JP3606536B2 - ウイルス複製抑制剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、肝臓又はその周辺組織の特定の酵素活性を増強させることによって、Ｂ型肝炎ウイルスの複製を抑制する薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウイルスはウイルス膜に糖タンパク質や糖脂質を持っている。糖脂質は宿主細胞の細胞膜由来であるが、糖タンパク質のタンパク質部分はウイルス特異的な遺伝子産物である。糖鎖は宿主細胞のゴルジ装置内でタンパク質部分に付加されるが、この過程で用いられる酵素系はウイルスのものではなく、宿主細胞の持つ酵素系が用いられる。例えば後天性免疫不全症候群、いわゆるエイズはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と呼ばれる一種のレトロウイルスがＣＤ４分子を発現している細胞に主に感染し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を激減させる疾患であるが、ＨＩＶの感染においてはウイルスエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０分子が重要な役割を果たしている。このｇｐ１２０分子は重量にしてその約半分が糖鎖によって占められており、これらの糖鎖のＨＩＶ感染過程における重要性について様々な報告がされている。例えば糖鎖を欠いたｇｐ１２０分子はＣＤ４との結合能を失うことが示されている。またＨＩＶ感染細胞は未感染細胞と共に培養すると合胞体が形成されるが、ｇｐ１２０分子の添加はこの合胞体形成を阻害するのに対し、糖鎖を欠いたｇｐ１２０分子を添加しても阻害は起こらないことも示されている。ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のエンベロープを構成していると考えられているＥ１及びＥ２は共に糖タンパク質であり、共にその糖鎖の末端にシアル酸残基を持たず、末端にＮ−アセチルグルコサミン残基を持つものが少数あることからＨＣＶが肝実質細胞上のアシアロ糖タンパク質リセプター、あるいは肝内皮細胞やマクロファージに見出されるマンノース結合タンパク質を介して肝臓に感染する可能性が示されている。更に、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）はその粒子表面にＨＢｓ抗原と呼ばれる糖タンパク質を有しており、これらのタンパクは２本のアスパラギン結合型糖鎖を持っている。これらの糖鎖はウイルスの複製、輸送、分泌の各過程において、重要な役割を果たしていることが示されている。
現在までに、このようなウイルス糖タンパク質の糖鎖に着目した抗ウイルス剤の可能性が幾つか示されている。例えばツニカマイシン等のＮ−グリコシド型糖鎖プロセッシング酵素の阻害剤の存在下で培養されたＨＩＶ感染細胞には合胞体形成能やウイルス感染能がなくなることが示されている。例えばイミノ糖であるＮ−ブチルデオキシノジリマイシンによってヒトＢ型肝炎ウイルスの分泌を抑制した例が報告されている〔プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ）、第９１巻、第２２３５〜２２３９頁（１９９４）〕。
しかしながら、このような糖鎖プロセッシング阻害剤による処理は宿主細胞の糖鎖合成をかく乱させるため、当然宿主細胞の糖タンパク質の糖鎖構造も多大な影響を受けることになり、安全性の点で決して満足できるものではない。
ところで、本発明者らは細胞表層糖鎖の構造変化に関する研究過程でこれまでにラット及びヒトのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ （以下、ＧｎＴ−ＩＩＩ と略す）遺伝子を獲得することに成功している（特開平６−３８７６７号、同６−６２８６５号各公報）。この酵素はアスパラギン結合型糖鎖のＧｌｃＮＡｃβ１−４Ｍａｎβ１ 構造、いわゆるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを生成する。
既に本発明者らは、肝炎及び肝癌を自然発症するＬＥＣラットを用いた実験系において、肝炎発症時期である第３ステージでＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（以下、ＧｎＴ−Ｖと略す）の活性が、また肝臓に癌組織がマクロ的に観察される第４ステージでＧｎＴ−ＩＩＩ 活性が、コントロールラットであるＬＦＡに比べて著しく上昇することを見出している。また、このＧｎＴ−ＩＩＩ は正常な肝臓にはほとんど発現していないが、ラット化学発癌過程の癌部位や前癌病変部位、腹水肝癌由来細胞、胎児肝、再生肝等において活性が上昇することを見出している。また、ヒトの肝炎、肝硬変、肝癌組織、あるいはこれら肝疾患患者の血清中の酵素発現量が上昇することが本発明者らによって報告されている〔バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケイションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、第１５２巻、第１０７〜１１２頁（１９８８）；クリニカ キミカ アクタ（Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ）、第１８５巻、第３２５〜３３２頁（１９８９）〕。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
既に述べたように、ウイルス感染細胞において糖転移酵素の活性が変化することは知られているが、これらの現象を作用点としてウイルスの複製を抑制し、ウイルス性疾患を治療する方法は開発されていない。
したがって、本発明の目的は、肝臓又はその周辺組織の特定の酵素活性を増強させることによって、Ｂ型肝炎ウイルスの複製を抑制する薬剤を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を抑制することができるＢ型肝炎ウイルス複製抑制剤に関する発明であって、ＧｎＴ−III又はその遺伝子を有効成分とすることを特徴とする。
【０００５】
本発明者らはウイルスの感染と糖転移酵素活性との関係について鋭意研究を重ねた結果、従来、肝疾患のステージの進行度と酵素活性が正の相関を持つと報告されていたＧｎＴ−ＩＩＩ をＢ型肝炎ウイルス感染細胞に導入すると、意外なことにその細胞におけるＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を抑制することができるという驚くべき事実を発見し、本発明を完成するに至ったものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本明細書において、ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を有するポリペプチドとは、天然型のＧｎＴ−ＩＩＩ のみならず、ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を有する限り天然型のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、付加、挿入、置換等によりアミノ酸配列が改変されたポリペプチドをも本発明に含む意味である。
また、ここで言う天然型ＧｎＴ−ＩＩＩ としては、例えばヒト又はラット由来のものが挙げられるが、本発明においてはこれに限定されるものではなく、他の動物、植物等の生物体由来のもの、あるいは細菌類、酵母類、放線菌類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来のものも含まれる。
【０００７】
また、本明細書において、機能的に同等の活性を有するポリペプチドとは、以下のようなものをいう。
天然に存在するタンパク質にはそれをコードする遺伝子の多形や変異のほかに、生成後のタンパク質の生体内及び精製中の修飾反応などによって、そのアミノ酸配列中にアミノ酸の欠失、挿入、付加、置換等の変異が起こりうるが、それにも関わらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に差異があっても、その機能については大きな違いが認められないものを機能的に同等の活性を有するポリペプチドと呼ぶ。
人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合でも同様であり、この場合は更に多種多様の変異体を作製することが可能であるが、変異を有しないものと実質的に同等の生理活性を示す限り、これらの変異体は機能的に同等の活性を有するポリペプチドと解釈される。
例えば、大腸菌で発現されたタンパク質のＮ末端に存在するメチオニン残基は、多くの場合、メチオニンアミノペプチダーゼの作用により除去されるとされているが、タンパク質の種類によってはメチオニン残基を持つもの、持たないものの両方が生成される。しかしながら、このメチオニン残基の有無はタンパク質の活性に影響を与えない場合が多い。また、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２２４巻、第１４３１頁（１９８４）〕。
更に、遺伝子工学的にタンパク質の生産を行う際には、融合タンパク質として発現させることがしばしば行われる。例えば、目的のタンパク質の発現量を増加させるために、目的のタンパク質のＮ末端に他のタンパク質由来のＮ末端ペプチド鎖を付加したり、目的のタンパク質のＮ末端、あるいはＣ末端に適当なペプチド鎖を付加して発現させ、この付加したペプチド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより、目的のタンパク質の精製を容易にすることなどが行われている。
また、遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組合せ）は、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在することが知られている。したがって、アミノ酸配列をコードする遺伝子はそのアミノ酸配列にもよるが、多数存在することができる。遺伝子は自然界において決して安定に存在しているものではなく、その核酸に変異が起こることはまれではない。遺伝子上に起こった変異がコードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる遺伝子が生じたといえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子ができていく可能性は否定できない。
【０００８】
更に、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。
例えば、遺伝子工学的なタンパク質生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが、使用している宿主中では使用頻度の低いものであった場合、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合には、コードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的のタンパク質の高発現を図ることが行われている。このように特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子を、人為的に多種類作製することが可能なことは言うまでもない。したがって、これらの人為的に作製された異なるポリペプチドであっても、本発明に開示されたアミノ酸配列がコードされている限り、本発明に包含されるものである。
更に、目的のタンパク質のアミノ酸配列に１個若しくは複数個のアミノ酸残基を欠失、付加、挿入、若しくは置換の少なくとも１つを行ったポリペプチドも目的のタンパク質と機能的に同等の活性を有する場合が少なくないが、このようなポリペプチドをコードする遺伝子も、天然のものであれ人為的に作製されたものであれ、本発明に包含される。
一般に、機能的に同等の活性を有するポリペプチドは、それをコードする遺伝子が相同性を有することが多い。したがって、本発明に用いる遺伝子とハイブリダイズすることができ、ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子も本発明に含まれる。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明においては、Ｂ型肝炎ウイルス感染細胞にＧｎＴ−ＩＩＩ を導入することによってその目的を達成することができる。ＧｎＴ−ＩＩＩ を導入するには、例えばマイクロインジェクション法などによってＧｎＴ−ＩＩＩ を活性を保持したままでＢ型肝炎ウイルス感染細胞に直接導入してもよいし、また例えばウイルス等を使ってＧｎＴ−ＩＩＩ 遺伝子をＢ型肝炎ウイルス感染細胞へ導入し、ＧｎＴ−ＩＩＩ を発現させることによって本発明の目的を達成することができる。
すなわち、本発明の薬剤を用いればＧｎＴ−ＩＩＩ 又はＧｎＴ−ＩＩＩ をコードする遺伝子をウイルス感染細胞又はその周辺組織に導入することができ、ウイルスの複製を抑制することができる。ＧｎＴ−ＩＩＩ 又はＧｎＴ−ＩＩＩ をコードする遺伝子は組織表面の患部には直接注入すればよい。また組織内部の患部にも直接注入することもできるがドラッグデリバリーシステムを応用してもよい。ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）としては、ウイルス感染細胞に特異的なシステムであれば良い。
【００１０】
本発明のＧｎＴ−ＩＩＩ 又はその遺伝子を有効成分とする薬剤をウイルス感染細胞又はその周辺組織に使用する場合、上記薬剤が最も効率よく効果を発揮するようにするのは当然のことである。
本発明のウイルス複製抑制剤はＧｎＴ−ＩＩＩ 、又はその遺伝子を医薬として許容される範囲で含有していれば良く、通常の遺伝子治療剤、タンパク質含有剤と同様に製剤化することができ、製剤中には担体、賦形剤、安定化剤等が含まれていても良い。
本発明のウイルス複製抑制剤として用いられるＧｎＴ−ＩＩＩ 、又はその遺伝子の用量は年齢、体重等の患者の状態、患部の程度などを考慮した上で調整すれば良い。
本発明のウイルス複製抑制剤に含有されるＧｎＴ−ＩＩＩ 、又はその遺伝子は生体内物質であり、毒性はない。
【００１１】
本発明で用いられるＧｎＴ−ＩＩＩ については、既にその詳細な酵素化学的性質が明らかにされており、例えばラット腎臓から表１に示す工程により調製することができる。
【００１２】
【表１】
【００１３】
〔表中Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ−ＡｓｎはＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎの略である。ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性はバイオキミカ エ バイオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ）、第１０３５巻、第３号、第３１３〜３１８頁（１９９０）に記載の方法に準じ、８０μＭの蛍光基質を用いて測定し、酵素の比活性は、転移されたＧｌｃＮＡｃ（ｍｏｌ）／タンパク質（ｍｇ）／時間（ｈ）で表し、ピリジル（−２−）アミノ化ＧｌｃＮＡｃを標準物質として使用した。タンパク質は血清アルブミンを標準物質として、ＢＣＡキット（ピアス社製）を用いて測定した〕
【００１４】
また、その遺伝子は、例えばヒト胎児肝ｃＤＮＡライブラリーから井原らの方法〔ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）、第１１３巻、第６９２〜６９８頁（１９９３）〕によって得ることができる。また、例えばラット腎臓のｃＤＮＡライブラリーから西河らの方法〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）、第２６７巻、第１８１９９〜１８２０４頁（１９９２）〕によって得られる遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルス複製抑制の研究における適切な実験材料となりうる。
また、例えば、ラットＧｎＴ−ＩＩＩ については、特開平６−３８７６７号公報に記載の方法で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されているＦＥＲＭ ＢＰ−４３５２を用いて調製することができる。
また、例えばヒトＧｎＴ−ＩＩＩ については、特開平６−６２８６５号公報に記載の方法によって調製することができる。
【００１５】
配列表の配列番号１にラットＧｎＴ−ＩＩＩ をコードする遺伝子のＤＮＡ配列、及びそのアミノ酸配列を示す。また配列表の配列番号２にヒトＧｎＴ−ＩＩＩ をコードする遺伝子のＤＮＡ配列及びそのアミノ酸配列を示す。これらの遺伝子をプローブとして用いることにより、該遺伝子にハイブリダイズし、ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を示すタンパク質をコードする遺伝子を調製することができる。また配列表の配列番号１又は２で表される遺伝子を遺伝子工学的な置換、変異、切断処理等を行うことによっても、更には配列表の配列番号１又は２で表される遺伝子にハイブリダイズし、かつ、ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を示すタンパク質をコードする遺伝子を調製することができる。
これらの遺伝子、及び該遺伝子の発現タンパク質も本発明の薬剤として使用することができる。
【００１６】
遺伝子そのものを用いて本発明の薬剤のＧｎＴ−ＩＩＩ を細胞に導入する場合、例えばＧｎＴ−ＩＩＩ 遺伝子とこれに関係する調節遺伝子を持つ組換えベクターを使用することで簡単にＧｎＴ−ＩＩＩ 遺伝子を導入することができる。このようにＧｎＴ−ＩＩＩ そのもののプロモーター以外にも、もちろん他の有効なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス由来ＬＴＲプロモーター、ヒートショックプロモーター、メタロチオネインプロモーター、アクチンプロモーター等を使用することができる。
ＧｎＴ−ＩＩＩ 遺伝子の導入に際しては、ウイルスベクターを使って当該遺伝子を含むベクターを効率よくＢ型肝炎ウイルス未感染細胞あるいは感染細胞に導入させることによって本発明の目的を達成することができる。これらのベクターとしては、従来から目的のＤＮＡを細胞に輸送することが知られておりかつ感染効率の高いレトロウイルスやワクシニアウイルス、更には非増殖性組換えウイルス等を用いることができる。特に、非増殖性組換えウイルスは、目的の細胞等に導入後、この組換えウイルスは増殖しないため２週間から２カ月ごとに毎回用いる必要はあるが、その際に量の調節を行えるという利点もある。また、人工の脂質カプセルであるリポソームを用いることができる。
【００１７】
本発明の薬剤として望ましいベクターの構築方法としては次に示すような方法が挙げられる。ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ のｃＤＮＡを熊本大学の山村研一博士から供与されたｐＣＡＧＧＳベクターのＥｃｏＲＩサイトに導入し、アクチンプロモーターで制御されるＧｎＴ−ＩＩＩ の発現ベクターを作製することができる。
図１にｐＣＡＧＧＳベクターの制限酵素地図を示す。
【００１８】
ウイルスの複製に関しては、例えば処理された細胞が培地中に産生するウイルス関連抗原であるＨＢｓ抗原、あるいはＨＢｅ抗原の量を測定することによって、その複製の程度を知ることができる。すなわち、、先に述べたＧｎＴ−ＩＩＩ の発現ベクターをＳａｌＩで直線化したＤＮＡとｐＭＥＰ〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、ハイグロマイシン耐性遺伝子を持つベクター〕をＢａｍＨＩで直線化したＤＮＡを混合し、前述のＨｕｈ−６細胞にＨＢＶゲノム遺伝子をタンデムに組込んだ細胞であるＨＢ６１１細胞〔プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８４巻、第４４４〜４４８頁（１９８７）〕にエレクトロポレーション法にて導入する。その後、ハイグロマイシンを含む培地で培養し耐性細胞株をスクリーニングする。こうして得られるＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を発現している細胞株数株を選び、ＨＢｓ抗原あるいはＨＢｅ抗原の量を測定する。
ＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原の量の測定は、例えばラジオイムノアッセイ法で本発明者らが報告している方法〔インターナショナル ジャーナル オブ キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ）、第５２巻、第１３７〜１４０頁（１９９２）〕に従って測定することができる。
【００１９】
また、ウイルス関連のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量を測定することによってもウイルスの複製に関する情報を得ることができる。すなわち、３２ＰでラベルしたウイルスｃＤＮＡをプローブとしてノーザンブロットハイブリダイゼーション法によりウイルス関連のメッセンジャーＲＮＡの量を評価することができる。
【００２０】
以上、本発明者らはＧｎＴ−ＩＩＩ 遺伝子を導入した細胞でのウイルスタンパク質の発現をＧｎＴ−ＩＩＩ 遺伝子を導入していない細胞と比較したところ、ＨＢＶを組込んだＨＢ６１１細胞にＧｎＴ−ＩＩＩ 遺伝子を導入した細胞では明らかにそのウイルス関連タンパク質の発現が低下していることを見出し、本発明を完成した。
本発明の薬剤は、ウイルス性疾患を治療する分野において有用である。
【００２１】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
〔発現ベクターの構築及び細胞への導入〕
ラットＧｎＴ−ＩＩＩ のコーディング領域全長を含むｃＤＮＡクローンＣ４〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、第１８１９９〜１８２０４頁（１９９２）〕をＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化後、ｐＣＡＧＧＳベクター（熊本大学の山村研一博士から供与された）のＥｃｏＲＩサイトにクローニングした。図１にｐＣＡＧＧＳベクターの制限酵素地図を示す。
このようにして構築した発現プラスミドをＧｎＴ−ＩＩＩ 発現プラスミドＡｃｔ−５と命名した。このＧｎＴ−ＩＩＩ 発現プラスミドＡｃｔ−５において、ＧｎＴ−ＩＩＩ の発現はアクチンプロモーターによる制御を受けることになる。図２にＧｎＴ−ＩＩＩ 発現プラスミドＡｃｔ−５の模式図を示す。図中、上段の太実線（黒）はラットＧｎＴ−ＩＩＩ のｃＤＮＡを示し、下段はｐＣＡＧＧＳベクター（図１）を示す。また、下段の縦縞の入っている箇所はアクチンプロモーターを、斜線縞の入っている箇所はＳＶ４０ｏｒｉを示す。
このＧｎＴ−ＩＩＩ 発現プラスミドＡｃｔ−５とｐＭＥＰベクター（インヴィトロジェン社製、ハイグロマイシン耐性遺伝子を持つベクター）をそれぞれＳａｌＩ（宝酒造社製）とＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化し直線化した後、ＧｎＴ−ＩＩＩ 発現プラスミドＡｃｔ−５を２０μｇとｐＭＥＰベクター２μｇを混合し、５×１０５ 個のＨＢ６１１細胞にジーンパルサー（バイオラッド社製；電圧、２５０Ｖ／０．４ｃｍ；静電容量、９６０μＦ）を用いたエレクトロポレーション法によって導入した。なお、ＨＢ６１１細胞はヒト肝芽細胞腫由来Ｈｕｈ−６細胞にＨＢＶゲノム遺伝子をタンデムに組込んだ細胞〔プロシーディングズ オブザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８４巻、第４４４〜４４８頁（１９８７）〕であり、大阪大学、細胞工学センターの松原謙一博士から供与された物である。
遺伝子導入細胞の選抜はハイグロマイシン（５００μｇ／ｍｌ）を含む培地で行い、耐性細胞株を希釈法によってクローン化した。その結果ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を持つ細胞株を３株、ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を持たない株を３株得た。 ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を持つ細胞（ＧｎＴ−ＩＩＩ ポジティブ細胞）株をＨＢ６１１−ＧＮＴ−ＩＩＩ （１）、ＨＢ６１１−ＧＮＴ−ＩＩＩ （２）、ＨＢ６１１−ＧＮＴ−ＩＩＩ （３）と命名し、ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を持たない細胞（ＧｎＴ−ＩＩＩ ネガティブ細胞）株をＨＢ６１１−ｈｙｇｒｏ（１）、ＨＢ６１１−ｈｙｇｒｏ（２）、ＨＢ６１１−ｈｙｇｒｏ（３）と命名した。
【００２３】
〔細胞のＧｎＴ−ＩＩＩ 及びＧｎＴ−Ｖの酵素活性〕
コンフルエント状態にある細胞約５−１０×１０６ 個を集め、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、同溶液０．２ｍｌに懸濁し、超音波処理を行った。各酵素活性はこの超音波破砕液を酵素液と、２−アミノピリジンで蛍光標識された糖鎖を基質として〔アナリチカル バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）、第１７０巻、第３４９〜３５４頁（１９８８）、メソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）、第１７９巻、第３９７〜４０８頁（１９８５）、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６５巻、第６００９〜６０１８頁（１９９０）〕に記載の方法に従って細胞中のＧｎＴ−ＩＩＩ 、ＧｎＴ−ＩＶ、ＧｎＴ−Ｖの活性を各細胞につき、３回ずつ測定した。
その結果を表２に示す。
【００２４】
【表２】
【００２５】
表中、＊は統計学的処理をステューデンツｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）で行った結果を示しており、ＨＢ６１１細胞に対してｐ＜０．０１である。ｐ＜０．０１とは、ＨＢ６１１に対して同じである可能性が０．０１以下であることを示している。
表２に示すようにＧｎＴ−ＩＩＩ 活性はＧｎＴ−ＩＩＩ ポジティブ細胞で親株の約８〜１０倍に迄上昇している。ＧｎＴ−ＩＶ及びＧｎＴ−Ｖの活性は親株及び形質転換株の間でほとんど変わらなかった。
【００２６】
次に、ＧｎＴ−ＩＩＩのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量をモレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ほか著、第７章、第３９〜５２頁、コールド スプリングハーバー ラボラトリー社、１９８９年発行に記載の方法を用いて、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを行った。ＨＢ６１１細胞及び上記で得た６種類の細胞におけるＧｎＴ−ＩＩＩのｍＲＮＡの量を比較した結果、ＧｎＴ−ＩＩＩポジティブ細胞ではＧｎＴ−ＩＩＩは高発現であった。
【００２７】
〔ＨＢＶ複製の評価〕
ＨＢ６１１細胞におけるＨＢＶ関連タンパク質発現量の評価を行うため、培地中のＨＢｓ抗原量及びＨＢｅ抗原量をラジオイムノアッセイキット（大塚アッセイ研究所製）を用いて本発明者らが既に報告している方法〔インターナショナルジャーナル オブ キャンサー、第５２巻、第１３７〜１４０頁（１９９２）〕に従って測定した。ＨＢ６１１細胞及び形質転換細胞を０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳでプレートからはがし、細胞数を計測した。ＨＢｓ抗原量及びＨＢｅ抗原量は細胞１個当りの相対単位で表した。なお、形質転換細胞は、ＧｎＴ−ＩＩＩ ポジティブ細胞（ＨＢ６１１−ＧｎＴ−ＩＩＩ ）及びＧｎＴ−ＩＩＩ ネガティブ細胞（ＨＢ６１１−ｈｙｇｒｏ）で行った。
その結果を表３に示す。
【００２８】
【表３】
【００２９】
表中、＊は統計学的処理をステューデンツｔ検定で行った結果を示しており、ＨＢ６１１−ｈｙｇｒｏ細胞に対してｐ＜０．０２である。
表３に示すように、ＧｎＴ−ＩＩＩ ポジティブ細胞の培地中のＨＢｓ抗原量及びＨＢｅ抗原量はＧｎＴ−ＩＩＩ ネガティブ細胞や親株に比べて明らかに減少していた。
【００３０】
次に、ＨＢＶ関連ｍＲＮＡの発現量を３２ＰでラベルしたＨＢＶ全ｃＤＮＡをプローブとして、モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニュアル、第２版、Ｔ．マニアティスほか著、第７章、第３９〜５２頁、コールド スプリングハーバー ラボラトリー社、１９８９年発行に記載の方法を用いて、ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって評価した。ＨＢ６１１細胞及び上記で得た６種類の細胞におけるＨＢＶ関連ｍＲＮＡの発現量を、ＨＢＶ）β−アクチン、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の量で比較した結果、ＧｎＴ−ＩＩＩポジティブ細胞はＧｎＴ−ＩＩＩネガティブ細胞や親株に比べて明らかにＨＢＶ関連ｍＲＮＡの発現量も抑制されていることがわかった。
【００３１】
一方、同様にして、ＨＢ６１１細胞及び上記で得た６種類の細胞におけるアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン、プレアルブミンタンパク質のｍＲＮＡの発現量を測定した。
その結果、どの細胞においてもＡＦＰ）アルブミン、プレアルブミンタンパク質のｍＲＮＡの発現量はＧｎＴ−ＩＩＩ活性のレベルとは相関がなかった。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によって、ウイルス感染細胞又はその周囲組織のＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を増強させる、ＧｎＴ−ＩＩＩ 又はその遺伝子を有効成分とすることを特徴とするウイルス複製抑制剤が提供された。該ウイルス複製抑制剤はウイルス性疾患の治療の分野で有用である。
【００３３】
【配列表】
【００３４】
【００３５】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＣＡＧＧＳべクターの制限酵素地図を示す図である。
【図２】ＧｎＴ−ＩＩＩ発現プラスミドＡｃｔ−５の模式図を示す図である。
【発明の属する分野】
本発明は、肝臓又はその周辺組織の特定の酵素活性を増強させることによって、Ｂ型肝炎ウイルスの複製を抑制する薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウイルスはウイルス膜に糖タンパク質や糖脂質を持っている。糖脂質は宿主細胞の細胞膜由来であるが、糖タンパク質のタンパク質部分はウイルス特異的な遺伝子産物である。糖鎖は宿主細胞のゴルジ装置内でタンパク質部分に付加されるが、この過程で用いられる酵素系はウイルスのものではなく、宿主細胞の持つ酵素系が用いられる。例えば後天性免疫不全症候群、いわゆるエイズはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と呼ばれる一種のレトロウイルスがＣＤ４分子を発現している細胞に主に感染し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を激減させる疾患であるが、ＨＩＶの感染においてはウイルスエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０分子が重要な役割を果たしている。このｇｐ１２０分子は重量にしてその約半分が糖鎖によって占められており、これらの糖鎖のＨＩＶ感染過程における重要性について様々な報告がされている。例えば糖鎖を欠いたｇｐ１２０分子はＣＤ４との結合能を失うことが示されている。またＨＩＶ感染細胞は未感染細胞と共に培養すると合胞体が形成されるが、ｇｐ１２０分子の添加はこの合胞体形成を阻害するのに対し、糖鎖を欠いたｇｐ１２０分子を添加しても阻害は起こらないことも示されている。ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のエンベロープを構成していると考えられているＥ１及びＥ２は共に糖タンパク質であり、共にその糖鎖の末端にシアル酸残基を持たず、末端にＮ−アセチルグルコサミン残基を持つものが少数あることからＨＣＶが肝実質細胞上のアシアロ糖タンパク質リセプター、あるいは肝内皮細胞やマクロファージに見出されるマンノース結合タンパク質を介して肝臓に感染する可能性が示されている。更に、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）はその粒子表面にＨＢｓ抗原と呼ばれる糖タンパク質を有しており、これらのタンパクは２本のアスパラギン結合型糖鎖を持っている。これらの糖鎖はウイルスの複製、輸送、分泌の各過程において、重要な役割を果たしていることが示されている。
現在までに、このようなウイルス糖タンパク質の糖鎖に着目した抗ウイルス剤の可能性が幾つか示されている。例えばツニカマイシン等のＮ−グリコシド型糖鎖プロセッシング酵素の阻害剤の存在下で培養されたＨＩＶ感染細胞には合胞体形成能やウイルス感染能がなくなることが示されている。例えばイミノ糖であるＮ−ブチルデオキシノジリマイシンによってヒトＢ型肝炎ウイルスの分泌を抑制した例が報告されている〔プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ）、第９１巻、第２２３５〜２２３９頁（１９９４）〕。
しかしながら、このような糖鎖プロセッシング阻害剤による処理は宿主細胞の糖鎖合成をかく乱させるため、当然宿主細胞の糖タンパク質の糖鎖構造も多大な影響を受けることになり、安全性の点で決して満足できるものではない。
ところで、本発明者らは細胞表層糖鎖の構造変化に関する研究過程でこれまでにラット及びヒトのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ （以下、ＧｎＴ−ＩＩＩ と略す）遺伝子を獲得することに成功している（特開平６−３８７６７号、同６−６２８６５号各公報）。この酵素はアスパラギン結合型糖鎖のＧｌｃＮＡｃβ１−４Ｍａｎβ１ 構造、いわゆるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを生成する。
既に本発明者らは、肝炎及び肝癌を自然発症するＬＥＣラットを用いた実験系において、肝炎発症時期である第３ステージでＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（以下、ＧｎＴ−Ｖと略す）の活性が、また肝臓に癌組織がマクロ的に観察される第４ステージでＧｎＴ−ＩＩＩ 活性が、コントロールラットであるＬＦＡに比べて著しく上昇することを見出している。また、このＧｎＴ−ＩＩＩ は正常な肝臓にはほとんど発現していないが、ラット化学発癌過程の癌部位や前癌病変部位、腹水肝癌由来細胞、胎児肝、再生肝等において活性が上昇することを見出している。また、ヒトの肝炎、肝硬変、肝癌組織、あるいはこれら肝疾患患者の血清中の酵素発現量が上昇することが本発明者らによって報告されている〔バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケイションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、第１５２巻、第１０７〜１１２頁（１９８８）；クリニカ キミカ アクタ（Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ）、第１８５巻、第３２５〜３３２頁（１９８９）〕。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
既に述べたように、ウイルス感染細胞において糖転移酵素の活性が変化することは知られているが、これらの現象を作用点としてウイルスの複製を抑制し、ウイルス性疾患を治療する方法は開発されていない。
したがって、本発明の目的は、肝臓又はその周辺組織の特定の酵素活性を増強させることによって、Ｂ型肝炎ウイルスの複製を抑制する薬剤を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を抑制することができるＢ型肝炎ウイルス複製抑制剤に関する発明であって、ＧｎＴ−III又はその遺伝子を有効成分とすることを特徴とする。
【０００５】
本発明者らはウイルスの感染と糖転移酵素活性との関係について鋭意研究を重ねた結果、従来、肝疾患のステージの進行度と酵素活性が正の相関を持つと報告されていたＧｎＴ−ＩＩＩ をＢ型肝炎ウイルス感染細胞に導入すると、意外なことにその細胞におけるＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を抑制することができるという驚くべき事実を発見し、本発明を完成するに至ったものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本明細書において、ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を有するポリペプチドとは、天然型のＧｎＴ−ＩＩＩ のみならず、ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を有する限り天然型のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、付加、挿入、置換等によりアミノ酸配列が改変されたポリペプチドをも本発明に含む意味である。
また、ここで言う天然型ＧｎＴ−ＩＩＩ としては、例えばヒト又はラット由来のものが挙げられるが、本発明においてはこれに限定されるものではなく、他の動物、植物等の生物体由来のもの、あるいは細菌類、酵母類、放線菌類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来のものも含まれる。
【０００７】
また、本明細書において、機能的に同等の活性を有するポリペプチドとは、以下のようなものをいう。
天然に存在するタンパク質にはそれをコードする遺伝子の多形や変異のほかに、生成後のタンパク質の生体内及び精製中の修飾反応などによって、そのアミノ酸配列中にアミノ酸の欠失、挿入、付加、置換等の変異が起こりうるが、それにも関わらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に差異があっても、その機能については大きな違いが認められないものを機能的に同等の活性を有するポリペプチドと呼ぶ。
人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合でも同様であり、この場合は更に多種多様の変異体を作製することが可能であるが、変異を有しないものと実質的に同等の生理活性を示す限り、これらの変異体は機能的に同等の活性を有するポリペプチドと解釈される。
例えば、大腸菌で発現されたタンパク質のＮ末端に存在するメチオニン残基は、多くの場合、メチオニンアミノペプチダーゼの作用により除去されるとされているが、タンパク質の種類によってはメチオニン残基を持つもの、持たないものの両方が生成される。しかしながら、このメチオニン残基の有無はタンパク質の活性に影響を与えない場合が多い。また、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２２４巻、第１４３１頁（１９８４）〕。
更に、遺伝子工学的にタンパク質の生産を行う際には、融合タンパク質として発現させることがしばしば行われる。例えば、目的のタンパク質の発現量を増加させるために、目的のタンパク質のＮ末端に他のタンパク質由来のＮ末端ペプチド鎖を付加したり、目的のタンパク質のＮ末端、あるいはＣ末端に適当なペプチド鎖を付加して発現させ、この付加したペプチド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより、目的のタンパク質の精製を容易にすることなどが行われている。
また、遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組合せ）は、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在することが知られている。したがって、アミノ酸配列をコードする遺伝子はそのアミノ酸配列にもよるが、多数存在することができる。遺伝子は自然界において決して安定に存在しているものではなく、その核酸に変異が起こることはまれではない。遺伝子上に起こった変異がコードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる遺伝子が生じたといえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子ができていく可能性は否定できない。
【０００８】
更に、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。
例えば、遺伝子工学的なタンパク質生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが、使用している宿主中では使用頻度の低いものであった場合、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合には、コードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的のタンパク質の高発現を図ることが行われている。このように特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子を、人為的に多種類作製することが可能なことは言うまでもない。したがって、これらの人為的に作製された異なるポリペプチドであっても、本発明に開示されたアミノ酸配列がコードされている限り、本発明に包含されるものである。
更に、目的のタンパク質のアミノ酸配列に１個若しくは複数個のアミノ酸残基を欠失、付加、挿入、若しくは置換の少なくとも１つを行ったポリペプチドも目的のタンパク質と機能的に同等の活性を有する場合が少なくないが、このようなポリペプチドをコードする遺伝子も、天然のものであれ人為的に作製されたものであれ、本発明に包含される。
一般に、機能的に同等の活性を有するポリペプチドは、それをコードする遺伝子が相同性を有することが多い。したがって、本発明に用いる遺伝子とハイブリダイズすることができ、ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子も本発明に含まれる。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明においては、Ｂ型肝炎ウイルス感染細胞にＧｎＴ−ＩＩＩ を導入することによってその目的を達成することができる。ＧｎＴ−ＩＩＩ を導入するには、例えばマイクロインジェクション法などによってＧｎＴ−ＩＩＩ を活性を保持したままでＢ型肝炎ウイルス感染細胞に直接導入してもよいし、また例えばウイルス等を使ってＧｎＴ−ＩＩＩ 遺伝子をＢ型肝炎ウイルス感染細胞へ導入し、ＧｎＴ−ＩＩＩ を発現させることによって本発明の目的を達成することができる。
すなわち、本発明の薬剤を用いればＧｎＴ−ＩＩＩ 又はＧｎＴ−ＩＩＩ をコードする遺伝子をウイルス感染細胞又はその周辺組織に導入することができ、ウイルスの複製を抑制することができる。ＧｎＴ−ＩＩＩ 又はＧｎＴ−ＩＩＩ をコードする遺伝子は組織表面の患部には直接注入すればよい。また組織内部の患部にも直接注入することもできるがドラッグデリバリーシステムを応用してもよい。ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）としては、ウイルス感染細胞に特異的なシステムであれば良い。
【００１０】
本発明のＧｎＴ−ＩＩＩ 又はその遺伝子を有効成分とする薬剤をウイルス感染細胞又はその周辺組織に使用する場合、上記薬剤が最も効率よく効果を発揮するようにするのは当然のことである。
本発明のウイルス複製抑制剤はＧｎＴ−ＩＩＩ 、又はその遺伝子を医薬として許容される範囲で含有していれば良く、通常の遺伝子治療剤、タンパク質含有剤と同様に製剤化することができ、製剤中には担体、賦形剤、安定化剤等が含まれていても良い。
本発明のウイルス複製抑制剤として用いられるＧｎＴ−ＩＩＩ 、又はその遺伝子の用量は年齢、体重等の患者の状態、患部の程度などを考慮した上で調整すれば良い。
本発明のウイルス複製抑制剤に含有されるＧｎＴ−ＩＩＩ 、又はその遺伝子は生体内物質であり、毒性はない。
【００１１】
本発明で用いられるＧｎＴ−ＩＩＩ については、既にその詳細な酵素化学的性質が明らかにされており、例えばラット腎臓から表１に示す工程により調製することができる。
【００１２】
【表１】
〔表中Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ−ＡｓｎはＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎの略である。ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性はバイオキミカ エ バイオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ）、第１０３５巻、第３号、第３１３〜３１８頁（１９９０）に記載の方法に準じ、８０μＭの蛍光基質を用いて測定し、酵素の比活性は、転移されたＧｌｃＮＡｃ（ｍｏｌ）／タンパク質（ｍｇ）／時間（ｈ）で表し、ピリジル（−２−）アミノ化ＧｌｃＮＡｃを標準物質として使用した。タンパク質は血清アルブミンを標準物質として、ＢＣＡキット（ピアス社製）を用いて測定した〕
【００１４】
また、その遺伝子は、例えばヒト胎児肝ｃＤＮＡライブラリーから井原らの方法〔ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）、第１１３巻、第６９２〜６９８頁（１９９３）〕によって得ることができる。また、例えばラット腎臓のｃＤＮＡライブラリーから西河らの方法〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）、第２６７巻、第１８１９９〜１８２０４頁（１９９２）〕によって得られる遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルス複製抑制の研究における適切な実験材料となりうる。
また、例えば、ラットＧｎＴ−ＩＩＩ については、特開平６−３８７６７号公報に記載の方法で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されているＦＥＲＭ ＢＰ−４３５２を用いて調製することができる。
また、例えばヒトＧｎＴ−ＩＩＩ については、特開平６−６２８６５号公報に記載の方法によって調製することができる。
【００１５】
配列表の配列番号１にラットＧｎＴ−ＩＩＩ をコードする遺伝子のＤＮＡ配列、及びそのアミノ酸配列を示す。また配列表の配列番号２にヒトＧｎＴ−ＩＩＩ をコードする遺伝子のＤＮＡ配列及びそのアミノ酸配列を示す。これらの遺伝子をプローブとして用いることにより、該遺伝子にハイブリダイズし、ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を示すタンパク質をコードする遺伝子を調製することができる。また配列表の配列番号１又は２で表される遺伝子を遺伝子工学的な置換、変異、切断処理等を行うことによっても、更には配列表の配列番号１又は２で表される遺伝子にハイブリダイズし、かつ、ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を示すタンパク質をコードする遺伝子を調製することができる。
これらの遺伝子、及び該遺伝子の発現タンパク質も本発明の薬剤として使用することができる。
【００１６】
遺伝子そのものを用いて本発明の薬剤のＧｎＴ−ＩＩＩ を細胞に導入する場合、例えばＧｎＴ−ＩＩＩ 遺伝子とこれに関係する調節遺伝子を持つ組換えベクターを使用することで簡単にＧｎＴ−ＩＩＩ 遺伝子を導入することができる。このようにＧｎＴ−ＩＩＩ そのもののプロモーター以外にも、もちろん他の有効なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス由来ＬＴＲプロモーター、ヒートショックプロモーター、メタロチオネインプロモーター、アクチンプロモーター等を使用することができる。
ＧｎＴ−ＩＩＩ 遺伝子の導入に際しては、ウイルスベクターを使って当該遺伝子を含むベクターを効率よくＢ型肝炎ウイルス未感染細胞あるいは感染細胞に導入させることによって本発明の目的を達成することができる。これらのベクターとしては、従来から目的のＤＮＡを細胞に輸送することが知られておりかつ感染効率の高いレトロウイルスやワクシニアウイルス、更には非増殖性組換えウイルス等を用いることができる。特に、非増殖性組換えウイルスは、目的の細胞等に導入後、この組換えウイルスは増殖しないため２週間から２カ月ごとに毎回用いる必要はあるが、その際に量の調節を行えるという利点もある。また、人工の脂質カプセルであるリポソームを用いることができる。
【００１７】
本発明の薬剤として望ましいベクターの構築方法としては次に示すような方法が挙げられる。ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ のｃＤＮＡを熊本大学の山村研一博士から供与されたｐＣＡＧＧＳベクターのＥｃｏＲＩサイトに導入し、アクチンプロモーターで制御されるＧｎＴ−ＩＩＩ の発現ベクターを作製することができる。
図１にｐＣＡＧＧＳベクターの制限酵素地図を示す。
【００１８】
ウイルスの複製に関しては、例えば処理された細胞が培地中に産生するウイルス関連抗原であるＨＢｓ抗原、あるいはＨＢｅ抗原の量を測定することによって、その複製の程度を知ることができる。すなわち、、先に述べたＧｎＴ−ＩＩＩ の発現ベクターをＳａｌＩで直線化したＤＮＡとｐＭＥＰ〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、ハイグロマイシン耐性遺伝子を持つベクター〕をＢａｍＨＩで直線化したＤＮＡを混合し、前述のＨｕｈ−６細胞にＨＢＶゲノム遺伝子をタンデムに組込んだ細胞であるＨＢ６１１細胞〔プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８４巻、第４４４〜４４８頁（１９８７）〕にエレクトロポレーション法にて導入する。その後、ハイグロマイシンを含む培地で培養し耐性細胞株をスクリーニングする。こうして得られるＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を発現している細胞株数株を選び、ＨＢｓ抗原あるいはＨＢｅ抗原の量を測定する。
ＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原の量の測定は、例えばラジオイムノアッセイ法で本発明者らが報告している方法〔インターナショナル ジャーナル オブ キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ）、第５２巻、第１３７〜１４０頁（１９９２）〕に従って測定することができる。
【００１９】
また、ウイルス関連のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量を測定することによってもウイルスの複製に関する情報を得ることができる。すなわち、３２ＰでラベルしたウイルスｃＤＮＡをプローブとしてノーザンブロットハイブリダイゼーション法によりウイルス関連のメッセンジャーＲＮＡの量を評価することができる。
【００２０】
以上、本発明者らはＧｎＴ−ＩＩＩ 遺伝子を導入した細胞でのウイルスタンパク質の発現をＧｎＴ−ＩＩＩ 遺伝子を導入していない細胞と比較したところ、ＨＢＶを組込んだＨＢ６１１細胞にＧｎＴ−ＩＩＩ 遺伝子を導入した細胞では明らかにそのウイルス関連タンパク質の発現が低下していることを見出し、本発明を完成した。
本発明の薬剤は、ウイルス性疾患を治療する分野において有用である。
【００２１】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
〔発現ベクターの構築及び細胞への導入〕
ラットＧｎＴ−ＩＩＩ のコーディング領域全長を含むｃＤＮＡクローンＣ４〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、第１８１９９〜１８２０４頁（１９９２）〕をＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化後、ｐＣＡＧＧＳベクター（熊本大学の山村研一博士から供与された）のＥｃｏＲＩサイトにクローニングした。図１にｐＣＡＧＧＳベクターの制限酵素地図を示す。
このようにして構築した発現プラスミドをＧｎＴ−ＩＩＩ 発現プラスミドＡｃｔ−５と命名した。このＧｎＴ−ＩＩＩ 発現プラスミドＡｃｔ−５において、ＧｎＴ−ＩＩＩ の発現はアクチンプロモーターによる制御を受けることになる。図２にＧｎＴ−ＩＩＩ 発現プラスミドＡｃｔ−５の模式図を示す。図中、上段の太実線（黒）はラットＧｎＴ−ＩＩＩ のｃＤＮＡを示し、下段はｐＣＡＧＧＳベクター（図１）を示す。また、下段の縦縞の入っている箇所はアクチンプロモーターを、斜線縞の入っている箇所はＳＶ４０ｏｒｉを示す。
このＧｎＴ−ＩＩＩ 発現プラスミドＡｃｔ−５とｐＭＥＰベクター（インヴィトロジェン社製、ハイグロマイシン耐性遺伝子を持つベクター）をそれぞれＳａｌＩ（宝酒造社製）とＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化し直線化した後、ＧｎＴ−ＩＩＩ 発現プラスミドＡｃｔ−５を２０μｇとｐＭＥＰベクター２μｇを混合し、５×１０５ 個のＨＢ６１１細胞にジーンパルサー（バイオラッド社製；電圧、２５０Ｖ／０．４ｃｍ；静電容量、９６０μＦ）を用いたエレクトロポレーション法によって導入した。なお、ＨＢ６１１細胞はヒト肝芽細胞腫由来Ｈｕｈ−６細胞にＨＢＶゲノム遺伝子をタンデムに組込んだ細胞〔プロシーディングズ オブザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８４巻、第４４４〜４４８頁（１９８７）〕であり、大阪大学、細胞工学センターの松原謙一博士から供与された物である。
遺伝子導入細胞の選抜はハイグロマイシン（５００μｇ／ｍｌ）を含む培地で行い、耐性細胞株を希釈法によってクローン化した。その結果ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を持つ細胞株を３株、ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を持たない株を３株得た。 ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を持つ細胞（ＧｎＴ−ＩＩＩ ポジティブ細胞）株をＨＢ６１１−ＧＮＴ−ＩＩＩ （１）、ＨＢ６１１−ＧＮＴ−ＩＩＩ （２）、ＨＢ６１１−ＧＮＴ−ＩＩＩ （３）と命名し、ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を持たない細胞（ＧｎＴ−ＩＩＩ ネガティブ細胞）株をＨＢ６１１−ｈｙｇｒｏ（１）、ＨＢ６１１−ｈｙｇｒｏ（２）、ＨＢ６１１−ｈｙｇｒｏ（３）と命名した。
【００２３】
〔細胞のＧｎＴ−ＩＩＩ 及びＧｎＴ−Ｖの酵素活性〕
コンフルエント状態にある細胞約５−１０×１０６ 個を集め、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、同溶液０．２ｍｌに懸濁し、超音波処理を行った。各酵素活性はこの超音波破砕液を酵素液と、２−アミノピリジンで蛍光標識された糖鎖を基質として〔アナリチカル バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）、第１７０巻、第３４９〜３５４頁（１９８８）、メソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）、第１７９巻、第３９７〜４０８頁（１９８５）、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６５巻、第６００９〜６０１８頁（１９９０）〕に記載の方法に従って細胞中のＧｎＴ−ＩＩＩ 、ＧｎＴ−ＩＶ、ＧｎＴ−Ｖの活性を各細胞につき、３回ずつ測定した。
その結果を表２に示す。
【００２４】
【表２】
表中、＊は統計学的処理をステューデンツｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）で行った結果を示しており、ＨＢ６１１細胞に対してｐ＜０．０１である。ｐ＜０．０１とは、ＨＢ６１１に対して同じである可能性が０．０１以下であることを示している。
表２に示すようにＧｎＴ−ＩＩＩ 活性はＧｎＴ−ＩＩＩ ポジティブ細胞で親株の約８〜１０倍に迄上昇している。ＧｎＴ−ＩＶ及びＧｎＴ−Ｖの活性は親株及び形質転換株の間でほとんど変わらなかった。
【００２６】
次に、ＧｎＴ−ＩＩＩのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量をモレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ほか著、第７章、第３９〜５２頁、コールド スプリングハーバー ラボラトリー社、１９８９年発行に記載の方法を用いて、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを行った。ＨＢ６１１細胞及び上記で得た６種類の細胞におけるＧｎＴ−ＩＩＩのｍＲＮＡの量を比較した結果、ＧｎＴ−ＩＩＩポジティブ細胞ではＧｎＴ−ＩＩＩは高発現であった。
【００２７】
〔ＨＢＶ複製の評価〕
ＨＢ６１１細胞におけるＨＢＶ関連タンパク質発現量の評価を行うため、培地中のＨＢｓ抗原量及びＨＢｅ抗原量をラジオイムノアッセイキット（大塚アッセイ研究所製）を用いて本発明者らが既に報告している方法〔インターナショナルジャーナル オブ キャンサー、第５２巻、第１３７〜１４０頁（１９９２）〕に従って測定した。ＨＢ６１１細胞及び形質転換細胞を０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳでプレートからはがし、細胞数を計測した。ＨＢｓ抗原量及びＨＢｅ抗原量は細胞１個当りの相対単位で表した。なお、形質転換細胞は、ＧｎＴ−ＩＩＩ ポジティブ細胞（ＨＢ６１１−ＧｎＴ−ＩＩＩ ）及びＧｎＴ−ＩＩＩ ネガティブ細胞（ＨＢ６１１−ｈｙｇｒｏ）で行った。
その結果を表３に示す。
【００２８】
【表３】
表中、＊は統計学的処理をステューデンツｔ検定で行った結果を示しており、ＨＢ６１１−ｈｙｇｒｏ細胞に対してｐ＜０．０２である。
表３に示すように、ＧｎＴ−ＩＩＩ ポジティブ細胞の培地中のＨＢｓ抗原量及びＨＢｅ抗原量はＧｎＴ−ＩＩＩ ネガティブ細胞や親株に比べて明らかに減少していた。
【００３０】
次に、ＨＢＶ関連ｍＲＮＡの発現量を３２ＰでラベルしたＨＢＶ全ｃＤＮＡをプローブとして、モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニュアル、第２版、Ｔ．マニアティスほか著、第７章、第３９〜５２頁、コールド スプリングハーバー ラボラトリー社、１９８９年発行に記載の方法を用いて、ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって評価した。ＨＢ６１１細胞及び上記で得た６種類の細胞におけるＨＢＶ関連ｍＲＮＡの発現量を、ＨＢＶ）β−アクチン、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の量で比較した結果、ＧｎＴ−ＩＩＩポジティブ細胞はＧｎＴ−ＩＩＩネガティブ細胞や親株に比べて明らかにＨＢＶ関連ｍＲＮＡの発現量も抑制されていることがわかった。
【００３１】
一方、同様にして、ＨＢ６１１細胞及び上記で得た６種類の細胞におけるアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン、プレアルブミンタンパク質のｍＲＮＡの発現量を測定した。
その結果、どの細胞においてもＡＦＰ）アルブミン、プレアルブミンタンパク質のｍＲＮＡの発現量はＧｎＴ−ＩＩＩ活性のレベルとは相関がなかった。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によって、ウイルス感染細胞又はその周囲組織のＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を増強させる、ＧｎＴ−ＩＩＩ 又はその遺伝子を有効成分とすることを特徴とするウイルス複製抑制剤が提供された。該ウイルス複製抑制剤はウイルス性疾患の治療の分野で有用である。
【００３３】
【配列表】
【００３４】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＣＡＧＧＳべクターの制限酵素地図を示す図である。
【図２】ＧｎＴ−ＩＩＩ発現プラスミドＡｃｔ−５の模式図を示す図である。
Claims (7)
- Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII又はその遺伝子を有効成分とすることを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を抑制することがで
きるＢ型肝炎ウイルス複製抑制剤。 - 請求項１記載の遺伝子が配列表の配列番号１又は２で表される配列を含む遺伝子である請求項１記載のＢ型肝炎ウイルス複製抑制剤。
- 請求項１記載の遺伝子が配列表の配列番号１又は２で表される遺伝子にハイブリダイズし、かつ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性又はその機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子である請求項１記載のＢ型肝炎ウイルス複製抑制剤。
- 請求項２又は３に記載の遺伝子がベクターに組込まれていることを特徴とする請求項１記載のＢ型肝炎ウイルス複製抑制剤。
- ベクターがプラスミドベクターである請求項４記載のＢ型肝炎ウイルス複製抑制剤。
- ベクターがウイルスベクターである請求項４記載のＢ型肝炎ウイルス複製抑制剤。
- ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである請求項６記載のＢ型肝炎ウイルス複製抑制剤。
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