WO1997018836A1

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Publication number: WO1997018836A1
Application number: PCT/JP1996/001986
Authority: WO
Inventors: Eiji Miyoshi; Yoshito Ihara; Naoyuki Taniguchi
Original assignee: Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date: 1995-11-17
Filing date: 1996-07-17
Publication date: 1997-05-29
Also published as: JPH09143095A; JP3606536B2; US6153433A; AU6469496A

Description

明細書

ゥィルス複製抑制剤

技術分野

本発明は、肝臓又はその周辺組織の特定の酵素活性を增強させることによって、ウィルスの複製を抑制する薬剤に関する。

背景技術

ゥィルスはウイルス膜に糖タンパク質や糖脂質を持っている。糖脂質は宿主細胞の細胞膜由来であるが、糖タンパク質のタンパク質部分はウイルス特異的な遺伝子産物である。糖鎖は宿主細胞のゴルジ装置内でタンパク質部分に付加されるが、この過程で用いられる酵素系はウィルスのものではなく、宿主細胞の持つ酵素系が用いられる。例えば後天性免疫不全症候群、いわゆるエイズはヒト免疫不全ウィルス（H I V ) と呼ばれる一種のレトロウイルスが C D 4分子を発現している細胞に主に感染し、 C D 4陽性 T細胞を激減させる疾患であるが、 H I Vの感染においてはウィルスエンベロープ糖タンパク質である g P 1 2 0分子が重要な役割を果たしている。この g: p 1 2 0分子は重量にしてその約半分が糖鎖によつて占められており、これらの糖鎖の H I V感染過程における重要性について様々な報告がされている。例えば糖鎖を欠いた 8Γ p 1 2 0分子は C D 4との結合能を失うことが示されている。また H I V感染細胞は未感染細胞と共に培養すると合胞体が形成されるが、 g P 1 2 0分子の添加はこの合胞体形成を阻害するのに対し、糖鎖を欠いた gr P 1 2 0分子を添加しても阻害は起こらないことも示されている。ヒト C型肝炎ウィルス（H C V ) のエンベロープを構成していると考えられている E 1及び E 2は共に糖タンパク質であり、共にその糖鎖の末端にシァル酸残基を持たず、末端に N—ァセチルダルコサミン残基を持つものが少数あることから H C Vが肝実質細胞上のァシァロ糖タンパク質リセプター、あるいは肝内皮細胞やマクロファージに見出されるマンノース結合タンパク質を介して肝脇に感染する可能性が示されている。更に、ヒト B型肝炎ウィルス（H B V ) はその粒子表面に HB s抗原と呼ばれる糖タンパク質を有しており、これらのタンパクは 2本のァスパラギン結合型糖鎖を持っている。これらの糖鎖はウイルスの複製、輸送、分泌の各過程において、重要な役割を果たしていることが示されている。

現在までに、このようなウィルス糖タンパク質の糖鎖に着目した抗ウィルス剤の可能性が後つか示されている。例えばッニカマイシン等の N—グリコシド型糖鎖プロセッシング酴素の阻害剤の存在下で培養された H I V感染細胞には合胞体形成能やウイルス感染能がなくなることが示されている。例えばイミノ糖である N—プチルデォキシノジリマイシンによってヒト B型肝炎ウィルスの分泌を抑制した例が報告されている〔プロシーディングズォブザナショナルァカデミーォブサイエンシーズォブザ U S A (Proceedings of the Nat iona 1 Academy of Sciences of the USA) 、第 9 1巻、第 22 35~223 9頁（ 1 99 4 ) o

しかしながら、このような糖鎖プロセッシング阻害剤による処理は宿主細胞の糖鎖合成をかく乱させるため、当然宿主細胞の糖タンパク質の糖鎖構造も多大な影響を受けることになり、安全性の点で決して満足できるものではない。

ところで、本発明者らは細胞表層糖鎖の構造変化に関する研究過程でこれまでにラット及びヒトの N—ァセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ Π1 (以下、 G n T- 111 と略す）遺伝子を獲得することに成功している（特開平 6— 38 76 7号、同 6— 62865号各公報）。この酵素はァスパラギン結台型糖鎖の GlcNAc S l-4Man/91 構造、いわゆるバイセクティング GlcNAcを生成する。

既に本発明者らは、肝炎及び肝癌を自然発症する L E C ラットを用いた実験系において、肝炎発症時期である第 3ステージで N—ァセチルダルコサミニルトランスフラーゼ V (以下、 G n T— Vと略す）の活性が、また肝に癌組織がマク口的に観察される第 4ステージで G n T- 111 活性が、コントロールラットである L F Aに比べて著しく上昇することを見出している。また、この G n T— 11 I は正常な肝臓にはほとんど発現していないが、ラット化学発癌過程の癌部位や前癌病変部位、腹水肝癌由来細胞、胎児肝、再生肝等において活性が上昇することを見出している。また、ヒトの肝炎、肝硬変、肝癌組織、あるいはこれら肝疾患患者の血清中の酵素発現量が上昇することが本発明者らによって報告されている〔バイオケミカルアンドバイオフィジカルリサーチコミュニケイシ β ンズ Biochenica 1 Biophysical Reseach Comnun ications) 、 ίβ 1 52巻、 1 07〜 1 1 2頁（ 1 98 8 ) ; クリニ力キミ力ァクタ（Clinica Chinica Ac ta) 、第 1 85巻、第 325~332頁（ 1 989 ) 〕。

既に述べたように、ゥィルス感染細胞において糖転移酵素の活性が変化することは知られているが、これらの現象を作用点としてウィルスの複製を抑制し、ゥィルス性疾患を治療する方法は開発されていない。

発明の目的

本発明の目的は、肝臓又はその周辺組織の特定の酵素活性を増強させることによって、ウイルスの複製を抑制する薬剤を提供することにある。

発明の概要

本発明を溉説すれば、本発明はウィルス複製抑制剤に関する発明であって、 G n T - III 又はその遣伝子を有効成分とすることを特徴とする。

本発明者らはゥィルスの感染と糖転移酵素活性との関係について鋭意研究を重ねた結果、従来、！jT-疾患のステージの進行度と酵素活性が正の相関を持つと報告されていた G n T— 111 を B型肝炎ウィルス感染細胞に導入すると、意外なことにその細胞における B型肝炎ウイルス遺伝子の発現を抑制することができるという驚くべき事実を発見し、本発明を完成するに至ったものである。

発明の詳細な記述

本明細書において、 G n T— III 活性を有するボリペプチドとは、天然型の G n T -111 のみならず、 G n T— III 活性を有する限り天然型のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、付加、挿入、置換等によりアミノ酸配列が改変されたポリぺプチドをも本発明に含む意味である。

また、ここで言う天然型 G n T - I I 1 としては、例えばヒト又はラット由来のものが挙げられる力;、本発明においてはこれに限定されるものではなく、他の動物、植物等の生物体由来のもの、あるいは細菌類、酵母類、放線菌類、糸状菌類、子 S菌類、担子菌類等の微生物由来のものも含まれる。

また、本明細書において、機能的に同等の活性を有するポリペプチドとは、以下のようなものをいう。

天然に存在するタンパク質にはそれをコードする遺伝子の多形や変異のほかに、生成後のタンパク質の生休内及び精製中の修飾反応などによって、そのアミノ酸配列中にアミノ酸の欠失、挿入、付加、隱換等の変異が起こりうるが、それにも閱わらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に差異があっても、その機能については大きな違いが認められないものを機能的に同等の活性を有するボリぺプチドと呼ぶ。

人為的にタンパク質のァミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合でも同様であり、この埸合は更に多褪多様の変異体を作製することが可能であるが、変異を有しないものと実質的に同等の生理活性を示す限り、これらの変異体は機能的に同等の活性を有するボリぺプチドと解釈される。

例えば、大腸菌で発現されたタンパク質の N末端に存在するメチォニン残基は、多くの場合、メチォニンアミノぺプチダーゼの作用により除去されるとされているが、タンパク質の種類によってはメチォニン残基を持つもの、持たないものの両方が生成される。しかしながら、このメチォニン残基の有無はタンパク質の活性に影響を与えない場合が多い。また、ヒトインタ一ロイキン 2 ( 1 L— 2 ) のアミノ酸配列中の、あるシスティン残基をセリンに置換したボリべプチドがィンターロイキン 2活性を保持することが知られている〔サイエンス（Sc ience)、第 2 2 4巻、第 1 4 3 1頁（ 1 9 8 4 ) 〕。更に、遗伝子工学的にタンパク質の生産を行う際には、融合タンパク質として発現させることがしばしば行われる。例えば、目的のタンパク質の発現量を増加させるために、目的のタンパク質の N末端に他のタンパク質由来の N末端ぺブチド鎖を付加したり、目的のタンパク質の N末端、あるいは C末端に適当なぺプチド鎖を付加して発現させ、この付加したぺプチド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより、目的のタンパク質の精製を容易にすることなどが行われている。また、遺伝子上でァミノ酸を指定するコドン（ 3つの塩基の組合せ）は、ァミノ酸の種類ごとに 1〜6種類ずつが存在することが知られている。したがって、ァミノ酸配列をコ一ドする遺伝子はそのァミノ酸配列にもよるが、多数存在することができる。遺伝子は自然界において決して安定に存在しているものではなく、その核酸に変異が起こることはまれではない。遺伝子上に起こった変異がコードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じァミノ酸配列をコードする異なる遺伝子が生じたといえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子ができていく可能性は否定できない。

更に、同じァミノ酸配列をコ一ドする多種類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。

例えば、遺伝子工学的なタンパク質生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使 fflされているコドンが、使用している宿主中では使用頻度の低いものであった場合、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合には、コードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的のタンパク質の高発現を図ることが行われている。このように特定のァミノ酸配列をコ一ドする遺伝子を、人為的に多種類作製することが可能なことは言うまでもない。したがつて、これらの人為的に作製された異なるボリペプチドであっても、本発明に開示されたアミノ酸配列がコードされている限り、本発明に包含されるものである。更に、目的のタンパク質のアミノ酸配列に 1個若しくは複数個のァミノ酸残基を欠失、付加、挿入、若しくは置換の少なくとも 1 つを行ったポリペプチドも目的のタンパク質と機能的に同等の活性を有する場合が少なくないが、このようなボリぺプチドをコ一ドする遺伝子も、天然のものであれ人為的に作製されたものであれ、本発明に包含される。

一般に、機能的に同等の活性を有するボリペプチドは、それをコードする遺伝子が相同性を有することが多い。したがって、本発明に用いる遺伝子とハイプリダイズすることができ、 G n T— Π 1 活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子も本発明に含まれる。

図面の簡単な説明

図 1 は P C AG G Sべクターの制限酵素地図を示す図である。

図 2は G n T— 111 発現ブラスミド A c t - 5の模式図を示す図である。以下、本発明を詳細に I兑明する。

本発明においては、 B型肝炎ウィルス感染細胞に G n T— 111 を導入することによってその目的を達成することができる。 G n T— 111 を導入するには、例えばマイクロインジヱクシ s ン法などによって G n T— 111 を活性を保持したままで B型肝炎ウイルス感染細胞に直接導入してもよいし、また例えばウィルス等を使って G n T— 111 遺伝子を B型肝炎ウィルス感染細胞へ導入し、 G n T— 111 を発現させることによって本発明の目的を達成することができる。

すなわち、本発明の薬剤を用いれば G n T— ΙΠ 又は G n T— 111 をコードする遺伝子をゥィルス感染細胞又はその周辺組織に導入することができ、ウィルスの複製を抑制することができる。 G n T— 111 又は G n T— 111 をコードする遺伝子は組織表面の患部には直接注入すればよい。また組織内部の患部にも直接注入することもできるがドラッグデリバリ—システムを応用してもよい。ドラッグデリバリーシステム（D D S ) としては、ウィルス感染細胞に特異的なシステムであれば良い。

本発明の G n T— Il l 又はその遗伝子を有効成分とする薬剤をウィルス感染細胞又はその周辺組織に使用する場合、上記薬剤が最も効率よく効果を発揮するようにするのは当然のことである。

本発明のウィルス複製抑制剤は G n T— 111 、又はその遺伝子を医薬として許容される範囲で含有していれば良く、通常の遺伝子治療剤、タンパク質含有剤と同様に製剤化することができ、製剤中には担体、賦形剤、安定化剤等が含まれていても良い。

本発明のウィルス複製抑制剤として fflいられる G n T— 111 、又はその遺伝子の用量は ^齢、体重等の患者の状態、患部の程度などを考慮した上で調整すれば良い。

本発明のウィルス複製抑制剤に含有される G n T— 111 、又はその遺伝子は生体内物質であり、毒性はない。

本発明で用いられる G n T— 111 については、既にその詳細な酵素化学的性質が明らかにされており、例えばラット腎臓から表 1 に示す工程により調製することができる。

ェ程比活性 n nol /mg/h

1. ホモジネート 2. 1 6

2. トリトン抽出 8. 94

3. QAE—セファロース 42. 1

4. ヒドロキシアパタイト 74. 6

5 - C u 2+—キレ一ティングセファロ一ス 248

6. C o nAセファロース 578

7. C u 2+—キレーティングセファロース 820

8. UDP— へキサノールアミンァガロース 7 , 230

9. G n , G n— b i — A s nセファロ—ス 33 1 , 000

〔表中 G n, G n— b i — A s nは G l c NAc 8 l— 2Ma n a l — 6 ( G 1 c NAc /9 1— 2Ma n a l— 3) Ma n /31— 4 G 1 c NA c 9 l -4G l c N Ac— A s nの略である。 G n T— lIl 活性はバイオキミ力ェバイオフイジ力ァク夕（Biochinica et Biophysica Acta ) 、第 1035巻、第 3号、第 3 1 3〜 3 1 8頁（ 1 990 ) に記載の方法に準じ、 80 Mの蛍光基質を用いて測定し、酵素の比活性は、転移された G I c NAc (mo 1 ) /タンパク質 (m g) /時 f¾] ( h) で表し、ピリジル（一 2—）アミノ化 G 1 c N A cを標準物質として使用した。タンパク質は血清アルブミンを標準物質として、 B CAキット（ピアス社製）を用いて測定した〕

また、その遺伝子は、例えばヒト胎児肝 c DNAライブラリ一から井原らの方法〔ジャーナルォブバイオケミストリー（Journal of Biochemistry ) 、第 1 1 3巻、第 692〜698頁（ 1 993) 〕によって得ることができる。また、例えばラット腎臓の c DNAライブラリーから西河らの方法〔ジャーナルォブ 'ィォロジカケミストリ一 ( Journa I of B iolo ical Chemistry ) 、第 267巻、第 1 8 1 99~ 1 8204頁（ 1 992) 〕によって得られる遺伝子は、 B型肝炎ウイルス複製抑制の研究における適切な実験材料となりうる。また、例えば、ラット G n T— 111 については、特開平 6— 38767号公報に記載の方法で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている F E RM BP— 4352 (この菌株は Escherichia col i XLl-Blue SV3と命名、表示され通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 [日本国茨城県つくば市束 1丁目 1番 3号（郵便番号 305) ] に平成 4年 1月 22日に F E RM P — 1 27 1 8として寄託され、そして平成 5年 7月 5曰に前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所において原寄託よりブダぺスト条約に基づく国際寄託に移管）を用いて調製することができる。

また、例えばヒト G n T— 111 については、特開平 6— 62865号公報に記載の方法によって調製することができる。

配列表の配列番号 1にラット G n T— III をコードする遺伝子の DN A配列、及びそのァミノ酸配列を示す。また配列表の配列番号 2にヒト G n T— 1Π をコ一ドする遺伝子の D N A配列及びそのァミノ酸配列を示す。これらの遣伝子をブローブとして用いることにより、詨遺伝子にハイブリダィズし、 G n T— II 1 活性を示すタンパク質をコードする遺伝子を調製することができる。また配列表の配列番号 1又は 2で表される遺伝子を遺伝子工学的な置換、変異、切断処等を行うことによつても、更には配列表の配列番号 1又は 2で表される遺伝子にハイブリダィズし、かつ、 G nT— III 活性を示すタンパク質をコードする遺伝子を調製することができる。

これらの遺伝子、及び該遺伝子の発現タンパク質も本発明の薬剤として使用することができる。 /JP96/01986 遺伝子そのものを fflいて本発明の薬剤の G ηΤ-IIl を細胞に導入する場合、例えば G n T— 111 遺伝子とこれに関係する調節遺伝子を持つ組換えべクターを使用することで簡舉に G n T— ΙΠ 遺伝子を導入することができる。このように G n T - 111 そのもののプロモータ一以外にも、もちろん他の有効なプロモータ一、例えば S V 40プロモーター、レトロウイルス由来 L TRプロモータ一、ヒ — トシ a ックプロモー夕一、メタ口チォネインプロモーター、ァクチンプロ乇一夕一等を使用することができる。

G n T- 111 遺伝子の導入に際しては、ウィルスベクターを使って当該遺伝子を含むベクターを効率よく B型肝炎ウイルス未感染細胞あるいは感染細胞に導入させることによつて本発明の目的を逮成することができる。これらのベクタ一としては、従来から目的の D N Aを細胞に輪送することが知られておりかつ感染効率の高いレトロウィルスやワクシニアウィルス、更には非增殖性組換えウィルス等を用いることができる。特に、非增殖性組換えウィルスは、目的の細胞等に導入後、この組換えウィルスは增殖しないため 2週間から 2力月ごとに毎回用いる必要はあるカその際に量の調節を行えるという利点もある。また、人工の脂質カブセルであるリボソームを用いることができる。

本発明の薬剤として望ましいべクタ一の構築方法としては次に示すような方法が挙げられる。ヒト G n T— III の c D N Aを熊本大学の山村研一博士から供与された P CAGG Sベクタ一の E c o R Iサイトに導人し、ァクチンプロモ一夕一で制御される G n T— 111 の発現べク夕一を作製することができる。

図 1に P CAG GSべクターの制限酵素地図を示す。

ゥィルスの複製に関しては、例えば処理された細胞が培地中に産生するウィルス関連抗原である HB s抗原、あるいは HB e抗原の量を測定することによって、その複製の程度を知ることができる。すなわち、先に述べた G nT— 111 の発現べクタ一を S a 1 Iで直線化した D N Aと PME P 〔インビトロジン（Invi trogen) 社製、ハイグロマイシン耐性遺伝子を持つべクター〕を B amH Iで直線化した DN Aを混合し、前述の H u h— 6細胞に HBVゲノム遺伝子をタンデムに組込んだ細胞である HB 6 1 1細胞〔ブロン一ディングズォブザナショナルアカデミーォブサイエンシーズォブザ USA、第 84巻、第 444~448頁（ 1 987) ) にエレクトロボレ一シヨン法にて導入する。その後、ハイグロマイシンを含む培地で培養し耐性細胞株をスクリ一ニングする。こうして得られる G nT— 111 活性を発現している細胞株数株を選び、 HB s抗原あるいは H B e抗原の量を測定する。

HB s抗原、 HB e抗原の量の測定は、例えばラジオィムノアッセィ法で本発明者らが報告している方法〔インターナショナルジャーナルォブキャンサ一 ( International Journal of Cancer ；) 、第 52巻、第 1 37〜 1 40頁（ 1 992) 〕に従って測定することができる。

また、ウイルス関連のメッセンジャー RNA (mRNA) の量を測定することによってもウイルスの複製に関する情報を得ることができる。すなわち、 ³²Pでラベルしたウィルス c DNAをプロ一ブとしてノーザンブロットハイプリダイゼ —シヨン法によりウイルス閲违のメッセンジャー R N Aの量を評価することができる。

以上、本発明者らは G n T— III 遺伝子を導入した細胞でのウィルスタンパク質の発現を G nT— 111 遣伝子を導入していない細胞と比較したところ、 HBV を組込んだ HB 6 1 1細胞に G nT— III 遺伝子を導入した細胞では明らかにそのウィルス関連タンパク質の発現が低下していることを見出し、本発明を完成した。

本発明の薬剤は、ウイルス性疾患を治療する分野において宵用である。

実施例

以下に实施例を示して本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例 1 〔発現べクターの構築及び細胞への導入〕

ラット G n T— 1U のコ一ディング頟域全長を含む c D NAクローン C 4 〔ジヤーナルォブバイオロジカルケミストリー、第 26 7巻、第 1 8 1 99〜 1 8204頁（ 1 992) 〕を E c o R I (宝酒造社製）で消化後、 P C A G G Sベクタ一（熊本大学の山村研一博士から供与された）の E c o R Iサイトにクローニングした。図 1に p C A G G Sべクターの制限酵素地図を示す。

このようにして構築した発現ブラスミドを G n T— ΙΠ 発現プラスミド A c t 一 5 と命名した。この G n T— III 発現ブラスミド A c t — 5において、 G n T -III の発現はァクチンプロモーターによる制御を受けることになる。図 2に G n T - 111 発現プラスミド A c t— 5の模式図を示す。図中、上段の太実線（黒 ) はラット G n T— III の c D NAを示し、下段は P C A G G Sベクター（図 1 ) を示す。また、下段の縦縞の入っている箇所はァクチンプロモータ一を、斜線縞の入っている箇所は S V 40 o r i を示す。

この G n T— 111 発現プラスミド A c t— 5と pME Pベクタ一（インヴィトロジヱン社製、ハイグロマイシン耐性遺伝子を持つべクター）をそれぞれ S a 1 I (宝酒造社製）と B a mH I (宝酒造社製）で消化し直線化した後、 G n T— 111 発現プラスミド Ac t— 5を 20 w gと PME Pベクタ一 2 / gを混合し、 5 X 1 05 個の H B 6 1 1細胞にジーンパルサー（バイオラッド社製；電圧、 2 50 V/0. 4 c m ;静電容量、 960 F ) を用いたエレクトロボレーシヨン法によって導入した。なお、 H B 6 1 1細胞はヒト肝芽細胞腫由来 H u h— 6細胞に HBVゲノム遺伝子をタンデムに組込んだ細胞〔プロシーディングズォブザナショナルアカデミーォブサイエンシーズォブザ U SA、第 84巻、第 444〜 448頁（ 1 987) 〕であり、大阪大学、細胞工学センタ一の松原謙一博士から供与された物である。

遺伝子導入細胞の選抜はハイグロマイシン（500 sr/m l ) を含む培地で行い、耐性細胞株を希釈法によってクローン化した。その結果 G n T— 111 活性を持つ細胞株を 3株、 G n T— III 活性を持たない株を 3株得た。 G n T— 11 I 活性を持つ細胞（G n T— IH ポジティブ細胞）株を HB 6 1 1 -GNT-I1 I ( 1 ) 、 HB 6 1 1— GNT - 111 ( 2 ) 、 H B 61 1 - G N T - 111 (3) と命名し、 G nT— ΙΠ 活性を持たない細胞（G n T— ΠΙ ネガティブ細胞）株を HB 6 1 1 — h y g r o ( 1 ) 、 H B 61 1一 h y g r o (2) 、 H B 6 1 1 — h y g r 0 ( 3 ) と命名した。

〔細胞の G nT— 111 及び G n T— Vの酵素活性〕

コンフルェント状態にある細胞約 5— 1 0 X 1 06 個を集め、リン酸緩衝化生理食塩水（PB S) で洗浄した後、同溶液 0. 2m I に懸濁し、超音波処理を行つた。各酵素活性はこの超音波破砕液を酵素液と、 2—アミノビリジンで蛍光標識された糖鎖を基質として〔アナリチカルバイオケミストリ一（Analytical B iochemistry ) 第 170巻、第 349〜 354頁（ 1 988) 、メソッズィンェンザィモ口ジ一（Methods in Enzymology ) 、第 1 79巻、第 397〜 4 08頁（ 1 985) 、ジャーナルォブバイオロジカルケミストリ一、第 2 65卷、第 6009~60 1 8頁（ 1 990) 〕に記載の方法に従って細胞中の G n T— 111 、 G nT— I V、 G n T— Vの活性を各細胞につき、 3回ずつ測定した。

その結果を表 2に示す。

2 細胞 G n T -III G n T - I V G n T- V

HB611 9. 9 ±3.4 143±30 163土 23

HG611 -hygro( 1) 8. 2 ± 1.7 138±27 181±30

HG611 -hygro(2) 17. 0 ±5.1 237 ±32 209±22

HG611 -hygro(3) 13. 0 ±2.7 117±4.7 182土 11

HG611 -GNT- 111(1) 98. 0 土 17* 145±40 225土 18

HG611 -GNT-I1K2) 103. 0 ±3.2 * U6±28 179土 18

HG611 -GNT-1IK3) 81. 0 ±9,8 * 122± 11 200土 19

表中、 *は統計学的処理をステューデンッ t検定（Student's t test) で行つた結果を示しており、 HB 6 1 1細胞に対して P < 0. 0 1である。 p <0. 0 1 とは、 H B 6 1 1 に対して同じである可能性が 0. 0 1以下であることを示している。

表 2に示すように G n T— 111 活性は G n T— 1Π ポジティブ細胞で親株の約 8〜 1 0倍に迄上昇している。 G n T— I V及び G n T— Vの活性は親株及び形質転換株の間でほとんど変わらなかった。

次に、 G n T— III のメッセンジャー RNA (mRNA) の量をモレキュラークロ一ニング、ァラボラトリーマ二ユアノレ（Molecular Cloning, A Labor atory Manual) 、第 2版、 T. マニアテイス（T. Maniatis ) ほか著、第 7章、第 3 9〜52頁、コールドスプリングハーバーラボラトリー社、 1 989年発行に記載の方法を用いて、ノーザンブロットハイブリダィゼ一シ β ンを行った。 Η Β 6 1 1細胞及び上記で得た 6種類の細胞における G η Τ - III の mRNA の唐.を比較した結果、 G n T— 111 ポジティブ細胞では G n T— 111 は高発現であつ

(H B V複製の評偭〕

H B 6 1 1細胞における H B V関連タンパク質発現量の評価を行うため、培地中の HB s抗原量及び HB e抗原量をラジオイムノアツセィキット（大塚ァッセィ研究所製）を用いて本発明者らが既に報告している方法〔インタ一ナショナルジャーナルォブキャンサー、第 52巻、第 1 37~ 1 40頁（ 1 992) 〕に従って測定した。 H B 6 1 1細胞及び形質転換細胞を 0. 5 mM E DTA を含む P B Sでプレートからはがし、細胞数を計測した。 H B s抗原量及び H B e抗原量は細胞 1 個当りの相対単位で表した。なお、形質転換細胞は、 G n T— III ポジティブ細胞（H B 6 1 1 - G n T - II I ) 及び G n T— 111 ネガティブ細胞（H B 6 1 1 — h y gr r o ) で行った。

その結果を表 3に示す。

表 3 細胞 H B s抗原量 H B e抗原

H B 6 1 1 30. 2 1 08. 0

H B 6 1 1 - h y gr r o 24. 0 ± 1 4. 7 95. 0 ± 1 2. 9 H B 6 1 1 - G NT - III 4. 5 ± 3. 3* 2 4. 4 ± 8. 1 *

表中、 *は統計学的処理をステューデンッ t検定で行つた結果を示しており、 HB 6 1 1 — h y g r o細胞に対して P <0. 02である。

表 3に示すように、 G n T— ΙΠ ポジティブ細胞の培地中の H B s抗原量及び HB e抗原量は G η Τ— [Π ネガティブ細胞や親株に比べて明らかに減少していた。

次に、 HB VM迎 mRNAの発現量を 32Pでラベルした HB V全 c DNAをブローブとして、モレキュラークロ一ユング、ァラボラトリーマニュアル、笫 2版、 T. マニアテイスほか著、第 7章、第 39 ~52頁、コールドスブリングハーバーラボラトリ一社、 1 989年発行に記載の方法を用いて、ノーザンブロットハイブリダィゼーシヨンによって評価した。 HB 6 1 1細胞及び上記で得た 6種類の細胞における H B Vl¾連 mRNAの発現量を、 HBV、 β— Ύゥチン、リボゾーム RN A ( r R N A) の量で比較した結果、 G n T— 111 ポジティブ細胞は G n T— III ネガティブ細胞や親株に比べて明らかに HBV関連 mR N Aの発現量も抑制されていることがわかった。

一方、同様にして、 HB 6 1 1細胞及び上記で得た 6種類の細胞におけるアルファフヱトプロテイン（AF P) 、アルブミン、ブレアルブミンタンパク質の m RN Aの発現量を測定した。その結果、どの細胞においても AF P、アルブミン、プレアルブミンタンパク質の mR N Aの発現量は G n T— 111 活性のレベルとは相関がなかった。

本発明によって、ウィルス感染細胞又はその周囲組織の G n T— 1I1 活性を增強させる、 G n T— III 又はその遺伝子を有効成分とすることを特徴とするウイルス複製抑制剤が提供された。該ウイルス複製抑制剂はゥィルス性疾患の治療の分野で有用である。

配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 1608

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列：

ATG AGA CGC TAC AAG CTT TTT CTC ATG TTC TGT ATG GCC GGC CTG 45

Met Arg Arg Tyr Lys Leu Phe Leu Met Phe Cys Met Ala Gly Leu

1 5 10 15

TGC CTC ATC TCC TTC CTG CAC TTC TTT AAG ACG TTA TCC TAT GTC 90

Cys Leu He Ser Phe Leu His Phe Phe Lys Thr Leu Ser Tyr Val

20 25 30

ACC TTC CCG AGA GAA CTG GCC TCC CTC AGC CCT AAC CTC ATA TCC 135

Thr Phe Pro Arg Glu Leu A 1 a Ser Leu Ser Pro Asn Leu l ie Ser

35 40 45

AGC TTC TTC TGG AAC AAT GCC CCT GTC ACT CCC CAG GCC ACT CCG 180

Ser Phe Phe Trp Asn Asn Ala Pro Val Thr Pro Gin Ala Ser Pro

50 55 60

GAG CCC GGT GAC CCC GAC TTG TTA CGG ACT CCA CTC TAC TCC CAC 225

Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Leu Arg Thr Pro Leu Tyr Ser His

65 70 75

TCC CCC CTG CTC CAG CCA CTG TCC CCT AGC AAG GCC ACC GAA GAA 270

Ser Pro Leu Leu Gin Pro Leu Ser Pro Ser Lys Ala Thr Glu Glu

80 85 90 CTG CAC CGG GTG GAC TTC GTG TTG CCG GAG GAC ACC ACA GAG TAT 315

Leu His Arg Val Asp Phe Val Leu Pro Glu Asp Thr Thr Glu Tyr

95 100 105

TTT GTG CGC ACC AAA GCT GGC GGT GTG TGC TTC AAA CCA GGT ACC 360

Phe Val Arg Thr Lys Ala Gly Gly Val Cys Phe Lys Pro Gly Thr

110 115 120

AGG ATG CTG GAG AAA CCT TCT CCA GGG CGG ACA GAG GAG AAG ACC 405

Arg Met Leu Glu Lys Pro Ser Pro Gly Arg Thr Glu Glu Lys Thr

125 130 135

AAG GTG GCT GAG GGG TCC TCG GTC CGG GGT CCT GCT CGG AGG CCT 450

Lys Val Ala Glu Gly Ser Ser Val Arg G!y Pro Ala Arg Arg Pro

140 145 150

ATG CGG CAT GTG TTG ACT GCA CGG GAG CGC CTG GGA GGC CGG GGC 495

Met Arg His Val Leu Ser Ala Arg Glu Arg Leu Gly Gly Arg Gly

155 160 165

ACT AGG CGC AAG TGG GTT GAG TGT GTG TGC CTG CCA GGC TGG CAC 540

Thr Arg Arg Lys Trp Va 1 Glu Cys Val Cys Leu Pro Gly Trp His

170 175 180

GGG CCC AGC TGC GGG GTG CCC ACT GTG GTC CAG TAT TCC AAC CTG 585

Gly Pro Ser Cys Gly Val Pro Thr Val Val Gin Tyr Ser Asn Leu

185 190 195

CCC ACC AAG GAG CGC CTG GTA CCC AGG GAG GTG CCG AGG CGG GTT 630

Pro Thr Lys Glu Arg Leu Val Pro Arg Glu Val Pro Arg Arg Val

200 205 210 -ei-

OSS 5ZZ QZ

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086 013 D10 I3D 1VD 1D3 DGD 100 31V OVO 0V9 000 OVO OVO 01V 01V

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018 3VV OVO 303 OIV OVI 3V0 3丄丄 03V 3D3 1VV 03V 013 OIV OVO V03

393 092

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99 Oil OVV 010 033 ODO 100 3VD D3D OVI 30D 33V Oil 1VV DOI WO 0f2 982 QZZ

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OZL 3D1 OID DID III 03D 3Ϋ0 DID 丄丄 3 1VD ODD 013 DVO 1V3 Oil 3D0 ^ZZ 022 SI2

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986l0/96df/X3d 9C881/厶 6 -oz-

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0921 3V 33丄 3313 DOD U丄 3丄） 330 ODV ODD ：)丄 3 丄：]丄 331 DVO 3丄 3

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9121 VIO 3IV OVO 0D3 33V 300 3VV OVO IVI DV3 VDO III 3VV 000 OIV

06S 58S 08S

Jqi J^U JL u|o 3JV 3JV sav Π9ΐ 3αγ 3[ ι Λ|ο dsy na λ[0 丄

Oil I 03V OVI 3VI DVO 100 303 DDD DIO 3D0 31V ODD OVD 313 DDD 1V1

9/.S 0 99S

[«Λ 8i v na dsy 8] | J i SXQ 13 J3S |¾Λ nij] na^

5211 DI3 I3D DV3 DI3 OIV OVD 1IV 33V ODl ODD V31 OID DIO OVO OID

09S Q98 05S

JMl ^io OJJ uio s^i djj, slid aqd Λ10 J?i ng aas s q 3jy

0901 V3V OOD YOG VV3 DVV ODl 111 Oil 130 1V1 DIG 001 DVV 0D3 D1V

0Π 9S8

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986l0/96df/13d 9C88W6 OM AAG AGG GAC CTC AAT TAC ATC CGA AGC TTG ATT CGC ACT GGG GGA 1395

Lys Arg Asp Leu Asn Tyr lie Arg Ser Leu lie Arg Thr G 1 y Gly

455 460 465

TGG TTC GAC GGC ACG CAG CAG GAG TAC CCT CCT GCA GAC CCC ACT 1440

Trp Phe Asp Gly Thr Gin Gin Glu Tyr Pro Pro Ala Asp Pro Ser

470 475 480

GAA CAC ATG TAT GCT CCT AAG TAC CTG CTC AAG AAC TAT GAC CAG 1485

Glu His Met Tyr A 1 a Pro Lys Tyr Leu Leu Lys Asn Tyr Asp Gin

485 490 495

TTC CGC TAC TTG CTC GAA AAT CCC TAC CGG GAG CCC AAG AGC ACT 1530

Phe Arg Tyr Leu Leu Glu Asn Pro Tyr Arg Glu Pro Lys Ser Thr

500 505 510

GTA GAG GGT GGG CGC CGG AAC CAG GGC TCA GAC GGA AGG TCA TCT 1575

Val Glu Gl Gly Arg Arg Asn Gin Gly Ser Asp Gly Arg Ser Ser

515 520 525

GCT GTC AGG GGC AAG TTG GAT ACA ACG GAG GGC 1608

Ala Val Arg Gly Lys Leu Asp Thr Thr Glu Gly

530 535

配列番号： 2

配列の長さ： 1533

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to nRNA

配列： ATG AGA CGC TAC AAG CTC TTT CTC ATG TTC TGT ATG GCC GGC CTG 45

Met Arg Arg Tyr Lys Leu Phe Leu Met Phe Cys Met Ala Gly Leu

1 5 10 15

TGC CTC ATC TCC TTC CTG CAC TTC TTC AAG ACC CTG TCC TAT GTC 90

Cys Leu lie Ser Phe Leu His Phe Phe Lys Thr Leu Ser Tyr Val

20 25 30

ACC TTC CCC CGA GAA CTG GCC TCC CTC AGC CCT AAC CTG GTG TCC 135

Thr Phe Pro Arg Glu し eu Ala Ser Leu Ser Pro Asn Leu Val Ser

35 40 45

AGC TTT TTC TGG AAC AAT GCC CCG GTC ACG CCC CAG GCC AGC CCC 180

Ser Phe Phe Trp Asn Asn Ala Pro Val Thr Pro Gin A la Ser Pro

50 55 60

GAG CCA GGA GGC CCT GAC CTG CTG CGT ACC CCA CTC TAC TCC CAC 225

Glu Pro Gly Gly Pro Asp Leu Leu Arg Thr Pro Leu Tyr Ser His

65 70 75

TCG CCC CTG CTG CAG CCG CTG CCG CCC AGC AAG GCG GCC GAG GAG 270

Ser Pro Leu Leu G In Pro Leu Pro Pro Ser Lys Ala Ala Glu Glu

80 85 90

CTC CAC CGG GTG GAC TTG GTG CTG CCC GAG GAC ACC ACC GAG TAT 315

Leu His Arg Val Asp Leu Val Leu Pro Glu Asp Thr Thr Glu Tyr

95 100 105

TTC GTG CGC ACC AAG GCC GGC GGC GTC TGC TTC AAA CCC GGC ACC 360

Phe Val Arg Thr Lys Ala Gly Gly Val Cys Phe Lys Pro Gly Thr

110 115 120 0 982 0S2

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9i D13 DIV OVD DD3 311 OVV 010 030 0D3 D30 DVD ODD IVl I3D D3V 986l0/96«ir/13d 9C881/Z.6 OAV TCA GGC TGC ACG GTG GAC ATG CTG CAG GCA GTG TAT GGG CTG GAC 1125

Ser Giy Cys Thr Val Asp Met Leu Gin Ala Val Tyr Gly Leu Asp

365 370 375

GGC ATC CGC CTG CGC CGC CGC CAG TAC TAC ACC ATG CCC AAC TTC 1170

Gly l ie Arg Leu Arg Arg Arg Gin Tyr Tyr Thr Met Pro Asn Phe

380 385 390

AGA CAG TAT GAG AAC CGC ACC GGC CAC ATC CTG GTG CAG TGG TCG 1215

Arg Gin Tyr Glu Asn Arg Thr Gly His 1 le Leu Val Gin Trp Ser

395 400 405

CTG GGC AGC CCC CTG CAC TTC GCC GGC TGG CAC TGC TCC TGG TGC 1260

Leu Gly Ser Pro Leu His Phe Ala Gly Trp His Cys Ser Trp Cys

410 415 420

TTC ACG CCC GAG GGC ATC TAC TTC AAG CTC GTG TCC GCC CAG AAT 1305

Phe Thr Pro Glu Gly lie Tyr Phe Lys Leu Val Ser Ala Gin Asn

425 430 435

GGC GAC TTC CCA CGC TGG GGT GAC TAC GAG GAC AAG CGG GAC CTG 1350

Gly Asp Phe Pro Arg Trp Gly Asp Tyr Glu Asp Lys Arg Asp Leu

440 445 450

AAC TAC ATC CGC GCC CTG ATC CGC ACC GGG GGC TGG TTC GAC GGC ]395

Asn Tyr lie Arg Gly Leu lie Arg Thr Gly Gly Trp Phe Gly

455 460 465

ACG CAG CAG GAG TAC CCG CCT GCA GAC CCC AGC GAG CAC ATG TAT 1440

Thr Gin Gin Glu Tyr Pro Pro Ala Asp Pro Ser Glu His Met Tyr

470 475 480 -9Z-

089

Ι«Λ "ID «IV n|D dsy

S6SI 313 VV9 DOD DVD 3V0 D13

929 OZS 913

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S8fl DIO OVI 3V0 311 0D3 OVO 3V1 OVV DVV DI3 DIO OVI DVV 033 DOO 86l0/96df/13d 9£88l/i6 O/W

Claims

請求の範囲

1 . N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ Π 1 又はその遺伝子を有効成分とすることを特徴とするウイルス複製抑制剤。

2. ウイルスが肝炎ウイルスである請求の範囲第 1項記載のウイルス複製抑制剤。

3. ウィルスがヒト免疫不全ゥィルスである請求の範囲第 1項記載のウィルス複製抑制剤。

4 . 肝炎ウィルスが Β型肝炎ウィルスである請求の範囲第 2 ¾記載のウィルス複製抑制剤。

5. 肝炎ウイルスが C型肝炎ウイルスである請求の範囲第 2項記載のウィルス枚製抑制剤。

6. 請求の範囲第 1項記載の遺伝子が配列表の配列番号 1又は 2で表される配列を含む遺伝子である請求の範囲第 1項記載のウイルス複製抑制剤。

7. 請求の範囲第 1項記載の遺伝子が配列表の配列番号 1又は 2で表される遗伝子にハイブリダィズし、かつ、 Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ 1 1 1 活性又はその機能的に同等の活性を有するポリベプチドをコ一ドする遺伝子である請求の範！ 10第 1 ¾記載のウィルス複製抑制剤。

8. 請求の範囲第 6又は 7項記載の遣伝子がべクターに組込まれていることを特徴とする靖求の範囲第 1項記載のウイルス複製抑制剤。

9. ベクターがプラスミドべクターである請求の範囲第 8項記載のゥィルス複製抑制剤。

10. ベクタ一がウィルスべク夕一である請求の範囲第 8項記載のウイルス複製抑制剤。

1 1 . ウィルスベクタ一がレトロウイルスベクターである ^求の範囲第 1 0項己載のウイルス複製抑制剤。