JP2789283B2 - ヒト糖転移酵素遺伝子 - Google Patents
ヒト糖転移酵素遺伝子Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト糖転移酵素遺伝子
及び糖質工学の分野において有用な該酵素の製造方法に
関する。
及び糖質工学の分野において有用な該酵素の製造方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】糖転移酵素の１種であるＵＤＰ−Ｎ−ア
セチルグルコサミン：β−Ｄ−マンノシドβ１−４Ｎ−
アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（Ｅ
Ｃ２．４．１．１４４：以下、ＧｎＴ−ＩＩＩと略す）
は、アスパラギン結合型糖鎖のβ１−４結合したマンノ
ース残基（Ｍａｎ）に、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサ
ミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）中のＧｌｃＮＡｃを転移
する酵素であり、ナラシムハンによって初めて報告され
た〔ナラシムハン，Ｓ．（Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ，
Ｓ．）、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２５７巻、第１
０２３５〜１０２４２頁（１９８２）〕。ＧｎＴ−ＩＩ
Ｉによって転移されたＧｌｃＮＡｃはバイセクティング
ＧｌｃＮＡｃと称され、各種の糖タンパク質の糖鎖に見
出されている。また、ラット肝のガン化に伴ってＧｎＴ
−ＩＩＩの活性が上昇することもナラシムハンら〔ナラ
シムハン，Ｓ．らジャーナル オブバイオロジカル ケ
ミストリー、第２６３巻、第１２７３〜１２８２頁（１
９８８）〕、パスカルら〔Ｐａｓｃａｌｅ，Ｒ．らカル
シノゲネシス（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）、第１
０巻、第９６１〜９６４頁（１９８９）〕によって報告
されている。他に、ヒトでは肝ガンの患者血清中でＧｎ
Ｔ−ＩＩＩ活性の上昇がイシバシらによって報告されて
いる〔イシバシ（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ）ら、クリニカ
キミカ アクタ（Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａ
ｃｔａ）、第１８５巻、第３２５〜３３２頁（１９８
９）〕。また、遺伝子に関しては、ラット由来のＧｎＴ
−ＩＩＩ（ラットＧｎＴ−ＩＩＩ）をコードする遺伝子
が本発明者らのうちの１人によって単離されている（特
願平４−６９３４５号明細書）。
セチルグルコサミン：β−Ｄ−マンノシドβ１−４Ｎ−
アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（Ｅ
Ｃ２．４．１．１４４：以下、ＧｎＴ−ＩＩＩと略す）
は、アスパラギン結合型糖鎖のβ１−４結合したマンノ
ース残基（Ｍａｎ）に、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサ
ミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）中のＧｌｃＮＡｃを転移
する酵素であり、ナラシムハンによって初めて報告され
た〔ナラシムハン，Ｓ．（Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ，
Ｓ．）、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２５７巻、第１
０２３５〜１０２４２頁（１９８２）〕。ＧｎＴ−ＩＩ
Ｉによって転移されたＧｌｃＮＡｃはバイセクティング
ＧｌｃＮＡｃと称され、各種の糖タンパク質の糖鎖に見
出されている。また、ラット肝のガン化に伴ってＧｎＴ
−ＩＩＩの活性が上昇することもナラシムハンら〔ナラ
シムハン，Ｓ．らジャーナル オブバイオロジカル ケ
ミストリー、第２６３巻、第１２７３〜１２８２頁（１
９８８）〕、パスカルら〔Ｐａｓｃａｌｅ，Ｒ．らカル
シノゲネシス（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）、第１
０巻、第９６１〜９６４頁（１９８９）〕によって報告
されている。他に、ヒトでは肝ガンの患者血清中でＧｎ
Ｔ−ＩＩＩ活性の上昇がイシバシらによって報告されて
いる〔イシバシ（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ）ら、クリニカ
キミカ アクタ（Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａ
ｃｔａ）、第１８５巻、第３２５〜３３２頁（１９８
９）〕。また、遺伝子に関しては、ラット由来のＧｎＴ
−ＩＩＩ（ラットＧｎＴ−ＩＩＩ）をコードする遺伝子
が本発明者らのうちの１人によって単離されている（特
願平４−６９３４５号明細書）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上述の様に、ＧｎＴ−
III は生体内で重要な役割を持ち、また、ガン化と関連
して活性が上昇するといったガン診断においても有用な
酵素であるにもかかわらず、ヒトＧｎＴ−III に関する
報告はその活性の測定にとどまり、ヒトＧｎＴ−III 遺
伝子が単離されたという報告は無い。本発明の目的は、
ヒトＧｎＴ−III 遺伝子を特定し、ヒトＧｎＴ−III の
遺伝子工学的製造方法を提供することにある。
III は生体内で重要な役割を持ち、また、ガン化と関連
して活性が上昇するといったガン診断においても有用な
酵素であるにもかかわらず、ヒトＧｎＴ−III に関する
報告はその活性の測定にとどまり、ヒトＧｎＴ−III 遺
伝子が単離されたという報告は無い。本発明の目的は、
ヒトＧｎＴ−III 遺伝子を特定し、ヒトＧｎＴ−III の
遺伝子工学的製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は下記（ａ）〜（ｄ）に記載の遺伝子
から選択され、かつ、ＧｎＴ一ＩＩＩ活性を有すること
を特徴とするヒト糖転移酵素をコードする遺伝子に関す
る。 （ａ）配列表の配列番号１の塩基番号１６９〜１７７０
番目で示される塩基配列を有する遺伝子、 （ｂ）配列表の配列番号１の塩基番号１６９〜１７７０
番目で示される塩基配列において、１個又は複数個の塩
基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つが
なされている遺伝子、 （ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子に厳密な条
件下でハイブリダイズする遺伝子、 （ｄ）上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に記載の遺伝子を
含んでなる遺伝子。本発明の第２の発明は組換えベクタ
ーに関し、第１の発明の遺伝子を含有することを特徴と
する。 本発明の第３の発明はヒト糖転移酵素の製造方法に関
し、第２の発明の組換えベクターを導入させた形質転換
体を培養し、該培養物からヒト糖転移酵素を採取するこ
とを特徴とする。
発明の第１の発明は下記（ａ）〜（ｄ）に記載の遺伝子
から選択され、かつ、ＧｎＴ一ＩＩＩ活性を有すること
を特徴とするヒト糖転移酵素をコードする遺伝子に関す
る。 （ａ）配列表の配列番号１の塩基番号１６９〜１７７０
番目で示される塩基配列を有する遺伝子、 （ｂ）配列表の配列番号１の塩基番号１６９〜１７７０
番目で示される塩基配列において、１個又は複数個の塩
基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つが
なされている遺伝子、 （ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子に厳密な条
件下でハイブリダイズする遺伝子、 （ｄ）上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に記載の遺伝子を
含んでなる遺伝子。本発明の第２の発明は組換えベクタ
ーに関し、第１の発明の遺伝子を含有することを特徴と
する。 本発明の第３の発明はヒト糖転移酵素の製造方法に関
し、第２の発明の組換えベクターを導入させた形質転換
体を培養し、該培養物からヒト糖転移酵素を採取するこ
とを特徴とする。
【０００５】本発明者らは、ラットＧｎＴ−III 遺伝子
からプローブを調製し、これを用いてヒトｃＤＮＡライ
ブラリーよりヒトＧｎＴ−III をコードする遺伝子を含
有するクローン体を検索し、ヒトＧｎＴ−III をコード
する遺伝子の単離及び該遺伝子を用いたヒトＧｎＴ−II
I の発現に成功し、本発明を完成させた。
からプローブを調製し、これを用いてヒトｃＤＮＡライ
ブラリーよりヒトＧｎＴ−III をコードする遺伝子を含
有するクローン体を検索し、ヒトＧｎＴ−III をコード
する遺伝子の単離及び該遺伝子を用いたヒトＧｎＴ−II
I の発現に成功し、本発明を完成させた。
【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。ヒトＧｎ
Ｔ−ＩＩＩをコードする遺伝子の検索に用いるプローブ
としては、例えば特開平６−３８７６７号公報に記載さ
れているラットＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子を含むプラスミド
ＳＶ３を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断することによっ
て得られる約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を用いることがで
きる。プラスミドＳＶ３は通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されている大腸菌Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＳＶ３（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４３５２）より調製できる。該ＤＮＡ断片
をプローブとしてプラークハイブリダイゼーション法に
より、例えば市販のヒトｃＤＮＡライブラリーから、ヒ
トＧｎＴ−ＩＩＩをコードする遺伝子を検索することが
できる。検索の結果、３×１０６個のプラークから２個
の陽性クローンが得られ、それぞれＨ２、Ｈ３と命名し
た。これらのクローンはＥｃｏＲＩ分解後、例えばブル
ースクリプトＩＩＳＫ＋（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ
ＳＫ＋、ストラタジーン社製）のＥｃｏＲＩサイトにサ
ブクローニングされる。サブクローニングされたプラス
ミドをそれぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｈ
２）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｈ３）と命名し
た。
Ｔ−ＩＩＩをコードする遺伝子の検索に用いるプローブ
としては、例えば特開平６−３８７６７号公報に記載さ
れているラットＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子を含むプラスミド
ＳＶ３を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断することによっ
て得られる約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を用いることがで
きる。プラスミドＳＶ３は通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されている大腸菌Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＳＶ３（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４３５２）より調製できる。該ＤＮＡ断片
をプローブとしてプラークハイブリダイゼーション法に
より、例えば市販のヒトｃＤＮＡライブラリーから、ヒ
トＧｎＴ−ＩＩＩをコードする遺伝子を検索することが
できる。検索の結果、３×１０６個のプラークから２個
の陽性クローンが得られ、それぞれＨ２、Ｈ３と命名し
た。これらのクローンはＥｃｏＲＩ分解後、例えばブル
ースクリプトＩＩＳＫ＋（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ
ＳＫ＋、ストラタジーン社製）のＥｃｏＲＩサイトにサ
ブクローニングされる。サブクローニングされたプラス
ミドをそれぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｈ
２）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｈ３）と命名し
た。
【０００７】Ｈ２、Ｈ３の制限酵素分析による関係を図
２に示す。これらＨ２、Ｈ３の塩基配列を確認したとこ
ろ、開始コドンＡＴＧが含まれていなかったため、ヒト
ＧｎＴ−III をコードする遺伝子全長を得るために、Ｈ
２、Ｈ３をプローブとして再度ヒトｃＤＮＡライブラリ
ーより検索を行った。検索の結果、７×１０5 個のプラ
ークより４個の陽性クローンが得られ、これらのクロー
ンはＥｃｏＲＩ分解後例えばブルースクリプトIIＳＫ+
のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングされる。
２に示す。これらＨ２、Ｈ３の塩基配列を確認したとこ
ろ、開始コドンＡＴＧが含まれていなかったため、ヒト
ＧｎＴ−III をコードする遺伝子全長を得るために、Ｈ
２、Ｈ３をプローブとして再度ヒトｃＤＮＡライブラリ
ーより検索を行った。検索の結果、７×１０5 個のプラ
ークより４個の陽性クローンが得られ、これらのクロー
ンはＥｃｏＲＩ分解後例えばブルースクリプトIIＳＫ+
のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングされる。
【０００８】サブクローニングされたＤＮＡのうち、開
始コドンを含む２種をそれぞれＨ１５、Ｈ２０と命名
し、これがサブクローニングされているプラスミドをそ
れぞれpBluescript II （Ｈ１５）、 pBluescript II
（Ｈ２０）と命名した。Ｈ１５、Ｈ２０の制限酵素分析
による関係を図２に示す。
始コドンを含む２種をそれぞれＨ１５、Ｈ２０と命名
し、これがサブクローニングされているプラスミドをそ
れぞれpBluescript II （Ｈ１５）、 pBluescript II
（Ｈ２０）と命名した。Ｈ１５、Ｈ２０の制限酵素分析
による関係を図２に示す。
【０００９】次に、ヒトＧｎＴ−III 遺伝子全長を含む
発現プラスミドの構築は、例えば、Ｈ２０を pBluescri
pt II （Ｈ２０）からＥｃｏＲＩで切り出し、ｐＳＶＫ
３（ファルマシア社製）に組込みｐＳＶＫ３（Ｈ２０）
を作製することができる。また例えばＨ３が組込まれた
pBluescript II （Ｈ３）からＮｏｔＩとＸｈｏＩで切
り出した断片を、ｐＳＶＫ３（Ｈ２０）より切り出した
ＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ断片を交換するようにｐＳＶＫ３
（Ｈ２０）に組込み、発現プラスミドＥＸ２０Ｆを作製
することができる（図３）。
発現プラスミドの構築は、例えば、Ｈ２０を pBluescri
pt II （Ｈ２０）からＥｃｏＲＩで切り出し、ｐＳＶＫ
３（ファルマシア社製）に組込みｐＳＶＫ３（Ｈ２０）
を作製することができる。また例えばＨ３が組込まれた
pBluescript II （Ｈ３）からＮｏｔＩとＸｈｏＩで切
り出した断片を、ｐＳＶＫ３（Ｈ２０）より切り出した
ＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ断片を交換するようにｐＳＶＫ３
（Ｈ２０）に組込み、発現プラスミドＥＸ２０Ｆを作製
することができる（図３）。
【００１０】ＥＸ２０Ｆに組込まれているＤＮＡ断片の
塩基配列をジデオキシ法で決定することができる。決定
した塩基配列の一部を配列表の配列番号１に示す。オー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を検索した結果、
塩基番号１６９〜１７７０にＯＲＦが認められた。該Ｏ
ＲＦ部分の制限酵素地図を図１に示す。
塩基配列をジデオキシ法で決定することができる。決定
した塩基配列の一部を配列表の配列番号１に示す。オー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を検索した結果、
塩基番号１６９〜１７７０にＯＲＦが認められた。該Ｏ
ＲＦ部分の制限酵素地図を図１に示す。
【００１１】発現プラスミドで発現用細胞を形質転換
し、ヒトＧｎＴ−III の発現性の有無を検討することに
より、ヒトＧｎＴ−III 産生細胞を得ることができる。
発現用細胞としては、例えばＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １６５０）を用いることができ、例えば、前
述の発現プラスミドＥＸ２０ＦでＣＯＳ−１細胞を形質
転換すればよい。形質転換体を培養し、形質転換体中に
発現されたＧｎＴ−III活性を測定することにより、ヒ
トＧｎＴ−III をコードする遺伝子が特定される。該遺
伝子はＥＸ２０Ｆに組込まれその塩基配列の一部が配列
表の配列番号１で示されるＤＮＡ断片上に存在する。そ
して該形質転換体を培養することにより、ヒトＧｎＴ−
III を遺伝子工学的に製造することができる。
し、ヒトＧｎＴ−III の発現性の有無を検討することに
より、ヒトＧｎＴ−III 産生細胞を得ることができる。
発現用細胞としては、例えばＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １６５０）を用いることができ、例えば、前
述の発現プラスミドＥＸ２０ＦでＣＯＳ−１細胞を形質
転換すればよい。形質転換体を培養し、形質転換体中に
発現されたＧｎＴ−III活性を測定することにより、ヒ
トＧｎＴ−III をコードする遺伝子が特定される。該遺
伝子はＥＸ２０Ｆに組込まれその塩基配列の一部が配列
表の配列番号１で示されるＤＮＡ断片上に存在する。そ
して該形質転換体を培養することにより、ヒトＧｎＴ−
III を遺伝子工学的に製造することができる。
【００１２】また、得られた遺伝子をプローブとして厳
密な条件下でハイブリダイゼーションを行えば、本酵素
と配列は少し異なるが同様の酵素活性を持つと期待され
るすべての本酵素類似の遺伝子を得ることが期待でき
る。ここで言う厳密な条件下とは、以下の条件下のこと
を言う。すなわち、ＤＮＡを固定したナイロン膜を、６
×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、ク
エン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かし
たもの）、１％ラウリル硫酸ナトリウム、１００μｇ／
ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツ（ Denhardt's
) （ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フ
ィコールをそれぞれ０．１％の濃度で含む）を含む溶液
中で６５℃で２０時間プローブとハイブリダイゼーショ
ンを行うことを言う。
密な条件下でハイブリダイゼーションを行えば、本酵素
と配列は少し異なるが同様の酵素活性を持つと期待され
るすべての本酵素類似の遺伝子を得ることが期待でき
る。ここで言う厳密な条件下とは、以下の条件下のこと
を言う。すなわち、ＤＮＡを固定したナイロン膜を、６
×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、ク
エン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かし
たもの）、１％ラウリル硫酸ナトリウム、１００μｇ／
ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツ（ Denhardt's
) （ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フ
ィコールをそれぞれ０．１％の濃度で含む）を含む溶液
中で６５℃で２０時間プローブとハイブリダイゼーショ
ンを行うことを言う。
【００１３】以上、詳細に説明した様に、本発明により
ヒトＧｎＴ−III の遺伝子が単離され、該遺伝子を用い
たヒトＧｎＴ−III の製法が提供される。該遺伝子及び
その分解物は、ヒトＧｎＴ−III の生体中での発現過程
の測定に使用することもでき、ガン診断等の遺伝子診断
においても有用である。また、本発明遺伝子のコードす
るポリペプチドを用いて、種々の抗体を免疫学的に作製
することもでき、これらの抗体も、診断の分野や、ヒト
ＧｎＴ−III の精製等に有用である。
ヒトＧｎＴ−III の遺伝子が単離され、該遺伝子を用い
たヒトＧｎＴ−III の製法が提供される。該遺伝子及び
その分解物は、ヒトＧｎＴ−III の生体中での発現過程
の測定に使用することもでき、ガン診断等の遺伝子診断
においても有用である。また、本発明遺伝子のコードす
るポリペプチドを用いて、種々の抗体を免疫学的に作製
することもでき、これらの抗体も、診断の分野や、ヒト
ＧｎＴ−III の精製等に有用である。
【００１４】
【実施例】以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明は
これらの実施例に限定されるものではない。
これらの実施例に限定されるものではない。
【００１５】実施例１ （１）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング プラスミドＳＶ３で形質転換された大腸菌Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＸＬ１−ＢｌｕｅＳＶ３（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４３５２）よりＳＶ３を調製し、該プラスミ
ドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、約１．４ｋｂのＤＮＡ断
片を得た。該ＤＮＡ断片をマルチプライムＤＮＡラベリ
ングシステム（アマーシャム社製）を用い、〔α−３２
Ｐ〕αＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（アマーシャ
ム社製）で放射性標識し、プローブを作製した。該プロ
ーブを用い、ヒトｃＤＮＡライブラリー（ヒューマン
フェイタル リバー＜λｇｔ１０＞、クローンテック社
製）よりプラークハイブリダイゼーション法にて目的の
クローンを検索した。その結果、３×１０６個のプラー
クから２個の陽性クローンが得られた。これらのクロー
ンからＤＮＡを抽出し、そのＥｃｏＲＩ分解物をブルー
スクリプトＩＩＳＫ＋にサブクローニングし、サブクロ
ーニングされた２種のそれぞれ約１．３ｋｂ、約１．５
ｋｂのＤＮＡをＨ２、Ｈ３と命名し、プラスミドをそれ
ぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｈ２）、ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｈ３）と命名した。各ＤＮＡの
制限酵素地図及びその関係を図２に示す。
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＸＬ１−ＢｌｕｅＳＶ３（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４３５２）よりＳＶ３を調製し、該プラスミ
ドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、約１．４ｋｂのＤＮＡ断
片を得た。該ＤＮＡ断片をマルチプライムＤＮＡラベリ
ングシステム（アマーシャム社製）を用い、〔α−３２
Ｐ〕αＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（アマーシャ
ム社製）で放射性標識し、プローブを作製した。該プロ
ーブを用い、ヒトｃＤＮＡライブラリー（ヒューマン
フェイタル リバー＜λｇｔ１０＞、クローンテック社
製）よりプラークハイブリダイゼーション法にて目的の
クローンを検索した。その結果、３×１０６個のプラー
クから２個の陽性クローンが得られた。これらのクロー
ンからＤＮＡを抽出し、そのＥｃｏＲＩ分解物をブルー
スクリプトＩＩＳＫ＋にサブクローニングし、サブクロ
ーニングされた２種のそれぞれ約１．３ｋｂ、約１．５
ｋｂのＤＮＡをＨ２、Ｈ３と命名し、プラスミドをそれ
ぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｈ２）、ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｈ３）と命名した。各ＤＮＡの
制限酵素地図及びその関係を図２に示す。
【００１６】（２）開始コドンを含む上流領域のクロー
ニング Ｈ２、Ｈ３を実施例１−（１）と同様にして放射性標識
し、プローブを作製した。該プローブを用い、実施例１
−（１）と同様にしてヒトｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングし、７×１０5 個のプラークから４個の陽性
クローンを得、そのＥｃｏＲＩ分解物をブルースクリプ
トIIＳＫ+ にサブクローニングした。サブクローニング
されたＤＮＡの塩基配列を確認し、開始コドンを含む２
種のそれぞれ約１．６ｋｂ、約１．５ｋｂのＤＮＡをＨ
１５、Ｈ２０と命名し、各プラスミドをそれぞれ pBlue
script II （Ｈ１５）、 pBluescript II （Ｈ２０）と
命名した。各ＤＮＡの制限酵素地図及びそのＨ２、Ｈ３
との関係を図２に示す。
ニング Ｈ２、Ｈ３を実施例１−（１）と同様にして放射性標識
し、プローブを作製した。該プローブを用い、実施例１
−（１）と同様にしてヒトｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングし、７×１０5 個のプラークから４個の陽性
クローンを得、そのＥｃｏＲＩ分解物をブルースクリプ
トIIＳＫ+ にサブクローニングした。サブクローニング
されたＤＮＡの塩基配列を確認し、開始コドンを含む２
種のそれぞれ約１．６ｋｂ、約１．５ｋｂのＤＮＡをＨ
１５、Ｈ２０と命名し、各プラスミドをそれぞれ pBlue
script II （Ｈ１５）、 pBluescript II （Ｈ２０）と
命名した。各ＤＮＡの制限酵素地図及びそのＨ２、Ｈ３
との関係を図２に示す。
【００１７】実施例２ （１）発現プラスミドの構築 実施例１−（２）で調製した pBluescript II （Ｈ２
０）をＥｃｏＲＩで消化してＨ２０を切り出し、真核細
胞用の発現ベクターｐＳＶＫ３（ファルマシア社製）の
ＥｃｏＲＩサイトに組込み、ｐＳＶＫ３（Ｈ２０）を作
製した。一方、実施例１−（１）で調製した pBluescri
pt II （Ｈ３）をＮｏｔＩとＸｈｏＩで消化し、ヒトＧ
ｎＴ−III 遺伝子の下流部分を含むＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ
断片（約０．９ｋｂ）を得た。次に、ｐＳＶＫ３（Ｈ２
０）をＮｏｔＩとＸｈｏＩで消化し、ＮｏｔＩ−Ｘｈｏ
Ｉ断片を切除し、その部分に pBluescript II （Ｈ３）
のＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ断片（約０．９ｋｂ）を組込み、
真核細胞での発現プラスミドＥＸ２０Ｆを構築した（図
３）。
０）をＥｃｏＲＩで消化してＨ２０を切り出し、真核細
胞用の発現ベクターｐＳＶＫ３（ファルマシア社製）の
ＥｃｏＲＩサイトに組込み、ｐＳＶＫ３（Ｈ２０）を作
製した。一方、実施例１−（１）で調製した pBluescri
pt II （Ｈ３）をＮｏｔＩとＸｈｏＩで消化し、ヒトＧ
ｎＴ−III 遺伝子の下流部分を含むＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ
断片（約０．９ｋｂ）を得た。次に、ｐＳＶＫ３（Ｈ２
０）をＮｏｔＩとＸｈｏＩで消化し、ＮｏｔＩ−Ｘｈｏ
Ｉ断片を切除し、その部分に pBluescript II （Ｈ３）
のＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ断片（約０．９ｋｂ）を組込み、
真核細胞での発現プラスミドＥＸ２０Ｆを構築した（図
３）。
【００１８】ＥＸ２０Ｆに組込まれているＤＮＡ断片の
塩基配列をジデオキシ法にて決定した。その一部を配列
表の配列番号１に示す。ＤＮＡＳＩＳ（宝酒造社製）に
てＯＲＦを検索し、塩基番号１６９〜１７７０にＯＲＦ
を確認した。該ＯＲＦ部分の制限酵素地図を図１に示
す。
塩基配列をジデオキシ法にて決定した。その一部を配列
表の配列番号１に示す。ＤＮＡＳＩＳ（宝酒造社製）に
てＯＲＦを検索し、塩基番号１６９〜１７７０にＯＲＦ
を確認した。該ＯＲＦ部分の制限酵素地図を図１に示
す。
【００１９】（２）形質転換及びヒトＧｎＴ−III 遺伝
子の発現 ヒトＧｎＴ−III 発現用のＣＯＳ−１細胞は５％ＣＯ2
下、湿条件で３７℃で、１０％ＦＣＳを含むダルベッコ
変法イーグル培地で培養した。次に、実施例２−（１）
で調製したＥＸ２０Ｆを、ジーンパルサー（バイオラッ
ド社製）を用いエレクトロポレーションによりＣＯＳ−
１細胞に導入した。約５×１０6 の細胞と組換えプラス
ミド、又は対照のベクターは１３７mM ＮａＣｌ、５mM
ＫＣｌ、０．７mM Ｎａ2 ＨＰＯ4 、６mM デキスト
ロースを含む０．８mlの２０mM ヘペスバッファー、ｐ
Ｈ７．０５中に懸濁され、電圧２５０Ｖ／０．４cm、キ
ャパシタンス９６０μＦＤで処理を行った。形質転換
後、２日間培養を行い、細胞を集め、ＰＢＳ中で超音波
破砕を行い、破砕液中のＧｎＴ−III 活性を測定した。
プラスミド無処理の細胞、対照のプラスミドｐＳＶＫ３
処理の細胞にはＧｎＴ−III 活性は認められないのに対
し、プラスミドＥＸ２０Ｆで形質転換した細胞ではＧｎ
Ｔ−III 活性が認められヒトＧｎＴ−III 遺伝子が発現
していた。つまり、ＥＸ２０Ｆに組込まれ、その塩基配
列の一部が配列表の配列番号１で示されるＤＮＡ断片上
にヒトＧｎＴ−III をコードする遺伝子が存在すること
を確認した。
子の発現 ヒトＧｎＴ−III 発現用のＣＯＳ−１細胞は５％ＣＯ2
下、湿条件で３７℃で、１０％ＦＣＳを含むダルベッコ
変法イーグル培地で培養した。次に、実施例２−（１）
で調製したＥＸ２０Ｆを、ジーンパルサー（バイオラッ
ド社製）を用いエレクトロポレーションによりＣＯＳ−
１細胞に導入した。約５×１０6 の細胞と組換えプラス
ミド、又は対照のベクターは１３７mM ＮａＣｌ、５mM
ＫＣｌ、０．７mM Ｎａ2 ＨＰＯ4 、６mM デキスト
ロースを含む０．８mlの２０mM ヘペスバッファー、ｐ
Ｈ７．０５中に懸濁され、電圧２５０Ｖ／０．４cm、キ
ャパシタンス９６０μＦＤで処理を行った。形質転換
後、２日間培養を行い、細胞を集め、ＰＢＳ中で超音波
破砕を行い、破砕液中のＧｎＴ−III 活性を測定した。
プラスミド無処理の細胞、対照のプラスミドｐＳＶＫ３
処理の細胞にはＧｎＴ−III 活性は認められないのに対
し、プラスミドＥＸ２０Ｆで形質転換した細胞ではＧｎ
Ｔ−III 活性が認められヒトＧｎＴ−III 遺伝子が発現
していた。つまり、ＥＸ２０Ｆに組込まれ、その塩基配
列の一部が配列表の配列番号１で示されるＤＮＡ断片上
にヒトＧｎＴ−III をコードする遺伝子が存在すること
を確認した。
【００２０】（３）ＧｎＴ−III 活性の測定 ビオキミカ エ ビオフィジカ アクタ（ Biochimica
et Biophysica Acta )第１０３５巻、第３１３〜３１８
頁（１９９０）に記載の様に、８０μＭのピリジルアミ
ノ（ＰＡ）化Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ〔 GlcNAc β１−２Man
α１−６（ GlcNAc β１−２Man α１−３）Man β１−
４ GlcNAc β１−４ GlcNAc −ＰＡ〕を受容体とし、１
０mM ＭｎＣｌ2 、２００mM GlcNAc 、０．５％（ｖ
／ｖ）トリトンＸ１００を含む１２５mM ２−（Ｎ−モ
ルホリノ）エタンスルホン酸バッファー（ＭＥＳバッフ
ァー、ｐＨ６．２５）溶液に、最終濃度８０μＭになる
ように糖供与体であるＵＤＰ− GlcNAc を加え、３７℃
１時間反応を行った後、ＨＰＬＣにて分析し、ＧｎＴ−
III 活性を測定した。
et Biophysica Acta )第１０３５巻、第３１３〜３１８
頁（１９９０）に記載の様に、８０μＭのピリジルアミ
ノ（ＰＡ）化Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ〔 GlcNAc β１−２Man
α１−６（ GlcNAc β１−２Man α１−３）Man β１−
４ GlcNAc β１−４ GlcNAc −ＰＡ〕を受容体とし、１
０mM ＭｎＣｌ2 、２００mM GlcNAc 、０．５％（ｖ
／ｖ）トリトンＸ１００を含む１２５mM ２−（Ｎ−モ
ルホリノ）エタンスルホン酸バッファー（ＭＥＳバッフ
ァー、ｐＨ６．２５）溶液に、最終濃度８０μＭになる
ように糖供与体であるＵＤＰ− GlcNAc を加え、３７℃
１時間反応を行った後、ＨＰＬＣにて分析し、ＧｎＴ−
III 活性を測定した。
【００２１】
【発明の効果】本発明によって、生体内で重要な役割を
有するヒトＧｎＴ−III の遺伝子及び該酵素の工業的製
造方法が提供された。該遺伝子及び酵素は生化学、診断
等の分野で有用である。
有するヒトＧｎＴ−III の遺伝子及び該酵素の工業的製
造方法が提供された。該遺伝子及び酵素は生化学、診断
等の分野で有用である。
配列番号：１ 配列の長さ：2246 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： CCGGCTGCGA TGCCGGGCGC CCGCCGCAGC CGCTGCCGCC GGAGCCCGGG ATGGGGCGAG 60 AGGCTGCGGC GGACGCCAGC ATCTCCCCGC CGGGGACCCC GGGGGCCGCG GAGCCGCCGC 120 CGCCGCTGCT GCCGCCGTTG CTGAGACCCA GCGGGCGATG GGATGAAGAT GAGACGCTAC 180 AAGCTCTTTC TCATGTTCTG TATGGCCGGC CTGTGCCTCA TCTCCTTCCT GCACTTCTTC 240 AAGACCCTGT CCTATGTCAC CTTCCCCCGA GAACTGGCCT CCCTCAGCCC TAACCTGGTG 300 TCCAGCTTTT TCTGGAACAA TGCCCCGGTC ACGCCCCAGG CCAGCCCCGA GCCAGGAGGC 360 CCTGACCTGC TGCGTACCCC ACTCTACTCC CACTCGCCCC TGCTGCAGCC GCTGCCGCCC 420 AGCAAGGCGG CCGAGGAGCT CCACCGGGTG GACTTGGTGC TGCCCGAGGA CACCACCGAG 480 TATTTCGTGC GCACCAAGGC CGGCGGCGTC TGCTTCAAAC CCGGCACCAA GATGCTGGAG 540 AGGCCGCCCC CGGGACGGCC GGAGGAGAAG CCTGAGGGGG CCAACGGCTC CTCGGCCCGG 600 CGGCCACCCC GGTACCTCCT GAGCGCCCGG GAGCGCACGG GGGGCCGAGG CGCCCGGCGC 660 AAGTGGGTGG AGTGCGTGTG CCTGCCCGGC TGGCACGGAC CCAGCTGCGG CGTGCCCACT 720 GTGGTGCAGT ACTCCAACCT GCCCACCAAG GAGCGGCTGG TGCCCAGGGA GGTGCCGCGC 780 CGCGTCATCA ACGCCATCAA CGTCAACCAC GAGTTCGACC TGCTGGACGT GCGCTTCCAC 840 GAGCTGGGCG ACGTGGTGGA CGCCTTTGTG GTGTGCGAGT CCAACTTCAC GGCTTATGGG 900 GAGCCGCGGC CGCTCAAGTT CCGGGAGATG CTGACCAATG GCACCTTCGA GTACATCCGC 960 CACAAGGTGC TCTATGTCTT CCTGGACCAC TTCCCGCCCG GCGGCCGGCA GGACGGCTGG 1020 ATCGCCGACG ACTACCTGCG CACCTTCCTC ACCCAGGACG GCGTCTCGCG GCTGCGCAAC 1080 CTGCGGCCCG ACGACGTCTT CATCATTGAC GATGCGGACG AGATCCCGGC CCGTGACGGC 1140 GTCCTTTTCC TCAAGCTCTA CGATGGCTGG ACCGAGCCCT TCGCCTTCCA CATGCGCACG 1200 TCGCTCTACG GCTTCTTCTG GAAGCAGCCG GGCACCCTGG AGGTGGTGTC AGGCTGCACG 1260 GTGGACATGC TGCAGGCAGT GTATGGGCTG GACGGCATCC GCCTGCGCCG CCGCCAGTAC 1320 TACACCATGC CCAACTTCAG ACAGTATGAG AACCGCACCG GCCACATCCT GGTGCAGTGG 1380 TCGCTGGGCA GCCCCCTGCA CTTCGCCGGC TGGCACTGCT CCTGGTGCTT CACGCCCGAG 1440 GGCATCTACT TCAAGCTCGT GTCCGCCCAG AATGGCGACT TCCCACGCTG GGGTGACTAC 1500 GAGGACAAGC GGGACCTGAA CTACATCCGC GGCCTGATCC GCACCGGGGG CTGGTTCGAC 1560 GGCACGCAGC AGGAGTACCC GCCTGCAGAC CCCAGCGAGC ACATGTATGC GCCCAAGTAC 1620 CTGCTGAAGA ACTACGACCG GTTCCACTAC CTGCTGGACA ACCCCTACCA GGAGCCCAGG 1680 AGCACGGCGG CGGGCGGGTG GCGCCACAGG GGTCCCGAGG GAAGGCCGCC CGCCCGGGGA 1740 AACTGGACGA GGCGGAAGTC TAGAGCTGCA TGATCTGATA GGGTTTGTGA CAGGGCGGGG 1800 GTGGCGGCGG CCCCTAGCGC TATCTCCCTG CCTCCTGCCG GCTCCTTGGT TCTTGAGGGG 1860 ACCAGGAGTG GGTGGGGAGT GGGGGTGGGG CTAGGGTTTC CCTACTGAAG CCCTTGTGAT 1920 CAAGGGTCAG GCCTTTGAGC TCAGAAAATA TCCCTCCTGT TGGGAGAGGG CGCAGGCCGT 1980 GACGTCTGGG TGGCCCTTAT GACTGCCAAG ACTGCTGTGG CCAGGAGGTG CCACTGGAGT 2040 GTGCGTGGTG GTCCCTGGGT AGCGGGGGAG GGTAGGCAGG ATTGGGGAAG AGAGCCTGCA 2100 GGATCTCACC AGGCAGCCTC TGGGGGGTGG CCAGGCCGGA AAAAGCCCAC CATTTGGCAT 2160 CCCTGGGCCT TGGGCTCCGT GTGGGAGACC GGCCTGCCAG GAGGACCCAG GGCTCTGTAA 2220 GTAGATGCAT TTGGGTCCAG GAGGAA 2246
【図１】ヒトＧｎＴ−III をコードする遺伝子の制限酵
素地図を示す図である。
素地図を示す図である。
【図２】４種のＤＮＡ、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ１５、Ｈ２０の
関係を示す図である。
関係を示す図である。
【図３】プラスミドＥＸ２０Ｆの構築を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/54 ZNA C12N 5/10 C12N 9/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 下記（ａ）〜（ｄ）に記載の遺伝子から
選択され、かつ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：
β−Ｄ−マンノシドβｌ−４Ｎ−アセチルグルコサミニ
ルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を有することを特徴と
するヒト糖転移酵素をコードする遺伝子。 （ａ）配列表の配列番号１の塩基番号１６９〜１７７０
番目で示される塩基配列を有する遺伝子、 （ｂ）配列表の配列番号１の塩基番号１６９〜１７７０
番目で示される塩基配列において、１個又は複数個の塩
基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つが
なされている遺伝子、 （ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子に厳密な条
件下でハイブリダイズする遺伝子、 （ｄ）上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に記載の遺伝子を
含んでなる遺伝子。 - 【請求項２】 請求項１に記載の遺伝子を含有すること
を特徴とする組換えベクター。 - 【請求項３】 請求項２に記載の組換えベクターを導入
させた形質転換体を培養し、該培養物からヒト糖転移酵
素を採取することを特徴とするヒト糖転移酵素の製造方
法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4243984A JP2789283B2 (ja) | 1992-08-21 | 1992-08-21 | ヒト糖転移酵素遺伝子 |
| EP19930306628 EP0585083B1 (en) | 1992-08-21 | 1993-08-20 | Human glycosyltransferase gene |
| DE1993601018 DE69301018T2 (de) | 1992-08-21 | 1993-08-20 | Menschliches Glycosyltransferase Gen |
| US08/524,828 US5874271A (en) | 1992-08-21 | 1995-09-07 | Human glycosyltransferase gene, compounds and method for inhibiting cancerous metastasis |
| US08/975,114 US5876714A (en) | 1992-08-21 | 1997-11-20 | Human glycosyltransferase gene, compounds and method for inhibiting cancerous metastasis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4243984A JP2789283B2 (ja) | 1992-08-21 | 1992-08-21 | ヒト糖転移酵素遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0662865A JPH0662865A (ja) | 1994-03-08 |
| JP2789283B2 true JP2789283B2 (ja) | 1998-08-20 |
Family
ID=17111982
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4243984A Expired - Fee Related JP2789283B2 (ja) | 1992-08-21 | 1992-08-21 | ヒト糖転移酵素遺伝子 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0585083B1 (ja) |
| JP (1) | JP2789283B2 (ja) |
| DE (1) | DE69301018T2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2204980T3 (es) * | 1995-06-30 | 2004-05-01 | Takara Bio Inc. | Nuevo promotor y metodo de expresion de genes que lo utiliza. |
| JP3606536B2 (ja) * | 1995-11-17 | 2005-01-05 | タカラバイオ株式会社 | ウイルス複製抑制剤 |
| JP4246264B2 (ja) * | 1996-12-12 | 2009-04-02 | 協和発酵キリン株式会社 | 新規β１→４Ｎ―アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、それをコードする遺伝子 |
| AU2002226062A1 (en) * | 2000-11-20 | 2002-05-27 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 47169 and 33935, novel glycosyl transferases and uses therefor |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU8941191A (en) * | 1990-11-30 | 1992-06-25 | Hsc Research And Development Limited Partnership | Cloning of udp-n-acetylglucosamine:alpha-3-d-mannoside beta -1,2-n-acetylglucosaminyltransferase i |
-
1992
- 1992-08-21 JP JP4243984A patent/JP2789283B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-08-20 DE DE1993601018 patent/DE69301018T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-20 EP EP19930306628 patent/EP0585083B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0662865A (ja) | 1994-03-08 |
| EP0585083B1 (en) | 1995-12-13 |
| DE69301018T2 (de) | 1996-06-05 |
| DE69301018D1 (de) | 1996-01-25 |
| EP0585083A1 (en) | 1994-03-02 |
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