ES2235259T3 - Beta-1-4 n-acetilglucosaminiltransferasa y gen que la codifica. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA ENZIMA QUE TIENE ACTIVIDAD BE 1 -> 4 N - ACETILGLUCOSAMINILTRANSFERASA ( GNT-IV); A UN GEN QUE CODIFICA PARA LA MISMA; A UN ADN RECOMBINANTE QUE COMPRENDE DICHO GEN; A UNA CELULA HUESPED QUE COMPRENDE DICHO ADN RECOMBINANTE; A UN METODO PARA PRODUCIR UNA PROTEINA ENZIMATICA QUE TIENE ACTIVIDAD GNT-IV QUE CONSISTE EN CULTIVAR LA CELULA HUESPED EN UN MEDIO; Y A UN SACARIDO EN EL CUAL LA CADENA DE AZUCAR SE HA MODIFICADO UTILIZANDO UNA GNT-IV. SEGUN LA PRESENTE INVENCION, SE PROPORCIONA UNA NUEVA GNT-IV, UN METODO DE PRODUCCION DE DICHA ENZIMA Y UN GEN QUE CODIFICA PARA LA MISMA. CON LA GNT-IV DE LA PRESENTE INVENCION, SE POSIBILITA LA PRODUCCION DE UN SACARIDO CON UNA ESTRUCTURA DE RAMIFICACION QUE NO SE PODIA FORMAR CON LAS GLICOSILTRANSFERASAS CONVENCIONALES. POR TANTO, LA GNT-IV DE LA INVENCION ES UTIL NO SOLO PARA PRODUCIR O MEJORAR LOS FARMACOS DE TIPO GLICOCONJUGADO, SINO PARA MODIFICAR LA ESTRUCTURA DE LA CADENA DE AZUCAR DE CUALQUIER BIOPOLIMERO.

Description

\beta-1-4 N-acetilglucosaminiltransferasa y gen que la codifica.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una nueva N-acetilglucosaminiltransferasa (transferasa GlcNAc) que reconoce una estructura de cadena de azúcar específica en un sacárido e introduce en éste una estructura ramificada de GlcNAc \beta 1 -> 4.

Antecedentes de la técnica 1. Glucoproteínas

La mayor parte de las proteínas que hay en la naturaleza no son simples proteínas compuestas de aminoácidos solos, sino que las proteínas "maduras" tienen cadenas de azúcar y otras sustancias tales como fosfatos y lípidos que se unen a éstas. Por lo tanto, el desarrollo de productos del tipo de proteínas simples producidas por Escherichia coli como huésped ha sido implicado con varios problemas porque tales productos carecen de un procedimiento de maduración de proteínas. Dado que todas las proteínas activas fisiológicamente del tipo de secreción (por ejemplo las citoquinas) son glicoproteínas con algunas excepciones, la función y el papel de las cadenas de azúcar han atraído la atención como el punto más importante en el desarrollo de productos farmacéuticos biológicos.

Las cadenas de azúcar en las glicoproteínas son clasificadas a groso modo en del tipo unida a Asn, del tipo de mucina, o del tipo de GlcNAc unida a O, del tipo marcada con GPI y del tipo de proteoglucano [Makoto Takeuchi, "Glycobiology Series 5: Glycotechnology", Kihata, Hakomori y Nagai (eds.), Kodansha Scientific Co., (1994), 191-208]. Cada una de estos tipos de cadenas de azúcar tiene su propia ruta de biosíntesis y una función fisiológica discreta. Las cadenas de azúcar unidas a Asn están extensamente distribuidas en mohos, levaduras, insectos, plantas y animales. La ruta de biosíntesis básica para cadenas de azúcar unidas a Asn se conserva más allá de la especie (figura 1). Una característica de la(s) cadena(s) de azúcar de una especie específica es que es(son) formada(s) sobre el lado externo (llamado el "lado terminal no reductor") del resto de la cadena de azúcar principal que es común en la biosíntesis de las cadenas de azúcar unidas a Asn. Una cadena de azúcar del tipo manano en la que restos de manosa \alpha 1,3- y \alpha 1,2-ramificada se unen a una cadena principal que se extiende vía enlaces \alpha 1,6 es una estructura de cadena de azúcar característica de hongos tales como las levaduras (véase el dibujo A en la figura 2) [Hiroshi Nakajima, Sugar Chain Technology, Industry Survey Association (1992), 384-397]. Por otra parte, en insectos, plantas y animales, no se observa la extensión de los restos de manosa; en cambio, se forma una cadena de azúcar del tipo alto en manosa que es una cadena de azúcar transferida de un intermedio dolicol y sólo recortada (véase el dibujo c en la figura 2). Una estructura única que tiene xilosa característica o parecida (véase el dibujo b en la figura 2) también se observa en insectos, plantas y moluscos. En animales, se observan estructuras de cadena de azúcar características tales como la cadena de azúcar de tipo compleja (dibujo e en la figura 2) y la cadena de azúcar del tipo híbrida (dibujo d en la figura 2); en las primeras, se forman estructuras ramificadas de GlcNAc en una cadena de azúcar recortada una vez, y la adición de otras clases de monosacáridos tales como galactosa y estructuras complicadas de formas del ácido siálico; en las últimas, están presentes tanto una cadena de azúcar de tipo compleja como una cadena de azúcar del tipo alta en manosa [Kiyoshi Furukawa, Sugar Chain Technology, Industry Survey Association (1992), 64-75].

Tales cadenas de azúcar como se describen anteriormente están conferidas en la mayor parte de proteínas de superficie de las células y de proteínas de secreción, y como se piensa, juegan papeles importantes que determinan la naturaleza y las propiedades de las células y las proteínas. Con todo, la parte de una estructura de cadena de azúcar que forma cadenas del tipo de ramificación alargada desde la cadena de azúcar común principal se llama estructura ramificada de cadena de azúcar. Esta estructura, como se cree, tiene la función de dar a un organismo un ligando de reconocimiento (es decir, la parte del extremo de la cadena de azúcar) en un alto grado de libertad para así proporcionar posibilidades para un reconocimiento multipuntual y otra función para maximizar la capacidad de protección para el resto de la proteína aumentando enormemente el volumen que ocupa de espacio (Takeuchi et al., supra). Por lo tanto, controlando la estructura ramificada de las cadenas de azúcar, es posible modificar las funciones fisiológicas, tales como la estabilidad in vivo, la cinética in vivo y las propiedades de reconocimiento de órgano de las glicoproteínas de varios modos. En vista a esto, se espera que la tecnología controle las estructuras ramificadas de las cadenas de azúcar tal como la biotecnología de la próxima generación para el desarrollo de productos farmacéuticos del tipo de glicoproteína que son "amigables para los seres humanos".

2. Importancia fisiológica de las cadenas de azúcar de las glicoproteínas

Las cadenas de azúcar de glicoproteínas del tipo de secreción exhiben excelentes funciones en biosíntesis, clasificación intracelular, enmascaramiento de antigenicidad, estabilidad in vivo y propiedades de reconocimiento de órgano de glicoproteínas. Se sabe que las cadenas de azúcar de proteínas de superficie de las células cambian su respuesta frente a cambios en las células (tales como diferenciación, cambiarse a un estado mórbido, cancerización). En particular, se ha publicado que hay una relación cercana entre la metástasis del cáncer y la estructura ramificada de las cadenas de azúcar.

(1) Enmascaramiento de antigenicidad

Es considerado que las cadenas de azúcar tienen un alto grado de libertad en términos de estructura estérica y así se mueven libremente como propulsores. Por lo tanto, las moléculas de proteínas tales como las proteases y los anticuerpos contra proteínas que no tienen afinidad a las cadenas de azúcar son apartadas por las cadenas de azúcar de modo que no pueden conseguir el acceso al resto de la proteína. Por consiguiente, incluso si hay antigenicidad en el resto del péptido cerca del sitio de unión de la cadena de azúcar, las moléculas de anticuerpo no pueden tener acceso al resto del péptido. Así, es extremadamente difícil que ocurra una reacción de antígeno-anticuerpo. Además, cuando una glicoproteína ha sido capturada por un macrófago y se presentan productos de degradación tal como el antígeno, los receptores tienen dificultad de acceder a los péptidos de alrededor del sitio de unión de la cadena de azúcar. De este modo, la estimulación del antígeno es difícil que ocurra. En realidad, se ha publicado que cuando han sido introducidas cadenas de azúcar a la parte central del péptido antígeno de lisozima de albúmina de clara de huevo, la unión de moléculas de clase II de MHC al antígeno se inhibe notablemente [Mouritsen, S., Meldal, M., Christiansen-Brams, I., Elsner, H. y Werdelin, O., Eur. J. Immunol., (1994), 24, 1066-1072]. El efecto de tal enmascaramiento de antigenicidad se hace mayor cuando el volumen ocupado por las cadenas de azúcar es mayor. Así, se considera que el desarrollo de una estructura ramificada contribuye enormemente al efecto de tal enmascaramiento.

(2) Estabilidad in vivo

En lo que concierne a la eritropoyetina que es el primer producto farmacéutico del tipo glicoprotéico nunca producido de una célula transgénica de animal como huésped, las funciones de las cadenas de azúcar de ésta han sido estudiadas a fondo. Por consiguiente, se ha mostrado que las cadenas de azúcar de eritropoyetina funcionan inhibitoriamente contra la unión de eritropoyetina con su receptor, pero hacen una contribución decisiva al conservar la estructura activa y la mejora de la cinética in vivo; en total, se ha mostrado que las cadenas de azúcar son esenciales para la expresión de la actividad farmacológica de eritropoyetina (Takeuchi, M. y Kobata, A., Glycobiology (1991), 1, 337-346]. En particular, ha sido encontrada una fuerte correlación entre el número de proyecciones en las cadenas de azúcar y el efecto farmacológico de la eritropoyetina, y ha sido aclarada así la importancia de su estructura ramificada (una estructura ramificada formada por restos GlcNAc que se unen a la cadena de azúcar principal) que nunca atrajo la atención anteriormente [Takeuchi, M., Inoue, N., Strickland, T. W., Kobata, M., Wada, M., Shimizu, R., Hoshi, S., Kozutsumi, H., Takasaki, S. y Kobata, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1989), 86, 7819-22]. La causa principal del fenómeno anterior se explica como sigue: la eritropoyetina sin la estructura ramificada desarrollada se limpia más bien rápidamente en el riñón y, por consiguiente, el tiempo de residencia in vivo de tal eritropoyetina se hace más corto [Misaizu, T., Matsuki, S., Strickland, T. W., Takeuchi, M., Kobata, A. y Takasaki, S., Blood, (1995), 86, 4097-4104].

(3) Propiedad de reconocimiento de órgano

La mayor parte de los tejidos biológicos tienen receptores del tipo lectina y se usan entonces en interacciones de célula-célula o toman glicoproteínas de la sangre. La lectina unida a sialoproteína en el hígado es un ejemplo representativo de un sistema explicativo para glicoproteínas viejas [Toshihiro Kawasaki, Sugar Chain Technology, Industry Survey Association (1992), 125-136]. Además, se conocen la selectina contenida en células vasculares endoteliales, plaquetas y leucocitos (Kawasaki, supra) y el receptor de lectina presente en la superficie de macrófagos y células NK (Kawasaki, supra). Además, no sólo se conocen glicoproteínas, sino también células que se juntan en un tejido específico usando las cadenas de azúcar como ligandos. Los casos del retorno de las células de la médula ósea [Tatsuo Irimura, "Glycobiology Series 3: Glycobiology in Cell Society", Katsutaka Nagai, Senichiro Hakomori y Akira Kobata (eds.), Kodansha Scientific Co., (1993), 127-175] y el reclutamiento de neutrófilos en sitios inflamatorios (Irimura, supra) son examinados detalladamente. Reuniendo todas estas cosas, puede ser bien asumido que las glicoproteínas y las células tienen, vía sus estructuras de cadena de azúcar, la propiedad del reconocimiento de órganos específicos o tejidos que presentan un receptor de lectina en la circulación de la sangre, aunque tal sistema de reconocimiento no sea encontrado en todo el órgano. Esto significa que el suministro de fármaco mediante cadenas de azúcar es posible. En tal suministro de fármaco, la afinidad de la lectina por las cadenas de azúcar está enormemente inflluenciada por el grado de libertad y el número de ligandos de la cadena de azúcar. Por lo tanto, la estructura ramificada de las cadenas de azúcar será el punto más importante en tal suministro de fármaco.

(4)

"Correlation between Cells' Change into Morbid State and Sugar Chain Branched Structure thereof" [Junko Kato, Naoko Suzuki, "Sugar Chain Technology and Development of Pharmaceutical", Foundation for the Relief and Study of Injury Caused by Pharmaceutical Side Effect (ed.), Yakugyo-Jiho-Sha, (1994), 107-13214].

Una vez que una lectina de planta llamada L-PHA ha sido desarrollada como una sonda para detectar una estructura de cadena de azúcar del tipo multi-ramificada, se ha hecho posible examinar varias muestras de tejido mórbidas. De acuerdo con esto, ha sido encontrada una tendencia por la que algunos tipos de células cancerígenas, particularmente, células cancerígenas con una alta capacidad de metástasis se tiñen bien con L-PHA. Así, los investigadores se han dado cuenta de la correlación entre la estructura ramificada de las cadenas de azúcar y la capacidad de metástasis de las células cancerígenas. La gonadotropina coriónica humana (hCG) es una hormona glicoproteica enérgicamente biosintetizada en la vellosidad placentaria en una etapa temprana del embarazo. Ya que se descarga una cantidad considerable de hCG en la orina, la hCG se utiliza clínicamente como un indicador del embarazo. Las cadenas de azúcar unidas a Asn principalmente formadas por cadenas del tipo mono- y bi-catenarias complejas son características de hCG. Como el cáncer aumenta su malignidad de trofoblastoma a corioadenoma y de corioadenoma a coriocarcinoma, se dice que las cadenas de azúcar tri-catenaria del tipo 2,4,2 y las cadenas de azúcar anormales bicatenarias (ambas se forman por la acción de GnT-IV en las cadenas de azúcar mono-catenarias normales como bicatenarias, respectivamente) aparecen en las cadenas de azúcar de hCG [Katsuko Yamashita, Protein, Nucleic Acid and Enzyme (1992), 37, 1880-1888]. Como una causa de este fenómeno, se sugiere que la actividad de GnT-IV aumenta cuando la malignidad del coriocarcinoma progresa.

La \gamma-Glutamiltranspeptidasa (\gamma-GTP) es una glicoproteína que se da específicamente como abundante en el hígado. Ya que el nivel de la \gamma-GTP en suero aumenta drásticamente cuando hay una enfermedad del hígado, este nivel se usa como indicador clínico de la enfermedad del hígado. Además, Yamashita et al. [Yamashita, K., Totani, K., Iwaki, Y., Takamisawa, I., Takeishi, N., Higashi, T., Sakamoto, Y. y Kobata, A., J. Biochem., (1989), 105, 728-735] han encontrado que, como consecuencia de la cancerización de las células, la estructura de cadena de azúcar de \gamma-GTP cambia de modo anormal de su estructura ramificada similar a la de hCG anormal; así, ellos han publicado sobre la correlación entre la cancerización y la activación de GnT-IV. Las cadenas de azúcar unidas a Asn de \gamma-GTP derivadas de células de hígado sanas humanas están compuestas principalmente de cadena de azúcar de tipo bicatenaria compleja con pequeñas cantidades de cadenas tri-catenarias y tetra-catenarias de azúcar mezcladas en ella. Al contrario, fue observado un aumento notable del grado de ramificación en las cadenas de azúcar unidas a Asn de \gamma-GTP derivada de células humanas de hepatomas. Al mismo tiempo, aunque en pequeñas cantidades, aparecieron cadenas de azúcar del tipo de alta en manosa y cadenas de azúcar anormales bicatenarias (ambas de las cuales no fueron observadas en la \gamma-GTP de células normales). Como una causa de estos cambios de la estructura de la cadena de azúcar, surge una posibilidad de que la N-acetilglucosaminiltransferasa IV (GnT-IV) y V (GnT-V) sean activadas en relación con la cancerización de células del hígado (Yamashita et al., supra).

También se ha publicado que la estructura ramificada de la cadena de azúcar de una glicoproteína en células cambia enormemente por infección viral (Yamashita et al., supra). Las células BHK tienen estructuras de cadena de azúcar con ramificación hasta del tipo de tetra-catenaria. Cuando las células BHK son transformadas con poliomavirus, hay disminución de cadenas de azúcar del tipo bicatenarias en las cadenas de azúcar de glicoproteína producidas por las células, mientras que aumentan las cadenas de azúcar del tipo tetra-catenaria y las estructuras de repetición de N-acetillactosamina; en resumen, fue reconocido un aumento notable del número de ramificaciones [Takasaki S., Ikehira, H. and Kobata A., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1980), 90, (3), 735-742]. Como una causa del cambio anterior, puede ser considerada la activación de GnT-IV, GnT-V e i-GnT.

3. Enzimas relacionadas con las estructuras ramificadas de las cadenas de azúcar de las glicoproteínas

Las cadenas de azúcar de tipo complejas, que son estructuras de cadena de azúcar de glicoproteína características en animales, tienen una estructura ramificada complicada en la que los restos de N-acetilglucosamina (GlcNAc) se unen a la estructura común principal de varios modos (Kiyoshi Furukawa, supra) (figura 1). Ya que esta estructura ramificada está estrechamente relacionada con la estabilidad in vivo e in vitro, la localización, la actividad biológica y las propiedades farmacológicas de las glicoproteínas (Makoto Takeuchi, supra), ha sido investigado detalladamente el procedimiento de biosíntesis de la estructura ramificada. Usando sustratos inventivos H. Schachter et al. han distinguido varias actividades de enzima en las trompas de falopio de mujeres para así predecir la presencia de enzimas que forman ramificación en GlcNAc a partir de GnT-I a GnT-VI (grupo de glucosiltransferasas de GlcNAc; figura 3) [Glesson, P. A. y Schachter, H., J. Biol. Chem., (1983), 258, 6162-6173]. A partir de entonces, han sido sucesivamente purificados GnT-I [Kumar, R., Yang, J., Larsen, R. D. y Stanley P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1990), 87, 9948-9952; Sarkar, M., Hull, E., Nishikawa, Y., Simpson, R. J., Moritz, R. L., Dunn, R. y Schachter, H., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, (1991), 88, 234-238], GnT-II [D'Agostaro, GA., Zingoni, A., Moritz, RL., Simpson, RJ., Schachter, H. y Bendiak, B., J. Biol. Chem., (1995), 270, 15211-21], GnT-III [Nishikawa, A., Ihara, Y., Hatakeyama, M., Kangawa, K. y Taniguchi, N., J. Biol. Chem., (1992), 267, 18199-18204] y GnT-V [Shorebah, M. G., Hindsgaul, O. y Perforan, M., J. Biol. Chem., (1992), 267, 2920-2927; Gu, J., Nishikawa, A., Turuoka, N., Ono, M., Yamaguchi, N., Kangawa, K. y Taniguchi, N., J. Biochem., (1993), 113, 614-619], y sus genes han sido clonados. Sin embargo, con estas conocidas transferasas GlcNAc solas, es imposible formar la cadena principal de azúcar (del tipo tetra-catenaria; véase la fórmula debajo) encontrada en \alpha 1 glicoproteína ácida conocida como una glicoproteína de la sangre humana representativa [Yoshima, K., Tsuji, T., Irimura, T. y Osawa, T, J. Biol. Chem., (1984), 256, 10834-10840] y eritropoyetina (Takeuchi, M., Takasaki, S., Shimada, M. y Kobata, A., J. Biol. Chem., (1990), 265, 12127-12130]. Por lo tanto, una N-acetilglucosaminiltransferasa que tiene tal especificidad de sustrato y especificidad de reacción en GnT-IV como se espera ha sido buscada como un eslabón perdido.

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Estructura de una cadena de azúcar del tipo tetracatenaria

Además de las mencionadas anteriormente, las siguientes N-acetilglucosaminiltransferasas han sido purificadas o sus genes han sido clonados: una transferasa que actúa sobre cadenas de azúcar de tipo mucina [Bierhuizen, M. F., Maemura, K. y Fukuda, M., J. Biol. Chem., (1994), 269, 4473-4479], una transferasa que actúa sobre los glucolípidos, y una transferasa que forma epítopo de cadena de azúcar conocida como la estructura antígena I \cdot i [Kawashima, H., Yamamoto, K., Osawa, T. y Irimura, T., J. Biol. Chem., (1993), 268, 27118-27126; Bierhuizen, M. F., Mattei, M. G. y Fukuda, M., Genes Dev., (1993), 7, 468-478]. Sin embargo, la especificidad de sustrato de estas transferasas y el modo de unión del grupo GlcNAc transferido por estas transferasas son diferentes de las de GnT-IV. Cualquiera de estas transferasas no proporciona productos que se parezcan a los productos de GnT-IV.

Descripción de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar una enzima que tenga actividad con \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa (denominada de aquí en adelante en este documento como "GnT-IV"); un gen que codifique la enzima; un DNA recombinante que comprenda el gen; una célula que contenga el DNA recombinante; un método para producir una proteína enzimática que tenga actividad con GnT-IV que comprende cultivar las células en un medio; y un sacárido en el que las cadenas de azúcar están modificadas con GnT-IV.

En la dirección hacia la solución de las tareas anteriores, los presentes inventores han hecho investigaciones intensivas y extensas. Como resultado, los inventores han aislado y han purificado una proteína enzimática de GnT-IV del intestino delgado bovino, y han caracterizado las propiedades bioquímicas de la proteína. Luego, los inventores han tenido éxito en la clonación de un gen que codifica para la GnT-IVa bovina de una genoteca de cDNA y mRNA del intestino delgado basada en una secuencia de aminoácidos parcial de la proteína enzimática anterior. Además, basado en un gen bovino de GnT-IVa, los inventores han tenido éxito en la clonación de dos genes que codifican para GnT-IVa humana y GnT-IVb humana, a partir de genotecas de cDNA y mRNAs de hígado humano y pulmón humano, respectivamente. La presente invención ha sido completada confirmando que los productos de estos genes exhiben actividad para GnT-IV.

La primera invención de la presente solicitud se refiere a una GnT-IV que tiene una actividad para producir un sacárido que tiene una estructura parcial representada por la fórmula siguiente:

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usando UDP-GlcNAc como donante de azúcar y un sacárido que tiene una estructura parcial representada por la fórmula siguiente como receptor de azúcar:

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La segunda invención se refiere a una GnT-IV que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 18 o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 18 que sufre la adición, la deleción o la sustitución de uno o varios restos de aminoácidos y que produce todavía actividad para GnT-IV; una GnT-IV que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 24 o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 24 que sufre la adición, la deleción o la sustitución de uno o varios restos de aminoácidos y que produce todavía actividad para GnT-IV; y una GnT-IV que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 37 o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 37 que sufre la adición, la deleción o la sustitución de uno o varios restos de aminoácido y que produce todavía actividad para GnT-IV.

La tercera invención se refiere a un gen de GnT-IV que codifica para una GnT-IV que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 18 o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 18 que sufre la adición, la deleción o la sustitución de uno o varios restos de aminoácidos y que produce todavía actividad para GnT-IV; un gen de GnT-IV que codifica para una GnT-IV que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 24 o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 24 que sufre la adición, la deleción o la sustitución de uno o varios restos de aminoácidos y que produce todavía actividad para GnT-IV; un gen de GnT-IV que codifica para una GnT-IV que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 37 o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 37 que sufre la adición, la deleción o la sustitución de uno o varios restos de aminoácidos y que produce todavía actividad para GnT-IV; un gen de GnT-IV que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID Nº. 17; un gen de GnT-IV que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID Nº. 23; y un gen de GnT-IV que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID Nº. 36.

La cuarta invención se refiere a un DNA recombinante fácil de conseguir insertando cualquiera de los genes anteriores de GnT-IV en un vector de DNA; y un fragmento cromosómico que comprende una parte o todo de cualquiera de los genes anteriores de GnT-IV.

La quinta invención se refiere a una célula huésped que lleva el DNA anterior recombinante; y una célula huésped en la que el fragmento anterior cromosómico se introduce artificialmente.

La sexta invención se refiere a un método para producir una GnT-IV que comprende cultivar la célula huésped anterior en un medio y recuperar la GnT-IV del cultivo resultante; y un método para producir una GnT-IV que comprende recuperar la enzima GnT-IV de secreciones, de fluidos corporales u homogenados originados de la célula huésped anterior.

La séptima invención se refiere a un método para purificar la GnT-IV a partir de muestras biológicas.

La octava invención se refiere a un sacárido cuya estructura de cadena de azúcar es modificada con la GnT-IV.

A continuación en este documento la presente invención será descrita detalladamente.

El gen de GnT-IV de la invención puede ser aislado como se describe a continuación.

Aislamiento del gen GnT-IVa bovino

Primero, se somete una fracción de microsoma de intestino delgado bovino solubilizado con un detergente a una serie de procedimientos de purificación usando cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de quelato de cobre, cromatografía de afinidad en dos pasos usando un análogo de sustrato y filtración de gel para obtener así una muestra purificada de la enzima de GnT-IV. La muestra purificada resultante se somete a SDS-PAGE y luego se transfiere a una membrana de PVDF. La proteína transferida, como tal o después de la hidrólisis restringida, se analiza con un secuenciador de aminoácidos en fase gaseosa para obtener una secuencia de aminoácidos parcial para la enzima de GnT-IV.

Posteriormente, se realiza una RT-PCR en el RNA extraído de las células del animal (es decir, intestino delgado bovino) como plantilla usando iniciadores diseñados basado en las secuencias de aminoácidos parciales determinadas anteriormente. Además, usando un fragmento obtenido por RT-PCR como una sonda, el gen de GnT-IV de interés se selecciona a partir de una genoteca de cDNA a partir del tejido anteriormente mencionado por hibridación en placa. Un fragmento de cDNA contenido en la placa positiva resultante se corta y se subclona en un vector tal como pUC19, seguido por el análisis de su secuencia de nucleótidos. Si la longitud completa del gen que codifica para la proteína de interés no está contenida en el fragmento, la hibridación en placa se realiza de nuevo usando una parte del fragmento de cDNA subclonado como sonda. De forma alternativa, las partes terminales del cDNA de interés son obtenidas por RACE o parecido basado en la información de la secuencia de nucleótidos obtenida anteriormente. El gen de GnT-IV así obtenido (que se llama de aquí en adelante en este documento GnT-IVa) se somete al análisis de su secuencia de nucleótidos entera. Posteriormente, la secuencia de aminoácidos es traducida del gen que tiene la secuencia de nucleótidos anteriormente mencionada. Esta secuencia de aminoácidos es como muestra la SEC. ID Nº. 18.

Aislamiento de los genes GnT-IVa y GnT-IVb humanos

Los genes GnT-IVa y GnT-IVb humanos pueden ser obtenidos realizando una RT-PCR usando el RNA extraído de un tejido humano (hígado o pulmón) y basado en la información sobre la secuencia de nucleótidos del gen GnT-IVa bovino como se obtiene anteriormente, seguido de la selección de una genoteca de cDNA del tejido anterior. Los genes GnT-IVa y GnT-IVb resultantes humanos se someten al análisis de sus secuencias de nucleótidos enteras. Posteriormente, las secuencias de aminoácidos son traducidas por estos genes. Estas secuencias de aminoácidos son como muestran las SEC. ID N^{os}.: 24 y 37.

Para obtener un DNA que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 18, 24 o 37 que sufra la adición, la deleción o la sustitución de uno o varios restos de aminoácidos, pueden usarse un número de métodos. Por ejemplo, pueden enumerarse un método para tratar DNA con un mutágeno para inducir una mutación puntual o una mutación por deleción; un método que comprende romper DNA selectivamente, eliminando o añadiendo un nucleótido seleccionado y luego ligar el DNA; la mutagénesis dirigida; y similares.

La proteína GnT-IV de la invención puede ser producida preparando un vector recombinante en el que se inserta un DNA que codifica para la GnT-IV de la invención obtenida por el método descrito anteriormente corriente abajo de un promotor, introduciendo el vector en una célula huésped y cultivando las células resultantes. El DNA del vector usado para este propósito puede ser DNA de plásmido o DNA de bacteriófago. Por ejemplo, puede usarse el vector pSVL (Pharmacia, Suecia) mostrado en un Ejemplo descrito más adelante. Como célula huésped en la que se introduce el DNA recombinante resultante, se usa cualquier célula que pueda usarse de manera convencional en técnicas de DNA recombinante, por ejemplo, una célula procariota, una célula animal, una levadura, un hongo, una célula de insecto. Ejemplos específicos incluyen Escherichia coli como una célula procariota y células CHO de hámster chino o células COS de mono como célula de animal.

La transformación de la célula huésped descrita anteriormente se realiza por métodos convencionales para cada huésped. Por ejemplo, si el huésped es E. coli, un vector que comprende DNA recombinante se introduce por el método de choque de calor o electroporación en células competentes preparadas por el método de calcio o similar. Si el huésped es levadura, un vector que comprende DNA recombinante se introduce por el método de choque de calor o electroporación en células competentes preparadas por el método de litio o similar. Si el huésped es una célula de animal, un vector que comprende DNA recombinante se introduce en la célula en la fase de crecimiento o similar por el método de fosfato de calcio, lipofección o electroporación.

Cultivando el transformante así obtenido en un medio, se produce la proteína GnT-IV.

En el cultivo de un transformante, puede usarse cualquier medio mientras el huésped sea viable para ello. Por ejemplo, puede usarse el medio LB o similar si el huésped es E. coli. Si el huésped es levadura, puede usarse el medio YPD o similar. Si el huésped es una célula de animal, puede usarse el medio de Dulbecco suplementado con un suero de animal o similar. El cultivo se realiza en las condiciones convencionales usadas para el huésped. Por ejemplo, si el huésped es E. coli, las células se cultivan a aproximadamente 30-37ºC durante aproximadamente 3-24 horas con, si fuera necesario, aireación y/o agitación. Si el huésped es la levadura, las células se cultivan a aproximadamente 25-37ºC durante aproximadamente de 12 horas a 2 semanas con, si fuera necesario, aireación y/o agitación. Si el huésped es una célula de animal, el cultivo se realiza a aproximadamente 32-37ºC en 5% de CO_{2} y humedad del 100% durante aproximadamente de 24 horas a 2 semanas con, si fuera necesario, cambio de las condiciones de aireación y/o agitación.

Después del cultivo, el microorganismo cultivado o las células se interrumpen usando un homogeneizador, prensa francesa, sonicación, lisozima y/o liofilación para así eluir la proteína GnT-IV fuera del microorganismo o las células. Después, la proteína puede obtenerse a partir de fracciones solubles. Si la proteína de interés está contenida en fracciones insolubles, las fracciones insolubles son recogidas por centrifugación después de la interrupción del microorganismo o las células. Entonces, la proteína puede solubilizarse con un tampón que contenga hidrocloruro de guanidina o similar para la recuperación. De forma alternativa, el microorganismo cultivado o las células pueden ser interrumpidos directamente con un tampón que contenga un agente de desnaturación de proteínas tal como el hidrocloruro de guanidina para así eluir la proteína de interés fuera del microorganismo o las células.

La purificación de la proteína GnT-IV del sobrenadante anterior puede realizarse por el método descrito en el Ejemplo 1. De forma alternativa, esta purificación puede realizarse de manera apropiada combinando métodos de separación/purificación convencionales. Estos métodos de separación/purificación convencionales incluyen, pero no están limitados con centrifugación, precipitación de proteínas por sales, precipitación por disolvente, diálisis, ultrafiltración, cromatografía de reparto, filtración en gel, electrofóresis capilar, TLC, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de quelato metálico, cromatografía de afinidad, cromatografía de fase inversa y enfoque isoeléctrico.

Las propiedades bioquímicas de la proteína enzimática GnT-IV obtenida de intestino delgado bovino como se describe anteriormente son como sigue.

(1) Acción

Esta proteína enzimática produce un sacárido que tiene una estructura parcial representada por la fórmula siguiente:

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usando UDP-GlcNAc como donante de azúcar y un sacárido que tiene una estructura parcial representada por la fórmula siguiente como receptor de azúcar:

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El sacárido como receptor de azúcar significa un oligosacárido, polisacárido, glucoconjugado (glucopéptido, glicoproteína, glucolípido o proteoglucano) o uno de sus derivados.

(2) Especificidad del sustrato

Cuando el receptor de azúcar es un oligosacárido (para las estructuras de oligosacáridos, véase la figura 4), la proteína enzimática exhibe reactividades de 0% con los oligosacáridos de los tipos principales, 54% con oligosacáridos del tipo de producto de GnT-I y 164% con oligosacáridos del tipo de producto de GnT-V, en el que la reactividad de la proteína enzimática con oligosacáridos del tipo de producto de GnT-II es considerada como del 100%.

La proteína enzimática exhibe una reactividad del 46% con una estructura de oligosacáridos del tipo producto de GnT-II en la que la fucosa se une vía el enlace \alpha 1 -> 6 a la GlcNAc en el extremo reductor.

La proteína enzimática exhibe una reactividad del 0% con una estructura de oligosacáridos del tipo producto de GnT-II en la que la GlcNAc carece de \alpha 1 -> 3 manosa.

La proteína enzimática exhibe una reactividad del 16% con una estructura de oligosacáridos del tipo producto de GnT-II en la que la galactosa se une vía el enlace \beta 1 -> 4 a la GlcNAc en la \alpha 1 -> 6 manosa, y una reactividad del 0% con una estructura de oligosacáridos del tipo producto de GnT-II en la que la galactosa se une vía el enlace \beta 1 -> 4 a la GlcNAc en la \alpha 1 -> 3 manosa.

La proteína enzimática exhibe una reactividad del 0% con una estructura de oligosacáridos del tipo producto de GnT-II en la que la GlcNAc se une vía el enlace \beta 1 -> 4 a la \beta 1 -> 4 manosa.

(3) Peso molecular

Aproximadamente 66 K como se determina por SDS-PAGE (en condiciones no reductoras). Aproximadamente 60 K después del tratamiento con el péptido N-glucosidasa F. Ya que se observa un cambio de la banda cuando se usa el péptido N-glucanasa, la proteína enzimática, como se cree, es una glicoproteína.

El peso molecular aparente como se determina por filtración con un gel que contiene Triton X-100 es 77 K. Así, se piensa que GnT-IV no tiene una estructura de subunidad y que funciona como un monómero.

El resto proteico de esta enzima deducido de su secuencia de nucleótidos consiste en 535 restos de aminoácidos y tiene un peso molecular de 61614.

(4) pH óptimo

El pH óptimo para la reacción es de aproximadamente 5,5. Más del 50% de la actividad máxima se observa en el intervalo de pH de 6,5 a 8,0.

(5) Inhibición, activación y estabilización (i) Inhibición

La actividad de esta enzima se inhibe por la adición de EDTA 20 mM.

Esta enzima se inhibe con derivados de UDP. La intensidad de inhibición está en el intervalo siguiente: UDP >> UDP-Glc > UDP-GalNAc >> 2'-desoxi UDP > UDP-hexanolamina >> UDP-Gal > UTP> UDP-ácido-glucurónico > UMP.

Uridina, TDP y CDP no tienen efecto inhibitorio.

(ii) Activación

Un catión divalente es esencial para la expresión de la actividad. Entre los cationes divalentes, el Mn^{2+} muestra el mayor efecto. A una concentración de 7,5 mM, los efectos respectivos de Co^{2+} y Mg^{2+} son aproximadamente del 70% de él de Mn^{2+}, y el efecto de Ca^{2+} es aproximadamente de 10% de él de Mn^{2+}. El efecto de Mn^{2+} es el mayor en el intervalo de 5 a 20 mM.

(iii) Estabilización

El efecto de estabilización se reconoce en BSA y glicerol.

(6) Parámetros cinéticos

Cuando el sacárido como receptor es un oligosacárido (para las estructuras de oligosacárido, véase la figura 4):

(i) bajo condiciones de ensayo en las cuales la enzima se hace reaccionar en 50 \mul de tampón MOPS 125 mM (pH 7,3) que contenía el sustrato receptor 0,8 mM, UDP-GlcNAc 20 mM, MnCl_{2} 7,5 mM, GlcNAc 200 mM, 0,5% (p/v) de Triton X-100, 10% de glicerol y 1% de BSA a 37ºC durante 4 horas:

Los valores de Km y Vmax del oligosacárido del tipo producto de GnT-II son 0,73 mM y 3,23 \muM/minuto, respectivamente.

Los valores de Km y Vmax del oligosacárido del tipo producto de GnT-V son 0,13 mM y 1,75 \muM/minuto, respectivamente.

Cuando el oligosacárido del tipo producto de GnT-II es el sustrato receptor, el valor de Km con UDP-GlcNAc es 0,22 mM.

(ii) bajo condiciones de ensayo en las cuales la enzima se hace reaccionar en tampón MOPS 125 mM (pH 7,3) que contenía UDP-GlcNAc 120 mM, MnCl_{2}7,5 nM, Triton X-100 del 0,5% (p/v), glicerol del 10% y BSA del 1% a 37ºC durante 4 horas:

Los valores de Km y Vmax del oligosacárido del tipo producto de GnT-II son 0,59 mM y 0,74 mM/min/mg, respectivamente.

Los valores de Km y Vmax del oligosacárido del tipo producto de GnT-V son 0,14 mM y 0,47 mM/min/mg, respectivamente.

(7) Familia de GnT-IV

La homología entre GnT-IVa bovino y GnT-IVa humano es del 91% al nivel de ácidos nucleicos y del 96% al nivel de aminoácidos.

Todas las estructuras de aminoácidos parciales contenidas en la GnT-IV purificada de intestino delgado bovino son codificadas en el gen GnT-IVa bovino.

El GnT-IVb humano y el GnT-IVa humano tienen una homología del 63% al nivel de ácidos nucleicos y una homología del 62% al nivel de aminoácidos. Sin embargo, son completamente diferentes en las regiones del extremo C y del extremo N.

De las propiedades bioquímicas descritas anteriormente, la GnT-IV de la invención ha sido reconocida como una nueva enzima hasta el punto que esta enzima es capaz de realizar la reacción siguiente que otras enzimas convencionales no pueden realizar:

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Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una ruta biosintética de cadenas de azúcar unidas a Asn.

La figura 2 muestra las variaciones de la cadena de azúcar unida a Asn (revisado de la figura 1 en Makoto Takeuchi, Wako Purechemical Newsletter 64, 18-19, 1996).

a.

Tipo manano: una estructura de cadena de azúcar característica de hongos tales como levaduras y mohos.

b.

Tipo manosa alta en xilo: una estructura característica de plantas, moluscos e insectos.

c.

Tipo manosa alta: una estructura comúnmente vista en plantas, insectos y animales.

d.

Tipo híbrido: una estructura comúnmente vista en insectos y animales.

e.

Tipo complejo: una estructura característica de animales.

f.

Células procariotas: que no tenga ningún sistema para la biosíntesis de cadenas de azúcar unidas a Asn.

La parte encajada con líneas de puntos representa la cadena de azúcar común principal.

La figura 3 muestra las posiciones de la transferencia de GlcNAc por diversas GlcNAc transferasas (glucosiltransferasas GlcNAc).

La figura 4 muestra las denominaciones y las estructuras de los oligosacáridos.

La figura 5 muestra un cromatograma perteneciente a una cromatografía líquida de alta resolución para los productos de reacción de GnT-IV.

La figura 6 muestra los resultados del análisis de GnT-IV por cromatografía de Q-Sepharose FF.

La figura 7 muestra los resultados del análisis de GnT-IV por cromatografía de quelato de cobre Sepharose FF.

La figura 8 muestra los resultados del análisis de GnT-IV por cromatografía de afinidad en agarosa UDP-Hexanolamina (I).

La figura 9 muestra los resultados del análisis de GnT-IV por cromatografía de afinidad en agarosa UDP-Hexanolamina (II).

La figura 10 muestra los resultados del análisis de GnT-IV por cromatografía en gel de Superdex 200.

La figura 11 es una fotografía que muestra los resultados de SDS-PAGE (electrofóresis en gel de poliacrilamida SDS) de GnT-IV purificada.

La figura 12 muestra los resultados de la electrofóresis de gel nativo de GnT-IV purificado y su actividad.

La figura 13 muestra el perfil de degradación de Smith de oligosacáridos del tipo producto de GnT-IV, -V y -VI.

La figura 14 muestra los resultados de ^{1}H-RMN (30ºC) del producto de reacción de GnT-IV.

La figura 15 muestra el pH óptimo para GnT-IV.

La figura 16 muestra la concentración de Mn^{2+} óptima para GnT-IV.

La figura 17 muestra los resultados del análisis por SDS-PAGE y fluorocromatografía de glicoproteínas que son los productos de reacción de GnT-IV.

Rutas 1 y 2: 7,6 \mug de asialo agalacto transferrina humana

Ruta 3: 7,6 \mug de asialo transferrina humana

Rutas 4 y 5: 2,8 \mug de asialo agalacto, eritropoyetina derivada de células CHO recombinantes humanas

Rutas 6 y 7: 1,3 \mug de asialo agalacto fetuina

Las rutas 1, 4 y 6 representan experimentos control en los cuales la reacción fue realizada sin GnT-IV. M representa marcadores moleculares (BioRad). PM representa marcadores moleculares pre-marcados (BioRad, EE.UU).

Condiciones de reacción de GnT-IV: A 10 \mul de una solución que contenía 0,702 mnol/h de GnT-IV, se le añadió una glicoproteína sustrato equivalente a 1,6 nmol de cadenas de azúcar del tipo bicatenaria (para fetuina solo, el contenido de la cadena de azúcar era de 1,6 nmol) y 450 nCi de UDP-[^{14}C] GlcNAc, un volumen igual de una mezcla de ensayo (tampón MOPS 250 mM, pH 7,3, GlcNAc 400 mM, glicerol del 20%, Triton X-100 del 1,0% (p/v), MnCl_{2}15 mM, UDP-GlcNAc 1 mM) para obtener una solución de reacción, que fue incubada a 37ºC durante 20 horas. Una décima parte de la solución resultante fue analizada con SDS-PAGE y fluorografia.

Para la SDS-PAGE, fue usado un gel de gradiente del 10-20% (Daiichi Kagaku). Para la fluorografia, fue usado Amplify (Amersham) para exponer las muestras a películas de rayos X durante 20 horas. La visualización de las cadenas bicatenarias de azúcar en la glicoproteína fue realizada usando ConA-HRP y un kit POD-Immunostain (Wako Purechemical) después del "dot-blotting" en una membrana de PVDF.

La figura 18 muestra el marco de lectura abierto de GnT-IVa humano y la región contenida en el vector de expresión PCore-His.

La figura 19 muestra los resultados del análisis de enfoque isoeléctrico y Western de eritropoyetinas producidas por clones de células individuales. Usando dos cepas que producían eritropoyetina y las mismas cepas en las cuales fueron introducidos genes GnT-IVa bovino y humano, respectivamente, fue analizada la eritropoyetina secretada por cada cepa por enfoque isoeléctrico y transferencia Western usando el anticuerpo de antieritropoyetina. En el lado izquierdo, se muestran las posiciones de los marcadores de pI.

Los mejores modos para llevar a cabo la invención

A continuación en este documento, la presente invención será descrita más detalladamente con referencia a los Ejemplos siguientes. Sin embargo, la presente invención no está limitada a estos Ejemplos.

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Ejemplo de Referencia 1

(1) Reactivos usados en los Ejemplos

A no ser que se indique de otra manera, los reactivos usados fueron los productos de calidad más alta fabricados por Industrias Wako Purechemical, Ltd.

(i) Oligosacáridos piridilaminados

Cada uno de los oligosacáridos piridilaminados usados fue obtenido como se describe debajo. En primer lugar, fueron preparados oligosacáridos, piridilaminados de transferrina humano (tipo apo; Sigma, EE.UU.) de acuerdo con el método de Tokugawa et al. [Biehuizen, M.F., Mattei, M.G. y Fukuda, M. (1993) Genes Dev., 7, 468-478]. El material resultante fue tratado con una o una combinación de las enzimas siguientes: sialidasa derivada de Arethrobacter ureafaciens (Nacalai Tesque), \beta-galactosidasa derivada de la especie Asperugillus (Toyobo), \beta-N-acetilhexosaminidasa derivada de semilla Jack (Seikagaku Corp.), fracción activa de GnT-V en extracto de células CHO-K1 (sobrenadante obtenido por sonicación de células CHO-K1 en 2 volúmenes de tampón Tris-HCl 5 mM, pH 7,5, conteniendo MgCl_{2} 2 mM y PMSF 1 mM, y luego centrifugación a 900 x g durante 10 minutos), y la fracción activa de GnT-V en la fracción solubilizada del homogenado de intestino delgado bovino (para el método de la preparación, véase la "Preparación de la Fracción de Microsoma" y "Solubilización" en el Ejemplo 1). Una parte de los oligosacáridos piridilaminados fue preparada tratando la cadena de azúcar PA 021 y 022 (Takara Shuzo) con las enzimas anteriores. En ambos casos, los oligosacáridos preparados fueron purificados por cromatografía en fase inversa usando una columna ODS (10 x 250 mm; Vydac, EE.UU.) antes de su uso.

(ii) Sustratos de glicoproteína

Fetuina bovina (Sigma, EE.UU.) y eritropoyetina derivada de células CHO recombinantes humanas (Kirin Brewery) fueron sometidos al pretratamiento siguiente para purificarlos en una glucoforma relativamente uniforme. Brevemente, 40-100 mg de la glicoproteína fueron aplicados a una columna ConA-Sepharose (5 ml; Pharmacia, Suecia) equilibrada con tampón Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, conteniendo MgCl_{2}1 mM, CaCl_{2} 1 mM y NaCl 0,15 M para así obtener un glucoforma con un contenido de cadenas de azúcar bicatenarias bajo como fracción no adsorbida. A partir de entonces, la columna fue eluida con el tampón anterior que contenía \alpha-metil manosida 1,0 M (Nacalai Tesque) para así obtener la fracción que adsorbe una glucoforma con un alto contenido de cadenas de azúcar bicatenarias. Así, fueron obtenidos fetuina con un contenido de cadenas de azúcar bicatenarias bajo y eritropoyetina con un alto contenido de cadenas de azúcar bicatenarias. En lo que concierne a la transferrina humana, no hay ninguna necesidad de purificar esta glicoproteína dado que casi todas sus cadenas de azúcar son bicatena-
rias.

Se hicieron reaccionar fetuina así obtenida y transferrina humana individualmente con 1 U de sialidasa y 0 o 107 U de \beta-galactosidasa en 1 ml de tampón acetato de sodio 0,4 M, pH 5,0, conteniendo MgCl_{2} 4 mM a 37ºC durante 16 horas para así obtener asialo o glicoproteínas de asialo agalacto. La eritropoyetina con un alto contenido de cadenas de azúcar bicatenarias se hizo reaccionar con 0,5 U de sialidasa y 5 U de \beta-galactosidasa en la misma manera que se describe anteriormente para obtener una glicoproteína de asialo agalacto.

Cada uno de los sustratos de glicoproteína así obtenidos fue dializado contra tampón acetato de amonio 50 mM, pH 7,3. Después, fue determinada la cantidad de proteína con un ensayo de proteínas BCA (Pierce, EE.UU.) usando BSA (albúmina de suero bovino) como estándar. Además, la proteína fue analizada por SDS-PAGE (electrofóresis de gel de poliacrilamida de dodesil-sulfato de sodio). Las glucoproteínas así preparadas fueron usadas en los Ejemplos.

(iii) RT-PCR (Reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa)

Para la RT-PCR fue usado un sistema de RT-PCR Access (Promega, EE.UU.). Para la amplificación de un fragmento de un gen de interés, fue usada la polimerasa de Pfu (Stratagene, EE.UU.).

(2) Equipo usado en los Ejemplos (i) Secuenciación del gen

Fue usado el secuenciador de DNA ABI PLISM 377 (Perkin-Elmer, EE.UU.).

Ejemplo de referencia 2

Ensayo específico para la actividad de GnT-IV

Generalmente, hay dos métodos para ensayar la actividad de GnT-IV: un método en el que la transferencia de GlcNAc radiomarcada a un sustrato de oligosacárido se examina y un método en que la transferencia de GlcNAc a un sustrato de oligosacárido marcado se analiza fraccionalmente por HPLC o similar. Taniguchi et al. han desarrollado un método en el que las actividades de GnT-III, -IV y -V se determinan simultáneamente usando el oligosacárido del tipo producto de GnT-II como receptor [Nishikawa, A., Fujii, S., Sugiyama, T. y Taniguchi, N. (1988) Anal. Biochem., 170, 349-354]. Sin embargo, este método de ensayo era inadecuado para el ensayo durante la purificación de GnT-IV porque la actividad relativa de GnT-IV es mucho menor que las de GnT-III y -V.

Por esto, los presentes inventores han desarrollado un método para determinar la actividad de GnT-IV cuantitativamente y con sensibilidad aumentando la cantidad del oligosacárido piridilaminado aceptor a 10 veces comparada con la cantidad usada en el sistema de ensayo anterior [Tokugawa, K., Oguri, S. y Takeuchi, M. (1996) Glycoconjugate J., 13, 53-56]. Generalmente, es muy difícil preparar una cantidad tan grande de oligosacáridos aceptores. Sin embargo, de acuerdo con el método de Tokugawa et al. [Tokugawa, K., Oguri, S. y Takeuchi, M. (1996) Glycoconjugate J., 13, 53-56], tales oligosacáridos se preparan fácilmente.

En los Ejemplos de la presente invención, fue analizada la actividad de GnT-IV como se describe debajo.

La enzima se hizo reaccionar en tampón MOPS 125 mM [ácido 3-(N-morfolino)-propano-sulfónico], pH 7,3, que contenía el sustrato de oligosacárido piridilaminado 0,8 mM (sustrato de oligosacárido del tipo producto de GnT-II), UDP-GlcNAc 20 mM, MnCl_{2}7,5 mM, GlcNAc 200 mM, Triton X-100 0,5% (p/v), glicerol del 10% y BSA del 1% a 37ºC durante 4 horas. Entonces, la reacción fue terminada hirviendo la solución durante 2 minutos. Después de la eliminación de sólidos con un filtro de 0,45 nm, fueron analizados 5 \mul del filtrado con una columna ODS-80TM (4,6 x 150 mm; TOSO) (figura 5) a 50ºC con tampón acetato de amonio 50 mM, pH 4,0, que contenía n-butanol del 0,15% (p/v) a un caudal de 1,2 ml/min. La fluorescencia de los grupos piridilamino fue detectada usando la excitación a 320 nm y la emisión a 400 nm.

Ejemplo 1 Aislamiento y purificación de la enzima (1) Selección de una fuente de la enzima

Una fuente de la enzima de GnT-IV que se purificó fue buscada utilizando el método de ensayo descrito anteriormente. Fue encontrado que la actividad relativa de GnT-IV respecto a las de GnT-III y GnT-V en intestino delgado bovino son más bien más altas que las actividades relativas de GnT-IV en cualquier otro tejido tal como se muestra en la Tabla 1. Así, el intestino delgado bovino fue seleccionado como material de partida para la purificación.

TABLA 1 Búsqueda de fuentes de la enzima de GnT-IV

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(2) Purificación

A no ser que se indique de otra manera, todas las operaciones fueron realizadas a 4ºC.

(i) Preparación de la fracción de microsoma

Dos kilogramos de intestino delgado bovino (obtenido de un matadero de carne) fueron picados. Entonces, 4 volúmenes de un tampón de extracción (tampón Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, que contenía sacarosa 0,25 M, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, hidrocloruro de benzamidina 1 mM, ditiotreitol 1 mM y 10 mg/ml de antidolor) fueron añadidos a esto y fueron homogeneizados con Polytron (Kinematica, Suecia). El homogenado resultante fue centrifugado a 900 x g durante 10 minutos. Después, el sobrenadante fue centrifugado además a 105,000 x g durante 60 minutos para así obtener la fracción de microsoma como un precipitado (Muestra 1).

(ii) Solubilización

La muestra 1 fue suspendida en 3 volúmenes de tampón de solubilización preparado añadiendo Triton-100 al tampón de extracción para dar una concentración final del 1%. El sobrenadante fue obtenido por centrifugación a 105.000 x g durante 60 minutos. El pelet fue suspendido de nuevo y se recogió el sobrenadante. Los primeros y segundos extractos fueron combinados (Muestra 2).

(iii) Cromatografía Q-Sepharose FF

La muestra 2 fue aplicada a la columna Q-Sepharose FF (5 x 30 cm; Pharmacia, Suecia) pre-equilibrada con tampón de operación 1 (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, que contenía hidrocloruro de benzamidina 1 mM, Triton X-100 del 0,1% y glicerol del 20%) y luego fue eluida por un gradiente lineal de KCl 0-0,5 M (figura 6) (Muestra 3).

(iv) Cromatografía de quelato de cobre Sepharose FF

La muestra 3 fue aplicada a una columna de quelato de cobre Sepharose FF (5 x 10 cm; Pharmacia, Suecia) pre-equilibrada con tampón de operación 2 (fácil de conseguir añadiendo KCl a tampón de operación 1 hasta una concentración final de 0,15 M). Después, las fracciones no adsorbidas fueron lavadas con 5 volúmenes de tampón de operación 2. A partir de ahí, el adsorbate fue eluido por un gradiente lineal de glicina 0,01 M (figura 7). La fracción de GnT-IV activa resultante fue reunida y concentrada con una membrana de ultrafiltración YM30 (Amicon, EE.UU.) (Muestra 4).

(v) Cromatografía de afinidad en agarosa UDP-Hexanolamina I

A una columna de afinidad en agarosa UDP-Hexanolamina (1,2 x 4,5 cm; Sigma, EE.UU.) pre-equilibrada con tampón de operación 3 (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, que contenía KCl 0,15 M, MnCl_{2}10 mM, Triton X-100 del 0,05% y glicerol del 20%), fueron aplicados una mitad de la Muestra 4 dializada contra tampón de operación 3 añadido hidrocloruro de benzamidina 1 mM. Entonces, las fracciones no adsorbidas fueron lavadas con tampón de operación 4 (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, que contenía MnCl_{2}10 mM, Triton x-100 del 0,05% y glicerol del 20%). A partir de entonces, el adsorbato fue eluido con tampón de operación 4 al que había sido añadido KCl 1 M (concentración final) (figura 8). La fracción GnT-IV activa fue reunida y dializada contra el tampón de operación 5 (que tenía la misma composición que el tampón de operación 4, pero que tenía un pH de 7,4) (Muestra 5).

(vi) Cromatografía de afinidad en agarosa UDP-Hexanolamina II

La muestra 5 fue aplicada a una columna de afinidad en agarosa UDP-Hexanolamina (1,0 x 6,5 cm; Sigma, EE.UU.) pre-equilibrada con tampón de operación 5. Después, las fracciones no adsorbidas fueron lavadas con tampón de operación 5. A partir de entonces, el adsorbato fue eluido con tampón de operación 5 eliminado el MnCl_{2} (figura 9). La fracción de GnT-IV activa resultante fue reunida (Muestra 6).

(vii) Cromatografía en gel de Superdex 200

La muestra 6 fue concentrada con una pequeña columna de Q-Sepharose FF y fue aplicada a una columna Superdex 200HR5/5 (1 x 30 cm; Pharmacia, Suecia) pre-equilibrada con tampón de operación 6 (obtenido añadiendo KCl al tampón de operación 5 en una concentración final de 0,15 M) (figura 10). El tampón de operación 6 fue aplicado a la columna a un caudal de 0,25 ml/min para así obtener la fracción de GnT-IV activa (Muestra 7).

(viii) La cantidad de proteína, actividad y la actividad específica en cada etapa de purificación se resumen en la Tabla 2. La muestra final fue purificada 224.000 veces comparada a la del homogenado del intestino delgado.

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(3) Propiedades en términos de química enzimática y química proteica (i) Pureza

La muestra 7 dio una sola banda en un peso molecular de 60 K en la SDS-PAGE (figura 11). Cuando la Muestra 7 fue sometida a PAGE nativo y la banda resultante fue cortada del gel para determinar la actividad de GnT-IV, la posición de la banda de proteína estaba de acuerdo con la posición de la actividad (figura 12). Además, no fue detectada ninguna actividad de GnT-I, -II, -III o -V en la Muestra 7. De estas conclusiones, fue concluido que la Muestra 7 es GnT-IV pura. Teniendo en cuenta que el peso molecular aparente de esta proteína era de 77 K como se determina por la filtración en gel que contenía Triton X-100 (figura 10), se piensa que la GnT-IV no tiene una estructura de subunidad y que expresa su actividad en la forma de un monómero. Cuando la Muestra 7 fue tratada con el Péptido N-Glucosidasa F (Boehringer-Mannheim, Alemania), fue observado un aumento de la movilidad en la SDS-PAGE. Así, se piensa que la GnT-IV del intestino delgado bovino es una glicoproteína que al menos tiene cadenas de azúcar unidas a Asn.

(ii) Especificidad de la reacción

Cuando esta enzima reacciona con el oligosacárido del tipo producto de GnT-II representado por la fórmula siguiente como sustrato:

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en las condiciones de ensayo estándar, la enzima proporcionaba un solo producto (el oligosacárido piridilaminado 1) como se analiza por HPLC.

Este producto fue recogido, seguido por la determinación de su estructura por (i) una combinación de la degradación de Smith y TOF-MS láser (espectrómetro de masas de tiempo-de-vuelo) e (ii) ^{1}H-RMN. Así, la especificidad de la reacción de esta enzima fue examinada. Cuando el oligosacárido piridilaminado 1 fue sometido a la degradación de Smith de acuerdo con el método de Kobata y Takasaki [Kobata, A. y Takasaki, S. (1993) en Glycobiology "A Practical Approach" (Fukuda, M. y Kobata, A., editores) 165-185, IRL Press, Oxford, Inglaterra], su número de masa cambió de 1599,0 a 795,30 como consecuencia de la primera degradación y luego cambió a 634,68 como consecuencia de la segunda degradación. Esto está de acuerdo con el mecanismo de reacción mostrado en la figura 13. Así, fue concluido que el producto de reacción de esta enzima tiene la estructura siguiente:

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Además, cuando el oligosacárido piridilaminado 1 fue sometido a ^{1}H-RMN, fue detectado un pico de 4,53 ppm que correspondía al protón anomérico de GlcNAc7 mostrado en la fórmula siguiente; su constante de acoplamiento J1,2 fue de 7,9 Hz (figura 14). Estos resultados indican que la GlcNAc7 está, como se muestra en la fórmula siguiente, unida a la posición 4 de Man4 vía el enlace del tipo \beta-, apoyando completamente la estructura anterior.

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(iii) pH óptimo

El pH óptimo de esta enzima es de aproximadamente 7,5 como se muestra en la figura 15.

(iv) Exigencia del catión divalente

Como se muestra en la Tabla 3, esta enzima se desactiva por la adición de EDTA (ácido etilendiamina tetra-acético). Un catión divalente es esencial para su actividad. Entre los cationes divalentes, el Mn^{2+} muestra el mayor efecto, seguido de Co^{2+} y Mg^{2+}. Un efecto débil es reconocido en Ca^{2+} y Fe^{2+}. La concentración óptima de Mn^{2+} es de aproximadamente 10 mM como se muestra en la figura 16.

TABLA 3 Requerimiento del catión divalente de GnT-IV

12

La actividad de GnT-IV fue determinada añadiendo cada uno de los iones metálicos (10 mM) a una muestra de GnT-IV de la cual habían sido eliminados los iones metálicos. La actividad de GnT-IV se representa en tanto por ciento en la Tabla, en la que la actividad cuando se añade MnCl_{2}10 mM es considerada como del 100%.

(v) Inhibición por nucleótidos de azúcar

Como se muestra en la Tabla 4, UDP inhibió la actividad de esta enzima más fuertemente. Los efectos inhibitorios actúan de UDP-glucosa, UDP-GalNAc, 2'-desoxi-UDP y UDP-hexanolamina (Sigma, EE.UU.) seguido de UDP en este orden. Uridina, UMP, TDP y CDP exhibieron poco efecto inhibitorio.

TABLA 4 Inhibición de GnT-IV por nucleótidos

13

La actividad de GnT-IV cuando fue añadido cada nucleótido (2mM) en presencia de UDP-GlcNAc 0,5 mM se expresa en tanto por ciento en la Tabla, en la que la actividad cuando no fue añadido nada se considera como del 100%.

(vi) Especificidad de sustrato

Como se muestra en la Tabla 5, esta enzima prefirió más el oligosacárido del tipo producto de GnT-V (E en la Tabla 5) como aceptor. Al lado de esto, la enzima prefirió los oligosacáridos del tipo producto de GnT-II (D en la Tabla 5).

Cuando la reactividad de esta enzima frente al oligosacárido del tipo GnT-II se considera como del 100%, esta enzima exhibe reactividades del 0% y del 54% frente a los oligosacáridos del tipo principales (A en Tabla 5) y los oligosacáridos del tipo producto de GnT-I (C en Tabla 5), respectivamente.

Esta enzima exhibe una reactividad del 46% frente a una estructura de oligosacárido del tipo producto de GnT-II en el que fucosa se une vía el enlace \alpha 1 -> 6 a GlcNAc en el extremo reductor (F en la Tabla 5).

Esta enzima exhibe una reactividad del 0% frente a una estructura de oligosacáridos del tipo producto de GnT-II en los cuales GlcNAc carece de \alpha 1 -> 3 manosa (B en la Tabla 5).

Esta enzima exhibe una reactividad del 16% frente a una estructura de oligosacáridos del tipo producto de GnT-II en los que la galactosa se une vía el enlace \beta 1 -> 4 a GlcNAc en la \alpha 1 -> 6 manosa (G en la Tabla 5), y una reactividad del 0% frente a una estructura de oligosacárido del tipo producto de GnT-II en el que la galactosa se une vía el enlace \beta 1 -> 4 a GlcNAc en la \alpha 1 -> 3 manosa (H e I en la Tabla 5).

Esta enzima exhibe una reactividad del 0% frente a una estructura de oligosacáridos del tipo producto de GnT-II en la que GlcNAc se une vía el enlace \beta 1 -> 4 a la \beta 1 -> 4 manosa (J en la Tabla 5).

La especificidad de sustrato de esta enzima como se describe anteriormente casi está de acuerdo con la especificidad de sustrato de la GnT-IV predicha por Schachter et al. [Glesson, P.A. y Schachter, H. (1983) J. Biol. Chem., 258, 6162-6173]. Así, se ha hecho explícito que esta enzima de la invención es la GnT-IV que ha sido mucho tiempo un eslabón perdido en la biosíntesis de cadenas de azúcar del tipo complejas.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5

14

(vii) Parámetros cinéticos

En las condiciones de ensayo que se describen en el Ejemplo de Referencia 2, los valores de Km y Vmax de esta enzima frente a los oligosacáridos del tipo producto de GnT-II fueron 0,73 mM y 3,23 \muM/minuto, respectivamente, y estos valores frente a los oligosacáridos del tipo producto de GnT-V fueron 0,13 mM y 1,75 \muM/minuto, respectivamente. El valor de Km frente a UDP-GlcNAc fue 0,22 mM.

Entre los oligosacáridos piridilaminados obtenidos, los representados por las fórmulas siguientes fueron encontrados que eran oligosacáridos nuevos:

15

y

16

(viii) Acción sobre las glicoproteínas

Para demostrar que la GnT-IV puede actuar no sólo sobre sustratos de oligosacárido, sino que también sobre las cadenas de oligosacárido en las glicoproteínas, la GnT-IV reacciona con glicoproteínas asialo agalacto usando UDP-[^{14}C] GlcNAc como donante de azúcar. Después, fueron analizados los productos de reacción con SDS-PAGE y fluorografia (dibujos A y B, figura 17). Como se muestra en las rutas 2 y 5 del dibujo B en la figura 17, la transferencia de [^{14}C] GlcNAc a transferrina asialo agalacto humana y asialo agalacto, eritropoyetina derivada de células CHO recombinantes humanas.

La transferrina humana que tiene la cadena de azúcar del tipo producto de GnT-IV (de la fórmula siguiente) obtenida por esta reacción de GnT-IV es una sustancia nueva que no se da en la naturaleza.

17

Estructura de cadena de azúcar del tipo producto de GnT-IV

Ejemplo 2 Análisis cartográfico del péptido

Aproximadamente 1 mg de esta enzima de la invención finalmente purificada fue sometida a electroforesis en gel de poliacrilamida del 10%-SDS del 0,1% de acuerdo con el método de Laemmli [Laemmli, U.K., Nature (1970) 313, 756-762]. Las proteínas separadas fueron sometidas a electro-inmunotransferencia en una membrana de PVDF. La proteína fijada a la membrana fue S-carboximetilada y luego se digirió con proteasa I de lisilendopeptidasa Achromobacter (AP-I) (Industrias Wako Pure Chemicals, Ltd) para obtener una mezcla del fragmento AP-I-digerido. La membrana de PVDF AP-I-digerida además fue digerida con Asp-N (Takara Shuzo) para obtener una mezcla de fragmento de Asp-N-digerido. Cada una de las mezclas del fragmento de péptido fue separada por cromatografía líquida de alta resolución y fue sometida al análisis de la secuencia de aminoácidos. Como resultado, fueron obtenidas las secuencias mostradas en las SEC. ID N^{os}.: 1-14.

Ejemplo 3 Aislamiento e identificación de cDNA de GnT-IVa bovino (1) RT-PCR

Basado en las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC. ID N^{os}.: 7 y 11 obtenidas en el Ejemplo 2, el oligómero AP-5F mostrado en la SEC. ID Nº. 15 y el oligómero DN-9R mostrado en la SEC. ID Nº. 16 fueron sintetizados respectivamente. Una RT-PCR fue realizada usando como plantilla el RNA total extraído del tejido del intestino delgado bovino por el método del isotiocianato de guanidio y usando los iniciadores anteriores. Como resultado, fue obtenido un fragmento amplificado de aproximadamente 170 bp que parecía específico. Este fragmento fue subclonado.

(2) Selección de una genoteca

Una genoteca de cDNA de intestino delgado bovino (Clontech, EE.UU.) fue rastreada con el producto anteriormente mencionado de la RT-PCR para obtener cuatro placas positivas. Las secuencias de nucleótidos de estos clones fueron determinadas. Las secuencias resultantes contenían un número de secuencias de nucleótidos que codificaban para algunas de las secuencias de aminoácidos parciales (SEC. ID N^{os}.: 1-14) obtenidas en el Ejemplo 2, y también contenían una secuencia que parece ser un codon de terminación. Usando un fragmento de 150 bp que representaba la región más corriente arriba de la secuencia de nucleótidos resultante, la genoteca fue rastreada de nuevo para obtener dos placas positivas. Las secuencias de nucleótidos de estos clones fueron determinadas. Después, la genoteca fue rastreada también de modo similar con una sonda de 150 bp de la región situada más corriente arriba, sin embargo, no fueron obtenidos nuevos clones.

(3) 5 ' RACE (Amplificación rápida de los extremos de cDNA)

Posteriormente, fue realizada la 5' RACE para obtener un cDNA de cadena completa. Usando la secuencia de la región situada más corriente arriba obtenida por la selección de bacteriófago, fue realizada la primera 5' RACE. Sin embargo, no pudo ser encontrado un codon de iniciación. Entonces, basado en la secuencia obtenida por la primera 5' RACE, fue realizada la segundo 5' RACE para obtener así una secuencia que contuviera un codon de iniciación. Esta secuencia fue ligada a la secuencia génica parcial antes obtenida del clón de bacteriófago para así obtener un fragmento génico que contuviera un marco de lectura abierto intacto (Gen 1). Se muestra la secuencia de nucleótidos para el fragmento génico así obtenido en la SEC. ID Nº. 17, y se muestra la secuencia de aminoácidos deducida de ahí en la SEC. ID Nº. 18. Se confirmó que este fragmento de DNA contenía todas las secuencias de nucleótidos que codificaban para las 14 secuencias de aminoácidos parciales (SEC. ID N^{os}.: 1-14) obtenidas en el Ejemplo 2.

Ejemplo 4 Construcción de un vector de expresión usando el gen GnT-IVa clonado bovino y un método para producir la enzima de GnT-IVa (1) Construcción de un vector

Fue sintetizado un iniciador (SEC. ID Nº. 19) que introduce un sitio de XhoI en una región corriente arriba del codon de iniciación del Gen 1 y otro iniciador (SEC. ID Nº. 20) que introduce un sitio de XbaI en una región corriente abajo del codon de terminación del gen. Después, el gen entero que codificaba para la enzima de GnT-IV fue amplificado por PCR con los iniciadores. El fragmento amplificado obtenido fue digerido con XhoI y XbaI, y fue insertado entre los sitios de XhoI y XbaI del vector pSVL (Pharmacia, Suecia) para preparar el plásmido pBGT4.

(2) Introducción en células COS7

El plásmido pBGT4 fue introducido en células COS7 (Banco de células RIKEN) por electroporación. Brevemente, fueron añadidos 10 \mug del plásmido a aproximadamente 5 x 10^{6} células en 0,8 ml de PBS (-) (Compañía Nissui Farmaceutical). Un voltaje de 1600 V fue aplicado con una capacitancia de 25 \muF con un electroporador Gene Pulser (BioRad, EE.UU.) a temperatura ambiente para introducir el gen en las células. Las células resultantes fueron transferidas a una placa de laboratorio de 90 mm y fueron cultivados en 10 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (Catálogo Base Nº. 12430, Life Technologies, Inc., EE.UU.) que contenía suero fetal bovino del 10% en 5% de CO_{2} a 37ºC durante 72 horas. A partir de entonces, las células fueron recuperadas y suspendidas en 100 \mul de tampón (Tris-HCl 5 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 2 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM), seguido por sonicación y centrifugación a 2000 x g durante 5 minutos. De esta forma fue obtenido un extracto celular.

(3) Ensayo de actividad de GnT-IV

La actividad de GnT-IV en el extracto de células fue determinada por el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. Se muestran los resultados en la Tabla 6. Comparado con el extracto de células en las cuales el vector pSVL fue introducido como control, los extractos en los cuales el plásmido pBGT4 fue introducido exhibieron una actividad de GnT-IV 44-78 veces más alta por célula. De estos resultados, se confirmó que el Gen 1 codifica para la enzima de GnT-IV. Así, la enzima de GnT-IV puede ser producida por células cultivadas de acuerdo con este método.

TABLA 6

18

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Tiempo de reacción: 4 horas\cr  \begin{minipage}[t]{110mm} Las
relaciones de actividad se expresan en relación con la actividad
total de pSVL que se considera como
1.\end{minipage} \cr}

Ejemplo 5 Aislamiento e identificación de cDNA de GnT-IVa humano (1) RT-PCR

Basado en la secuencia de nucleótidos de GnT-IVa bovino obtenida en el Ejemplo 3, fueron sintetizados el iniciador h1-2F mostrado en la SEC. ID Nº. 21 y el iniciador h1-1R mostrado en la SEC. ID Nº. 22. Usando RNA completo de hígado humano (Clontech, EE.UU.) como plantilla, fue realizada una RT-PCR con los iniciadores anteriores. Como resultado fue obtenido un fragmento amplificado de aproximadamente 650 bp que pareció ser específico. Este fragmento fue subclonado, y su secuencia de nucleótidos fue determinada.

(2) Rastreo de una genoteca

Una genoteca de cDNA de hígado humano (Clontech, EE.UU.) fue rastreada usando el fragmento de DNA de 685 bp obtenido por la RT-PCR anterior como sonda. Dos placas positivas de hGT4/\lambda gt10-1 y hGT4/\lambda gt10-2 fueron obtenidas. Las secuencias de nucleótidos de las inserciones en estos clones de bacteriófago fueron determinadas. Como resultado, hGT4/\lambda gt10-1 contuvo una región de DNA de 804 bp y hGT4/\lambda gt10-2 contuvo una región de DNA de 2115 bp. La primera región fue incluida completamente en la región última. Como se muestra en la SEC. ID Nº. 23, el fragmento de DNA contenido en hGT4/\lambda gt10-2 tenía un marco de lectura abierto (ORF) sumamente homólogo a la secuencia de aminoácidos de GnT-IVa bovino (96% idéntico). De los resultados descritos en el Ejemplo 6, se confirmó que este ORF es un gen GnT-IVa humano. Se muestra la secuencia de aminoácidos de este ORF en la SEC. ID Nº. 24.

Ejemplo 6 Construcción de un plásmido de expresión para el gen GnT-IVa humano y un método para producir la enzima de GnT-IVa humana (1) Construcción del plásmido de expresión pHGT4-1 para el gen GnT-IVa humano

Un iniciador (h1-7F; SEC. ID Nº. 25) que introduce un sitio de XhoI en una región corriente arriba del codon de iniciación del gen GnT-IVa humano y otro iniciador (h1-7R; SEC. ID Nº. 26) que es complementario a una región corriente abajo del codon de terminación del gen fueron sintetizados. Usando el RNA del hígado humano (Clontech, EE.UU.) como plantilla, el gen entero que codificaba para la enzima GnT-IVa humana fue amplificada por RT-PCR con los iniciadores anteriores. El fragmento amplificado resultante fue insertado en el sitio de SrfI del plásmido pCRScript Amp SK (+) (Stratagene, DNA) en la dirección opuesta a la transcripción del gen lacZ. Usando el plásmido resultante, el análisis de la secuencia de nucleótidos confirmó que el fragmento amplificado codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 24. Además, este plásmido fue digerido con XhoI y SacI para obtener un fragmento XhoI-SacI de 1,7 kb. Este fragmento fue insertado entre los sitios de XhoI y SacI del vector pSVL (Pharmacia, Suecia) para preparar el plásmido de expresión pHGT4-1 para el gen GnT-IVa humano.

(2) Introducción del gen GnT-IVa humano en células COS7

Fue introducido el plásmido pHGT4-1 en células COS7 por electroporación. Las células resultantes fueron cultivadas en 10% de CO_{2} a 37ºC durante 72 horas. Después, las células fueron cultivadas, suspendidas en 100 \mul de tampón (Tris-HCl 5 mM, pH 7,5, cloruro de magnesio 2 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM), fueron interrumpidas por sonicación, centrifugadas a 2000 x g durante 5 minutos y el sobrenadante fue recogido para obtener un extracto de las células.

(3) Expresión del gen GnT-IVa humano en células COS7

La actividad de GnT-IV en el extracto de las células fue determinada por el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. Se muestran los resultados en la Tabla 7. Comparado con el extracto de células en las cuales el vector pSVL fue introducido como control, los extractos de células en las que el plásmido pHGT4-1 fue introducido exhibieron una actividad de GnT-IV 21-28 veces más alta por célula. De estos resultados, se confirmó que el gen GnT-IVa mostrado en la SEC. ID Nº. 23 codifica la glucosiltransferasa GnT-IV. También se confirmó que la enzima de GnT-IVa humano puede ser producida por células cultivadas de acuerdo con este método.

TABLA 7

19

Ejemplo 7 Aislamiento e identificación de cDNA de GnT-IVb humano (1) Adquisición del gen del tipo GnT-IVa humano por PCR, RT-PCR y 5'RACE (Amplificación Rápida de los Extremos de cDNA)

Las secuencias de nucleótidos que tienen semejanza en la secuencia de nucleótidos del gen GnT-IVa humano obtenido en el Ejemplo 3 fueron buscadas en la base de datos de la genoteca de DNA por BLASTN. Como resultado, fueron averiguados los Números de Acceso R12057, H10557 y W16571. Después, el iniciador h2-45F mostrado en la SEC. ID Nº. 27 y el iniciador h2-43R mostrado en la SEC. ID Nº. 28 fueron sintetizados para realizar una PCR usando una genoteca de cDNA de cerebro humano de "Quick Screen Human cDNA Library Panel" (Clontech, EE.UU.) como plantilla. El fragmento amplificado fue subclonado en el sitio de SrfI de pCRScript Amp SK (+) (Stratagene, EE.UU.) y fue sometido al análisis de la secuencia de nucleótidos. También, el iniciador h2-2F mostrado en la SEC. ID Nº. 29 y el iniciador h2-1R mostrado en la SEC. ID Nº. 30 fueron sintetizados para realizar una RT-PCR usando el RNA completo de pulmón humano (Clontech, EE.UU.) como plantilla. Como resultado, fue obtenido un fragmento amplificado de aproximadamente 500 bp del tamaño esperado. Después, este fragmento fue subclonado en el sitio de SrfI de pCRScript Amp SK (+) (Stratagene, EE.UU.) y fue sometido al análisis de la secuencia de nucleóti-
dos.

Las secuencias de nucleótidos así obtenidas de los dos fragmentos de DNA traslapaban la uno con la otra formando una región de 1006 bp. En esta región, fue reconocida un marco de lectura que codifica las secuencias de aminoácidos homólogas a las de GnT-IVa bovino y humano. Así, fue sugerida la existencia de una proteína que se relaciona con las proteínas de GnT-IVa.

Después, las secuencias de nucleótidos posibles que pueden estar una secuencia corriente arriba a R12057 o una secuencia corriente abajo a W16571 fueron buscadas en la base de datos de la Genoteca de DNA BLASTN. Como resultado, fue encontrado R15554 como una secuencia corriente arriba a R12057, y W16466 como una secuencia corriente abajo a W16571. Sin embargo, un codon de terminación al parecer inadecuado estaba contenido en los ORF (marcos de lectura abiertos) deducidos de estas secuencias de nucleótidos. Por lo tanto, para confirmar las secuencias de nucleótidos, fueron obtenidos los fragmentos de DNA por RT-PCR. Como iniciadores, fueron sintetizados el h2-1F mostrado en la SEC. ID Nº. 31, el h2-3F mostrado en la SEC. ID Nº. 32 y el h2-8R mostrado en la SEC. ID Nº. 33. Con una combinación de h2-1F y h1-1R descritos en el Ejemplo 5, o una combinación de h2-3F y h2-8R, fue realizada una RT-PCR usando el RNA completo del hígado humano (Clontech, EE.UU.) como plantilla. Los fragmentos amplificados de aproximadamente 550 bp y de aproximadamente 300 bp, ambos en coincidencia con los tamaños esperados, fueron detectados. Cada uno de estos fragmentos fue subclonado en el sitio de SrfI de pCRScript Amp SK (+) para analizar su secuencia de nucleótidos. Como resultado, se confirmó que estos fragmentos respectivamente traslapan con una región corriente arriba y una región corriente abajo a la región de 1006 bp entre los h2-45F y h2-1R mencionados anteriormente. En la región ligada de 1361 bp, fue encontrado un ORF que codificaba una proteína de 433 aminoácidos que tenía una alta semejanza con las secuencias de aminoácidos de proteínas de GnT-IVa bovina y humana.

Sin embargo, cuando este ORF es comparado con las secuencias de aminoácidos de las proteínas de GnT-IVa, fue supuesto que el comienzo de metionina debería estar presente en una región corriente arriba a este ORF. Por lo tanto, la región corriente arriba fue obtenida por 5'-RACE usando cDNA preparado de 5'-RACE de pulmón humano (Clontech, EE.UU.). En la primera PCR, un iniciador marcador y el h2-5R mostrado en la SEC. ID Nº. 34 fueron usados como iniciadores. En la segunda PCR, un iniciador marcador y el h2-3R mostrado en la SEC. ID Nº. 35 fueron usados como iniciadores. Los fragmentos obtenidos por 5'-RACE fueron purificados, digeridos con EcoRI y PstI, y luego separados por electrofóresis en gel de agarosa. Un fragmento de aproximadamente 450 bp fue recuperado del gel. Este fragmento fue insertado entre los sitios de EcoRI y PstI del vector pUC18 (Pharmacia, Suecia) para analizar su secuencia de nucleótidos. Como consecuencia, se confirmó que este fragmento traslapa con una región corriente arriba de la región entre h2-1F y h2-8R. En la región ligada de 1758 bp, se confirmó un ORF que codifica una proteína de 548 aminoácidos que tiene una alta semejanza con las secuencias de aminoácidos de las proteínas de GnT-IVa bovina y humana. Se muestra la secuencia de nucleótidos de este ORF en la SEC. ID Nº. 36, y su secuencia de aminoácidos en la SEC. ID Nº. 37. De los resultados descritos en el Ejemplo 8 debajo, se confirmó que este gen es el gen GnT-IVb humano.

Ejemplo 8 Construcción de un plásmido de expresión para el gen GnT-IVb humano y un método para producir la enzima de GnT-IVb humano (1) Construcción del plásmido de expresión pHGT4-2 para el gen GnT-IVb humano

Un iniciador (h2-4: SEC. ID Nº. 38) que introduce un sitio de XhoI en una región corriente arriba del codon de iniciación del gen GnT-IVb humano, y otro iniciador (h2-10R: SEC. ID Nº. 39) que introduce un sitio de XbaI en una región corriente abajo al codon de terminación del gen anterior fueron sintetizados. Usando estos iniciadores, el ORF entero que codifica para la enzima de GnT-IVb humano fue amplificado por RT-PCR con RNA de pulmón humano (Clontech, EE.UU.) como plantilla. El fragmento amplificado fue insertado en el sitio de SrfI del plásmido pCRScript Amp SK (+), seguido por la determinación de su secuencia de nucleótidos. Como resultado, se confirmó que el fragmento amplificado codificaba para la secuencia de aminoácidos de SEC. ID Nº. 37. Además, este plásmido fue digerido con XhoI y XbaI para obtener un fragmento XhoI-XbaI de 1,7 kb. Este fragmento fue insertado entre los sitios de XhoI y XbaI del vector pSVL (Pharmacia, Suecia) para construir un plásmido de expresión pHGT4-2 para el gen GnT-IVb humano.

(2) Introducción del gen GnT-IVb humano en células COS7

El plásmido pHGT4-2 fue introducido en células COS7 por electroporación. Las células resultantes fueron cultivadas en 10% de CO_{2} a 37ºC durante 72 horas. Después, las células fueron recuperadas, suspendidas en 100 \mul de tampón (Tris-HCl 5 mM, pH 7,5, cloruro de magnesio 2 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM), interrumpidas por sonicación, centrifugadas a 2000 x g durante 5 minutos y el sobrenadante fue recogido para así obtener un extracto de células.

(3) Expresión del gen GnT-IVb humano en células COS7

La actividad de GnT-IV en el extracto de las células fue determinada por el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. Se muestran los resultados en la Tabla 7 anterior. Comparado con el extracto de las células en las cuales el vector pSVL fue introducido como control, los extractos de las células en las que el plásmido pHGT4-2 fue introducido exhibieron una actividad de GnT-IV 8-11 veces más alta por célula. De estos resultados, se confirmó que el gen GnT-IVb mostrado en la SEC. ID Nº. 36 codifica la glucosiltransferasa GnT-IV. También se confirmó que la enzima de GnT-IVb humano puede ser producida por células cultivadas de acuerdo con este método.

Ejemplo 9 Construcción de plásmidos de expresión para mutantes por deleción del extremo N de GnT-IVa bovino y su expresión (1) Construcción de los plásmidos de expresión pSigIle93, pSigPro113 y pSigPro142 para GnT-IVa bovino

Fueron sintetizados un iniciador (XhoEsig: SEC. ID Nº. 40) que introduce un sitio de XhoI en una región corriente arriba de la secuencia de señal de eritropoyetina humana (Número de Acceso de Genoteca X02157) y un iniciador de antisentido (E4-1R: SEC. ID Nº.:41) que liga el extremo C de la secuencia de la señal anterior a una parte de la secuencia de aminoácidos de GnT-IVa bovino que se extiende desde la posición 93 (Ile) al extremo para amplificar la secuencia de la señal de eritropoyetina humana por PCR. También, fue sintetizado un iniciador de sentido (E4-1F: SEC. ID Nº. 42) correspondiente al iniciador de antisentido anterior y un iniciador (4EXPR: SEC. ID Nº.:20) que introduce un sitio de XbaI en una región corriente abajo del codon de terminación del gen GnT-IVa bovino para amplificar una secuencia parcial del gen GnT-IVa bovino por PCR. Usando partes de los dos productos de la PCR resultantes como plantilla mixta, fue realizada una PCR con los iniciadores XhoEsig y 4EXPR. El fragmento amplificado fue digerido con XhoI y XbaI y fue insertado entre los sitios de XhoI y XbaI del vector pSVL (Pharmacia, Suecia), para así construir el plásmido pSigIle93 que expresa una secuencia de aminoácidos en la que la señal de eritropoyetina humana se une a una parte de la secuencia de aminoácidos de GnT-IVa bovino que se extiende desde la posición 93 al extremo.

El plásmido pSigPro113 que expresa una secuencia de aminoácidos en la que la señal de eritropoyetina humana se une a una parte de la secuencia de aminoácidos GnT-IVa bovino que se extiende desde la posición 113 (Pro) al extremo; o el plásmido pSigPro142 que expresa una secuencia de aminoácidos en la que la señal de eritropoyetina humana se une a una parte de la secuencia de aminoácidos GnT-IVa bovino que se extiende desde la posición 142 (Pro) al extremo fueron construidos respectivamente de la misma manera que se describe anteriormente usando el iniciador E4-2R (SEC. ID Nº.:43) o el iniciador E4-3R (SEC. ID Nº. 44) en vez del iniciador E4-1R; y el iniciador E4-2F (SEC. ID Nº.:45) o el iniciador E4-3F (SEC. ID Nº.:46) en vez del iniciador E4-1F.

(2) Introducción de plásmidos que expresan a mutantes por deleción del extremo N de GnT-IVa bovino en células COS7

El plásmido pSigIle93, pSigPro113 o pSigPro142 fue introducido en células COS7 por electroporación. Las células resultantes fueron cultivadas en 10% de CO_{2} a 37ºC durante 72 horas. Después, las células y el sobrenadante del cultivo fueron recuperados separadamente. Las células fueron suspendidas en 100 \mul de un tampón (Tris-HCl 5 mM, pH 7,5, cloruro de magnesio 2 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM), interrumpidas por sonicación y centrifugadas a 2000 x g durante 5 minutos para así obtener un extracto celular. El sobrenadante del cultivo fue concentrado a aproximadamente 100 \mul con Centriplus 30 (Amicon).

(3) Expresión de mutantes por deleción del extremo N de GnT-IVa bovino en células COS7

La actividad de GnT-IV en el sobrenadante del cultivo y el extracto celular fue determinada por el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. Se muestran los resultados en la Tabla 8. Comparada con la actividad total (es decir, la actividad en las células + la actividad en el sobrenadante) de las células en las cuales el vector pBGT4 fue introducido como control positivo, la actividad total de las células en las que pSigIle93 fue introducido era de más del 30%. Además, más de un tercio de la actividad fue secretada en el sobrenadante del cultivo. De estos resultados, fue encontrado que los aminoácidos del extremo N a la posición 92 de la secuencia de aminoácidos de GnT-IVa bovino puede ser suprimida conservando la actividad de la enzima. También se muestra que la enzima de GnT-IVa puede ser expresada en el modo de secreción usando una señal de secreción apropiada.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 8

20

Ejemplo 10 Construcción de plásmidos de expresión para mutantes por deleción del extremo C de GnT-IVa bovino y su expresión (1) Construcción de plásmidos de expresión pCGly499, pCPro465, pCLys432 y pCPro383 para GnT-IVa bovino

Un iniciador (SEC. ID Nº.:19) que introduce un sitio de XhoI en una región corriente arriba del codon de iniciación del gen GnT-IVa bovino y un iniciador (CGly499: SEC. ID Nº.:47) que liga el codon de terminación después del codon Gly en la posición 499 e introduce un sitio de XbaI en una región corriente abajo al codon de terminación anterior fueron sintetizados para amplificar una secuencia parcial del gen GnT-IVa bovino por PCR. El fragmento amplificado fue digerido con XhoI y XbaI, y fue insertado entre los sitios de XhoI y XbaI del vector pSVL (Pharmacia, Suecia). Así, fue construido el plásmido pCGly499 que expresa la secuencia de aminoácidos de GnT-IVa bovino hasta la posición 499 (Glicina). Usando el iniciador CPro465 (SEC. ID Nº.:48), el iniciador CLys432 (SEC. ID Nº.:49) o el iniciador CPro383 (SEC. ID Nº.:50) en vez del iniciador CGly499, fueron construidos tres plásmidos adicionales de la misma manera. Fueron denominados pCPro465 (plásmido que expresa la secuencia de aminoácidos de GnT-IVa bovino hasta la posición 465 (Prolina)); PCLys432 (plásmido que expresa la secuencia de aminoácidos de GnT-IVa bovino hasta la posición 432 (Lisina)); y pCPro383 (plásmido que expresa la secuencia de aminoácidos de GnT-IVa bovino hasta la posición 383 (Prolina)), respectivamente.

(2) Introducción de plásmidos que expresan a mutantes por deleción del extremo C de GnT-IVa bovino en células COS7

El plásmido pCGly499, pCPro465, pCLys432 o pCPro383 fue introducido en células COS7 por electroporación. Las células resultantes fueron cultivadas en 10% de CO_{2} a 37ºC durante 72 horas. Después, las células fueron recuperadas y suspendidas en 100 \mul de tampón (Tris-HCl 5 mM, pH 7,5, cloruro de magnesio 2 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM), interrumpidas por sonicación y centrifugadas a 2000 x g durante 5 minutos para así obtener un extracto celular.

(3) Expresión de mutantes por deleción del extremo C de GnT-IVa bovino en células COS7

La actividad de GnT-IV en el extracto celular fue determinada por el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. Se muestran los resultados en la Tabla 9. Comparada con la actividad de GnT-IV del extracto de las células en las cuales el vector pBGT4 fue introducido como control positivo, la actividad del extracto de células en las que pCGly499, pCPro465, pCLys432 o pCPro383 fue introducido fue de 15,2%, 12,1%, 2,8% o 104,2% por célula, respectivamente. De estos resultados, se muestra que la actividad de GnT-IV puede ser conservada incluso si los aminoácidos de la posición 384 al extremo C en la secuencia de aminoácidos de GnT-IVa bovino son delecionados.

TABLA 9

21

Ejemplo 11 Construcción de plásmidos para expresar varios genes de GnT-IV en E. coli y su expresión (1) Construcción de un plásmido de expresión de E. coli para GnT-IVa bovino

Fueron sintetizados un iniciador (BSP-N: SEC. ID Nº.:51) que introduce un sitio de BspHI en una región corriente arriba del codon de iniciación del gen GnT-IVa bovino y otro iniciador (C-Hd: SEC. ID Nº.:52) que introduce un sitio de HindIII en una región corriente abajo del codon de terminación para amplificar el marco de lectura abierto entero del gen GnT-IVa bovino por PCR. El fragmento amplificado fue digerido con BspHI y HindIII, y fue introducido entre los sitios de NcoI y HindIII del vector pTrc99A (Pharmacia, Suecia) para así construir el plásmido pEBGT4. Usando el iniciador BSP-sN (SEC. ID Nº.:53) en vez del iniciador BSP-N junto con el iniciador C-Hd, fue construido el plásmido pEIle93 de una manera similar. Además, fue amplificado un gen que codifica para el marco de lectura abierto en el que se añade His-Tag al extremo C usando el iniciador BSP-N, un iniciador (CH-Hd: SEC. ID Nº.:54) que puede introducir His-Tag, un codon de terminación y un sitio de HindIII en una región corriente abajo del extremo C del gen GnT-IVa bovino y un iniciador (H-Hd: SEC. ID Nº.:55) que tiene His-Tag, un codon de terminación y un sitio de HindIII, para así construir el plásmido pEBGT4+His de una manera similar.

(2) Construcción de un plásmido de expresión de E. coli para el gen GnT-IVa humano y el gen GnT-IVb huma-no

Fueron sintetizados un iniciador (4aBSPIL94: SEC. ID Nº.:56) que introduce un codon de iniciación y un codon Ile en una región corriente arriba de la posición 94 (Leu) de la secuencia de aminoácidos de GnT-IVa humano y que también puede introducir un sitio de BspHI en una región más corriente arriba del mismo; un iniciador (4aCH-Hd: SEC. ID Nº. 57) que introduce His-Tag, un codon de terminación y un sitio de HindIII en una región corriente abajo del aminoácido del extremo C; y un iniciador de H-Hd para amplificar un fragmento génico compuesto de una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos de GnT-IVa humano a la que se añade una secuencia que codifica His-Tag. El fragmento amplificado fue digerido con BspHI y HindIII, e insertado entre los sitios de NcoI y HindIII del vector pTrc99A (Pharmacia, Suecia) para así construir el plásmido pMA4a+His. Además, usando el iniciador CP383H-Hd (SEC. ID Nº.:58) en vez del iniciador 4aCH-Hd, fue construido el plásmido pCore+His de una manera similar (figura 18). Un fragmento del gen GnT-IVb humano fue amplificado usando un iniciador (4bBSP-n: SEC. ID Nº.:59) que introduce un sitio de BspHI en una región corriente arriba del codon de iniciación del gen GnT-IVb humano y el iniciador 4bSACR (SEC. ID Nº. 60), fue digerido con BspHI y SacI, y luego fue insertado entre los sitios de NcoI y SacI del vector pTrc99A (Pharmacia, Suecia). Entre los sitios de SacI y HindIII del plásmido resultante, fue insertada una longitud parcial del gen GnT-IVb humano amplificado usando el iniciador 4bSACF (SEC. ID Nº.:61), un iniciador (4bCH-Hd: SEC. ID Nº. 62) que introduce His-Tag en el extremo C de la secuencia de aminoácidos de GnT-IVb humano y el iniciador H-Hd, y fue digerido con SacI y HindIII para así lograr el plásmido pEHGT4-2+His. Además, una secuencia parcial del gen GnT-IVb humano fue amplificada usando un iniciador (4bNCOG91: SEC. ID Nº.:63) que introducía un sitio de NcoI y un codon de iniciación en una región corriente arriba de la posición 91 (Gly) de la secuencia de aminoácidos de GnT-Ivb humano, el iniciador 4bCH-Hd y el iniciador de H-Hd, fue digerido con NcoI y HindIII, y luego fue insertado entre los sitios de NcoI y HindIII del vector pTrc99A (Pharmacia, Suecia) para así construir el plásmido pMA4b+His.

(3) Introducción de cada plásmido de expresión en la cepa BL21 de E. coli

Cada plásmido de expresión fue introducido en células competentes de la cepa BL21 de E. coli preparada por el método del calcio. Las células resultantes se cultivaron en placas de agar LB que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. Las colonias resultantes de E. coli transformadas con cada plásmido fueron inoculadas en medio líquido LB y fueron cultivadas en agitación a 37ºC de la noche a la mañana. Después, el cultivo fue inoculado en un medio líquido LB preparado recientemente para dar una concentración del 2%. Cuando la turbidancia (OD 595 nm) del fluido de cultivo fue de aproximadamente 0,1 a 0,2, se añadió IPTG (isopropil \beta-D-tiogalactopiranosido) además para dar una concentración final de 1 mM. Las células se cultivaron a 37ºC durante 2 horas o a 25ºC durante 4 horas. Después, se cultivaron 500 \mul de células. El pelet de células fue suspendido en 50 \mul de un tampón (Tris-HCl 5 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 2 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM), interrumpido por sonicación y centrifugado a 2000 x g durante 5 minutos para obtener un extracto celular como sobrenadante.

(4) Expresión de cada plásmido de expresión en la cepa BL21 de E. coli

La actividad de GnT-IV en el extracto celular fue determinada por el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. La tabla 10 muestra los resultados de la expresión del gen bovino. Aunque el extracto de células E. coli en las cuales fue introducido el vector pTrc99A como control tenían poco GnT-IV, el extracto de células de E. coli en las cuales pEBGT4 fue introducido tenía la actividad definida de GnT-IV. De estos resultados, fue demostrado que la enzima de GnT-IV puede ser producida por E. coli. La secuencia de His-Tag añadida al extremo C de GnT-IVa bovino no influyó enormemente sobre la actividad de GnT-IV. Así, se muestra que puede ser añadida una secuencia tag apropiada a la enzima GnT-IV. El mutante (pEIle93) en el que el aminoácido 92 del extremo N es suprimido exhibió una actividad de GnT-IV más grande. Por lo tanto, también se mostró que la expresión de variantes de la enzima de GnT-IV que se confirmó en células animales era posible en E. coli.

TABLA 10

22

La tabla 11 muestra los resultados de la expresión del gen humano. Comparado con el extracto de células E. coli en las cuales el vector pTrc99A fue introducido como control, el extracto de células E. coli pTrc99A en las que cualquiera de los plásmidos de expresión fueron introducidos tenía una actividad de GnT-IV considerable. Como se muestra en la enzima de GnT-IVa bovino, también fue posible en enzimas de GnT-IVa y de GnT-IVb humano delecionar una secuencia del extremo N conservando la actividad. Además, la enzima de GnT-IVa humano que tiene tanto la deleción del extremo N como la deleción del extremo C exhibió una alta actividad de GnT-IV (pCore+His). Esto muestra que las partes delecionadas en este mutante no son esenciales para la actividad de GnT-IV.

TABLA 11

23

Ejemplo 12 Conversión de la estructura ramificada de la cadena de azúcar de una eritropoyetina recombinante (EPO) introduciendo el gen GnT-IVa bovino o humano en células CHO que producen EPO (1) Introducción del plásmido de expresión de GnT-IV en células CHO que producen EPO

Fueron creados clones de células CHO que producen EPO de acuerdo con el método descrito en la publicación de patente japonesa examinada Nº. 2-17156. El plásmido de expresión de GnT-IVa pBGT4 o pHGT4-1 fue introducido en los clones MO1 y h-5 de las células resultantes por electroporación. En la introducción, 15 \mug del plásmido de expresión y 1,5 \mug de un plásmido marcador de resistencia de fármaco (pSV2bsr de Kaken Pharmaceutical o pMAMneo de Clontech) fueron usados en la mezcla. Las células electroporadas fueron cultivadas en 10% de CO_{2} a 37ºC durante aproximadamente 60 horas. Después, fueron añadidos blasticidin S (Kaken Pharmaceutical) (concentración final: 10 \mug/ml) o geneticin (Life Technologies, Inc.) (concentración final: 500 \mug/ml), al medio en el que las células fueron cultivadas durante otros 10 días a 2 semanas. Y así, fueron aislados clones resistentes a cualquiera de los dos fármacos.

(2) Confirmación de la expresión de los genes de GnT-IV introducidos en clones de células CHO productoras de EPO

Se cultivaron clones de células CHO productoras de EPO (clones iniciales) y clones resistentes a fármacos individuales en una escala apropiada. El RNA total de cada clón fue purificado. Después, fue realizado el análisis de inmunotransferencia de RNA usando una parte del gen GnT-IVa como sonda para así examinar la cantidad de mRNA de GnT-IVa. Además, la actividad de GnT-IV expresada en clones iniciales y clones resistentes a fármaco fue determinada por el ensayo descrito en el Ejemplo de Referencia 2. Los clones que dieron una señal fuerte en el análisis de inmunotransferencia de RNA y que aún exhibieron una actividad de GnT-IV más alta que los clones iniciales fueron seleccionados y usados para la producción de EPO. Los clones seleccionados habían aumentado la actividad de GnT-IV; por ejemplo, el MO1 (GnT-IV bovino) Nº. 36 exhibió un aumento de 104 veces sobre el clón de MO1, y h-5 (GnT-IV humano) Nº. 23 exhibió un aumento de 125 veces sobre el clón de h-5.

(3) Producción de EPO usando por clones de células CHO productoras de EPO con el gen de GnT-IV introducido

Se expresó EPO secretado en fluido de cultivo. Después, fueron cultivados clones de células CHO productoras de EPO M01 y h-5, y los clones anteriormente mencionados MO1 (GnT-IV bovino) Nº. 36 y h-5 (GnT-IV humano) Nº. 23 en frascos de cultivo. Primero, cada clón fue cultivado en adherencia en un medio de crecimiento, y luego 1,5 x 10^{7} células fueron transferidas a un frasco de cultivo de 850 cm^{2} que contenía 200 ml de un medio de crecimiento. Las células fueron cultivadas en 10% de CO_{2} a 37ºC durante 3 días de modo que se adhirieran al frasco uniformemente. A partir de entonces, el medio de crecimiento fue eliminado, y las células fueron lavadas con tampón PBS. Después, 200 ml de un medio sin suero fueron añadidos al frasco, en el que las células fueron cultivadas en 10% de CO_{2} a 37ºC durante 7 días. A partir de ahí, el sobrenadante del cultivo fue recuperado. Como medio de crecimiento, fueron usados medio D-MEM/F12 mezclado suplementado con suero fetal bovino del 5%, 290 mg/litro de ácido L-glutámico, solución de aminoácidos no esenciales 1xMEM y metotrexato 100 nM. Como medio sin suero, fue usado el medio anterior sin suero fetal bovino. El EPO contenido en cada uno de los sobrenadantes de cultivo sin suero fue determinado cuantitativamente por ELISA usando anticuerpo EPO antihumano.

(4) Análisis de los EPO producidos por clones introducidos o no introducidos en genes de GnT-IV basado en sus estructuras de cadenas de azúcar

Un EPO recombinante no existe como una molécula sola en gel de enfoque isoeléctrico; es una mezcla de moléculas con varias cargas eléctricas. Ya que el resto de proteínas no varía, se ha mostrado que la diferencia en la carga eléctrica entre estas moléculas se basa en la diferencia en la estructura de la cadena de azúcar; se llama a tal mezcla de moléculas glucoformas [Watson, E. y Yao, F., Anal. Biochem. (1993), 210, 389-93]. El EPO tiene tres cadenas de azúcar unidas a Asn; las estructuras ramificadas de las cadenas individuales de azúcar varían de bicatenaria a tetra-catenaria. La Gal (galactosa) además se une al extremo de cada GlcNAc ramificada, y además el ácido siálico se une a esta Gal. Por lo tanto, si el grado de ramificación de la cadena de azúcar se aumenta introduciendo el gen de GnT-IV, el número de moléculas de ácido siálico que se unen a Gal debería aumentar y, así, el contenido de glucoformas con bajo punto isoeléctrico debería aumentar. Por lo tanto, los inventores realizaron un análisis por enfoque isoeléctrico para detectar cambios de la estructura de la cadena de azúcar de los EPO producidos por células que producen EPO introducidas en el gen de GnT-IV.

Para el enfoque isoeléctrico, fue usado un equipo Multiphor II fabricado por Pharmacia. El gel estaba compuesto de acrilamida del 5% (30:0,8) y Pharmalyte del 1,5% 2,5-5 (Pharmacia). Para la solución de electrodo (+), fue usado ácido sulfúrico 0,1 M. Para la solución de electrodo (-), fue usada L-histidina 0,2 M. Después del enfoque isoeléctrico, las muestras fueron transferidas por electroforesis en una membrana de PVDF, seguido del análisis por inmunotransferencia usando anticuerpos monoclonales anti-EPO de ratón para detectar las bandas de glucoformas individuales de los EPO. Brevemente, el sobrenadante de cultivo sin suero de cada clón de célula fue concentrado de aproximadamente 7 a 1000 veces con Centriplus 30 y Microcon 30 (ambos fabricados por Amicon), si era necesario. Al principio, fueron usados aproximadamente 50-100 IU de EPO como muestra, pero esta cantidad fue ajustada de manera apropiada de modo que las intensidades de las bandas detectadas por el análisis de inmunotransferencia fueran casi iguales entre las muestras.

Cuando el EPO del clón MO1 fue comparado con el EPO del clón MO1 (GnT-IV bovino) Nº. 36, se confirmó que las posiciones de las glucoformas principales en el último muestran un desplazamiento al lado de pI bajo (lado de la solución de electrodo +) por al menos una glucoforma (figura 19). De este resultado, se piensa que la enzima de GnT-IV expresada como consecuencia de la introducción génica aumentó el número de ramificaciones de GlcNAc en las cadenas de azúcar unidas a Asn que se unen a EPO, aumento así el número de moléculas de ácido siálico que se unen para aumentar el contenido de glucoformas con bajos puntos isoeléctricos. Un análisis similar fue realizado en el clón H-5 y el clon H-5 (GnT-IV humano) Nº. 23. Por consiguiente, también fue encontrado que las posiciones de glucoformas de EPO principales en el último se desplazaban al lado del pI bajo (figura 19).

De lo anterior, fue demostrado que es posible modificar la estructura de las cadenas de azúcar unidas a Ans de la proteína producida por la célula introduciendo el gen de GnT-IV en cualquier célula.

Aplicabilidad industrial

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan una nueva \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa (GnT-IV), un método para producir la enzima de GnT-IV y un gen que codifica para GnT-IV. Con la GnT-IV de la presente invención, se ha hecho posible producir un glucoconjugado que tiene una estructura ramificada que no podía estar formado con glucosiltransferasas convencionales. Así, la GnT-IV de la invención es útil no sólo para producir o mejorar productos farmacéuticos del tipo de glucoconjugado, reactivos y productos de alimentación, sino que también para modificar la estructura de las cadenas de azúcar de cualquier biopolímero.

El gen de GnT-IV de la invención es también útil para diagnosticar o tratar enfermedades tales como el cáncer y para modificar la estructura de la cadena de azúcar de los productos glucoconjugados producidos por microorganismos.

Además, un anticuerpo o antisuero producido contra la proteína de GnT-IV de la invención como un antígeno, o una parte o todo el gen de GnT-IV de la invención como una sonda son útiles para caracterizar microorganismos, células cultivadas, varios tejidos de animales, células de sangre y sangre o para diagnosticar células de enfermos o tejidos tales como del cáncer.

<110> Kirin Beer Kabushiki Kaisha

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<120> Nueva \beta_{1}->4 N-acetilglucosaminiltransferasa y gen que codifica a la misma

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<130> 75004m3

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<140> 97947881.5

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<141> 1997-12-10

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<150> JP 8/332411

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<151> 1996-12-12

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<150> JP 9/161462

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<151> 1997-06-18

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<160> 63

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial:péptido

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<400> 1

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\sa{ Asp Asn Leu Tyr Pro Glu Glu Lys}

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<210> 2

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial:péptido

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<400> 2

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\sa{Asp Tyr Val Asn Gly Val Val Ala Asn Glu Lys}

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<210> 3

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial:péptido

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<400> 3

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\sa{Glu Ile Ser Ser Gly Leu Val Glu Ile Ile Ser Pro Pro Glu Ser Tyr}

\sac{Tyr Pro Asp Leu Thr}

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<210> 4

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial:péptido

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<400> 4

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\sa{Glu Arg Val Arg Trp Arg Thr Lys}

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<210> 5

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial:péptido

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<400> 5

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\sa{Lys Gln Asn Leu Asp Tyr Cys Phe Leu Met Met Tyr Ala Gln Glu}

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<210> 6

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial:péptido

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<400> 6

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\sa{Asp His Ile Leu Trp Val}

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<210> 7

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial:péptido

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<400> 7

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\sa{Lys Ile His Val Asn Pro Pro Ala Glu Val Ser Thr Ser Leu}

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<210> 8

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial:péptido

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<400> 8

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\sa{Lvs Val Tyr Gln Gly His Thr Leu Glu Lys}

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<210> 9

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial:péptido

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<400> 9

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\sa{Asp Phe Phe Trp Ala Ile Thr Pro Val Ala}

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<210> 10

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial:péptido

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<400> 10

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\sa{Asp Tyr Ile Leu Phe Lys}

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial:péptido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Lys Pro Val Asn Val Glu Ser Tyr Leu Phe His Ser Gly Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial:péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ile Leu Leu Xaa Thr Thr Val Glu Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial:péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ser Glu Gly Leu Asp Ile Ser Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial:péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Gly Tyr Phe Arg Ile Gly Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaratycayg tbaavcchcc hgcngargt

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgraavarrt arswytcvac rttvacdggy ttrtc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2246

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> especie Bos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 535

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> especie Bos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

26

27

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctcgagat gaggctccga aatggaactg t

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttctagatc agtttgtgac ttttttaata t

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgattgtgc aacagttcaa gcgt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggagaactc caggatcatc cagt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 535

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctcgagat gaggctccgc aatggaactg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaaatgtgg gcttcacggc tggc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctcgagat gaggctccgc aatggaactg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaaatgtgg gcttcagggc tggc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctcgagat gaggctccgc aatggaactg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaaatgtgg gcttcagggc tggc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttccatcacc tgccacacct gctgg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaaccctca gtcagacaag gagg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acacccccag aaatgtgggc ttca

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgaccgagt cctccttctc ctgc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgcccatca ccaccgacac tccg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1724

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 548

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctcgagga gatgaggctc cgcaatggc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatctagaaa tgtgggcttc agggctggc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctcgagat gggggtgcac gaatgtcc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctttttgctt gttaactcct ttagtattgg ggcgcccagg actgggag

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcccagtcc tgggcgcccc aatactaaag gagttaacaa gcaaaaag

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttccttcat tttccaataa atgaggggcg cccaggactg ggag

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

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<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atttaacttc tctcttcact gtaggggcgc ccaggactgg gag

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcccagtcc tgggcgcccc tcatttattg caaaatgaag gaag

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

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<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcccagtcc tgggcgcccc tacagtgaag agagaagtta aat

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sintético oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctagaatc acccttccgc aacacc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctagaatc aaggcagaac ttccaccg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctagaatc atttaaatag gatgtagtct ccagctac

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctagaatc atggtttcat gtaatcttta tccg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcatgaggc tccgaaatg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

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<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

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\hskip-.1em\dddseqskip

caagcttcag tttgtgactt ttttaatat

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

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<211> 27

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

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<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

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\hskip-.1em\dddseqskip

tcatgatact aaaggagtta acaagca

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

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<400> 54

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagcttcag tggtggtggt ggtggtggtt tgtgactttt ttaatatggat

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

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<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagcttcag tggtggtg

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sintético oligonucleótido

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<400> 56

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcatgatatt aaaggagtta acaagcaaaa aa

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

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<400> 57

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagcttcag tggtggtggt ggtggtggtt ggtggctttt ttaatatgaa t

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

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<400> 58

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagcttcag tggtggtggt ggtggtgtgg tttcatataa tctttatcc

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

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<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcatgaggc tccgcaatg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

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<400> 60

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggttgagc tccttgga

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccaaggagc tcaacctg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

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<400> 62

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagcttcag tggtggtggt ggtggtggtc ggcctttttc agga

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

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<400> 63

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccatgggcc ccctaacaga cca

\hfill

23

Claims (20)

1. Una \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa que tiene una actividad para producir un sacárido que tiene una estructura parcial representada por la fórmula siguiente:

39

usando UDP-GlcNAc como donante de azúcar y un sacárido que tiene una estructura parcial representada por la fórmula siguiente como receptor de azúcar:

40

2. La \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa de la reivindicación 1, en la que la \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa comprende las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC. ID N^{os}.: 1-14 como secuencias parciales.

3. La \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa de la reivindicación 1, en la que el sacárido como receptor de azúcar es un oligosacárido, polisacárido, glucoconjugado (glucopéptido, glicoproteína, glucolípido o proteoglucano) o uno de sus derivados.

4. La \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa de la reivindicación 1, en la que el receptor de azúcar es un sacárido que tiene la estructura parcial representada por la fórmula siguiente:

41

en la que

R1: H-, Man \alpha 1 -> 6 o GlcNAc \beta 1 -> 6

R2: H-, Man \alpha 1 -> 3 o GlcNAc \beta 1 -> 2

R3: -OH o \beta 1 -> 4 GlcNAc -> R4

R4: -OH, -H, cadena de -piridilamina o -péptido.

5. Una \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 18 o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 18 que sufre la adición, la deleción o la sustitución de uno o varios restos de aminoácidos y que produce aún actividad de \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa.

6. Una \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa que consiste en una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 18 incluyendo al menos restos de la posición 93 a la posición 383, o sufriendo dicha secuencia la adición, la deleción o la sustitución parcial de uno o varios restos de aminoácidos y que produce aún actividad de \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa.

7. Una \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 24 o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 24 que sufre la adición, la deleción o la sustitución de uno o varios restos de aminoácidos y que produce aún actividad de \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa.

8. Una \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa que consiste en una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 24 incluyendo al menos restos de la posición 94 a la posición 383, o sufriendo dicha secuencia la adición, la deleción o la sustitución parcial de uno o varios restos de aminoácido y que produce aún actividad de \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa.

\newpage

9. Una \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 37 o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 37 que sufre la adición, la deleción o la sustitución de uno o varios restos de aminoácidos y que produce aún actividad de \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa.

10. Una \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa que consiste en una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº. 37 incluyendo al menos de restos de la posición 91 a la posición 390, o sufriendo dicha secuencia la adición, la deleción o la sustitución parcial de uno o varios restos de aminoácidos y que produce aún actividad de \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa.

11. Un gen de \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa que codifica para la \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10.

12. Un gen de \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID N^{os}.: 17, 23 ó 36.

13. Un DNA recombinante obtenido insertando en un DNA de vector el gen de \beta 1 -> 4N-acetilglucosaminiltransferasa de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12.

14. Una célula huésped que lleva el DNA recombinante de la reivindicación 13.

15. Un método para purificar la \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 a partir de muestras biológicas.

16. Un método para producir una \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 14 en un medio y recuperar la \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa del cultivo resultante.

17. Un método para producir una \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa que comprende recuperar la \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa de secreciones, fluidos corporales y homogenados originados a partir de la célula huésped de la reivindicación 14.

18. Un método para producir una estructura ramificada de una cadena de azúcar de glicoproteína producida por una célula huésped, que comprende introducir en la célula huésped el gen de la \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa de una cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12.

19. Un método para modificar una estructura ramificada de una cadena de azúcar de una glicoproteína producida por una célula huésped, que comprende introducir en la célula huésped el gen de la \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa de una cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12.

20. Un método para producir un sacárido que tiene una estructura parcial representada por la fórmula siguiente:

42

que comprende hacer reaccionar UDP-GlcNAc como un donante de azúcar con un sacárido que tiene una estructura parcial representada por la fórmula siguiente como un receptor de azúcar:

43

en presencia de \beta 1 -> 4 N-acetilglucosaminiltransferasa.