereinigt und die biochemischen Eigenschaften
des Proteins gekennzeichnet. Dann waren die Erfinder erfolgreich
bei der Klonierung eines Gens von einer cDNA-Bibliothek, das bovines
GnT-IVa kodiert und der mRNA des Dünndarms, basierend auf einer
Teil-Aminosäuresequenz
des oben Enzymproteins. Weiterhin, basierend auf einem bovinen GnT-IVa-Gen
waren die Erfinder erfolgreich bei der Klonierung von zwei Genen,
die für
menschliches GnT-IVa und menschliches GnT-IVb kodieren, aus cDNA-Bibliotheken
und mRNAs von menschlicher Leber bzw. menschlicher Lunge. Die gegenwärtige Erfindung
wurde durch die Bestätigung
vervollständigt,
dass die Produkte dieser Gene eine GnT-IV-Aktivität ausüben.
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Die
erste Erfindung der gegenwärtigen
Anmeldung betrifft ein GnT-IV mit einer Aktivität zur Erzeugung eines Saccharids
mit einer Teilstruktur, dargestellt durch die Formel unten:
unter Verwendung von UDP-GlcNAc
als Zuckerdonor und einem Saccharid mit einer Teilstruktur, dargestellt durch
die unten stehende Formel als Zuckerrezeptor:
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Die
zweite Erfindung betrifft ein GnT-IV, bestehend aus der Aminosäuresequenz,
wie dargestellt in SEQ ID NO: 18, oder der Aminosäuresequenz,
dargestellt in SEQ-ID NO: 18, mit einer Addition, Deletion oder Substitution
von ein oder mehr Aminosäureresten
und noch immer einer GnT-IV-Aktivität; ein GnT-IV, bestehend aus
der Aminosäuresequenz,
dargestellt in SEQ ID NO: 24, oder der Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ
ID NO: 24, mit einer Addition, Deletion oder Substitution von ein
oder mehr Aminosäureresten
und noch immer einer GnT-IV-Aktivität; und ein GnT-IV, bestehend
aus der Aminosäuresequenz,
wie dargestellt in SEQ ID NO: 37, oder der Aminosäuresequenz,
dargestellt in SEQ-ID NO: 37, mit einer Addition, Deletion oder
Substitution von ein oder mehr Aminosäureresten und noch immer einer
GnT-IV-Aktivität.
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Die
dritte Erfindung betrifft ein GnT-IV-Gen, kodierend für ein GnT-IV,
bestehend aus der Aminosäuresequenz,
wie dargestellt in SEQ ID NO: 18 oder der Aminosäuresequenz, dargestellt in
SEQ ID NO: 18 mit einer Addition, Deletion oder Substitution von
ein oder mehr Aminsäureresten,
und noch immer einer GnT-IV-Aktivität; ein GnT-IV-Gen, kodierend
für ein
GnT-IV, bestehend aus der Aminosäuresequenz,
wie dargestellt in SEQ ID NO: 24 oder der Aminosäuresequenz, dargestellt in
SEQ ID NO: 24 mit einer Addition, Deletion oder Substitution von
ein oder mehr Aminsäureresten,
und noch immer einer GnT-IV-Aktivität; ein GnT-IV-Gen, kodierend
für ein
GnT-IV, bestehend aus der Aminosäuresequenz,
wie dargestellt in SEQ ID NO: 37 oder der Aminosäuresequenz, dargestellt in
SEQ ID NO: 37 mit einer Addition, Deletion oder Substitution von
ein oder mehr Aminsäureresten,
und noch immer einer GnT-IV-Aktivität; ein GnT-IV-Gen, bestehend
aus der Nucleotidsequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 17; ein
GnT-IV-Gen, bestehend aus der Nucleotidsequenz, wie dargestellt
in SEQ ID NO: 23; und ein GnT-IV-Gen, bestehend aus der Nucleotidsequenz,
wie dargestellt in SEQ ID NO: 36.
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Die
vierte Erfindung betrifft eine rekombinante DNA, erhältlich durch
Insertion von einem der obigen GnT-IV-Gene in eine Vektor-DNA; und
ein Chromosomenfragment, umfassend einen Teil oder die Gesamtheit von
einem der obigen GnT-IV-Gene.
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Die
fünfte
Erfindung betrifft eine Wirtszelle, die die obige rekombinante DNA
trägt,
und eine Wirtszelle, in die das obige chromosomale Fragment künstlich
eingeführt
wird.
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Die
sechste Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines GnT-IV,
umfassend die Kultivierung der obigen Wirtszelle in einem Medium
und die Gewinnung von GnT-IV aus der resultierenden Kultur; und
ein Verfahren zur Erzeugung von GnT-IV, umfassend die Gewinnung
des GnT-IV-Enzyms aus den Sekreten, Körperflüssigkeiten oder einem Homogenat,
das von der obigen Wirtszelle abstammt.
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Die
siebte Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von GnT-IV
aus biologischen Proben.
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Die
achte Erfindung betrifft ein Saccharid, worin die Zuckerkettenstruktur
mit GnT-IV modifiziert wird.
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Hiernach
wird die gegenwärtige
Erfindung im Detail beschrieben.
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Das
GnT-IV-Gen der Erfindung kann wie unten beschrieben isoliert werden.
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ISOLIERUNG
VON BOVINEM GnT-IVa-GEN
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Zunächst wird
eine Mikrosomenfraktion von einem Dünndarm von Rindern, löslich gemacht
mit einem Detergens, einer Reihe von Reinigungsverfahren unter Verwendung
einer Anionenaustauschchromatographie, Kupferchelatchromatographie,
Zweischritt-Affinitätschromatographie
unter Verwendung eines Substratanalogs und Gelfiltration unterzogen,
um dadurch eine gereinigte Probe des GnT-IV-Enzyms zu erhalten.
Die resultierende gereinigte Probe wird einer SDS-PAGE unterzogen
und dann auf eine PVDF-Membran übertragen.
Das übertragene
Protein, so wie es ist oder nach einer Restriktionshydrolyse, wird
mit einem Gasphasen-Aminosäuresequenzierer
analysiert, um eine Teil-Aminosäuresequenz
für das
GnT-IV-Enzym zu erhalten.
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Darauffolgend
wird eine RT-PCR an der RNA, extrahiert aus den Tierzellen, (d.h.,
Dünndarm
von Rindern) durchgeführt
als Matrize unter Verwendung von Primern, die basierend auf den
oben bestimmten Teil-Aminosäuresequenzen
entworfen wurden. Weiterhin wird unter Verwendung eines Fragments,
erhalten durch RT-PCR als Sonde, das GnT-IV-Gen von Interesse aus
einer cDNA-Bibliothek von dem oben erwähnten Gewebe durch Plaquehybridisierung
einem Screening unterzogen. Ein cDNA-Fragment, enthalten in dem resultierenden
positiven Plaque wird ausgeschnitten und in einen Vektor, wie z.B.
pUC19 subkloniert, gefolgt von einer Analyse der Nucleotidsequenz.
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Wenn
die gesamte Länge
des Gens, kodierend für
das Protein von Interesse nicht in dem Fragment enthalten ist, wird
die Plaquehybridisierung wiederum unter Verwendung eines Teils des
subklonierten cDNA-Fragments als Sonde durchgeführt. Alternativ werden Endbereiche
der cDNA von Interesse durch RACE oder ähnliches, basierend auf Information
aus der oben erhaltenen Nucleotidsequenz, erhalten. Das so erhaltene
GnT-IV-Gen (das hiernach GnT-IVa genannt wird) wird einer Analyse
seiner gesamten Nucleotidsequenz unterzogen. Darauffolgend wird
die Aminosäuresequenz
von dem Gen mit der oben erwähnten
Nucleotidsequenz translatiert. Diese Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NR:
18 dargestellt.
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ISOLIERUNG VON MENSCHLICHEN
GnT-IVa- UND GnT-IVb-GENEN
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Menschliche
GnT-IVa- und GnT-IVb-Gene können
durch Durchführung
einer RT-PCR unter Verwendung von RNA erhalten werden, die aus einem
menschlichen Gewebe extrahiert wurde (Leber oder Lunge) und basierend
auf der Information über
die Nucleotidsequenz von dem oben erhaltenen bovinen GnT-IVa-Gen, gefolgt
von einem Screening einer cDNA-Bibliothek von dem obigen Gewebe.
Die resultierenden menschlichen GnT-IVa- und GnT-IVb-Gene werden
einer Analyse ihrer gesamten Nucleotidsequenzen unterzogen. Darauffolgend
werden die Aminosäuresequenzen
durch diese Gene translatiert. Diese Aminosäuresequenzen werden in SEQ
ID NOS: 24 und 37 dargestellt.
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Um
eine DNA zu erhalten, kodierend für die in SEQ ID NO: 18, 24
oder 37 dargestellte Aminosäuresequenz
mit einer Addition, Deletion oder Substitution von ein oder mehr
Aminosäureresten
kann eine Anzahl von Verfahren verwendet werden. Z.B. ein Verfahren
zur Behandlung einer DNA mit einem Mutagen, um eine Punktmutation
oder eine Deletionsmutation zu induzieren; ein Verfahren, umfassend
das selektive Spalten von DNA, die Entfernung oder Zugabe eines
selektierten Nucleotids und dann die Ligation der DNA; eine ortspezifische
Mutagenese; und ähnliches
können
aufgezählt
werden.
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Das
GnT-IV-Protein der Erfindung kann durch Herstellung eines rekombinanten
Vektors erzeugt werden, worin eine DNA, kodierend für das GnT-IV
der Erfindung, erhalten durch das oben beschriebene Verfahren stromabwärts eines
Promotors inseriert wird, Einführung
des Vektors in eine Wirtszelle und Kultivieren der resultierenden
Zelle. Die für
diesen Zweck verwendete Vektor-DNA kann entweder eine Plasmid-DNA
oder eine Bakteriophagen-DNA sein. Z.B. kann ein pSVL-Vektor (Pharmacia,
Schweden), wie in dem später
beschriebenen Beispiel dargestellt, verwendet werden. Als Wirtszelle,
worin die resultierende rekombinante DNA eingeführt wird, kann jede Zelle,
die konventionell bei rekombinanten DNA-Verfahren verwendet wird,
verwendet werden, z.B. eine prokaryontische Zelle, eine tierische
Zelle, eine Hefe, ein Pilz, ein Insektenzelle. Spezifische Beispiele
beinhalten Escherichia coli als prokaryontische Zelle und CHO-Zellen
vom chinesischen Hamster oder COS-Zellen von Affen als tierische
Zellen.
-
Die
Transformation der oben beschriebenen Wirtszelle wird durch konventionelle
Verfahren für
jeden Wirt durchgeführt.
Wenn der Wirt z.B. E. coli ist, wird ein Vektor, umfassend die rekombinante
DNA durch das Wärme-Schock-Verfahren
oder Elektroporation in kompetente Zellen eingeführt, hergestellt durch das
Calciumverfahren oder ähnliches.
Wenn der Wirt eine Hefe ist, wird ein Vektor, umfassend die rekombinante
DNA, durch das Hitze-Schock-Verfahren oder Elektroporation in kompetente
Zellen eingeführt,
hergestellt durch das Lithiumverfahren oder ähnliches. Wenn der Wirt eine
tierische Zelle ist, wird ein Vektor, umfassend die rekombinante
DNA in die Zelle in der Wachstumsphase oder ähnlichem durch das Calciumphosphatverfahren,
eine Lipofektion oder Elektroporation eingeführt.
-
Durch
Kultivierung des so erhaltenen Transformanten in einem Medium, wird
das GnT-IV-Protein erzeugt.
-
Bei
der Kultivierung eines Transformanten kann jedes Medium verwendet
werden, solange der Wirt darin lebensfähig ist. Z.B. kann ein LB-Medium
oder ähnliches
verwendet werden, wenn der Wirt E. coli ist. Wenn der Wirt eine
Hefe ist, kann ein YPD-Medium oder ähnliches verwendet werden.
Wenn der Wirt ein tierische Zelle ist, kann ein Dulbecco's-Medium, supplementiert
mit einem tierischen Serum oder ähnlichem
verwendet werden. Die Kultivierung wird unter den Bedingungen durchgeführt, die
konventionell für
den Wirt verwendet werden. Wenn der Wirt z.B. E. coli ist, werden
die Zellen bei ungefähr
30 bis 37°C
für ungefähr 3 bis 24
Stunden mit, falls nötig,
Belüftung
und/oder Bewegung kultiviert. Wenn der Wirt Hefe ist, werden die
Zellen bei ungefähr
25 bis 37°C
für ungefähr 12 Stunden
bis 2 Wochen mit, falls nötig,
Belüftung
und/oder Bewegung kultiviert. Wenn der Wirt eine tierische Zelle
ist, wird die Kultivierung bei ungefähr 32 bis 37°C unter 5%
CO2 und 100% Feuchtigkeit für ungefähr 24 Stunden
bis 2 Wochen mit, falls nötig, Änderung
der Belüftungsbedingungen
und/oder Bewegung durchgeführt.
-
Nach
der Kultivierung werden die kultivierten Mikroorganismen oder Zellen
unter Verwendung eines Homogenisators, einer French-Press, einer
Beschallung, Lysozym und/oder Einfrier-Auftau-Zyklen aufgebrochen, um dadurch
das GnT-IV-Protein aus den Mikroorganismen oder Zellen zu eluieren.
Dann kann das Protein aus den löslichen
Fraktionen erhalten werden. Wenn das Protein von Interesse in den
unlöslichen
Fraktionen enthalten ist, werden die unlöslichen Fraktionen durch Zentrifugation
nach Aufbrechen der Mikroorganismen oder Zellen gesammelt. Dann
kann das Protein mit einem Puffer, enthaltend Guanidinhydrochlorid
oder ähnliches
für die
Gewinnung löslich
gemacht werden. Alternativ können
die kultivierten Mikroorganismen oder Zellen direkt mit einem Puffer
aufgebrochen werden, enthaltend ein Proteindenaturierungsmittel,
wie z.B. Guanidinhydrochlorid um dadurch das Protein von Interesse
außerhalb
des Mikroorganismus oder der Zellen zu eluieren.
-
Die
Reinigung des GnT-IV-Proteins aus dem obigen Überstand kann durch das in
Beispiel 1 beschriebene Verfahren durchgeführt werden. Alternativ kann
diese Reinigung durch die geeignete Kombination konventioneller
Abtrenn-/Reinigungsverfahren durchgeführt werden. Diese konventionellen
Abtrenn-/Reinigungsverfahren beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt
auf eine Zentrifugation, ein Aussalzen, eine Lösungsmittelpräzipitation,
eine Dialyse, eine Ultrafiltration, eine Trennchromatographie, eine
Gelfiltration, eine Kapillarelektrophorese, eine DC, eine Ionenaustauschchromatographie,
eine Metallchelatchromatographie, eine Affinitätschromatographie, eine Umkehrphasenchromatographie
und ein isoelektrisches Fokussieren.
-
Die
biochemischen Eigenschaften des aus dem Dünndarm von Rindern erhaltenen
GnT-IV-Enzymproteins werden, wie oben beschrieben, wie folgt dargestellt.
-
(1) WIRKUNG
-
Dieses
Enzymprotein erzeugt ein Saccharid mit einer Teilstruktur, dargestellt
durch die Formel unten:
unter Verwendung von UDP-GlcNAc
als Zuckerdonor und einem Saccharid mit einer Teilstruktur, dargestellt durch
die Formel unten als Zuckerrezeptor:
-
-
Das
Saccharid als Zuckerrezeptor bedeutet ein Oligosaccharid, Polysaccharid,
Glycokonjugat (Glycopeptid, Glycoprotein, Glycolipid oder Proteoglycan)
oder ein Derivat davon.
-
(2) SUBSTRATSPEZIFITÄT
-
Wenn
der Zuckerrezeptor ein Oligosaccharid ist (für die Strukturen der Oligosaccharide,
siehe 4) zeigt das Enzymprotein Reaktivitäten von
0% zu Kerntyp-Oligosacchariden,
54% zu GnT-I-Produkttyp-Oligosacchariden und 164% zu GnT-V-Produkttyp-Oligosacchariden,
wobei die Reaktivität
des Enzymproteins zu GnT-II-Produkttyp-Oligosacchariden als 100% angesetzt
wird.
-
Das
Enzymprotein zeigt eine Reaktivität von 46% zu einer Struktur
von GnT-II-Produkttyp-Oligosacchariden, worin Fucose über α1→6-Bindungen
an das GlcNAc am reduzierenden Ende angebunden ist.
-
Das
Enzymprotein zeigt eine Reaktivität von 0% zu einer Struktur
von GnT-II-Produkttyp-Oligosacchariden, worin das GlcNAc an der α1→3-Mannose
fehlt.
-
Das
Enzymprotein zeigt eine Reaktivität von 16% zu einer Struktur
von GnT-II-Produkttyp-Oligosacchariden, worin die Galactose über eine β1→4-Bindung
an das GlcNAc an einer α1→6-Mannose
gebunden ist und eine Reaktivität
von 0% zu einer Struktur von GnT-II-produktartigen Oligosacchariden,
worin die Galactose über
eine β1→4-Bindung
an das GlcNAc der α1→3-Mannose
gebunden ist.
-
Das
Enzymprotein zeigt eine Reaktivität von 0% zu einer Struktur
von GnT-II-produktartigen Oligosacchariden, worin GlcNAc über eine β1→4-Bindung
an die β1→4-Mannose
gebunden ist.
-
(3) MOLEKULARGEWICHT
-
Ungefähr 66 K,
wie bestimmt durch SDS-PAGE (unter nicht-reduzierenden Bedingungen). Ungefähr 60 K
nach Behandlung mit dem Peptid N-Glycosidase F. Da eine Shift einer
Bande beobachtet wird, wenn die Peptid N-Glycanase verwendet wird,
nimmt man an, dass das Enzymprotein ein Glycoprotein ist.
-
Das
anscheinende Molekulargewicht wurde bestimmt durch Filtration mit
einem Gel, enthaltend Triton X-100, und beträgt 77 K. So wird angenommen,
dass GnT-IV keine Untereinheitstruktur aufweist und als Monomer
wirkt.
-
Der
Proteinbestandteil dieses Enzyms, abgeleitet von einer Nucleotidsequenz,
besteht aus 535 Aminosäureresten
und hat ein Molekulargewicht von 61.614.
-
(4) OPTIMALER pH
-
Das
pH-Optimum für
die Reaktion liegt bei ungefähr
5,5. Mehr als 50% der maximalen Aktivität werden im Bereich von 6,5
bis 8,0 beobachtet.
-
(5) INHIBITION, AKTIVIERUNG
UND STABILISIERUNG
-
(i) INHIBITION
-
Die
Aktivität
dieses Enzyms wird durch Zugabe von 20 mM EDTA inhibiert.
-
Dieses
Enzym wird durch UDP-Derivate inhibiert.
-
Die
Intensität
der Inhibition liegt in folgender Rangfolge: UDP>>UDP-Glc>>UDP-GalNAc>>2'-Deoxy UDP>UDP-Hexanolamin>>UDP-Gal>UTP>UDP-glucuronsäure>UMP.
-
Uridin,
TDP und CDP weisen keine inhibitorische Wirkung auf.
-
(ii) AKTIVIERUNG
-
Ein
divalentes Kation ist für
die Expression der Aktivität
essentiell. Unter den divalenten Kationen zeigt Mn2+ die
größte Wirkung.
Bei einer Konzentration von 7,5 mM liegen die respektiven Wirkungen
von CO2+ und Mg2+ bei
ungefähr
70% von der von Mn2+ und die Wirkung von
Ca2+ beträgt ungefähr 10% derjenigen von Mn2+. Die Wirkung von Mn2+ ist
im Bereich von 5 bis 20 mM am größten.
-
(iii) STABILISIERUNG
-
Eine
stabilisierende Wirkung wird in BSA und Glycerin erkannt.
-
(6) KINETISCHE PARAMETER
-
Wenn
das Saccharid als Rezeptor ein Oligosaccharid ist (für die Strukturen
des Oligosaccharids, siehe 4):
- (i) Unter Assaybedingungen, unter denen das
Enzym in 50 μl
eines 125 mM MOPS-Puffers (pH 7,3), enthaltend 0,8 mM Rezeptorsubstrat,
20 mM UDP-GlcNAc,
7,5 mM MnCl2, 200 mM GlcNAc, 0,5% (G/V)
Triton X-100, 10% Glycerin und 1% BSA bei 37°C bis 4 Stunden umgesetzt wird:
Km-
und Vmax-Werte zu GnT-II-produktartigem Oligosaccharid betragen
0,73 mM bzw. 3,23 μM/min.
Km-
und Vmax-Werte zu einem GnT-V-produktartigen Oligosaccharid betragen
0,13 mM bzw. 1,75 μM/min.
Wenn
das GnT-II-produktartige Oligosaccharid das Rezeptorsubstrat ist
liegt der Km-Wert zu UDP-GlcNAc bei
0,22 mM.
- (ii) Unter Assaybedingungen, unter denen das Enzym in 125 mM
MOPS-Puffer (pH 7,3), enthaltend 120 mM UDP-GlcNAc, 7,5 nM MnCl2,
0,5% (G/V) Triton X-100, 10% Glycerin und 1% BSA bei 37°C für 4 Stunden
umgesetzt wird:
Km- und Vmax-Werte zu dem GnT-II-produktartigen
Oligosaccharid betragen 0,59 mM bzw. 0,74 mM/min/mg.
Km- und
Vmax-Werte zu dem GnT-V-produktartigen Oligosaccharid betragen 0,14
mM bzw. 0,47 mM/min/mg.
-
(7) Gnt-IV-FAMILIE
-
Die
Homologie zwischen bovinem GnT-IVa und menschlichem GnT-IVa beträgt 91% auf
dem Nucleinsäureniveau
und 96% auf dem Aminosäureniveau.
-
Die
gesamten partiellen Aminosäurestrukturen,
enthalten in dem gereinigten GnT-IV aus Rinderdünndarm werden von dem Rinder-GnT-IVa-Gen
kodiert.
-
Menschliches
GnT-IVb und menschliches GnT-IVa weisen eine 63%ige Homologie auf
dem Nucleinsäureniveau
und eine 62%ige Homologie auf dem Aminosäureniveau auf. Sie unterscheiden
sich jedoch vollständig
in den C-terminalen und N-terminalen Regionen.
-
Aus
den oben beschriebenen biochemischen Eigenschaften wurde das GnT-IV
der Erfindung als neues Enzym in der Hinsicht erkannt, dass dieses
Enzym in der Lage ist, die folgende Reaktion durchzuführen, die
konventionelle Enzyme nicht durchführen können:
-
-
KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
-
1 zeigt
den Biosyntheseweg von Asn-gebundenen Zuckerketten.
-
2 zeigt
Variationen der Asn-gebundenen Zuckerkette (revidiert von 1 in
Makoto Takeuchi, Wako Purechemical Newsletter 64, 18–19, 1996).
- a. Mannanart: Eine Zuckerkettenstruktur, die
für Pilze,
wie z.B. Hefen und Schimmelpilze charakteristisch ist.
- b. Eine Xylo-Art mit hohem Mannosegehalt: Eine Struktur, die
charakteristisch für
Pflanzen, Mollusken und Insekten ist.
- c. Eine Art mit hohem Mannosegehalt: Eine Struktur, die üblicherweise
in Pflanzen, Insekten und Tieren angetroffen wird.
- d. Hybridart: Eine Struktur, die üblicherweise bei Insekten und
Tieren angetroffen wird.
- e. Komplexart: Eine Struktur, die für Tiere charakteristisch ist.
- f. Prokaryontische Zellen: Diese weisen kein System für eine Biosynthese
von Asn-gebundenen Zuckerketten auf.
-
Der
Bereich, der durch gepunktete Linien mit einem Kästchen versehen ist, repräsentiert
den gemeinsamen Kern der Zuckerkette.
-
3 zeigt
die Positionen des GlcNAc-Transfers durch verschiedene GlcNAc-Transferasen (GlcNAc-Glycosyltransferasen).
-
4 zeigt
die Bezeichnungen und Strukturen von Oligosacchariden.
-
5 zeigt
ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm
für GnT-IV-Reaktionsprodukte.
-
6 zeigt
die Ergebnisse der Analyse von GnT-IV durch Q-Sepharose FF-Chromatographie.
-
7 zeigt
die Ergebnisse der Analyse von GnT-IV durch Kupferchelat-Sepharose
FF-Chromatographie.
-
8 zeigt
die Ergebnisse einer Analyse von GnT-IV durch eine UDP-Hexanolaminagarose-Affinitätschromatographie
(I).
-
9 zeigt
die Ergebnisse der Analyse von GnT-IV durch eine UDP-Hexanolaminagarose-Affinitätschromatographie
(II).
-
10 zeigt die Ergebnisse der Analyse von GnT-IV
durch eine Superdex 200-Gelchromatographie.
-
11 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse von
SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)
von gereinigtem GnT-IV dargestellt.
-
12 zeigt die Ergebnisse der nativen Gelelektrophorese
von gereinigtem GnT-IV und dessen Aktivität.
-
13 zeigt ein Smith-Abbauprofil von GnT-IV-, -V-
und -VI-produktartigen Oligosacchariden.
-
14 zeigt die Ergebnisse von einer 1H-NMR
(30°C) des
GnT-IV-Reaktionsprodukts.
-
15 zeigt den optimalen pH für GnT-IV.
-
16 zeigt die optimale Mn2+-Konzentration
für GnT-IV.
-
17 zeigt die Ergebnisse einer Analyse durch SDS-PAGE
und Fluorchromatographie von Glycoproteinen, die die Reaktionsprodukte
von GnT-IV sind.
Spuren 1 und 2: 7,6 μg menschliches Asialo-Agalacto-Transferrin
Spur
3: 7,6 μg
menschliches Asialo-Transferrin
Spuren 4 und 5: 2,8 μg menschliches
Asialoagalacto, von CHO-Zellen abgeleitetes Erythropoietin
Spuren
6 und 7: 1,3 μg
Asialoagalacofetuin
-
Die
Spuren 1, 4 und 6 repräsentieren
Scheinexperimente, worin die Reaktion ohne GnT-IV durchgeführt wurde.
M bedeutet molekularer Marker (Bio-Rad). PM repräsentiert vorgefärbte molekulare
Marker (Bio-Rad, USA).
-
GnT-IV-Reaktionsbedingungen:
Zu 10 μl
einer Lösung,
enthaltend 0,702 nmol/Std. GnT-IV, einem Substrat Glycoproteinäquivalent
zu 1,6 nmol von Zuckerketten vom Biantennentyp (nur für Fetuin,
der Zuckerkettengehalt war 1,6 nmol) und 450 nCi UDP-[14C]
GlcNAc, wurde ein entsprechendes Volumen einer Assaymischung (250
mM MOPS-Puffer,
pH 7,3, 400 mM GlcNAc, 20% Glycerin, 1,0% (G/V) Triton X-100, 15
mM MnCl2, 1 mM UDP-GlcNAc) zugefügt, um eine
Reaktionslösung
zu erhalten, die bei 37°C
20 Stunden inkubiert wurde. Ein Zehntel der resultierenden Lösung wurde
durch SDS-PAGE und Fluorographie analysiert.
-
Für SDS-PAGE
wurde 10 bis 20% Gradientengel (Daiichi Kagaku) verwendet. Für die Fluorographie wurde
Amplify (Amersham) verwendet, um die Proben einem Röntgenfilm
für 20
Stunden auszusetzen. Die Sichtbarmachung der Biantennen-Zuckerketten
im Glycoprotein wurde unter Verwendung von ConA-HRP und des POD-Immunostain-Kit
(Wako Purechemical) nach Tüpfelung
auf einer PVDF-Membran durchgeführt.
-
18 zeigt den offenen Leserahmen von menschlichem
GnT-IVa und der Region, enthalten in dem pCore-His-Expressionsvektor.
-
19 zeigt die Ergebnisse einer isoelektrischen
Fokussierung und einer Western-Analyse von Erythropoietin, erzeugt
durch individuelle Zellklone. Unter Verwendung von zwei Erythropoietin-erzeugenden Stämmen und
denselben Stämmen,
in die die Rinder bzw. menschlichen GnT-IVa-Gene eingeführt worden
waren, wurde das von jedem Stamm sezernierte Erythropoietin durch
isoelektrisches Fokussieren und Western-Blot unter Verwendung von
Anti-Erythropoietin-Antikörper analysiert.
Auf der linken Seite sind die Positionen der pI-Marker dargestellt.
-
BESTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
DER ERFINDUNG
-
Hiernach
wird die gegenwärtige
Erfindung im Detail unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele
beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese
Beispiele begrenzt.
-
[REFERENZBEISPIEL 1]
-
(1) In den Beispielen
verwendete Reagenzien
-
Wenn
nicht anders angegeben, waren die verwendeten Reagenzien Produkte
vom höchsten
Grad, hergestellt von Wako Purechemical Industries, Ltd.
-
(i) Pyridylaminierte Oligosaccharide
-
Jedes
der verwendeten pyridylaminierten Oligosaccharide wurde wie unten
beschrieben erhalten. Zunächst
wurden die pyridylaminierten Oligosaccharide aus menschlichem Transferrin
(apo-Typ; Sigma, USA) gemäß dem Verfahren
von Tokugawa et al. [Bierhuizen, M. F., Mattei, M. G. und Fukuda,
M. (1993) Genes Dev., 7, 468–478]
hergestellt. Das resultierende Material wurde mit einem oder einer
Kombination der folgenden Enzyme behandelt: Arthrobacter ureafaciens-abgeleitete Sialidase
(Nacalai Tesque), Aspergillus sp.-abgeleitete β-Galactosidase (Toyobo), Jack-Bohnen-abgeleitete β-N-Acetylhexosaminidase
(Seikagaku Corpl), GnT-V-aktive
Fraktion im CHO-K1-Zellextrakt (Überstand
erhalten durch Beschallung von CHO-K1-Zellen in 2 Volumen 5 mM Tris-HCl-Puffer,
pH 7,5, enthaltend 2 mM MgCl2 und 1 mM PMSF und
dann Zentrifugation bei 900 × g
für 10
Minuten) und der GnT-V-aktiven Fraktion in löslich gemachter Fraktion von
Rinderdünndarmhomogenat
(für das
Herstellungsverfahren, siehe "Herstellung
der Mikrosomenfraktion" und "Löslichmachen" in Beispiel 1). Ein Teil der pyridylaminierten
Oligosaccharide wurde durch Behandlung der PA-Zuckerkette 021 und 022 (Takara Shuzo)
mit den obigen Enzymen hergestellt. In beiden Fällen wurden die Oligosaccharide, die
hergestellt wurden, durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung
einer ODS-Säule
(10 × 250 mm;
Vydac, USA) vor der Verwendung gereinigt.
-
(ii) Glycoproteinsubstrate
-
Rinderfetuin
(Sigma, USA) und von CHO-Zellen abstammendes rekombinantes menschliches
Erythropoietin (Kirin Brewery) wurden der folgenden Vorbehandlung
für ihre
Reinigung in eine relativ einheitliche Glycoform unterzogen. Kurz
gefasst, wurden 40 bis 100 mg des Glycoproteins auf eine ConA-Sepharosesäule (5 ml;
Pharmacia, Schweden), äquilibriert
mit 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, enthaltend 1 mM MgCl2,
1 mM CaCl2 und 0,15 M NaCl aufgebracht,
um dadurch eine Glycoform mit einem niedrigen Biantennen-Zuckerkettengehalt
als nicht-adsorbierte
Fraktion zu erhalten. Danach wurde die Säule mit dem obigen Puffer,
enthaltend 1,0 M α-Methylmannosid
(Nacalai Tesque) eluiert um dadurch die Fraktion zu erhalten, die
ein Glycoform mit einem hohen Biantennen-Zuckerkettengehalt adsorbiert. Dadurch
wurde Fetuin mit einem niedrigen Biantennen- Zuckerkettengehalt und Erythropoietin
mit einem hohen Biantennen-Zuckerkettengehalt erhalten. Im Hinblick
auf menschliches Transferrin gab es keinen Bedarf dieses Glycoprotein
zu reinigen, da fast alle Zuckerketten davon biantennär sind.
-
Das
so erhaltene Fetuin und menschliches Transferrin wurden individuell
mit 1 U Sialidase und 0 oder 107 U β-Galactosidase in 1 ml 0,4 M
Natriumacetatpuffer, pH 5,0, enthaltend 4 mM MgCl2 bei
37°C für 16 Stunden
umgesetzt, um dadurch Asialo- oder Asialoagalacto-Glycoproteine
zu erhalten. Das Erythropoietin mit einem hohen Biantennen-Zuckerkettengehalt
wurde mit 0,5 U Sialidase und 5 U β-Galactosidase auf dieselbe Weise
wie oben beschrieben umgesetzt, um ein Asialoagalakto-Glycoprotein
zu erhalten.
-
Jedes
der so erhaltenen Glycoproteinsubstrate wurde gegen 50 mM Ammoniumacetatpuffer,
pH 7,3 dialysiert. Dann wurde die Menge des Proteins durch den BCA-Proteinassay
(Pierce, USA), unter Verwendung von BSA (bovinem Serumalbumin) als
Standard bestimmt. Weiterhin wurde das Protein durch SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese)
analysiert. Die so hergestellten Glycoproteine wurden in den Beispielen
verwendet.
-
(iii) RT-PCR (reverse
Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion)
-
Für RT-PCR
wurde das Access RT-PCR-System (Promega, USA) verwendet. Für die Amplifikation
eines Fragments eines interessierenden Gens wurde Pfu-Polymerase
(Stratagene, USA) verwendet.
-
(2) In den Beispielen
verwendete Ausrüstung
-
(i) Gensequenzierung
-
- ABI PLISM 377 DNA-Sequencer (Perkin-Elmer, USA)
-
[REFERENZBEISPIEL 2] SPEZIFISCHER
ASSAY AUF DIE GnT-IV-AKTIVITÄT
-
Im
allgemeinen gibt es zwei Verfahren um die GnT-IV-Aktivität zu überprüfen: ein
Verfahren, wobei der Transfer von radioaktiv markiertem GlcNAc auf
ein Oligosaccharidsubstrat überprüft wird
und ein Verfahren, bei dem der Transfer von GlcNAc auf ein markiertes
Oligosaccharidsubstrat fraktionsweise durch HPLC oder ähnliches
analysiert wird. Taniguchi et al. entwickelten ein Verfahren, wobei
die GnT-III-, -IV- und -V-Aktivitäten simultan unter Verwendung
des GnT-II-produktartigen Oligosaccharids als Rezeptor bestimmt
wurden, [Nishikawa, A., Fujii, S., Sugiyama, T. und Taniguchi, N.
(1988) Anal. Biochem., 170, 349–354].
Dieses Assayverfahren in seiner vorliegenden Form war jedoch als
Assay während
der Reinigung von GnT-IV ungeeignet und zwar aufgrund der relativen
Aktivität
von GnT-IV, die nieder liegt als diejenigen von GnT-III und -V.
-
Daraufhin
haben die gegenwärtigen
Erfinder ein Verfahren zur Bestimmung der GnT-IV-Aktivität auf quantitative
und sensitive Weise entwickelt, indem sie die Menge des Akzeptorpyridylaminierten
Oligosaccharids auf das 10-fache im Vergleich mit der in dem vorherigen
Assaysystem verwendeten Menge erhöht haben [Tokugawa, K., Oguri,
S. und Takeuchi, M. (1996) Glycoconjugate J., 13, 53–56]. Es
ist allgemein sehr schwierig eine so große Menge des Akzeptor-Oligosaccharids
herzustellen. Gemäß dem Verfahren
von Tokugawa et al. [Tokugawa, K., Oguri, S. und Takeuchi, M. (1996)
Glycoconjugate J., 13, 53–56]
können
solche Oligosaccharide jedoch einfach hergestellt werden.
-
In
den Beispielen der vorliegenden Erfindung wurde die GnT-IV-Aktivität wie unten
beschrieben überprüft.
-
Das
Enzym wurde in 125 mM MOPS [3-(N-Morpholino)propansulfonsäure]-Puffer,
pH 7,3, enthaltend 0,8 mM pyridylaminiertes Oligosaccharidsubstrat
(GnT-II-produktartiges
Oligosaccharidsubstrat), 20 mM UDP-GlcNAc, 7,5 mM MnCl2,
200 mM GlcNAc, 0,5% (G/V) Triton X-100, 10 Glycerin und 1% BSA bei
37°C für 4 Stunden
umgesetzt. Dann wurde die Reaktion durch Kochen der Lösung für 2 Minuten
beendet. Nach Entfernung der Feststoffe mit 0,45 nm Filtern wurden
5 μl des
Filtrats mit einer ODS-80TM-Säule
(4,6 × 150
mm; TOSO) (5) bei 50°C mit einem 50 mM Ammoniumacetatpuffer,
pH 4,0, enthaltend 0,15% (G/V) n-Butanol bei einer Flussrate von
1,2 ml/min analysiert. Die Fluoreszenz von Pyridolaminogruppen wurde
unter Verwendung von einer Anregung bei 320 nm und einer Emission
bei 400 nm nachgewiesen.
-
[BEISPIEL 1] Isolierung
und Reinigung des Enzyms
-
(1) Screening einer Quelle
des Enzyms
-
Es
wurde nach einer Quelle des GnT-IV-Enzyms, das gereinigt werden
sollte, gesucht, wobei das oben beschriebene Assayverfahren verwendet
wurde. Es wurde festgestellt, dass die relative Aktivität von GnT-IV zu
denjenigen von GnT-III und GnT-V in Rinderdünndarm deutlich höher ist
als die relative Aktivität
von GnT-IV in anderen Geweben, wie in Tabelle 1 dargestellt. So
wurde der Dünndarm
von Rindern als Ausgangsmaterial für die Reinigung gewählt. TABELLE
1
SUCHE NACH QUELLEN FÜR
GnT-IV-Enzyme
- N.D.
- unterhalb der Nachweisgrenze
-
(2) Reinigung
-
Wenn
nicht anders angegeben, wurden alle Arbeitsschritte bei 4°C durchgeführt.
-
(i) Herstellung der Mikrosomenfraktion
-
Zwei
Kilogramm Dünndarm
von Rindern (erhalten von einem Fleischverarbeiter) wurden gehackt. Dann
wurden 4 Volumen Extraktionspuffer (10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4,
enthaltend 0,25 M Saccharose, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid,
1 mM Benzamidinhydrochlorid, 1 mM Dithiothreitol und 10 mg/ml Antipain) hinzugefügt und mit
Polytron (Kinematica, Schweden) homogenisiert. Das resultierende
Homogenat wurde bei 900 × g
10 Minuten zentrifugiert. Dann wurde der Überstand weiter bei 105.000 × g für 60 Minuten
zentrifugiert, um dadurch die Mikrosomenfraktion als Präzipitat
zu erhalten (Probe 1).
-
(ii) Löslichmachen
-
Die
Probe 1 wurde in 3 Volumen eines Lösungspuffers suspendiert, hergestellt
durch Zugabe von Triton-100 zu dem Extraktionspuffer, um eine Endkonzentration
von 1% zu erhalten. Der Überstand
wurde durch Zentrifugation bei 105.000 × g für 60 Minuten erhalten. Das
Pellet wurde wiederum suspendiert und der Überstand gesammelt. Die ersten
und zweiten Extrakte wurden kombiniert (Probe 2).
-
(iii) Q-Sepharose FF-Chromatographie
-
Probe
2 wurde auf eine Q-Sepharose FF-Säule (5 × 30 cm; Pharmacia, Schweden),
prä-äquilibriert mit
Arbeitspuffer 1 (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, enthaltend 1 mM Benzamidinhydrochlorid
0,1% Triton X-100 und 20% Glycerin) aufgebracht und dann durch einen
linearen Gradienten von 0 bis 0,5 M KCl (6) eluiert
(Probe 3)
-
(iv) Kupferchelatsepharose
FF-Chromatographie
-
Probe
3 wurde auf eine Kupferchelatsepharose FF-Säule (5 × 10 cm; Pharmacia Schweden)
aufgebracht, prä-äquilibriert mit dem Arbeitspuffer
2 (erhältlich
durch Zugabe von KCl zu dem Arbeitspuffer 1 mit einer Endkonzentration
von 0,15 M). Dann wurden die nicht adsorbierten Fraktionen mit 5
Volumen des Arbeitspuffers 2 ausgewaschen. Danach wurde das Absorbat
durch einen linearen Gradienten von 0,01 M Glycin eluiert (7).
Die resultierende GnT-IV-aktive
Fraktion wurde gesammelt und mit einer YM30-Ultrafiltrationsmembran (Amicon, USA)
konzentriert (Probe 4).
-
(v) UDP-Hexanolamin-Agarose-Affinitätschromatographie
I
-
Zu
einer UDP-Hexanolamin-Agarose-Affinitätssäule (1,2 × 4,5 cm; Sigma, USA) prä-äquilibriert
mit Arbeitspuffer 3 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 0,15 M KCl,
10 mM MnCl2, 0,05% Triton X-100 und 20%
Glycerin), wurde eine Hälfte
der Probe 4, dialysiert gegen 1 mM Benzamidinhydrochlorid-versetztem
Arbeitspuffer 3 aufgebracht. Dann wurden die nicht-adsorbierten Fraktionen
mit Arbeitspuffer 4 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 10 mM MnCl2, 0,05% Triton X-100 und 20% Glycerin) ausgewaschen.
Danach wurde das Adsorbat mit Arbeitspuffer 4 eluiert, zu dem 1
M (Endkonzentration) KCl zugefügt
worden war (8). Die GnT-IV-aktive Fraktion
wurde gesammelt und gegen Arbeitspuffer 5 (mit derselben Zusammensetzung
wie derjenigen von Arbeitspuffer 4, jedoch mit einem pH von 7,4)
dialysiert (Probe 5).
-
(vi) UDP-Hexanolamin-Agarose-Affinitätschromatographie
II
-
Probe
5 wurde zu einer UDP-Hexanolamin-Agarose-Affinitätssäule (1,0 × 6,5 cm; Sigma, USA) prä-äquilibriert mit Arbeitspuffer
5 aufgebracht. Dann wurden die nicht-adsorbierten Fraktionen mit
Arbeitspuffer 5 ausgewaschen. Danach wurde das Adsorbat mit einem
von MnCl2-befreiten Arbeitspuffer 5 eluiert (9).
Die resultierende GnT-IV-aktive Fraktion wurde gesammelt (Probe
6).
-
(vii) Superdex 200-Gelchromatograhie
-
Probe
6 wurde mit einer kleinen Q-Sepharose FF-Säule konzentriert und auf eine
Superdex 200HR5/5-Säule
(1 × 30
cm; Pharmacia, Schweden), prä-äquilibriert
mit Arbeitspuffer 6 (erhalten durch Zugabe von KCl zu Arbeitspuffer
5 mit einer Endkonzentration von 0,15 M) aufgebracht (10). Arbeitspuffer 6 wurde auf die Säule mit
einer Flussrate von 0,25 ml/min aufgebracht, um dadurch die GnT-IV-aktive
Fraktion zu erhalten. (Probe 7).
-
(viii)
Die Menge an Protein, Aktivität
und spezifischer Aktivität
in jedem Reinigungsschritt sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Die
endgültige
Probe wurde 224.000-fach im Vergleich mit dem Homogenat aus dem
Dünndarm
gereinigt.
-
-
(3) Eigenschaften im Hinblick
auf die Enzymchemie und Proteinchemie
-
(i) Reinheit
-
Probe
7 ergab eine einzelne Bande bei einem Molekulargewicht von 60 K
in SDS-PAGE (11). Wenn Probe 7 einer nativen
PAGE unterzogen wurde und die resultierende Bande aus dem Gel ausgeschnitten
wurde, um die GnT-IV-Aktivität
zu bestimmen, stimmte die Lokalisierung der Proteinbande mit der
Lokalisierung der Aktivität überein (12). Weiterhin wurde keinerlei GnT-I, -II-, -III-
oder -V-Aktivität
in Probe 7 nachgewiesen. Aus diesen Feststellungen wurde geschlossen,
dass Probe 7 reines GnT-IV ist. Unter Einbeziehung der Tatsache,
dass das anscheinende Molekulargewicht dieses Proteins 77 K war,
wie bestimmt durch Triton X-100-haltige Gelfiltration (10) wird angenommen, dass GnT-IV keine Untereinheitsstruktur
aufweist und seine Aktivität
in Form eines Monomers exprimiert. Wenn Probe 7 mit dem Peptid N-Glycosidase
F (Boehringer-Mannheim,
Deutschland) behandelt wurde, wurde ein Anstieg der Mobilität auf SDS-PAGE
beobachtet. So wird angenommen, dass GnT-IV von Rinderdünndarm ein
Glycoprotein mit mindestens Asn-gebundenen Zuckerketten ist.
-
(ii) Reaktionsspezifität
-
Wenn
dieses Enzym auf das GnT-II-produktartigen Oligosaccharid einwirkt,
dargestellt durch die Formel unten als Substrat:
unter
Standardassaybedingungen, ergab das Enzym ein einzelnes Produkt
(pyridylaminiertes Oligosaccharid 1), wie überprüft durch HPLC.
-
Dieses
Produkt wurde gesammelt, gefolgt von einer Bestimmung seiner Struktur
durch (i) eine Kombination von Smith Abbau und Laser TOF-MS (time-of-flight-Massenspektrometer)
und (ii) 1H-NMR. So wurde die Reaktionsspezifität dieses
Enzyms überprüft. Wenn
das pyridylaminierte Oligosaccharid 1 einem Smith-Abbau gemäß dem Verfahren
von Kobata und Takasaki (Kobata, A. und Takasaki, S. (1993) in Glycobiology "A Practical Approach" (Fukuda, M. und
Kobaa, A., Hrsg.) 165–185,
IRL Press, Oxford, England] unterzogen wurde, veränderte sich
seine Massezahl von 1.599,0 zu 795,30 als Ergebnis des ersten Abbaus
und veränderte
sich weiter auf 634,68 als Ergebnis des zweiten Abbaus. Dies stimmt
mit dem in 13 dargestellten Reaktionsweg überein.
So wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass das Reaktionsprodukt
dieses Enzyms die folgende Struktur aufweist:
-
-
Wenn
das pyridylaminierte Oligosaccharid 1 weiterhin einer 1H-NMR
unterzogen wurde, wurde ein Peak von 4,53 ppm, der zu dem anomeren
Proton von GlcNAc7 korrespondiert, dargestellt in der folgenden Formel,
nachgewiesen; seine Kopplungskonstante J1,2 war 7,9 Hz (14). Diese Ergebnisse zeigen an, dass GlcNAc7,
wie in der Formel unten dargestellt, an Position 4 von Man4 über eine β-Typbindung
angebunden ist, was die obige Struktur vollständig unterstützt.
-
-
(iii) pH-Optimum
-
Das
pH-Optimum dieses Enzyms liegt ungefähr bei 7,5, wie in 15 dargestellt.
-
(iv) Bedarf an divalenten
Kationen
-
Wie
in Tabelle 3 dargestellt, wird dieses Enzym durch die Addition von
EDTA (Ethylendiamintetra-Essigsäure) deaktiviert.
Ein divalentes Kation ist für
seine Aktivität
essentiell. Unter den divalenten Kationen zeigt Mn2+ die
größte Wirkung,
gefolgt von Co2+ und Mg2+.
Eine schwache Wirkung wird für
Ca2+ und Fe2+ erkannt. Die
optimale Konzentration von Mn2+ liegt bei
ungefähr
10 mM, wie in 16 dargestellt.
-
TABELLE
3
Bedarf von GnT-IV an divalenten Kationen
-
Die
GnT-IV-Aktivität
wurde durch Zugabe jedes der Metallionen (10 mM) zu einer GnT-IV-Probe
bestimmt, aus der Metallionen entfernt worden waren. Die GnT-IV-Aktivität wird in
Prozent in der Tabelle dargestellt, worin die Aktivität, wenn
10 mM MnCl2 zugefügt wurden, als 100 angesehen
wird.
-
(v) Inhibition durch Zuckernucleotide
-
Wie
in Tabelle 4 dargestellt, inhibierte UDP die Aktivität dieses
Enzyms am stärksten.
Die inhibitorischen Wirkungen von UDP-Glucose, UDP-GalNAc, 2'-Deoxy-UDP und UDP-Hexanolamin
(Sigma, USA) folgten derjenigen von UDP in dieser Reihenfolge. Uridin,
UMP, TDP und CDP zeigten eine geringe inhibitorische Wirkung.
-
TABELLE
4
Inhibition von GnT-IV durch Nucleotide
-
Die
GnT-IV-Aktivität,
wenn jedes Nucleotid (2 mM) in Gegenwart von 0,5 mM UDP-GlcNAc zugefügt wird,
wird in Prozent in der Tabelle ausgedrückt, wobei die Aktivität, wenn
nichts zugefügt
wurde, als 100% betrachtet wird.
-
(vi) Substratspezifität
-
Wie
in Tabelle 5 dargestellt, bevorzugte diese Enzym das GnT-V-Produkttyp
Oligosaccharid (E in Tabelle 5) als Akzeptor am meisten. Danach
bevorzugte das Enzym die GnT-II-Produkttyp-Oligosaccharide (D in Tabelle 5).
-
Wenn
die Reaktivität
dieses Enzyms zu dem GnT-II-Typ
Oligosaccharid als 100% angesehen wird, zeigt dieses Enzym Reaktivitäten von
0% und 54% zu den Kerntyp-Oligosacchariden (A in Tabelle 5) bzw.
den GnT-I-Produkttyp Oligosacchariden (C in Tabelle 5).
-
Dieses
Enzym zeigt eine Reaktivität
von 46% zu einer Struktur von GnT-II-Produkttyp Oligosaccharid, worin
Fucose über
eine α1→6-Bindung an das GlcNAc
am reduzierenden Ende angebunden ist (F in Tabelle 5).
-
Dieses
Enzym zeigt eine Reaktivität
von 0% zu einer Struktur von GnT-II-Produkttyp Oligosacchariden,
worin das GlcNAc an der α1→3-Mannose fehlt (B
in Tabelle 5).
-
Dieses
Enzym zeigt eine Reaktivität
von 16% zu einer Struktur von GnT-II-Produkttyp Oligosacchariden,
worin die Galactose über
eine β1→4-Bindung
an das GlcNAc an der α1→6-Mannose
angebunden ist (G in Tabelle 5) und eine Reaktivität von 0%
zu einer Struktur von GnT-II-Produkttyp
Oligosacchariden, worin die Galactose über eine β1→4-Bindung an das GlcNAc an
der α1→3-Mannose angebunden
ist (H und I in Tabelle 5).
-
Dieses
Enzym zeigt eine Reaktivität
von 0% zu einer Struktur von GnT-II-Produkttyp Oligosacchariden,
worin das GlcNAc über
eine β1→4-Bindung an die β1→4-Mannose
angebunden ist (J in Tabelle 5).
-
Die
Substratspezifität,
wie oben beschrieben, stimmt fast vollständig mit der Substratspezifität von GnT-IV überein,
wie vorhergesagt von Schachter et al. [Glesson, P. A. und Schachter,
H. (1983) J. Biol. Chem., 258, 6162–6173]. So wird deutlich, dass
dieses Enzym der Erfindung genau das GnT-IV ist, das seit langem ein
fehlendes Bindeglied bei der Biosynthese von Zuckerketten vom Komplextyp
war.
-
-
(vii) Kinetische Parameter
-
Unter
den wie in Referenzbeispiel 2 beschriebenen Assaybedingungen betrugen
die Km- und Vmax-Werte dieses Enzyms zu den GnT-II-Produkttyp Oligosacchariden
0,73 mM bzw. 3,23 μM/min
und diese Werte zu den GnT-V-Produkttyp Oligosacchariden betrugen
0,13 mM bzw. 1,75 μM/min.
Der Km-Wert zu UDP-GlcNAc betrug 0,22 mM.
-
Unter
den erhaltenen pyridylaminierten Oligosacchariden erwiesen sich
diejenigen, die durch die folgenden repräsentiert werden, als neue Oligosaccharide:
-
-
(vii) Wirkung auf Glycoproteine
-
Um
zu demonstrieren, dass GnT-IV nicht nur auf Oligosaccharidsubstrate
sondern auch Oligosaccharidketten auf Glycoproteinen wirken kann,
wird GnT-IV mit Asialo-Agalacto-Glycoproteinen
unter Verwendung von UDP[14C]-GlcNAc als
Zuckerdonator umgesetzt. Dann wurden die Reaktionsprodukte durch
SDS-PAGE und Fluorographie (Panels A und B, 17)
analysiert. Wie in den Spuren 2 und 5 von Panel B in 17 dargestellt, gibt es einen Transfer von [14C]-GlcNAc zu Asialo-Agalacto-menschlichem Transferrin und
menschlichem Asialo-Agalacto, CHO-Zellen-abgeleiteten rekombinantem
Erythropoietin.
-
Das
menschliche Transferrin mit der GnT-IV-Produkttyp-Zuckerkette (der folgenden
Formel), erhalten durch diese GnT-IV-Reaktion ist eine neue Substanz,
die in der Natur nicht auftritt.
-
GnT-IV-Produkttyp-Zuckerkettenstruktur
-
[BEISPIEL 2] PEPTID-KARTIERUNGSANALYSE
-
Ungefähr 1 mg
dieses Enzyms der Erfindung, wie schließlich gereinigt, wurde auf
einem 0,1%igem SDS-10%igem Polyacrylamidgel gemäß dem Verfahren von Laemmli
[Laemmli, U. K. Nature (1970) 313, 756–762] elektrophoretisch behandelt.
Die abgetrennten Proteine wurden auf einer PVDF-Membran elektrogeblottet.
Das auf der Membran fixierte Protein war S-carboxymethyliert und wurde dann mit
Lysylendopeptidase Achromobacter-Protease I (AP-I) (Wako Pure Chemical
Industries, Ltd.) zum Erhalt einer AP-I-verdauten Fragmentmischung
verdaut. Die AP-I-verdaute PVDF-Membran wurde weiter mit Asp-N (Takara
Shuzo) verdaut um eine Asp-N-verdaute
Fragmentmischung zu erhalten. Jede der Peptid-Fragmentmischungen wurde durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie
getrennt und einer Aminosäure-Sequenzanalyse unterzogen. Im
Ergebnis wurden die in SEQ ID NOS: 1 bis 14 dargestellten Sequenzen
erhalten.
-
[BEISPIEL 3] ISOLIERUNG
UND IDENTIFIZIERUNG VON RINDER-GnT-IVa-cDNA
-
(1) RT-PCR
-
Basierend
auf den in SEQ ID NOS: 7 und 11, wie erhalten in Beispiel 2, dargestellten
Aminosäuresequenzen
wurden das Oligomer AP-5F, dargestellt in SEQ ID NO: 15 bzw. das
Oligomer DN-9R, wie dargestellt in SEQ ID NO: 16 synthetisiert.
Eine RT-PCR wurde durchgeführt,
wobei als Matrize die aus Dünndarmgewebe von
Rindern extrahierte Gesamt-RNA (durch das Guanidinium-Isothiocyanat-Verfahren) verwendet
wurde und wobei die obigen Primer verwendet wurden. Im Ergebnis
wurde ein amplifiziertes Fragment mit ungefähr 170 bp, das spezifisch erschien,
erhalten. Dieses Fragment wurde subkloniert.
-
(2) Screening einer Bibliothek
-
Eine
Rinderdünndarm-cDNA-Bibliothek
(Clontech, USA) wurde mit dem oben erwähnten RT-PCR-Produkt zum Erhalt
von vier positiven Plaques einem Screening unterzogen. Die Nucleotidsequenzen dieser
Klone wurden bestimmt. Die resultierenden Sequenzen enthielten eine
Anzahl von Nucleotidsequenzen, die für einige Teil-Aminosequenzen
(SEQ ID NOS: 1 bis 14), erhalten in Beispiel 2, kodierten und enthielten
auch eine Sequenz, bei der es sich um einen Stopp-Kodon zu handeln
schien. Unter Verwendung eines Fragments von 150 bp, das den am
meisten stromaufwärts
gelegenen Bereich der resultierenden Nucleotidsequenz repräsentierte,
wurde die Bibliothek wiederum mit einem Screening überprüft um zwei
positive Plaques zu erhalten. Die Nucleotidsequenzen dieser Klone
wurden bestimmt. Dann wurde die Bibliothek weiter ähnlich mit
einer Sonde von 150 bp von dem am meisten stromaufwärts gelegenen Bereich
gescreent, es wurden jedoch keine neuen Klone erhalten.
-
(3) 5'-RACE (Schnellamplifizierung der cDNA-Enden)
-
Darauffolgend
wurde eine 5'-RACE
durchgeführt,
um eine Gesamtlängen-cDNA
zu erhalten. Unter Verwendung der Sequenz des am meisten stromaufwärts gelegenen
Bereichs, erhalten durch Phagen-Screening, wurde die erste 5'-RACE durchgeführt. Jedoch
konnte kein Startkodon gefunden werden. Dann wurde, basierend auf
der durch die erste 5'-RACE
erhaltenen Sequenz, die zweite 5'-RACE
durchgeführt
um dadurch eine Sequenz zu erhalten, die ein Startkodon enthielt.
Diese Sequenz wurde mit der vorher erhaltenen Teil-Gensequenz des
Phagenklons ligiert, um dadurch ein Genfragment zu erhalten, das
einen intakten offenen Leserahmen enthielt (Gen 1). Die Nucleotidsequenz
für das
so erhaltene Genfragment ist in SEQ ID NO: 17 dargestellt und die
davon abgeleitete Aminosäuresequenz
in SEQ ID NO: 18 dargestellt. Es wurde bestätigt, dass dieses DNA-Fragment
die gesamten Nucleotidsequenzen enthält, die für die 14 Teil-Aminosäuresequenzen
(SEQ ID NOS: 1 bis 15), erhalten in Beispiel 2, kodieren.
-
[BEISPIEL 4] KONSTRUKTION
EINES EXPRESSIONSVEKTORS UNTER VERWENDUNG DES KLONIERTEN RINDER-GnT-IVa-GENS
UND EIN VERFAHREN ZUR ERZEUGUNG DES GnT-IVa-ENZYMS
-
(1) Konstruktion eines
Vektors
-
Ein
Primer (SEQ ID NO: 19), der eine XhoI-Stelle in einem Bereich stromaufwärts vom
Stratkodon von Gen 1 einfügt
und ein anderer Primer (SEQ ID NO: 20) der eine XbaI-Stelle in einen
Bereich stromabwärts
vom Endkodon des Gens einführt,
wurden synthetisiert. Dann wurde das gesamte Gen, das das GnT-IV-Enzym
kodiert, durch PCR mit diesen Primern amplifiziert. Das erhaltene
amplifizierte Fragment wurde mit XhoI und XbaI verdaut und zwischen
den XhoI und XbaI-Stellen des pSVL-Vektors (Pharmacia, Schweden)
inseriert, um das Plasmid pBGT4 herzustellen.
-
(2) Einführung in
COS7-Zellen
-
Das
Plasmid pGBT4 wurde in COS7-Zellen (RIKEN Cell Bank) durch Elektroporation
eingeführt.
Kurzgefasst wurden 10 μg
des Plasmids zu ungefähr
5 × 106 Zellen in 0,8 ml PBS(–) (Nissui Pharmaceutical Co.) zugefügt. Eine
Spannung von 1.600 V wurde bei einer Kapazität von 25 μF mit einem Genpulser (BioRad, USA)
bei Raumtemperatur angewandt, um das Gen in die Zellen einzuführen. Die
resultierenden Zellen wurden in eine Laborschale mit einem Durchmesser
von 90 mm übertragen
und in 10 ml Dulbecco's-modifiziertem Eagle's-Medium kultiviert
(Base Catalogue Nr. 12430, Life Technologies, Inc., USA), enthaltend
10% fötales Rinderserum
unter 5% CO2 bei 37°C für 72 Stunden. Danach wurden
die Zellen wiedergewonnen und in 100 μl eines Puffers (5 mM Tris-HCl,
pH 7,5, 2 mM MgCl2, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid)
suspendiert, gefolgt von einer Beschallung und Zentrifugation bei
2.000 × g
für 5 Minuten.
So wurde ein Zellextrakt erhalten.
-
(3) Assay auf GnT-IV-Aktivität
-
Die
GnT-IV-Aktivität
in dem Zellextrakt wurde durch das in Referenzbeispiel 2 beschriebene
Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt.
Im Vergleich mit dem Extrakt von Zellen, in die der pSVL-Vektor als Kontrolle
eingeführt
worden war, zeigten diejenigen Extrakte, in die das Plasmid pBGT4
eingeführt worden
war, eine 44- bis 78-fach höhere
GnT-IV-Aktivität
pro Zelle. Aus diesen Ergebnissen wurde bestätigt, dass Gen 1 das GnT-IV-Enzym
kodiert. So kann das GnT-IV-Enzym durch kultivierte Zellen gemäß diesem
Verfahren erzeugt werden. TABELLE
6
Reaktionszeit: 4 Stunden
-
Die
Aktivitätsverhältnisse
werden unter Bezugnahme auf die Gesamtaktivität von pSVL, die als 1 angesetzt
wird, ausgedrückt.
-
[BEISPIEL 5] ISOLIERUNG
UND IDENTIFIZIERUNG VON MENSCHLICHER GnT-IVa-cDNA
-
(1) RT-PCR
-
Basierend
auf der Nucleotidsequenz von bovinem GnT-IVa, erhalten in Beispiel
3, wurden die Primer h1-2F, dargestellt in SEQ ID NO: 21 und Primer
h1-1R, dargestellt in SEQ ID NO: 22, synthetisiert. Unter Verwendung
von Gesamt-RNA von menschlicher Leber (Clontech, USA) als Matrize,
wurde eine PT-PCR mit den obigen Primern durchgeführt. Im
Ergebnis wurde ein amplifiziertes Fragment mit ungefähr 650 bp,
das spezifisch zu sein schien, erhalten. Dieses Fragment wurde subkloniert
und seine Nucleotidsequenz wurde bestimmt.
-
(2) Screening einer Bibliothek
-
Eine
cDNA-Bibliothek von menschlicher Leber (Clontech, USA) wurde unter
Verwendung des durch die obige RT-PCR erhaltenen 685 bp-DNA-Fragment
als Sonde gescreent.
-
Zwei
positive Plaques von hGT4/λ gt10-1
und hGT4/λ gt10-2
wurden erhalten. Die Nucleotidsequenzen der Inserts in diesen Phagenklonen
wurden bestimmt. Im Ergebnis enthielt hGT4/λ gt10-1 einen 804 bp-DNA-Bereich
und hGT4/λ gt10-2
enthielt einen 2.115 bp-DNA-Bereich. Der erstere Bereich war vollständig in
dem letzteren Bereich beinhaltet. Wie in SEQ ID NO: 23 dargestellt,
hatte das DNA-Fragment, enthalten in hGT4/λ gt10-2 einen offenen Leserahmen
(ORF), der zu der Aminosäuresequenz
von Rinder-GnT-IVa hoch homolog war (96% identisch). Durch die in
Beispiel 6 beschriebenen Ergebnissen wurde bestätigt, dass dieser ORF ein menschliches
GnT-IVa-Gen ist. Die Aminosäuresequenz
dieses ORF ist in SEQ ID NO: 24 dargestellt.
-
[BEISPIEL 6] KONSTRUKTION
EINES EXPRESSIONSPLASMIDS FÜR
DAS MENSCHLICHE GnT-IVa-GEN UND EIN VERFAHREN ZUR ERZEUGUNG VON
MENSCHLICHEM GnT-IVa-ENZYM
-
(1) Konstruktion des Expressionsplasmids
pHGT4-1 für
das menschliche GnT-IVa-Gen
-
Ein
Primer (h1-7F; SEQ ID NO: 25), der eine XhoI-Stelle in einem Bereich
stromaufwärts
von dem Startkodon des menschlichen GnT-IVa-Gens einführt und
ein anderer Primer (h1-7R; SEQ ID NO: 26), der zu einer Region stromabwärts von
dem Startkodon des Gens komplementär ist, wurden synthetisiert.
Unter Verwendung von RNA von menschlicher Leber (Clontech, USA)
als Matrize, wurde das gesamte Gen, das für das menschliche GnT-IVa-Enzym
kodierte, durch RT-PCR mit den obigen Primern amplifiziert. Das
resultierende amplifizierte Fragment wurde in die SrfI-Stelle des
Plasmids pCRScript Amp SK(+) (Stratagene, DNA) in entgegengesetzter
Richtung zu der Transkription des lacZ-Gens inseriert. Unter Verwendung
des resultierenden Plasmids wurde durch eine Nucleotidsequenzanalyse
bestätigt,
dass das amplifizierte Fragment die in SEQ ID NO: 24 dargestellte
Aminosäuresequenz
kodiert. Weiterhin wurde dieses Plasmid mit XhoI und SacI verdaut, um
ein XhoI-SacI-1,7 kb-Fragment. Dieses Fragment wurde zwischen den
XhoI- und SacI-Stellen von dem pSVL-Vektor (Pharmacia, Schweden)
inseriert, um ein Expressionsplasmid pHGT4-1 für das menschliche GnT-IVa-Gen herzustellen.
-
(2) Einführung des
menschlichen GnT-IVa-Gens in COS7-Zellen
-
Das
Plasmid pHGT4-1 wurde in COS7-Zellen durch Elektroporation eingeführt. Die
resultierenden Zellen wurden unter 10% CO2 bei
37°C 72
Stunden kultiviert. Dann wurden die Zellen geerntet, in 100 μl eines Puffers
(5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM Magnesiumchlorid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid)
suspendiert, durch Beschallung aufgebrochen, bei 2.000 × g 5 Minuten
zentrifugiert und der Überstand
gesammelt, um einen Zellextrakt zu erhalten.
-
(3) Expression des menschlichen
GnT-IVa-Gens in COS7-Zellen
-
Die
GnT-IV-Aktivität
in dem Zellextrakt wurde durch das in Referenzbeispiel 2 beschriebene
Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt.
Im Vergleich mit einem Extrakt von Zellen, in die der pSVL-Vektor als Kontrolle
eingeführt
worden war, zeigten die Extrakte von Zellen, in die das Plasmid
pHGT4-1 eingeführt
worden war, eine 21- bis 28-fach höhere GnT-IV-Aktivität pro Zelle.
Aus diesen Ergebnissen wurde bestätigt, dass das in SEQ ID NO:
23 dargestellte GnT-IVa-Gen die Glycosyltransferase GnT-IV kodiert.
Es wurde auch bestätigt,
dass das menschliche GnT-IVa-Enzym durch kultivierte Zellen gemäß diesem
Verfahren erzeugt werden kann. TABELLE
7
Reaktionszeit: 1,3 Stunden
-
Die
Aktivitätsverhältnisse
werden unter Bezugnahme auf die Gesamtaktivität von pSVL, die als 1 angesetzt
wird, ausgedrückt.
-
[BEISPIEL 7] ISOLIERUNG
UND IDENTIFIZIERUNG VON MENSCHLICHER GnT-IVb-cDNA
-
(1) Erhalt des menschlichen
GnT-IVa-ähnlichen
Gens durch PCR, RT-PCR und 5'-RACE
(Schnellamplifizierung von cDNA-Enden)
-
Nucleotidsequenzen
mit einer Ähnlichkeit
zu der Nucleotidsequenz von menschlichem GnT-IVa-Gen, erhalten in
Beispiel 3, wurden in der DNA-Datenbank-GenBank durch BLASTN gesucht.
Im Ergebnis wurden die Hinterlegungsnummern R12057, H10557 und W16571
aufgefunden. Dann wurden die Primer h2-45F, dargestellt in SEQ ID
NO: 27, und h2-43R, dargestellt in SEQ ID NO: 28, zur Durchführung einer
PCR unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek von menschlichen Gehirn
der Quick Screen Human cDNA Library Panel (Clontech, USA) als Matrize
synthetisiert. Das amplifizierte Fragment wurde in die SrfI-Stelle
des pCRScript Amp SK(+) (Stratagene, USA) subkloniert und einer
Analyse der Nucleotidsequenz unterzogen. Außerdem wurden die Primer h2-2F,
dargestellt in SEQ ID NO: 29, und h2-1R, dargestellt in SEQ ID NO:
30, synthetisiert um eine RT-PCR unter Verwendung von Gesamt-RNA
von menschlicher Lunge (Contech, USA) als Matrize durchzuführen. Im
Ergebnis wurde ein amplifizierte Fragment mit ungefähr 500 bp
der erwarteten Größe erhalten.
Dann wurde dieses Fragment in der SrfI-Stelle des pCRScript Amp
SK(+) (Stratagene, USA) subkloniert und einer Analyse der Nucleotidsequenz
unterzogen.
-
Die
so erhaltenen Nucleotidsequenzen der beiden DNA-Fragmente überlappen einander und bildeten eine
Region von 1.006 bp. In dieser Region wurde ein Leserahmen, der
die homologe Aminosäuresequenzen zu
denjenigen von Rinder und menschlichem GnT-IVa kodiert, erkannt.
So wurde das Vorhandensein eines Proteins, das in Bezug zu GnT-IVa-Proteinen
stand, vorgeschlagen.
-
Dann
wurden mögliche
Nucleotidsequenzen, die eine stromaufwärts gelegene Sequenz zu R12057 oder
stromabwärts
gelegene Sequenzen zu W16571 sein könnten in der DNA-Datenbank-Genbank
durch BLASTN gesucht. Im Ergebnis wurde R15554 als stromabwärts gelegene
Sequenz zu R12057 gefunden und W16466 als stromabwärts gelegene Sequenz
zu W16571. Ein anscheinend nicht geeignetes Stoppkodon war jedoch
in den ORFs, abgeleitet von diesen Nucleotidsequenzen, enthalten.
Um daher die Nucleotidsequenzen zu bestätigen wurden DNA-Fragmente
durch RT-PCR erhalten. Als Primer wurden h2-1F, dargestellt in SEQ ID
NO: 31, h2-3F, dargestellt in SEQ ID NO: 32 und h2-8R, dargestellt
in SEQ ID NO: 33, synthetisiert. Mit einer Kombination aus h2-1F
und dem in Beispiel 5 beschriebenen h1-1R oder einer Kombination
aus h2-3F und h2-8R wurde eine RC-PCR unter Verwendung von Gesamt-RNA
von menschlicher Leber (Clontech, US) als Matrize durchgeführt. Amplifizierte
Fragmente mit ungefähr
550 bp und ungefähr
300 bp, die jeweils mit den erwarteten Größen übereinstimmten, wurden nachgewiesen.
Jedes dieser Fragmente wurde in die SrfI-Stelle von pCRScript Amp
SK(+) subkloniert, um die Nucleotidsequenz zu analysieren. Im Ergebnis
wurde bestätigt, dass
diese Fragmente jeweils mit einem stromaufwärts gelegenen und einem stromabwärts gelegenen
Bereich zu dem 1.006-Bereich
zwischen den oben erwähnten
h2-45F und h2-1R überlappten.
In dem ligierten Bereich von 1.361 bp wurde ein ORF angetroffen,
der ein 433-Aminosäurenprotein
mit einer hohen Ähnlichkeit zu
den Aminosäuresequenzen
von bovinen und menschlichen GnT-IVa-Proteinen aufwies.
-
Wenn
jedoch dieser ORF mit den Aminosäuresequenzen
von GnT-IVa-Proteinen verglichen wird, wird angenommen, dass das
Startmethionin in einer Region stromaufwärts zu diesem ORF vorliegen
sollte. Daher wurde der stromaufwärts gelegene Bereich durch
5'-RACE unter Verwendung
von menschlicher Lungen-5'-RACE-Ready-cDNA
(Clontech, USA) erhalten. In der ersten PCR wurden ein Anchor-Primer
und h2-5R, dargestellt in SEQ ID NO: 34, als Primer verwendet. In
der zweiten PCR wurden ein Anchor-Primer und h2-3R, dargestellt
in SEQ ID NO: 35, als Primer verwendet. Die durch 5'-RACE erhaltenen Fragmente
wurden gereinigt, mit EcoRI und PstI verdaut und dann durch Agarosegelelektrophorese
getrennt. Ein Fragment mit ungefähr
450 bp wurde von dem Gel gewonnen. Dieses Fragment wurde zwischen
die EcoRI- und PstI-Stellen des
pUC18-Vektors (Pharmacia, Schweden) inseriert, um die Nucleotidsequenzen
zu analysieren. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass dieses Fragment
mit einem Bereich stromaufwärts
zu dem Bereich zwischen h2-1F und h2-8R überlappt. In dem ligierten
Bereich von 1.758 bp wurde ein ORF bestätigt, das ein 548-Aminosäureprotein
mit hoher Ähnlichkeit
zu den Aminosäuresequenzen
von Rinder- und menschlichen GnT-IVa-Proteinen kodiert. Die Nucleotidsequenz
dieses ORF ist in SEQ ID NO: 36 dargestellt und die Aminosäuresequenz
in SEQ ID NO: 37. Aus den in Beispiel 8 unten beschriebenen Ergebnissen
wurde bestätigt,
dass dieses Gen das menschliche Gen GnT-IVb-Gen ist.
-
[BEISPIEL 8] KONSTRUKTION
EINES EXRESSIONSPLASMIDS FÜR
DAS MENSCHLICHE GnT-IVb-GEN UND EIN VERFAHREN ZUR ERZEUGUNG DES
MENSCHLICHEN GnT-IVb-ENZYMS
-
(1) Konstruktion des Expressionsplasmids
pHGT4-2 für
das menschliche GnT-IVb-Gen
-
Ein
Primer (h2-4: SEQ ID NO: 38), der eine XhoI-Stelle in einer Region,
stromaufwärts
zum Startkodon des menschlichen GnT-IVb-Gens einführt und
ein anderer Primer (h2-10R: SEQ ID NO: 39), der eine XbaI-Stelle
in einer Region stromabwärts
zum Stoppkodon des obigen Gens einführt, wurden synthetisiert.
Unter Verwendung dieser Primer wurde der gesamte ORF, kodierend
für das
menschliche GnT-IVb-Enzym, durch RT-PCR mit einer RNA von menschlicher
Lunge (Clontech, USA) als Matrize amplifiziert. Das amplifizierte Fragment
wurde in die SrfI-Stelle des Plasmids pCRScript Amp SK(+) inseriert, gefolgt
von einer Bestimmung seiner Nucleotidsequenz. Im Ergebnis wurde
bestätigt,
dass das amplifizierte Fragment für die Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO: 37 kodiert. Weiterhin wurde dieses Plasmid mit XhoI und XbaI
verdaut, um ein XhoI-XbaI-1,7 kg-Fragment zu erhalten. Diese Fragment
wurde zwischen die XhoI- und XbaI-Stellen des pSVL-Vektors (Pharmacia,
Schweden) inseriert, um ein Expressionsplasmid pHGT4-2 für das menschliche GnT-IVb-Gen
zu konstruieren.
-
(2) Einführung des
menschlichen GnT-IVb-Gens in COS7-Zellen
-
Das
Plasmid pHGT4-2 wurde in COS7-Zellen durch Elektroporation eingeführt. Die
resultierenden Zellen wurden unter 10% CO2 bei
37°C für 72 Stunden
kultiviert.
-
Dann
wurden die Zellen wiedergewonnen, in 100 μl eines Puffers (5 mM Tris-HCl,
pH 7,5, 2 mM Magnesiumchlorid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid)
suspendiert, durch Beschallung aufgebrochen, bei 2.000 × g 5 Minuten
zentrifugiert und der Überstand
gesammelt um dadurch einen Zellextrakt zu erhalten.
-
(3) Expression des menschlichen
GnT-IVb-Gens in COS7-Zellen.
-
Die
GnT-IV-Aktivität
in dem Zellextrat wurde durch das in Referenzbeispiel 2 beschriebene
Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 oben dargestellt.
Im Vergleich zu dem Extrakt von Zellen, in die der pSVL-Vektor als Kontrolle
eingeführt
worden war zeigten die Extrakte von Zellen, in die das Plasmid pHGT4-2 eingeführt worden
war, eine 8- bis 11-fach höhere
GnT-IV-Aktivität
pro Zelle. Aus diesen Ergebnissen wurde bestätigt, dass das in SEQ ID NO:
36 dargestellte GnT-IVb-Gen die Glycosyltransferase-GnT-IV kodiert.
Es wurde auch bestätigt,
dass das menschliche GnT-IVb-Enzym durch kultivierte Zellen, gemäß diesem
Verfahren, erzeugt werden kann.
-
[BEISPIEL 9] KONSTRUKTION
VON EXPRESSIONSPLASMIDEN FÜR
BOVINE GnT-IVa-N-TERMINALE DELETIONSMUTANTEN UND IHRE EXPRESSION
-
(1) Konstruktion von Expressionsplasmiden
pSigIle93, pSigPro113 und pSigPro142 für Rinder-GnT-IVa
-
Ein
Primer (XhoEsig: SEQ ID NO: 40), der eine XhoI-Stelle in einem Bereich, stromaufwärts von
der Signalsequenz von menschlichem Erythropoietin (GenBank Accessions
Number X02157) und ein Antisinn-Primer (E4-1R: SEQ ID NO: 41), der
das C-terminale Ende der obigen Signalsequenz mit einem Teil der
Rinder GnT-IVa-Aminosäuresequenz
legiert, die sich von Position 94 (Ile) zum Ende erstreckt, wurden
synthetisiert, um die Signalsequenz von menschlichem Erythropoietin
durch PCR zu amplifizieren. Außerdem
wurde ein Sinn-Primer (E4-1F: SEQ ID NO: 42), korrespondierend zu
dem obigen Antisinn-Primer
und ein Primer (4EXPR: SEQ ID NO: 20), der eine XbaI-Stelle in einer
Region, stromabwärts
vom Stoppkodon des Rinder-GnT-IVa-Gens einführt, synthetisiert, um eine
Teilsequenz des Rinder-GnT-IVa-Gens durch PCR zu amplifizieren.
Unter Verwendung von Teilen der resultierenden zwei PCR-Produkte
als Mischmatrize wurde eine PCR mit dem Primern XhoEsig und 4EXPR
durchgeführt.
Das amplifizierte Fragment wurde mit XhoI und XbaI verdaut und zwischen
die XhoI- und XbaI-Stellen des pSVL-Vektors (Pharmacia, Schweden)
inseriert, um dadurch das Plasmid pSigIle93 zu konstruieren, das
eine Aminosäuresequenz
exprimiert, worin das menschliche Erythropoietinsignal mit einem
Teil der Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz
verbunden ist, die sich von der Position 93 zum Ende hin erstreckt.
-
Das
Plasmid pSigPro113, das eine Aminosäuresequenz exprimiert, worin
das menschliche Erythropoietinsignal an einen Teil der Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz
gebunden ist, die sich von Position 113 (Pro) zum Ende erstreckt;
oder das Plasmid pSigPro142, das eine Aminosäuresequenz exprimiert, worin
das menschliche Erythropoiethinsignal an einen Teil der Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz
gebunden ist, die sich von Position 142 (Pro) zum Ende erstreckt,
wurden jeweils auf dieselbe Weise wie oben unter Verwendung der
E4-2R-Primer (SEQ
ID NO: 43) oder E4-3R-Primer (SEQ ID NO: 44) anstelle des E4-1R-Primers; und
E4-2F-Primer (SEQ ID NO: 45) oder E4-3F-Primer (SEQ ID NO: 46) anstelle
des E4-1F-Primers konstruiert.
-
(2) Einführung von
Plasmiden, die Rinder-GnT-IVa-N-terminale Deletionsmutanten exprimieren,
in COS7-Zellen
-
Das
Plasmid pSigIle93, pSigPro113 oder pSigPro142 wurde in COS7-Zellen
durch Elektroporation eingeführt.
Die resultierenden Zellen wurden unter 10% CO2 72
Stunden bei 37°C
kultiviert. Dann wurden die Zellen und der Kulturüberstand
getrennt wiedergewonnen. Die Zellen wurden in 100 μl eines Puffers
(5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM Magnesiumchlorid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid)
suspendiert, durch Beschallung aufgebrochen und bei 2.000 × g für 5 Minuten
zentrifugiert, um einen Zellextrakt zu erhalten. Der Kulturüberstand
wurde auf ungefähr
100 μl mit
Centriplus 30 (Amicon) konzentriert.
-
(3) Expression von Rinder-GnT-IVa-N-terminalen
Deletionsmutanten in COS7-Zellen
-
Die
GnT-IV-Aktivität
im Kulturüberstand
und dem Zellextrakt wurden durch das in Referenzbeispiel 2 beschriebene
Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt.
Im Vergleich mit der Gesamtaktivität (d.h., Aktivität der Zellen
+ Aktivität
im Überstand)
der Zellen, in die der pBGT4-Vektor als positive Kontrolle eingeführt worden
war, betrug die Gesamtaktivität
der Zellen, in die pSigIle93 eingeführt worden war, mehr als 30%.
Weiterhin wurde mehr als ein Drittel der Aktivität in den Kulturüberstand
sezerniert. Aus diesen Ergebnissen wurde festgestellt, dass die
Aminosäuren
vom N-Terminus zu Position 92 der Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz deletiert werden
können
ohne die Enzymaktivität
zurückzuhalten.
Es wurde auch dargestellt, dass das GnT-IVa-Enzym sezernierend unter
Verwendung eines geeigneten Sekretionssignals exprimiert werden
kann. TABELLE
8
Reaktionszeit: 2,5 Stunden
-
Die
Aktivitätsverhältnisse
werden unter Bezugnahme auf die Gesamtaktivität von pBGT4, die als 100% angesetzt
wird, ausgedrückt.
-
[BEISPIEL 10] KONSTRUKTION
VON EXPRESSIONSPLASMIDEN FÜR
BOVINE GnT-IVa-DELETIONSMUTANTEN UND IHRE EXPRESSION
-
(1) Konstruktion der Expressionsplasmide
pCGly499, pCPro465, pCLys432 und pCPro383 für Rinder-GnT-IVa
-
Ein
Primer (SEQ ID NO: 19), der eine XhoI-Stelle in einen Bereich, stromaufwärts zu dem
Startkodon des Rinder-GnT-IVa-Gens einführt und ein Primer (CGly499:
SEQ ID NO: 47), der das Stoppkodon nach dem Gly-Kodon an Position
499 ligiert und eines XbaI-Stelle in einem Bereich, stromabwärts zu dem
Stoppkodon einführt,
wurden synthetisiert um eine Teilsequenz von dem Rinder-GnT-IVa-Gen durch
PCR zu amplifizieren. Das amplifizierte Fragment wurde mit XhoI
und XbaI verdaut und zwischen den XhoI- und XbaI-Stellen des pSVL-Vektors
(Pharmacia, Schweden) inseriert. So wurde das Plasmid pCGly499,
das die Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz
bis zu Position 499 (Glycin) exprimiert, konstruiert. Unter Verwendung
des CPro465-Primers (SEQ ID NO: 48), CLys432-Primers (SEQ ID NO: 49) oder CPro383-Primers
(SEQ ID NO: 50) anstelle des CGly499-Primers wurden drei zusätzliche
Plasmide auf dieselbe Weise konstruiert. Sie wurden als pCPro465
(Plasmid, das die Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz
bis Position 465 (Proline) exprimiert); pCLys432 (Plasmid, das die
Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz
bis zu Position 432 (Lysin) exprimiert) bzw. pCPro383 (Plasmid,
das die Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz
bis zu Position 383 (Prolin) exprimiert) bezeichnet.
-
(2) Einführung von
Plasmiden, die Rinder-GnT-IVa-C-terminale Deletionsmutanten exprimieren,
in COS7-Zellen
-
Das
Plasmid pCGly499, pCPro465, pCLys432 oder pCPro383 wurde in COS7-Zellen
durch Elektroporation eingeführt.
Die resultierenden Zellen wurden unter 10% CO2 72
Stunden bei 37°C
kultiviert. Dann wurden die Zellen wiedergewonnen und in 100 μl eines Puffers
(5 ml Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM Magnesiumchlorid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid)
suspendiert, durch Beschallung aufgebrochen und bei 2.000 × g 5 Minuten zentrifugiert,
um einen Zellextrakt zu erhalten.
-
(3) Expression von Rinder-GnT-IVa-C-terminalen
Deletionsmutanten in COS7-Zellen
-
Die
GnT-IV-Aktivität
in dem Zellextrakt wurde durch das in Referenzbeispiel 2 beschriebene
Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt.
Im Vergleich mit der GnT-IV-Aktivität des Extrakts von Zellen,
in die der pBGT4-Vektor als positive Kontrolle eingeführt war,
betrug die Aktivität
des Extrakts von Zellen, in die pCGly499, pCPro465, pCLys432 oder
pCPro383 eingeführt
worden war, 15,2%, 12,1%, 2,8% bzw. 104,2% pro Zelle. Aus diesen
Ergebnissen wurde gezeigt, dass die GnT-IV-Aktivität erhalten
werden kann, selbst wenn die Aminosäuren von Position 384 bis zum
C-Terminus in der
Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz
deletiert sind. TABELLE
9
Reaktionszeit: 2 Stunden
-
Die
Aktivitätsverhältnisse
werden unter Bezugnahme auf die Gesamtaktivität von pBGT4, die als 100% angesetzt
wird, ausgedrückt.
-
[BEISPIEL 11] KONSTRUKTION
VON PLASMIDEN UM VERSCHIEDENE GnT-IV-GENE IN E. COLI ZU EXPRIMIEREN
UND IHRE EXPRESSION
-
(1) Konstruktion eines
E. coli-Expressionsplasmids für
Rinder-GnT-IVa
-
Ein
Primer (BSP-N: SEQ ID NO: 51), der eine BspHI-Stelle in einem Bereich
stromaufwärts
vom Startkodon des Rinder-GnT-IVa-Gens einführt und ein anderer Primer
(C-Hd: SEQ ID NO: 52), der eine HindIII-Stelle in einem Bereich
stromabwärts
vom Stoppkodon einführt,
wurden synthetisiert, um den gesamten offenen Leserahmen von dem
Rinder-GnT-IVa-Gen durch PCR zu amplifizieren. Das amplifizierte
Fragment wurde mit BspHI und HindIII verdaut und zwischen die NcoI-
und HindIII-Stellen des pTrc99A-Vektors (Pharmacia, Schweden) eingeführt, um
dadurch das Plasmid pEBGT4 zu konstruieren. Unter Verwendung des
BSP-sN-Primers (SEQ ID NO: 53) anstelle des BSP-N-Primers zusammen
mit den C-Hd-Primer wurde das Plasmid pEIle93 auf ähnliche
Weise konstruiert. Weiterhin wird ein Gen, kodierend für den offenen
Leserahmen, worin ein His-Tag zum C-Terminus zugefügt ist,
unter Verwendung des BSP-N-Primers, einem Primer (CH-Hd: SEQ ID
NO: 54), der ein His-Tag einführen
kann, einem Stoppkodon und einer HindIII-Stelle in einem Bereich
stromabwärts
vom C-Terminus des Rinder-GnT-IVa-Gens und einem Primer (H-Hd: SEQ ID
NO: 55), der ein His-Tag aufweist, einem Stoppkodon und einer HindIII-Stelle, amplifiziert,
um dadurch das Plasmid pEBGT4+His auf ähnliche Weise zu konstruieren.
-
(2) Konstruktion des E.
coli-Expressionsplasmids für
das menschliche GnT-IVa-Gen und das menschliche GnT-IVb-Gen
-
Ein
Primer (4aBSPIL94: SEQ ID NO: 56), der ein Startkodon und ein Ile-Kodon
in einem Bereich stromaufwärts
von Position 94 (Leu) der menschlichen GnT-IVa-Aminosäuresequenz
einführt
und der auch eine BspHI-Stelle in einem Bereich weiter stromaufwärts davon
einführen
kann; ein Primer (4aCH-Hd: SEQ ID NO: 57), der ein His-Tag, ein
Stoppkodon und eine HindIII-Stelle in einem Bereich stromabwärts von
der C-terminalen Aminosäure
einführt
und der H-Hd-Primer wurden synthetisiert, um ein Genfragment zu
amplifizieren, bestehend aus einer Teilsequenz der menschlichen
GnT-IVa-Aminosäuresequenz,
wozu eine Sequenz, kodierend ein His-Tag zugefügt wurde. Das amplifizierte
Fragment wurde mit BspHI und HindIII verdaut und zwischen NcoI- und HindIII-Stellen
des pTrc99A-Vektors (Pharmacia, Schweden) inseriert, um dadurch
das Plasmid pMA4a+His zu konstruieren. Weiterhin wurde unter Verwendung
des CP383H-Hd-Primer (SEQ ID NO: 58) anstelle des 4aCH-Hd-Primers, das Plasmid
pCore+His auf ähnliche
Weise konstruiert (18). Ein Fragment des menschlichen GnT-IVb-Gens
wurde unter Verwendung eines Primers (4bBSP-N: SEQ ID NO: 59) amplifiziert,
der eine BspHI-Stelle
in einem Bereich stromaufwärts
zum Startkodon des menschlichen GnT-IVb-Gens einführt und
eines 4bSACR-Primers
(SEQ ID NO: 60), verdaut mit BspHI und SacI und dann zwischen die NcoI-
und SacI-Stellen des pTrc99A-Vektors
(Pharmacia, Schweden) inseriert. Zwischen den SacI- und HindIII-Stellen
des resultierenden Plasmids wurde eine Teillänge des menschlichen GnT-IVb-Gens,
amplifiziert unter Verwendung des 4bSACF-Primers (SEQ ID NO: 61),
einem Primer (4bCH-Hd: SEQ ID NO: 62), der ein His-Tag am C-Terminus
der menschlichen GnT-IVb-Aminosäuresequenz
einführt
und einem H-Hd-Primer und mit SacI und HindIII verdaut, inseriert,
um dadurch das Plasmid pEHGT4-2+His zu erhalten. Weiterhin wurde eine
Teilsequenz des menschlichen GnT-IVb-Gens unter Verwendung eines
Primers (4bNCOG91: SEQ ID NO: 63) amplifiziert, der eine NcoI-Stelle
und ein Startkodon in einem Bereich stromaufwärts von Position 91 (Gly) der
menschlichen GnT-IVb-Aminosäuresequenz
einführt,
eines 4bCH-Hd-Primers und eines H-Hd-Primers, verdaut mit NcoI und
HindIII und dann zwischen den NcoI- und HindIII-Stellen des pTrc99A-Vektors (Pharmacia,
Schweden) inseriert und dadurch das Plasmid pMA4b+His zu konstruieren.
-
(3) Einführung von
jedem Expressionsplasmid in den E. Coli-BL21-Stamm
-
Jedes
Expressionsplasmid wurde in kompetente Zellen des E. coli-BL21-Stamms,
hergestellt durch das Calciumverfahren, eingeführt. Die resultierenden Zellen
wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin kultiviert.
Die resultierenden Kolonien von E. coli, transformiert mit jedem
Plasmid, wurden in das LB-Flüssigmedium
inokuliert und unter Schütteln über Nacht
bei 37°C
kultiviert. Dann wurde die Kultur in ein frisches LB-Flüssigmedium
inokuliert, um eine Konzentration von 2% zu ergeben. Während die
Trübheit
(OD 595 nm) der Kulturflüssigkeit
ungefähr
0,1 bis 0,2 betrug, wurde IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) hinzugefügt, um eine
Endkonzentration von 1 mM zu ergeben. Die Zellen wurden für 2 Stunden
bei 37°C
oder für
4 Stunden bei 25°C
kultiviert. Dann wurden 500 μl
der Zellen geerntet. Das Zellpellet wurde in 50 μl eines Puffers (5 mM Tris-HCl,
pH 7,5, 2 mM MgCl2, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid)
suspendiert, durch Beschallung aufgebrochen und bei 2.000 × g 5 Minuten
zentrifugiert, um einen Zellextrakt als Überstand zu erhalten.
-
(4) Expression von jedem
Expressionsplasmid in dem E. coli-BL21-Stamm
-
Die
GnT-IV-Aktivität
in dem Zellextrakt wurde durch das in Referenzbeispiel 2 beschriebene
Verfahren bestimmt. Tabelle 10 zeigt die Ergebnisse der Expression
des Rindergens. Obwohl der Extrakt von E. coli-Zellen, in die der
pTrc99A-Vektor als Kontrolle eingeführt worden war, wenig GnT-IV
aufwies, hatte der Extrakt von E. coli-Zellen, in die pEBGT4 eingeführt worden
war, eine definitive GnT-IV-Aktivität. Durch dieses Ergebnisse wurde
gezeigt, dass das GnT-IV-Enzym durch E. coli erzeugt werden kann.
Die zum C-Terminus von Rinder-GnT-IVa
zugefügte
His-Tag-Sequenz beeinflusste die GnT-IV-Aktivität nicht sehr. So wurde gezeigt,
dass eine geeignete Tag-Sequenz dem GnT-IV-Enzym zugefügt werden
kann. Der Mutant (pEIle93), worin die N-terminalen 92 Aminosäuren deletiert
sind, zeigte eine stärkere
GnT-IV-Aktivität.
So wurde gezeigt dass die Expression von Varianten des GnT-IV-Enzyms,
die in tierischen Zellen bestätigt
wurde, auch in E. coli möglich war. TABELLE
10
Reaktionszeit: 3,0 Stunden
-
Nach
einer IPTG-Addition wurden die Zellen bei 37°C 2 Stunden kultiviert.
-
Die
Aktivitätsverhältnisse
sind in Prozent unter Bezugnahme auf die Gesamtaktivität von pEBGT4,
die als 100% angesetzt wird, ausgedrückt.
-
Tabelle
11 zeigt die Ergebnisse der Expression des menschlichen Gens. Im
Vergleich mit dem Extrakt von E. coli-Zellen, in die der pTrc99A-Vektor
als Kontrolle eingeführt
worden war, hatte der Extrakt von E. coli-Zellen, in die irgendeins der Expressionsplasmide
eingeführt
worden war, eine signifikante GnT-IV-Aktivität. Wie bei dem Rinder-GnT-IVa-Enzym
dargestellt war es auch bei den menschlichen GnT-IVa- und GnT-IVb-Enzymen möglich, eine
N-terminale Sequenz zu deletieren und die Aktivität beizubehalten.
Weiterhin zeigte das menschliche GnT-IVa-Enzym, das sowohl eine
N-terminale als auch eine C-terminale Deletion aufwies, eine hohe
GnT-IV-Aktivität
(pCore+His). Dies zeigt, dass die bei dieser Mutante deletierten
Bereiche für
die GnT-IV-Aktivität nicht
essentiell sind. TABELLE
11
Reaktionszeit: 4,0 Stunden
-
Nach
einer IPTG-Addition wurden die Zellen bei 25°C 4 Stunden kultiviert.
-
Die
Aktivitätsverhältnisse
sind in Prozent unter Bezugnahme auf die Gesamtaktivität von pMA4a+His, die
als 100% angesetzt wird, ausgedrückt.
-
[BEISPIEL 12] UMWANDLUNG
EINER ZUCKERKETTENVERZWEIGUNGSSTRUKTUR EINES REKOMBINANTEN ERYTHROPOIETINS
(EPO) DURCH EINFÜHRUNG
EINES RINDER- ODER MENSCHLICHEN GnT-IVa-GENS IN EPO-ERZEUGENDE CHO-ZELLEN
-
(1) Einführung des
GnT-IV-Expressionsplasmids in EPO-erzeugende CHO-Zellen
-
EPO-erzeugende
CHO-Zellklone wurden gemäß den in
der japanischen geprüften
Patentveröffentlichung
Nr. 2-17156 offenbarten Verfahren erzeugt.
-
Das
GnT-IVa-Expressionsplasmid pBGT4 oder pHGT4-1 wurde in die resultierenden
Zellklone MO1 und H-5 durch Elektroporation eingeführt. Bei
der Einführung
wurden 15 μg
des Expressionsplasmids und 1,5 μg
eines Arzneimittelresistenz-Markerplasmids (pSV2bsr von Kaken Pharmaceutical
oder pMAMneo von Clontech) in der Mischung verwendet. Die elektroporierten
Zellen wurden unter 10% CO2 für ungefähr 60 Stunden
bei 37°C
kultiviert. Dann wurde Blasticidin S (Kaken Pharmaceuticals) (Endkonzentration:
10 μg/ml)
oder Geneticin (Life Technologies, Inc.) (Endkonzentration: 500 μg/ml) dem
Medium zugefügt,
worin die Zellen für weitere
10 Tage bis 2 Wochen kultiviert wurden. So wurden Klone, die gegen
eines der beiden Arzneimittel resistent waren, isoliert.
-
(2) Bestätigung der
Expression der eingeführten
GnT-IV-Gene in EPO-erzeugenden CHO-Zellklonen
-
EPO-erzeugende
CHO-Zellklone (Anfangsklone) und individuelle Arzneimittel-resistente
Klone wurden in geeignetem Umfang kultiviert. Die gesamte RNA von
jedem Klon wurde gereinigt. Dann wurde eine RNA-Dot-Blot-Analyse unter Verwendung
eines Teils des GnT-IVa-Gens als Sonde durchgeführt, um dadurch die Menge der
GnT-IVa-mRNA zu überprüfen. Weiterhin
wurde die GnT-IV-Aktivität, exprimiert
in den Anfangsklonen und den Arzneimittel-resistenten Klonen durch
den in Referenzbeispiel 2 beschriebenen Assay bestimmt. Diejenigen
Klone, die ein starkes Signal in der RNA-Dot-Blot-Analyse ergaben und dennoch eine
höhere
GnT-IV-Aktivität als die
Anfangsklone zeigten, wurden selektiert und für die EPO-Produktion verwendet. Die
selektierten Klone hatten einer erhöhte GnT-IV-Aktivität; z.B. zeigte MO1(Rinder-GnT-IV)#36
einen ungefähr
104-fachen Anstieg gegenüber
dem MO1-Klon und H-5(menschliches GnT-IV)#23 zeigte einen ungefähr 125-fachen Anstieg gegenüber dem
H-5-Klon.
-
(3) Produktion von EPO
unter Verwendung der EPO-erzeugenden CHO-Zellklone mit eingeführtem GnT-IV-Gen.
-
EPO
wird sezerniert in die Kulturflüssigkeit
exprimiert. Dann wurden die EPO-erzeugenden CHO-Zellklone M01 und
H-5 und die oben erwähnten
Klone M01(Rinder-GnT-IV)#36 und H5(menschliches GnT-IV)#23 in Rollflaschen
kultiviert. Zunächst
wurde jeder Klon in eine Wachstumsmedium Adhäsion-kultiviert und dann wurden
1,5 × 107
Zellen in eine 850 cm2 Rollflasche, enthaltend
200 ml Wachstumsmedium, übertragen.
Die Zellen wurden unter 10% CO2 bei 37°C 3 Tage
kultiviert, so dass sie einheitlich an die Flasche anhafteten. Danach
wurde das Wachstumsmedium entfernt und die Zellen wurden mit PBS-Puffer gewaschen.
Dann wurden 200 ml eines serumfreien Mediums der Flasche zugefügt, worin
die Zellen unter 10% CO2 7 Tage bei 37°C kultiviert
wurden. Danach wurde der Kulturüberstand
wiedergewonnen.
-
Als
Wachstumsmedium wurden D-MEM/F12 Mischmedium, supplementiert mit
5% fötalem
Rinderserum, 290 mg/l L-Glutaminsäure, 1 × MEM nicht-essentieller Aminosäurelösung und
100 nM Methotrexat verwendet. Als serumfreies Medium wurde das obige
Medium ohne fötales
Rinderserum verwendet. EPO, enthalten in jedem der serumfreien Kulturüberstände, wurde
quantitativ durch ELISA unter Verwendung eines anti-humanen EPO-Antikörpers bestimmt.
-
(4)
Analyse von EPOs, erzeugt durch Klone mit oder ohne eingeführtes GnT-IV-Gen,
basierend auf ihren Zuckerkettenstrukturen.
-
Ein
rekombinantes EPO existiert nicht als einzelnes Molekül auf einem
isoelektrischen Fokussierungsgel; es ist eine Mischung von Molekülen mit
verschiedenen elektrischen Ladungen. Da sich der Proteinbestandteil
nicht ändert
wurde gezeigt, dass der Unterschied in der elektrischen Ladung bei
diesen Molekülen auf
den Unterschieden auf der Zuckerkettenstruktur basiert; eine solche
Mischung von Molekülen
wird Glycoforme genannt [Watson, E. und Yao, F., Anal. Biochem.
(1993), 210, 389–93].
EPO weist drei Asn-gebundene Zuckerketten auf; die Verzweigungsstrukturen
der individuellen Zuckerketten variieren von biantennär zu tetraantennär. Gal (Galactose)
ist weiter an das Ende von jedem verzweigen GlcNAc angebunden und
weiterhin bindet sich Sialinsäure
an dieses Gal. Wenn daher der Grad der Zuckerkettenverzweigung durch
Einführung des
GnT-IV-Gens ansteigt, sollte die Anzahl der Sialinsäuremoleküle, die
sich an das Gal anbinden, steigen und so sollte sich der Gehalt
an Glycoformen mit einem niedrigen isoelektrischen Punkt vermehren.
Dann führten
die Erfinder eine Analyse durch isoelektrisches Fokussieren durch,
um Veränderungen
in der Zuckerkettenstruktur der EPOs nachzuweisen, erzeugt durch
die EPO-erzeugenden Zellen mit eingeführtem GnT-IV-Gen.
-
Für die isoelektrische
Fokussierung wurde eine Multiphor II-Ausrüstung, hergestellt von Pharmacia, verwendet.
Das Gel bestand aus 5% Acrylamid (30:0,8) und 1,5% Pharmalyte 2,5
bis 5 (Pharmacia). Als (+)-Elektrodenlösung wurde
eine 0,1 M Schwefelsäure
verwendet. Als (–)-Elektrodenlösung wurde
0,2 M L-Histidin verwendet. Nach der isoelektrischen Fokussierung
wurden die Proben elektrophoretisch auf eine PVDF-Membran übertragen,
gefolgt von einer Western-Blot-Analyse
unter Verwendung eines Anti-EPO-Maus-monoklonalen Antikörpers, um die Banden von individuellen
Glycoformen der EPOs nachzuweisen. Kurz gefasst, wurde der serumfreie
Kulturüberstand
von jedem Zellklon auf das ungefähr
7- bis 1.000-fache mit Centripus 30 und Microcon 30 (beide von Amicon
hergestellt), falls nötig,
konzentriert. Am Beginn wurden ungefähr 50 bis 100 IU EPO als Probe
verwendet, jedoch wurde diese Menge in geeigneter Weise eingestellt,
so dass die Intensitäten
der durch Western-Blot-Analyse
nachgewiesenen Banden zwischen den Proben ungefähr gleich sein würden.
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Wenn
das EPO des M01-Klons mit dem EPO des M01(Rinder-GnT-IV)#36-Klons verglichen wurde, wurde
bestätigt,
dass die Positionen der Hauptglycoformen im letzteren eine Verlagerung
zur Nieder-pI-Seite (+-Elektrodenlösungsseite) um mindestens ein
Glycoform zeigen (19). Aus diesem Ergebnis wird
abgelesen, dass das als Ergebnis der Geneinführung exprimierte GnT-IV-Enzym die Anzahl
der GlcNAc-Verzweigungen in den Asn-gebundenen Zuckerketten, die sich an
das EPO anhaften, erhöhte,
und so die Anzahl von Sialinsäuremolekülen, die
sich anbinden, um den Gehalt an Glycoformen mit niedrigen isoelektrischen
Punkten zu vermehren. Eine ähnliche
Analyse wurde an dem H-5-Klon und H-5(menschlichem GnT-IV)#23-Klon
durchgeführt.
Im Ergebnis wurde ebenfalls gefunden, dass die Positionen der Haupt-EPO-Glycoformen
in dem letzteren sich zu der niedrigen pI-Seite verlagern (19).
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Aus
dem obigen wurde demonstriert, dass es möglich ist, die Struktur der
Asn-gebundenen Zuckerketten des Proteins zu modifizieren, erzeugt
durch die Zelle, durch Einführung
eines GnT-IV-Gens in irgendeine Zelle.
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GEWERBLICHE
ANWENBARKEIT
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden eine neue β1→4-N-Acetylglucosaminyltransferase (GnT-IV),
ein Verfahren zur Erzeugung des GnT-IV-Enzyms und ein Gen, kodierend
für das GnT-IV
bereitgestellt. Mit dem GnT-IV der gegenwärtigen Erfindung wurde es möglich, ein
Glycokonjugat mit einer Verzweigungsstruktur zu erzeugen, die durch
konventionelle Glycosyltransferasen nicht gebildet werden konnte.
So ist das GnT-IV der Erfindung nicht nur für die Erzeugung oder Verbesserung
von Glycokonjugat-artigen Pharmazeutika, Reagenzien und Nahrungsmitteln
nützlich,
sondern auch für
eine Modifikation der Zuckerkettenstruktur von irgendeinem Biopolymer.
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Das
GnT-IV-Gen der Erfindung ist auch für die Diagnose oder Behandlung
von Erkrankungen, wie z.B. Krebs geeignet und für eine Modifikation der Zuckerkettenstruktur
von Glycokonjugatprodukten, erzeugt durch Mikroorganismen.
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Weiterhin
ist ein Antikörper
oder ein Antiserum, gezüchtet
gegen das GnT-IV-Protein der Erfindung als Antigen oder ein Teil
oder das gesamte erfindungsgemäße GnT-IV-Gen
als Sonde für
die einer Charakterisierung von Mikroorganismen, kultivierten Zellen,
verschiedenen Tiergeweben, Blutzellen und Blut oder für die Diagnose
von erkrankten Zellen oder Geweben, wie z.B. durch Krebs, nützlich.
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