JP2537570B2 - エイズ及びその他のレトロウイルス病用ワクチンの遺伝子工学による製造 - Google Patents
エイズ及びその他のレトロウイルス病用ワクチンの遺伝子工学による製造Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、免疫原性を有し、かつ非病原性のヒトレト
ロウイルス様粒子、特にHIV様粒子調製物に関するもの
である。これらの調製物は、ヒトレトロウイルス病用の
完全ウイルス様ワクチンとして使用することができ、か
つ従来の感染性ウルスを用いた完全ウルスワクチン調製
物で問題となる倫理上の問題もない。
ロウイルス様粒子、特にHIV様粒子調製物に関するもの
である。これらの調製物は、ヒトレトロウイルス病用の
完全ウイルス様ワクチンとして使用することができ、か
つ従来の感染性ウルスを用いた完全ウルスワクチン調製
物で問題となる倫理上の問題もない。
背景技術 レトロウイルスに起因するヒト及び動物の疾病のう
ち、後天性免疫不全症候群（AIDS）及び成人性Ｔ−細胞
白血病リンパ腫（ATLL）は、それぞれHIV及びHTLV−１
レトロウイルスにより起こる最も典型的なヒトの疾病で
ある。後天性免疫不全症候群（AIDS）の病原は、ヒト免
疫不全ウイルス（HIV）と呼ばれるヒトレトロウイルス
であり、現在のところ主要な２小群、すなわちHIV−１
及びHIV−２が存在する。これらのウイルスは、緩慢
で、進行性の免疫及び中枢神経系機能の退化を特長と
し、現在でも広がりを見せている免疫不全及び中枢神経
系障害の世界的規模での流行に関与している。HIV−１
は主として北アメリカ、西ヨーロッパ、ハイチ及び中央
アフリカを襲い、HIV−２は主として西アフリカの諸国
で認められている。HIVの感染初期の症状は急性インフ
ルエンザ様症候群であり、２〜３週間持続する。感染後
数週間から数カ月、場合によっては数年経過して、リン
パ腺節疾患、進行性CD4+T−ヘルパーリンパ球減少また
はこれらの症状が併発し、病気の進展にともなって明瞭
な免疫不全が現われる。HIV感染の診断は、患者の血清
からHIVに特異的な抗体またはHIV抗原の検出、及び患者
の体液または細胞から感染ウイルスの分離等の臨床検査
により確認される。サル後天性免疫不全ウイルス（SI
V）に感染したアカゲザルでも同様な病気が認められて
いる。
ち、後天性免疫不全症候群（AIDS）及び成人性Ｔ−細胞
白血病リンパ腫（ATLL）は、それぞれHIV及びHTLV−１
レトロウイルスにより起こる最も典型的なヒトの疾病で
ある。後天性免疫不全症候群（AIDS）の病原は、ヒト免
疫不全ウイルス（HIV）と呼ばれるヒトレトロウイルス
であり、現在のところ主要な２小群、すなわちHIV−１
及びHIV−２が存在する。これらのウイルスは、緩慢
で、進行性の免疫及び中枢神経系機能の退化を特長と
し、現在でも広がりを見せている免疫不全及び中枢神経
系障害の世界的規模での流行に関与している。HIV−１
は主として北アメリカ、西ヨーロッパ、ハイチ及び中央
アフリカを襲い、HIV−２は主として西アフリカの諸国
で認められている。HIVの感染初期の症状は急性インフ
ルエンザ様症候群であり、２〜３週間持続する。感染後
数週間から数カ月、場合によっては数年経過して、リン
パ腺節疾患、進行性CD4+T−ヘルパーリンパ球減少また
はこれらの症状が併発し、病気の進展にともなって明瞭
な免疫不全が現われる。HIV感染の診断は、患者の血清
からHIVに特異的な抗体またはHIV抗原の検出、及び患者
の体液または細胞から感染ウイルスの分離等の臨床検査
により確認される。サル後天性免疫不全ウイルス（SI
V）に感染したアカゲザルでも同様な病気が認められて
いる。
HIV感染による免疫不全の特徴は、免疫不全を患って
いない患者では通常認められない微生物の副次感染がみ
られることである。これらのウイルス感染の症状は、ヘ
ルパーＴ−細胞機能の喪失によりますます悪化し、下痢
及び体重減少等の症状を併発したとき、一般的な消耗性
疾患症候群を呈する。通常、１種類または複数の副次感
染が起こったとき、死亡が起こる。上記の中枢神経系機
能の退化は、AIDSの特徴の別の側面であり、直接HIVに
より誘導される神経学的疾患であると同時に副次的感染
によっても起こりうる。
いない患者では通常認められない微生物の副次感染がみ
られることである。これらのウイルス感染の症状は、ヘ
ルパーＴ−細胞機能の喪失によりますます悪化し、下痢
及び体重減少等の症状を併発したとき、一般的な消耗性
疾患症候群を呈する。通常、１種類または複数の副次感
染が起こったとき、死亡が起こる。上記の中枢神経系機
能の退化は、AIDSの特徴の別の側面であり、直接HIVに
より誘導される神経学的疾患であると同時に副次的感染
によっても起こりうる。
HIV感染個体における主要なHIV宿主細胞は、CD4+T−
ヘルパー細胞及び単球／マクロファージである。しか
し、HIVはin vitro及びin vivoで多くの種類の細胞、
すなわちCD4+及びCD4-に感染を起こすことを示す多くの
証拠が得られている。これらの細胞には、造血系の細
胞、中枢神経系の細胞、消化管及び皮膚の細胞が含まれ
る。このように宿主細胞走性が広いことが、HIV感染に
関連した症状の多様性及び病気の重篤性の原因であると
思われる。
ヘルパー細胞及び単球／マクロファージである。しか
し、HIVはin vitro及びin vivoで多くの種類の細胞、
すなわちCD4+及びCD4-に感染を起こすことを示す多くの
証拠が得られている。これらの細胞には、造血系の細
胞、中枢神経系の細胞、消化管及び皮膚の細胞が含まれ
る。このように宿主細胞走性が広いことが、HIV感染に
関連した症状の多様性及び病気の重篤性の原因であると
思われる。
近年、ワクチン療法を含む多くの分野で、HIV−１及
び２について広範な、先例のない研究が行われている。
あらゆる感染性疾患を防止する上で最良の方法は感染の
防止であることが容易に理解できることから、HIVの感
染防止に有効なワクチンの開発はきわめて重要である。
び２について広範な、先例のない研究が行われている。
あらゆる感染性疾患を防止する上で最良の方法は感染の
防止であることが容易に理解できることから、HIVの感
染防止に有効なワクチンの開発はきわめて重要である。
AIDSに対して有効なワクチンを開発するために、現在
いくつかの方法が用いられている。これらの方法のいく
つかについて簡単に説明するとともに、それぞれの長所
及び欠点を以下に示す。
いくつかの方法が用いられている。これらの方法のいく
つかについて簡単に説明するとともに、それぞれの長所
及び欠点を以下に示す。
サブユニットHIVワクチンは１種類または数種の精製H
IV免疫原から成り、崩壊ウイルスから得られるか、遺伝
子工学により真核細胞または細菌の表現系で製造され
る。この種のワクチンの長所は製造法が簡単なことであ
る。しかし、このような長所があっても、サブユニット
ワクチンはHIV抗体の決定要素の一部しか含んでいない
ため、十分な免疫反応を示すことができない場合もあ
る。さらに、完全ウイルス粒子の構造から抽出する過程
で、ウイルスタンパクのサブユニットが異なった立体配
座に適応することも考えられる。そのため、重要な配座
エピトープの構造に影響を及ぼし、免疫反応の効率が低
下する。
IV免疫原から成り、崩壊ウイルスから得られるか、遺伝
子工学により真核細胞または細菌の表現系で製造され
る。この種のワクチンの長所は製造法が簡単なことであ
る。しかし、このような長所があっても、サブユニット
ワクチンはHIV抗体の決定要素の一部しか含んでいない
ため、十分な免疫反応を示すことができない場合もあ
る。さらに、完全ウイルス粒子の構造から抽出する過程
で、ウイルスタンパクのサブユニットが異なった立体配
座に適応することも考えられる。そのため、重要な配座
エピトープの構造に影響を及ぼし、免疫反応の効率が低
下する。
遺伝子組替え生ウイルスワクチンは、１種類または数
種類のHIV抗原をコード化したヌクレオチド配列で置換
された１種類また数種類の非不可欠遺伝子を有するワク
シニアまたはアデノウイルス等の非病原性ウイルスから
成る。遺伝子組替え生ウイルスは、特定の病原ウイルス
の単一サブユニットに対して、ほとんどの場合十分な免
疫反応を誘導することができる。しかし、遺伝子組替え
ウイルスワクチンは、サブユニットワクチンであるた
め、特定のウイルスの全体の抗原のうちの一部しか表現
できないことから、高度に効率的な免疫反応が要求され
るような場合には欠点となる。
種類のHIV抗原をコード化したヌクレオチド配列で置換
された１種類また数種類の非不可欠遺伝子を有するワク
シニアまたはアデノウイルス等の非病原性ウイルスから
成る。遺伝子組替え生ウイルスは、特定の病原ウイルス
の単一サブユニットに対して、ほとんどの場合十分な免
疫反応を誘導することができる。しかし、遺伝子組替え
ウイルスワクチンは、サブユニットワクチンであるた
め、特定のウイルスの全体の抗原のうちの一部しか表現
できないことから、高度に効率的な免疫反応が要求され
るような場合には欠点となる。
将来のワクチンは、特定の病原の複数のエピトープを
含む合成ペプチドから成るものと考えられる。これらの
ペプチドは、担体としてのタンパクと対にし、適当なア
ジュバントと組合せることにより、特定の病原の多数の
成分に対して、良好で、かつ持続性の長い体液及び細胞
の免疫反応を引き出す可能性を持っている。AIDSに対し
て有効な合成ペプチドを開発するためには、HIV−１及
びHIV−２の機能的に重要な免疫決定要素の全てを同定
する必要があり、このような仕事は数年のうちに完成す
るとは考えられない。ペプチドワクチンの最も大きな欠
点は、配座エピトープ（タンパク褶曲によりスペース内
に集められたアミノ酸残基間で形成される免疫決定要
素）を模した分子の合成が困難なことである。特定の感
染原に対する予防に配座エピトープが重要である場合、
従来のペプチドワクチンの設計が成功するとは考えられ
ない。
含む合成ペプチドから成るものと考えられる。これらの
ペプチドは、担体としてのタンパクと対にし、適当なア
ジュバントと組合せることにより、特定の病原の多数の
成分に対して、良好で、かつ持続性の長い体液及び細胞
の免疫反応を引き出す可能性を持っている。AIDSに対し
て有効な合成ペプチドを開発するためには、HIV−１及
びHIV−２の機能的に重要な免疫決定要素の全てを同定
する必要があり、このような仕事は数年のうちに完成す
るとは考えられない。ペプチドワクチンの最も大きな欠
点は、配座エピトープ（タンパク褶曲によりスペース内
に集められたアミノ酸残基間で形成される免疫決定要
素）を模した分子の合成が困難なことである。特定の感
染原に対する予防に配座エピトープが重要である場合、
従来のペプチドワクチンの設計が成功するとは考えられ
ない。
不活性化完全ウイルスワクチンは、化学的または物理
的手段により非感染性とした特定の病原ウイルスから抽
出した無傷の粒子を精製した調製物である。これらのワ
クチンの長所は、製造が比較的容易であり、ウイルスの
重要な免疫エピトープの全てまたはそのほとんどが存在
していることである。しかし、これらのワクチンの主な
欠点は、感染性ウイルスを多量に培養しなければならな
いため、病原ウイルスの性質によっては、製造従事者が
著しい危険に曝されることである。同様に重要なこと
は、ウイルスを完全に非感染性にしなければならないこ
とである。全ての感染性遺伝物質が完全に除去されたこ
とを実証することは困難であるため、これは倫理的な問
題を提起する。さらに、全ての感染性ウイルスを殺すよ
うな広範な不活性化処理を行えば、各種の免疫エピトー
プの破壊または変化をもたらし、そのためワクチンの免
疫原性を弱めることになる。
的手段により非感染性とした特定の病原ウイルスから抽
出した無傷の粒子を精製した調製物である。これらのワ
クチンの長所は、製造が比較的容易であり、ウイルスの
重要な免疫エピトープの全てまたはそのほとんどが存在
していることである。しかし、これらのワクチンの主な
欠点は、感染性ウイルスを多量に培養しなければならな
いため、病原ウイルスの性質によっては、製造従事者が
著しい危険に曝されることである。同様に重要なこと
は、ウイルスを完全に非感染性にしなければならないこ
とである。全ての感染性遺伝物質が完全に除去されたこ
とを実証することは困難であるため、これは倫理的な問
題を提起する。さらに、全ての感染性ウイルスを殺すよ
うな広範な不活性化処理を行えば、各種の免疫エピトー
プの破壊または変化をもたらし、そのためワクチンの免
疫原性を弱めることになる。
本発明は、AIDSに対して使用することができるヒトワ
クチンの基剤として、非感染性のレトロウイルス様粒子
の製造法について記載する。また本発明は、サル免疫不
全ウイルス（SIV）に起因するサル後天性免疫不全症候
群及びヒトＴ−細胞性白血病ウイルスＩ（HTLV）に起因
するある種のヒトＴ−細胞性白血病−リンパ腺のみなら
ず、全てのレトロウイルスに対するワクチンとして使用
できる同様な粒子の製造にも適用できる。
クチンの基剤として、非感染性のレトロウイルス様粒子
の製造法について記載する。また本発明は、サル免疫不
全ウイルス（SIV）に起因するサル後天性免疫不全症候
群及びヒトＴ−細胞性白血病ウイルスＩ（HTLV）に起因
するある種のヒトＴ−細胞性白血病−リンパ腺のみなら
ず、全てのレトロウイルスに対するワクチンとして使用
できる同様な粒子の製造にも適用できる。
このような性質を有する非感染性レトロウイルス様粒
子ワクチンは、感染性のRNAを全く含まず、かつ主要な
ウイルス抗原の全てまたはその大部分を元の配列のまま
の形で含む利点を有する。このようなワクチンの製造に
あたっては、必ずしも物理的または化学的不活性化を必
要とせず、したがって重要な免疫決定要素を破壊する恐
れがない。本発明に関するワクチンは感染や疾病を誘発
する危険性が全くなく、ウイルス本来のタンパクに対し
て強力な免疫反応を示すことができるため、動物モデル
またはヒトを用いた評価に使用することのできる重要な
新規ワクチンである。
子ワクチンは、感染性のRNAを全く含まず、かつ主要な
ウイルス抗原の全てまたはその大部分を元の配列のまま
の形で含む利点を有する。このようなワクチンの製造に
あたっては、必ずしも物理的または化学的不活性化を必
要とせず、したがって重要な免疫決定要素を破壊する恐
れがない。本発明に関するワクチンは感染や疾病を誘発
する危険性が全くなく、ウイルス本来のタンパクに対し
て強力な免疫反応を示すことができるため、動物モデル
またはヒトを用いた評価に使用することのできる重要な
新規ワクチンである。
発明の概略 本発明は、免疫原性を有し、かつ非感染性のヒトレト
ロウイルス様粒子、特にHIV様粒子の一般的な製造法を
記載する。ここで述べる遺伝子工学によるHIV様粒子調
製物はAIDSに対する「完全ウイルス」ワクチンとして使
用することができ、かつ従来の感染性ウイルス調製物を
用いた完全ウイルスワクチンの製造時に問題となる特異
的な倫理上の問題がない。ここでAIDSウイルスのために
開発した製造法は、全てのヒト及び動物のレトロウイル
スに適用することができ、かつAIDSウイルスに限らず、
またヒトの病原に限らず全てのレトロウイルス用ワクチ
ンの製造に使用することができる。さらに、レトロウイ
ルス病の診断免疫試験用の抗体として使用する非感染性
レトロウイルス粒子の製造にも適用することができる。
ここでは明快な説明をするため、AIDSウイルスを用いた
実施例に限ったが、本発明は全てのレトロウイルスに適
用することができる。
ロウイルス様粒子、特にHIV様粒子の一般的な製造法を
記載する。ここで述べる遺伝子工学によるHIV様粒子調
製物はAIDSに対する「完全ウイルス」ワクチンとして使
用することができ、かつ従来の感染性ウイルス調製物を
用いた完全ウイルスワクチンの製造時に問題となる特異
的な倫理上の問題がない。ここでAIDSウイルスのために
開発した製造法は、全てのヒト及び動物のレトロウイル
スに適用することができ、かつAIDSウイルスに限らず、
またヒトの病原に限らず全てのレトロウイルス用ワクチ
ンの製造に使用することができる。さらに、レトロウイ
ルス病の診断免疫試験用の抗体として使用する非感染性
レトロウイルス粒子の製造にも適用することができる。
ここでは明快な説明をするため、AIDSウイルスを用いた
実施例に限ったが、本発明は全てのレトロウイルスに適
用することができる。
本発明は、感染性レトロウイルスゲノムRNA分子を全
く生成することなく、自ら集合してウイルス様粒子を生
成するレトロウイルスタンパクを製造するための培養細
胞の遺伝子工学について記載する。ここでウイルス様粒
子は、ウイルスの生活環のある段階で重要な機能を司る
ウイルス遺伝子またはその他の遺伝エレメントの１カ所
以上を遺伝学的に修飾することにより宿主細胞に対する
感染性を欠く不完全ウイルス粒子と定義することができ
る。ウイルス様粒子は、感染性ウイルス粒子で通常認め
られるウイルスタンパクの全てを含んでもよいし、含ま
なくてもよい。また、RNAを含んでもよいし、含まなく
てもよい。RNAは粒子内に含まれていたとしても、宿主
細胞に対する感染性を有さない。
く生成することなく、自ら集合してウイルス様粒子を生
成するレトロウイルスタンパクを製造するための培養細
胞の遺伝子工学について記載する。ここでウイルス様粒
子は、ウイルスの生活環のある段階で重要な機能を司る
ウイルス遺伝子またはその他の遺伝エレメントの１カ所
以上を遺伝学的に修飾することにより宿主細胞に対する
感染性を欠く不完全ウイルス粒子と定義することができ
る。ウイルス様粒子は、感染性ウイルス粒子で通常認め
られるウイルスタンパクの全てを含んでもよいし、含ま
なくてもよい。また、RNAを含んでもよいし、含まなく
てもよい。RNAは粒子内に含まれていたとしても、宿主
細胞に対する感染性を有さない。
ここに示したHIVに関する実施例においては、非感染
性ウイルス様粒子の製造にあたり、関連したタンパクの
コード情報を含み、かつレトロウイルスゲノムの複製及
び転写に必要なゲノムエレメントを欠くHIVプロウイル
スからDNAフラグメントを分離する必要がある。このDNA
フラグメントは異種構造のプロモーターにリンクしてお
り、培養細胞系に形質移行（トランスフェクション）さ
せることによりHIV−１タンパクの発現及びウイルス様
粒子内でのその組み立てを可能にする。本発明の特徴は
以下に詳しく述べるが、本発明は化学的不活性化を必要
とせず、かつ病原レトロウイルスのワクチンとして使用
することのできるウイルス様粒子の調製から成るという
事実に中心をおく。さらに、本法は１種類またはそれ以
上のタンパクの修飾を含み、そのため粒子の免疫原性を
助長することのできる非感染性ウイルス様粒子の製造を
可能にするものである。したがって、得られたワクチン
は強力な免疫反応を刺激する上で必要な免疫エピトープ
の最適組合せを含むウイルス様粒子の完全な調製物を代
表するものである。
性ウイルス様粒子の製造にあたり、関連したタンパクの
コード情報を含み、かつレトロウイルスゲノムの複製及
び転写に必要なゲノムエレメントを欠くHIVプロウイル
スからDNAフラグメントを分離する必要がある。このDNA
フラグメントは異種構造のプロモーターにリンクしてお
り、培養細胞系に形質移行（トランスフェクション）さ
せることによりHIV−１タンパクの発現及びウイルス様
粒子内でのその組み立てを可能にする。本発明の特徴は
以下に詳しく述べるが、本発明は化学的不活性化を必要
とせず、かつ病原レトロウイルスのワクチンとして使用
することのできるウイルス様粒子の調製から成るという
事実に中心をおく。さらに、本法は１種類またはそれ以
上のタンパクの修飾を含み、そのため粒子の免疫原性を
助長することのできる非感染性ウイルス様粒子の製造を
可能にするものである。したがって、得られたワクチン
は強力な免疫反応を刺激する上で必要な免疫エピトープ
の最適組合せを含むウイルス様粒子の完全な調製物を代
表するものである。
遺伝子工学による非感染性HIV様粒子の完全性は、こ
れらの粒子の製造工程における遺伝子工学の段階により
保証される。複製に必要なウイルスの遺伝的エレメント
は除去され、製造に用いる細胞系に挿入するためにウイ
ルスのDNA配列に各種の遺伝子修飾を導入することがで
きる。このような突然変異はウイルスの感染性に必要な
遺伝子機能、遺伝子産物または遺伝子エレメントに影響
を及ぼすことはできても、粒子の組み立てまたは免疫原
性に必要な主要なウイルスタンパクの合成には関与しな
い。このような戦略を採用すれば、上記の非感染性粒子
の製造に利用する発現ベクターが感染性ウイルスを生産
しないことは、当該技術分野では自明の事実である。
れらの粒子の製造工程における遺伝子工学の段階により
保証される。複製に必要なウイルスの遺伝的エレメント
は除去され、製造に用いる細胞系に挿入するためにウイ
ルスのDNA配列に各種の遺伝子修飾を導入することがで
きる。このような突然変異はウイルスの感染性に必要な
遺伝子機能、遺伝子産物または遺伝子エレメントに影響
を及ぼすことはできても、粒子の組み立てまたは免疫原
性に必要な主要なウイルスタンパクの合成には関与しな
い。このような戦略を採用すれば、上記の非感染性粒子
の製造に利用する発現ベクターが感染性ウイルスを生産
しないことは、当該技術分野では自明の事実である。
安全で、非感染性のウイルス様粒子調製物を製造する
ための技術は、当該技術分野で公知の知識に基づくが、
ここではこの知識を独創的に応用し、感染性HIVウイル
スRNAまたは受容細胞中で二重螺旋構造DNAを複製するこ
とのできるRNAを欠く完全ウイルス様粒子を製造した。
われわれは、遺伝子工学に基づく細胞中で、感染性ゲノ
ムRNA分子を生産することなく、主要なHIV−１抗原を生
産するHIV抗原の発現系を開発した。われわれは、エン
ベロープと核抗原が共に発現することを実証し、これら
の産物がレトロウイルス様粒子中に組み込まれ、正常な
感染性HIV粒子調製物の精製に用いられる手段で精製で
きるという事実を提供した。さらに、これらの精製ウイ
ルス様粒子は、免疫獲得マウスにおいて効果的なHIV−
１特異性抗体反応及びHIV−２を含むその他のHIVと交差
反応性を誘導する。
ための技術は、当該技術分野で公知の知識に基づくが、
ここではこの知識を独創的に応用し、感染性HIVウイル
スRNAまたは受容細胞中で二重螺旋構造DNAを複製するこ
とのできるRNAを欠く完全ウイルス様粒子を製造した。
われわれは、遺伝子工学に基づく細胞中で、感染性ゲノ
ムRNA分子を生産することなく、主要なHIV−１抗原を生
産するHIV抗原の発現系を開発した。われわれは、エン
ベロープと核抗原が共に発現することを実証し、これら
の産物がレトロウイルス様粒子中に組み込まれ、正常な
感染性HIV粒子調製物の精製に用いられる手段で精製で
きるという事実を提供した。さらに、これらの精製ウイ
ルス様粒子は、免疫獲得マウスにおいて効果的なHIV−
１特異性抗体反応及びHIV−２を含むその他のHIVと交差
反応性を誘導する。
ここに記載したこれらの粒子を製造するにあたって使
用したHIV様粒子及び細胞系は、レトロウイルスゲノム
の培養細胞系に挿入に関する従来のレトロウイルス試験
に用いられているものとは著しく異なる。従来の実験で
は、外来遺伝子を運ぶ不完全レトロウイルスゲノムを封
入することのできるマウスレトロウイルスタンパクを発
現する細胞系の構築が用いられた。外来遺伝子を運ぶ不
完全レトロウイルスゲノムRNAをウイルス粒子に封入す
ることによって、受容細胞中にこれらのRNAを効果的に
導入することができる。これらの遺伝子組替えウイルス
RNAは、一旦受容細胞中に導入されると、二重螺旋構造D
NAに反転写され、細胞の染色体中に統合されることによ
って、受容細胞を遺伝学的に変換する。ここに記載した
発明では、ロング ターミナル リピート:long termin
al repeat（LTR）要因を欠くHIV−１発現ベクターを用
いることにより、遺伝子の変換を目的とした組替えレト
ロウイルスRNA分子の受容細胞への形質移行を意図せ
ず、ワクチンとしての使用を目的とした非感染性ウイル
ス様粒子を製造することができる。実際に、本発明にお
いてRNAのウイルス粒子中への封入は最小限とすること
ができ、かつ封入されたRNAは全く反転写の過程を行う
ことができない。したがって、本発明は、目的とした用
途、採用した方法及び得られた生産物の性質及び特性の
点で従来のレトロウイルスタンパク発現の研究とは異な
る。
用したHIV様粒子及び細胞系は、レトロウイルスゲノム
の培養細胞系に挿入に関する従来のレトロウイルス試験
に用いられているものとは著しく異なる。従来の実験で
は、外来遺伝子を運ぶ不完全レトロウイルスゲノムを封
入することのできるマウスレトロウイルスタンパクを発
現する細胞系の構築が用いられた。外来遺伝子を運ぶ不
完全レトロウイルスゲノムRNAをウイルス粒子に封入す
ることによって、受容細胞中にこれらのRNAを効果的に
導入することができる。これらの遺伝子組替えウイルス
RNAは、一旦受容細胞中に導入されると、二重螺旋構造D
NAに反転写され、細胞の染色体中に統合されることによ
って、受容細胞を遺伝学的に変換する。ここに記載した
発明では、ロング ターミナル リピート:long termin
al repeat（LTR）要因を欠くHIV−１発現ベクターを用
いることにより、遺伝子の変換を目的とした組替えレト
ロウイルスRNA分子の受容細胞への形質移行を意図せ
ず、ワクチンとしての使用を目的とした非感染性ウイル
ス様粒子を製造することができる。実際に、本発明にお
いてRNAのウイルス粒子中への封入は最小限とすること
ができ、かつ封入されたRNAは全く反転写の過程を行う
ことができない。したがって、本発明は、目的とした用
途、採用した方法及び得られた生産物の性質及び特性の
点で従来のレトロウイルスタンパク発現の研究とは異な
る。
上記のように、本発明の最終生産物は、粒子内に感染
性のレトロウイルスゲノムが存在しないことにより、非
感染性としたウイルス様粒子調製物である。さらに、本
発明は当該粒子の免疫原性及び免疫を獲得した受容体に
おけるワクチン効率を最適とするための遺伝子操作が可
能である。ウイルスタンパク成分をコード化したDNA配
列を変えることにより、遺伝子工学による粒子のある種
のウイルスタンパク成分に著しい変更を加えることがで
きるものと予想される。これらの変更として、粒子の組
み立てには決定的ではないが、さらに各種の重要な免疫
エピトープのコピーをウイルスタンパク部位に挿入する
ことが考えられる。また別の変更としては、免疫抑制効
果を有するタンパク、または自己免疫性障害または抗体
亢進をもたらすある種のタンパクの除去が考えられる。
このような変更にあたっては、粒子組み立ての妨害をさ
け、修飾粒子が最高の免疫反応を示すことができるよう
に設計することができる。また、本発明は特定の感染性
ウイルスの多数の系統から得た抗原または異なったウイ
ルスから得た全ての抗原を含む交雑ウイルス粒子の製造
にも適用できる。
性のレトロウイルスゲノムが存在しないことにより、非
感染性としたウイルス様粒子調製物である。さらに、本
発明は当該粒子の免疫原性及び免疫を獲得した受容体に
おけるワクチン効率を最適とするための遺伝子操作が可
能である。ウイルスタンパク成分をコード化したDNA配
列を変えることにより、遺伝子工学による粒子のある種
のウイルスタンパク成分に著しい変更を加えることがで
きるものと予想される。これらの変更として、粒子の組
み立てには決定的ではないが、さらに各種の重要な免疫
エピトープのコピーをウイルスタンパク部位に挿入する
ことが考えられる。また別の変更としては、免疫抑制効
果を有するタンパク、または自己免疫性障害または抗体
亢進をもたらすある種のタンパクの除去が考えられる。
このような変更にあたっては、粒子組み立ての妨害をさ
け、修飾粒子が最高の免疫反応を示すことができるよう
に設計することができる。また、本発明は特定の感染性
ウイルスの多数の系統から得た抗原または異なったウイ
ルスから得た全ての抗原を含む交雑ウイルス粒子の製造
にも適用できる。
要約すると、本発明はワクチンとして非感染性の組み
立てウイルス様粒子の製造を目的とし、正常または修飾
レトロウイルスタンパクの培養細胞系における発現を包
含する。本発明は、誘導可能かつ組み立て可能なプロモ
ーターを用いることにより、安定な遺伝子工学細胞系の
利用及び当該粒子を製造するための一方法の例を記載す
る。当然、ワクチンとして利用される非感染性レトロウ
イルス様粒子を発現させるための手段は、ここに記載し
た遺伝子工学の例のみに限らない。
立てウイルス様粒子の製造を目的とし、正常または修飾
レトロウイルスタンパクの培養細胞系における発現を包
含する。本発明は、誘導可能かつ組み立て可能なプロモ
ーターを用いることにより、安定な遺伝子工学細胞系の
利用及び当該粒子を製造するための一方法の例を記載す
る。当然、ワクチンとして利用される非感染性レトロウ
イルス様粒子を発現させるための手段は、ここに記載し
た遺伝子工学の例のみに限らない。
図面の簡単な説明 図１はHIV系プロウイルスLAV−1BRUの遺伝子地図であ
り、LTRSの相対的位置、主要なタンパクコード配列（ga
g,pol及びenv）及びその他の構造的または調整機能を有
するタンパク（vif,rev,vpu,vpr,tat及びnef）をコード
化した転写解読枠（オープン リーディング フレー
ム）を示す。
り、LTRSの相対的位置、主要なタンパクコード配列（ga
g,pol及びenv）及びその他の構造的または調整機能を有
するタンパク（vif,rev,vpu,vpr,tat及びnef）をコード
化した転写解読枠（オープン リーディング フレー
ム）を示す。
図２はHIV発現用構造体pHIV−SVの地図を示し、LAV−
1BRUゲノムからの8.3kbのSac I−Xho Iフラグメントを
含む。このフラグメントは、LTRエレメントを欠き、SV4
0ウイルス早期プロモーター及び後期ポリアデニル化部
位を含んだ発現ベクターに挿入されている。
1BRUゲノムからの8.3kbのSac I−Xho Iフラグメントを
含む。このフラグメントは、LTRエレメントを欠き、SV4
0ウイルス早期プロモーター及び後期ポリアデニル化部
位を含んだ発現ベクターに挿入されている。
図３はLAV−1BRUゲノムからの8.3kbのSac I−Xho Iフ
ラグメントを含むHIV発現用構造体pHIV−CHO−SVの地図
を示す。このフラグメントはLTRエレメントを欠き、ア
デノウイルス主動後期プロモーター、ヒトサイトメガロ
ウイルス直接早期エンハンサーのコピー２つ、SV40ウイ
ルス後期ポリアデニル化、及びSV40ウイルスのオリジン
または複製を含んだ発現ベクターに挿入されている。後
者のエレメントはサルのCOS細胞中で一時的に発現でき
るように挿入されている。
ラグメントを含むHIV発現用構造体pHIV−CHO−SVの地図
を示す。このフラグメントはLTRエレメントを欠き、ア
デノウイルス主動後期プロモーター、ヒトサイトメガロ
ウイルス直接早期エンハンサーのコピー２つ、SV40ウイ
ルス後期ポリアデニル化、及びSV40ウイルスのオリジン
または複製を含んだ発現ベクターに挿入されている。後
者のエレメントはサルのCOS細胞中で一時的に発現でき
るように挿入されている。
図４は一時的に形質移行を行ったCOS細胞中に発現し
たHIV−１様粒子のシュークローズ濃度勾配遠心分離の
プロファイルを示す。ウイルス粒子を含む画分はRT検定
で検出し、各画分の比重は比重計を用いて測定した。RT
活性のピークは比重が約1.16g/mlの画分で認められた。
たHIV−１様粒子のシュークローズ濃度勾配遠心分離の
プロファイルを示す。ウイルス粒子を含む画分はRT検定
で検出し、各画分の比重は比重計を用いて測定した。RT
活性のピークは比重が約1.16g/mlの画分で認められた。
図５はHIV発現プラスミドpHIV−ADの地図を示す。こ
のベクターは図３に示したpHIV−CHO−SVと類似である
が、DNAの複製によるSV40ウイルスオリジンを欠き、安
定的形質移行試験を目的としたものである。
のベクターは図３に示したpHIV−CHO−SVと類似である
が、DNAの複製によるSV40ウイルスオリジンを欠き、安
定的形質移行試験を目的としたものである。
図６は安定的な形質移行を行ったCOS細胞中に発現さ
れたHIV−１様粒子のシュークローズ濃度勾配遠心分離
のプロフィルを示す。ウイルス様粒子を含む画分はRT検
定により検出した。
れたHIV−１様粒子のシュークローズ濃度勾配遠心分離
のプロフィルを示す。ウイルス様粒子を含む画分はRT検
定により検出した。
図７は抗原特異性EIA′ｓで測定したときの４種類の
遺伝子組替えHIV−１抗原（gp120,gp160,gp41及びp24）
に対するIgG抗体の反応性を測定した代表例である。各
点の値は、ウイルス様粒子を２回注射して免疫を獲得さ
せた２匹のマウスから得た抗体血清の測定値の平均であ
る。対照として用いた正常マウスの血清について得られ
た吸光度は、常に0.1以下であった。
遺伝子組替えHIV−１抗原（gp120,gp160,gp41及びp24）
に対するIgG抗体の反応性を測定した代表例である。各
点の値は、ウイルス様粒子を２回注射して免疫を獲得さ
せた２匹のマウスから得た抗体血清の測定値の平均であ
る。対照として用いた正常マウスの血清について得られ
た吸光度は、常に0.1以下であった。
図８は抗原特異性EIA′ｓで測定したときの５種類の
遺伝子組替えHIV−１抗原（HIV−１ gp120,gp160,gp41
及びp24及びHIV−２ gp120）に対するIgG抗体の反応性
を測定した代表例である。各点の値は、ウイルス様粒子
を３回注射して免疫を獲得させた２匹のマウスから得た
抗体血清の測定値の平均である。対照として用いた正常
マウスの血清について得られた吸光度は、常に0.1以下
であった。
遺伝子組替えHIV−１抗原（HIV−１ gp120,gp160,gp41
及びp24及びHIV−２ gp120）に対するIgG抗体の反応性
を測定した代表例である。各点の値は、ウイルス様粒子
を３回注射して免疫を獲得させた２匹のマウスから得た
抗体血清の測定値の平均である。対照として用いた正常
マウスの血清について得られた吸光度は、常に0.1以下
であった。
図９は抗原特異性EIA′ｓで測定したときの３種類の
遺伝子組替えHIV−１抗原（HIV−１ gp160及びgp120及
びHIV−２ gp120）に対するIgG抗体の反応性を測定し
た代表例である。各点の値は、ウイルス様粒子を３回注
射して免疫を獲得させた２匹のマウスから得た抗体血清
の測定値の平均である。図８と比較して、HIV−１ rgp
160で強い免疫反応が認められた。ここで用いたHIV−１
rgp160は、図８で用いたrgp160（Repligen製）とは供
給元（Transgene）が異なる。対照として用いた正常マ
ウスの血清について得られた吸光度は、常に0.1以下で
あった。
遺伝子組替えHIV−１抗原（HIV−１ gp160及びgp120及
びHIV−２ gp120）に対するIgG抗体の反応性を測定し
た代表例である。各点の値は、ウイルス様粒子を３回注
射して免疫を獲得させた２匹のマウスから得た抗体血清
の測定値の平均である。図８と比較して、HIV−１ rgp
160で強い免疫反応が認められた。ここで用いたHIV−１
rgp160は、図８で用いたrgp160（Repligen製）とは供
給元（Transgene）が異なる。対照として用いた正常マ
ウスの血清について得られた吸光度は、常に0.1以下で
あった。
図10はHIV表現プラスミドpMT−HIVの地図を示す。こ
のベクターは図２に示したpHIV−SVベクターに類似であ
るが、pHIV−SVで用いたSV40ウイルス早期プロモーター
の位置にヒトメタロチオネインIIaプロモーターを含
む。
のベクターは図２に示したpHIV−SVベクターに類似であ
るが、pHIV−SVで用いたSV40ウイルス早期プロモーター
の位置にヒトメタロチオネインIIaプロモーターを含
む。
図11は８日間にわたって安定的に導入したVero細胞の
上清中に存在する高分子物質と関連したp24抗原とRT活
性の分布を示したものである。細胞は細胞融合が起こる
まで培養した後、5uMのCdCl2を添加してウイルス様粒子
の生産を刺激した。培地は24時間毎にCdCl2を含んだ新
しい培地と交換し、この操作を毎日８日間繰り返した。
８日後の試料を集め、全ての試料についてRT及びp24の
検定を同時に行った。
上清中に存在する高分子物質と関連したp24抗原とRT活
性の分布を示したものである。細胞は細胞融合が起こる
まで培養した後、5uMのCdCl2を添加してウイルス様粒子
の生産を刺激した。培地は24時間毎にCdCl2を含んだ新
しい培地と交換し、この操作を毎日８日間繰り返した。
８日後の試料を集め、全ての試料についてRT及びp24の
検定を同時に行った。
図12は安定的な形質移行を行ったCOS細胞の２系統に
ついてHIV−１様粒子のシュークローズ濃度勾配遠心分
離のプロフィルを示す。COS−HIV−３はpHIV−Ad表現ベ
クターをCOS細胞に形質移行させることによって得た。
またCOS−HIV−６はRNA封入シグナル配列に26bpが欠失
した同様なベクターを形質移行させることにより得た。
ついてHIV−１様粒子のシュークローズ濃度勾配遠心分
離のプロフィルを示す。COS−HIV−３はpHIV−Ad表現ベ
クターをCOS細胞に形質移行させることによって得た。
またCOS−HIV−６はRNA封入シグナル配列に26bpが欠失
した同様なベクターを形質移行させることにより得た。
発明についての記述 図１はHIV−１プロウイルスの機能地図であり、レト
ロウイルス遺伝子の発現及びゲノムの複製に必要な各種
遺伝子の位置ならびにlong terminal repeat（LTR）エ
レメントを示す。本発明において、われわれはSV40ウイ
ルス早期プロモーター（図２）を用いて、LAV−1BRUプ
ロウイルスからの8.3kbのSac I−Xho I DNAフラグメン
トを単純な真核細胞発現ベクターに挿入することによ
り、一時的に形質移行したサルCOS細胞中でHIV−１様粒
子の製造が可能であるることを実証した。用いたプロウ
イルスフラグメントは両LTRエレメント間にウイルスタ
ンパクをコード化する情報を含み、したがってこのフラ
グメントから転写される全てのRNA分子の反転写に必要
な遺伝子エレメントを欠く。このベクターをCOS細胞に
形質移行させた際のHIV−１タンパクの発現は、代謝標
識及び免疫沈澱法、特異的抗HIV抗体血清を用いたペレ
ット状の物質のウエスターン法による分析及び形質移行
細胞におけるリバーストランスクリプターゼ（RT）活性
を検出することにより確認した。HIV様粒子生成の証拠
は、形質移行細胞の上清中に遊離する高分子物質をシュ
ークローズ濃度勾配で遠心分離することにより得られ
た。この実験で、RT活性は無傷のレトロウイルス粒子の
場合と同じ濃度の画分に結合していることが認められ
た。さらに、SIV様粒子は同じ遺伝子工学的手法を用い
て製造できることが実証された。非感染性HIV−１様粒
子をさらに効率よく製造するために、安定的な遺伝子工
学細胞系の確立を目的として、HIV−１タンパクのコー
ド情報をアデノウイルス主動後期プロモーターを用いて
発現ベクターに挿入し、抗生物質G418に対する抵抗性を
規定するプラスミドとともにCOS細胞に形質移行させた
（図３）。多くのG418抵抗性細胞コロニーを検査したと
ころ、そのいくつかは主要なHIV−１抗原とともにRT活
性を有する高分子物質を構造的に生産することが確認さ
れた。実際にウイルス様粒子が生産されていることは、
シュークローズ濃度勾配遠心分離及び電子顕微鏡分析に
より確認された。また、電子顕微鏡検査では、形質移行
細胞の原形質膜から発芽中のウイルス様粒子の存在が確
認された。
ロウイルス遺伝子の発現及びゲノムの複製に必要な各種
遺伝子の位置ならびにlong terminal repeat（LTR）エ
レメントを示す。本発明において、われわれはSV40ウイ
ルス早期プロモーター（図２）を用いて、LAV−1BRUプ
ロウイルスからの8.3kbのSac I−Xho I DNAフラグメン
トを単純な真核細胞発現ベクターに挿入することによ
り、一時的に形質移行したサルCOS細胞中でHIV−１様粒
子の製造が可能であるることを実証した。用いたプロウ
イルスフラグメントは両LTRエレメント間にウイルスタ
ンパクをコード化する情報を含み、したがってこのフラ
グメントから転写される全てのRNA分子の反転写に必要
な遺伝子エレメントを欠く。このベクターをCOS細胞に
形質移行させた際のHIV−１タンパクの発現は、代謝標
識及び免疫沈澱法、特異的抗HIV抗体血清を用いたペレ
ット状の物質のウエスターン法による分析及び形質移行
細胞におけるリバーストランスクリプターゼ（RT）活性
を検出することにより確認した。HIV様粒子生成の証拠
は、形質移行細胞の上清中に遊離する高分子物質をシュ
ークローズ濃度勾配で遠心分離することにより得られ
た。この実験で、RT活性は無傷のレトロウイルス粒子の
場合と同じ濃度の画分に結合していることが認められ
た。さらに、SIV様粒子は同じ遺伝子工学的手法を用い
て製造できることが実証された。非感染性HIV−１様粒
子をさらに効率よく製造するために、安定的な遺伝子工
学細胞系の確立を目的として、HIV−１タンパクのコー
ド情報をアデノウイルス主動後期プロモーターを用いて
発現ベクターに挿入し、抗生物質G418に対する抵抗性を
規定するプラスミドとともにCOS細胞に形質移行させた
（図３）。多くのG418抵抗性細胞コロニーを検査したと
ころ、そのいくつかは主要なHIV−１抗原とともにRT活
性を有する高分子物質を構造的に生産することが確認さ
れた。実際にウイルス様粒子が生産されていることは、
シュークローズ濃度勾配遠心分離及び電子顕微鏡分析に
より確認された。また、電子顕微鏡検査では、形質移行
細胞の原形質膜から発芽中のウイルス様粒子の存在が確
認された。
非感染性HIV−１様粒子のワクチンとしての機能を実
証するために、安定的に形質移行させたCOS細胞が生産
した非感染性HIV−１様粒子調製物を用い、マウスに免
疫を獲得させた。これらの実験では、沈降及びシューク
ローズ分画で粒子を精製し、免疫原として使用した。２
回注射すると、HIV−１タンパク及びペプチドに対する
効率の高い抗体反応が認められ、HIV−１の２系統に対
してウイルス中和活性が検出された。３回目の注射を行
った場合、HIV−１特異的抗体はHIV−２の封入グリコプ
ロテインと交差反応性を示した。
証するために、安定的に形質移行させたCOS細胞が生産
した非感染性HIV−１様粒子調製物を用い、マウスに免
疫を獲得させた。これらの実験では、沈降及びシューク
ローズ分画で粒子を精製し、免疫原として使用した。２
回注射すると、HIV−１タンパク及びペプチドに対する
効率の高い抗体反応が認められ、HIV−１の２系統に対
してウイルス中和活性が検出された。３回目の注射を行
った場合、HIV−１特異的抗体はHIV−２の封入グリコプ
ロテインと交差反応性を示した。
遺伝子工学による細胞系の非感染性HIV−１粒子生産
性を高めることを目的として、安定的遺伝子工学細胞系
でウイルス様粒子の表現を誘導されるため、ヒトメタロ
チオネインII aプロモーター及びHIV−１タンパクをコ
ード化したDNAフラグメントを含む発現ベクターを開発
した（図10）。このベクターをG418抵抗性マーカーとと
もにベルノ（Vero）細胞に導入し、きわめて多くのコロ
ニーが高いレベルの特異的RT活性を生産することを確認
した。HIV様粒子の生産は、電子顕微鏡及びp24抗原で確
認し、感染性HIV−１が感染したヒト白血病Ｔ−細胞で
通常認められるレベルに比較して、粒子の生産性が高か
った。さらに、安定的に形質移行させたベルノ（Vero）
細胞における粒子の生産性は、細胞が融合期に達した場
合でも、24時間毎に新鮮な培地と塩化カドミウムを与え
ることにより、少なくともその後８日間は保たれた。こ
のような誘導性及び長期間にわたる発現は、サルのベル
ノ（Vero）細胞に限ったものではなかった。また、かな
り多くの粒子の金属依存性発現は、ヒト結腸腺癌細胞系
でも認められた。これらのデータは、広範な細胞系を用
いて非感染性ウイルス様粒子の大規模製造が可能である
ことを示している。
性を高めることを目的として、安定的遺伝子工学細胞系
でウイルス様粒子の表現を誘導されるため、ヒトメタロ
チオネインII aプロモーター及びHIV−１タンパクをコ
ード化したDNAフラグメントを含む発現ベクターを開発
した（図10）。このベクターをG418抵抗性マーカーとと
もにベルノ（Vero）細胞に導入し、きわめて多くのコロ
ニーが高いレベルの特異的RT活性を生産することを確認
した。HIV様粒子の生産は、電子顕微鏡及びp24抗原で確
認し、感染性HIV−１が感染したヒト白血病Ｔ−細胞で
通常認められるレベルに比較して、粒子の生産性が高か
った。さらに、安定的に形質移行させたベルノ（Vero）
細胞における粒子の生産性は、細胞が融合期に達した場
合でも、24時間毎に新鮮な培地と塩化カドミウムを与え
ることにより、少なくともその後８日間は保たれた。こ
のような誘導性及び長期間にわたる発現は、サルのベル
ノ（Vero）細胞に限ったものではなかった。また、かな
り多くの粒子の金属依存性発現は、ヒト結腸腺癌細胞系
でも認められた。これらのデータは、広範な細胞系を用
いて非感染性ウイルス様粒子の大規模製造が可能である
ことを示している。
本法の主要な利点の一つは、本質的に全てのウイルス
タンパクを元の配列のままで含むことのできるウイルス
様粒子を製造することにあるが、それにもかかわらず構
造を変更したウイルス抗原を含む修飾ウイルス様粒子を
製造することも可能である。ウイルス系統から交互にエ
ピトープをHIV−１エンベロープグリコプロテインのあ
る部位に導入することによりその免疫原性が助長され、
元の構造的エピトープの変化にともなう好ましくない影
響が考えられるにも拘らず全体的に利点があるかどうか
はさらに検討を要する。さらに、エンベロープまたはそ
の他のウイルスタンパクの抗体亢進または免疫抑制部位
を除去することにより、HIV様粒子の免疫原性を改良す
ることができる。修飾したエンベロープタンパクを含む
ウイルス様粒子の製造の可能性を実証することを目的と
して、われわれはまずgp160分子から成熟gp120エンベロ
ープ糖タンパク及びgp41膜間糖タンパクへの過程を阻害
するためにgp160エンベロープ糖タンパクの前駆体のタ
ンパク加水分解部位に突然変異を起こさせた。この実験
は、未加工のgp160がウイルス様粒子の膜の標的になる
か否かを検討するために行った。修飾したgp120分子
は、gp41膜間糖タンパクに対する親和性が低下した結
果、ウイルス様粒子から容易に流れ落ちるため、粒子上
に修飾エンベロープ分子を効率よく保持するためにタン
パク加水分解過程を阻害する必要があると考えられる。
このタンパク加水分解部位をコード化した部位に突然変
異を起こした表現構造から生産された粒子をシュークロ
ーズで濃度勾配分析した結果、形質移行細胞から遊離さ
れる高分子物質中のRT活性と密接に関連した未解裂のgp
160の存在が認められた。さらに、特定部位にエピトー
プを挿入することによりエンベロープ糖タンパクをコー
ド化した別の表現構造を用いて、特異的アミノ酸挿入を
含む修飾gp120エンベロープ糖タンパクを有する粒子の
製造が可能なことを実証した。逆に、gp120の主要な部
分をコード化したDNA配列を除去すると、エンベロープ
タンパクの細胞外領域を欠くウイルス様粒子が生成し
た。
タンパクを元の配列のままで含むことのできるウイルス
様粒子を製造することにあるが、それにもかかわらず構
造を変更したウイルス抗原を含む修飾ウイルス様粒子を
製造することも可能である。ウイルス系統から交互にエ
ピトープをHIV−１エンベロープグリコプロテインのあ
る部位に導入することによりその免疫原性が助長され、
元の構造的エピトープの変化にともなう好ましくない影
響が考えられるにも拘らず全体的に利点があるかどうか
はさらに検討を要する。さらに、エンベロープまたはそ
の他のウイルスタンパクの抗体亢進または免疫抑制部位
を除去することにより、HIV様粒子の免疫原性を改良す
ることができる。修飾したエンベロープタンパクを含む
ウイルス様粒子の製造の可能性を実証することを目的と
して、われわれはまずgp160分子から成熟gp120エンベロ
ープ糖タンパク及びgp41膜間糖タンパクへの過程を阻害
するためにgp160エンベロープ糖タンパクの前駆体のタ
ンパク加水分解部位に突然変異を起こさせた。この実験
は、未加工のgp160がウイルス様粒子の膜の標的になる
か否かを検討するために行った。修飾したgp120分子
は、gp41膜間糖タンパクに対する親和性が低下した結
果、ウイルス様粒子から容易に流れ落ちるため、粒子上
に修飾エンベロープ分子を効率よく保持するためにタン
パク加水分解過程を阻害する必要があると考えられる。
このタンパク加水分解部位をコード化した部位に突然変
異を起こした表現構造から生産された粒子をシュークロ
ーズで濃度勾配分析した結果、形質移行細胞から遊離さ
れる高分子物質中のRT活性と密接に関連した未解裂のgp
160の存在が認められた。さらに、特定部位にエピトー
プを挿入することによりエンベロープ糖タンパクをコー
ド化した別の表現構造を用いて、特異的アミノ酸挿入を
含む修飾gp120エンベロープ糖タンパクを有する粒子の
製造が可能なことを実証した。逆に、gp120の主要な部
分をコード化したDNA配列を除去すると、エンベロープ
タンパクの細胞外領域を欠くウイルス様粒子が生成し
た。
遺伝子工学による非感染性HIV様粒子は、ヒトに使用
できる全く安全なワクチンを目的に設計されたものであ
る。これは、ウイルス様粒子を製造する細胞系は反転写
に必要な遺伝子エレメントを含まないという事実に基づ
くものである。しかし、LTRエレメントのみを除去して
も、ワクチン生産細胞またはワクチン受容細胞のいずれ
かにある異種構造LTRエレメントによるタンパクコード
配列の組合せが感染性レトロウイルスを再生させる可能
性が論議されるかも知れない。このような可能性は、感
染性には必要であるが、粒子の生産及び免疫原性には必
要ないHIVヌクレオチド配列の部位に、さらにいくつか
の遺伝子修飾を加えることにより完全に取り除くことが
できる。上記の部位はRNA封入シグナル、gag、p15産物
のＣ−末端及びvif、インテグラーゼ、リバーストラン
スクリプターゼ及びtat遺伝子を含む。LTRエレメント欠
失に加えて、この種の突然変異を含む表現構造は、機能
的LTRエレメントと組合せても、感染性レトロウイルス
の発現は起こらない。本発明で、われわれはHIV−1RNA
封入シグナルの一部または全てを包囲するgagの最初の
接合ドナーと開始コドンの間で26個のヌクレオチドの除
去が可能であることを実証した。これらの実験で、安定
的に形質移行されたCOS細胞中でこの構造により発現す
るウイルス様粒子は、その前の構造により発現する粒子
と区別できないことから、RNAの封入は非感染性HIV−１
ウイルス様粒子の発現における決定的な機能ではないこ
とを示している。さらに、われわれはインテグラーゼ及
びVif遺伝子の両方を欠いても粒子の形成には影響のな
いことを実証することができた。
できる全く安全なワクチンを目的に設計されたものであ
る。これは、ウイルス様粒子を製造する細胞系は反転写
に必要な遺伝子エレメントを含まないという事実に基づ
くものである。しかし、LTRエレメントのみを除去して
も、ワクチン生産細胞またはワクチン受容細胞のいずれ
かにある異種構造LTRエレメントによるタンパクコード
配列の組合せが感染性レトロウイルスを再生させる可能
性が論議されるかも知れない。このような可能性は、感
染性には必要であるが、粒子の生産及び免疫原性には必
要ないHIVヌクレオチド配列の部位に、さらにいくつか
の遺伝子修飾を加えることにより完全に取り除くことが
できる。上記の部位はRNA封入シグナル、gag、p15産物
のＣ−末端及びvif、インテグラーゼ、リバーストラン
スクリプターゼ及びtat遺伝子を含む。LTRエレメント欠
失に加えて、この種の突然変異を含む表現構造は、機能
的LTRエレメントと組合せても、感染性レトロウイルス
の発現は起こらない。本発明で、われわれはHIV−1RNA
封入シグナルの一部または全てを包囲するgagの最初の
接合ドナーと開始コドンの間で26個のヌクレオチドの除
去が可能であることを実証した。これらの実験で、安定
的に形質移行されたCOS細胞中でこの構造により発現す
るウイルス様粒子は、その前の構造により発現する粒子
と区別できないことから、RNAの封入は非感染性HIV−１
ウイルス様粒子の発現における決定的な機能ではないこ
とを示している。さらに、われわれはインテグラーゼ及
びVif遺伝子の両方を欠いても粒子の形成には影響のな
いことを実証することができた。
実施例 実施例１ 本実施例は、HIVH発現用構造物を形質移行させた細胞
における主要なHIVタンパク抗体の発現を説明するもの
である。
における主要なHIVタンパク抗体の発現を説明するもの
である。
図２は、ヌクレオチド位置678から始まりヌクレオチ
ド位置8944で終わる、LAV−1BRU系からのHIV−１タンパ
クのコード情報を含む単一DNAフラグメントを含む発現
用構造体pHIV−SVの摸式図を示す。この8.3kbのフラグ
メントの末端は大腸菌（Ｅ・coli）のDNAポリメラーゼ
Ｉのクレノウ（Klenow）フラグメントを用いて切断し、
SV40ウイルス早期プロモーター及び後期ポリアデニル化
部位を含むブルスクリプト（Vluescript）に基づく発現
ベクターの平滑（Blunt）Hind III末端に挿入した。SV
40プロモーター及びポリアデニル化部位は、市販のクロ
ーンベクターから得た。pHIV−SVベクターは、DNA複製
のSV40ウイルスオリジンが存在するため、サルのCOS細
胞における一時的発現に適している。
ド位置8944で終わる、LAV−1BRU系からのHIV−１タンパ
クのコード情報を含む単一DNAフラグメントを含む発現
用構造体pHIV−SVの摸式図を示す。この8.3kbのフラグ
メントの末端は大腸菌（Ｅ・coli）のDNAポリメラーゼ
Ｉのクレノウ（Klenow）フラグメントを用いて切断し、
SV40ウイルス早期プロモーター及び後期ポリアデニル化
部位を含むブルスクリプト（Vluescript）に基づく発現
ベクターの平滑（Blunt）Hind III末端に挿入した。SV
40プロモーター及びポリアデニル化部位は、市販のクロ
ーンベクターから得た。pHIV−SVベクターは、DNA複製
のSV40ウイルスオリジンが存在するため、サルのCOS細
胞における一時的発現に適している。
標準的なリン酸カルシウム形質移行条件を用い、表面
積25cm2のフラスコ内のCOS−７細胞に15ugのpHIV−SVプ
ラスミドを形質移行させた。COS細胞は10％ウシ胎仔血
清を含むダルベコ（Dulbecco）の改良イーグル（Eagl
e）培地で保存した。HIVタンパクの発現は、3H−ロイシ
ン代謝標識及び細胞内及び細胞外抗原の免疫沈降により
分析した。形質移行24時間後に細胞を3H−ロイシンで15
時間標識した後、培地を収穫し、０℃で保存した。1ml
のNP−40融解緩衝液（トリス−HC1 20mM、Nacl 150m
M、ノニエット（Noniet）Ｐ−40 １％、デオキシコー
ル酸ナトリウム 0.5％、フッ化フェニルメチルスルフ
ォン酸 1mM、pH7.5）を加えて細胞を融解し、細胞融解
液を０℃で保存した。まず、上清及び細胞溶融試料を正
常なヒト血清と反応させ、正常なヒト免疫グロブリンと
非特異的に反応するタンパクを除いた。これらの複合体
は、プロテェイン−Ａアガロースに結合させることによ
り除去した。ついで、透明な培地及び細胞融解試料を市
販のヒト抗HIV抗体血清と反応させた。HIV特異性免疫複
合物をタンパク−Ａアガロースに結合させることにより
分離し、結合物質をSDS PAGEに供した。ゲル電気泳動
及びＶ−線透視法で分析したところ、特異的バンドの表
現はpHIV−１のp17,p24,gp41,p55,gp120及びgp160産物
と一致した。これらのバンドは、pHIV−SVを形質移行し
なかった細胞からの対照試料中には存在しなかった。
積25cm2のフラスコ内のCOS−７細胞に15ugのpHIV−SVプ
ラスミドを形質移行させた。COS細胞は10％ウシ胎仔血
清を含むダルベコ（Dulbecco）の改良イーグル（Eagl
e）培地で保存した。HIVタンパクの発現は、3H−ロイシ
ン代謝標識及び細胞内及び細胞外抗原の免疫沈降により
分析した。形質移行24時間後に細胞を3H−ロイシンで15
時間標識した後、培地を収穫し、０℃で保存した。1ml
のNP−40融解緩衝液（トリス−HC1 20mM、Nacl 150m
M、ノニエット（Noniet）Ｐ−40 １％、デオキシコー
ル酸ナトリウム 0.5％、フッ化フェニルメチルスルフ
ォン酸 1mM、pH7.5）を加えて細胞を融解し、細胞融解
液を０℃で保存した。まず、上清及び細胞溶融試料を正
常なヒト血清と反応させ、正常なヒト免疫グロブリンと
非特異的に反応するタンパクを除いた。これらの複合体
は、プロテェイン−Ａアガロースに結合させることによ
り除去した。ついで、透明な培地及び細胞融解試料を市
販のヒト抗HIV抗体血清と反応させた。HIV特異性免疫複
合物をタンパク−Ａアガロースに結合させることにより
分離し、結合物質をSDS PAGEに供した。ゲル電気泳動
及びＶ−線透視法で分析したところ、特異的バンドの表
現はpHIV−１のp17,p24,gp41,p55,gp120及びgp160産物
と一致した。これらのバンドは、pHIV−SVを形質移行し
なかった細胞からの対照試料中には存在しなかった。
実施例２ 本実施例は形質移行COS細胞の培地上清から得たリバ
ーストランスクリプターゼ活性に関連した高分子物質の
沈降を説明するものである。
ーストランスクリプターゼ活性に関連した高分子物質の
沈降を説明するものである。
プラスミドのpHIV−CHO−SV（図３）は、pHIV−SVと
同様であるが、SV40ウイルス早期プロモーターの代わり
にアデノウイルス主動後期プロモーター及びヒトサイト
メガロウイルス直接早期エンハンサーの２つのコピーを
用いた。また、このプラスミドは一時的発現の分析に用
いる複製のSV40ウイルスオリジンを含む。ヒトサイトメ
ガロウイルスの直接早期エンハンサーの２つのコピーは
ヌクレオチド−524から−218までの領域に広がり、重複
している合成オリゴヌクレオチドにより構成されてい
た。エンハンサーフラグメントは、アデノウイルス主動
後期プロモーターの上流に位置し、３深裂リーダーの最
初のエクソンの５′末端を取り囲むアデノウイルス−２
ゲノムDNAからの292bpのXhol−Pvullフラグメント内に
含まれる。この292bpフラグメントは、接合前の配列
で、最初のリーダーエクソンの３′末端、第２のリーダ
ーエクソンの全て、及び第３のリーダーエクソンの2/3
を含む合成140bpフラグメントに結紮されていた。
同様であるが、SV40ウイルス早期プロモーターの代わり
にアデノウイルス主動後期プロモーター及びヒトサイト
メガロウイルス直接早期エンハンサーの２つのコピーを
用いた。また、このプラスミドは一時的発現の分析に用
いる複製のSV40ウイルスオリジンを含む。ヒトサイトメ
ガロウイルスの直接早期エンハンサーの２つのコピーは
ヌクレオチド−524から−218までの領域に広がり、重複
している合成オリゴヌクレオチドにより構成されてい
た。エンハンサーフラグメントは、アデノウイルス主動
後期プロモーターの上流に位置し、３深裂リーダーの最
初のエクソンの５′末端を取り囲むアデノウイルス−２
ゲノムDNAからの292bpのXhol−Pvullフラグメント内に
含まれる。この292bpフラグメントは、接合前の配列
で、最初のリーダーエクソンの３′末端、第２のリーダ
ーエクソンの全て、及び第３のリーダーエクソンの2/3
を含む合成140bpフラグメントに結紮されていた。
COS−７細胞を接種した75cm2のフラスコ３本に、それ
ぞれ35ugのpHIV−CHO−SVプラスミドを形質移行させ、
３日後に75mlの培地の上清30mlを採取した。50mMのトリ
ス−HCl及び0.1mMのKCl、pH7.8を含む20％グリセロール
をSW28遠心管に採り、これに先に採取した上清を滴下し
て、遠心分離によりペレットとした。遠心分離は４℃の
温度条件下で100,000xg、90分間行った。偽−形質移行C
OS細胞からの試料を対照としてインキュベートした。ペ
レットを30uLのトライトン（Triton）Ｘ−100溶融緩衝
液（50mMのトリス−HCl、100mMのKCl、1mMのジチオスレ
イトール、0.1％トライトン、Ｘ−100、pH7.8）を懸濁
させ、リバーストランスクリプターゼ活性を分析した。
40mMのトリス−HCl、4mMのジチオスレイトール、45mMの
KCl、10mMのMgCl2、20uCiの3H−dTTP（80ci/mmol）、50
ugのpoly rA及びlugのoligo dTを含む反応混合物（pH
7.8）90uLに懸濁液の1/3を添加し、37℃で30分間インキ
ュベートした。トリクロロ酢酸で沈殿した核酸中に放射
能の取込みが認められたことから、リバーストランスク
リプターゼ活性の存在が暗示された。表１に示す結果か
ら、各試料に放射能の取込みが認められる。
ぞれ35ugのpHIV−CHO−SVプラスミドを形質移行させ、
３日後に75mlの培地の上清30mlを採取した。50mMのトリ
ス−HCl及び0.1mMのKCl、pH7.8を含む20％グリセロール
をSW28遠心管に採り、これに先に採取した上清を滴下し
て、遠心分離によりペレットとした。遠心分離は４℃の
温度条件下で100,000xg、90分間行った。偽−形質移行C
OS細胞からの試料を対照としてインキュベートした。ペ
レットを30uLのトライトン（Triton）Ｘ−100溶融緩衝
液（50mMのトリス−HCl、100mMのKCl、1mMのジチオスレ
イトール、0.1％トライトン、Ｘ−100、pH7.8）を懸濁
させ、リバーストランスクリプターゼ活性を分析した。
40mMのトリス−HCl、4mMのジチオスレイトール、45mMの
KCl、10mMのMgCl2、20uCiの3H−dTTP（80ci/mmol）、50
ugのpoly rA及びlugのoligo dTを含む反応混合物（pH
7.8）90uLに懸濁液の1/3を添加し、37℃で30分間インキ
ュベートした。トリクロロ酢酸で沈殿した核酸中に放射
能の取込みが認められたことから、リバーストランスク
リプターゼ活性の存在が暗示された。表１に示す結果か
ら、各試料に放射能の取込みが認められる。
表Ｉ 試 料 放射能の取込み量（CPM） ブランク 14,110 偽−形質移行 18,153 形質移行 390,220 精製MuLVリバーストランスクリプターゼ 5,416,920 これらのデータは、HIV表現プラスミドを形質移行し
たCOS細胞の培地上清中に遊離する高分子物質中にリバ
ーストランスクリプターゼ活性が存在することを示して
いる。
たCOS細胞の培地上清中に遊離する高分子物質中にリバ
ーストランスクリプターゼ活性が存在することを示して
いる。
実施例３ 本実施例は、形質移行COS細胞の上清中に遊離する高
分子物質としての複数のHIV−１高原が存在することを
説明するものである。
分子物質としての複数のHIV−１高原が存在することを
説明するものである。
市販のリポフェクチン（Lipofectin）形質移行キット
を用い、pHIV−SVプラスミド25μｇを75cm2の培養フラ
スコ中のCOS細胞に形質移行させた。形質移行後３日目
に培地の上清10mlのうち8mlを採取し、20％グリセロー
ル中で100,000xgで遠心して微粒子物質をペレットと
し、ウエスタン（Western）分析に供した。SDS−PAGE試
料緩衝液を添加する前に100μｌのTNE（150mMのNaCl、5
0mMのトリス−HCl、1mMのEDTA、pH7.5）に懸濁し、標準
的な方法を用いて12.5％のSDS−ポリアクリルアミド上
で電気泳動を行った。タンパクは電気泳動的にイモビリ
オン膜（Millipore）に移し、それぞれgp120（DuPont,N
EA−9382）,p24（DuPont,NEA−9306）,p17（DuPont,NEA
−9284）,gp41（DuPont,NEA−9303）に特異的な４種類
のモノクロナール抗体のカクテルと反応させた。第２の
抗体としてアルカリホスファターゼに抱合させたヤギの
抗マウスIgG（Promega）を用いた。抗体反応はBPSで希
釈した５％のカーネーションインスタントミルク中で行
い、アルカリホスファターゼ基質溶液（Bethesda Rese
arch Laboratories）を用いて展開した。形質移行細胞
の試料では４種類のHIV−１産物の全てに相当するバン
ドが認められたが、偽−形質移行細胞の対照試料では認
められなかった。その後の実験で、単一モノクロナール
抗体を用いてgp41及びgp120産物の同定を確認した。
を用い、pHIV−SVプラスミド25μｇを75cm2の培養フラ
スコ中のCOS細胞に形質移行させた。形質移行後３日目
に培地の上清10mlのうち8mlを採取し、20％グリセロー
ル中で100,000xgで遠心して微粒子物質をペレットと
し、ウエスタン（Western）分析に供した。SDS−PAGE試
料緩衝液を添加する前に100μｌのTNE（150mMのNaCl、5
0mMのトリス−HCl、1mMのEDTA、pH7.5）に懸濁し、標準
的な方法を用いて12.5％のSDS−ポリアクリルアミド上
で電気泳動を行った。タンパクは電気泳動的にイモビリ
オン膜（Millipore）に移し、それぞれgp120（DuPont,N
EA−9382）,p24（DuPont,NEA−9306）,p17（DuPont,NEA
−9284）,gp41（DuPont,NEA−9303）に特異的な４種類
のモノクロナール抗体のカクテルと反応させた。第２の
抗体としてアルカリホスファターゼに抱合させたヤギの
抗マウスIgG（Promega）を用いた。抗体反応はBPSで希
釈した５％のカーネーションインスタントミルク中で行
い、アルカリホスファターゼ基質溶液（Bethesda Rese
arch Laboratories）を用いて展開した。形質移行細胞
の試料では４種類のHIV−１産物の全てに相当するバン
ドが認められたが、偽−形質移行細胞の対照試料では認
められなかった。その後の実験で、単一モノクロナール
抗体を用いてgp41及びgp120産物の同定を確認した。
実施例４ 本実施例は、形質移行COS細胞で生産されたHIV様粒子
の浮遊密度分析を説明するものである。
の浮遊密度分析を説明するものである。
カルシウムリン酸法を用いて、COS細胞を含むそれぞ
れ150cm2のフラスコに70ugのpHIV−CHO−SVを形質移行
させ、３日後に培地の上清を採取した。培地にNaCl及び
PEG−8000を添加して、それぞれ0.15M及び9.3％とし
て、HIV様粒子を沈殿させ、100mMのNaCl、10mMのトリス
−HCl、1mMのEDTA、pH7.4中で20−60％の濃度勾配のシ
ュークローズ11mlに載せた。これを４℃のSW40ローター
中で、35,000rpmで15分間遠心した。ついでこれを分画
し、各分画から一部試料を採り、ウイルス様粒子を破壊
するためにトライトンＸ−100及びKClを添加してそれぞ
れ0.2％及び0.25mMとした後リバーストランスクリプタ
ーゼ活性を測定した。比重1.16g/mlの画分で単一ピーク
が認められ、レトロウイルス様粒子の生産と一致してい
た（図４）。各画分の比重は比重計で測定し、ピーク画
分の比重を求めた。
れ150cm2のフラスコに70ugのpHIV−CHO−SVを形質移行
させ、３日後に培地の上清を採取した。培地にNaCl及び
PEG−8000を添加して、それぞれ0.15M及び9.3％とし
て、HIV様粒子を沈殿させ、100mMのNaCl、10mMのトリス
−HCl、1mMのEDTA、pH7.4中で20−60％の濃度勾配のシ
ュークローズ11mlに載せた。これを４℃のSW40ローター
中で、35,000rpmで15分間遠心した。ついでこれを分画
し、各分画から一部試料を採り、ウイルス様粒子を破壊
するためにトライトンＸ−100及びKClを添加してそれぞ
れ0.2％及び0.25mMとした後リバーストランスクリプタ
ーゼ活性を測定した。比重1.16g/mlの画分で単一ピーク
が認められ、レトロウイルス様粒子の生産と一致してい
た（図４）。各画分の比重は比重計で測定し、ピーク画
分の比重を求めた。
実施例５ 本実施例は、リバーストランスクリプターゼ活性を含
む高分子物質を発現する安定的に形質移入したCOS細胞
の生成能力を説明するものである。
む高分子物質を発現する安定的に形質移入したCOS細胞
の生成能力を説明するものである。
HIV発現プラスミドpHIV−Ad（図５）はHIV−COS−SV
と類似であるが、COS細胞における安定的形質移入と両
立しないSV40ウイルスオリジンの複製を含まない。抗生
物質G418に抵抗性を有するリニアー化したpLTRneoベク
ターとともに、５μｇのリニアーpHIV−Adを5cmのシャ
ーレ中のCOS細胞に形質移入した。形質移入２日後に、
0.6mh/mlのG418を含む培地に細胞を1:10の割合で分け、
抵抗性コロニーを形成させた。各コロニーを分離し、大
量培養した後、先に述べたように各クローンの上清8ml
についてRT活性を測定した。最初の44クローンのうち２
クローンでRT活性が検出された。これらのクローンは、
0.6mg/mlのG418の存在下で引き続き培養を繰り返して、
RT活性と関連した高分子物質を生産させた。
と類似であるが、COS細胞における安定的形質移入と両
立しないSV40ウイルスオリジンの複製を含まない。抗生
物質G418に抵抗性を有するリニアー化したpLTRneoベク
ターとともに、５μｇのリニアーpHIV−Adを5cmのシャ
ーレ中のCOS細胞に形質移入した。形質移入２日後に、
0.6mh/mlのG418を含む培地に細胞を1:10の割合で分け、
抵抗性コロニーを形成させた。各コロニーを分離し、大
量培養した後、先に述べたように各クローンの上清8ml
についてRT活性を測定した。最初の44クローンのうち２
クローンでRT活性が検出された。これらのクローンは、
0.6mg/mlのG418の存在下で引き続き培養を繰り返して、
RT活性と関連した高分子物質を生産させた。
実施例６ 本実施例は、ウエスタン法及びシュークローズ濃度勾
配遠心分離で実証されるように、安定的に形質移入した
COS細胞におけるHIV様粒子の生産を説明するものであ
る。
配遠心分離で実証されるように、安定的に形質移入した
COS細胞におけるHIV様粒子の生産を説明するものであ
る。
ウエスタン法で分析するため、安定的に形質移入した
COS細胞の培地の上清を20％のグリセロールに載せ、10
0、000xgで90分間遠心してウイルス様粒子をペレットと
した。このペレットを、各細胞の上清1mlあたり1.5μｌ
のTNEに懸濁させた。このようにして調製した濃厚な物
質より20μｌを２点採り、市販のヒトHIV−１特異性抗
体血清（BioRad）または上記のようにHIV−１ gp120,g
p41,p24及びp17に特異的な市販のモノクロナール抗体４
種のカクテルを用い、ウエスタン法で分析した。これら
の結果から、HIV−１ gp120,p55,gp41,p30,p23及びp17
蛋白に相当する分子量を有するいくつかのバンドの存在
が実証された。
COS細胞の培地の上清を20％のグリセロールに載せ、10
0、000xgで90分間遠心してウイルス様粒子をペレットと
した。このペレットを、各細胞の上清1mlあたり1.5μｌ
のTNEに懸濁させた。このようにして調製した濃厚な物
質より20μｌを２点採り、市販のヒトHIV−１特異性抗
体血清（BioRad）または上記のようにHIV−１ gp120,g
p41,p24及びp17に特異的な市販のモノクロナール抗体４
種のカクテルを用い、ウエスタン法で分析した。これら
の結果から、HIV−１ gp120,p55,gp41,p30,p23及びp17
蛋白に相当する分子量を有するいくつかのバンドの存在
が実証された。
シュークローズ濃度勾配遠心分離を行うため、安定的
に形質移入したCOS細胞の上清500mlから20％グリセロー
ル中でHIV様粒子をペレット化した。ペレットはTNEに懸
濁させ、20−60％の濃度勾配のシュークローズ中で上記
のように遠心分離した。遠心分離後、各分画中のRT活性
を測定した。結果は、図６に示したように、HIV様粒子
の形成と一致する比重の画分で主要なRT活性のピークが
認められた。
に形質移入したCOS細胞の上清500mlから20％グリセロー
ル中でHIV様粒子をペレット化した。ペレットはTNEに懸
濁させ、20−60％の濃度勾配のシュークローズ中で上記
のように遠心分離した。遠心分離後、各分画中のRT活性
を測定した。結果は、図６に示したように、HIV様粒子
の形成と一致する比重の画分で主要なRT活性のピークが
認められた。
実施例７ 本実施例は、安定的に形質移入したCOS細胞で発芽し
ている粒子の電子顕微鏡により検出を説明するものであ
る。
ている粒子の電子顕微鏡により検出を説明するものであ
る。
薄切片分析にあたり、培養フラスコより安定的に形質
移入したCOS細胞をはぎ取り、培養培地で洗浄した後、
遠心分離によりペレットとした。懸濁させた細胞を2.5
％緩衝グルタルアルデヒド、ついで１％緩衝オスミウム
テトラオキシドで固定し、アルコール及びプロピレノキ
サイドで乾燥し、標準的な手法を用いてエポン−アラル
ダイト エポキシ樹脂混合物に包埋した。薄切片を酢酸
ウラニル及びクエン酸鉛で染色し、フィリップスEM3000
透過型電子顕微鏡で検査した。その結果、HIV様粒子の
生産を示す発芽中の未成熟粒子の存在が実証された。
移入したCOS細胞をはぎ取り、培養培地で洗浄した後、
遠心分離によりペレットとした。懸濁させた細胞を2.5
％緩衝グルタルアルデヒド、ついで１％緩衝オスミウム
テトラオキシドで固定し、アルコール及びプロピレノキ
サイドで乾燥し、標準的な手法を用いてエポン−アラル
ダイト エポキシ樹脂混合物に包埋した。薄切片を酢酸
ウラニル及びクエン酸鉛で染色し、フィリップスEM3000
透過型電子顕微鏡で検査した。その結果、HIV様粒子の
生産を示す発芽中の未成熟粒子の存在が実証された。
実施例８ 本実施例は、安定的に形質移入したCOS細胞から、実
施例６で述べたごとく、シュークローズ濃度勾配遠心分
離により精製したHIV様粒子の免疫原性を説明するもの
である。
施例６で述べたごとく、シュークローズ濃度勾配遠心分
離により精製したHIV様粒子の免疫原性を説明するもの
である。
RT活性を有するシュークローズ勾配画分を10倍量のTN
Eで希釈した後、４℃,100,000xgで90分間遠心分離して
ウイルス様粒子を濃縮した。精製したウイルス様粒子
は、市販のHIV−１ p24検定キット（Abbott Laborato
ries及びCoulter Immunology）を用いてp24含有量を定
量した。
Eで希釈した後、４℃,100,000xgで90分間遠心分離して
ウイルス様粒子を濃縮した。精製したウイルス様粒子
は、市販のHIV−１ p24検定キット（Abbott Laborato
ries及びCoulter Immunology）を用いてp24含有量を定
量した。
６−８週齢のマウス雌、（C57BL/6 ｘ C3H）F1系
（Charles River,Montreal）にHIV−１ウイルス様粒子
を投与して免疫を獲得させた後、血清中のHIV−１特異
性抗体を検定した。各マウスには毎回６μｇ相当量のp2
4抗原を３週間間隔で皮下注射した。一次免疫処置及び
追加免疫処置は、それぞれフロイントの完全アジュバン
ト及びフロイントの不完全アジュバントを用いて行っ
た。第２回目の免疫処置から９日後に血清を採取し、56
℃で30分間加熱して不活性化した。HIV−１特異性抗体
は酵素免疫検定（EIAs）で検出した。リン酸緩衝生理食
塩水（PBS,pH7.0）に溶解させた遺伝子組替え（ｒ）抗
原、すなわちrgp120（American Biotech）,rgp160（Re
pligen）,rgp41（DuPont）またはrp24（DuPont）を0.4
μｇの割合でEIAプレートの各ウエルに添加して、コー
トした。４℃に一夜放置して抗原を吸収させた。未吸収
の抗原を吸引して除き、BPSに懸濁させた２％スキムミ
ルク（Carnation）を井筒あたり300μｌ加えてプレート
をブロックし、室温に２時間放置した。ついで、0.025
％のツイン（Tween）20（BioRad）を含むPBSでプレート
を３回洗浄した。血清試料をPBSで連続希釈し、各井筒
に添加した後、室温に１時間放置した。ついで、上記と
同様にPBS/ツイン（Tween）20で３回プレートを洗浄し
た。ホースラデイッシュ ペルオキシターゼ（Jackson
Laboratories）に抱合させたヤギの抗マウス−IgG抗
体をPBSで1/5000に希釈し、室温で１時間添加した。PBS
/ツイン（Tween）20で洗浄した後、テトラ−メチルベン
ジディンを製造業者（ADI Diagnostics）の記載に従っ
て、ペルオキサイド試薬で1/10に希釈して基質液を調製
し、その10μｌを各ウエルに加え、室温に10−15分間置
いた。1NのH2SO4を100μｌ添加して反応を止め、EIAプ
レートリーダーを用い、450nmでプレートを読んだ。
（Charles River,Montreal）にHIV−１ウイルス様粒子
を投与して免疫を獲得させた後、血清中のHIV−１特異
性抗体を検定した。各マウスには毎回６μｇ相当量のp2
4抗原を３週間間隔で皮下注射した。一次免疫処置及び
追加免疫処置は、それぞれフロイントの完全アジュバン
ト及びフロイントの不完全アジュバントを用いて行っ
た。第２回目の免疫処置から９日後に血清を採取し、56
℃で30分間加熱して不活性化した。HIV−１特異性抗体
は酵素免疫検定（EIAs）で検出した。リン酸緩衝生理食
塩水（PBS,pH7.0）に溶解させた遺伝子組替え（ｒ）抗
原、すなわちrgp120（American Biotech）,rgp160（Re
pligen）,rgp41（DuPont）またはrp24（DuPont）を0.4
μｇの割合でEIAプレートの各ウエルに添加して、コー
トした。４℃に一夜放置して抗原を吸収させた。未吸収
の抗原を吸引して除き、BPSに懸濁させた２％スキムミ
ルク（Carnation）を井筒あたり300μｌ加えてプレート
をブロックし、室温に２時間放置した。ついで、0.025
％のツイン（Tween）20（BioRad）を含むPBSでプレート
を３回洗浄した。血清試料をPBSで連続希釈し、各井筒
に添加した後、室温に１時間放置した。ついで、上記と
同様にPBS/ツイン（Tween）20で３回プレートを洗浄し
た。ホースラデイッシュ ペルオキシターゼ（Jackson
Laboratories）に抱合させたヤギの抗マウス−IgG抗
体をPBSで1/5000に希釈し、室温で１時間添加した。PBS
/ツイン（Tween）20で洗浄した後、テトラ−メチルベン
ジディンを製造業者（ADI Diagnostics）の記載に従っ
て、ペルオキサイド試薬で1/10に希釈して基質液を調製
し、その10μｌを各ウエルに加え、室温に10−15分間置
いた。1NのH2SO4を100μｌ添加して反応を止め、EIAプ
レートリーダーを用い、450nmでプレートを読んだ。
図７に示した結果から、遺伝子組替えgp120,gp41及び
p24タンパクに対する著しいIgG抗体反応が実証された。
ABIモデル430Aペプチドシンセサイザー上で固相化学合
成法が合成されたペプチドをコートしたマイクロタイタ
ープレートを用いたペプチド特異性EIA′ｓで、gp120の
残遺311から320を取り囲む主要な合成HIV−１中和エピ
トープ及び合成gp41 Ｂ−細胞エピトープ（残基727か
ら751）に対するIgG抗体の存在が検出された。マウスの
抗体血清を用いた場合にも、血清希釈率1/10で行った標
準的組織培養による多核細胞阻害検定で、HIV−１のLAV
−1BRU及びHTLV−IIIMN系統に対するHIV−１に特異的な
中和活性が認められた。これらの結果は、HIV様粒子が
各種の単離ウイルスに対して交差反応的免疫反応を誘導
することができることを暗示している。さらに、p24コ
アー抗体として1.5μｇのウイルス様粒子で２回目に追
加免疫処置した動物から得た血清でも、抗体の交差反応
が認められた。各種のHIV遺伝子組替え抗原に特異的なI
gG反応は、図８及び９に示すように、HIV−１ gp120及
びgp160に対して強力であるばかりか、HIV−２ gp120
に対しても著しい反応を示した。これらの結果は、HIV
様粒子交差反応性免疫反応の誘導において、効果的な免
疫原であることを実証している。
p24タンパクに対する著しいIgG抗体反応が実証された。
ABIモデル430Aペプチドシンセサイザー上で固相化学合
成法が合成されたペプチドをコートしたマイクロタイタ
ープレートを用いたペプチド特異性EIA′ｓで、gp120の
残遺311から320を取り囲む主要な合成HIV−１中和エピ
トープ及び合成gp41 Ｂ−細胞エピトープ（残基727か
ら751）に対するIgG抗体の存在が検出された。マウスの
抗体血清を用いた場合にも、血清希釈率1/10で行った標
準的組織培養による多核細胞阻害検定で、HIV−１のLAV
−1BRU及びHTLV−IIIMN系統に対するHIV−１に特異的な
中和活性が認められた。これらの結果は、HIV様粒子が
各種の単離ウイルスに対して交差反応的免疫反応を誘導
することができることを暗示している。さらに、p24コ
アー抗体として1.5μｇのウイルス様粒子で２回目に追
加免疫処置した動物から得た血清でも、抗体の交差反応
が認められた。各種のHIV遺伝子組替え抗原に特異的なI
gG反応は、図８及び９に示すように、HIV−１ gp120及
びgp160に対して強力であるばかりか、HIV−２ gp120
に対しても著しい反応を示した。これらの結果は、HIV
様粒子交差反応性免疫反応の誘導において、効果的な免
疫原であることを実証している。
実施例９ 本実施例は、誘導発現ベクターをベロ（Vero）細胞に
形質移行した場合のHIV様粒子の誘導発現を説明するも
のである。
形質移行した場合のHIV様粒子の誘導発現を説明するも
のである。
図10はHIV発現ベクターpMT−HIVの地図を示す。pMT−
HIVは先の発現ベクターと類似であるが、ヌクレオチド
位置678で始まるHIV−１コード配列のすぐ上流に位置
し、ヌクレオチド位置−742から＋59にヒトメタロチオ
ネインII aプロモーターを含んでいる。このプラスミド
は1990年10月12日からアメリカンタイプカルチャーコレ
クションで保存されている（＃40912）。pMT−HIVをG41
8抵抗性マーカーとともにベロ（Vero）細胞に形質移行
して多くのG418抵抗性コロニーを分離し、塩化カドミウ
ム（CdCl2）を添加してRTの生産を試験した。各クロー
ンを9cmのシャーレで細胞融合期まで培養し、５μＭのC
dCl2で24時間処理した後、実施例２で述べたごとく、8m
lの培地上清から集めた高分子物質について、標準的な
検定法でRT活性を測定した。これらの結果から、少なく
とも30％のクローンで、著しいレベルのRT活性が認めら
れた。誘導条件のない場合には、わずかなベロ（Vero）
細胞のクローンの上清でRT活性が検出された。次の表II
には、CdC12の存在下及び非存在下における６種のクロ
ーンの培地上清で検出されたp24抗原の生産性を示す。
HIVは先の発現ベクターと類似であるが、ヌクレオチド
位置678で始まるHIV−１コード配列のすぐ上流に位置
し、ヌクレオチド位置−742から＋59にヒトメタロチオ
ネインII aプロモーターを含んでいる。このプラスミド
は1990年10月12日からアメリカンタイプカルチャーコレ
クションで保存されている（＃40912）。pMT−HIVをG41
8抵抗性マーカーとともにベロ（Vero）細胞に形質移行
して多くのG418抵抗性コロニーを分離し、塩化カドミウ
ム（CdCl2）を添加してRTの生産を試験した。各クロー
ンを9cmのシャーレで細胞融合期まで培養し、５μＭのC
dCl2で24時間処理した後、実施例２で述べたごとく、8m
lの培地上清から集めた高分子物質について、標準的な
検定法でRT活性を測定した。これらの結果から、少なく
とも30％のクローンで、著しいレベルのRT活性が認めら
れた。誘導条件のない場合には、わずかなベロ（Vero）
細胞のクローンの上清でRT活性が検出された。次の表II
には、CdC12の存在下及び非存在下における６種のクロ
ーンの培地上清で検出されたp24抗原の生産性を示す。
p24のレベルは市販のHIV−１ p24検定キットを用い
て測定した。得られた結果から、１個のクローン（クロ
ーン11）できわめて高いレベルの表現が認められ、６個
のクローン全てで高い誘導比が認められた。
て測定した。得られた結果から、１個のクローン（クロ
ーン11）できわめて高いレベルの表現が認められ、６個
のクローン全てで高い誘導比が認められた。
実施例10 本実施例は、誘導発現ベクターpMT−HIVを安定的に形
質移行ベロ（Vero）細胞クローン11における成熟HIV様
粒子の生産を説明するものである。
質移行ベロ（Vero）細胞クローン11における成熟HIV様
粒子の生産を説明するものである。
75cm2の培養フラスコで培養した亜融合期の細胞を５
μＭのCdCl2で24時間処理し、ついでフラスコから掻き
取り、実施例７に述べたように処理して薄切片を電子顕
微鏡で検鏡した。電子顕微鏡像は、形質移行細胞の原形
質膜から発芽している多数の未成熟または成熟したウイ
ルス様粒子が認められた。これらの粒子形成レベルは、
このクローンで認められた高レベルのp24及びRT生産と
一致した。
μＭのCdCl2で24時間処理し、ついでフラスコから掻き
取り、実施例７に述べたように処理して薄切片を電子顕
微鏡で検鏡した。電子顕微鏡像は、形質移行細胞の原形
質膜から発芽している多数の未成熟または成熟したウイ
ルス様粒子が認められた。これらの粒子形成レベルは、
このクローンで認められた高レベルのp24及びRT生産と
一致した。
実施例11 本実施例は、８日間にわたってCdCl2で連続誘導した
ベロ（Vero）細胞クローンIIのフラスコ１本中のRT活性
及びp24コアー抗原の連続的生産を説明するものであ
る。
ベロ（Vero）細胞クローンIIのフラスコ１本中のRT活性
及びp24コアー抗原の連続的生産を説明するものであ
る。
75cm2の培養フラスコ中でクローン11細胞を融合期ま
で培養し、ついで５μＭのCdCl2で24時間処理した後、
全ての培地を収穫し、CdCl2を含む新鮮な培地を加え
た。この操作を24時間毎、８日間にわたって行い、各24
時間毎の培地の上清中におけるRT及びp24の生産レベル
を図11に示す。RTとp24の生産レベルはきわめて高い相
関性を示し、細胞が融合期に達してから５日後に最高値
を示した。
で培養し、ついで５μＭのCdCl2で24時間処理した後、
全ての培地を収穫し、CdCl2を含む新鮮な培地を加え
た。この操作を24時間毎、８日間にわたって行い、各24
時間毎の培地の上清中におけるRT及びp24の生産レベル
を図11に示す。RTとp24の生産レベルはきわめて高い相
関性を示し、細胞が融合期に達してから５日後に最高値
を示した。
実施例12 本実施例は、遺伝学的に修飾したエンベロープ糖タン
パクを有するHIV様粒子の製造を説明するものである。
パクを有するHIV様粒子の製造を説明するものである。
gp120の構造を変更すると、gp41に対するその結合性
が減少し、したがって粒子の表面から洗い落される可能
性が考えられる。gp160エンベロープ糖タンパクのタン
パク加水分解工程を阻害するような突然変異は、この問
題を解決し、ウイルス様粒子と安定的に関連した未解裂
の糖タンパク前駆体を表現させることができる。LAV−1
BRU gp160エンベロープ糖タンパク遺伝子のコドン位置
455は、gp160エンベロープ糖タンパクにおけるタンパク
加水分解部位であるアルギニン残基をコード化してい
る。市販のM13ファージーベース部位指向突然変異キッ
ト（Amersham）及びこのコドンに接する領域を補足する
適当な突然変異原性合成オリゴヌクレオチドを用いて、
このコドンに突然変異を起こさせ、スレオニン残基をコ
ード化させた。この突然変異はエンベロープ糖タンパク
遺伝子のクローン化したサブフラグメントに起こさせ、
これを用いてpHIV−SV粒子発現プラスミドの相当する領
域を置換した。この修飾プラスミドをCOS細胞に形質移
行させると、gp160エンベロープ糖タンパク前駆体をと
もなった高分子のウイルス様物質が表現されることが、
ウエスタン分析により確認された。gp120が検出されな
かったことは、タンパク加水分解の過程が撹乱されたこ
とを示している。gp160エンベロープタンパクがウイル
ス様粒子に関連して残存していることは、一時的形質移
行実験で生産された粒子をシュークロース濃度勾配遠心
分離で分画することにより実証された。gp160前駆体タ
ンパクはRT活性を含む画分にのみ存在し、それよりも重
いか、または軽い画分では検出されないことが、ウエス
タン分析で確認された。
が減少し、したがって粒子の表面から洗い落される可能
性が考えられる。gp160エンベロープ糖タンパクのタン
パク加水分解工程を阻害するような突然変異は、この問
題を解決し、ウイルス様粒子と安定的に関連した未解裂
の糖タンパク前駆体を表現させることができる。LAV−1
BRU gp160エンベロープ糖タンパク遺伝子のコドン位置
455は、gp160エンベロープ糖タンパクにおけるタンパク
加水分解部位であるアルギニン残基をコード化してい
る。市販のM13ファージーベース部位指向突然変異キッ
ト（Amersham）及びこのコドンに接する領域を補足する
適当な突然変異原性合成オリゴヌクレオチドを用いて、
このコドンに突然変異を起こさせ、スレオニン残基をコ
ード化させた。この突然変異はエンベロープ糖タンパク
遺伝子のクローン化したサブフラグメントに起こさせ、
これを用いてpHIV−SV粒子発現プラスミドの相当する領
域を置換した。この修飾プラスミドをCOS細胞に形質移
行させると、gp160エンベロープ糖タンパク前駆体をと
もなった高分子のウイルス様物質が表現されることが、
ウエスタン分析により確認された。gp120が検出されな
かったことは、タンパク加水分解の過程が撹乱されたこ
とを示している。gp160エンベロープタンパクがウイル
ス様粒子に関連して残存していることは、一時的形質移
行実験で生産された粒子をシュークロース濃度勾配遠心
分離で分画することにより実証された。gp160前駆体タ
ンパクはRT活性を含む画分にのみ存在し、それよりも重
いか、または軽い画分では検出されないことが、ウエス
タン分析で確認された。
さらに、gp120エンベロープ糖タンパク構造の修飾が
可能であることは、LAV−1BRU DNA配列のヌクレオチド
位置7008のBgIII部位に２対の合成オリゴヌクレオチド
を挿入することにより実証された。これらのオリゴヌク
レオチドを挿入することにより、コード配列が修飾さ
れ、挿入したエレメントはウイルスのエンベロープ糖タ
ンパクのアミノ酸残基306から329を取り囲むHTLV−III
MNV3中和エピトープをコード化した。得られた配列は、
アミノ酸位置272にMNストレインV3ループ挿入を有する
完全なLAV−1BRUエンベロープ糖タンパクをコード化し
た。得られたプラスミドはpV3Bgと命名し、1990年10月1
2日にアメリカン タイプ カルチャー コレクション
に保管された（＃49010）。修飾に用いたオリゴヌクレ
オチドは以下の通りである。
可能であることは、LAV−1BRU DNA配列のヌクレオチド
位置7008のBgIII部位に２対の合成オリゴヌクレオチド
を挿入することにより実証された。これらのオリゴヌク
レオチドを挿入することにより、コード配列が修飾さ
れ、挿入したエレメントはウイルスのエンベロープ糖タ
ンパクのアミノ酸残基306から329を取り囲むHTLV−III
MNV3中和エピトープをコード化した。得られた配列は、
アミノ酸位置272にMNストレインV3ループ挿入を有する
完全なLAV−1BRUエンベロープ糖タンパクをコード化し
た。得られたプラスミドはpV3Bgと命名し、1990年10月1
2日にアメリカン タイプ カルチャー コレクション
に保管された（＃49010）。修飾に用いたオリゴヌクレ
オチドは以下の通りである。
５′GATCTCGGACCGCCTACAATAAAAGAAAAAGGATACATATAGGA
３′ ３′AGCCTGGCGGATGTTATTTTCTTTTTCCTATGTATATCCTGGTCCC
TC ５′ ５′CCAGGGAGAGCATTTTATACAACAAAAAATATAATAGGAACGCGTA
３′ ３′TCGTAAAATATGTTGTTTTTTATATTATCCTTGCGCATCTAG5′ 形質移行細胞の上清を20％グリセロール中で遠心分離し
て得られたペレットをウエスタン法で分析したところ、
非修飾の発現ベクターで認められたレベルと同等のレベ
ルで、gp120を含む微粒子が生産されることが実証され
た。これらのデータは、LAV−１エンベロープのアミノ
酸位置272に24個のアミノ酸残基を余分に挿入しても、
そのウイルス膜に対する標的、エンベロープ糖タンパク
前駆体の処理、またはgp41膜間糖タンパクとの非共有関
係が撹乱されないことを実証するものである。したがっ
て、残りのgp120は修飾されずに残り、そのためエンベ
ロープ糖タンパクの免疫原性をさらに調節することが可
能と考えられる。
３′ ３′AGCCTGGCGGATGTTATTTTCTTTTTCCTATGTATATCCTGGTCCC
TC ５′ ５′CCAGGGAGAGCATTTTATACAACAAAAAATATAATAGGAACGCGTA
３′ ３′TCGTAAAATATGTTGTTTTTTATATTATCCTTGCGCATCTAG5′ 形質移行細胞の上清を20％グリセロール中で遠心分離し
て得られたペレットをウエスタン法で分析したところ、
非修飾の発現ベクターで認められたレベルと同等のレベ
ルで、gp120を含む微粒子が生産されることが実証され
た。これらのデータは、LAV−１エンベロープのアミノ
酸位置272に24個のアミノ酸残基を余分に挿入しても、
そのウイルス膜に対する標的、エンベロープ糖タンパク
前駆体の処理、またはgp41膜間糖タンパクとの非共有関
係が撹乱されないことを実証するものである。したがっ
て、残りのgp120は修飾されずに残り、そのためエンベ
ロープ糖タンパクの免疫原性をさらに調節することが可
能と考えられる。
実施例13 本実施例は、感染性には必要であるが、ウイルス様粒
子の生産には必要がないHIV−１配列エレメントに突然
変異を起こさせることが可能であることを説明するもの
である。
子の生産には必要がないHIV−１配列エレメントに突然
変異を起こさせることが可能であることを説明するもの
である。
感染性に必要な遺伝子エレメントに別の突然変異を含
む表現構造物を用いてHIV様粒子が生産できることを実
証するため、RNA封入シグナルを欠く発現プラスミドを
作り出した。このシグナルはヌクレオチド位置744の最
初のスプライスドナーとヌクレオチド790のGag開始コド
ンの間に横たわり、HIVのRNA封入シグナル及び感染性に
決定的であることが認められている。LAV−1BRU（ヌク
レオチド位置678−9619）の8.9kb Sac I−Sac Iフラグ
メントを含むクローンからヌクレオチド位置678−791間
の114 bp Sac I−Hga I制限フラグメントを除くこと
により、この領域を欠失させた。除いたフラグメント
は、ヌクレオチド位置753−777の26bpを欠く二重螺旋構
造の合成フラグメントで置換した。ついで、このように
修飾したSac I−Sac IはSac I−Xho Iフラグメント（ヌ
クレオチド位置678−8944）を分離するためのDNAソース
として使用し、分離したSac I−Xho Iフラグメントは実
施例５で記載したpHIV−Ad−d26と同様なアデノウイル
ス主動後期プロモーターを用いたHIV発現ベクターの構
築に使用した。この新規なプラスミド（pHIV−Ad−d26
と呼ぶ）を実施例５と同様にCOS細胞に形質移行させ、
構造的にRT活性を表現するG418抵抗性クローンを分離し
た。それぞれ元の構造物及び「RNA封入欠失」表現構造
物を安定的に形質移行させたCOS細胞クローンの培地上
清200mlからウイルス様粒子をペレットとした。図12
は、これらの発現用構造物に由来するウイルス様粒子の
シュークローズ濃度勾配遠心分離のプロフィールを比較
したものである。封入欠失構造物に由来するウイルス様
粒子は、元の発現用構造物に由来するウイルス様粒子と
比較して顕著な差がなかった。
む表現構造物を用いてHIV様粒子が生産できることを実
証するため、RNA封入シグナルを欠く発現プラスミドを
作り出した。このシグナルはヌクレオチド位置744の最
初のスプライスドナーとヌクレオチド790のGag開始コド
ンの間に横たわり、HIVのRNA封入シグナル及び感染性に
決定的であることが認められている。LAV−1BRU（ヌク
レオチド位置678−9619）の8.9kb Sac I−Sac Iフラグ
メントを含むクローンからヌクレオチド位置678−791間
の114 bp Sac I−Hga I制限フラグメントを除くこと
により、この領域を欠失させた。除いたフラグメント
は、ヌクレオチド位置753−777の26bpを欠く二重螺旋構
造の合成フラグメントで置換した。ついで、このように
修飾したSac I−Sac IはSac I−Xho Iフラグメント（ヌ
クレオチド位置678−8944）を分離するためのDNAソース
として使用し、分離したSac I−Xho Iフラグメントは実
施例５で記載したpHIV−Ad−d26と同様なアデノウイル
ス主動後期プロモーターを用いたHIV発現ベクターの構
築に使用した。この新規なプラスミド（pHIV−Ad−d26
と呼ぶ）を実施例５と同様にCOS細胞に形質移行させ、
構造的にRT活性を表現するG418抵抗性クローンを分離し
た。それぞれ元の構造物及び「RNA封入欠失」表現構造
物を安定的に形質移行させたCOS細胞クローンの培地上
清200mlからウイルス様粒子をペレットとした。図12
は、これらの発現用構造物に由来するウイルス様粒子の
シュークローズ濃度勾配遠心分離のプロフィールを比較
したものである。封入欠失構造物に由来するウイルス様
粒子は、元の発現用構造物に由来するウイルス様粒子と
比較して顕著な差がなかった。
実施例14 本実施例は、非感染性SIV様粒子の製造を説明するも
のである。
のである。
HIV以外のレトロウイルスに由来するウイルス様粒子
の製造に本発明が適用できることを実証するため、SIV
mac239プロウイルスからのDNAフラグメントを含むSIV発
現ベクターを構築した。SIVmac239プロウイルスのヌク
レオチド配列は現在公表されていないが、この制限地図
を配列が明らかにされているSIVmac142と比較すると、
多くの類似性が認められた。SIVmac142のニュクレオチ
ド位置835のNar I制限部位と位置5756及び9236における
２つのSst I制限部位がSIVmac239プロウイルスに保存さ
れていた。したがって、SIVmac239プロウイルスの4.9kb
Nar I−Sst I及び3.4kb Sst I−Sst Iの２つのフラ
グメントをクローン化したSIVmac239プロウイルスから
分離し、先にLAV−1BRUの実施例で述べたように、SV40
ウイルス早期プロモーターを用いて発現ベクターに挿入
した。このプラスミド（pSIV−SVと呼ぶ）をCOS細胞に
形質移行させると、実施例２でLAV−1BRUについて述べ
たように、RT活性を一時的に発現させた。pSIV−SVをG4
18抵抗性マーカーとともにベロ（Vero）細胞に形質移行
させると、実施例５でpHIV−AdのCOS細胞への形質移行
について述べたように、構造的にRT活性を発現する薬剤
抵抗性のクローンを分離することができた。
の製造に本発明が適用できることを実証するため、SIV
mac239プロウイルスからのDNAフラグメントを含むSIV発
現ベクターを構築した。SIVmac239プロウイルスのヌク
レオチド配列は現在公表されていないが、この制限地図
を配列が明らかにされているSIVmac142と比較すると、
多くの類似性が認められた。SIVmac142のニュクレオチ
ド位置835のNar I制限部位と位置5756及び9236における
２つのSst I制限部位がSIVmac239プロウイルスに保存さ
れていた。したがって、SIVmac239プロウイルスの4.9kb
Nar I−Sst I及び3.4kb Sst I−Sst Iの２つのフラ
グメントをクローン化したSIVmac239プロウイルスから
分離し、先にLAV−1BRUの実施例で述べたように、SV40
ウイルス早期プロモーターを用いて発現ベクターに挿入
した。このプラスミド（pSIV−SVと呼ぶ）をCOS細胞に
形質移行させると、実施例２でLAV−1BRUについて述べ
たように、RT活性を一時的に発現させた。pSIV−SVをG4
18抵抗性マーカーとともにベロ（Vero）細胞に形質移行
させると、実施例５でpHIV−AdのCOS細胞への形質移行
について述べたように、構造的にRT活性を発現する薬剤
抵抗性のクローンを分離することができた。
さらに、SIV様粒子の製造に関する証拠を提供するた
めに、pSIV−SVを安定的に形質移行させたベロ（Vero）
細胞から培地の上清を採取し、100,000xgで遠心分離し
てウイルス様粒子をペレットとした。ペレット化した物
質は、SDS−PAGE及びサルのSIV特異性抗体血清を用いた
ウエスタン法で分析した。データを分析したところ、主
要なSIV抗原の発現と一致する分子量のバンドが認めら
れた。これらのバンドは、形質移行を行わなかったベロ
（Vero）細胞の培地からは検出されなかった。
めに、pSIV−SVを安定的に形質移行させたベロ（Vero）
細胞から培地の上清を採取し、100,000xgで遠心分離し
てウイルス様粒子をペレットとした。ペレット化した物
質は、SDS−PAGE及びサルのSIV特異性抗体血清を用いた
ウエスタン法で分析した。データを分析したところ、主
要なSIV抗原の発現と一致する分子量のバンドが認めら
れた。これらのバンドは、形質移行を行わなかったベロ
（Vero）細胞の培地からは検出されなかった。
実施例15 本実施例は、ウイルスの感染性には必要であるが、粒
子の組立には必要がないタンパクをコード化したプロウ
イルスゲノムを欠く発現ベクターを用いて、HIV様粒子
を発現できることを説明するものである。
子の組立には必要がないタンパクをコード化したプロウ
イルスゲノムを欠く発現ベクターを用いて、HIV様粒子
を発現できることを説明するものである。
実施例９で述べたpMT−HIV発現ベクターを修飾して、
実施例13で述べたようにRNA封入領域のヌクレオチド26
を除去した。さらに、Vif及びインテグラーゼ遺伝子を
コード化したHIVコード配列も除去した。Vif及びインテ
グラーゼ遺伝子はウイルスの感染性には必要であるが、
粒子の組立には必要がない。この２回目に行った遺伝子
の除去は、LAV−1BRUゲノムのヌクレオチド位置4345及
び5091のBspm I制限部位の間の746bpのフラグメントを
除去することにより行った。得られた発現プラスミド
（pMT−HIV−dVI−d26と呼ぶ）は、1990年10月12日にア
メリカン タイプ カルチャー コレクションに保存さ
れた（＃40911）。pMT−HIV−dVI−d26をCOS細胞に形質
移行させると、一時的発現検定で、培地の上清中に顕著
なp24の発現が認められたが、RT活性は検出されなかっ
た。RT活性がないことから、近隣のインテグラーゼの突
然変異によってRTタンパク合成が影響をうけたものと考
えられる。ウイルス様粒子が組み立てられたことを示す
証拠は、形質移行細胞の培地の上清を20％グリセロール
中で高速遠心してペレット化した物質をウエスタン法で
分析することにより得た。その結果、顕著なgp120の存
在が認められた。形質移行を行わなかった細胞では、p2
4及びgp120の生産が検出されなかった。
実施例13で述べたようにRNA封入領域のヌクレオチド26
を除去した。さらに、Vif及びインテグラーゼ遺伝子を
コード化したHIVコード配列も除去した。Vif及びインテ
グラーゼ遺伝子はウイルスの感染性には必要であるが、
粒子の組立には必要がない。この２回目に行った遺伝子
の除去は、LAV−1BRUゲノムのヌクレオチド位置4345及
び5091のBspm I制限部位の間の746bpのフラグメントを
除去することにより行った。得られた発現プラスミド
（pMT−HIV−dVI−d26と呼ぶ）は、1990年10月12日にア
メリカン タイプ カルチャー コレクションに保存さ
れた（＃40911）。pMT−HIV−dVI−d26をCOS細胞に形質
移行させると、一時的発現検定で、培地の上清中に顕著
なp24の発現が認められたが、RT活性は検出されなかっ
た。RT活性がないことから、近隣のインテグラーゼの突
然変異によってRTタンパク合成が影響をうけたものと考
えられる。ウイルス様粒子が組み立てられたことを示す
証拠は、形質移行細胞の培地の上清を20％グリセロール
中で高速遠心してペレット化した物質をウエスタン法で
分析することにより得た。その結果、顕著なgp120の存
在が認められた。形質移行を行わなかった細胞では、p2
4及びgp120の生産が検出されなかった。
実施例16 本実施例は、修飾発現ベクター中のgp120コード配列
を除去したため、gp120エンベロープ糖タンパクを欠くH
IV様粒子の製造を説明するものである。
を除去したため、gp120エンベロープ糖タンパクを欠くH
IV様粒子の製造を説明するものである。
HIV発現ベクターpHIV−SVを修飾して、gp120エンベロ
ープ糖タンパクを欠くウイルス様粒子の生産をコード化
した。この修飾は、ヌクレオチド6379のKpn I部位とヌ
クレオチド7668のBgl II部位の間のフラグメントを除去
することにより行った。残った制限末端は、クレノウ
（Klenow）のDNAポリメラーゼで処理して、Kpn Iの３′
張出しを除き、Bgl II末端の５′張出しを充足した。そ
の鈍端をBgl IIリンカー（Pharmacia,5′−pd［CAGATCT
GI−３′）に結紮し、ついでこのリンカーをBgl IIで解
裂させ、両突出末端を一緒に結紮した。この結紮は、後
に異種起源のコード配列を挿入できるように、gp120リ
ーディングフレームが残るように修復した。このプラス
ミド（pBL−HIV−dgp120−６と呼ぶ）は、1990年10月12
日にアメリカン タイプ カルチャー コレクションに
保管された（＃40913）。
ープ糖タンパクを欠くウイルス様粒子の生産をコード化
した。この修飾は、ヌクレオチド6379のKpn I部位とヌ
クレオチド7668のBgl II部位の間のフラグメントを除去
することにより行った。残った制限末端は、クレノウ
（Klenow）のDNAポリメラーゼで処理して、Kpn Iの３′
張出しを除き、Bgl II末端の５′張出しを充足した。そ
の鈍端をBgl IIリンカー（Pharmacia,5′−pd［CAGATCT
GI−３′）に結紮し、ついでこのリンカーをBgl IIで解
裂させ、両突出末端を一緒に結紮した。この結紮は、後
に異種起源のコード配列を挿入できるように、gp120リ
ーディングフレームが残るように修復した。このプラス
ミド（pBL−HIV−dgp120−６と呼ぶ）は、1990年10月12
日にアメリカン タイプ カルチャー コレクションに
保管された（＃40913）。
COS細胞にpBL−HIV−gdp120−６を形質移行させる
と、一時的発現検定で、RT活性を有する高分子物質を生
成することが認められた。培地の上清を20％グリセロー
ル中で高速遠心して得られたペレットをウエスタン法で
分析したところ、p24及びp17 gagタンパクの発現が認
められたが、gp120の発現は認められなかった。元ののp
HIV−SV発現プラスミドを形質移行させた対照実験で
は、ペレット中に顕著なHIV−１ gp120が検出された。
と、一時的発現検定で、RT活性を有する高分子物質を生
成することが認められた。培地の上清を20％グリセロー
ル中で高速遠心して得られたペレットをウエスタン法で
分析したところ、p24及びp17 gagタンパクの発現が認
められたが、gp120の発現は認められなかった。元ののp
HIV−SV発現プラスミドを形質移行させた対照実験で
は、ペレット中に顕著なHIV−１ gp120が検出された。
開示内容の要約 本発明の開示内容を要約すると、本発明は、AIDS等の
レトロウイルスに対するワクチンとして使用できる遺伝
子工学により調製された非感染性で、かつ免疫原性を有
するレトロウイルス様粒子及びその製造法を提供するも
のである。本発明の範囲内で、修飾が可能である。
レトロウイルスに対するワクチンとして使用できる遺伝
子工学により調製された非感染性で、かつ免疫原性を有
するレトロウイルス様粒子及びその製造法を提供するも
のである。本発明の範囲内で、修飾が可能である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 7/00 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｑ 1/70 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/70 (Ｃ１２Ｐ 21/00 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ロヴィンスキー、ベンジャミン カナダ国 エル４ジェイ ５エイチ６ オンタリオ州 ソーンヒル バインディ ング レーン 70 (72)発明者 カオ、シー シーアン カナダ国 エム９シー ４エックス６ オンタリオ州 エトビコーク ザ ウエ スト モール 716 エイピーティー. ナンバー 408 (56)参考文献 特開 平１−120284（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−104325（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−500985（ＪＰ，Ａ) 欧州特許公開335635（ＥＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．82（1985）Ｐ. 3101−3105 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．333（1988) Ｐ．475−461
Claims (10)
- 【請求項１】非感染性で、複製せず、免疫原性を有し、
かつgag、pol及びenv遺伝子産物を含む天然の形態を実
質的に有するHIVまたはSIVレトロウイルス様粒子の製造
に用いるDNA分子であって、 gag、pol及びenv遺伝子を天然HIVまたはSIVレトロウイ
ルスゲノム中の配列で含み、ロングターミナルリピート
を欠く部分的変更がなされたHIVまたはSIVレトロウイル
スゲノムのDNA配列と、 該DNA配列に機能的に接続された該DNA配列の哺乳動物細
胞中での発現用の異種プロモーターと、 を有することを特徴とするDNA分子。 - 【請求項２】前記DNA配列がHIV−１ BRU 単離体のSac
I（678）−Xho I（8944）ゲノム断片の遺伝学的特性を
有するエレメントを含む請求項１に記載のDNA分子。 - 【請求項３】前記DNA配列が、プライマー結合部位を欠
く請求項１または２に記載のDNA分子。 - 【請求項４】インテグラーゼ及びVifをコードする領域
を欠く請求項１〜３のいずれかに記載のDNA分子。 - 【請求項５】非感染性で、複製せず、免疫原性を有し、
かつgag、pol及びenv遺伝子産物を含む天然の形態を実
質的に有するレトロウイルス様粒子の製造方法であっ
て、 請求項１〜４のいずれかに記載のDNA分子を発現ベクタ
ーに組み込む過程と、 該DNA分子が組み込まれた発現ベクターを哺乳動物細胞
に導入して形質転換された哺乳動物細胞を製造する過程
と、 該形質転換された哺乳動物細胞を培養して前記レトロウ
イルス様粒子を製造する過程と を有することを特徴とするレトロウイルス様粒子の製造
方法。 - 【請求項６】前記DNA分子が組み込まれた発現ベクター
が、プラスミドpHIV−SV、pHIV−CHO−SV、pHIV−Ad、p
MT−HIV、pV3BgまたはpMT−HIV−dVI−d26である請求項
５に記載の製造方法。 - 【請求項７】非感染性で、複製せず、免疫原性を有する
レトロウイルス様粒子であって、請求項５〜６のいずれ
かに記載の方法で得られ、かつ少なくともgag、pol及び
env遺伝子産物からなる天然の形態を実質的に有するこ
とを特徴とするレトロウイルス様粒子。 - 【請求項８】異種HIV単離体からのV3中和エピトープが
エンベロープ糖蛋白質のBgl II部位に挿入されている
請求項７に記載のレトロウイルス様粒子。 - 【請求項９】免疫分析用サンプルを作成する方法におい
て、試料中のレトロウイルス抗原の存在を検出するため
に、請求項７または８に記載のレトロウイルス様粒子を
用いることを特徴とする方法。 - 【請求項１０】レトロウイルス感染に対するワクチンで
あって、請求項７または８に記載のレトロウイルス様粒
子と、生理学的に許容される担体を含むことを特徴とす
るワクチン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB898923123A GB8923123D0 (en) | 1989-10-13 | 1989-10-13 | A vaccine for human immunodeficiency virus |
| GB8923123.7 | 1989-10-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04506301A JPH04506301A (ja) | 1992-11-05 |
| JP2537570B2 true JP2537570B2 (ja) | 1996-09-25 |
Family
ID=10664542
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2513524A Expired - Lifetime JP2537570B2 (ja) | 1989-10-13 | 1990-10-12 | エイズ及びその他のレトロウイルス病用ワクチンの遺伝子工学による製造 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0495811B1 (ja) |
| JP (1) | JP2537570B2 (ja) |
| AT (1) | ATE211766T1 (ja) |
| CA (1) | CA2067333C (ja) |
| DE (1) | DE69033896T2 (ja) |
| DK (1) | DK0495811T3 (ja) |
| ES (1) | ES2171156T3 (ja) |
| GB (1) | GB8923123D0 (ja) |
| WO (1) | WO1991005864A1 (ja) |
Families Citing this family (74)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO1991019803A1 (en) * | 1990-06-19 | 1991-12-26 | Applied Biotechnology, Incorporated | Self assembled, defective, nonself-propagating viral particles |
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| WO1992020790A1 (en) * | 1991-05-15 | 1992-11-26 | L'institut De Recherches Cliniques De Montreal | Transgenic non-human animal carrying a non-infectious hiv genome |
| US6268211B1 (en) | 1991-08-20 | 2001-07-31 | L'institut De Recherches Cliniques De Montreal | Non-infectious HIV transgene |
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