KR100325552B1

KR100325552B1 - 신규β1→4N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제및이를코딩하는유전자

Info

Publication number: KR100325552B1
Application number: KR1019980706231A
Authority: KR
Inventors: 스구루 오구리; 마리 미노와; 아루토 요시다; 마코토 다케우치; 나오유키 다니구치
Original assignee: 기린비이루가부시끼가이샤
Priority date: 1996-12-12
Filing date: 1997-12-10
Publication date: 2002-08-14
Also published as: US20010024814A1; DE69732628T2; WO1998026053A1; US6338955B2; ES2235259T3; EP0905232A1; EP0905232A4; CN1214732A; KR19990082498A; DE69732628D1; JP4246264B2; EP0905232B1; ATE290068T1; CN1273586C

Abstract

본 발명은 신규 β1→4N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라아제(GnT-IV) 활성을 갖는 신규 효소, 상기 효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 DNA, 상기 재조합 DNA를 함유하는 숙주세포, 상기 숙주세포를 배지에 배양하여 GnT-IV 활성을 갖는 효소 단백질을 생산하는 방법, 및 GnT-IV에 의해 변형된 당쇄를 갖는 당에 관한 것이다.

본 발명은 신규 GnT-IV, 이의 제조방법 및 상기 효소를 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 GnT-IV는 기존의 당전이효소가 형성할 수 없었던 분지구조를 갖는 당을 생산할 수 있으며, 복합당 형태의 의약품, 시약, 식품의 제조나 개량에 도움이 되며 동시에, 모든 생체 고분자의 당쇄구조를 변형시키는데 유용하다.

Description

신규 β１→４Ｎ-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라아제 및 이를 코딩하는 유전자

1. 당단백질에 관하여.

천연계에 존재하는 단백질의 대개는 아미노산만으로 이루어진 단순 단백질이 아니라, 당쇄 또는 인산·지질 등이 결합한 「성숙」단백질의 형태로 존재한다. 따라서, 대장균을 생산 숙주로 하는 단순 단백질형의 제품 개발에는 단백질의 성숙 과정을 생략함에 따라 여러가지 문제가 발생하였다. 특히 시토킨류 등 분비형 생리 활성단백질은 소수의 예외를 제외하고 전부 당단백질이기 때문에, 바이오테크놀로지 의약개발의 중요한 사항으로서, 당쇄의 기능과 역할이 주목되고 있다.

당단백질의 당쇄에는, 크게 나누어 Asn결합형, 뮤신형, O-연결 GlcNAc형, GPI-고정형, 프로테오글리칸형 등이 있으며[죽내성, 글리코바이오로지 시리즈5, 글리코 테크놀로지, 목번양·상수선일랑, 영정극효편, 고단샤 사이언티픽, (1994), 191-208], 각각 고유의 생합성 경로를 가지며 개별 생리기능을 맡고 있다. Asn 결합형 당쇄는 곰팡이, 효모로부터 곤충, 식물 및 동물계에 널리 분포하고 있으며,기본적인 생합성 경로는 종을 초월하여 보존되어 있다(도 1). 생합성적으로 공통인 코어 당쇄 부분의 외측(비환원 말단측으로 칭함)에는 생물종에 특징적인 당쇄가 형성된다. α1,6 결합으로 신장하는 주쇄에 α1,3 및 α1,2분지의 만노오스가 결합하여 형성되는 만난형 당쇄는 효모를 비롯한 균류에 특징적인 당쇄구조이다(도 2, a)[중도우, 당쇄공학, 산업조사회, (1992), 384-397]. 한편, 곤충, 식물, 동물에는 만노오스 잔기의 신장이 보이지 않고, 돌리콜 중간체로부터 전이를 받은 당쇄가 절단된 형태인 고 만노오스형(도 2, b)이 형성된다. 곤충, 식물, 연체 동물 등에서는 특징적인 크실로오스 등이 배치된 독특한 구조(도 2, c)를 나타낸다. 동물에서는 일단 절단된 당쇄에 GlcNAc의 분지구조가 형성되고, 갈락토오스, 시알산 등 복수의 단당이 복잡한 구조를 형성하는 복합형 당쇄(도 2, d) 또는 복합형 당쇄와 고 만노오스형 당쇄가 혼재하는 하이브리드형 당쇄(도 2, e) 등의 특징적인 당쇄구조가 보인다[고천청, 당쇄공학, 산업조사회, (1992), 64-75].

이상과 같은 당쇄는 세포 표층 단백질이나 분비 단백질의 대부분에 제공되어, 세포나 단백질의 개성을 결정짓는 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 그 중에서도, 공통 코어 당쇄로부터 안테나 형태로 신장하는 분지를 형성하는 당쇄구조 부분은 분지 당쇄구조로 불리며, 생체 인식 리간드(예컨대, 당쇄의 첨단 부분)에 높은 자유도를 부여하면서 다점 인식의 기회를 만들고, 또한 공간 점유 부피를 비약적으로 증대시켜 단백질 부분에 대한 보호 기능을 최대한 증가시키는 기능을 맡고 있다고 생각된다(죽내성 일행, 전기). 따라서, 당쇄의 분지구조를 조절함으로써, 당단백질의 생리기능, 체내 안정성, 체내 동태, 장기 타겟팅 특성을 여러가지로 변형할 수 있다. 이로써 당쇄 분지구조의 제어기술은 "인간에게 온화한" 당단백질형 의약품 개발을 위한 차세대 바이오 기술로서 기대된다.

2. 당단백질 당쇄의 생리적 의의에 관하여

분비형 당단백질의 당쇄는 당단백질의 생합성, 세포내 소팅, 항원성의 은폐, 생체내 안정성, 장기 타겟팅 특성 등이 뛰어난 기능을 나타낸다. 또한, 세포 표층 당단백질 당쇄는 세포의 분화, 병변, 암화 등의 변화에 따라 변하는 것으로 알려져 있으며, 특히 암의 전이와 당쇄의 분지구조 사이에 밀접한 관계가 있는 것으로 보고되어 있다.

(1)항원성의 은폐

당쇄는 입체 구조상의 자유도가 높고, 마치 프로펠러와 같이 제멋대로 운동한다고 생각된다. 이 때문에, 당쇄에 대한 친화도를 갖지 않은 단백질 분자(프로테아제나 단백질에 대한 항체 등)는 당쇄로부터 멀어져 단백질 부분에 접근할 수 없다. 따라서, 비록 당쇄 결합부위 부근의 펩티드 부분에 항원성이 맞더라도, 항체 분자는 거기에 가까이 갈 수 없고, 항원 항체 반응은 매우 일어나기 어렵게 된다. 또한, 당단백질이 마크로파아지에 포식되어 분해 산물이 항원으로 제시될 때에도 당쇄 결합부위 주변의 펩티드에는 리셉터가 접근하기 어렵고, 항원 자극이 일어나기 어렵다. 실제, 난백 리소짐(lysozyme)의 항원 펩티드의 중앙 부근에 당쇄를 도입하면, MHC class II 분자와의 결합이 현저히 저해되는 것이 보고되어 있다[Mouritsen, S., Meldal, M., Christiansen-Brams, I., Elsner, H. 및 Werdelin, 0., Eur. J.Immuno1., (1994), 24, 1066-1072]. 이러한 항원성의 은폐효과는 당쇄가 차지하는 공간 용적이 클수록 높기 때문에, 분지구조의 발전에 의한 기여는 크다고 생각된다.

(2) 생체내 안정성

유전자 재조합 동물세포를 숙주로 하여 생산된 최초의 당단백질형 의약품인 에리트로포이에틴에 있어서는 그 당쇄의 기능이 철저히 조사되었다. 그 결과, 에리트로포이에틴의 당쇄는 수용체와의 결합을 저해하지만, 활성 구조의 유지 및 체내 동태의 개선에 결정적으로 기여하며, 전체적으로 약리 활성의 발현에 필요 불가결한 것으로 보인다[Takeuchi, M. 및 Kobata, A., 글리코바이올로지, (1991), 1, 337-346]. 특히, 당쇄의 안테나수와 에리트로포이에틴의 약리 효과 사이에 강한 연관성이 밝혀졌으며, 지금까지 주목받지 못한 분지구조(코어 당쇄에 결합하는 GlcNAc에 의해 형성되는 분지구조)의 중요성이 처음으로 분명히 밝혀졌다[Takeuchi, M., Inoue, N., Strickland, T.W., Kobata, M., Wada, M., Shimizu, R., H oshi, S., Kozutsumi, H., Takasaki, S. 및 Kobata, A., Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, (1989), 86, 7819-22]. 분지구조가 발달하지 않은 에리트로포이에틴은 신장에서의 제거가 빨라져서, 결과적으로 체내 체류 시간이 줄어드는 것이 이 현상의 주된 원인으로 보고되어 있다[Misaizu, T., Matsuki, S., Strickland, T. W., Takeuchi, M., Kobata, A. 및 Takasaki, S., Blood, (1995), 86, 4097-4104].

(3) 장기 타겟팅 특성

생체조직의 대부분은 렉틴형 리셉터를 가지고 있고, 세포-세포 상호작용에사용되거나, 혈중으로부터 당단백질을 넣은 데 이용되고 있다. 간의 아실-알로 단백질 결합 렉틴은 노화된 당단백질의 제거계의 대표적인 예[천기민우, 당쇄공학, 산업조사회, (1992), 125-136]이다. 그외에도, 혈관 내피세포, 혈소판, 백혈구가 가지는 셀렉틴(천기민우, 전기)이나, 마크로파아지, NK 세포 표층의 렉틴 리셉터(천기민우, 전기)가 잘 알려져 있다. 또한, 당단백질 뿐만아니라, 세포도 당쇄를 리간드로 하여 특정조직에 모이는 현상이 알려져 있고, 골수세포의 호밍(homing)[입촌달랑, 글리코바이올로지 시리즈3, 세포 사회의 글리코바이올로지, 영정극효·상수선일랑·목번양편, 고단샤 사이언티픽, (1993), 127-175]이나 염증 부위로의 호중구의 보급(입촌달랑, 전기) 등의 예가 자세히 조사되고 있다. 이상을 통합하면, 당단백질이나 세포는 그 당쇄구조에 의해 모든 장기에 가지 않을 정도로도, 혈류중에 렉틴 리셉터를 제시하는 특정한 장기와 조직에 대한 타겟팅 특성을 가지고 있는 것으로 충분히 생각된다. 이것은, 당쇄에의한 약물 수송의 길을 여는 것이다. 그 경우, 렉틴의 당쇄에 대한 친화성은 당쇄 리간드의 자유도와 수에 크게 좌우되기 때문에, 당쇄의 분지구조가 최대의 주안점이 된다.

(4) 세포의 병변과 당쇄 분지구조의 연관성[가등순자, 영목직자, 당쇄공학과 의약품개발, 의약품 부작용 피해 구제, 연구진흥기금편, 약업시보사, (1994), 107-13214)]

다분지형 당쇄구조를 검출하는 프로브로서, L-PHA라는 식물 렉틴이 개발되어, 여러가지 병변 조직 표본을 조사하였다. 그 결과, 일부의 암세포, 특히 전이능이 높은 암세포가 L-PHA에서 잘 염색되는 경향이 밝혀졌고, 당쇄의 분지구조와암의 전이능과의 연관성이 있는 것으로 밝혀졌다. 인간 코리오닉 고나도트로핀(hCG, human Chorionic gonadotropin)은 임신 초기의 섬모조직에서 열심히 생합성되는 당단백질 호르몬이다. 상당량이 소변으로 배출되기 때문에, 임신의 지표로서 임상적으로 이용되어 왔다. 이 hCG의 Asn 결합형 당쇄는 1분지 및 2분지 복합형을 주체로 하는 특징이 있지만, 영양막 종양(Trophoblastoma)으로부터 침식성 모반(Invasive mole), 섬모암(Choriocarcinoma)으로 암이 악성도를 증가시킴에 따라서, 2,4,2형 3분지쇄 및 이상 2분지쇄(어느것이나 1분지쇄 및 2분지쇄에 GnT-IV가 작용한 형)가 출현하는 것이 보고되어 있다[산하극자, 단백질·핵산·효소, (1992), 37, 1880-1888]. 그 원인으로서 GnT-IV가 섬모암의 악성화에 연동하여 활성 상승할 가능성이 시사되고 있다.

γ-글루타밀트랜스펩티다아제(γ-GTP)는 간에 특이적으로 많이 존재하는 당단백질이다. 혈청중의 γ-GTP는 여러가지의 간질환에 따라 극적으로 증가하기 때문에, 간질환의 지표로서 임상 응용되고 있다. 또한 야마시타 등[Yamashita, K., Totani, K., Iwaki, Y., Takamisawa, I., Tateishi, N., Higashi, T., Sakamoto, Y. 및 Kobata, A., J.Biochem., (1989), 105, 728-735]은 γ-GTP의 당쇄구조가 세포의 암화보다는 hCG와 유사한 분지구조 이상을 일으키는 것을 밝혔으며, 암화와 GnT-IV 활성화의 연관성을 보고하고 있다. 정상 인간 간세포유래 γ-GTP의 Asn 결합형 당쇄는 2분지 복합형을 주체로 하여, 소량의 3분지쇄, 4분지쇄도 혼재하는 분포가 있지만, 인간 간암세포유래의 것은 현저한 분지구조의 앙진이 보이며, 동시에 소량이기는 하지만 정상 세포유래의 것에는 보이지 않은 고 만노오스형 당쇄 및 이상 2분지쇄가 출현하고 있었다. 그 원인으로서, N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라아제-IV(GnT-IV) 및 -V가 암화에 수반하여 활성화 되었을 가능성을 시사하고 있다(야마시타 등, 전기).

세포의 당단백질의 당쇄 분지구조는 바이러스의 감염에 의해서도 심하게 변하는 것으로 보고되어 있다(야마시타 등, 전기). BHK 세포는 테트라-안테나형까지의 분지 당쇄구조를 가지고 있다. 이것을 폴리오마 바이러스로 형질전환시키면, 세포가 생산하는 당단백질 당쇄중 바이-안테나형이 감소하고, 대신 테트라-안테나형 및 N-아세틸락토오사민의 반복 구조가 증가하며, 전체적으로 분지수의 현저한 앙진이 확인되었다[Takasaki, S., Ikehira, H. 및 Kobata, A., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1980), 90, (3), 735-742]. 그 원인으로서는, GnT-IV, -V 및 i-GnT의 활성화가 고려된다.

3. 당단백질의 분지 당쇄구조와 관련된 효소에 관하여

동물에게 특징적인 당단백질 당쇄구조인 복합형 당쇄는 공통 코어형 당쇄에 아세틸글루코사민(GlcNAc)이 다양하게 결합하여 복잡한 분지구조를 형성하고 있다(고천청, 전기)(도 1). 이 분지구조는 생체내외에 있어서 당단백질의 안정성, 국재성, 생물활성, 약리특성과 밀접한 관계가 있기 때문에(죽내성, 전기), 그 생합성 과정이 자세히 조사되어 왔다. H. Schachter 등은 기질에 고안하여, 암탉 난관 중의 각 효소활성을 구별하고, GnT-I∼VI까지의 GlcNAc 분지 형성 효소(GlcNAc 당전이효소군; 도 3)의 존재를 예언하였다[Glesson, P. A. 및 Schachter, H., J.Bio1.Chem., (1983) ,258, 6162-6173]. 그 후, GnT-I[Kumar, R., Yang, J.,Larsen, R. D. 및 Stanley P., Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, (1990), 87, 9948-9952; Sarkar, M., Hul1, E., Nishikawa, Y., Simpson, R. J., Moritz, R. L., Dunn, R. 및 Schachter, H., Proc. Natl. Acad. Sci., 미국, (1991), 88, 234-238], GnT-II[D' Agostaro, GA., Zingoni, A., Moritz, RL., Simpson, RJ., Schachter, H. 및 Bendiak, B., J.Bio1.Chem., (1995), 270, 15211-21], GnT-III[Nishikawa, A., Ihara, Y., H atakeyama, M., Kangawa, K. 및 Taniguchi, N., J.Bio1.Chem., (1992), 267, 18199-18204], GnT-V[Shorebah, M. G., Hindsgaul, O. 및 Pierce, M., J.Bio1.Chem., (1992), 267, 2920-2927; Gu, J., Nishikawa, A., Turuoka, N., Ono, M., Yamaguchi, N., Kangawa, K. 및 Taniguchi, N., J.Biochem., (1993), 113, 614-619]가 차례로 정제되어, 유전자가 클로닝되었다. 그러나, 이것들의 이미 알려진 GlcNAc 전이효소만으로서는 대표적인 인간의 혈중 당단백질로서 알려지고 α1산성 당단백질[Yoshima, H., Matsumoto, A., Mizuochi, T., Kawasaki, T. 및 Kobata, A., J. Biol. Chom. (1981), 256, 8476-8484] 또는 에리트로포이에틴[Takeuchi, M., Takasaki, S., Shimada, M. 및 Kobata, A., J.Bio1.Chem., (1990), 265, 12127-12130]에서 보이는 주요 당쇄[테트라-안테나형', 하기 식를 형성할 수 없기 때문에, GnT-IV에 해당하는 기질 및 반응 특이성을 갖는 아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라아제가미싱 링크(Missing link)로서 탐구되어 왔다.

아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라아제로서는, 상기 이외에 뮤신형 당쇄에 작용하는 것[Bierhuizen, M. F., Maemura, K. 및 Fukuda, M., J.Bio1.Chem., (1994), 269, 4473-4479], 당지질에 작용하는 것, 또는 I·i-항원구조로 알려진 당쇄 에피토프를 형성하는 것[Kawashima, H., Yamamoto, K., 0sawa, T. 및 Irimura, T., J.Bio1.Chem., (1993), 268, 27118-27126; Bierhuizen, M. F., Mattei, M. G. 및 Fukuda, M., Genes Dev., (1993), 7, 468-478]에 관하여 정제 또는 유전자의 클로닝이 이루어지고 있지만, 기질 특이성이나 전이된 GlcNAc기의 결합 양식이 다르고, 어느 것이나 GnT-IV형태의 생성물을 제공하지 않는다.

본 발명은 당중의 특정 당쇄구조를 인식하여, GlcNAcβ1→4 분지구조를 도입하는 신규 N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라아제(GlcNAc 전이효소)에 관한 것이다.

도 1은 Asn결합형 당쇄 생합성 경로를 나타낸다.

도 2는 Asn결합형 당쇄의 변이형(죽내성; 화광순약시보 64, 18-19, 1996; 도 1의 변형)을 나타낸다.

a. 만난형: 효모·곰팡이 등 균류에 특징적인 당쇄구조.

b. 크실로오스 고 만노오스형: 식물·연체동물·곤충에서 특징적임.

c. 고 만노오스형: 식물·곤충에서 동물까지 공통으로 볼 수 있는 구조.

d. 하이브리드형: 곤충·동물에서 공통으로 볼 수 있는 구조.

e. 복합형: 동물에서 특징적임.

f. 원핵세포: Asn결합형 당쇄의 생합성계가 없슴.

그림중, 점선으로 둘러싼 부분은 공통 코어 당쇄를 나타낸다.

도 3은 GlcNAc 전이효소(GlcNAc 당전이효소) 작용점을 나타낸다.

도 4는 올리고당의 호칭과 그 구조를 나타낸다.

도 5는 GnT-IV 반응생성물의 고속 액체 크로마토그램을 나타낸다.

도 6은 Q-세파로오스 FF 크로마토그래피의 분석 결과를 나타낸다.

도 7은 구리 킬레이트 세파로오스 FF 크로마토그래피의 분석 결과를 나타낸다.

도 8은 UDP-헥사놀아민 아가로오스 친화도 크로마토그래피(I)의 분석 결과를 나타낸다.

도 9는 UDP-헥사놀아민 아가로오스 친화도 크로마토그래피(II)의 분석 결과를 나타낸다.

도 10은 수퍼덱스(Superdex) 200 겔 크로마토그래피의 분석 결과를 나타낸다.

도 l1은 정제 GnT-IV의 SDS-PAGE(SDS 폴리아크릴아미드 겔전기영동)의 결과를 나타낸 사진이다.

도 12는 GnT-IV 샘플의 네이티브 겔 전기영동 사진과 활성을 나타낸다.

도 13은 GnT-IV, V, VI 생성물 올리고당의 스미스분해를 나타낸다.

도 14는 GnT-IV 반응 생성물의¹H-NMR(30℃)의 결과를 나타낸다.

도 15는 GnT-IV의 적정 pH를 나타낸다.

도 16은 GnT-IV의 적정 Mn²⁺농도를 나타낸다.

도 17은 당단백질에 대하여 GnT-IV를 작용시킨 반응 산물의 SDS-PAGE(SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 및 그 플루오로 크로마토그래프에 의한 분석 결과를 나타낸 사진이다(A: CBB에 의한 단백질 염색, B:플오로그래픽).

레인 l, 2; 아시알로·아가락토·인간·트랜스페린 7.6㎍

레인 3; 아시알로·인간·트랜스페린 7.6㎍

레인 4, 5; 아시알로·아가락토·CHO 세포유래 재조합·인간·에리트로포이에틴 2.8㎍

레인 6, 7 ; 아시알로·아가락토·펙틴 1.3㎍

레인 l, 4, 6은 GnT-IV를 가하지 않고 반응시킨 MOCK 실험. M은 분자량 표지물질(Bio-Rad), PM은 미리 염색된 분자량 표지물질(Bio-Rad, 미국).

GnT-IV 반응조건: 0.702nmo1/hr의 GnT-IV, 바이-안테나형 당쇄 1.6nmo1상당의 기질 당단백질(펙틴만은 당쇄 함량을 1.6nmo1에 합하였다), 450nCi의 UDP-[14C]GlcNAc를 함유하는 용액 10㎕에 등량의 분석 혼합물(250mM MOPS 완충액, pH 7.3, 40OmM GlcNAc, 20% 글리세롤, 1.0%(w/v) Triton X-100, 15mM MnC1₂, lmM UDP-GlcNAc)을 가한 반응액을 37℃에서 20시간 배양한 후, 1/1O을 SDS-PAGE 및 플루오로그래피로 분석하였다.

SDS-PAGE에는 10-20% 그래디언트 겔(제일화학)을 사용하고, 플루오로그래피에는 앰플리티(Amplity, 아머샴)를 사용하여 X선 필름에 20시간 노출시켰다.

도 18은 인간 GnT-IVa의 오픈 리딩프레임과 pCore-His 발현벡터에 포함된 영역을 나타낸다.

도 19는 각 세포주가 생산하는 에리트로포이에틴의 등전점 전기영동/웨스턴 분석을 나타낸다. 두 종류의 에리트로포이에틴 생산주 및 이들에 소 또는 인간의 GnT-IVa 유전자를 도입한 주에 있어서, 이들이 분비하는 에리트로포이에틴을 등전점전기영동 및 항에리트로포이에틴 항체를 사용한 웨스턴 분석법에 의해 해석하였다. 좌단에 동시에 영동한 pI 표지물질의 위치를 나타낸다.

본 발명의 과제는 β1→4N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라아제(이하, GnT-IV로 칭함) 활성을 갖는 효소, 상기 효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 DNA, 상기 재조합 DNA를 함유하는 세포, 상기 세포를 배지에 배양하여 GnT-IV 활성을 갖는 효소 단백질을 생산하는 방법, 및 GnT-IV에 의해 변형된 당쇄를 갖는 당을 제공하는 것이다.

본 발명자 일행은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 소의 소장보다 GnT-IV 효소 단백질을 분리 정제하여, 그 생화학적 성질을 밝힘과 동시에, 이의 부분 아미노산 서열을 바탕으로 상기 조직의 cDNA 라이브러리 및 mRNA에서 소 GnT-IVa 유전자의 클로닝을 성공하였다. 또한, 소 GnT-IVa 유전자를 바탕으로 인간 간·인간 폐의 cDNA 라이브러리 및 mRNA에서 각각 인간 GnT-IVa·인간 GnT-IVb의 2개의 유전자를 클로닝하는 것에 성공하였다. 그리고, 이들 유전자산물이 GnT-IV 활성을 나타낸다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명의 제 1발명은 당공급체로서 UDP-GlcNAc를, 당수용체로서로 표시되는 부분 구조를 갖는 당을 각각 기질로 하여,로 표시되는 부분 구조를 갖는 당을 생성시키는 작용을 갖는 GnT-IV이다.

본 발명의 제 2발명은 서열 18에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 18에 기재된 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수의 아미노산 서열이 부가, 결실 또는 치환되고 GnT-IV 활성을 가져오는 아미노산 서열을 갖는 GnT-IV; 서열 24에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 24에 기재된 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수의 아미노산 서열이 부가, 결실 또는 치환되고 GnT-IV 활성을 가져오는 아미노산 서열을 갖는 GnT-IV; 서열 37에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 37에 기재된 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수의 아미노산 서열이 부가, 결실 또는 치환되고 GnT-IV 활성을 가져오는 아미노산 서열을 갖는 GnT-IV 이다.

본 발명의 제 3발명은 서열 18에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 18에 기재된 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수의 아미노산 서열이 부가, 결실 또는 치환되고 GnT-IV 활성을 가져오는 아미노산 서열을 갖는 GnT-IV를 코딩하는 GnT-IV유전자; 서열 24에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 24에 기재된 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수의 아미노산 서열이 부가, 결실 또는 치환되고 GnT-IV 활성을 가져오는 아미노산 서열을 갖는 GnT-IV를 코딩하는 GnT-IV 유전자; 서열 37에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 37에 기재된 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수의 아미노산 서열이 부가, 결실 또는 치환되고 GnT-IV 활성을 가져오는 아미노산 서열을 갖는 GnT-IV를 코딩하는 GnT-IV 유전자; 서열 17에 기재된 염기 서열을 갖는 GnT-IV 유전자; 서열 23에 기재된 염기 서열을 갖는 GnT-IV 유전자; 서열 36에 기재된 염기 서열을 갖는 GnT-IV 유전자이다.

본 발명의 제 4발명은 상기 어느 한 항에 있어서 GnT-IV 유전자를 벡터 DNA에 삽입하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA; 상기 어느 한 항에 기재된 GnT-IV 유전자의 일부 또는 전부를 함유하는 염색체 단편이다.

본 발명의 제 5발명은 상기 재조합 DNA를 함유하는 숙주세포; 상기 염색체 단편을 인위적으로 도입한 숙주세포이다.

본 발명의 제 6발명은 상기 숙주세포를 배지에 배양하여, 배양물로부터 GnT-IV를 채취하는 것을 특징으로 하는 GnT-IV의 제조법; 상기 숙주세포를 기원으로 하는 숙주의 분비물·체액·균질물로부터 GnT-IV를 채취하는 것을 특징으로 하는 GnT-IV의 제조법이다.

본 발명의 제 7발명은 생물 시료로부터 상기 GnT-IV를 정제하는 방법이다.

본 발명의 제 8발명은 상기 GnT-IV에 의해 당쇄구조를 변경시킨 당이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 GnT-IV 유전자는 아래와 같이 분리할 수 있다.

소 GnT-IVa 유전자의 취득

우선, 소 소장의 마이크로솜 분획을 계면활성화제로 가용화시켜, 음이온 교환 수지·구리킬레이트 칼럼·2단계의 기질 유사체에 의한 친화도 크로마토그래피 및 겔 여과의 일련의 조작을 가하여 GnT-IV 효소의 정제샘플을 얻는다. 얻어진 정제샘플을 SDS-PAGE에 걸어, PVDF 막상에 전사된 것 그대로, 또는, 한정 가수분해 후, 기체 아미노산 시퀀서(sequencer)로 분석함으로써 본 효소의 부분 아미노산 서열을 얻는다.

다음, 동물세포(소 소장)에서 추출한 RNA를 주형으로 하여, 상기 서열 결정된 부분 아미노산 서열을 바탕으로 설계한 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 실시한다. 또한, RT-PCR에 의해 얻어진 단편을 프로브로 하여, 플라크 하이브리다이제이션에 의해 상기 조직 유래의 cDNA 라이브러리로부터 목적하는 GnT-IVa 유전자를 스크리닝한다. 얻어진 양성 플라크에 함유된 cDNA 단편을 절단하고, pUC19 등의 벡터에 서브클론하여 염기 서열을 해석한다. 단백질을 코딩하는 부분의 전장이 얻어지지 않으면, 필요에 따라 서브클론한 단편의 일부를 프로브로 하여 다시 플라크 하이브리다이제이션을 하여 얻어진 염기 서열 정보를 바탕으로 RACE법 등으로 cDNA 말단부를 얻는다. 이렇게 하여 클로닝된 GnT-IVa 유전자의 전체 염기 서열을 해석하고, 이어서 상기 염기 서열을 갖는 유전자에 의해 번역되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 확정한다. 이 아미노산 서열은 서열 18에 표시된 바와 같다.

인간 GnT-IVa 유전자, 인간 GnT-IVb 유전자의 취득

인간 GnT-IVa 유전자, 인간 GnT-IVb 유전자는 상술한 바와 같이 실시하여 얻어진 소 GnT-IVa 유전자의 염기 서열 정보를 바탕으로 인간조직(간 또는 폐)에서 추출한 RNA를 사용한 RT-PCR 및 이들 조직에서 유래된 cDNA 라이브러리의 스크리닝에 의해 얻어진다. 얻어진 인간 GnT-IVa 유전자, 인간 GnT-IVb 유전자의 전체 염기 서열을 해석하고, 이어서 이들 유전자에 의해 번역되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 확정한다. 이들 아미노산 서열은 서열 24,37에 표시된 바와 같다.

한편, 서열 18, 24, 37의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수의 아미노산이 부가, 결실 또는 치환된 서열을 코딩하는 DNA를 얻기 위하여 많은 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 점 변이 또는 결실 변이를 생기게 하기 위하여 유전자를 변이원으로 처리하는 방법; 유전자를 선택적으로 분해시켜, 다음에 선택된 뉴클레오티드를 제거 또는 부가하여 유전자를 연결하는 방법; 올리고뉴클레오티드 변이 유발법 등을 들 수 있다.

상기 방법에 의해 얻어진 본 발명의 GnT-IV를 코딩하는 DNA를 적당한 벡터의 프로모터 하부에 삽입하여 재조합 벡터를 제작하고, 그것을 숙주세포에 도입하 얻어진 세포를 배양함으로써 본 발명의 GnT-IV를 제조할 수 있다. 사용되는 벡터 DNA는 플라스미드 DNA 또는 박테리아 파아지 DNA라도 좋다. 예컨대, 하기 실시예에 표시되는 벡터 pSVL 벡터(파마시아, 스웨덴)를 사용할 수 있다. 얻어진 재조합 DNA를 도입하는 숙주세포로서는 원핵세포, 동물세포, 효모, 곰팡이, 곤충세포등, 재조합 DNA 기술에 사용되는 세포면 어떠한 세포라도 사용할 수 있다. 예컨대, 원핵세포로서는 대장균, 동물세포로서는 중국 햄스터의 세포인 CHO 세포, 원숭이의세포인 COS 세포 등을 들 수 있다.

상기 형질전환은 각각의 숙주에 대하여 일반적으로 행해지는 방법으로 실시한다. 예로서는 숙주가 대장균이면 칼슘법, 그 밖의 방법에 의해 형성된 콤피턴트 세포에 재조합 DNA를 함유하는 벡터를 온도 충격법 또는 일렉트로포레이션법에 의해 도입한다. 숙주가 효모이면 리튬법, 그 밖의 방법에 의해 형성된 콤피턴트 세포에 재조합 DNA를 함유하는 벡터를 온도 충격법 또는 일렉트로포레이션법에 의해 도입한다. 숙주가 동물세포이면, 증식기 등의 세포에 재조합 DNA를 함유하는 벡터를 인산칼슘법, 리포펙션법 또는 일렉트로포레이션법에 의해 도입한다.

이렇게 하여 얻어진 형질전환체를 배지에 배양함으로써, GnT-IV 단백질을 생산한다.

형질전환체를 배양하는 경우, 배양에 사용되는 배지로서는 각각의 숙주가 생육가능한 배지이면 좋다. 예로서는 숙주가 대장균이면 LB 배지 등을 쓴다. 숙주가 효모이면 YPD 배지 등을 사용한다. 숙주가 동물세포이면, Dulbecco's MEM에 동물혈청을 가한 것 등을 쓴다. 배양은 각각의 숙주에 대하여 일반적으로 사용하고 있는 조건으로 한다. 예로서는 숙주가 대장균이면 약30∼37℃에서 약 3∼24시간 실시하며, 필요에 따라 통풍이나 교반할 수 있다. 숙주가 효모이면 약 25∼37℃에서 약 12시간∼2주간 실시하며, 필요에 따라 통풍이나 교반할 수 있다. 숙주가 동물세포이면 약 32∼37℃에서 5%의 C0₂, 100%의 습도 조건으로 약 24시간∼2주간 실시하며, 필요에 따라 기상의 조건을 바꿔 교반할 수 있다.

배양 후, 배양균체 또는 세포를 균질기, 프렌치 프레스, 초음파, 리소짐 및/또는 동결융해에 의해 균체 또는 세포를 파괴하고, 균체외에 GnT-IV 단백질을 용출시켜, 가용성 분획으로부터 상기 단백질을 얻을 수 있다. 또한, 원하는 단백질이 불용성 분획에 포함되는 경우 균체 또는 세포를 파괴한 후, 원심분리에 의해 불용성 분획을 회수하고, 염산 구아니딘 등을 함유하는 완충액 등으로 가용성 분획을 회수하는 방법도 쓸 수 있다. 그외에 염산 구아니딘 등의 단백질 변성제를 함유하는 완충액으로 직접 균체 또는 세포를 파괴하여 균체외에 원하는 단백질을 용출시키는 방법도 있다.

상기 상등액으로부터 GnT-IV 단백질을 정제하기 위하여, 실시예 1에 나타낸 방법 이외에, 공지된 분리·정제법을 적절히 조합할 수 있다. 공지의 분리, 정제법으로서는 원심분리, 염석, 용매침전, 투석, 한외여과, 분배 크로마토그래피, 겔여과, 모세관 전기영동, TLC, 이온교환 크로마토그래피, 금속 킬레이트 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 등전점 전기영동 등이 있다.

상기한 바와 같이 하여 소 소장에서 얻어진 GnT-IV 효소 단백질의 생화학적성질은 다음과 같다.

(1) 작용

당공급체로서 UDP-GlcNAc를, 당수용체로서로 표시되는 부분 구조를 갖는 당을 각각 기질로하여,로 표시되는 부분 구조를 갖는 당을 생성한다.

당수용체가 되는 당은 올리고당, 다당, 복합당(당펩티드, 당단백질, 당지질, 프로테오글리칸) 및 이들의 유도체를 말한다.

(2) 기질 특이성

수용체가 되는 당이 올리고당(올리고당의 구조는 도 4 참조)인 경우, GnT-II 생성물형 올리고당을 수용체로 하였을 때를 1OO%로 하면, 코어형 올리고당, GnT-I 생성물형 올리고당, GnT-V 생성물형 올리고당은 각각 0%, 54%, 164%의 반응성을 나타낸다.

GnT-II 생성물형 올리고당의 환원말단 GlcNAc에 푸코오스가 α1→6결합으로 결합된 구조에는 46%의 반응성을 나타낸다.

GnT-II 생성물형의 만노오스 α1→3 분지측의 GlcNAc가 결핍된 구조에는 0%의 반응성을 나타낸다.

GnT-II 생성물형 올리고당의 α1→6 분지측 UGlcNAc에 갈락토오스가 β1→4결합으로 결합한 구조에는 16%의 반응성, α 1→3분지측 GlcNAc에 갈락토오스가 β1→4결합으로 결합한 구조에는 0%의 반응성을 나타낸다.

GnT-II 생성물형 올리고당의 β1→4잔기에 GlcNAc가 β1→4결합으로 결합한 구조에는 0%의 반응성을 나타낸다.

(3) 분자량

SDS-PAGE(비환원하에서)에서 약 66K. 펩티드 N-글리코오시다아제 F 처리 후 약 60K.펩티드 N-글리카나아제에서 밴드의 이동이 있는 것부터, 당단백질이라고 생각된다.

Triton X-100이 들어간 겔여과에서 겉보기 분자량은 77K. 따라서 GnT-IV는 서브유닛 구조를 가지지 않고, 단량체로 기능한다고 생각된다.

염기 서열로부터 추정된 본 효소의 단백질 부분은 535 아미노산 잔기로 이루어지며, 분자량은 61614이다.

(4) 적정 pH

반응의 적정 pH는 약 5.5이다. pH 6.5∼8.0의 범위에서 최대치의 50% 이상의 활성이 확인된다.

(5) 저해, 활성화 및 안정화

(i) 저해

본 효소는 20mM의 EDTA의 첨가로 활성이 저지된다.

본 효소는 UDP 유도체에 의해 저해된다. 저해의 강도는 UDP >> UDP-Glc > UDP-GalNAc >> 2'-데옥시UDP > UDP-헥사놀아민 >> UDP-Ga1 > UTP > UDP-글루쿠론산 > UMP 이다.

유리딘, TDP, CDP에는 저해효과가 없다.

(ii) 활성화

활성 발현에 2가 양이온이 필수적이다. 2가 양이온 중에는 Mn²⁺가 최대의 효과를 나타내고, 7.5mM 농도하에서 Co²⁺, Mg²⁺에서는 Mn²⁺의 70%정도, Ca²⁺에서는 10% 정도의 효과가 있다. Mn²⁺의 효과는 5∼20mM의 범위에서 최대이다.

(iii) 안정화

BSA, 글리세롤에 안정화 효과가 확인된다.

(6) 속도정수

수용체가 되는 당이 올리고당(올리고당의 구조는 도 4 참조)의 경우, (i) 0.8mM의 수용체 기질, 20mM UDP-GlcNAc, 7.5mM MnC1₂, 20OmM GlcNAc, 0.5%(w/v) Triton X-100, 10% 글리세롤, 1% BSA를 함유하는 125mM MOPS 완충액, pH 7.3, 50㎕중에서 37℃, 4시간 동안 반응시켜 분석하는 조건:

GnT-II 생성물형 올리고당에 대한 Km, Vmax값은 각각, 0.73mM, 3.23μM/min.

GnT-V형 생성물 올리고당에 대한 Km, Vmax값은 각각, 0.13mM, 1.75μM/min.

GnT-II형 생성물 올리고당을 수용체 기질로 한 경우, UDP-GlcNAc에 대한 Km값은 0.22mM.

(ii) 120mM UDP-GlcNAc, 7.5nM MnCl₂, 0.5%(w/v) Triton X-100, 10% 글리세롤, 1% BSA를함유하는 125mM MOPS 완충액, pH 7.3, 37℃에서 4시간 동안 반응시켜 분석하는 조건:

GnT-II 생성물형 올리고당에 대한 Km, Vmax값은 각각 0.59mM, 0.74mM/min/mg.

GnT-V 생성물형 올리고당에 대한 Km, Vmax값은 각각 0.14mM, 0.47mM/min/mg.

(7) GnT-IV 패밀리

소 GnT-IVa와 인간 GnT-IVa 양자의 상동성은 핵산 수준에서 91%, 아미노산 수준에서 96%이다.

소 소장으로부터 얻어진 정제 GnT-IV의 부분 아미노산 구조는 전부 소 GnT-IVa 유전자 내에 코딩되어 있다.

인간 GnT-IVb와 인간 GnT-IVa는 핵산 수준에서 63%, 아미노산 수준에서 62%의 상동성이 있지만, C말단 및 N말단 영역이 전혀 다르다.

이상의 생화학적 성질보다, 본 발명의 GnT-IV는 종래의 당전이효소로서는 할 수 없는 하기 식의 반응을 할 수 있는 점에서 신규 효소로 확인되었다:

이하에서 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[참고예 1]

(1) 실시예에 사용한 시약류

특별한 지정이 없는 시약류는 화광순약제의 최고 등급의 것을 사용하였다.

① 피리딜아미노화 올리고당

사용된 각 피리딜아미노화 올리고당은 인간·트랜스페린(아포형, 시그마, 미국) [Tokugawa 등의 방법; Biehuizen, M.F., Mattei, M.G. 및 Fukuda, M. (1993) Genes Dev. , 7, 468-478]으로 조제한 것을 기재로 하고, 여기에 아레트로박터 유레아파시엔스(Arethrobacter ureafaciens) 유래 시알리다아제(나카라이테스크), 아스페루길루스(Asperugillus sp.) 유래 β-갈락토오시다아제(동양방적), 작두콩 유래 β-N-아세틸헥소사미니다아제(생화학공업) , CHO-K1 세포추출액(CHO-K1세포를 2배 용량의 2mM MgC1₂와 1mM PMSF를 함유하는 5mM Tris-HC1, pH7.5의 완충액에서 초음파 분쇄하여, 900×g에서 lO분 동안 원심분리하여 얻은 상층액)중의 GnT-V 활성 분획, 및 소 소장 균질물 가용화 분획(조제법은 실시예 1; 마이크로솜 분획의 조제 및 가용화에서 기술함)중의 GnT-V 활성 분획을 단독으로 또는 조합하여 조제하였다. 일부는 PA-Sugar chain 021, 022 (보주조)를 상기 효소로 처리하여 조제하였다. 어느 것이나 ODS 칼럼(10×250mm, Vydac, 미국)의 역상 크로마토그래피로 정제하고 나서 사용하였다.

② 당단백질 기질

소·펙틴(시그마, 미국)과 CHO 세포유래 재조합 인간·에리트로포이에틴(기린맥주)는 이하 전처리에 의해 비교적 균질한 당쇄구조의 것을 정제하여 사용하였다. 당단백질 40∼1OOmg을 1mM MgC1₂, 1mM CaCl₂, O.15M NaC1을 함유하는 10mM Tris-HC1, pH 7.4 완충액으로 평형화된 ConA-세파로오스 칼럼(5㎖, 파마시아, 스웨덴)에 첨가하여, 바이-안테나형 당쇄가 적은 글리코형을 비흡착 분획으로 얻었다. 또한, 칼럼을 1.0Mα-메틸만노시드(나카라이테스크)가 들어간 상기 완충액으로 용출시켜, 바이-안테나형 당쇄 함량이 높은 글리코형 흡착 분획을 얻었다. 이렇게 해서 바이-안테나형 당쇄 저함량의 펙틴과 바이-안테나형 당쇄 고함량의 에리트로포이에틴을 얻었다. 또한, 인간·트랜스페린은 거의 모든 당쇄가 바이-안테나형이기 때문에 정제할 필요는 없다.

상기한 바와 같이 하여 얻어진 펙틴 및 인간·트랜스페린은 4mM MgC1₂를 함유하는 0.4M 아세트산 나트륨 완충액, pH5.0, l㎖ 반응액 속에서 시알리다아제 1U와 β-갈락토오시다아제0 또는 107U를 37℃에서 16시간 동안 반응시켜, 아실알로화 및 아시알로·아가락토화시켰다. 또한, 바이-안테나형 당쇄 고함량의 에리트로포이에틴은 시알리다아제 0.5U와 β-갈락토오시다아제 5U를 상기와 같이 작용시켜, 아시알로·아가락토화시켰다.

얻어진 당단백질 기질은 50mM 암모늄 아세테이트 완충액, pH7.3에서 투석한 후, BCA 단백질 분석(Pierce, 미국)으로 단백질량을 정량(BSA, bovine serum albumin을 표준 물질로 하였다)하여, SDS-PAGE(sodium dodesylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis)에서 검정하여 실시예에 사용하였다.

③ RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction)

RT-PCR에는 Access RT-PCR 시스템(프로메가, 미국)을, 또한 원하는 유전자 단편을 증폭할 때는 Pfu 폴리머라아제(스트라타젠, 미국)를 사용하였다.

(2) 실시예에 사용된 기기류

① 유전자 서열 결정

ABI PLISM 377 DNA 시퀀서(퍼킨-엘머, 미국)를 사용하였다.

[참고예 2] GnT-IV 활성의 특이적 분석

일반적으로 GnT 활성의 분석법으로서는 올리고당 기질에의 방사 활성 표지화 GlcNAc의 전이를 측정하는 방법, 미리 표지된 올리고당 기질에의 GlcNAc의 전이를 HPLC 등으로 분별 측정하는 방법이 있다. 곡구 등은 GnT-II 생성물형 올리고당을 수용체로 사용하여, GnT-III, -IV 및 -V 활성을 동시 측정하는 방법을 개발하고 있다[Nishikawa, A., Fujii, S., Sugiyama, T. 및 Taniguchi, N. (1988) Anal. Biochem., 170, 349-354]. 그러나, 전체내에서 GnT-IV의 상대 활성이 GnT-III 또는 -V에 비해 낮은 것부터, 상기 분석법 그대로서는 GnT-IV의 정제에는 맞지 않았다.

따라서, 발명자 등은 분석에 사용되는 수용체 피리딜아미노화 올리고당 양을 GnT-III, -V의 분석때의 1O배로 하여, GnT-IV를 정량적으로 양호한 감도로 측정하는 방법을 개발하였다[Tokugawa, K., Oguri, S. 및 Takeuchi, M. (1996) Glycoconjugate J., 13, 53-56]. 이와 같은 대량의 수용체 올리고당을 조제하는 것은 일반적으로 대단히 곤란하지만, 덕천 등의 방법[Tokugawa, K., Oguri, S. 및 Takeuchi, M. (1996) Glycoconjugate J., 13, 53-56]에 의해 용이하게 조제할 수 있다.

따라서, 본 발명의 실시예에 있어서는 아래와 같이 실시하여 GnT-IV를 분석하였다.

0.8mM의 피리딜아미노화 올리고당 기질(GnT-II 생성물형 올리고당 기질), 20mM UDP-GlcNAc, 7.5mM MnC1₂, 20OmM GlcNAc, 0.5%(w/v) Triton X-100, 10% 글리세롤, 1% BSA를 함유하는 125mM MOPS[3-(N-모르폴리노)프로판술폰산] 완충액, pH7.3, 37℃의 반응액 속에서 효소를 4시간 동안 반응시켜, 2분간 펄펄 끓여 반응을 중지시켰다. 0.45nm 구멍의 필터로 고형물을 제거한 후, 5㎕를 TSKODS-80TM 칼럼(4.6×150mm, TOSO)으로 분석하였다(도 5). 칼럼 조건은 유속 1.2㎖/min, 칼럼 온도 50℃로 하였다. 액상은 0.15%(w/v) n-부탄올을 함유하는 50mM 초산암모늄 완충액, pH4.0으로 하였다. 피리딜아미노기의 석영광은 여기(excitation) 320nm, 방출(emission) 400nm에서 측정하였다.

[실시예 1] 효소의 분리·정제

(1) 효소원의 스크리닝

상기 분석법을 사용하여 GnT-IV를 정제하기 위한 효소원을 찾았다. 표 1에 도시한 바와 같이 소 소장으로 GnT-IV의 상대 활성이 GnT-III, -V와 비교해서 높은 것을 알 수 있으며, 이것을 정제의 출발 재료에 선택하였다.

GnT-IV 효소원의 탐색

효소원비활성 (pmo1/h·mg-단백질)IV III V

배양세포 CHO 10.8 0 1097Bowes 12.0 341 150AH66¹⁾2.0 634 30고형 AH^l)27 116 80요시다 사르코마^l)1.3 70 109쥐장기¹⁾소장 17 280 68심장 9.4 11 10비장 20 100 21신장 1.9 1840 30뇌 3.7 660 38인간¹⁾간장 2.8 8.1 8.2소 장기 소장 25 174 41심장 N.D. N.D. N.D.비장 10.9 0.7 10.9초유 N.D. N.D. N.D.

N.D.; 검출 한계 이하

¹⁾; Nishikawa, A.일행, BBA l035, 313-318(1990)

(2) 정제

특별히 기재하지 않은 한 조작은 모두 4℃에서 실시하였다.

① 마이크로솜 분획의 조제

2Kg의 소 소장(축육가공업자로부터 입수)을 잘게 자르고, 4배 용량의 추출 완충액(O.25M 수크로오스, lmM 플루오르화 페닐메틸술포닐, lmM 벤자미딘 염산, lmM 디티오트레이톨, 10mg/㎖ 앤티페인(antipain)을 함유하는 1OmM Tris-HCl 완충액, pH7.4)을 가하여, 폴리트론(Kinematica, 스웨덴)으로 균질화하였다. 이것을 900×g에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 또한 105,000×g에서 60분간 원심분리하여 마이크로솜 분획을 침전시켜 얻었다(샘플 1).

② 가용화

샘플 1을 3배 용량의 상기 추출 완충액에 최종 농도 1%의 Triton-100를 가한 것(가용화 완충액으로 칭함)에 현탁하고, 같은 조작을 되풀이하여 상층액을 가용화 분획에 가한다(샘플 2).

③ Q-세파로오스 FF 크로마토그래피

미리, 조작 완충액 1(1mM 벤자미딘 염산, 0.1% Triton X-100, 20% 글리세롤을 함유하는 20mM Tris-H C1, pH7.4)로 평형화된 Q-세파로오스 FF 칼럼(5×30cm, 파마시아, 스웨덴)에 샘플 2을 가하고, 0∼0.5M의 KC1 그래디언트로 용출시켰다(도 6)(샘플 3).

④ 구리 킬레이트 세파로오스 FF 크로마토그래피

미리, 조작 완충액 2(조작 완충액 1에 최종 농도 O.15M의 KC1를 첨가하여 조성된 것)로 평형화된 구리 킬레이트 세파로오스 FF 칼럼(5×1Ocm, 파마시아, 스웨덴)에 샘플 3을 가하고, 5배 양의 조작 완충액 2로 비흡착 분획을 씻어 버린 후, 0.0lM 글리신의 그래디언트로 용출시켰다(도 7). 얻어진 GnT-IV 활성 분획을 모아서, YM30 한외 여과막(아미콘, 미국)으로 농축하였다(샘플 4).

⑤ UDP-헥사놀아민 아가로오스 친화도 크로마토그래피 I

미리, 조작 완충액 3(0.15M KC1, 10mM MnC1₂, 0.05% Triton X-100, 20% 글리세롤을 함유하는 20mM Tris-HC1, pH8.0)으로 평형화된 UDP-헥사놀아민 아가로오스 친화도 칼럼(1.2×4.5cm, 시그마, 미국)에 미리 1mM 벤자미딘 염산을 첨가한 조작 완충액 3에 대하여 투석한 샘플 4의 반량을 1회 분으로서 가하고, 조작 완충액 4(1OmMMnC1₂, 0.05% Triton X-100, 20% 글리세롤을 함유하는 20mM Tris-HC1, pH8.0)로 비흡착 분획을 씻어 버린 후, 최종 농도 1M의 KC1를 가한 조작 완충액 4로 용출시켰다(도 8). GnT-IV 활성 분획을 모아서 조작 완충액 5(조작 완충액 4와 같은 조성으로 pH가 7.4)에 대하여 투석하였다(샘플 5).

⑥ UDP-헥사놀아민 아가로오스 친화도 크로마토그래피 II

미리 조작 완충액 5로 평형화된 UDP-헥사놀아민 아가로오스 친화도 칼럼(1.0×6.5cm, 시그마, 미국)에 샘플 5를 가하여, 조작 완충액 5로 비흡착 분획을 씻어 버린 후, MnC1₂를 제거한 조작 완충액 5로 용출시켰다(도 9). 얻어진 GnT-IV 활성 분획을 모았다(샘플 6).

⑦ 수퍼덱스 200 겔 크로마토그래피

샘플을 작은 Q-세파로오스 FF 칼럼으로 농축하고, 미리 조작 완충액 6(조작 완충액 5에 최종 농도 0.15M KC1을 첨가하여 조성된 것)으로 평형화된 수퍼덱스 20OHR5/5(1×30cm, 파마시아, 스웨덴)에 가했다(도 10). 0.25㎖/min의 유속으로 조작 완충액 6를 계속 흘려, GnT-IV 활성 분획을 얻었다(샘플 7).

⑧ 각 정제단계에 있어서의 단백질량, 활성, 비활성의 변화를 표 2에 정리하였다. 최종 샘플은 소장 균질물중의 224,000배 순도까지 정제되었다.

GnT-IV 정제표

정제단계 단백질량 전체효소활성 비활성 수율 정제계수(mg) (nmo1/h) (nmol/h/mg) (%) (배)

소 소장 균질물 112,900 49,500 0.44 100 1가용화화분 24,100 14,500 0.60 29 1.4Q세파로오스 4,000 7,200 1.80 14 4.1Cu킬레이트세파로오스 450 3,670 8.10 7.4 18.4UDP-헥사노르아민 I 0.59 1,950 3,310 3.9 7,510UDP-헥사노르아민 II 0.035 1,420 40,600 2.9 92,200스파덱스200 0.008 790 98,800 1.6 224,000

소 소장 2kg에서 시작함.

(3) 효소 화학 및 단백질 화학적 성질

① 순도

샘플 7은 SDS-PAGE에서 분자량 60K의 위치에 단일 밴드를 부여한다(도 11). 샘플 7을 네이티브-PAGE에 걸어, 겔을 잘라내어 GnT-IV 활성을 측정한 바, 단백질의 밴드와 활성의 위치가 일치하였다(도 12). 또한, 샘플 7에는 GnT-I, II, III 및 V의 활성은 전혀 검출되지 않았다. 이상으로부터 샘플 7은 GnT-IV의 순품이다고 결론내렸다. 또, Triton X-1OO이 들어간 겔여과에서 얻어진 겉보기 분자량이 77K였다(도 10). 이상을 종합하면, GnT-IV는 서브유닛 구조를 가지지 않으며, 단일유닛으로 활성을 발현한다고 생각된다. 샘플 7을 펩티드 N-글리코오시다아제 F(뵈링거-만하임, 독일)로 처리하면, SDS-PAGE 상에서 역동도의 증대가 보였기 때문에 소 소장의 GnT-IV는 적어도 Asn 결합형 당쇄를 가진 당단백질이라고 생각된다.

② 반응 특이성

본 효소는 다음 식로 표시되는 GnT-I1 생성물형 올리고당을 기질로서 표준 분석 조건으로 반응시키면, HPLC에서 단일 생산물(피리딜아미노화 올리고당 1)을 제공하였다.

이것을 모아, (i) 스미스분해와 레이저 TOF-MS (레이저 이온화형 질량 분석계)의 조합, 및 (ii)^lH-NNR에서 구조를 결정하여 본 효소의 반응 특이성을 조사하였다. 피리딜아미노화 올리고당 1을 고바타, 다카사키 등의 방법[Kobata, A. 및 Takasaki, S. (1993) 글리코바이올로지 "A Practical Approach"(Fukuda, M. 및 Kobata, A., 편저) 165-185, IRL출판사, 옥스포드, 영국]에 따라 스미스분해하면, 제 1스미스분해에서 질량수는 1599.0에서 795.30까지 변하며, 제 2스미스분해에서 또한 634.68로 변하였다. 이것은 도 13과 같은 반응 경로와 일치하고 있으며, 본 효소의 반응 생산물이 이하의 구조인 것으로 결정되었다:

또한, 피리딜아미노화 올리고당 1을¹H-NMR에 건 바, 하기 식의 GlcNAc7의 아노머릭 프로톤에 해당하는 4.53ppm의 피이크가 검출되고, 또한 그 커플링 정수 Jl,2값이 7.9Hz이기 때문에(도 14), 하기 식과 같이 GlcNAc가 Man4의 4위치에 β-형으로 결합하고 있는 것이 표시되어 상기의 구조 결정을 완전히 지지하였다:

③ 적정 pH

본 효소의 적정 pH는 도 15에 도시한 바와 같이 7.5 부근이었다.

④ 2가 양이온 요구성

표 3에 나타낸 바와 같이, 본 효소는 EDTA(에틸렌 디아민 테트라-아세트산)의 첨가로 활성을 잃으며, 활성 발현에는 2가 양이온이 필수적이다. 이 효과는 Mn²⁺가 최대이며, Co²⁺, Mg²⁺가 그 다음이고, Ca²⁺, Fe²⁺에도 약한 효과가 확인되었다. Mn²⁺의 농도는 1OmM 부근이 적합하였다(도 16).

GnT-IV의 2가 양이온 요구성

첨가물 활성(%)

무첨가 5.6EDTA 0MnC1₂100CoC1₂74.8MgCl₂72.5CaC1₂7.2FeC1₂9.8CuC1₂0

금속 이온을 제거한 GnT-IV 샘플에 1OmM의 각종 금속 이온을 첨가하여 GnT-IV 활성을 측정하였다. 1OmM MnC1₂첨가시에 GnT-IV 활성을 1OO%로 하여 표시하였다.

⑤ 당 뉴클레오티드에 의한 저해

표 4에 도시한 바와 같이 UDP가 가장 강하게 본 효소의 활성을 저해하였다. UDP-글루코오스, UDP-GalNAc, 2'-데옥시-UDP, UDP-헥사놀아민(시그마, 미국)이 이 순서로 UDP에 저해 효과를 나타냈다. 유리딘, UMP, TDP, CDP에는 거의 저해 효과가 보이지 않았다.

뉴클레오티드에 의한 GnT-IV의 저해

첨가물 활성(%)

무첨가 10O유리딘 l15UMP 97.3UDP 27.3UTP 88.2TDP 11OCDP 1122'-데옥시-UDP 67.4UDP-헥사놀아민 73.6UDP-글루코오스 56.6UDP-갈락토오스 87.3UDP-글루쿠론산 92.3UDP-N-아세틸갈락토오사민 59.7

0.5mM UDP-GlcNAc의 존재하에서 2mM의 각종 뉴클레오티드를 첨가하였을 때의 GnT-IV 활성을 아무 것도 첨가하지 않을 때의 값을 100%으로 표시하였다.

⑥ 기질 특이성

표 5에 도시한 바와 같이, 본 효소는 수용체로서 GnT-V 생성물형(표 5, E)을 가장 좋아하고, 이어서 GnT-II 생성물형(표 5, D)을 좋아하였다.

또한, GnT-II 생성물형 올리고당을 수용체로 하였을 때를 1OO%로 하면, 코어형 올리고당(표 5, A), GnT-I 생성물형 올리고당(표 5, C)에 대하여, 각각 0%, 54%의 반응성을 나타낸다.

GnT-II 생성물형 올리고당의 환원 말단 GlcNAc에 푸코오스가 α1→6결합으로 결합된 구조(표 5, F)에는 46%의 반응성을 나타낸다.

GnT-II 생성물형의 만노오스 α1→3 분지측의 GlcNAc가 없는 구조(표 5, B)에는 0%의 반응성을 나타낸다.

GnT-II 생성물형 올리고당의 α1→6 분지측 GlcNAc에 갈락토오스가 β1→4 결합으로 결합된 구조(표 5, G)에는 16%의 반응성, α1→3 분지측 GlcNAc에 갈락토오스가 β1→4 결합으로 결합된 구조(표 5, H, I)에는 0%의 반응성을 나타낸다.

GnT-II 생성물형 올리고당의 만노오스 β1→4 잔기에 GlcNAc가 β1→4 결합으로 결합된 구조(표 5, J)에는 0%의 반응성을 나타낸다.

이상과 같은 본 효소의 기질 특이성은 Schachter 등[Glesson. P.A. 및 Schachter, H. (1983) J.Bio1.Chem., 258, 6162-6173]에 의해 예언된 GnT-IV의 기질 특이성과 거의 일치하며, 본 효소가 복합형 당쇄 생합성상 오랫동안 미싱 링크로 되어있는 GnT-IV인 것이 분명해졌다.

⑦ 속도 정수

참고예 2의 분석 조건에 있어서, 본 효소의 Km, Vmax값은 GnT-lI 생성물형 올리고당에 대하여 각각 0.73mM, 3.23μM/min; GnT-V 생성물형에 대하여 각각 0.13mM, 1.75μM/min이었다. UDP-GlcNAc에 대한 Km값은 0.22mM이었다.

얻어진 피리딜아미노화 올리고당중 하기 식의 것은 신규 올리고당이었다:

및

⑧ 당단백질에 대한 작용

GnT-IV가 올리고당 기질뿐만아니라, 당단백질상의 올리고당쇄에도 작용할 수 있는 것을 나타내기 위하여, UDP-[¹⁴C] GlcNAc를 당공급체로서 아시알로·아가락토화된 각 당단백질에 GnT-IV를 작용시키고, 반응 산물을 SDS-PAGE 및 플루오로그래피로 해석하였다(도 17, A, B). 도 17, B의 레인 2와 5에 도시한 바와 같이, 아시알로·아가락토·인간·트랜스페린 및 아시알로·아가락토·CHO 세포유래 재조합·인간·에리트로포이에틴에 대하여 [¹⁴C]-GlcNAc의 전이가 확인되었다. 이와대조적으로, 바이-안테나형 당쇄를 갖지 않는 아시알로아가락토 페투인에서는¹⁴[C]GlcNAc의 전이가 발견되지 않았다(도17, 패널 B)

또, 이 GnT-IV 반응으로 얻어진 GnT-IV 생성물형 당쇄를 갖는 인간·트랜스페린은 천연적으로는 존재하지 않는 신규 물질이다.

[실시예 2] 펩티드 맵핑 분석

최종 정제된 본 효소 약 1mg을 라엠리 방법[Laemmli, 영국, Nature (1970) 313, 756-762]에 의해 0.1% SDS, 10% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동하였다. 분리된 단백질을 PVDF막(ABI사, 미국)에서 일렉트로블롯하고, PVDF 막상에 고정된 단백질을 S-카르복시메틸화 시킨 후, 최초로 리실엔도펩티다아제(화광순약) 아크로모박터 프로테아제 I(Achromobacter protease I, AP-I)로 절단하여 AP-I 절단 단편 혼합액을 AP-I 절단 후의 PVDF 막을 또한 Asp-N(보주조)로 절단하여, Asp-N 절단 단편 혼합액을 얻었다. 각 펩티드 단편을 고속 액체 크로마토그래피로 분리하고, 그 아미노산 서열을 결정한 바, 서열 1∼14에 기재된 서열을 얻었다.

[실시예 3] 소 GnT-IVa cDNA의 분리 및 확인

(1) RT-PCR

실시예 2에서 얻어진 서열 7로 나타낸 아미노산 서열을 바탕으로 서열 15로 나타낸 올리고머 AP-5F를, 또한 서열 11에 나타낸 아미노산 서열을 바탕으로는 서열 16에 나타낸 올리고머 DN-9R을 합성하였다. 구아니듐 이소티오시아네이트법에 의해 소 소장 조직으로부터 추출한 총 RNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 RT-PCR를 한 바, 특이적으로 생각되는 약 170bp의 증폭 단편이 수득하였으며,이것을 서브클론하였다.

(2) 라이브러리의 스크리닝

상술한 RT-PCR 산물을 사용하여 소 소장 cDNA 라이브러리(C1ontech, 미국)를 스크리닝한 바, 4개의 양성 플라크를 얻을 수 있었다. 이들의 염기 서열을 결정한 바, 이중에는 실시예 2에 나타낸 부분 아미노산 서열(서열 1∼14)을 코딩하는 염기 서열이 다수 출현하여, 종료와 시작 코돈이라고 생각되는 서열이 포함되어 있었다. 얻어진 염기 서열의 최상위 영역에 해당하는 부분 150bp을 사용하고, 또한 동 라이브러리를 스크리닝하여 2개의 양성 플라크를 얻었다. 이들의 염기 서열을 결정하고, 여기서 최상위 영역 150bp을 프로브로 하여 상기 라이브러리를 스크리닝하였지만, 새로운 클론은 얻어지지 않았다.

(3) 5'RACE(Rapid amplification of cDNA ends)

전체 cDNA를 얻기위하여 다음으로 5'RACE를 실시하였다. 파아지 스크리닝으로 얻어진 최상위 영역의 서열을 사용하고, 제 1회 5'RACE를 실시하였지만, 아직 개시 코돈이 찾아지지 않았기 때문에, 제 1회 5'RACE에서 얻어진 서열을 바탕으로 제 2회 5'RACE를 실시하여, 개시 코돈을 포함하는 서열을 얻었다. 먼저 얻어진 파아지 클론의 부분 유전자 서열과 연결하여 완전한 오픈 리딩프레임(유전자 1)을 포함하는 유전자 단편을 얻었다. 이상에서 얻어진 DNA 단편의 염기 서열을 서열 17에, 추정되는 아미노산 서열을 서열 18에 나타낸다. 이 DNA 단편은 실시예 2에서 얻어진 14의 아미노산 서열(서열 1∼14)을 코딩하는 염기 서열을 모두 포함하는 것으로 확인되었다.

[실시예 4] 클로닝한 소 GnT-IVa 유전자를 사용한 발현벡터의 제작과 GnT-IVa 효소의 제조법

(1) 벡터의 구축

유전자 1의 개시 코돈의 상부에 XhoI 부위를 도입하는 프라이머(서열 19)로, 종료와 개시 코돈의 하부에 XbaI 부위를 도입하는 프라이머(서열 20)를 합성하여, GnT-IV 효소를 코딩하는 유전자 전체를 PCR법에 의해 증폭하였다. 이 증폭 단편을 XhoI 및 XbaI로 절단하고, pSVL 벡터(파마시아, 스웨덴)의 XhoI-XbaI 사이에 삽입하여 플라스미드 pBGT4를 제조하였다.

(2) C0S7 세포에의 도입

플라스미드 pBGT4를 일렉트로포레이션법으로 COS7세포(이연세포은행)에 도입하였다. 즉, O.8㎖의 PBS(-)(일수제약)중의 약 5×1O⁶개의 세포에 1O㎍의 플라스미드를 가하고, 진펄사(BioRad, 미국)를 사용하여 실온에 있어서 160OV, 25μF의 조건으로 유전자를 도입하였다. 세포는 90mm의 페트리 접시에 옮기고, 1O㎖의 1O%의 소 태아 혈청을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's 배지(Base Catalogue No. 12430, Life Techno1ogies, Inc., 미국)에서, 5% CO_2,37℃에서 72시간 배양하고, 세포를 회수하여 100㎕의 완충액(5mM Tris-HC1 pH7.5, 2mM MgC1₂, lmM 플루오르화 페닐메틸술포닐)에 현탁하고, 초음파로 파쇄한 후, 2000×g에서 5분간 원심 분리하여 세포 추출액을 얻었다.

(3) GnT-IV 활성의 분석

참고예 2에 상술한 방법에 의해, 세포 추출액중의 GnT-IV 활성을 측정하였다. 측정 결과를 표 6에 나타냈다. 대조군으로서, pSVL 벡터를 도입한 세포의 추출액과 비교하였으며, 플라스미드 pBGT4를 도입한 세포의 추출액은 세포당 44∼78배 이상의 GnT-IV 활성을 가지고 있었다. 이상의 결과에서 유전자 1이 GnT-IV 효소를 코딩하고 있는 것으로 확인되었으며, 이 방법에 의해 배양세포로 GnT-IV 효소를 제조할 수 있었다.

플라스미드 비활성 활성의 비율(pmol/hr/mg단백질)

pSVL 409 1pBGT4(#1) 29623 72pBGT4(#2) 31773 78pBGT4(#3) 20182 44

반응 시간: 4시간

활성의 비율은 전부 pSVL의 총 활성을 1로 하여 나타냈다.

[실시예 5] 인간 GnT-IVa cDNA의 분리 및 확인

(1) RT-PCR

실시예 3에서 얻어진 소 GnT-IVa의 염기 서열을 참고하여 서열 21로 나타낸 프라이머 hl-2F를, 서열 22에 나타낸 프라이머 hl-lR를 합성하였다. 인간 간 유래 총 RNA(C1ontech, 미국)를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 RT-PCR를 실시한 바, 특이적으로 생각되는 약 650bp의 증폭 단편를 얻을 수 있었기 때문에, 이것을 서브클로닝하여 염기 서열을 해석하였다.

(2) 라이브러리의 스크리닝

상술한 RT-PCR에 의해 얻어진 685bp의 DNA 단편을 프로브로 하여, 인간 간 유래 cDNA 라이브러리(C1ontech, 미국)를 스크리닝한 바, 2개의 양성 플라크 hGT4/λgtl0-1 및 hGT4/λgtl0-2를 얻을 수 있었다. 이들 파아지 클론의 삽입 단편의 염기 서열을 해석한 바, hGT4/λgtl0-1에는 804bp, hGT4/λgtl0-2에는 2115bp의 DNA 영역이 포함되어 있고, 전자의 영역은 모두 후자에 포함되어 있었다. 서열 23에 도시한 바와 같이, hGT4/λgtl0-2에 포함된 DNA 단편에는 소 GnT-IVa의 아미노산 서열과 96% 일치하는 높은 상동성의 오픈 리딩프레임(ORF)이 확인되었다. 이 ORF는 다음 실시예 6에 기재된 결과로부터 인간 GnT-IVa 유전자인 것이 확인되었으며, 이 아미노산 서열을 서열 24에 나타냈다.

[실시예 6] 인간 GnT-IVa 유전자의 발현 플라스미드의 제작과 인간 GnT-IVa 효소의 제조법

(1) 인간 GnT-IVa 유전자의 발현 플라스미드 pHGT4-1의 제조

인간 GnT-IVa 유전자의 개시코돈의 상부에 XhoI 부위를 도입하는 프라이머(hl-7F, 서열 25)와, 개시 종료 코돈의 하부의 프라이머(hl-7R, 서열 26)를 합성하고, 인간 간 유래 RNA(C1ontech, 미국)를 주형으로 인간 GnT-IVa 효소를 코딩하는 유전자 전부를 RT-PCR법에 의해 증폭하였다. 이 증폭 단편은 플라스미드 pCRScript Amp SK(+)(스트라타젠, 미국)의 SrfI 부위에 1acZ 유전자의 전사 방향과 역방향으로 삽입하고, 얻어진 플라스미드를 사용하여 증폭된 단편이 서열 24의 아미노산 서열을 코딩하고 있는 것을 염기 서열 해석에 의해 확인하였다. 또한, 이 플라스미드를 XhoI 및 SacI에서 절단하여 얻어진 XhoI-SacI 1.7kb 단편을 pSVL 벡터(파마시아, 스웨덴)의 XhoI-SacI 사이에 삽입하여 인간 GnT-IVa 유전자의 발현 플라스미드 pHGT4-1를 제조하였다.

(2) 인간 GnT-IVa 유전자의 COS7 세포에의 도입

플라스미드 pHGT4-1를 일렉트로포레이션법에 의해 COS7 세포에 도입하고, 10% C0₂, 37℃에서 72시간 배양하여, 세포를 회수하고, 100㎕의 완충액(5mM Tris-HC1 pH7.5, 2mM 염화마그네슘, lmM 플루오르화 페닐메틸술포닐)에 현탁하고, 초음파 파쇄기로 파쇄한 후, 2000×g에서 5분간 원심 분리하여 세포 추출액을 얻었다.

(3) 인간 GnT-IVa 유전자의 COS7 세포에서의 발현

참고예 2에 상술한 방법에 의해, 세포 추출액중의 GnT-IV 활성을 측정하였다. 측정 결과를 표 7에 나타냈다. 대조군으로서 pSVL 벡터를 도입한 세포 집단의 추출액과 비교하여, pHGT4-1이 삽입된 세포 집단의 추출액은 세포당 21∼28배 이상의 GnT-IV 활성을 가졌다. 이 결과로부터, 서열 23에 나타낸 GnT-IVa 유전자는 당전이효소 GnT-IV를 코딩하고 있는 것으로 확인되었으며, 이 방법에 의해 배양 세포에서 인간 GnT-IVa를 제조하는 것이 가능한 것도 확인되었다.

플라스미드 비활성 활성의 비율(pmol/hr/mg단백질)

pSVL 1037 1pHGT4-1(#1) 28951 28pHGT4-1(#2) 21788 21pHGT4-2(#1) 11024 11pHGT4-2(#2) 8029 8

반응시간: 1.3시간

활성의 비율은 전부 pSVL의 총 활성을 1로 하여 나타냈다.

[실시예 7] 인간 GnT-IVb cDNA의 분리 및 확인

(1) PCR, RT-PCR, 5'-RACE(Rapid amplification of cDNA ends)에 의한 인간 GnT-IVa 유전자와 유사한 유전자의 취득:

실시예 3에서 얻어진 인간 GnT-IVa의 염기 서열과 유사성이 있는 염기 서열을 BLASTN에 의해 DNA 데이타베이스 GenBank에서 검색한 결과, 수탁번호 R12057, Hl0557, W16571가 발견되었다. 따라서, 서열 27에 나타낸 프라이머 h2-45F와 서열 28에 나타낸 프라이머 h2-43R를 합성하고, 퀵 스크린 인간 cDNA 라이브러리 패널(C1ontech, 미국)의 인간 뇌 유래 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR법에 의해 증폭하고, 이것을 pCRScript Amp SK(+)(스트라타젠, 미국)의 SrfI 부위에 서브클로닝하여 염기 서열을 해석하였다. 또한, 서열 29에 나타낸 프라이머 h2-2F와 서열 30에 나타낸 프라이머 h2-lR를 합성하고, 인간 폐 유래 총 RNA(C1ontech, 미국)를 주형으로 하여 RT-PCR를 실시하였다. 그 결과, 예상과 일치하는 약 50Obp의 증폭 단편를 얻을 수 있었기 때문에, 이것을 pCRScript Amp SK(+)(스트라타젠, 미국)의 SrfI 부위에 서브클로닝하여 염기 서열을 해석하였다.

얻어진 2개의 DNA 단편의 염기 서열로부터, 양자는 중첩되어 있으며, 이 1006bp의 영역에는 소 및 인간의 GnT-IVa의 아미노산 서열과 높은 유사성을 갖는 1개의 오픈 리딩프레임(ORF)이 확인되었으며, GnT-IVa에 관련된 단백질의 존재를 시사하였다.

따라서, 수탁번호 R12057의 상부와 W16571의 하부의 가능성이 있는 염기 서열을 BLASTN에 의해 DNA 데이타베이스 GenBank에서 두 번째 검색한 결과, R12057의상부로서 R15554, W16571의 하부로서 W16466가 발견되었다. 그러나, 이들의 염기 서열로부터 추정되는 ORF에는 부적합하다고 생각되는 개시종료 코돈이 포함되기 때문에, 염기 서열을 확인하기 위하여 RT-PCR에 의해 DNA 단편을 취득하였다. 프라이머로서는, 서열 31에 나타낸 h2-lF, 서열 32에 나타낸 h2-3F, 서열 33에 나타낸 h2-8R를 합성하였다. h2-lF와 실시예 5에 기재된 hl-lR을 조합하거나 또는 h2-3F와 h2-8R을 조합하고, 인간 간 유래 총 RNA(C1ontech, 미국)를 주형으로 하여 RT-PCR를 실시한 바, 각각 예상과 일치하는 약 550bp의 증폭 단편, 약 30Obp의 증폭 단편이 검출되었다. 이들을 각각 pCRScript AmpSK(+)(스트라타젠, 미국)의 SrfI 부위에 서브클로닝하여 염기 서열을 해석한 결과, 상기의 h2-45F와 h2-lR 사이의 1006bp의 상부와 하부에 중첩하는 DNA 단편인 것으로 확인되었다. 그리고, 연결된 1361bp의 영역에는 소 및 인간의 GnT-IVa의 아미노산 서열과 높은 유사성을 갖는 433개의 아미노산으로 이루어진 1개의 ORF가 확인되었다.

그러나, GnT-IVa 아미노산 서열과 비교하면, 개시 메티오닌은 최상부에 존재하는 것으로 추정되었기 때문에, 5'-RACE에 의해 상부 영역을 취득하였다. 5'-RACE는 인간 폐 5'-RACE-Ready cDNA(C1ontech, 미국)를 사용하고, 제 1회 PCR에는 프라이머로서 앤코(Ancor) 프라이머와 서열 34에 나타낸 h2-5R, 제 2회 PCR에는 프라이머로서 앤코 프라이머와 서열 35에 나타낸 h2-3R를 사용하였다. 5'-RACE에서 얻어진 DNA 단편은 정제하여 EcoRI 및 PstI로 절단한 후, 아가로오스겔 전기영동을 사용하여 분리하고, 약 450bp 부근의 단편을 회수하였다. 이 DNA 단편을 pUC18벡터(파마시아, 스웨덴)의 EcoRI-PstI 사이에 삽입하여 염기 서열을 해석한 결과, 상기 h2-lF에서 h2-8R의 영역의 상부에 중첩하는 DNA 단편인 것으로 확인되었다. 그리고, 연결된 1758bp의 영역에는 소 및 인간의 GnT-IVa의 아미노산 서열과 높은 유사성을 갖는 548개의 아미노산으로 이루어진 1개의 ORF가 확인되었다. 이 0RF 영역의 염기 서열을 서열 36에, 이 아미노산 서열을 서열 37에 나타냈다. 이 유전자는 다음 실시예 8에 기재된 결과로부터 인간 GnT-IVb 유전자인 것으로 확인되었다.

[실시예 8] 인간 GnT-IVb 유전자의 발현 플라스미드의 제작과 인간 GnT-IVb 효소의 제조법

(1) 인간 GnT-IVb 유전자의 발현 플라스미드 pHGT4-2의 제조

인간 GnT-IVb 유전자의 개시코돈의 상부에 XhoI 부위를 도입하는 프라이머(h2-4: 서열 38)와 개시종료 코돈의 하부에 XbaI 부위를 도입하는 프라이머(h2-10R:서열 39)를 합성하고, 인간 폐 유래 RNA(C1ontech, 미국)를 주형으로 인간 GnT-IV 효소를 코딩하는 유전자 전부를 RT-PCR법에 의해 증폭하였다. 이 증폭 단편을 플라스미드 pCRScript Amp SK(+)(스트라타젠, 미국)의 SrfI 부위에 삽입하고, 얻어진 플라스미드를 사용하여 증폭된 단편이 서열 37의 아미노산 서열을 코딩하는 것을 염기 서열 해석에 의해 확인하였다. 또한, 이 플라스미드를 XhoI 및 XbaI로 절단하여 얻어진 XhoI-XbaI 1.7kb단편을 pSVL 벡터(파마시아, 스웨덴)의 XhoI-XbaI 사이에 삽입하여 인간 GnT-IVb 유전자의 발현 플라스미드 pHGT4-2를 제조하였다.

(2) 인간 GnT-IVb 유전자의 COS7 세포로의 도입

플라스미드 pHGT4-2를 일렉트로포레이션법에 의해 COS7 세포에 도입하고,10% C0₂,37℃에서 72시간 배양하고, 세포를 회수하여 100㎕의 완충액(5mM Tris-HC1 pH7.5, 2mM 염화마그네슘, 1mM 플루오르화 페닐메틸술포닐)에 현탁하여, 초음파 파쇄기로 파쇄한 후, 2000×g로 5분간 원심 분리하여 세포 추출액을 얻었다.

(3) 인간 GnT-IVb 유전자의 COS7 세포에서의 발현

참고예 2에 상술한 방법에 의해, 세포 추출액중의 GnT-IV 활성을 측정하였다. 측정 결과를 표 7에 나타냈다. 대조군으로서 pSVL 벡터를 도입한 세포 집단의 추출액에 비하여, pHGT4-2가 삽입된 pSVL 벡터를 도입한 세포 집단의 추출액은 세포당 8∼11배 이상의 GnT-IV 활성을 가졌다. 이 결과로부터, 서열 36에 나타낸 GnT-IVb 유전자는 당전이효소 GnT-IV를 코딩하는 것으로 확인되었으며, 이 방법에 의해 배양 세포에서 인간 GnT-IVb를 제조할 수 있음이 확인되었다.

[실시예 9] 소 GnT-IVa 유전자의 N말단결실 변이체 발현 플라스미드의 제작과 그 발현

(1) 소 GnT-lVa 유전자의 발현 플라스미드 pSigIle93, pSigProl13 및 pSigPro142의 제조

인간 에리트로포이에틴(GenBank 수탁번호 X02157)의 시그널 서열의 상부에 XhoI 부위를 도입하는 프라이머(XhoEsig: 서열 40)와 시그널 서열의 C말단과 소 GnT-IVa 아미노산 서열중의 93번째의 Ile 이후를 연결하는 안티센스 프라이머(E4-lR: 서열 41)를 합성하고, 인간 에리트로포이에틴의 시그널 서열을 PCR법에 의해 증폭하였다. 또한, 상기 안티센스 프라이머에 해당하는 센스프라이머(E4-lF: 서열42)와 개시종료 코돈의 하부에 XbaI 부위를 도입하는 프라이머(4EXPR: 서열 20)를 합성하고, 소 GnT-IVa 유전자를 주형으로 하여 부분 서열을 PCR법에 의해 증폭하였다. 얻어진 두 가지의 PCR 산물의 일부를 주형으로 하여, XhoEsig, 4EXPR 양 프라이머를 사용하여 PCR를 실시하고, 증폭 단편을 XhoI과 XbaI로 절단하고, pSVL 벡터(파마시아, 스웨덴)의 XhoI-XbaI 사이에 삽입하여 인간 에리트로포이에틴 시그널과 소 GnT-IVa 아미노산 서열중의 93번째의 Ile 이후가 연결된 아미노산 서열을 발현하는 플라스미드 pSigIle93를 제조하였다.

E4-lR 프라이머 대신 E4-2R 프라이머(서열 43) 또는 E4-3R 프라이머(서열 44), E4-lF 프라이머 대신 E4-2F 프라이머(서열 45) 또는 E4-3F 프라이머(서열 46)를 사용하여, 상기와 같은 조작을 되풀이하여, 인간 에리트로포이에틴 시그널과 소 GnT-IVa 아미노산 서열중의 l13번째 Pro 이후가 연결된 아미노산 서열을 발현하는 플라스미드 pSigPro113, 또는 인간 에리트로포이에틴 시그널과 소 GnT-IVa 아미노산 서열중의 142번째 Pro 이후가 연결된 아미노산 서열을 발현하는 플라스미드 pSigPro142를 각각 제조하였다.

(2) 소 GnT-IVa 유전자의 N말단결실 변이체 유전자의 C0S7 세포에의 도입

플라스미드 pSigIle93, pSigPro113 또는 pSigPro142를 일렉트로포레이션법에 의해 COS7 세포에 도입하고, 10% CO₂, 37℃에서 72시간 배양한 후, 세포와 배양 상층액을 따로 회수하였다. 세포는 100㎕의 완충액(5mM Tris-HC1 pH7.5, 2mM 염화마그네슘, lmM 플루오르화 페닐메틸술포닐)에 현탁하고, 초음파 파쇄기로 파쇄한 후, 2000×g에서 5분간 원심분리하여 세포 추출액을 얻었다. 배양 상층액은 센트리플러스30(아미콘)으로 약 100㎕로 될 때까지 농축하였다.

(3) 소 GnT-IVa 유전자의 N말단결실 변이체 유전자의 C0S7세포에서의 발현

참고예 2에서 상술한 방법에 의해, 세포 배양상층액 및 세포 추출액중의 GnT-IV 활성을 측정하였다. 측정 결과를 표 8에 나타냈다. 양성 대조군으로서 pBGT4 벡터를 도입한 세포의 총 활성(세포중 + 세포 배양상층액중)에 비하여, pSigIle93 플라스미드를 도입한 세포는 30% 이상의 GnT-IV 활성을 가졌다. 또한, 이중 1/3 이상의 활성은 세포 배양상층액중에 분비되어 있었다. 이 결과로부터, 소 GnT-IVa 아미노산 서열중의 N말단에서 92번째 아미노산까지는 활성을 유지하므로 결실시킬 수 있었다. 또한, 적당한 분비 시그널을 사용하면, GnT-IVa 효소를 분비 발현시키는 것도 가능한 것으로 나타났다.

플라스미드 화분 활성 각 화분중의 총활성의 비율(pmol/hr) 활성의 비율(%) (%)

pSVL 상층액 136 0.5 1.9pSVL 세포 384 1.4pBGT4 상층액 722 2.7 100.0pBGT4 세포 26152 97.3pSigIle93 상층액 3106 11.6 31.9pSigIle93 세포 5471 20.4pSigPro113 상층액 312 1.2 3.4pSigProl13 세포 606 2.3pSigPro142 상층액 219 0.8 2.2pSigPro142 세포 381 1.4

반응시간: 2.5시간

활성의 비율은 전부 pBGT4의 총 활성을 100%로 하여 나타냈다.

[실시예 1O] 소 GnT-IVa 유전자의 C말단결실 변이체 발현 플라스미드의 제작과 그발현

(1) 소 GnT-IVa 유전자의 발현 플라스미드 pCGly499, pCPro465, pCLys432 및 pCPro383의 제조

소 GnT-IVa 유전자의 개시코돈의 상부에 XhoI 부위를 도입하는 프라이머(서열 19)와, 499번째의 Gly 코돈의 다음에 개시종료 코돈을 연결시키고, 그 하부에 XbaI 부위를 도입하는 프라이머(CGly499: 서열 47)를 합성하여, 소 GnT-IVa 유전자의 부분 서열을 PCR법에 의해 증폭하였다. 이 증폭 단편을 XhoI 및 XbaI로 절단하고, pSVL 벡터(파마시아, 스웨덴)의 XhoI-XbaI 사이에 삽입하여 소 GnT-IVa 아미노산 서열을 499번의 글리신까지 발현하는 플라스미드 pCGly499를 제조하였다. CGly499 프라이머 대신 CPro465 프라이머(서열 48), CLys432 프라이머(서열 49) 또는 CPro383 프라이머(서열 50)를 사용하여 같은 방법으로 플라스미드를 제조하여, pCPro465(소 GnT-IVa 아미노산 서열을 465번 프롤린까지 발현하는 플라스미드), pCLys432(소 GnT-IVa 아미노산 서열을 432번 리신까지 발현하는 플라스미드) 또는 pCPro383(소 GnT-IVa 아미노산 서열을 383번 프롤린까지 발현하는 플라스미드)으로 각각 명명하였다.

(2) 소 GnT-IVa 유전자의 C말단결실 변이체 유전자의 COS7 세포에의 도입

플라스미드 pCGly499, pCPro465, pCLys432 또는 pCPro383을 일렉트로포레이션법에 의해 C0S7 세포에 도입하고, 10% C0₂, 37℃에서 72시간 배양하여 세포를 회수하고, 100㎕의 완충액(5mM Tris-HC1 pH7.5, 2mM 염화마그네슘, lmM 플루오르화페닐메틸술포닐)에 현탁하고, 초음파 파쇄기로 파쇄한 후, 2000×g에서 5분간 원심 분리하여, 세포 추출액을 얻었다.

(3) 소 GnT-IVa 유전자의 C말단결실 변이체 유전자의 COS7 세포에서의 발현

참고예 2에 상술한 방법에 의해, 세포 추출액중의 GnT-IV 활성을 측정하였다. 측정 결과를 표 9에 나타냈다. 양성 대조군으로서 pBGT4벡터를 도입한 세포 집단의 추출액에 비하여, pCGly499, pCPro465, pCLys432 또는 pCPro383을 도입한 세포 집단의 추출액은 세포당 15.2%, 12.1%, 2.8% 또는 104.2%의 GnT-lV 활성을 각각 가졌다. 이 결과로부터, 소 GnT-IVa 아미노산 서열의 N말단보다 384 아미노산이후의 아미노산 서열을 결실시켜도 GnT-IV 활성을 유지할 수 있음을 알 수 있다.

플라스미드 비활성 활성의 비율(pmol/hr/mg단백질) (%)

pSVL 77 1pBGT4 14917 100pCGly499 2263 15pCPro465 1798 12pCLys432 410 3pCPro383 15551 104

반응시간: 2시간

활성의 비율은 전부 pBGT4의 총 활성을 100%으로 하여 나타냈다.

[실시예 11] 각 GnT-IV 유전자의 대장균용 발현 플라스미드의 제작과 그 발현

(1) 소 GnT-IVa 유전자의 대장균용 발현 플라스미드의 제작

소 GnT-IVa 유전자의 개시코돈의 상부에 BspHI 부위를 도입하는 프라이머(BSP-N: 서열 51)와, 개시종료 코돈의 하부에 HindIII 부위를 도입하는 프라이머 (C-Hd: 서열 52)를 합성하여 소 GnT-IVa 유전자의 오픈 리딩프레임을 PCR법에 의해 증폭하였다. 이 증폭 단편을 BspHI 및 HindIII로 절단하고, pTrc99A 벡터(파마시아, 스웨덴)의 NcoI-HindIII 사이에 삽입하여 플라스미드 pEBGT4를 제조하였다. BSP-N 프라이머 대신에 BSP-sN 프라이머(서열 53)를 C-Hd 프라이머와 함께 PCR에 사용하여, 동일한 방법으로 플라스미드 pEIle93을 제조하였다. 또한, BSP-N 프라이머와 소 GnT-IVa 유전자의 C말단 아미노산의 하부에 His-Tag, 개시종료 코돈 및 HindIII 부위를 도입하는 프라이머(CH-Hd: 서열 54)로 His-Tag, 개시종료 코돈 및 HindIII 부위를 갖는 프라이머(H-Hd: 서열 55)를 사용하여, C말단에 His-Tag가 부가된 오픈 리딩프레임을 코딩하는 유전자를 증폭하여, 같은 방법으로 pEBGT4+His를 제조하였다.

(2) 인간 GnT-IVa 및 GnT-IVb 유전자의 대장균용 발현 플라스미드의 제작

인간 GnT-IVa 아미노산 서열 94번째 Leu의 상부에 개시코돈과 Ile코돈을 최상부에는 BspHI 부위를 도입하는 프라이머(4aBSPIL94 : 서열 56)로 C말단 아미노산의 하부에 His-Tag, 개시종료 코돈 및 HindIII 부위를 도입하는 프라이머(4aCH-Hd: 서열 57)로 H-Hd 프라이머를 합성하고, 인간 GnT-IVa 유전자의 부분 서열에 His-Tag를 코딩하는 서열을 부가한 유전자 단편을 증폭시켰다. 이 증폭 단편을 BspHI와 HindIII로 절단하고, pTrc99A 벡터(파마시아, 스웨덴)의 NcoI-HindIII 사이에 삽입하여 플라스미드 pMA4a+His를 제조하였다. 또한, 4aCH-Hd 프라이머 대신 CP383H-Hd 프라이머(서열 58)를 사용하여 함께 플라스미드 pCore+His를 제조하였다(도 18). 인간 GnT-IVb 유전자의 개시코돈의 상부에 BspHI 부위를 도입하는 프라이머(4bBSP-N: 서열 59)로 4bSACR 프라이머(서열 60)로 증폭한 인간 GnT-IVb 유전자 단편을 BspHI와 SacI로 절단하여 pTrc99A 벡터(파마시아, 스웨덴)의 NcoI-SacI 사이에 삽입하였다. 이 플라스미드의 SacI-HindIII 사이에 4bSACF 프라이머(서열 61)로 인간 GnT-IVb 아미노산 서열의 C말단에 His-Tag를 도입하는 프라이머(4 bCH-Hd :서열 62) 및 H-Hd 프라이머를 사용하여 증폭시켜 SacI과 HindIII로 절단한 인간 GnT-IVb 유전자의 일부를 삽입하여 플라스미드 pEHGT4-2+His를 완성하였다. 또한, 인간 GnT-IVb 아미노산 서열 91번째 Gly의 상부에 NcoI 부위와 개시코돈을 도입하는 프라이머(4bNCOG91: 서열 63)와 4bCH-Hd 프라이머, H-Hd 프라이머를 사용하여 인간 GnT-IVb 유전자의 부분 서열을 증폭시키고, NcoI와 HindIII로 절단하고 pTrc99A 벡터(파마시아, 스웨덴)의 NcoI-HindIII 사이에 삽입하여 플라스미드 pMA4b+His를 제조하였다.

(3) 각 발현 플라스미드의 대장균 BL21주로의 도입

각 플라스미드를 칼슘법에 의해 조제한 대장균 BL21주의 콤피턴트 세포에 도입하여, 암피실린 1OO㎍/㎖를 함유하는 LB 한천배지상에서 증식시켰다. 각 플라스미드가 도입된 대장균의 콜로니를 액체배지에 옮기고, 37℃에서 하룻밤 동안 침투 배양한 후, 2% 농도가 되도록 신선한 LB 액체배지로 옮겼다. 배양액의 탁도(OD 595nm)가 약 0.1 내지 0.2의 사이에서 IPTG(Isopropyl b-D-Thiogalactopyranoside)를 최종 농도 1mM로 되도록 첨가하여, 37℃에서 2시간 또는 25℃에서 4시간 배양하여, 500㎕분의 균체를 회수하였다. 균체 펠릿을 50㎕의 완충액(5mM Tris-HC1 pH7.5, 2mM 염화마그네슘, lmM 플로오르화 페닐메틸술포닐)에 현탁하여, 초음파 파쇄기로 파쇄한 후, 2000×g에서 5분간 원심분리하여 세포 추출액을 얻었다.

(4) 각 발현 플라스미드의 대장균 BL21주에서의 발현

참고예 2에 상술한 방법에 의해, 세포 추출액중의 GnT-IV 활성을 측정하였다. 소 유전자 발현의 측정 결과를 표 10에 나타냈다. 대조군으로서 pTrc99A 벡터를 도입한 대장균 균체의 추출액은 거의 GnT-IV 활성을 가지지 않았지만, pEBGT4를 도입한 대장균의 추출액은 분명한 GnT-IV 활성을 가졌다. 이로부터, GnT-IV 효소는 대장균에서도 생산 가능한 것으로 밝혀졌다. 소 GnT-IVa의 C말단에 부가한 히스티딘의 Tag 서열은 GnT-IV 활성에는 크게 영향을 주지 않고, GnT-IV 효소에는 적당한 Tag 서열을 부가할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, N말단의 92아미노산을 결실시킨 변이체(pEIle93)에서는 더욱 강한 GnT-lV 활성을 나타내며, 동물세포에서 확인된 GnT-IV 효소의 변이체의 발현이 대장균에 있어서도 가능한 것으로 나타났다.

플라스미드 비활성 활성의 비율(pmol/hr/mg단백질) (%)

pTrc99A 0 0pEBGT4 4611 100pEBGT4+His 3090 67pEIle93 5841 127

반응시간: 3.0시간

IPTG 첨가후 37℃에서 2시간 배양

활성의 비율은 전부 pEBGT4의 총활성을 100%로 하여 나타냈다.

또한, 인간 유전자 발현의 측정 결과를 표 11에 나타냈다. 대조군으로서 pTrc99A 벡터를 도입한 대장균 균체의 추출액에 비하여, 어느 플라스미드도 유의적으로 GnT-IV 활성을 가지고 있었다. 인간 GnT-IVa효소, 인간 GnT-IVb 효소에 있어서도 소 GnT-IVa 효소로 표시된 N말단의 결실과 같이 활성을 유지한 채로 N말단을 결실시키는 것이 가능하였다. 또한, 인간 GnT-IVa 효소에 있어서는 N말단의 결실과 동시에 C말단의 결실이 생기더라도 높은 GnT-IV 활성을 가졌다(pCore+His). 이로써, 이 결실변이로 제외된 부분은 GnT-IV 활성에는 불가결하지 않은 것으로 나타났다.

플라스미드 비활성 활성의 비율(pmol/hr/mg단백질) (%)

pTrc99A 0 0pEBGT4+His 21390 637pMA4a+His 3359 100pCore+His 39766 1184pEHGT4-2+His 270 8pMA4b+His 2812 84

반응시간: 4.0시간

IPTG 첨가후 25℃에서 4시간 배양

활성의 비율은 전부 pMA4a+His의 총활성을 100%로 하여 나타냈다.

[실시예 12] 소 또는 인간 GnT-IVa 유전자를 EP0 생산 CH0세포에 도입함으로써 조합체 에리트로포이에틴(EPO)의 당쇄 분지구조의 변환

(1) EPO 생산 CHO 세포주로의 GnT-IV 발현 플라스미드의 도입

특허공보 평성2-17156호에 표시된 방법에 의해, EP0생산 CH0세포주를 제작하였다. 이들의세포주 M01과 H-5에 GnT-IVa 발현 플라스미드 pBGT4 또는 pHGT4-1을 일렉트로포레이션법에 의해 도입하였다. 도입시, GnT-IVa 발현 플라스미드를 15㎍과 약제내성 표지물질 플라스미드(pSV2bsr[과연제약] 또는 pMAMneo[C1ontech])를1.5㎍ 혼합한 것을 사용하였다. 유전자를 도입한 세포는 10% C0₂, 37℃에서 약 60시간 배양한 후, 블래스티시딘S[과연제약](최종농도 1O㎍/㎖) 또는 제네티신[Life Technologies., Inc.](최종농도 500㎍/㎖)을 배지에 첨가하고, 추가로 10일 내지 2주간 배양을 계속하여 약제 내성주를 여러개 분리하였다.

(2) EP0생산 CH0세포주에 있어서의 도입 GnT-IVa 유전자 발현의 확인

EPO 생산 CHO 세포주(원래주) 및 각 약제 내성주를 적당한 크기로 배양하고, 총 RNA를 정제하여 GnT-IVa 유전자의 일부를 프로브로 한 RNA 도트블롯해석을 실시하여 GnT-IVa의 mRNA양을 조사하였다. 또한, 참고예 2에 나타낸 분석법을 사용하여, 원래주 및 각 약제 내성주가 발현하는 GnT-IV 활성을 측정하였다. RNA 도트블롯해석에 의해 강한 시그널을 내며, 또한 원래주와 비교해서 높은 GnT-IV 활성을 나타내는 주를 골라서 EPO 생산에 사용하였다. 선택한 세포주에서 예컨대, MOl(소 GnT-IVa) #36주는 M01주에 대하여 약 104배, H-5(인간 GnT-IVa) #23주로서는 H-5주에 대하여 약 125배의 GnT-IVa 활성 상승을 보이고 있었다.

(3) GnT-IVa 유전자를 도입한 EPO 생산 CH0세포주를 사용한 EP0의 생산

EPO는 배양액중에 분비 발현된다. 따라서, EPO 생산 CHO 세포주 MO1및 H-5와, 상기 M01(소 GnT-IVa) #36주 및 H-5(인간 GnT-IVa) #23주는 로울러 보틀(roller bottle)을 사용하여 배양하였다. 우선, 각 세포주를 증식용 배지속에서 부착 배양시키고, 1.5x10⁷개의 세포를 200㎖의 증식용 배지를 넣은 850cm²의 로울러 보틀에 옮기고, 10% CO₂, 37℃에서 3일간 세포가 균일하게 부착되도록 배양하였다. 그 후, 증식용 배지를 제거하고, PBS 완충액으로 세포를 세척한 후, 20O㎖의 무혈청 배지를 가하고, 10% CO₂, 37℃에서 7일간 배양한 후, 배양 상층액을 회수하였다. 증식용 배지로서는 D-MEM/F12 혼합배지에 5% 태아소혈청, 290mg/1L-글루타민산, 1xMEM 비필수 아미노산 용액, 1OOnM 메토트렉세이트를 가한 것을 사용하고, 무혈청 배지로서는 상기 배지보다 태아소혈청을 제외한 것을 사용하였다. 각각의 무혈청 배양 상층액중에 함유된 EPO는 항 인간EPO 항체를 사용한 ELISA법에 의해 정량하였다.

(4) GnT-IVa 유전자 도입주, 비도입주가 생산하는 EP0의 당쇄구조에 따른 분석

조합체 EPO는 등전점 전기영동상에서는 단일 분자로 존재하지 않고, 여러 가지 전하를 갖는 분자의 집합체이다. 단백질의 부분에는 변화가 없기 때문에, 이들 분자의 전하 차이는 당쇄구조의 차이에 기인하는 것으로 나타나며, 이들 분자 집합체는 글리코형으로 불린다[Watson, E. 및 Yao, F., Anal. Biochem. (1993), 210, 389-93]. EPO에는 아스파라긴 결합형 당쇄가 3개 있으며, 각각의 당쇄의 분지구조는 2개(바이-안테나형)부터 4개(테트라-안테나형)까지 여러 가지가 있다. 각각의 분지 GlcNAc의 앞에는 또한 Gal(갈락토오스)가 결합하고, 그 앞에는 시알산이 결합한다. 따라서, GnT-IVa 유전자의 도입에 의해 당쇄의 분지가 증가하면 결합하는 시알산의 수를 증가시키고, 등전점이 낮은 글리코형의 함량이 증가한다. 따라서, 등전점 전기영동에 의한 분석을 실시하여, GnT-IVa 유전자를 도입한 EPO 생산세포에서 생산되는 EPO의 당쇄구조의 변화를 검출하였다.

등전점 전기영동에는 파마시아사제의 Multiphor II 장치를 사용하였다. 영동에는 5%의 아크릴아미드(30:0.8), 1.5%의 파르마라이트(Pharmalyte) 2.5-5(파마시아)의 조성의 겔을 사용하고, +전극액에는 0.lM 황산, -전극액에는 0.2M L-히스티딘용액을 사용하였다. 등전점 전기영동 후의 시료는 PVDF 막으로 전기영동적으로 이동시키고, 항 EPO 마우스 단일클론 항체를 사용한 웨스턴 플롯분석을 실시하여, EPO의 각 글리코형 밴드를 검출하였다. 각 세포주의 무혈청 배양 상층액은 센트리플러스30 및 마이크로컴퓨터30(모두 아미콘)를 사용하며, 필요에 따라 약 7∼1000배로 농축시켰다. 당초, 약 50∼100IU분의 EP0를 시료로 사용하여, 웨스턴 플롯 분석에 의해 검출되는 밴드의 강도가 거의 동등하도록 적시에 시료량을 조절하였다.

그 결과, MO1주 유래의 EP0와 MO1(소 GnT-IVa) #36주 유래의 EP0를 비교하면, 주된 EPO 글리코형의 위치가 적어도 1개, 낮은 pI측(+전극액측)으로 이동하고 있는 것이 확인되었다(도 19). 이 결과로부터, 도입 발현된 GnT-IVa 효소가 EPO에 결합한 아스파라긴 결합형 당쇄의 GlcNAc 분지수를 증가시키고, 그 결과 시알산의 결합수가 증가하고 등전점이 낮은 글리코형의 함량이 증가하는 것으로 생각되었다. 또한, 동일한 해석을 H-5주와 H-5(인간 GnT-IVa) #23주에서 실시한 바, 역시 주된 EPO 글리코형의 위치가 낮은 pI 측으로 이동하고 있었다(도 19).

이상으로부터, 임의의 세포에 GnT-IVa 유전자를 도입함으로써, 그 세포가 생산하는 단백질의 아스파라긴 결합형 당쇄의 구조를 변화시킬 수 있음을 나타냈다.

본 발명에 따르면, 신규 β1→4N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라아제(GnT-IV), 그 제조방법 및 상기 효소를 코딩하는 유전자가 제공된다. 본 발명의 GnT-IV에 의하면, 기존의 당전이효소로서는 형성할 수 없던 분지구조의 복합당을 생산할 수 있으며, 복합당 형태의 의약품, 시약, 식품의 제조나 개량에 도움이 되며 동시에, 모든 생체 고분자의 당쇄구조를 변형시키는데 있어서 유용하다.

또한, 본 발명의 GnT-IV 유전자는 암 등의 병변의 진단이나 치료, 미생물 등을 이용한 복합당 제품의 당쇄구조의 변형에 유용하다.

또한, 본 발명의 GnT-IV 단백질을 항원으로 하여 얻어지는 항체·항혈청, 또는 본 발명의 GnT-IV 유전자의 전부 또는 일부를 프로브에 사용하면, 미생물·배양세포·동물 각 조직·혈구·혈액의 특성을 밝히거나 암 등 병변 세포 조직의 진단 등에 유용하다.

서열표

서열 번호: 1

서열의 길이: 8

서열의 형태: 아미노산

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 펩티드

[서열 1]

서열 번호: 2

서열의 길이: 11

서열의 형태: 아미노산

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[서열 2]

서열 번호: 3

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서열의 형태: 아미노산

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[서열 3]

서열 번호: 4

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서열의 형태: 아미노산

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[서열 4]

서열 번호: 5

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서열의 형태: 아미노산

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[서열 5]

서열 번호: 6

서열의 길이: 6

서열의 형태: 아미노산

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[서열 6]

서열 번호: 7

서열의 길이: 14

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[서열 7]

서열 번호: 8

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서열의 형태: 아미노산

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[서열 8]

서열 번호: 9

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서열의 형태: 아미노산

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[서열 9]

서열 번호: 10

서열의 길이: 6

서열의 형태: 아미노산

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서열의 종류: 펩티드

[서열 10]

서열 번호: 11

서열의 길이: 15

서열의 형태: 아미노산

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[서열 11]

서열 번호: 12

서열의 길이: 10

서열의 형태: 아미노산

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[서열 12]

서열 번호: 13

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[서열 13]

서열 번호: 14

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서열의 형태: 아미노산

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[서열 14]

서열 번호: 15

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[서열 15]

서열 번호: 16

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서열의 종류: 합성 DNA

안티센스: 예

[서열 16]

서열 번호: 17

서열의 길이: 2246

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[서열 17]

서열 번호: 18

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[서열 18]

서열 번호: 19

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[서열 19]

서열 번호: 20

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서열의 종류: 합성 DNA

안티센스: 예

[서열 20]

서열 번호: 21

서열의 길이: 24

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

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[서열 21]

서열 번호: 22

서열의 길이: 24

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[서열 22]

서열 번호: 23

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[서열 23]

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[서열 24]

서열 번호: 25

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[서열 25]

서열 번호: 26

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[서열 26]

서열 번호: 27

서열의 길이: 30

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[서열 27]

서열 번호: 28

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[서열 28]

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[서열 29]

서열 번호: 30

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서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

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[서열 30]

서열 번호: 31

서열의 길이: 25

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사슬의 수: 1개

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서열의 종류: 합성 DNA

[서열 31]

서열 번호: 32

서열의 길이: 24

서열의 형태: 핵산

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서열의 종류: 합성 DNA

[서열 32]

서열 번호: 33

서열의 길이: 24

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

[서열 33]

서열 번호: 34

서열의 길이: 24

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서열의 종류: 합성 DNA

[서열 34]

서열 번호: 35

서열의 길이: 24

서열의 형태: 핵산

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[서열 35]

서열 번호: 36

서열의 길이: 1724

서열의 형태: 핵산

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서열의 종류: cDNA

[서열 36]

서열 번호: 37

서열의 길이: 548

서열의 형태: 아미노산

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서열의 종류: 펩티드

[서열 37]

서열 번호: 38

서열의 길이: 29

서열의 형태: 핵산

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[서열 38]

서열 번호: 39

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[서열 39]

서열 번호: 40

서열의 길이: 28

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

[서열 40]

서열 번호: 41

서열의 길이: 48

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

안티센스: 예

[서열 41]

서열 번호: 42

서열의 길이: 48

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

[서열 42]

서열 번호: 43

서열의 길이: 44

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

안티센스: 예

[서열 43]

서열 번호: 44

서열의 길이: 43

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

안티센스: 예

[서열 44]

서열 번호: 45

서열의 길이: 44

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

[서열 45]

서열 번호: 46

서열의 길이: 43

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

[서열 46]

서열 번호: 47

서열의 길이: 26

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

안티센스: 예

[서열 47]

서열 번호: 48

서열의 길이: 28

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

안티센스: 예

[서열 48]

서열 번호: 49

서열의 길이: 38

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

안티센스: 예

[서열 49]

서열 번호: 50

서열의 길이: 34

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

[서열 50]

서열 번호: 51

서열의 길이: 19

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

[서열 51]

서열 번호: 52

서열의 길이: 29

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

안티센스: 예

[서열 52]

서열 번호: 53

서열의 길이: 27

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

[서열 53]

서열 번호: 54

서열의 길이: 51

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

안티센스: 예

[서열 54]

서열 번호: 55

서열의 길이: 18

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

안티센스: 예

[서열 55]

서열 번호: 56

서열의 길이: 32

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

[서열 56]

서열 번호: 57

서열의 길이: 51

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

안티센스: 예

[서열 57]

서열 번호: 58

서열의 길이: 49

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

안티센스: 예

[서열 58]

서열 번호: 59

서열의 길이: 19

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

[서열 59]

서열 번호: 60

서열의 길이: 18

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

안티센스: 예

[서열 60]

서열 번호: 61

서열의 길이: 18

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

[서열 61]

서열 번호: 62

서열의 길이: 44

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

안티센스: 예

[서열 62]

서열 번호: 63

서열의 길이: 23

서열의 형태: 핵산

사슬의 수: 1개

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 합성 DNA

[서열 63]

Claims

서열 17에 기재된 염기 서열을 갖는 GnT- IV DNA.
서열 23에 기재된 염기 서열을 갖는 GnT- IV DNA.
서열 36에 기재된 염기 서열을 갖는 GnT- IV DNA.
제 1항 내지 3항중 어느 하나에 기재된 GnT- IV DNA를 벡터 DNA에 삽입하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA
제 1항 내지 3항중 어느 하나에 기재된 GnT- IV DNA를 포함하는 염색체 단편.
제 4 항에 기재된 재조합 DNA를 포함하는 원핵세포, 동물세포, 효모세포, 진균 세포 또는 곤충 세포.
제 5항에 기재된 염색체 단편이 인위적으로 도입된 원핵세포, 동물 세포, 효모세포, 진균 세포 또는 곤충 세포.
제 6항에 기재된 원핵세포,동물세포,효모 세로, 진균 세포 또는 곤충 세포를 배지에 배양하여, 배양물로부터 GnT- IV 를 채취하는 것을 특징으로 하는 GnT- IV의 제조법.
제 7항에 기재된 원핵세포, 동물세포, 효모세포, 진균 세포 또는 곤충세포를 배지에 배양하여, 배양물로부터 GnT- IV를 채취하는 것을 특징으로 하는 GnT- IV의 제조법.
제 6항에 기재된 원핵세포, 동물세포, 효모세포, 진균 세포 또는 곤충 세포를 기원으로 하는 숙주의 분비물. 체액. 균질물로부터 GnT- IV를 채취하는 것을 특징으로 하는 GnT- IV의 제조법.
제 7항에 기재된 원핵세포, 동물세포, 효모세포, 진균 세포 또는 곤충 세포를 기원으로 하는 숙주의 분비물, 체액, 균질물로부터 GnT- IV 를 채취하는것을 특징으로 하는 GnT- IV 의 제조법.
동물세포에 제 1항 내지 제 3항중 어느 하나에 기재된 GnT- IV DNA를 도입하여 상기 동물세포에 의해 생산되는 당단백질의 당쇄 분지구조를 변형시키는 방법.
GnT- IV의 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가지며 또 서열 24의 이하아 같은 하나 이상의 위치에 있는 아미노산이 결실, 부가 또는 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA:
GnT- IV의 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖고 상기 단백질의 아미노산 서열은 서열 24의 아미노산 서열과의 상동성이 96% 보다 큰 것을 특징으로 하는 DNA.
제 13항 또는 제 14항에 있어서, 상기 단백질이 서열 18의 아미노산 93 내지 383을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 15항에 있어서, 상기 단백질이 서열 18의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 13항 또는 제 14항에 있어서, 상기 단백질이 서열 24의 아미노산 번호 94 내지 383을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 17항에 있어서, 상기 단백질이 서열 24의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 13항 또는 제 14항에 있어서, 상기 단백질이 서열 37의 아미노산 번호 91 내지 548을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 19항에 있어서, 상기 단백질이 서열 37의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 13항 또는 제 14항에 있어서, 상기 DNA가 동물 세포로부터 분리된 것을 특징으로 하는 DNA.
제 13항 또는 제 14항에 기재된 GnT- IV DNA를 벡터 DNA에 삽입하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA.
제 13항 또는 제 14항에 기재된 GnT- IV DNA를 포함하는 염색체 단편.
동물세포에 제 13항 또는 제 14항에 기재된 GnT- IV DNA 를 도입하여 상기 동물세포에 의해 생산되는 당단백질의 당쇄 분지구조를 변형시키는 방법.
제 1항 내지 제 3항, 제13항 및 제 14항중 어느 하나에 기재된 DNA에 의해 암호화되는 단리된 GnT- IV 효소.
생물 시료로부터 제 25항에 기재된 GnT- IV 효소를 정제하는 방법.
GnT- IV 의 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖고 상기 단백질의 아미노산 서열은 서열 18의 아미노산 서열과의 상동성이 96% 보다 큰 것을 특징으로 하는 DNA,
제 27항에 기재된 GnT- IV DNA를 벡터 DNA에 삽입하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA,
제 27항에 기재된 GnT- IV DNA를 포함하는 염색체 단편.
동물세포에 제 27항에 기재된 GnT- IV DNA 를 도입하여 상기 동물세포에 의해 생산되는 당단백질의 당쇄 분지구조를 변형시키는 방법.
제 1항 내지 제 3 항 및 제 27항중 어느 하나에 기재된 DNA에 의해 암호화되는 단리된 GnT- IV 효소.