ES2246222T3 - Gen para la fucosiltransferasa. - Google Patents
Gen para la fucosiltransferasa.Info
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Abstract
Molécula de ADN, caracterizada porque comprende una secuencia según la SEC ID nº: 1 con un marco de lectura abierto del par de bases 211 al par de bases 1740 o presenta una identidad de por lo menos un 50% con la secuencia citada anteriormente o hibridiza con la secuencia citada anteriormente en condiciones rigurosas o comprende una secuencia que, como consecuencia del código genético, está degenerada en la secuencia de ADN citada anteriormente, cuya secuencia codifica para una proteína vegetal con una actividad de fucosiltransferasa o es complementaria a la misma.
Description
Gen para la fucosiltransferasa.
La presente invención se refiere a
polinucleótidos que codifican para una fucosiltransferasa. La
invención se refiere también a partes de la secuencia de dichos
polinucleótidos así como a vectores que contienen dichos
polinucleótidos, a células hospedadoras recombinantes y a plantas
que han sido transfectadas por los polinucleótidos o por el ADN
procedente de los mismos, así como a las glicoproteínas producidas
en dicho sistema.
Las glicoproteínas presentan una multitud y
complejidad de unidades de carbohidratos, cuya composición y
disposición son características para organismos diferentes. Las
unidades de oligosacárido de las glicoproteínas desempeñan una serie
de funciones; así, por ejemplo, son importantes en la regulación del
metabolismo, participan en la mediación de interacciones
intercelulares, establecen los tiempos de circulación de proteínas
en la circulación sanguínea y son decisivos para la detección de
epítopes en las reacciones antigen/anticuerpo.
La glicosilación de las glicoproteínas comienza
en el retículo endoplásmico (RE), donde se unen los oligosacáridos o
bien a las cadenas laterales de asparagina por enlaces
N-glucosílicos o bien a las cadenas laterales de
serina o treonina por enlaces O-glucosílicos. Los
oligosacáridos con enlaces N-glucosílicos contienen
un núcleo común de una unidad de pentasacárido constituida por tres
radicales de manosa y dos radicales de
N-acetilglucosamina. Para la modificación ulterior
de las unidades de carbohidratos, las proteínas son transportadas
por el RE al complejo de Golgi. La estructura de las unidades de
oligosacárido con enlace N-glucosílico de las
glicoproteínas es determinada por su conformación y la composición
de las glicosiltransferasas de los compartimentos Golgi en los que
son procesadas.
Se ha demostrado que en el complejo de Golgi de
algunas células de plantas e insectos la unidad de pentasacárido del
núcleo se encuentra substituida por xilosa y fucosa con enlace
\alpha-1,3 (P. Lerouge et al. 1998 Plant
Mol. Biol. 38, 31-48; Rayon et al. 1998 L.
Exp. Bot. 49, 1463-1472). El heptasacárido
"MMXF^{3}" resultante constituye el tipo del oligosacárido
principal en las plantas (Kurosaka et al. 1991 J. Biol.
Chem., 266, 4168-4172). Así, por ejemplo, la
peroxidasa de rábano picante, la
\beta-fructosidasa de zanahorias y la lectina de
Erythrina cristagalli así como la fosfolipasa A2 del veneno
de las abejas melíferas o las glicoproeínas de la membrana neuronal
de los embriones de insectos contienen radicales de
\alpha-1,3-fucosa, unidos al
núcleo de glicano. Estas estructuras se denominam también
N-glicanos complejos o N-glicanos
deficientes en manosa o N-glicanos truncados.
Además, los radicales \alpha-manosilo pueden ser
substituidos por GlcNAc, a los cuales están unidos galactosa y
fucosa, produciendo una estructura que corresponde al epítope humano
Lewis a (Melo et al. 1997, FEBS Lett. 415,
186-191; Fitchette-Laine et
al. 1997 Plant J. 12, 1411-1417).
Ni la xilosa ni la fucosa con enlace
\alpha-1,3 se encuentran en las glicoproteínas de
mamíferos. Resulta que la
\alpha-1,3-fucosa del núcleo
desempeña un papel importante en la detección de epítopes de
anticuerpos dirigidos contra los oligosacáridos con enlace N de
insectos (I.B.H. Wilson et al., Glycobiology Vol. 8, nº 7, p.
651-661, 1998), disparando reacciones inmunes en el
cuerpo humano o animal contra dichos oligosacáridos. Además, el
radical \alpha-1,3-fucosa parece
ser una de las causas principales para la reactividad cruzada
alérgica muy difundida entre los varios alergenos de plantas y de
insectos (Tretter et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 1993;
102:259-266) y se denomina también "determinante
de carbohidrato de reacción cruzada" (CCD). En un estudio de los
epítopes de tomates y polen de hierba se determinaron también
radicales fucosa con enlace \alpha-1,3 como
determinante común, lo cual parece ser la causa de la frecuente
aparición común de alergias de tomates y de polen de hierba en
pacientes (Petersen et al. 1996, J. Allergy Clin. Immunol,
Vol 98, 4; 805-814). Además, por la frecuente
apariencia de las reacciones cruzadas inmunológicas, los CCDs
ocultan los diagnósticos de alergias.
Dichas reacciones inmunológicas, que son
desencadenada por las proteínas de plantas en el cuerpo humano,
representan el problema principal de la utilización médica de las
proteínas humanas recombinantes, producidas en plantas. Para evitar
dicho problema, habría que impedir la
\alpha-1,3-fucosilación del
núcleo. En un estudio, se ha podido demostrar que los oligosacáridos
que incluyen una L-galactosa en lugar de una
L-fucosa
(6-deoxi-L-galactosa)
son no obstante completamente activos biológicamente (E. Zablackis
et al. 1996, Science, Vol 272). Según otro estudio, se aisló
una mutante de la planta Arabidopsis thaliana, a la que falta la
N-acetilglucosaminiltransferasa I, que constituye la
primera enzima en la biosintésis de glicanos complejos. La
biosíntesis de las glicoproteínas complejas en dicha mutante se
encuentra por lo tanto perturbada. No obstante, dichas plantas
mutadas son capaces de desarrollarse de forma normal en ciertas
condiciones (A. Schaewen et al. 1993, Plant Physiol. 102;
1109-1118).
Para impedir selectivamente el enlace de la
\alpha-1,3-fucosa del núcleo en un
oligosacárido, sin por ello intervenir también en otras etapas de la
glicosilación, habría que eliminar sólo la enzima que es
directamente responsable de dicha glicosilación específica, es
decir, la
\alpha-1,3-fucosiltransferasa del
núcleo. Por primera vez, dicha transferasa se aisló y se caracterizó
a partir de judías Mungo, y se descubrió que la actividad de dicha
enzima es dependiente de la presencia de términos GlcNAc no
reductores (Staudacher et al., 1995, Glycoconjugate J. 12,
780-786). Dicha transferasa, que ocurre sólo en
plantas e insectos, pero no en el ser humano u otros vertebrados
habría que ser desactivada o suprimida selectivamente, con el fin de
conseguir que las proteínas humanas que son producidas en plantas o
células de plantas o también en insectos o células de insectos ya no
contienen, a diferenica de antes, dicho epítope que dispara las
reacciones inmunes.
\newpage
El artículo de John M. Burke "Clearing the way
for ribozymes" (Nature Biotechnology 15:414-415;
1997) se refiere al modo de funcionamiento general de ribozimas.
El artículo de Pooga et al. "Cell
penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and
modify pain transmission in vivo" (Nature Biotechnology
16:857-861; 1998) se refiere a las moléculas de ANP
de forma generalizada y específicamente a una molécula de ANP que es
complementaria al ARNm humano del tipo de receptor de galanina
1.
La patente US nº 5.272.066 A se refiere a un
procedimiento para la modificación de proteínas eucariotes y
procariotes, con el fin de prolongar su circulación in vivo.
En dicho procedimiento, se modifican los oligosacáridos ligados con
la ayuda de diferentes enzimas, entre las cuales se encuentra
también la
GlcNac-\alpha1->3(4)-fucosiltransferasa.
El documento EP 0 643 132 A1 se refiere a la
clonación de una
\alpha-1,3-fucosiltransferasa
aislada a partir de células humanas (THP-1). Las
cadenas de carbohidratos descritas en dicho documento corresponden a
los oligosacáridos humanos del tipo sialil Lewis x y sialil Lewis a.
La especificidad de la enzima procedente de células humanas es
completamente distinta a la de la fucosiltransferasa procedente de
células de plantas.
El objetivo de la presente invención es clonar y
secuenciar el gen que codifica para una fucosiltransferasa vegetal,
preparar vectores que comprenden dicho gen, partes del ADN del mismo
o ADN modificado o ADN derivado del mismo, transfectar plantas e
insectos así como células de los mismos con uno de dichos vectores,
preparar glicoproteínas que no comprenden la
\alpha-1,3-fucosa del núcleo que
normalmente ocurre así como proporcionar procedimientos
apropiados.
El objetivo según la invención se alcanza por
medio de una molécula ADN que comprende una secuencia según la SEC
ID No: 1 (en la presente memoria se utilizó el código IUPAC, en el
que "N" representa inosina) con un marco de lectura abierto
desde el par de bases 211 hasta el par de bases 1740 o incluye una
identidad de por lo menos un 50% con la secuencia citada
anteriormente o que se hibridiza con la secuencia citada
anteriormente en condiciones rigurosas o comprende una secuencia
que, como resultado del código genético, ha degenerado en la
secuencia de ADN citada anteriormente, codificando dicha secuencia
para una proteína de plantas que presenta una actividad de
fucosiltransferasa o es complementaria a la misma.
Dicha secuencia que nunca antes ha sido descrita
resulta particularmente apta para cualquier experimento, análisis y
procedimiento de preparación, etc., que se refieren a la actividad
de la fucosiltransferasa de plantas. Para esto son de interés tanto
la secuencia de ADN como la proteína para la que codifica dicha
secuencia, utilizándose la secuencia de ADN, sin embargo, en
particular para impedir la actividad de la fucosiltransferasa.
El marco de lectura abierto de la SEC ID No: 1
codifica para una proteína con 510 aminoácidos y un peso molecular
teórico de 56,8 kDa, en el que se encuentra en la zona entre Asn36 y
Gly54 probablemente una pieza transmembrana. El valor pI calculado
de la proteína codificada de la secuencia según la SEC ID No: 1 es
de 7,51.
La actividad de la fucosiltransferasa de plantas
se detecta y se mide por medio de un método, en el que se adiciona
la fucosiltransferasa a una muestra que comprende fucosa marcada y
un aceptor (por ejemplo una glicoproteína) ligado a un soporte, por
ejemplo Sefarosa. Una vez transcurrido el tiempo de reacción, se
lava la muestra, y se mide el contenido en fucosa ligada. La
actividad de la fucosiltransferasa se considera como positiva cuando
la medición de la actividad es más alta en por lo menos un 10 a un
20%, en particular en por lo menos un 30 a un 50%, que la medición
de la actividad del control negativo. Adicionalmente, la estructura
de la glicoproteína puede verificarse mediante HPLC. Los protocolos
de este tipo forman parte del estado de la técnica (Staudacher
et al. 1998, Anal. Biochem. 246, 96-101;
Staudacher et al. 1991, Eur. J. Biochem. 199,
745-751).
Por ejemplo, se adiciona fucosiltransferasa a una
muestra que comprende fucosa marcada radiactivamente y un aceptor,
por ejemplo
GlcNAc\beta1-2Man\alpha-1,3(GlcNAc\beta1-2Man\alpha1-6)Man\beta1-4GlcNAc\beta1-4GlcNAc\beta1-Asn.
Una vez transcurrido el tiempo de reacción, se purifica la muestra
por cromatografia de intercambio de aniones y se mide el contenido
en fucosa ligada. La actividad puede calcularse a partir de la
diferencia de la radiactividad medida de la muestra con aceptor y de
la de un control negativo sin aceptor. La actividad de la
fucosiltransferasa se considera ya como positiva cuando la
radiactividad medida es más alta en por lo menos un
30-40% que la radiactividad medida del control
negativo.
El apareamiento de dos moléculas ADN puede
modificarse en función de la selección de la temperatura y de la
fuerza iónica de la muestra. Por condiciones rigurosas se entienen,
según la invención, condiciones que permitan un enlace exacto,
riguroso. Por ejemplo, las moléculas de ADN se hibridizan a 50ºC en
sulfato de sodio y dodecilo (SDS) al 7%, NaPO_{4} (sic) 0,5 M, pH
7,0; EDTA 1 mM, y el producto resultante se lava con SDS al 1% a
42ºC.
Por ejemplo, el progama FastDB del EMBL o el
banco de datos SWISSPROT permite determinar si las secuencias
presentan una identidad de por lo menos un 50% con la SEC ID No:
1.
Preferentemente, la secuencia de la molécula ADN
según la invención codifica para una proteína con una actividad de
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa,
en particular con una actividad de
\alpha-1,3-fucosiltransferasa del
núcleo. Tal como ya se ha descrito anteriormente, la
\alpha-1,3-fucosiltransferasa del
núcleo ocurre en plantas e insectos, pero no en el organismo humano,
con lo cual es apta en particular dicha secuencia de ADN para ser
utilizada en los análisis y experimentos específicos de la
fucosiltransferasa así como en procedimientos de producción. Por una
\alpha-1,3-fucosiltransferasa del
núcleo se entiende en particular la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
unida a GDP-L-Fuc:Asn. Para los
fines de la presente invención, por la denominación
\alpha-1,3-fucosiltransferasa se
entiende por lo general en particular la
\alpha-1,3-fucosiltransferasa del
núcleo. Para la medición de la actividad descrita anteriormente, son
aptos en particular los aceptores con un término GlcNAc no reductor.
Entre los ejemplos de aceptores de este tipo se incluyen
GlcNAc\beta1-2Man\alpha-1-3(GlcNAc\beta1-2Man\alpha1-6)Man\beta1-4GlcNAc\beta1-4GlcNAc\beta1-Asn,
GlcNAc\beta1-2Man\alpha-1-3(GlcNAc\beta1-2Man\alpha1-6)Man\beta1-4GlcNAc\beta1-4(Fuc\alpha1-6GlcNAc\beta1-Asn
y
GlcNAc\beta1-2Man\alpha-3[Man\alpha-1-3(Man\alpha1-6)Man\alpha1-6]Man\beta1-4GlcNAc\beta1-4GlcNAc\beta1-Asn.
La medición de la insensibilidad a la N-glucosidasa
F, lo cual puede detectarse por la espectrometría de masas, permite
determinar si la fructosa está ligada.
Preferentemente, la molécula de ADN según la
invención presenta una identidad de por lo menos entre 70 y 80%, de
forma particularmente preferida de por lo menos un 95%, con la
secuencia según la SEC ID No: 1. Dicha secuencia codifica para una
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
particularmente activa. Puesto que la secuencia de ADN puede estar
modificada en mayor o menor grado según la planta o el insecto, una
secuencia con una identidad de por ejemplo un 70% con la secuencia
según la SEC ID No: 1, presenta también una actividad de
fucosiltransferasa, que es suficiente para ser utilizada para
análisis, experimentos o procedimientos de preparación, tal como se
ha descrito anteriormente.
Según otra forma de realización ventajosa, la
molécula de ADN comprende de 2.150 a 2.250, particularmente 2.198,
pares de bases. Dicha molécula de ADN presenta de 100 a 300,
preferentemente 210, pares de bases corriente arriba del codón de
iniciación así como de 350 a 440, en particular 458, pares de bases
corriente abajo del codón de terminación del marco de lectura
abierto, en la que el extremo de la molécula de ADN presenta
preferentemente una cola de 3'-poli(A). De
esta manera, está asegurada una regulación perfecta al nivel de
traducción, proporcionando una molécula de ADN que codifica de forma
particularmente eficaz y exenta de problemas para una
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
activa.
Además, la presente invención se refiere a una
molécula de ADN que comprende una secuencia según la SEC ID No: 3 o
una secuencia que presenta una identidad de por lo menos un 85%, de
forma particularmente preferida de por lo menos un 95%,
especialmente de por lo menos un 99%, con la secuencia citada
anteriormente, o hibridiza en condiciones rigurosas con la secuencia
citada anteriormente o que, como resultado del código genético, está
degenerada en la secuencia de ADN citada anteriormente. La identidad
se determina preferentemente mediante un programa que detecta
inserciones y deleciones y no las incluye en el cálculo de la
indentidad. Dicha secuencia de nucleótidos codifica para un motivo
de péptido conservado, es decir, que la mayoría de las
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasas
activas y funcionales comprende la secuencia de aminoácidos
codificada por la misma. Dicha secuencia puede presentar el mismo
tamaño que la secuencia según la SEC ID No: 3 o, alternativamente,
ser naturalmente también más larga. Dicha secuencia presenta una
longitud menor que la secuencia que codifica para la proteína
entera, siendo por lo tanto menos sensible a recombinaciones,
deleciones u otras mutaciones. Debido al motivo conservado y a su
mayor estabilidad, dicha secuencia es particularmente apta para las
pruebas de detección de secuencias.
La SEC ID No: 3 presenta la secuencia siguiente:
5'-gaagccctgaagcactacaaatttagcttagcgtttgaaaattcgaatgaggaagattatgtaactgaaaaattcttccaatcccttgttgctggaactgtccct-3'.
Según otro aspecto, la presente invención se
refiere a una molécula de ADN que comprende una parte de la
secuencia de una de las moléculas de ADN citadas anteriormente y
presenta una homología de por lo menos un 80% con la SEC ID No: 1
así como un tamaño de 20 a 200, preferentemente 30 a 50, pares de
bases. La molécula de ADN puede utilizarse por ejemplo para unirse
como sonda a secuencias complementarias de
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasas,
con lo cual dichas secuencias pueden ser seleccionadas a partir de
una muestra. Esto permite seleccionar, aislar y caracterizar otras
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasas
a partir de una amplia gama de plantas. Pueden utilizarse cualquier
parte de la secuencia o también varias partes diferentes de la
secuencia, en particular una parte del motivo conservado ya descrito
anteriormente.
Resulta particularmente ventajoso que una de las
moléculas de ADN citadas anteriormente esté asociada de forma
covalente a una sustancia de marcaje. Como sustancia de marcaje es
apto cualquier marcador convencional, por ejemplo marcadores
fluorescentes, luminescentes, radiactivos, marcajes no isotópicos,
tales como biotina, etc. Esto produce reactivos que son útiles para
la detección, selección y cuantificación de moléculas de ADN
apropiadas en muestras de tejidos sólidas (por ejemplo de plantas) o
también en muestras líquidas por medio de métodos de
hibridización.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
vector biológicamente funcional que comprende una de las moléculas
de ADN citadas anteriormente. Para la transfección en células
hospedadoras se necesita un vector independiente, capaz de
multiplicación, en la que puede utilizarse un vector apropiado según
la célula hospedadora, el mecanismo de transfección, la función y
tamaño de la molécula de ADN. Puesto que se conocen un gran número
de vectores diferentes, su enumeración superaría los límites de la
presente solicitud de patente, por lo cual se omitirá dicha lista
aquí, en particular porque los vectores son bien conocidos por los
expertos en la materia (para los vectores y cualquier técnica o
término conocidos por los expertos en la materia, ver también
Sambrook Maniatis). Idealmente, el vector presenta un bajo peso
molecular y debería contener genes seleccionables, con el fin de
producir un fenotipo fácilmente detectable en una célula,
permitiendo una selección fácil de células hospedadoras que
contienen vectores y de las que son libres de vectores. Para obtener
un alto rendimiento en ADN y los productos de genes
correspondientes, el vector debería contener un fuerte promotor así
como un "enhancer", señales de amplficación de genes y
secuencias de regulador. Para una replicación autónoma del vector,
se necesita además un origen de replicación. Los puntos de
poliadenilación son responsables para un procesamiento correcto del
ARNm y las señales de "splicing" para el de los trascriptos de
ARN. Si los vectores utilizados son fagos, virus o partículas de
virus, las señales de empaquetamiento controlan el empaquetamiento
del ADN vectorial. Por ejemplo, para la transcripción en plantas son
aptos plásmidos Ti y para la transcripción en células de insectos
son aptos los baculovirus y en los de insectos son aptos los
transposones, tales como el elemento P.
Si el vector según la invención descrito
anteriormente se infiltra en una planta o en una célula de plantas,
se consigue una supresión postranscripcional de la expresión génica
del gen de
\alpha-1,3-fucosiltransferasa
endógeno por transcripción de un transgen homólogo al mismo o a
partes del mismo en la orientación "sense". Para dicha técnica
"sense", ver además las publicaciones Baulcombe 1996, Plant
Mol. Biol. 9:373-382 y Brigneti et al. 1998,
EMBO J. 17:6739-6746. Esta strategia de "gene
silencing" representa una opción eficaz para suprimir la
expresión del gen de
\alpha-1,3-fucosiltransferasa, ver
también Waterhouse et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci.. USA,
95:13959-13964.
Además, la invención se refiere a un vector
biológicamente funcional que comprende una molécula de ADN según una
de las formas de realización descritas anteriormente en una
orientación inversa al promotor. Si dicho vector se transfecta en
una célula hospedadora, se lee un "ARNm antisense" que es
complementario al ARNm de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
y forma un complejo con el mismo. Dicho enlace obstaculiza o bien el
procesamiento correcto, el transporte, estabilidad o bien la
traducción por formación de un aducto con ribosomas y con esto la
expresión génica normal de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa.
Aunque toda la secuencia de la molécula ADN
podría incorporarse en el vector, partes de la secuencia pueden ser
más ventajosas para fines determinadas, debido a su menor tamaño. Lo
importante del aspecto "sense" es por ejemplo que la molécula
de ADN sea lo suficientemente grande como para formar un ARN
"antisense" lo suficientemente grande que forma un enlace con
el ARN de la transferasa. Por ejemplo, una molécula de ARN adecuada
comprende 50 a 200 nucleótidos, puesto que muchas moléculas de ARN
"antisense" conocidas, que ocurren naturalmente, comprenden
unos 100 nucleótidos.
Para una inhibición particularmente eficaz de la
expresión de una
\alpha-1,3-fucosiltransferasa
activa, resulta apta una combinación de la técnica "sense" y de
la técnica "antisense" (Waterhouse et al. 1998, Proc.
Nat. Acad. Sci. USA, 95:13959-13964).
De forma ventajosa, se utilizan moléculas de ARN
de rápida hibridización. La eficacia de las moléculas ARN
"antisense" que presentan un tamaño de más de 50 nucleótidos
depende de la cinética de formación de aductos in vitro. Así,
por ejemplo, las moléculas de ARN "antisense" de rápida
formación de aductos presentan una mayor inhibición de la expresión
de proteínas que las moléculas de ARN de lenta hibridización (Wagner
et al. 1994, Annu. Rev. Microbiol.,
48:713-742; Rittner et al. 1993, Nucl. Acids
Res., 21:1381-1387). Las moléculas de ARN
"antisense" de este tipo de rápida hibridización incluyen en
particular un gran número de bases externas (extremos libres y
secuencias de unión), un gran número de subdominios estructurales
(componentes) así como un bajo grado de bucles (Patzel et al.
1998; Nature Biotechnology, 16; 64-68). Las
estructuras secundarias hipotéticas de la molécula de ARN
"antisense" pueden determinarse utilizando, por ejemplo, un
programa de software, según el cual se realiza la selección de una
secuencia de ADN/ARN "antisense" adecuada.
Pueden incorporarse en el vector regiones
distintas de la secuencia de la molécula de ADN. Una posibilidad
consiste por ejemplo en incorporar en el vector sólo la parte que es
responsable para la formación de aductos de las ribosomas. Un
bloqueo en esta parte del ARNm es suficiente para parar la
traducción entera. Una eficacia particularmente alta de las
moléculas "antisense" se obtiene también para las regiones 5' y
3' sin traducir del gen.
Preferentemente, la molécula de ADN según la
invención presenta una secuencia que comprende una mutación por
deleción, inserción y/o substitución. El número de los nucleótidos
así mutados es variable y se extiende de un solo nucleótido a varios
nucleótidos mutados por deleción, inserción o substitución. También
resulta posible que el marco de lectura quede trasladado como
resultado de la mutación. Lo importante de un gen "knockout" de
este tipo es solamente que la expresión de una
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
esté perturbada, impidiendo la formación de una enzima activa,
funcional. El lugar de dicha mutación es variable mientras se impida
la expresión de una proteína enzimáticamente activa.
Preferentemente, la mutación se encuentra en la zona catalítica de
la enzima situada en la zona C terminal. Los procedimientos para
introducir mutaciones en las secuencias de ADN es bien conocido por
los expertos en la materia, de modo que aquí no es necesaria una
discusión detallada de las varias posibilidades de mutagénesis. Aquí
pueden utilizarse tanto las mutagénesis al azar como en particular
las mutagenesis selectivas, por ejemplo la
"site-directed mutagenesis", la mutagénesis
controlada por oligonuecleótidos o las mutagenesesis con la ayuda de
enzimas de restricción.
La invención proporciona también una molécula de
ADN que codifica para una ribozima que presenta dos secciones de la
secuencia con por lo menos de 10 a 15 pares de bases cada una, que
son complementarias a las secciones de la secuencia de una molécula
de ADN según la invención, tal como se ha descrito anteriormente,
con lo cual la ribozima formará un complejo y cortará el ARNm
transcrito por una molécula de ADN de una
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
natural. La ribozima reconoce la ARNm de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
por el apareamiento de bases con el ARNm. A continuación, la
ribozima corta y destruye la ARN de una forma específica para la
secuencia, antes de que se someta la enzima a una traducción. Tras
ser disociada del substrato cortado, la ribozima hibridiza repetidas
veces con moléculas de ARN y actúa como endonucleasa específica. Por
lo general, es posible preparar ribozimas específicamente para
inactivar un ARNm determinado, incluso cuando no se conoce toda la
secuencia de ADN que codifica para la proteína. Las ribozimas son
particularmente eficaces cuando las ribosomas se deslizan lentamente
por el ARNm. En este caso, resulta más fácil para la ribozima
encontrar un sitio en el ARNm que es libre de ribosomas. Por este
motivo, los mutantes de ribosomas lentos son aptos también como
sistema para ribozomas (J. Burke, 1997, Nature Biotechnology; 15,
414-415). Dicha molécula de ADN es particularmente
apto para suprimir o impedir la expresión de una
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
de plantas.
Otra opción es utilizar una forma modificada de
una ribozima, es decir, una minizima. Minizimas son eficaces en
particular para cortar moléculas de ARNm de mayor tamaño. Una
minizima es una ribozima cabeza de martillo que, en lugar del
Stem/Loop II, presenta un "linker" de oligonucleótido corto.
Son particularmente eficaces las minizimas diméricas (Kuwabara et
al. 1998, Nature Biotechnology, 16;
961-965).
Por ello, la invención se refiere también a un
vector biológicamente eficaz que comprende una de las moléculas de
ADN (mutación o molécula de ADN de ribozima) citadas por último. Lo
que se ha expuesto anteriormente referente a los vectores es
aplicable de forma análoga. Un vector de este tipo puede infiltrarse
por ejemplo en un microorganismo y utilizarse para preparar altas
concentraciones de las moléculas de ADN descritas anteriormente.
Además, un vector de este tipo es particularmente apto para
infiltrar la molécula específica de ADN en un organismo vegetal, con
el fin de restringir o impedir completamente la producción de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
en dicho orga-
nismo.
nismo.
Según la invención, se proporciona un
procedimiento para la preparación de un ADNc, que comprende la
molécula de ADN según la invención, en el que se aisla ARN a partir
de células de insectos o de plantas, en particular a partir de
células del hipocotil, que se utilizará, tras adicionar una
transcriptasa reversa y cebadores, para realizar una transcripción
reversa. Las etapas individuales de dicho procedimiento se llevan a
cabo según los protocoles conocidos de por sí. Para la transcripción
inversa, existe, por un lado, la posibilidad de preparar el ADNc de
todo el ARNm con ayuda de cebadores oligo(dT) y sólo entonces
llevar a cabo una PCR con cebadores seleccionados, con el fin de
preparar moléculas de ADN que comprenden el gen de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa.
Por otro lado, pueden utilizarse los cebadores seleccionados
directamente para la transcripción reversa, con el fin de obtener un
ADNc corto, específico. Los cebadores adecuados pueden prepararse
por ejemplo por síntesis utilizando los modelos de las secuencias de
ADNc de la transferasa. Dicho procedimiento permite preparar grandes
cantidades de las moléculas de ADNc según la invención de forma muy
rápida y sencilla y con una baja tasa de errores.
La invención se refiere además a un procedimiento
para la clonación de una
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa,
caracterizado porque la molécula de ADN según la invención se clona
en un vector, que se transfecta, a continuación, en una célula
hospedadora o en un huésped, obteniéndose, por medio de selección y
amplificación de células hospedadoras transfectadas, líneas de
células que expresan la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
activa. La molécula de ADN se incorpora en el vector por ejemplo con
ayuda de endonucleasas de restricción. Lo expuesto anteriormente es
aplicable otra vez al vector. Lo importante de dicho procedimiento
es que se seleccione un sistema de huésped/vector eficaz. Para
obtener una enzima activa, son aptas en particular las células
hospedadoras eucariotes. Una opción radica en transfectar el vector
en células de insectos. En este caso, habría que utilizar en
particular un virus de insecto como vector, por ejemplo
baculovirus.
Naturalmente también es posible transfectar
células humanas o las de otros vertebrados, que entonces expresarían
una enzima ajena a dichas células.
Preferentemente, se proporciona un procedimiento
para la preparación de células hospedadoras recombinantes, en
particular células de plantas o células de plantas con una
producción de
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
suprimida o completamente impedida, que está caracterizado porque
por lo menos uno de los vectores según la invención, es decir, el
que comprende la molécula de ADN según la invención, la molécula de
ADN mutada o la molécula que codifica para ribozimas o el que
comprende la molécula de ADN en orientación inversa al promotor se
infiltra en la célula hospedadora o la planta. Lo expuesto
anteriormente referente a la transcripción es aplicable aquí
también.
Las células hospedadoras utilizadas pueden ser
por ejemplo células de plantas, siendo apto por ejemplo el plásmido
Ti con el sistema Agrobacterium. El sistema
Agrobacterium permite transfectar una planta directamente:
las agrobacterias producen cecidomia de las raíces en las plantas.
Cuando las agrobacterias infectan una planta herida, las bacterias
mismas no llegan a la planta, sino que infiltran la sección del ADN
recombinante, el denominado ADN T, del plásmido Ti anular,
extracromosómico, inducido con el tumor en las células de plantas.
El ADN T y con ello también la molécula ADN incorporada en el mismo
se incorporan de forma estable en el ADN cromosómico de la célula,
con lo cual los genes del ADN T vienen a ser expresados en la
planta.
Existe un gran número de mecanismos de
transfección eficaces conocidos para diferentes sistemas de
huéspedes. Entre los ejemplos de dichos sistemas se incluyen la
electroporación, el método de fosfato cálcico, la microinyección y
el método de liposomas.
A continuación, las células transfectadas se
someten a una selección, por ejemplo a base de sus resistencias a
los antibióticos, para los cuales el vector posee genes, o de otros
genes marcadores. A continuación, se amplifican las líneas de
células transfectadas, o bien en cantidades menores, por ejemplo en
placas de Petri, o bien en mayores cantidades, por ejemplo en
fermentadores. Además, las plantas presentan una característica
particular, puesto que son capaces de volver a desarrollarse a
partir de una célula (transfectada) o de un protoplasto en una
planta completa, que puede cultivarse.
Según el vector utilizado, se producen procesos
en el huésped, los cuales suprimen o impiden completamente la
expresión de la enzima.
Si el vector que comprende la molécula de ADN se
transfecta por la mutación por deleción, inserción o substitución,
se producirá una recombinación homóloga: La molécula de ADN mutada
reconoce, a pesar de la mutación, la secuencia idéntica en el genoma
de la célula hospedadora y se incorporará exactamente en este lugar,
con lo cual se produce un gen "knockout". De esta manera, se
introduce en el gen para la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
una mutación, que puede inhibir la expresión correcta de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa.
Tal como ya se ha expuesto anteriormente, lo importante en esta
técnica es que la mutación sea suficiente para impedir la expresión
de la proteína activa. Tras la selección y amplificación, una
comprobación adicional puede consistir en secuenciar el gen, con el
fin de establecer el éxito de la recombinación homóloga o el grado
de la mutación.
Si el vector que comprende la molécula de ADN que
codifica para una ribozima se transfecta, se expresará la ribozima
activa en la célula hospedadora. La ribozima forma un complejo con
la secuencia complementaria del ARNm de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
por lo menos en un sitio, corta este sitio, inhibiendo de esta
manera la traducción de la enzima. En esta célula hospedadora así
como en las líneas de células que proceden de la misma o de la
planta, no se expresará la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa.
En el caso del vector que comprende la molécula
de ADN según la invención en la dirección "sense" o inversa al
promotor, se expresa en la célula (o planta) transfectada un ARNm
"sense" o "antisense". El ARNm "antisense" o
"sense" es complementario con por lo menos una parte de la
secuencia del ARNm de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
y puede inhibir igualmente la traducción de la enzima. Como un
ejemplo de un procedimiento para suprimir la expresión de un gen
mediante la técnica "antisense", ver la publicación de Smith
et al. 1990, Mol. Gen. Genet. 224:477-481, en
la que está inhibida la expresión de un gen involucrado en el
proceso de maduración del
tomate.
tomate.
En todos los sistemas, por lo menos se suprime,
preferentemente incluso se impide completamente la expresión de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa.
El grado de perturbación de la expresión de gen depende del grado de
formación de complejo, recombinación homóloga, de mutaciones al azar
eventuales, subsiguientes y de otros procesos en la región del
genoma. Las células transfectadas se investigan con respecto a la
actividad de
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
y se seleccionan.
También cabe la posibilidad de reforzar aun más
la supresión de la expresión de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
descrita anteriormente, infiltrando en el huésped, además de la
infiltración de un vector tal como se ha descrito anteriormente, un
vector que comprende un gen que codifica para una proteína de un
mamífero, por ejemplo
\beta-1,4-galactosiltransferasa.
La fucosilación puede quedar disminuida por la acción de otras
enzimas de mamíferos, siendo particularmente eficaz la combinación
de la inhibición de la expresión de una
\alpha-1,3-fucosiltransferasa
activa con ayuda de un vector según la invención y con ayuda de un
vector de una enzima de mamífero.
Para la transfección puede utilizarse cualquier
tipo de planta, por ejemplo la judía Mungo, la planta de tabaco, de
tomate y/o de patata.
Otro procedimiento ventajoso para la preparación
de células hospedadoras recombinantes, en particular células de
plantas o plantas, consiste en infiltrar la molécula de ADN que
comprende la mutación en el genoma de la célula hospedadora o de la
planta en lugar de la secuencia homóloga, no mutada (Schaefer et
al. 1997, Plant J.; 11(6):1195-1206). Por
tanto, dicho procedimiento no funciona con un vector, sino con una
molécula pura de ADN. La molécula se infiltra en el huésped por
ejemplo por bombardeo genético, microinyección o electroporación,
para mencionar sólo tres ejemplos. Tal como ya se ha expuesto
anteriormente, la molécula de ADN se coloca al lado de la secuencia
homóloga en el genoma del huésped, con lo cual se produce una
recombinación homóloga, provocando de esta manera una mutación por
deleción, inserción o substitución en el genoma: La expresión de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
puede suprimirse o impedirse completamente.
Otro aspecto de la invención se refiere a las
plantas o células de plantas, cuya actividad de
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
es preferentemente por debajo de un 50%, en particular por debajo de
un 20%, de forma particularmente preferida de un 0%, de la actividad
de
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
que ocurre en plantas o células de plantas naturales. La ventaja de
dichas plantas o células de plantes radica en que las glicoproteínas
producidas por las mismas no presenta fucosa con un enlace
\alpha-1,3 o muy poco de la misma. Cuando los
productos de dichas plantas son ingeridos por el cuerpo humano o el
de un vertebrado, no se produce una reacción inmune contra el
epítope \alpha-1,3-fucosa.
Preferentemente, se proporcionan plantas o
células de plantas recombinantes preparadas según uno de los
procedimientos descritos anteriormente y cuya producción de
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
queda suprimida o completamente impedida.
Se describen también (que no forman parte de la
invención) insectos o células de insectos recombinantes preparadas
según uno de los procedimientos descritos anteriormente y cuya
producción de
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
queda suprimida o completamente impedida. Aquí tampoco se producen
glicoproteínas con radicales de fucosa con enlace
\alpha-1,3, con lo cual tampoco se produce una
reacción inmune contra el epítope
\alpha-1,3-fucosa.
La invención se refiere también a una molécula de
ANP que comprende una secuencia de bases que es complementaria con
la secuencia de la molécula de ADN según la invención. El ANP (ácido
nucleico peptídico) es una secuencia similar a la de ADN, en la que
las nucleobases están unidas a una espina dorsal de seudopéptido. El
ANP hibridiza por lo general con los oligómeros de ADN, ARN o ANP
complementarios por apareamiento de bases según
Watson-Crick y formación de hélix. La espina dorsal
de péptido asegura una mayor resistencia a la degradación
enzimática. Por lo tanto, la molécula de ANP constituye un mejor
reactivo "antisense". Ni las nucleasas ni las proteasas son
capaces de atacar una molécula de ANP. La estabilidad de la molécula
de ANP, en caso de ser unida a una secuencia complementaria,
presenta un bloqueo estérico suficiente de las polimerasas de ADN y
ARN, de la transcriptasa reversa, telomerasa y de las ribosomas.
Si la molécula de ANP presenta la secuencia
citada anteriormente, se unirá al ADN o a un sitio del ADN que
codifica para la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
y puede inhibir de esta manera la transcripción de dicha enzima.
Puesto que la molécula de ANP ni se transcribe ni se traduce, se
prepara sintéticamente, por ejemplo con ayuda de la técnica
t-boc.
Ventajosamente, se proporciona una molécula de
ANP que comprende una secuencia de bases que corresponde a la
secuencia de la molécula de ADN según la invención. Dicha molécula
de ANP forma un complejo con el ARNm o un sitio del ARNm de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa,
inhibiendo la traducción de la enzima. Lo que se ha dicho con
respecto al ARN "antisense" es aplicable aquí de forma análoga.
Así, por ejemplo, una región de formación de complejo
particularmente eficaz es la región del inicio de la traducción o
también las regiones 5' no traducidas del ARNm.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un procedimiento para la preparación de plantas o células, en
particular células de plantas que presentan una expresión bloqueada
de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
al nivel de la transcripción o traducción, que está caracterizado
porque en las células se infiltran moléculas de ANP según la
invención. Para la infiltración de la molécula de ANP o de las
moléculas de ANP en la célula, se utilizan otra vez los métodos
convencionales, tales como por ejemplo la electroporación o
microinyección. La infiltración resulta particularmente eficaz si
los oligómeros de ANP están unidos a péptidos penetradores de
células, por ejemplo transportan o pAntp (Pooga et al. 1998,
Nature Biotechnology, 16: 857-861).
La invención proporciona un procedimiento para la
preparación de glicoproteínas recombinantes, que está caracterizado
porque las plantas o células de plantas recombinantes según la
invención, cuya producción de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
queda suprimida o completamente impedida, o plantas o insectos o
células, en las que se han infiltrado las moléculas de ANP por medio
del procedimiento según la invención, se han transfectado con el gen
que codifica para la glicoproteína recombinante, con lo cual vienen
a ser expresadas las glicoproteínas recombinantes. En dicho
procedimiento, se transfectan los vectores ya descritos
anteriormente que comprenden genes para las proteínas deseadas en el
huésped o en las células hospedadoras, tal como ya se ha descrito
también anteriormente. Las células de plantas o de insectos
transfectados expresan las proteínas deseadas, no presentando fucosa
con enlace \alpha-1,3 o muy poco de la misma. Por
tanto, no disparan las reacciones inmunes ya mencionadas
anteriormente en el cuerpo humano o el de un vertebrado. Esto
permite producir cualquier proteína en dichos sistemas.
Preferentemente, se proporciona un procedimiento
para la preparación de glicoproteínas recombinantes humanas, que
está caracterizado porque las plantas o células de plantas
recombinantes según la invención, cuya producción de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
queda suprimida o completamente impedida, o plantas o células, en
las que se han infiltrado las moléculas de ANP por medio del
procedimiento según la invención, se han transfectado con el gen que
codifica para la glicoproteína, con lo cual vienen a ser expresadas
las glicoproteínas recombinantes. Dicho procedimiento permite
producir proteínas humanas en (células de) plantas, que, al ser
absortas por el cuerpo humano, no disparan una reacción inmune
dirigida contra los radicales de fucosa con enlace
\alpha-1,3. Al mismo tiempo, cabe la posibilidad
de utilizar, para la producción de las glicoproteínas recombinantes,
tipos de plantas que sirven de alimentos, por ejemplo plátano,
patata y/o tomate. Los tejidos de dicha planta comprenden la
glicoproteína recombinante, con lo cual la glicoproteína
recombinante es absorta por el cuerpo humano por ejemplo por
extracción de la glicoproteína recombinante del tejido, seguido por
administración o directamente por el consumo del tejido vegetal.
Se prefiere un procedimiento para la preparación
de glicoproteínas recombinantes humanas para su utilización en
medicina, que está caracterizado porque las plantas o células de
plantas recombinantes según la invención, cuya producción de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
queda suprimida o completamente impedida, o plantas o células, en
las que se han infiltrado las moléculas de ANP por medio del
procedimiento según la invención, se han transfectado con el gen que
codifica para la glicoproteína, con lo cual vienen a ser expresadas
las glicoproteínas recombinantes. Con tal fin, puede utilizarse
cualquier proteína que es de interés en medicina.
Se describen también glicoproteínas
recombinantes, (que no forman parte de la invención) que se han
preparado según un procedimiento descrito anteriormente en sistemas
de plantas o de insectos y cuya secuencia de péptidos presenta menos
de un 50%, en particular menos de un 20%, de forma particularmente
preferida un 0%, de los radicales de fucosa con enlace
\alpha-1,3 que ocurren en las proteínas expresadas
en los sistemas de plantas o de insectos no reducidos por la
fucosiltransferasa. Naturalmente, hay que dar preferencia a las
glicoproteínas que no presentan radicales de fucosa con enlace
\alpha-1,3. La cantidad de fucosa con enlace
\alpha-1,3 depende del grado de la supresión de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
descrita anteriormente.
Se describen también glicoproteínas recombinantes
humanas, (que no forman parte de la invención) que se han preparado
según un procedimiento descrito anteriormente en sistemas de plantas
o de insectos y cuya secuencia de péptidos presenta menos de un 50%,
en particular menos de un 20%, de forma particularmente preferida un
0%, de los radicales de fucosa con enlace
\alpha-1,3 que ocurren en las proteínas expresadas
en los sistemas de plantas o de insectos no reducidos por la
fucosiltransferasa.
Una forma de realización particularmente
preferida se refiere a glicoproteínas recombinantes humanas para su
utilización en medicina, que se han preparado según un procedimiento
descrito anteriormente en sistemas de plantas o de insectos y cuya
secuencia de péptidos presenta menos de un 50%, en particular menos
de un 20%, de forma particularmente preferida un 0%, de los
radicales de fucosa con enlace \alpha-1,3 que
ocurren en las proteínas expresadas en los sistemas de plantas o de
insectos no reducidos por la fucosiltransferasa.
Dichas glicoproteínas pueden contener otras
unidades de oligosacáridos unidas que son específicas de plantas o
de insectos, por lo cual serán diferentes - en el caso de las
glicoproteínas humnas - de las glicoproteínas naturales. No
obstante, las glicoproteínas iniciarán una menor reacción inmune o
ninguna en absoluto en el cuerpo humano, puesto que, tal como ya se
ha representado en la introducción de la descripción, los radicales
de fucosa con enlace \alpha-1,3 son la causa
principal de las reacciones inmunes o reacciones inmunes cruzadas
contra las glicoproteínas de plantas y de insectos.
Se describe también (que no forma parte de la
invención) una composición farmacéutica que comprende las
glicoproteínas. Además de las glicoproteínas, la composición
farmacéutica comprende también otros aditivos convencionales para
este tipo de composiciones. Se trata por ejemplo de diluyentes con
contenidos diferentes de tampones (por ejemplo
Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica,
aditivos, tales como tensioactivos y disolventes (por ejemplo Tween
80, Polysorbate 80), conservantes (por ejemplo timerosal, alcohol
benzílico), adyuvantes, antioxidantes (por ejemplo ácido ascórbico,
metabisulfito sódico), emulsificadores, cargas (por ejemplo lactosa,
manitol), enlaces covalentes del polímero, tal como por ejemplo
polietilenglicol, con la protéina, incorporación del material en
preparaciones en forma de partículas de compuestos poliméricos, tal
como por ejemplo ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., o en
liposomas, sustancias auxiliares y/o vehículos útiles para el
tratamiento correspondiente. Las composiciones de este tipo
afectarán al estado físico, la estabilidad, la velocidad de la
liberación in vivo y la velocidad de la excreción in
vivo de las glicoproteínas según la invención.
La invención proporciona también un procedimiento
para la selección de moléculas de ADN que codifican para una
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
en una muestra, a la que se adicionan las moléculas de ADN según la
invención marcadas, las cuales se unen a las moléculas de ADN que
codifican para una
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa.
Las moléculas de ADN hibridizadas pueden detectarse, cuantificarse y
seleccionarse. Con el fin de asegurar que la muestra contiene ADN
monohebra que permite hibridizar las moléculas de ADN marcadas, se
procede a desnaturalizar la muestra, por ejemplo calentándola.
Una opción consiste en separar el ADN que se va a
investigar, si se desea, tras la adición de endonucleasas, por
electroporesis sobre gel en un gel de agarosa. Tras trasladarlo a
una membrana de nitrocelulosa, se adicionan las moléculas de ADN
según la invención marcadas, que hibridizan con la molécula de ADN
homóloga ("Southern Blotting").
Otra opción es encontrar genes homólogos
procedentes de otras especies por medio de métodos dependientes de
PCR, utilizando cebadores específicos y/o degenerados, derivados de
la secuencia de la molécula de ADN según la invención.
Preferentemente, la muestra comprende, para el
procedimiento según la invención citado anteriormente, ADN genómica
de un organismo vegetal. Dicho procedimiento permite investigar un
gran número de plantas por presencia del gen de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
de manera muy rápida y eficaz. Esto permite seleccionar las plantas
que no contienen dicho gen o suprimir o impedir completamente la
expresión de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
en las plantas o insectos que contienen dicho gen por medio del
procedimiento según la invención descrito anteriormente, de modo que
pueden utilizarse a continuación para la transfección y producción
de glicoproteínas (humanas).
Se describen también las moléculas de ADN que
codifican para una
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
que han sido seleccionadas y luego aisladas de la muestra según los
dos procedimientos citados por último. Dichas moléculas pueden
utilizarse para otras investigaciones. Pueden secuenciarse y
utilizarse también por su lado como sondas de ADN para encontrar
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasas.
Dichas moléculas de ADN marcadas funcionarán de forma más eficaz que
las moléculas de ADN según la invención como sondas para los
organismos que presentan una relación más estrecha con los
organismos a partir de los cuales fueron aisladas.
Otra opción se refiere a una preparación de
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
clonada que presenta isoformas con valores pI comprendidos entre 6,0
y 9,0, en particular entre 6,8 y 8,2. El valor pI de una proteína es
el valor pH en el que su carga neta es de zero y es una función de
la secuencia de aminoácidos, del modelo de glicosilación y también
de la estructura espacial de la proteína. La
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
comprende por lo menos 7 isoformas que presentan un valor pI en
dicho intervalo. La razón de las diferentes isoformas de la
transferasa son por ejemplo diferentes glicosilaciones y proteólisis
limitada. Se ha demostrado por medio de experimentos que las plantas
de semillero de las judías Mungo procedentes de plantas diferentes
presentan relaciones diferentes de las isozimas. El valor pI de una
proteína puede establecerse por enfoque isoeléctrico conocido por
los expertos en la materia.
La isoforma principal de la enzima presenta un
peso molecular aparente de 54 kDa.
En particular, la preparación comprende isoformas
con valores pI de 6,8, 7,1 y 7,6.
Se describe también un procedimiento para la
preparación de unidades de carbohidrato "vegetalizadas"
procedentes de glicoproteínas humanas y de otros vertebrados, en el
que a una muestra que comprende una unidad de carbohidrato o una
glicoproteína se adicionan unidades de fucosa así como una
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
codificada por una molécula de ADN descrita anteriormente, con lo
cual la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
une la fucosa a la unidad de carbohidrato o a la glicoproteína en la
posición \alpha-1,3. El procedimiento según la
invención para la clonación de
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
preparar grandes cantidades de la enzima purificada. Para obtener
una transferasa completamente activa, se establecen condiciones de
reacción adecuadas. Se ha hallado que la transferasa presenta una
actividad particularmente alta a un valor pH de aproximadamente 7,
si el tampón utilizado es el ácido
2-(N-morfolino)etanosulfónico-HCl.
En presencia de cationes bivalentes, en particular Mn^{2+}, se
refuerza la actividad de la transferasa recombinante. La unidad de
carbohidrato se adiciona a la muestra o bien en una forma no ligada
o ligada a una proteína. La transferasa recombianate es efectiva
para ambas formas.
A continuación, la invención se ilustrará con
mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos y figuras de los
dibujos adjuntos, que no limitan la invención. Específicamente, se
muestran: en las Figs. 1a y 1b del dibujo, las cantidades de
proteína medidas y la actividad de enzima medida en las fracciones
individuales del eluado como curvas; en la Fig. 2, una
representación de un gel de electroforesis de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa;
en la Fig. 3, el resultado del enfoque isoeléctrico y la actividad
de transferasa medida de las isoformas individuales; en la Fig. 4,
las secuencias N-terminales de 4 péptidos trípticos
1 - 4 así como la secuencia de ADN de tres cebadores S1, A2 y A3; en
las Figs. 5a y 5b, la secuencia de ADNc de la
\alpha-1,3-fucosiltransferasa; en
las Figs. 6a y 6b, la secuencia de aminoácidos de la
\alpha-1,3-fucosiltransferasa
derivada de la anterior; en la Fig. 7, una representación
esquemática de la
\alpha-1,3-fucosiltransferasa así
como la hidrofobicidad de los radicales de aminoácidos; en la Fig.
8, una comparación de los motivos conservados de las diferentes
fucosiltransferasas; en la Fig. 9, una comparación de la actividad
de la fucosiltransferasa de células de insectos transfectadas con el
gen de la
\alpha-1,3-fucosiltransferasa con
un control negativo; en las Figs. 10a y 10 b, las estructuras de
diferentes aceptores de la
\alpha-1,3-fucosiltransferasa; en
las Figs. 11 y 12, los espectros de masas; y, en la Fig. 13, el
resultado de una HPLC.
Todas las etapas se llevaron a cabo a 4ºC.
Plantas de semillero de judías Mungo se homogenizaron en una
mezcladora, utilizando un volumen de 0,75 del tampón de extracción
por kg de judías. A continuación, el material homogenizado se filtró
pasándolo por dos capas de tejido de algodón, y el filtrado se
centrifugó a 30.000 g durante 40 min. Se descartó el sobrenadante, y
se extrajo el pellet con un tampón de disolución durante la noche
con agitación constante. La centrifugación subsiguiente a 30.000 g
durante 40 min. produjo el extracto de Triton.
El extracto de Triton se purificó de la manera
siguiente:
Etapa
1
El extracto de Triton se colocó en un
intercambiador de aniones microgranular de dietilaminoetilcelulosa
con una columna de celulosa DE52 (5x28 cm, de la empresa Whatman),
que anteriormente se había calibrado con el tampón A. La fracción no
ligada se sometió a un tratamiento posterior en la etapa 2.
Etapa
2
La muestra se colocó en una columna (2,5x32)
Affi-Gel Blue calibrada con el tampón A. Tras lavar
la columna con este tampón, se eluyó la proteína adsorta con el
tampón A que contiene NaCl 0,5 M.
Etapa
3
Tras la diálisis del eluado de la etapa 2
utilizando el tampón B, el mismo se colocó en una columna
S-Sefarosa calibrada con el mismo tampón. La
proteína ligada se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0 a 0,5 M
en el tampón B. Las fracciones que contienen la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
se combinaron y se sometieron a una diálisis con el tampón C.
\newpage
Etapa
4
La muestra dializada se colocó en una columna
GnGn-Sefarosa calibrada con el tampón C. La proteína
ligada se eluyó utilizando el tampón C que contiene NaCl 1 M en
lugar de MnCl_{2}.
Etapa
5
A continuación, la enzima se sometió a una
diálisis con el tampón D y se colocó en una columna de
GDP/hexanola-
mina/Sefarosa. Tras lavar la columna con el tampón D, se eluyó la transferasa reemplazando MgCl_{2} y NaCl con GDP 0,5 mM. Las fracciones activas se unieron, se dializaron con el tampón Tris-HCl 20 mM, pH 7,3, y se liofili-
zaron.
mina/Sefarosa. Tras lavar la columna con el tampón D, se eluyó la transferasa reemplazando MgCl_{2} y NaCl con GDP 0,5 mM. Las fracciones activas se unieron, se dializaron con el tampón Tris-HCl 20 mM, pH 7,3, y se liofili-
zaron.
La actividad enzimática de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
se determinó utilizando el péptido GnGn y
GDP-L-[U-^{34}C]-fucosa
en una cantidad de substrato de 0,5 y 0,25, respectivamente, en
presencia del tampón ácido
2-(N-morfolino)etanosulfónico-HCl,
Triton X-100, MnCl_{2}, GlcNAc y AMP (según
Staudacher et al. 1998 Glycoconjugate J. 15,
355-360; Staudacher et al. 1991 Eur. J.
Biochem. 199, 745-751).
Las concentraciones de proteína se determinaron
con ayuda del método Ácido bicincónico (Pierce) o, durante las
últimas etapas de la purificación enzimática, por medio del análisis
de aminoácidos (Altmann 1992, Anal. Biochem. 204,
215-219).
En las Figs. 1a y 1b, se han representado las
cantidades de proteína medidas y la actividad enzimática medida en
las fracciones individuales del eluado como curvas. La Fig. 1a
muestra la separación descrita anteriormente en la columna de
S-Sefarosa, y la Fig. 1b la separación en la columna
de GnGn-Sefarosa, en la que el círculo es la
proteína, el círculo lleno negro la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
y el cuadrángulo
N-acetil-\beta-glucosaminidasa.
Un U es definido como la cantidad de enzima que transfiere 1
\mumol de fucosa por minuto a un aceptor.
La Tabla 1 muestra las etapas individuales de la
purificación de la transferasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa de purificación | Tot. Prot. | Tot. Act. | Activ. Esp. | Factor de purificación | Rendimiento |
mg | mU | mU/mg | Veces | % | |
Extracto de Triton X-100 | 91.500 | 4.846 | 0,05 | 1 | 100 |
DE52 | 43.700 | 4.750 | 0,10 | 2 | 98,0 |
Affigel Blue | 180,5 | 4.134 | 23 | 460 | 85,3 |
S-Sefarosa | 8,4 | 3.251 | 390 | 7.800 | 67,1 |
GnGn-Sefarosa | 0,13^{1} | 1.044 | 8.030 | 160.000 | 21,5 |
GDP/hexanolamina/Sefarosa | 0,02^{1} | 867 | 43.350 | 867.000 | 17,9 |
^{1} se determinó por medio del análisis de aminoácidos. |
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de extracción:
- Ditiotreitol 0,5 mM
- EDTA 1 mM
- Polivinilpolipirrolidona al 0,5%
- Sacarosa 0,25 M
- Tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,3
\newpage
Tampón de disolución:
- Ditiotreitol 0,5 mM
- EDTA 1 mM
- Triton X-100 al 1,5%
- Tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,3
Tampón A:
- Tampón Tris-HCl 25 mM, pH 7,3 que contiene:
- Triton X-100 al 0,1% y
- NaN_{3} al 0,02%
Tampón B:
- Tampón citrato sódico 25 mM, pH 5,3 que contiene:
- Triton X-100 al 0,1% y
- NaN_{3} al 0,02%
Tampón C:
- Tampón Tris-HCl 25 mM, pH 7,3
- MnCl_{2} 5 mM y
- NaN_{3} al 0,02%
Tampón D:
- Tampón Tris-HCl 25 mM, pH 7,3 que contiene:
- MgCl_{2} 10 mM
- NaCl 0,1 M y
- NaN_{3} al 0,02%
Un SDS-Page se realizó en una
Biorad Mini-Protean Cell sobre geles que contenían
un 12,5% de acrilamida y 1% de bisacrilamida. Los geles se tiñeron o
bien con Coomassie Brilliant Blue R-250 o bien con
plata. El enfoque isoeléctrico de la fucosiltransferasa se llevó a
cabo sobre geles con un intervalo pI comprendido entre 6 y 9
(Servalyt precotes 6-9, Serva). Los geles se tiñiron
con plata según el protocolo del fabricante. Para la electroforesis
bidimensional, se cortaron bandas del gel de enfoque, que fueron
tratadas con reactivos de S-alquilación y SDS y se
sometieron a un SDS-Page tal como se ha descrito
anteriormente.
La Fig. 2 muestra un gel de electroforesis de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa,
en la que se ha representado la electroforesis bidimensional a mano
izquierda y el SDS-Page unidimensional a mano
derecha. El trayecto denominado A es un estándar, el trayecto
denominado B es la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
de la columna de GnGn/Sefarosa y el trayecto denominado C es la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
"purificada", es decir, la fracción de la columna de
GDP/hexanolamina/Sefarosa. Las dos bandas a 54 y 56 kDa representan
isoformas de la transferasa.
La Fig. 3 muestra el resultado del enfoque
isoeléctrico. El trayecto A se tiñó con plata, y la actividad de las
isoformas de la transferasa se comprobó en el trayecto B. La
actividad se ha indicado como % de fucosa transferido por la
GDP-fucosa al substrato.
Para la secuenciación de la proteína, se cortaron
bandas del gel de SDS/poliacrilamida teñido con Coomassie, se
sometieron las mismas a una carboxamidometilación y se disociaron
con tripsina según Görg et al. 1988, Electrophoresis, 9,
681-692. Los péptidos trípticos se separaron por
medio de HPLC con fase reversa en una columna Vydac C18 de 1,0x250
mm a 40ºC a un caudal de 0,05 ml/min, utilizando un aparato HP 1100
(Hewlett-Packard). Los péptidos aislados se
secuenciaron con un sistema de secuenciación de proteínas G10005A de
Hewlett-Packard según el protocolo del fabricante.
Además, se analizó la mezcla de péptidos por medio de digestión
Ingel con MALDI-TOF MS (ver abajo).
La Fig. 4 muestra las secuencias
N-terminales de 4 péptidos trípticos 1 - 4 (SEC ID
No: 5-8). A partir de los tres primeros péptidos, se
preparaon los cebadores S1, A2 y A3 (no. de identificación de la
secuencia 9-11).
Todo el ARN se aisló a partir de un hipocotil de
judías mungo de 3 días, utilizándose el sistema de aislamiento de SV
Total ARN de Promega. Para la preparación del ADNc de la primera
hebra, se incubó todo el ARN a 48ºC durante 1 h con AMV
transcriptasa reversa y cebadores de oligo(dT), utilizándose
el sistema de transcriptasa reversa de Promega.
El ADNc de la primera hebra se sometió a una PCR,
utilizando una combinación de cebadores "sense" y
"antisense":
"antisense":
A 10 \mul de la reacción de transcripción
reversa, se adicionó la cantidad siguiente:
50 \mul que contenía 0,1 \mumol de cada
cebador, dNTPs 0,1 mM, MgCl_{2} 2 mM, tampón
Tris-HCl 10 mM, pH 9,0, KCl 50 mM y Triton
X-100 al 0,1%.
Tras una primera etapa de desnaturalización a
95ºC durante 2 min., se realizaron 40 ciclos de 1 min. a 95ºC, 1
min. a 49ºC y 2 min. a 72ºC. La última etapa de extensión se realizó
a 72ºC durante 8 min. Los productos PCR se subclonaron en el vector
pCR2.1, utilizando el TA Cloning Kit de Invitrogen, y se
secuenciaron. Los productos de dicha PCR eran dos fragmentos de ADN
con una longitud de 744 bp y 780 bp, presentando ambos fragmentos el
mismo extremo 5' (ver también la Fig. 7).
A partir de dichos dos fragmentos de ADN, se
obtuvieron las regiones 5' y 3' del ADNc que faltaban por Rapid
Amplification 5' y 3' de los extremos ADNc (RACE), utilizando el
RACE kit de Gibco-BRL. Se utilizó como cebador
"antisense" el cebador de amplificación universal del kit y
como cebador "sense" o bien 5'-CTG
GAACTGTCCCTGTGGTT-3' (SEC ID NO: 12) o bien 5'-AGTGCACTAGAGGGCCAGAA-3' (SEC ID NO: 13). Se utilizó como cebador "sense" también el cebador de anclaje acortado del kit y como cebador "antisense" 5'-TTCGAGCACCACAATTGGAAAT-3' (SEC ID NO: 14) o 5'-GAATGCAAAGACGGCACGATGAAT-3' (SEC ID
GAACTGTCCCTGTGGTT-3' (SEC ID NO: 12) o bien 5'-AGTGCACTAGAGGGCCAGAA-3' (SEC ID NO: 13). Se utilizó como cebador "sense" también el cebador de anclaje acortado del kit y como cebador "antisense" 5'-TTCGAGCACCACAATTGGAAAT-3' (SEC ID NO: 14) o 5'-GAATGCAAAGACGGCACGATGAAT-3' (SEC ID
\hbox{NO: 15).}
La PCR se realizó a una "Annealing
Temperature" de 55ºC en las condiciones descritas anteriormente.
Los productos RACE 5' y 3' se subclonaron en el vector pCR2.1 y se
secuenciaron: Las secuencias de los fragmentos subclonados se
secuenciaron por medio del método de didesoxinucleótido (ABI PRISM
Dye Terminator Cycle Sequencing Ready reaction Kit y ABI PRISM 310
Genetic analyser (Perkin Elmer)). Para la secuenciación de los
productos clonados en el vector pCR2.1, se utilizaron los cebadores
directos T7 y M13. Ambas hebras de la región codificadora se
secuenciaron por el Vienna VBC Genomics Sequencing Service,
utilizándose cebadores marcados con infrarrojo (IRD700 e IRD800) y
un secuenciador LI-COR Long Read IR 4200 (Lincoln,
NE).
Las Figs. 5a y 5b muestran el ADNc entero, que
presenta un tamaño de 2.198 bp y un marco de lectura abierto de
1.530 bp (SEC ID NO: 1). El marco de lectura abierto (codón de
iniciación en los pares de bases 211-213, codón de
terminación en los pares de bases 1740-1743)
codifica para una proteína de 510 aminoácidos con un peso molecular
de 56,8 kDA y un valor pI teórico de 7,51.
Las Figs. 6a y 6b muestran la secuencia de
aminoácidos de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
derivada del ADNc (SEC ID NO: 2). Los sitios para la glicosilación
ligada a asparagina se encuentran en Asn346 y Asn429.
En la Fig. 7, se ha representado el ADNc de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
esquemática (arriba) y el índice de hidrofobicidad derivado de la
proteína codificada (abajo), en la que un índice de hidrofobicidad
positivo significa una mayor hidrofobicidad. Entre ambos, se han
representado los tamaños de los dos productos PCR citados
anteriormente con relación al ADNc entero. El área de codificación
se ha representado por medio de una barra, codificando "C" para
la región citoplasmática postulada, T para la región transmembrana
postulada y G para la región de la transferasa catalítica postulada
para el lumen de Golgi. El análisis de la secuencia de ADN por
"TMpred" (de EMBnet, Suiza) dio una región transmembrana
probable entre Asn36 y Gly54. La región C terminal de la enzima
incluye probablemente la región catalítica y por lo tanto debería de
estar dirigida hacia el lumen del aparato de Golgi. Por ello, esta
transferasa parece ser una proteína transmembrana del tipo II, tal
como lo son todas las glicosiltransferasas que desempeñan un papel
en la biosíntesis de glicoproteínas (Joziasse, 1992 Glycobiology 2,
271-277). Las regiones grises representan los cuatro
péptidos trípticos y los hexágonos representan los sitios
potenciales de la N-glicolisación. Una búsqueda
BLASTP de todos los bancos de datos accessible a través de NCBI
demostró una similiaridad entre la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
y otras
GlcNAc-\alpha-1,3/4-fucosiltransferasas,
por ejemplo la fucosiltransferasa VI humana. A
18-21% (investigado por
SIM-LALNVIEW, Expase, Suiza), la similaridad total
estaba fuera de cualquier significado. No obstante, una parte de la
secuencia de 35 aminoácidos (SEC ID NO: 4) presentaba una homología
sorprendentemente alta con otras
\alpha-1,3-fucosiltransferasas
(Fig. 8). Dicha parte de la secuencia se encuentra entre Glu267 y
Pro301 de la SEC ID NO: 2.
La región codificadora de la supuesta
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
junto con las regiones citoplasmática y transmembranal se amplificó
con el cebador directo
5'-CGGCGGATCCGCAATTGAATGATG-3' (SEC
ID NO: 16) y el cebador inverso
5'-CCGGCTGCAGTACCATTTAGCGCAT-3' (SEC
ID NO: 17) con el Expand High Fidelity PCR System de Boehringer
Mannheim. El producto PCR se sometió a una doble digestión con PstI
y BamHI y se subclonó en el vector de transferencia baculovirus
pVL1393 tratado con fosfatasa alcalina, que antes había sido
sometido a una digestión con PstI y BamHI. Con el fin de asegurar
una recombinación homóloga, se cotransfectó el vector de
transferencia con ADN viral del tipo BaculoGold (PharMingen, San
Diego, CA) en células de insectos Sf9 en un medio
IPL-41 que contenía lipofectin. Tras una incubación
de 5 días a 27ºC, se utilizaron volúmenes diferentes del
sobrenadante que contenía el virus recombinante para la infección de
las células de insectos Sf21. Tras una incubación de 4 días a 27ºC
en el medio IPL-41 que contenía FCS al 5%, se
cosecharon las células Sf1 [sic] y se lavaron dos veces con una
solución salina tratada con un tampón de fosfato. Las células se
volvieron a suspender en el tampón Tris-HCl 25 mM,
pH 7,4, que contenía Triton X-100 al 2% y se
rompieron por sonificación sobre hielo.
El homogenizado y el sobrenadante de las células
se ensayaron por presencia de
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa.
Muestras de control se prepararon con baculovirus recombinante que
codifica para la GlcNAc-fucosiltransferasa I de
tabaco (Strasser et al. 1999, Glycobiology, en prensa).
La Fig. 9 muestra la actividad enzimática de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
recombinante así como del control negativo. En el mejor caso, la
actividad enzimática de las células cotransfectadas y de su
sobrenadante era 30 veces más alta que la de los controles
negativos. Dicha actividad endógena, que puede medirse en ausencia
de la transferasa recombinante, se debe sustancialmente a la
\alpha-1,6-fucosiltransferasa de
insectos y sólo en un bajo tanto por ciento a la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa.
Por ello, el aumento de la actividad de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
procedente de los baculovirus es mucho más que 100 veces.
La enzima presentaba una ancha actividad máxima
alrededor de un valor pH de 7,0, si la actividad se midió en el
tampón ácido 2-(morfolin)etanosulfónico\cdotHCl. Tal como
puede apreciarse por la Tabla 2, la adición de cationes bivalentes,
en particular de Mn^{2+}, aumenta la actividad de la transferasa
recombinante.
Aditivo | Actividad relativa |
(conc. 10 mM) | (aceptor: péptido GnGn) |
% | |
Ninguno | 21 |
EDTA | 18 |
MnCl_{2} | 100 |
CaCl_{2} | 82 |
MgCl_{2} | 52 |
CdCl_{2} | 44 |
CoCl_{2} | 35 |
CuCl_{2} | 3 |
NiCl_{2} | 24 |
ZnCl_{2} | 0,6 |
La Tabla 3 muestra que entre los aceptores
utilizados es el péptido GnGn que presenta las mayores tasas de
incorporación en condiciones de ensayo estándares, seguido de muy
cerca del péptido GnGnF^{6} y M5Gn-Asn. Ninguna
transferencia al péptido MM, que no presenta el término reductor de
GlcNAc en la manosa con enlace en la posición 3, ha podido
observarse. Dicha estructura parece ser necesaria para la
fucosiltransferasa del núcleo. La transferasa recombinante estaba
inactiva también con relación a los aceptores convencionales,
responsables de la determinación de las
\alpha-1,3/4-fucosiltransferasas
de los grupos sanguíneos, que transfieren la fucosa a GlcNAc en los
términos no reductores de oligosacáridos. Los valores K_{m}
aparentes para los substratos aceptores péptido de GnGn, péptido de
GnGnF^{6}, M5Gn-Asn y para el substrato donante
GDP-fucosa se estimaron en 0,19, 0,13, 0,23 y 0,11.
Las estructuras de las moléculas se han representado en las Figs.
10a y 10b.
Substrato aceptor | Actividad relativa | Valor K_{m} |
% | nM | |
Péptido GnGn | 100 | 0,19 |
Péptido GnGnF^{6} | 87 | 0,13 |
M5Gn-Asn | 71 | 0,23 |
Péptido MM | 0 | |
Gal\beta1-4GlcNAc | 0 | |
Gal\beta1-3GlcNAc | 0 | |
Gal\beta1-3GlcNAc\beta1-3Gal\beta1-4Glc | 0 |
Un hexapéptido GnGn dabsilado (2 nmol) se incubó
con el homogenizado de células de insectos que comprende la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
recombinante (0,08 mU) en presencia de
GDP-L-fucosa no radiactiva (10
nmol), el tampón ácido
2-(N-morfolin)etanosulfónico\cdotHCl,
Triton X-100, MnCl_{2}, GlcNAc y AMP. Un control
negativo se realizó con el homogenizado de las células de insectos
infectadas para las muestras de control. La muestras se incubaron a
37ºC durante 16 h y se analizaron por medio de espectrometría de
masas MALDI TOF.
La espectrometría de masas se llevó a cabo en un
DYNAMO (Therrmo BioAnalysis, Santa Fe, NM), que es un
MALDI-TOF MS, capaz de extracción dinámica (sinónimo
para una extracción retrasada). Se utilizaron dos tipos de
preparaciones de una matriz de muestra: Los péptidos y los
glicopéptidos dabsilados se disolvieron en ácido formico al 5% y se
aplicaron alícuotas a la diana, se secaron al aire y se cubrieron
con ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinámico
al 1%. Glicanos piridilaminados, oligosacáridos reductores y
glicopéptidos no derivadizados se diluyeron con agua, se aplicaron a
la diana y se secaron al aire. Tras la adición de ácido
2,5-dihidroxibenzoico al 2%, las muestras se secaron
inmediatamente aplicando un vacío.
La Fig. 11 muestra el espectro de masas de dichas
muestras, representando A el control negativo: El pico principal (S)
muestra el substrato
dabsilo-Val-Gly-Glu-(GlcNAc_{4}Man_{3})Asn-Arg-Thr,
siendo el valor [M+H]^{+} calculado 2262,3. Aparentemente,
este substrato aparece también como un producto de adición sódico y
como un ion más pequeño, formado por fragmentación de la función azo
del grupo dabsilo, en (S*). Una pequeña cantidad del producto
(P, [M+H]^{+}= 2408,4) se puede atribuir a la \alpha-1,6-fucosiltransferasa endógena. El pico en m/z = 2424,0 muestra la degalactosilación incompleta del substrato. El espectro de masas B muestra la muestra que contiene la \alpha-1,3-fucosiltransferasa recombinante. El pico principal (P) representa el producto fucosilado, y (P*) su ion fragmentado.
(P, [M+H]^{+}= 2408,4) se puede atribuir a la \alpha-1,6-fucosiltransferasa endógena. El pico en m/z = 2424,0 muestra la degalactosilación incompleta del substrato. El espectro de masas B muestra la muestra que contiene la \alpha-1,3-fucosiltransferasa recombinante. El pico principal (P) representa el producto fucosilado, y (P*) su ion fragmentado.
Adicionalmente, se mezclaron alícuotas de ambas
muestras, con el fin de obtener concentraciones similares de
substrato y producto (muestra A). Dicha mezcla se diluyó con acetato
de amonio 0,1 M, pH 4,0, que comprende 10 \muU de
N-glicosidasa A (muestra B) o con
Tris-HCl 50 mM, pH 8,5, que contiene 100 \muU (1 U
hidroliza 1 \mumol de substrato por min.) de
N-glicosidasa F (muestra C). Tras 2 y 20 h, se
retiraron alícuotas pequeñas de dichas mezclas y se analizaron por
medio de MALDI-TOF MS.
En la Fig. 12, se han representado los tres
espectros de masas de las muestras A, B y C. La muestra A sin
digestión muestra dos picos principales: el substrato en un m/z de
2261,4 y el producto fucosilado en un m/z de 2407,7. La curva
central muestra el espectro de masas de la muestra B, tratada con
N-glicosidasa A, que hidroliza ambas glicoproteínas.
El pico de 963,22 representa el producto deglicosilado. La curva
inferior muestra el espectro de masas de la muestra C. La
N-glicosidasa F no es capaz de hidrolizar los
substratos \alpha-1,3-fucosilados,
con lo cual el espectro contiene el pico del producto en un m/z de
2406,7, mientras que el pico del substrato hidrolizado aparece en un
m/z de 963,08.
Las dos muestras descritas anteriormente
(producto fucosilado y control negativo) se digerieron con
N-glicosidasa A. Los oligosacáridos obtenidos se
piridilaminaron y se analizaron por HPLC en fase reversa (Wilson
et al. 1998 Glycobiology 8, 651-661; Kubelka
et al. 1994 Arch. Biochem. Biophys. 308,
148-157; Hase et al. 1984 J. Biochem. 95,
197-203).
En la Fig. 13, B del diagrama superior representa
el control negativo, en el que puede verse también, además del
substrato restante (péptido GnGn), el producto
\alpha-1,6-fucosilado. A presenta
un pico con un tiempo de retención sustancialmente reducido, lo cual
es específico de los [sic=términos] reductores GlcNAc de la fucosa
con enlace
\alpha-1,3.
\alpha-1,3.
En el diagrama inferior, se comparó el producto
de transferasa aislado antes (curva A) y después de la digestión por
N-acetil-\beta-glucosaminasa
(curva B) con MMF^{3} de la fosfolipasa A2 (curva C) de la abeja
melífera.
<110> Altmann Dr., Friedrich
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120>
alfa-1,3-fucosiltransferasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> R 36247
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> A 270/99
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-02-18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2198
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción del organismo
desconocido: planta
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 510
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética:ADNc
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Ala Leu Lys His Tyr Lys Phe Ser Leu Ala
Phe Glu Asn Ser Asn}
\sac{Glu Glu Asp Tyr Val Thr Glu Lys Phe Phe Gln
Ser Leu Val Ala Gly}
\sac{Thr Val Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
<211 < 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: Péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Pro Asp Ala Xaa Phe Gly Leu Pro Gln Pro
Ser Thr Ala Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: Péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Glu Thr Val Tyr His Ile Tyr Val
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: Péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Ser Ala Gly Tyr Tyr Ala Glu Asn Asn
Ile Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: Péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Phe Glu Met Glu Ser Ile Tyr
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcngartayt aygcngaraa yaayathgc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcrtadatrtg rtanacngty tc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptadatnswyt ccatytcraa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggaactgt ccctgtggtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: ADN
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtgcactag agggccagaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcgagcacc acaattggaa at
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaatgcaaag acggcacgat gaat
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggcggatcc gcaattgaat gatg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggctgcag taccatttag cgcat
\hfill25
Claims (25)
1. Molécula de ADN, caracterizada porque
comprende una secuencia según la SEC ID nº: 1 con un marco de
lectura abierto del par de bases 211 al par de bases 1740 o presenta
una identidad de por lo menos un 50% con la secuencia citada
anteriormente o hibridiza con la secuencia citada anteriormente en
condiciones rigurosas o comprende una secuencia que, como
consecuencia del código genético, está degenerada en la secuencia de
ADN citada anteriormente, cuya secuencia codifica para una proteína
vegetal con una actividad de fucosiltransferasa o es complementaria
a la misma.
2. Molécula de ADN según la reivindicación 1,
caracterizada porque codifica para una proteína con una
actividad de
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa,
particularmente con una actividad de
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
del núcleo.
3. Molécula de ADN según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque presenta una identidad de por lo menos
entre 70 y 80%, de forma particularmente preferida de por lo menos
un 95%, con la secuencia según la SEC ID nº: 1.
4. Molécula de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque comprende de
2150 a 2250, particularmente 2198, pares de bases.
5. Molécula de ADN, caracterizada porque
comprende una secuencia según la SEC ID nº: 3 o una secuencia que
presenta una identidad de por lo menos un 85%, particularmente de
por lo menos un 95%, con la secuencia citada anteriormente o
hibridiza con la secuencia citada anteriormente en condiciones
rigurosas o que, como consecuencia del código genético, está
degenerada en la secuencia de ADN citada anteriormente.
6. Molécula de ADN, caracterizada porque
comprende una parte de una secuencia de una molécula de ADN según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y presenta una identidad de
por lo menos un 80% con la SEC ID nº: 1 y un tamaño de 20 a 200,
preferentemente de 30 a 50, pares de bases.
7. Molécula de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque está asociada de
forma covalente con una sustancia de marcaje detectable.
8. Vector biológicamente funcional,
caracterizado porque comprende una molécula de ADN según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Vector biológicamente funcional,
caracterizado porque comprende una molécula de ADN según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en orientación inversa al
promotor.
10. Molécula de ADN que codifica para una
ribozima, caracterizada porque presenta dos secciones de
secuencias de por lo menos entre 10 y 15 pares de bases cada una,
que son complementarias con las secciones de secuencias de una
molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, de
modo que la ribozima corta y forma un complejo con el ARNm que es
transcrito por una molécula de ADN de una
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
natural.
11. Vector biológicamente funcional,
caracterizado porque comprende una molécula de ADN según la
reivindicación 10.
12. Procedimiento para la preparación de un ADNc
que comprende una molécula de ADN según cualquiera de la
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se aísla ARN a
partir de células de plantas, particularmente de células del
hipocotil, que se utiliza, tras la adición de una transcriptasa
reversa y de cebadores que son específicos de una molécula de ADN
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o cebadores que
hibridizan con una molécula de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, para realizar una transcripción inversa.
13. Procedimiento para la clonación de una
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa,
caracterizado porque se clona una molécula de ADN según
cualquiera de la reivindicaciones 1 a 5 en un vector, que a
continuación se transfecta en una célula hospedadora o en un
huésped, en el que se obtienen, por medio de la selección y
amplificación de células hospedadoras transfectadas, líneas de
células que expresan la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
activa.
14. Procedimiento para la preparación de células
hospedadoras recombinantes, particularmente de células de plantas o
plantas con una producción de
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
suprimida o completamente impedida, caracterizado porque por
lo menos uno de los vectores según las reivindicaciones 8, 9 ó 11 o
un vector que comprende una molécula de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la secuencia de ADN comprende una
mutación por deleción, inserción y/o substitución, se infiltra en la
célula hospedadora o la planta.
15. Procedimiento para la preparación de células
hospedadoras recombinantes, particularmente de células de plantas o
plantas, caracterizado porque la molécula de ADN según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la secuencia de
ADN comprende una mutación por deleción, inserción y/o substitución,
se infiltra en el genoma de la célula hospedadora o la planta en
lugar de la secuencia homóloga sin mutar.
16. Plantas o células de plantas recombinantes,
caracterizadas porque por lo menos uno de los vectores según
las reivindicaciones 8, 9 ó 11 o un vector que comprende una
molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en
la que la secuencia de ADN comprende una mutación por deleción,
inserción y/o substitución, se ha infiltrado en el mismo y porque su
producción endógena de
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
se encuentra suprimida o completamente impedida.
17. Plantas o células de plantas recombinantes,
caracterizadas porque la molécula de ADN según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en la que la secuencia de ADN comprende
una mutación por deleción, inserción y/o substitución, se ha
infiltrado en el genoma de las células o plantas en lugar de la
secuencia homóloga sin mutar y porque su producción endógena de
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
se encuentra suprimida o completamente impedida.
18. Molécula de un ácido nucleico peptídico
(ANP), caracterizada porque comprende una secuencia de bases
que es complementaria con la secuencia de una molécula de ADN según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que codifica para la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa.
19. Molécula de un ácido nucleico peptídico
(ANP), caracterizado porque comprende una secuencia de bases
que corresponde a la secuencia de una molécula de ADN según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que codifica para la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa.
20. Procedimiento para la preparación de plantas
o células, particularmente de células de plantas, que presentan una
expresión bloqueada de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
al nivel de la transcripción o traducción, caracterizado
porque se infiltran moléculas de ANP según la reivindicación 18 ó 19
en las células.
21. Procedimiento para la preparación de
glicoproteínas recombinantes, caracterizado porque las
plantas, células de plantas o tejidos de plantas recombinantes según
la reivindicación 16 ó 17 o plantas, tejidos de plantas o células,
en los que se ha infiltrado la molécula de ANP según la
reivindicación 18 ó 19 y que presentan una expresión bloqueada de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
al nivel de la transcripción o traducción, se han transfectado con
el gen que codifica para la glicoproteína, con lo cual las
glicoproteínas recombinantes vienen a ser expresadas.
22. Procedimiento para la preparación de
glicoproteínas recombinantes humanas, caracterizado porque
las plantas, células de plantes o tejidos de plantas recombinantes
según la reivindicación 16 ó 17 o plantas, tejidos de plantas o
células, en los que se ha infiltrado la molécula de ANP según la
reivindicación 18 ó 19 y que presentan una expresión bloqueada de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
al nivel de la transcripción o traducción, se han transfectado con
el gen que codifica para la glicoproteína, con lo cual las
glicoproteínas recombinantes vienen a ser expresadas.
23. Procedimiento para la preparación de
glicoproteínas recombinantes humanas para su aplicación en medicina,
caracterizado porque las plantas, células de plantes o
tejidos de plantas recombinantes según la reivindicación 16 ó 17 o
plantas, células de plantes o tejidos de plantas, en los que se ha
infiltrado la molécula de ANP según la reivindicación 18 ó 19 y que
presentan una expresión bloqueada de la
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
al nivel de la transcripción o traducción, se han transfectado con
el gen que codifica para la glicoproteína, de tal modo que las
glicoproteínas recombinantes son expresadas.
24. Procedimiento para la selección de moléculas
de ADN que codifican para una
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa
en una muestra, caracterizado porque a la muestra se
adicionan las moléculas de ADN según la reivindicación 7, las cuales
se unen a las moléculas de ADN que codifican para una
GlcNAc-\alpha-1,3-fucosiltransferasa.
25. Procedimiento según la reivindicación 24,
caracterizado porque la muestra comprende ADN genómico de un
organismo vegetal.
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