HRP20010681A2 - Fucosyl transferase gene - Google Patents

Fucosyl transferase gene Download PDF

Info

Publication number
HRP20010681A2
HRP20010681A2 HR20010681A HRP20010681A HRP20010681A2 HR P20010681 A2 HRP20010681 A2 HR P20010681A2 HR 20010681 A HR20010681 A HR 20010681A HR P20010681 A HRP20010681 A HR P20010681A HR P20010681 A2 HRP20010681 A2 HR P20010681A2
Authority
HR
Croatia
Prior art keywords
glcnac
sequence
accordance
dna
dna molecule
Prior art date
Application number
HR20010681A
Other languages
English (en)
Inventor
Friedrich Altmann
Original Assignee
Friedrich Altmann
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=3486087&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HRP20010681(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Friedrich Altmann filed Critical Friedrich Altmann
Publication of HRP20010681A2 publication Critical patent/HRP20010681A2/hr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Izum se odnosi na polinukleotide kodirane za fukozil transferazu. Osim toga, izum se odnosi na parcijalne sekvence tih polinukleotida isto tako i obuhvaća vektore tih polinukleotida, rekombinirane stanice domaćina, biljaka i insekata transfektirane s polinukleotidima ili DNA deriviranim iz njih, pojedinačno uvjetovano, te isto tako na glikoproteine proizvedene u tim sustavima.
Glikoproteini pokazuju raznolikost i složenost ugljiko-hidratnih jedinica, sastav i raspored ugljikohidrata je karakterističan za različite organizme. Oligosaharidne jedinice glikoproteina imaju brojne zadaće, npr. one su značajne u regulaciji metabolizma, uključene su u prijenosne stanica-stanica reakcije, koje određuju cirkulaciono razdoblje proteina u cirkulaciji, i oni su presudni u prepoznavanju epitopa u reakciji antigen-antitijelo.
Glikosilacija glikoproteina polazi od endoplazmatičkog retikula (ER), gdje su oligosaharidi isto vezani na aspargin stranu lanca s N-glikozidnom vezom ili serin ili treonin stranu lanca s O-glikozidnom vezom. N-veza oligosaharida sadržava običnu jezgru od penta-saharidne jedinice koja se sastoji od ostataka tri manoze i dva N-acetilglukoza amina. Daljnje modifikacije karbohidratnih jedinica, proteini se transportiraju od ER na Golgi kompleks. Struktura N-veze oligosaharidnih jedinica glikoproteina je određena prilagodijivošću i sastavom glikozil transferaza Golgi odjeljaka u kojima se prerađuju.
Bit će prikazano da jezgra pentasaharidne jedinice u Golgi kompleksu nekih biljnih i stanica insekata je zamijenjena sa ksikozom i al,3-vezom fukoze (P.Lerouge et al., 1998, Plant Mol.Biol. 38, 31-48; Rayon et al., 1998, L. EXP. Bot. 49, 1463-1472) . Heptasaharidi "MMXF3" su oblikuju sastavne dijelove glavnog oligosaharida u biljaka (Kurosaka et al. , 1991, J. Biol. Chem., 266, 4168-4172). Tako, peroksidaza hrena, β-fruktozidaza mrkve i Erythrina cristagalli obuhvaća lecitin kao što je i pčelinji venom fosfolipaza A2 ili glikoproteine membrane neurona embrija insekata fukoza α1,3-ostataka koji su veza na jezgru glikana. Te strukture također označavaju određeni kompleks N-glikan ili manoza-defićijenta ili odsječenog N-glikana, pojedinačno α-manozil ostaci mogu se dalje premještati s GlcNAc, koja vezuje galaktozu i fukozu tako da je struktura pripravljena da odgovara humanom Levisovom a-epitopu (Melo et al., 1997, FEBS Lett 415, 186-191; Fitchette-Laine et al., 1997, Plant J. 12, 1411-1417).
Ni ksiloza ni α1,3-veza fukoze ne postoje u glikoproteinima sisavaca. Utvrđeno je da jezgra-α1,3-fukoze igra značajnu ulogu u epitopu prilikom prepoznavanja antitijela, koje je direktno protiv N-veza oligosaharida biljaka i insekata (I.B.H.Wilson et al.; Glycobiology Vol.8, No. 7, pp.651-661, 1998), i otuda je okidač imune reakcije u ljudskom ili životinjskom tjelu protiv tih oligosaharida. Nadalje, ostaci α1,3-fukoze izgleda da su jedan od glavnih uzroka veoma rasprostranjene alergijske unakrsne reakcije između različitih alergena biljaka i insekata (Tretter et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 1993; 102: 259-266) i također se naziva "determinanta unakrsno-reaktivnog karbohidrata" (CCD) U ispitivanju epitopa rajčice i polena trave, također su nađeni ostaci al,3-veza fukoze kao uobičajena determinanta, za koju se čini da bi mogla biti razlog zašto rajčice i polen trave zajedno izazivaju često alergije u pacijenata (Petersen et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol., Vol. 98, 4; 805-814). Određena učestalost pojave unakrsnih reakcija u imunologiji, CCDs osim toga maskira alergijske dijagnoze.
Okidač imunih reakcija u organizmu ljudi i životinja s biljnim proteinima je glavni problem u medicinskoj upotrebi rekombiniranih humanih proteina proizvedenih na bilju. U zaobilaženju tog problema, mogla bi koristiti α1,3-jezgra fukozilacija. Ispitivanja mogu pokazati da oligosaharidi obuhvaćaju L-galaktozu umjesto L-fukoze (6-deoksi-L-galaktoza) unatoč tomu su biološki potpuno aktivne (E: Zablackis et al.; 1996, Science, Vol.272). U skladu s ostalim ispitivanjima, mutant biljke Arabidopsis thaliana je izoliran, i u njoj je nedostajala N-acetil-glukozaminil transferaza I, prvi enzim u biosintezi kompleksa glikana. Biosinteza kompleksa glikoproteina u tom mutantu je smetala. Unatoč tome, taj mutant biljke ima pod određenim uvjetima snažan normalan razvoj (A. Schaewen et al, 1993, Plant Physiol. 102; 1109-1118).
Značajno je blokiranje povezivanja jezgre-α1,3-fukoze i oligosaharida bez interferencije u drugim koracima glikosilacije, a jedino oni enzimi mogu biti inaktivirani koji su direktno odgovorni za specifičnu glikosialciju, npr. jezgra-α1,3-fukozil transferaze. Izolirana je i okarakterizirana za prvo vrijeme iz "mung" mahunarki, i nađeno je da aktivnost tog enzima ovisi o prisustvu nereduciranih GlcNAc krajeva (Staudacher et al. , 1995, Glycoconjugate J. 12, 780-786). Ta transferaza koja se nalazi samo u biljkama i insektima, nema je u ljudi ili u drugih kral ježnj aka, a mora se u tu svrhu deaktivirati ili potisnuti, tako da humani proteini koji se proizvode u biljkama ili stanicama biljaka ili u insekata ili stanicama insekata, pojedinačno, ne obuhvaćaju dalje taj imuno-reakcija-okidač epitop, kao što je u daljnjim slučajevima.
Publikacija od John M. Burke "Clearing the way for ribozymes" (Nature Biotechnology 15: 414-415; 1997) odnosi se opće metode djelovanja ribosoma.
Publikacija Pooga et al., "Cell penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and modify pain transmission in vivo" (Nature Biotechnology 16:857-861; 1998) odnosi se na PNA molekule općenito i specifičnosti PNA molekule koje su komplementarne s humanim galanin receptorom tipa 1 mRNA.
US 5,272,066 A odnosi se na postupak mijenjanja eukariotičkih i prokariotičkih proteina u produženje njihove cirkulacije in vivo. Na tom mjestu, veza oligosaharida je promjenjena pomoću različitih enzima, između kojih je i GlcNAc-α1→3(4)-fukozil transferaza.
EP 0 643 132 A1 odnosi se na kloniranje α1,3-fukozil transferaze izolirane iz humanih stanica (THP-1). Karbohidratni lanac opisan u toj publikaciji korespondira s humanim sialil Lewis x- i sialil Lewis a-oligosaharidima. Specifičnost enzima podrijetlom od humanih stanica prilično se razlikuje od fukozil transferaze podrijetlom od biljnih stanica.
To je predmet ove inovacije, da se kloniraju i poredaju genski nizovi, koji su kodirani za biljnu fukozil transferazu, i pripremanje vektora koji obuhvaća taj gen, DNA fragmente iz tih ili izmjenjene DNA ili DNA derivirane s njom, transfekcija biljaka i insekata kao i njihovih stanica s jednim od tih vektora, za proizvodnju glikoproteina, koja ne obuhvaća normalno događanje α1,3-jezgre-fukoze, kao što se to dobije odgovarajućim metodama.
Predmet u skladu s izumom je ostvaren s molekulom DNA koja obuhvaća sekvencije u skladu s SEQ ID NO: 1 (prikazano je ovdje da se koristi IUPAC kod, a "N" znači inozin) s otvorenim oblikom od 211 pari baza do 1740 pari baza ili je najmanje 50% homologno s gornjom sekvencijom ili hibridizirano s gore indiciranom sekvencijom pod određenim uvjetima, ili obuhvaća sekvencije koje su degenerirane s gore navedenom DNA sekvencijom preko genetskog koda, sekvencije kodirane za biljni protein koji ima aktivitet fukozil transferaze ili su osim toga komplementarne.
Te sekvencije, koje nisu prije opisane, mogu se potpuno koristiti za sve pokuse, analize i metode proizvodnje itd., koji se odnose na aktivitet biljne fukozil transferaze. Ovdje je zanimljiva DNA sekvencija, kao što je protein označen s tom sekvencijom. Međutim, osobito DNA sekvencije, mogu se koristiti za inhibiciju aktivnosti fukozil transferaze.
Otvoreni oblik SEQ ID NO: 1 kodiran za protein s 510 amino kiselina i s teoretskom molekulskom masom od 56.8 kDa, može se pretpostaviti, da je prisutan dio transmembrane u dijelu između Asn36 i Gly54. Računska pI vrijednost enkodiranog proteina sekvencije u skladu sa SEQ ID NO: 1 je 7.51.
Metoda i mjerenje aktivnosti biljne fukozil transferaze određuje se tako, da se fukozil transferaza doda u uzorak koji obuhvaća označenu fukozu i akceptor (tj. glikoprotein) vezan na nosač; npr. Sefarozu. Nakon određenog vremena reakcije, uzorak se ispere, a sadržaj vezane fukoze se izmjeri. Aktivnost fukozil transferaze u ovom slučaju vidi se kao pozitivan, ako je mjerenje aktivnosti veće od najmanje 10 do 20%, osobito najmanje 30 do 50%, od izmjerene aktivnosti negativne kontrole. Struktura glikoproteina može se dodatno odrediti na HPLC-u. Kao u prethodno poznatom protokolu (Staudacher et al.1998, Anal. Biochem. 246, 96-101; Staudacher et al.1991, Eur.J. Biochem. 199, 745-751).
Na primjer, fukozil transferaza je dodana uzorku koji obuhvaća radioaktivno označenu fukozu i prihvatitelja; npr. GlcNAcβ1-2Manα1-3(GlcNAβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-GlcNAcβ1-Asn. Nakon određenog vremena reakcije, uzorak se pročišćava anion izmjeničnom kromatografijom, a sadržaj vezane fukoze se izmjeri.
Od razlike izmjerene radioaktivnosti uzorka s akceptorom i negativne kontrole bez akceptora, može se izračunati aktivitet. Aktivitet fukozil transferaze proizlazi kao pozitivan ako je izmjerena radioaktivnost najmanje 30 do 40% viša od izmjerene radioaktivnosti negativnog uzorka.
Sparivanje dvije molekule DNA može se izmjeniti odabirom temperature i ionske snage uzorka. Utvrđeni uvjeti, u skladu s izumom se podrazumijeva one koji su točno uzeti u obzir, koji se ne mogu mimoići, i koji su povezani. Na primjer, molekule DNA su hibridizirane u 7% natrijevom dodecil sulfatu (SDS), 0.5 M NaPO4, pH 7.0, ImM EDTA na 50°C, i isprani s 1% SDS na 42°C.
Može se odrediti da jedna od sekvencija ima najmanje 50% homolognost sa SEQ ID NO: 1, tj. u značenju programa FastDB od EMBL ili SWISSPORT banke podataka.
Prednost ima, sekvencija molekule DNA u smislu izuma enkodirani protein s aktivitetom GlcNac-α1,2-fukozil transferaze, osobito s jezgrom-α1,3-fukozil transferaza aktivnosti.
Kao što je gore opisano, jezgra α1,3-fukozil transferaze prisutna je u biljkama i insektima, međutim, ne u ljudskom tijelu, tako da je osobito ta DNA sekvencija upotrebljiva u analitici i pokusima kao što su postupci proizvodnje, gdje je specifična fukozil transferaza.
Pod jezgrom α1,3-fukozil transferaze podrazumijeva se, osobito GDP-L-Fuc: Asn veza GlcNac-α1, 3-fukozil transferaza. Pregledom predmetnog izuma, pojam α1,3-fukozil transferaza u pravilu osobito znači jezgra-α1,3-fukozil transferaze. Za mjerenje gore opisanog aktiviteta, osobito se koristi termin za akceptore, ne-reducirani GlcNac. Takav akceptor je, npr., GlcNAcβ1-2Manα1-3(GlcNAcβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn, GlcNAcβ1-2Manα1-3(GlcNAcβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAcβ1-Asn i GlcNAcβ1-2Manα1-3[Manα1-3 (Manα1-6) Manα1-6]Manβ1-4GlcNAcβ1-GlcNAcβ1-Asn. Nadalje fukoza je vezana ili ne može dalje biti određena mjerenjem intenziteta, koji se odnosi na N-glikozidazu F, a koju se može odrediti masenom spektrometrijom.
Prednost ima, molekula DNA koja u skladu s izumom obuhvaća najmanje 70-80%, posebnu prednost ima najmanje 95%, homologna sa sekvencijom u skladu sa SEQ ID NO: 1. Ta sekvencija kodira za posebno aktivnu GlcNAc-α1-3-fukozil transferazu.
Od DNA sekvencije može se manje ili više promijeniti u skladu sa sekvencijama biljke ili insekta koje pokazuju, na primjer, 79% homolognost sekvencija u skladu sa SEQ ID NO 1 isto ima aktivitet fukozil transferaze, koja je dovoljna za upotrebu u analitici, pokusima ili metodama produkcije kao što je gore opisano.
U skladu s daljnjim uvrštenjem, molekule DNA obuhvaćaju 2150 do 2259, osobito 2198, parova baza. Te molekule DNA obuhvaćaju 100 do 300, prednost ima 210, parova baza gore od početnog koda, kao što je 350 do 440, osobito 458, parova baza prema dolje nakon zaustavnog kodiranja otvorenog okvira, gdje je kraj DNA molekule, prednosno obuhvaća 3'-poly(A)-rep. U tu svrhu besprijekorna regulacija na razini translacije je osigurana, a DNA molekuli omogućena osobita učinkovitost i neproblematičnost za kodiranje aktivne GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze.
Ovaj izum nadalje se odnosi na molekule DNA koje obuhvaćaju sekvencije u skladu sa SEQ ID NO: 3 ili obuhvaća sekvencije koje imaju najmanje 85%, posebnu prednost imaju s najmanje 95%, a naročito one s najmanje 99%, u homolognosti s gore identificiranim sekvencijama ili koje su, pod utvrđenim uvjetima, hibridizirane s gore indiciranim sekvencijama ili koje su zbog genetskog koda degenerirane s gore indiciranim DNA sekvencijama. Homologija koja ima prednost određena je s programom koji prepoznaje umetanje i poništavanje, a koji nisu obuhvaćeni homolognom kalkulacijom. Ova sekvencija nukleotida kodira za očuvanje motiva peptida, što znači da veći broj aktivnih i funkcionalnih GlcNAc-α1,3-fukozil transefraza obuhvaća enkodirane amino kiselinske sekvencije. U tom slučaju, sekvencije mogu imati istu dužinu kao sekvencije koje su u skladu sa SEO ID NO: 3, ili, naravno mogu biti i duže. Te sekvencije imaju manje duljine od sekvencija kojim je kodiran kompletni protein i zbog toga su manje osjetljive u odnosu na rekombinaciju, poništavanje ili koju drugu mutaciju. Zbog komparativnih motiva i veće stabilnosti tih sekvencija, posebna im je prednost za test prepoznavanja sekvencija.
SEQ ID NO: 3 obuhvaća slijedeće sekvencije:
5'-GAAGCCCTGAAGCACTACAAATTTAGCTTAGCGTTTGAAAATTCGAATGAGGAAGATTATGTAACTG
AAAAATTCTTCCAATCCCTTGTTGCTGGAACTGTCCCT-3'
U slijedećem aspektu, predmetni izum se odnosi na molekulu DNA koja obuhvaća parcijalne sekvencije jedne od gore navedenih molekula DNA i ima dužinu od 20 do 200, prednost ima 30 do 50, parova baza. DNA molekula može npr., biti iskorištena za povezivanje, kao sonda, za komplementarne sekvencije GlcNAc-α1,3-fukozil transefraza i tako se može selektirati iz uzorka. U tu svrhu, dalje GlcNAc-α1,3-fukozil transefraza različitih biljaka i insekata mogu se selektirati, izolirati i karakterizirati. Prema želji jedna ili nekoliko različitih dijelova sekvencija može se koristiti, osobito dio očuvanog motiva koji je gore opisan.
Tako učinjeno, ima osobitu prednost ako jedna od gore indiciranih molekula DNA je kovalentno udružena s detektorskom supstancijom za označavanje. Kao supstancija kojom se markira, može se koristiti svaki uobičajeni marker, kao što je , npr. fluorescentno sredstvo, sredstvo koje osvjetljava, radioaktivni markeri, ne-izotopni marker, kao što je biotin itd. U tom slučaju, reagens osigurava mogućnost detekcije odgovarajuće molekule DNA, zatim selekcije i kvantifikacije u čvrstom uzorku tkiva (npr. iz biljke) ili u tekućem uzorku, što znači postupkom hidroliziranja.
Slijedeći vid izuma odnosi se na biološko funkcionalni vektor koji obuhvaća jednu od gore indiciranih molekula DNA ili njihovih dijelova različite duljine s najmanje 20 parova baza. Za premještanje zaraze u stanice domaćina, može se koristiti odgovarajući vektor, slobodni vektor sposoban za pojačavanje, ako je to potrebno, što ovisi o stanicama domaćina, mehanizmu premještanja, zahtjevu za duljinu molekule DNA. Poznat je veliki broj različitih vektora, nabrajanje je izvan granica ovog zahtjeva, osobito zato jer su vektori veoma dobro poznati stručnjacima (osvrt na vektore kao što su sve tehnike i pojmovi koji se koriste u ovim specifikacijama, koje su poznate stručnjacima, usporedi s Sambrook Maniatis). Idealno, vektori imaju male molekulske mase i trebaju obuhvatiti selektirane gene što dovodi do laganog prepoznavanja fenotipa i vektor-slobodnih stanica domaćina. Dobivanje velikog prinosa DNA i produkata odgovarajućih gena, vektori će obuhvatiti snažne promotore, kao što je uvećavač, pojačivač signala gena i regulator sekvencija. Za autonomnu replikaciju vektora, nadalje, porijeklo replikacije je značajno. Mjesto poliadenilacije je odgovorno za korektan razvoj mRNA i djeljenje signala za transkripciju RNA. Ako se kao vektori koriste fagi, virusi ili dijelovi virusa, signali opremanja će kontrolirati opremanje vektora DNA. Na primjer, za transkripciju u biljaka, ti plazmidi odgovaraju, i za transkripciju u stanicama insekata, bakulovirusa, i u insekata, uvjetovano, transposona, kao što je P element.
Ako gore opisane vektore izuma uključimo u biljke ili u biljne stanice, post-transkripcionalno zatajenje ekspresije gena endogene α1,3-fukozil transferaze gena, postignuto je transkripcijom transgenih homologa ili njihovih dijelova, u smislu orijentacije. Tehnike koje se odnose na taj smisao, nadalje, opisane su i objavljene u publikacijama Baucombe 1996, Plant. Mol. Biol., 9:373-382, i Brigneti et al.; 1998, EMBO J. 17:6739-6746. Strategija "šutnje gena" je učinkovit put zatajenja i istiskivanja α1,3-fukozil transferaza gena, zaključuju i Waterhouse et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13959-13964.
Nadalje, izum se odnosi na biološko funkcionalni vektor koji obuhvaća DNA molekulu u skladu s jednim od gore opisanih ostvarenja, ili njihovih dijelova različitih duljina u obrnutoj orijentaciji na začetnika. Ako je taj vektor prenesen u stanicu domaćina, "antisense" mRNA bit će očitana kasnije kao komplemetarna mRNA GlcNAc-α1,3-fukozil transferazom i kompleksom. Ta veza će ili zapriječiti pravilan postupak, prijenos i stabilnost ili, s prevencijom očvršćivanja ribosoma, on će zapriječiti prijenos, a time i normalno izražavanje gena GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze.
Isto tako cjele sekvencije DNA molekula mogu biti umetnute u vektor, njihove parcijalne sekvencije, jer njihove manje duljine mogu imati prednost za određene svrhe. Sa "antisense" aspekta, npr. važno je da su DNA molekule dovoljno duge u odnosu na oblik dovoljne duljine "antisense" mRNA, koja će biti veza s transferazom mRNA. Odgovarajuća "antisense" RNA molekula obuhvaća, npr., od 50 do 200 nukleotida od mnogih poznatih, "antisense" RNA molekule koje se u prirodi javljaju obuhvaćaju oko 100 nukleotida.
Za posebno učinkovitu inhibiciju ekspresije aktivnosti α1,3-fukozil transferaze, odgovara kombinacija tehnike osjeta i tehnike neosjetljivosti (Waterhouse et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95: 13959-13964).
Prednost ima, korištenje brzo hibridizirajućih RNA molekula. Učinkovitost "antisense" RNA molekula koje imaju dužinu više od 50 nulkeotida, ovisi o očvrsnutoj kinetici in vitro. Dakle, npr., brzo očvrsnute "antisense" RNA molekule izložene su snažnijoj inhibiciji ekspresije proteina, nego polaganoj hibridizaciji RNA molekula (Wagner et al., 1994, Annu. Rev. Microbiol., 48:713-742; Rittner et al., 1993, Nucl. Acids Res., 21:1381-1387). Tako brzo hibridizirane "antisense" RNA molekule osobito obuhvaćaju veliki broj vanjskih baza (slobodnih krajeva i sekvencija koje su s njima u vezi), veliki broj strukturalnih potpodručja (komponenti), kao što su petlje niskog stupnja (Patzel et al. 1998; Nature Biotechnology, 16; 64-68). Hipotetske sekundarne strukture "antisense" RNA molekule, npr., bit će određene uz pomoć računalnog programa, u skladu s kojim su odabrane odgovarajuće "antisense" RNA sekvencije DNA.
Različita područja sekvencija DNA molekule mogu biti izdvojena u vektor. Jedna mogućnost sadržaja, npr., u izdvajanje u vektor samo onog djela koji je odgovoran za očvršćivanje ribosoma. Blokiranje u tom području mRNA bit će dovoljno za zaustavljanje cijele translacije. Posebno visoku učinkovitost "antisense" molekula isto rezultira na 5'- i 3'-neprenosiva područja gena.
Prednost imaju, DNA molekule u skladu s izumom koje uključuju sekvencije koje obuhvaćaju poništavanje, umetanje i/ili zamjenu mutacije. Broj mutiranih nukleotida je promjenjiv i različit od jednostavnog jedne do brojnih poništavanja, umetanja ili zamjene nukleotida. Isto tako je moguće da se očitani umetak pomiče mutacijom. U "knock-out" genu posebno je značajno, da se distribuira ekspresija GlcNAc-α1,3-fukozil transferazom, i sprečava oblikovanje aktivnog, funkcionalnog enzima. S time je mjesto mutacije promjenjivo i spriječena je dužina ekspresije enzimatski aktivnog proteina. Prednost ima, mutacija u katalitičkom području enzima, koji je lociran u C-terminalnom području. Postupak umetanja mutacije u DNA sekvencijama dobro je poznat stručnjacima, zato nije potrebno raspraviti u detalje različite mogućnosti mutageneze. Ovdje se mogu koristiti slučajne mutageneze kao što je, osobito, direktna mutageneza, npr. "site-directed" (točno usmjerena) mutanegeza, oligonukleotidna kontrolirana mutageneza ili mutageneza uz pomoć restriktivnih enzima.
Izum dalje osigurava DNA molekule koje su kodirane za ribozim koje obuhvaćaju dvije sekvencije dijelova, a svaka ima najmanje 10 do 15 pari baza, koje su komplementarne sa dijelovima sekvencija DNA molekule, koja je predmet izuma kao što je gore opisano, a to su kompleksi ribozima i onaj koji cijepa mRNA, koja je transkribirana od prirodne GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze DNA molekule. Ribozim će prepoznati mRNA GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze s komplementarnim parom baza s mRNA. Posljedično, ribozim će cijepati i razoriti RNA na sekventno specifični način, prije nego je enzim transaltiran. Nakon disocijacije od cijepanog supstrata, ribozim će ponovljeno hibridizirati s RNA molekulama i nastat će specifična endonukleaza. Općenito, ribozimi se mogu specifično proizvesti za deaktiviranje određene mRNA, i kada nije cijela, DNA sekvencija koja kodira za protein je poznata. Ribozimi su osobito djelotvorni ako se ribosomi polako kreću duž mRNA. U tom slučaju lakše je ribozimima naći ribosom-slobodno mjesto na mRNA. Iz tog razloga, polagani mutanti ribosoma su isto odgovarajući kao sustav za ribozime (J.Burke, 1997, Nature Biotechnology; 15, 414-415). Ta molekula DNA ima osobitu prednost za podregulaciju i inhibiciju, imajući u vidu, ekspresiju biljnih GlcNAc-α1,3-fukozil transferaza.
Jedan od mogućih putova je i upotreba različitih oblika ribozima, npr. minizima. Minizimi su djelotvorni osobito za cijepanje velikih molekula mRNA. Minizim je glava čekića ribozima koja ima kratku oligonukleotidnu vezu umjesto stapka/omea II. Dimer-minizimi su posebno djelotvorni (Kuwabara et al., 1998, Nature Biotechnology, 16; 961-965). Stoga, izum se odnosi i na biološke funkcionalne vektore koji obuhvaćaju jednu od dvije zadnje navedene DNA molekule (mutirane ili ribozim-DNA molekule). Što se može reći o gore spomenutim vektorima, također je primjenjivo na, ovome mjestu. To da mogu biti, na primjer, umetnuti u mikroorganizam i da se mogu koristiti za produkciju visokih koncentracija gore opisanih DNA molekula. Nadalje, kao vektor posebno je dobro za umetanje specifičnih molekula DNA u biljke ili organizme insekata u slijedu do deregulacije ili kompletne inhibicije produkcije GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze u tim organizmima.
U skladu s izumom, ovdje je osigurana metoda pripremanja cDNA koja obuhvaća DNA molekule koje su predmet izuma, gdje je RNA izolirana iz stanica insekta ili biljke, posebno iz hipokotil-stanica, što znači da je reverzna transkripcija izvedena nakon primješavanja reverzne transkriptaze i primera. Pojedinačni korak ove metode je izveden u skladu s poznatim protokolom. Za reverznu transkripciju, u jednu ruku, moguća je procedura cDNA za cijelu mRNA uz pomoć oligo (dT) primera, i samo izvođenje PCR u značenju selekcije primera, tako da pripremanje DNA molekule obuhvaća GlcNAc-α1,3-fukozil transferaza gen. U drugu ruku, odabrani primeri mogu se direktno koristiti za reverznu transkripciju, tako da se dobije kratka, specifična cDNA. Odgovarajući primeri mogu se pripremiti tj. sintetizirati u skladu su određenim cDNA sekvencijama transferaze. Uz pomoć te metode velike količine molekula cDNA, koje su u skladu s izumom, mogu se proizvesti brzo i na jednostavan način i s malo grešaka.
Izum se nadalje odnosi na metode kloniranja GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze, koja je karakterizirana time da su DNA molekule izuma klonirane u vektor, koji se kasnije prebacuje u stanice domaćina ili u domaćina, pojedinačno, gdje se selekcijom i amplifikacijom transfektiranih stanica domaćina, staničnih linija, dobije ekspresijom aktivne GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze. DNA molekule su umetnute u vektor uz pomoć restrikcije endonukleaze, npr. za vektor, ovdje se primjenjuje ono što je gore navedeno. Ono što je značajno u ovoj metodi je to, da je odabran učinkovit domaćin-vektor sustav. Za dobivanje aktivnog enzima, posebno su pogodne eukariotičke stanice domaćina. Jedan od mogućih načina je prijenos vektora u stanice insekta. U tome, osobito virus insekta može se koristiti kao vektor, kao što je, npr., bakulovirus.
Naravno, humane stanice ili stanice kralježnjaka mogu isto biti transfektirane, u tom slučaju kasnije će se izvršiti ekspresija njemu nepoznatog enzima.
Prednost ima, metoda za pripremu rekombinantnih stanica domaćina, posebno stanica biljaka i insekata, ili biljaka i insekata, odgovarajućih, sa zapriječenom ili potpuno zaustavi j enom produkci j om GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze, koja je karakterizirana time, da je najmanje jedan vektor u suglasnosti s izumom, tj. da jedan obuhvaća DNA. molekule koje su predmet izuma, mutanta DNA molekule ili DNA molekule kodirane s ribozimom ili jedna obuhvaća DNA molekule u inverznoj orijentaciji u odnosu na promotor, a umetnuta je u stanicu domaćina ili biljke ili insekta. Ono što je bilo gore rečeno za transfekciju, primjenjivo je i u ovom slučaju.
Kao stanice domaćina, mogu se koristiti npr., biljne stanice, pri čemu je pogodan, npr., Ti-plazmid s agrobakterijskim sustavom. S agrobakterijskim sustavom moguće je transfektirati biljke direktno: agrobakterija izaziva korijenske stabljične implante plodova. Ako agrobakterijom zarazimo štetnu biljku, bakterija neće ići u biljku, ona će umetnuti dio rekombinantne DNA, takozvanu T-DNA, od prstenastog, ekstra kromosomalnog, tumor-inducirajućeg Ti-plazmida u stanice biljke. T-DNA, i te DNA molekule tamo umetnute, instaliraju se u kromosomalni DNA stanice na pouzdan način, tako da će geni T-DNA izvršiti ekspresiju u biljku.
Ovdje postoje brojna znanja, učinkoviti mehanizmi transfekcije za različite sustave domaćina. Neki primjeri su elektroparacija, metoda kalcijevog fosfata, mikroinjekcije, liposomska metoda.
Posljedično, transfektirane stanice su odabrane, tj., određene na osnovu rezistencije na antibiotike za koje vektor obuhvaća gene ili druge markere gena. Potom transfektirane linije stanica su uvećane, također u malim količinama, npr. u Petrijevim zdjelicama, ili u većim količinama u fermentorima. Nadalje, biljke imaju posebne karakteristike, tj. one su sposobne za ponovni razvoj od jedne (transferirane) stanice ili od protoplasta, pojedinačno odabrano, do kompletne biljke koja može rasti.
Ovisno o upotrebljenom vektoru, proces će se javiti u domaćinu tako da će ekspresija enzima biti potisnuta ili potpuno blokirana.
Ako vektor obuhvaća DNA molekule gdje je sa zatiranjem, umetanjem ili supstitucijom mutacija transfektirana, homologna rekombinacija će se javiti: mutant molekule DNA će prepoznati identičnu sekvenciju u genomu stanice domaćina usprkos njezinoj mutaciji i točno će umetnuti na onom mjestu i na kojem će formirati "knock-out" gene. Na taj način, mutacija je uvedena u gen za GlcNAc-α1,3-fukozil transferazu koja je sposobna inhibirati besprijekornu ekspresiju GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze. Kao što je gore objašnjeno, sa svojim tehnikama važno je da mutacije zadovoljavaju zaustavljanje ekspresije aktivnih proteina. Nakon odabira i amplifikacije, gen se može sekvencionirati kao dodatna provjera, tako da se odredi zadovoljava li odgovarajuća homologna rekombinacija ili stupanj mutacije.
Ako vektor obuhvaća DNA molekulu kodiranu za transfekciju ribozima, aktivnost ribozima bit će ekspresionirana u stanicu domaćina. Ribozim kompleksi komplementarne mRNA sekvencije GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze najmanje na određenom mjestu, cijepaju to mjesto, i na taj način će inhibirati translaciju enzima. U tim stanicama domaćina kao što su stanične linije, ili optimalno biljke, uvjetovano, a koje su derivirane iz njih, GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze neće biti ekspresionirane . U slučaju kada vektor obuhvaća DNA molekulu koja je predmet izuma u smislu promotora ili u inverznom smjeru na promotor, a smisao ili anti-smisao-mRNA bit će ekspresija u transfektirane stanice (ili biljke, pojedinačno). Anti-smisao mRNA je komplementaran s najmanje jednim dijelom mRNA sekvencije GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze i može isto tako inhibirati translaciju enzima. Kao primjer, metoda sprečavanja ekspresije gena tehnikom anti-smisao je prikazana u publikaciji Smith et al., 1990, Mol.Gen.Genet. 224:477-481, a u toj publikaciji ekspresija gena uključena je u proces inhibicije sazrijevanja raj čiče.
U svim sustavima, ekspresija GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze je barem spriječena, a preferira se čak i potpuna blokada. Stupanj ometanja ekspresije gena će ovisiti o stupnju kompleksnosti, homolognosti rekombinacije, mogućoj posljedičnoj slučajnoj mutaciji i o drugim procesima u području genoma.
Transfektirane stanice su provjerene i selektirane na aktivnost GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze.
Nadalje, ako je moguće još povećati gore opisano sprečavanje ekspresije GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze uvođenjem u domaćina vektora, koji obuhvaća gen, koji je kodiran za proteine sisavaca, npr., (β1,4-galaktosil transferazu, u dodatnom umetanju gore opisanog vektora. Fukozilacija se može smanjiti djelovanjem drugih enzima sisavaca, kombinacijom inhibicije ekspresije aktivne α1,3-fukozil transferaze u značenju vektora izuma, a u smislu enzima vektora sisavaca je posebno djelotvorna.
Svaki tip biljaka može se koristiti za transfekciju, npr. "mung" mahunarke, duhan, rajčica i/ili krumpir. Slijedeća metoda koja ima prednost za produkciju rekombiniranih stanica domaćina, posebno stanica biljaka ili insekata, biljaka ili insekata, pojedinačno, sadržanoj u toj DNA molekuli, obuhvaća mutaciju umetnutu u genom stanice domaćina, ili biljke ili insekta, pojedinačno, na mjestu ne-mutirane homologne sekvencije (Schaefer et al., 1997, Plant J.: 11(6): 1195-1206). Ta metoda neće funkcionirati s vektorom, nego s čistom DNA molekulom. Molekula DNA je umetnuta u domaćina, npr. bombardiranjem genima, mikroinjekcijom ili elektroporacijom, s upravo ta tri spomenuta primjera. Kao što je objašnjeno, molekula DNA veže se homolognim sekvencijama u genome domaćina, tako da homolognom rekombinacijom i njihovom recepcijom brisanja, umetanja ili supstitucije mutacije, pojedinačno, rezultirat će genomom: ekspresija GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze može biti spriječena ili potpuno blokirana, pojedinačno.
Daljnji aspekt izuma odnosi se na biljke ili stanice biljaka, kao i insekte ili stanice insekata, pojedinačno, njihovu GlcNAc-α1,3-fukozil transferaza aktivnost, koja će biti manje od 50%, posebno manje od 20%, a posebno ima prednost 0% aktivnosti GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze prirodnih biljka ili stanicama biljaka, pojedinačno, te insektima ili stanicama insekata, pojedinačno. Prednost tih biljaka ili stanica biljaka pojedinačno, je da glikoproteini proizvedeni putem njih ne obuhvaćaju svaku ili jedva obuhvaćaju svaku α1,3-vezu fukoze. Ako se proizvod te biljke ili insekta, pojedinačno, uzme iz tijela čovjeka ili kralježnjaka, neće biti imune reakcije na α1,3-fukoza epitope.
Prednost imaju rekombinirane biljke ili stanice biljaka, pojedinačno, koje će biti pripremljene jednom od gore opisanih metoda, njihova produkcija GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze će biti spriječena ili kompletno blokirana, pojedinačno odabrano.
Izum se također odnosi i na rekombinirane insekte ili stanice insekata, pojedinačno, koji će biti pripremljeni jednom od gore opisanih metoda i čija produkcija GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze je spriječena ili kompletno blokirana, pojedinačno odabrano. Također na ovom mjestu, glikoproteini nemaju ostatke α1,3-veze fukoze i proizvedeni su isto tako, pa nema imune reakcije na α1,3-fukoza epitop.
Izum se također odnosi na PNA molekulu koja obuhvaća baze sekvencija komplementarnih sa sekvencijama DNA molekule koja je u skladu s izumom kao i njihovim parcijalnim sekvencijama. PNA (peptidna nukleinska kiselina) je DNA-slična sekvencija, nukleobaze su vezane na glavnu os pseudo-peptida. PNA općenito se hibridizira komplementarnim DNA-, RNA- ili PNA-oligomerama s Watson-Crick parovima baza i spiralnim formacijama. Peptidna glavna os osigurava veliku rezistenciju na enzimatske razgradnje. PNA molekule su na taj način "antisens" sredstvo za poboljšavanje. Niti nukleaze niti proteaze nisu sposobne za napadanje PNA molekule. Stabilitet PNA molekule, ako se veže na komplementarnu sekvenciju, obuhvaća dovoljno čvrstu blokadu DNA i RNA polimeraza, reverzne transkriptaze, telomeraze i ribosoma. Ako PNA molekule obuhvaćaju gore navedeno značenje sekvencija, oni će se vezati na DNA ili na mjesto DNA, pojedinačno, koja kodira za GlNAc-α1,3-fukozil transferazu i na taj način je sposobna za inhibiciju transkripcije tih enzima. Ako nije transkribirana ni translatirana, molekula PNA će biti pripremljena sintetički, npr. uz pomoć t-Boc tehnike. Odgovarajuća PNA molekula osigurava obuhvaćanje sekvencije baza koje odgovaraju sekvencijama DNA molekule, a koje su predmet izuma, kao što su njihove parcijalne sekvencije,. PNA molekule će stvarati kompleks mRNA ili na mjestu mRNA GlNAc-α1,3-fukozil transferaze, tako da će translacija enzima biti inhibirana. Isti argumenti pokazani za "antisense" RNA, koja se primjenjuje u ovom slučaju. Prema tome, npr. posebno aktivno područje kompleksa je područje od kojeg počinje prijenos ili isto 5'-ne-translatirano područje mRNA.
Slijedeći vid iznesenog izuma odnosi se na postupke proizvodnje bilja i insekata, ili stanica, pojedinačno odabrano, u određenih stanica biljka ili insekata koje obuhvaćaju blokiranje ekspresije GlNAc-α1,3-fukozil transferaze na razini transkripcije ili translacije, uvjetovano, što je karakterizirano time, da PNA molekula, koja je predmet izuma, bude umetnuta u stanice. Umetanje PNA molekule ili PNA molekula, odnosno, u stanice, opet uobičajenim postupkom, kao što se npr. koriste elektroporacija ili mikroinjekcija. Posebno učinkovito je umetanje, ako su PNA oligomeri vezani na stanicu penetracijom peptida, npr. Transportan ili pAntp (Pooga et al., 1998, Nature Biotechnology, 16; 857-861).
Izum obuhvaća postupak pripremanja rekombinantnih glikoproteina koji su označeni time u izumu, rekombinirane biljke ili stanice biljaka, pojedinačno, kao i rekombiniranim insektima ili stanicama insekata, pojedinačno, čija produkcija GlNAc-α1,3-fukozil transferaze je zapriječena ili potpuno zaustavljena, odabrano, ili biljaka ili insekata, ili njihovih stanica, pojedinačno, u kojima će PNA molekule biti umetnute u skladu s postupkom izuma, a transfektirane su s genom ekspresije glikoproteina, tako da su rekombinirani glikoproteini izraženi. U tako opisanom radu kao gore, vektori obuhvaćaju gene za zahtjevane proteine koji su preneseni u domaćina ili stanice domaćina, pojedinačno, kao što je gore opisano. Transfektirana stanica biljke ili insekta će izvršiti ekspresiju zahtjevanih proteina, a oni imaju malo ili niti jednu α1,3-vezu fukoze. Na taj način, oni nisu okidač imune reakcije gore spomenute u organizmu čovjeka ili kralježnjaka. Svaki protein se može producirati na taj način.
Prednost ima postupak pripremanja rekombiniranog humanog glikopropteina, koji je opskrbljen svojstvom, da rekombinirane stanice biljaka ili stanica biljaka, pojedinačno, kao i rekombiniranim stanicama insekata i stanica insekata, pojedinačno, čija produkcija GINAc-α1,3-fukozil transferaze je zapriječena ili potpuno zaustavljena, ili biljaka ili insekata, pojedinačno, u kojima će molekule biti umetnute u skladu s postupkom izuma, su transfektirane genom te ekspresije glikoproteina, tako da je rekombinirani glikoprotein izražen. Tom metodom pojavljuje se mogućnost proizvodnje humanih proteina u biljkama (biljnim stanicama) koje, ako ih prihvati humani organizam, neće biti okidač bilo koje imune reakcije usmjerene protiv ostataka α1,3-veze fukoze. Ovdje je moguće iskoristiti biljne tipove za produkciju rekombiniranih proteina koji se koriste kao hrana, npr. banane, krumpir i/ili rajčice. Tkivo tih biljaka obuhvaća rekombinirani glikoprotein tako da, npr., ekstrakcijom rekombiniranog glikoproteina iz tkiva i nakon toga administracijom, ili direktno jedenjem tkiva biljaka, pojedinačno odabrano, rekombinirani glikoprotein unosi se u ljudsko tijelo.
Kao prednost, postupak proizvodnje rekombiniranog glikoproteina za medicinsku upotrebu je osiguran, u čemu je izum karakteriziran, da rekombinirane biljke ili biljne stanice, pojedinačno, kao i rekombinirani insekti ili stanice insekata, pojedinačno, pri čemu je produkcija GlNAc-α1,3-fukozil transferaze spriječna ili kompletno zaustavljena, uvjetovano, ili biljke ili insekti, ili stanice, pojedinačno, u kojima je PNA molekula umetnuta u skladu s postupkom izuma, i transfektirana genom, koji ekspresira glikoprotein, tako da su rekombinirani glikoproteini izraženi. U takvom postupku, svaki protein koji je medicinski zanimljiv može se koristiti.
Osim toga, predmetni izum odnosi se na rekombinirane glikoproteine u skladu s gore opisanom metodom, koji su pripremljeni u sustavima biljke ili insekta i gdje njihove peptidne sekvencije obuhvaćaju manje od 50%, posebno manje od 20%, posebno poželjno je 0%, ostataka α1,3-veza fukoze pojavljenih u proteinima proizašlim iz non-fukozil transferaze-reduciranog sustava biljke ili insekta. Prirodno, glikoproteini koji ne obuhvaćaju ostatke α1,3-veze fukoze su poželjni. Količina α13-veze fukoze ovisit će o stupnju gore opisanog sprečavanja GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze.
Preferira se, da se izum odnosi na rekombinaciju humanih glikoproteina koji će biti proizvedeni u sustavu biljke ili insekta u skladu s gore opisanom metodom i čije peptidne sekvencije obuhvaćaju manje od 50%, posebno manje od 20%, osobitu prednost ima 0%, ostataka α1,3-veze fukoze, koje se javljaju u proteinima proizašlim iz non-fukozil transferaze-reduciranog sustava biljaka ili insekata.
Posebnu prednost ima ostvarenje koje se odnosi na rekombinirani humani glikoprotein za medicinsku upotrebu, koji se proizvodi u sustavima biljaka ili insekata u skladu s metodom koja je gore opisana i čije peptidne sekvencije obuhvaćaju manje od 50%, osobito manje od 20%, a osobito prednosno 0%, ostataka α1,3-veze fukoze koja se javlja u proteinima proizašlim iz non-fukozil transferaze-reduciranog sustava biljaka ili insekata.
Glikoproteini u skladu s izumom mogu uključivati druge veze oligosaharidnih jedinica specifičnih za biljke i insekte, uvjetovano, i time - u slučaju humanih glikoproteina - oni se razlikuju od tih prirodnih glikoproteina. Usprkos tomu, s glikoproteinima u skladu s izumom, su slabije imunosne reakcije ili nikakve imunosne reakcije, uvjetovano, koje nisu pokrenute u tijelu čovjeka, jer, kao što je bilo objašnjeno u uvodnom dijelu specifikacije, ostaci α1,3-veze fukoze su glavni uzrok imunosnih reakcija ili križnih imunosnih reakcija, pojedinačno, na glikoproteine biljaka i insekata.
Daljnji vid izuma obuhvaća farmaceutske spojeve koji sadrže glikoproteine u skladu s izumom. U dodatku glikoproteinima koji su predmet izuma, farmaceutski spojevi sadrže nadalje dodatke uobičajene za takve spojeve. To su , npr., odgovarajuća sredstva za razrjeđivanje različitih pufer sadržaja (npr. Tris-HCl, acetat, fosfat, pH i ionski sadržaj, aditivi, kao što su tenzidi i solubilizatori (npr. Tween 80, Polysorbat 80), konzervansi (npr. Thimerosal, benzilni alkohol), pomoćna sredstva, antioksidansi (npr. askorbinska kiselina, natrijev metabisulfit), emulgatori, punila (npr. laktoza, saharoza), kovalentne veze polimera, kao što je polietilen glikol, na proteine, inkorporacija materijala u pojedine spojeve polimeričnih supstancija, kao što su polimliječna kiselina, poliglikolna kiselina, itd. ili liposomi, pomoćna sredstva i/ili supstancije koje služe kao nosač i koje su odgovarajuće za određenu primjenu. Takvi spojeve će imati utjecaj na fizikalne uvjete, stabilitet, put otpuštanja in vivo i put ekskrecije in vivo glikoproteina, koji su predmet izuma.
Izum također obuhvaća i postupak selekcije DNA molekula koje su kodirane za GlcNAc-α1,3-fukozil transferazu, u primjeru, gdje su označena molekula DNA koja je predmet izuma, a dodane su u uzorak, koji se veže na DNA molekule, koje su kodirane za GlcNAc-α1,3- fukozil transferazu. Hibridizirane DNA molekule mogu se detektirati, kvantificirati i selektirati. Uzorak koji sadrži jednostruki lanac DNA s označenim DNA molekulama koje se mogu hibridizirati, uzorak se denaturira, npr. zagrijavanjem. Jedan od mogućih načina je separiranje DNA testiranjem, što je moguće nakon dodavanja endonukleaza, s elektroforezom na agaroza gelu. Nakon što se prenese na membranu nitroceluloze, označene molekule DNA u skladu s izumom dodaju se tako da hibridiziraju odgovarajuću homolognu molekulu DNA ("Southern blotting").
Drugi mogući način sastoji se u pronalaženju homolognog gena druge vrste s PCR-ovisnom metodom koristeći specifične i/ili degenerirane primere, derivirane od sekvencija DNA molekula koje su u skladu s izumom.
Prednosno, uzorak gore opisane metode, koja je predmet izuma, obuhvaća genomsku DNA organizma biljke ili insekta. Tom metodom, veliki broj biljaka i insekata su testirani na vrlo brz i učinkovit način na prisutnost gena za GlcNAc-α1,3-fukozil transferazu. Na taj način, moguće je odabrati biljke i insekte koji ne sadržavaju taj gen, sprečavaju ili potpuno blokiraju, pojedinačno, ekspresiju GlcNAc-α1,3- fukozil transferaze u tih biljaka i insekata koji sadrže taj gen, s gore opisanim postupkom izuma, tako da se poslije mogu koristiti za transfekciju i produkciju (humanih) glikoproteina. Izum se također odnosi na DNA molekule koje kodiraju za GlcNAc-α1,3-fukozil transferazu, a koje će biti odabrane u skladu s dvije zadnje navedene metode i poslije će biti izolirane iz uzorka. Te molekule se mogu koristiti za daljnja ispitivanja. Mogu biti sekvencionirane i naizmjence se mogu koristiti kao DNA probe za pronalaženje GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze. Te označene-DNA molekule će djelovati na organizme, koje se odnose na organizam iz kojeg su izolirane, učinkovitije kao proba nego DNA molekule izuma.
Daljnji vid izuma odnosi se na pripremanje GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze klonirane u skladu s izumom, koji obuhvaća izoforme koje imaju pI vrijednost između 6.0 i 9.0. i osobito između 6.8 i 8.2. Ta pI vrijednost proteina je ona pH vrijednost, kod koje čisto punjenje nula i ovisi o aminokiselinskim sekvencijama, kao i o uzorku glikosilacije i o prostranosti strukture proteina. GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze sadrži najmanje 7 izoformi, koje imaju pI vrijednost u tim granicama. Razlog za različite izoforme transferaze su, npr. različite glikosilacije kao i ograničena proteoliza. Ispitivanje je pokazalo da presadnica "mung" mahunarki različitih biljaka ima različitu vezu s izozimima. pI vrijednost proteina može se odrediti s izoelektričkim fokusiranjem, koje je poznato stručnjacima. Glavna izoforma enzima ima molekulsku masu 54 kDa.
Posebno, pripravak prema izumu obuhvaća izoforme koje imaju pI vrijednosti 6.8, 7.1 i 7.6.
Izum se također odnosi i na postupak pripremanja "plantificirane" karbohidratne jedinice humanih glikoproteina kao i glikoproteina drugih kralježnjaka, gdje su jedinice fukoze kao i GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze enkodirane s gore opisanim molekulama DNA dodanim uzorku, koji obuhvaća karbohidratne jedinice ili glikoprotein, pojedinačno, tako da će fukoza u α1,3-poziciji biti povezana s GlcNAc-α1,3-fukozil transferazom na karbohidratnu jedinicu ili na glikoprotein, pojedinačno odabrano. Postupkom u skladu s izumom za kloniranje GlcNAc-al,3-fukozil transferaze, moguća je produkcija velike količine pročišćenog enzima. Za dobivanje potpuno aktivne transferaze, odgovarajući uvjeti reakcije trebaju biti osigurani. Prikazano će biti, da transferaza ima osobito visoku aktivnost uz otprilike pH 7, ako se 2-(N-morfolin)-etan sulfonska kiselina-HCl koristi kao pufer. U prisutnosti bivalentnog kationa, osobito Mn+, aktivnost rekombinirane transferaze je pojačana. Karbohidratna jedinica je dodana u uzorak proteina, jednako u nevezanom obliku ili vezanom obliku. Rekombinirana transferaza je aktivna u oba oblika. Izum će biti objašnjen detaljno u slijedećim primjerima i slikama koje, naravno, nisu ograničenje izuma.
Detaljno, na crtežima,
Slike 1a i 1b prikazuju, kao krivulje, izmjerenu količinu proteina i izmjeren aktivitet enzima u pojedinačnim frakcijama eluata;
Slika 2 prikazuje elektroforeznu gel analizu od GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze;
Slika 3 prikazuje rezultat izoelektričkog fokusiranja i mjeranja aktiviteta transferaze pojedinih izoformi;
Slika 4 prikazuje N-terminalne sekvencije 4 triptičkih peptida 1-4, kao i DNA sekvencije od tri primera, S1, A2 i A3;
Slike 5a i 5b pokazuju cDNA sekvencije od α1,3-fukozil transferaze;
Slike 6a i 6b pokazuju amino kiselinske sekvencije od α1,3-fukozil transferaze derivirane iz toga;
Slika 7 je shematski prikaz a1, 3-fukozil transferaze isto kao i tako hidrofobnost ostatka aminokiselina;
Slika 8 prikazuje usporedbu konzerviranog motiva različitih fukozil transferaza;
Slika 9 pokazuje usporedbu aktiviteta fukozil transferaze stanica insekata transfektiranih s α1,3-fukozil transferaza genom s negativnim upravljanjem;
Slike 10a i 10b pokazuju strukturu različitih prihvatitelja za α1,3-fukozil transferazu;
Slike 11 i 12 prikazuju maseni spektar; i
Slika 13 prikazuje rezultat HPLC analize.
Primjer 1:
Izolacija jezgre-α1,3-fukozil transferaze
Svi koraci izvode se na 4°C. Presadnice "mung" mahunarki homogeniziraju se u mikseru, 0.75 volumena ekstrahiranog pufera koristi se na kg zrna. Kasnije, homogenat se filtrira kroz dva sloja pamučne tkanine, a filtrat se centrifugira 40 min na 30000xg. Supernatant se odlije, a talog se ekstrahira s otopinom pufera preko noći uz stalno miješanje. Centrifugiranjem na 30000xg kroz 40 minuta dobije se triton ekstrakt.
Ekstrakt se purificira kao što slijedi:
Korak 1. Triton ekstrakt se stavi na mikrogranulirani dietil amino etil celulozni anionski izmjenjivač DE52 celulozne kolone (5x28 cm) od Whatman-na, koja je predhodno kalibrirana s puferom A. Nevezana frakcija se dalje tretira u koraku 2.
Korak 2: Uzorak se stavi u Affi-Gel Blue kolonu (2,5x32) kalibriranu s puferom A. Nakon ispiranja kolone s puferom, adsorbirani protein se ispere s puferom A koji sadržava 0.5 M NaCl.
Korak 3.: nakon dijalize eluata iz koraka 2 prije pufera B, stavi se u S-sefaroza kalibriranu kolonu istim puferom. Vezani protein se ispere s linearnim odnosima od 0 do 0.5 M NaCl u puferu B. Frakcije s GlcNAc-α1,3-fukozil transferazom se puliraju i dijaliziraju prije pufera C.
Korak 4.: dijalizirani uzorak se doda u GnGn-sefaroza kolonu koja je kalibrirana s puferom C. Vezani protein se ispere s puferom C koji sadržava IM NaCl umjesto MnCl2.
Korak 5.: Naknadno, enzim se dijalizira stavljanjem pufera D i stavljanjem u GDP-heksanolamin-sefaroza kolonu. Nakon ispiranja kolone s puferom D, transferaza se eluira supstitucijom MgCl2 i NaCL s 0.5 mM GDP. Aktivne frakcije se puliraju, dijaliziraju s 20 mM Tris-HCl puferom, pH 7.3 i liofiliziraju.
Enzimatski aktivitet GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze se određuje upotrebom GnGn peptida i GDP-L-[U-14C]-fukoza kao supstrata koncentracije od 0.5 i 0.25 svakog, u prisutnosti 2-(N-morfolino)etansulfonske kiseline-HCl pufera, Triton X-100, MnCl2, GlcNAc i AMP (u skladu sa Staudacher et al. , 1998, Glicoconjugate J. 15, 355-360; Staudacher et al., 1991, Eur.J. Biochem. 199, 745-751).
Koncentracija proteina je određena uz pomoć bicinkoninik kiselinske metode (Pierce) ili, u krajnjem koraku purifikacijom enzima, što znači amino kiselinskom analizom (Altmann 1992, Anal. Biochem. 204, 215-219).
Na Slikama 1a i 1b, izmjerena količina proteina i izmjereni aktivitet enzima u pojedinim frakcijama eluata ilustruani su krivuljama. Slika 1a prikazuje gore opisanu separaciju na S-sefaroza koloni, Slika 1b prikazuje separaciju na GnGn-sefaroza koloni, krivulja s kružićima predstavlja protein, krivulja s crnim punim kružićima predstavlja GlcNAc-α1,3-fukozil transferazu, krivulja s kvadratićima ilustrira N-acetil-(3-glukozaminidazu. Jedan U je definiran kao količina enzima koja transferira l mmol fukoze na akceptoru po minuti.
Tablica 1 prikazuje pojedine korake purifikacije transferaze.
Tablica 1
[image] 1određeno analizom aminokiselina
Pufer za ekstrakciju:
0.5 mM ditiotreitol
1 mM EDTA
0.5% polivinil polipirolidona
0.25 M sukroza
50 mM Tris-HCl pufer, pH 7.3
Otopina pufera:
0.5 mM ditiotreitol
1 mM EDTA
1.5% Triton X-100
50 mM Tris-HCl, pH 7.3
Pufer A:
50 mM Tris-HCl pufer, pH 7.3 sadržava:
1.5% Triton K-100
0.02% NaN3
Pufer B:
25 mM Na citratni pufer, pH 5.3 sadržava:
1.0% Triton K-100
0.02% NaN3
Pufer C:
50 mM Tris-HCl pufer r pH 7.3 sadržava:
5 mM MnCl2nd
0.02% NaN3
Pufer D:
25 mM Tris-HCl pufer , pH 7.3 sadržava:
10 mM MnCl2
1.1 M NaCl, i
1.2 0.02% NaN3
Primjer 2:
SDS-PAGE i izoelektrično fokusiranje
SDS-PAGE izvodi se u Biorad Mini-protean stanici na gelu s 12.5% akrilamida i 1% bisakrilamida. Gelovi se oboje s Coomassie Brilliant plavo R-250 ili srebrno. Izoelektrično fokusiranje fukozil transferaze izvodi se na prefabriciranom gelu, čija je pI vrijednost između 6-9 (Servalyt precotes 6-9, Serva). Gel se oboji sa srebrom u skladu s protokolom proizvođača. Za dvodimenzionalnu elektroforezu, linija se dobiva fokusiranjem gela, tretira se sa S-alkilirajućim reagensima i SDS i podložnim SDS-PAGE, kao što je gore opisano.
Slika 2 prikazuje gel elektrof oreze GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze, dvodimenzionalna elektroforeza prikazana je na lijevoj strani, jednodimenzionalna SDS-PAGE prikazana je na na desnoj strani. Linija označena sa A je standard, linija označena s B je GlcNAc-α1,3-fukozil transferaza dobivena iz GnGn-sefaroza kolone, a linija označena sa C je "purificirana" GlcNAc-α1,3-fukozil transferaza, npr. frakcija dobivena GDP heksanolamin sefaroza kolonom. Dvije trake na 54 i 56 kDa predstavljaju izoforme transferaze.
Slika 3 prikazuje rezultat izoelektričkog fokusiranja. Linija A obojena srebrom, na liniji B su rezultati ispitivanja aktiviteta izoformi transferaze. Aktivitet je izražen kao postotak fukoze koja je transferirana od GDP fukoze iz supstrata.
Primjer 3:
Sekvencioniranje peptida
Za sekvencioniranje peptida, lanac se izreže iz Coomassie-obojenog SDS-poliakrilamid gela, karboksiamido--metiliranog i cijepa se s tripsinom u skladu s Görg et al 1988, Electrophoresis, 9 681-692. Triptizirani peptidi se odvoje reverznom fazom HPLC-a na 1.0x250 mm Vydac C18 na 40°C uz protok 0.05 ml/min, gdje se koriste HP 1100 uređaji (Hewlett-Packard). Izolirani peptidi se separiraju sa Hewlett-Packard G1005 sustavom sekvencioniranja proteina u skladu s protokolom proizvođača. Nadalje, smjesa peptida analizira se s Ingel digestijom s MALDI-TOF MS (vidi dolje).
Slika 4 prikazuje N-terminalne sekvencije 4 triptik peptida 1-4 (SEQ ID NO: 5-8). Polazeći od prva tri peptida, pripravljeni primeri su S1, A2 i A3 (SEQ ID NO: 9-11).
Primjer 4:
RT-PCR i klonirama cDNA
Cijela RNA izolirana je iz 3-dana starih hipokotila "mung" mahunarki, a korišten je SV Total RNA Izolacijski sustavPromega. Za pripremanje prvog lanca cDNA, cijela RNA inkubira se 1 sat na 48°C s AMV reverznom transkriptazom i oligo (dT) primerima, pri čemu se koristi reverzni transkripcijski sustav Promega. Prvi lanac cDNA se podvrgne PCR-u, i koristi se kombinacija "sense" i "antisense" primera:
U 10 μl reakcijske smjese za reverznu transkripciju, doda se slijedeće:
50 μ1 sa 0.1 mmol svakog primera, 0.1 mM dNTPs, 2 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl pufera, pH 9,0, 50 mM KCl i 0.1 % Triton X-100. Nakon prvog koraka denaturacije na 95°C kroz 2 min, prolazi se 40 ciklusa po 1 min. na 95°C, 1 min na 49°C i 2 min na 72°C. Posljednji korak ekstenzije izvodi se na 72°C kroz 8 min. Produkt PCR je subkloniran u pCR2.1 vektor, koristi se TA kit za kloniranje gena in vitro, i sekvencionira. Produkt tog PCR je dva fragmenta dužine 744 bp i 780 bp, oba fragmenta imaju isti 5'-kraj (vidi također Slika 7). Polazeći od ta dva fragmenta, nedostaje 5' i 3' područje cDNA, koje je dobiveno s 5' i 3' brzom amplifikacijom cDNA krajeva (RACE); koristi se RACE kit Gibco-BRL. "Antisense" primer, univerzalni primer oprema za amplifikaciju, i kao "sense" primer, jednako tako koristi se 5'-CTGGAACTGTCCCTGTGGTT-3' (SEQ ID NO: 12) ili 5'-AGTGCACTAGAGGGCCAGAA-3' (SEC ID NO: 13). Kao "serise" primer se koristi skraćeno sidreni primer kit, kao "antisense" primer, 5'-TTCGAGCACCACAATT GGAAAT-3' (SEQ ID NO: 14) ili 5'-GAATGCAAA-GACGGCACGATGAAT-3' (SEQ ID NO: 15) PCR se izvodi uz povišenu temperaturu 55°C i pod gore opisanim uvjetima. 5' i 3' RACE produkti su subklonirani u pCR2.1 vektor i sekvencionirani. Sekvencije subkloniranih dijelova su sekvencionirane u smislu metode didesoksinukleotidne metode (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready reaction Kit i ABI PRISM 310 Genetic analyser (Perkin Elmer)). T7 i M13 naprijed spomenuti primeri koriste se za sekvencioniranje kloniranih produkata u vektor pCR2.1. Oba lanca kodiranog područja su sekvencionirana s Vienna VBC Genomics-Sequencing Service, infracrveno označeni primeri (IRD700 i IRD800) i LICOR Long Red IR 4200 Sequencer (Lincoln, NE).
Slike 5a i 5b prikazuju cijelu cDNA, čija je veličina 2198 bp i otvorenog je lanca od 1530 bp (SEQ ID NO: 1). Otvoreni lanac (polazi od kodiranog para baza 211-213, završava kodiranim parom baza 1740-1743) kodiran je za protein od 510 amino kiselina čija je molekulska masa 56.8 kDA i teoretska pI vrijednost je 7.51.
Slike 6a i 6b prikazuju amino kiselinsku sekvenciju derivirane cDNA od GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze (SEQ ID NO: 2): Mjesto za asparagin-vezu glikosilacije su na Asn346 i Asn429.
Na Slici 7, ilustrirani su shematski prikaz GlcNAc-α1,3-fukozil transferaza-cDNA (gore) i derivirani indeks hidrofobnosti enkodiranog proteina (dolje), pozitivni indeks hidrofobnosti označava povišenu hidrofobnost. Između, veličine dva gore navedena PCR produkta pokazana su u odnosu na kompletnu cDNA. Kodirano područje označeno je s razmakom, "C" je kodiran za traženo citoplazmatsko područje, T za traženo područje transmembrane, i G za traženi Golgi lumen katalitičkog područja transferaze. Analize DNA sekvencija s " TMpred" (od EMBnet, Švicarska) daju pogrešku u području transmembrane između Asn36 i Gly54. C-terminalno područje enzima vjerojatno obuhvaća katalitičko područje i posljedično je dio lumena Golgi aparata. U skladu s time, ta transferaza čini tip II proteina transmembrane kao i sve do sada analizirane transferaze koje su uključene u biosintezu glikoproteina (Joziasse, 1992, Glycobiology 2, 271-277). Sivo područje predstavlja četiri peptida, heksagon predstavlja potencijalno mjesto N-glikosilacije. BLASTP traženje u svim dostupnim bankama preko NCBI pokazuje jednakost između GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze i istalih α1,3/4-fukozil transferaza, npr. humane fukozil transferaze IV. U 18-21% (ispitanih sa SIM-LALN-VIEW; Exprese, Švicarska), ukupna sličnost je iznad svake značajnosti. Unatoč tomu, sekvencije od 35 aminokiselina (SEQ ID NO: 4) pokazuju izrazito visoku homolognost s ostalim α1,3/4-fukozil transferazama (Slika 8). To područje sekvencija je smješteno između Glu267 i Pro301 SEQ ID NO:2.
Primjer 5:
Ekspresija rekombinirane GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze u stanice insekta
Enkodirano područje pretpostavljene GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze uključene u citoplazmatsko i područje transmembrane proširi se sa slijedećim primerom 5'-CGGCGGATCCGCAATTGAATGATG-3' (SEQ ID NO: 16) i reverzni primer 5'-CCGGCTGCAGTACCATTTAGCGCAT-3' (SEQ ID NO: 17) opširnije opisan u "Expand High Fidelity PCR System of Boehringer Mannheim". PCR produkt se dvostruko digestira s PstI i BamHI i subklonira u alkalnom fosfatazom-tretiranim bakulovirusom transfer vektorom pVL1393, koji je prije digestiran s PstI i BamHI. Za osiguranje homologne rekombinacije, transfer vektor je kotransfektiran s bakulovirusom zlatnim virusom DNA (PharMingen, Sand Diego, CA) u Sf9 stanicama insekta i IPL-41 mediju s lipofektinom. Nakon inkubacije od 5 dana na 27°C, različiti volumeni supernatanta s rekombiniranim virusom koriste se za infekciju Sf21 stanica insekta. Nakon inkubacije od 4 dana na 27°C u IPL-41 mediju s 5%FCS, Sf21 stanice se sakupe u isperu 2x sa fosfat-puferiranom fiziološkom otopinom. Stanice se resuspendiraju u 25mM Tris HCl puferu, ph 7.4, s 2% Triton X-100 i razbiju ultrazvukom na ledu.
Primjer 6:
Određivanje aktiviteta GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze
Homogenat i supernatant stanica se ispituje na GlcNAc-α1,3-fukozil transferazu. Slijepu probu pripremi se s rekombiniranim bakulovirusom koji je kodiran za duhan-GlcNAc-α1,3-fukozil transferazu I (Strasser et al., 1999, Glycobiology, u tisku).
Slika 9 prikazuje mjerenje enzimskog aktiviteta rekombinirane GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze uz negativnu kontrolu. Bolji, enzimski aktivitet kotransfektiranih stanica i njihovog supernatanta je 30x viši od negativne kontrole. Endogena aktivnost, koja je mjerljiva u odsutnosti rekombinirane transferaze, u biti dolazi od insekt-α1,3-fukozil transferaze i samo u malom postotku od GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze.
Posljedično, porast GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze dolazi od rekombiniranih bakulovirusa i viši je od 100-folda. Enzim pokazuje maksimalnu aktivnost oko pH 7.0 ako se aktivitet mjeri u 2-(N-morfolino)-etansulfonske kiseline-HCl puferu. To je vidljivo u Tablici 2, dodavanjem bivalentnih kationa, osobito MN, povisuje se aktivitet rekombinirane transferaze.
Tablica 2.
[image]
Tablica 3. prikazuje akceptore koji se upotrebljavaju, GnGn-peptid pokazuje visoku inkorporaciju u standardnim uvjetima ispitivanja, slijedi GnGnF6peptid i M5Gn-Asn. Transfer na MM peptid možda neće biti moguć, jer MM peptid ne obuhvaća reducirani GlcNAc-kraj na 3-vezi manoze. To značenje strukture bit će neophodno za jezgru fukozil transferaze. Rekombinirana transferaza, nadalje, je inaktivna u odnosu na akceptore koji se obično upotrebljavaju, α,3/4-fukozil transferaze se upotrebljavaju za determinaciju krvnih grupa, koje transferiraju fukozu na GlcNAc s ne-reduciranim krajevima oligosaharida. Očekivane Km-vrijednosti za supstrat akceptora GnGn peptida, GnGnF peptida, M5Gn-Asn i za supstrat davatelja GDP-fukoze, je utvrđena 0.19, 0.13, 0.23 i 0.11, pojedinačno. Strukture molekule su ilustrirane na Slikama 10a i 10b.
Tablica 3
[image]
Primjer 7:
Masena spektrometrija za fukozil transferaza produkte
Dabsilirani GnGn heksapeptidi (2 nmol) inkubiraju se s homogenatom stanica insekta, koji obuhvaća rekombiniranu GlcNAc-α,3-fukozil transferazu (0.08 mU) u prisutnosti ne-radioaktivne GDP-L-fukoze (10 nmol), 2 (N-morfolino)-etansulfonske kiseline-HCl pufera, Triton X-100, MnCl2, GlcNAc i AMP. Negativna kontrola izvodi se s homogenatom inficiranih stanica insekta za slijepi uzorak. Uzorak se inkubira 16 sati na 37°C i analizira na MALDI TOF masenom spektrometru. Masena spektrometrija izvodi se na DYNAMO (Therrmo BioAnalysis, Santa Fe, NM); na MALDI-TOF MS moguće je izvesti dinamičku ekstrakciju (sinonim za kasnu ekstrakciju) . Dva tipa za preparaciju matriksa se koriste: peptidi i dabsilirani glikoproteini se otope u 5% mravljoj kiselini, i nekoliko puta se apliciraju na nosač, zračno suše, i prekriju s 1% α-cijano-4-hidroksi cinamične kiseline. Piridil-aminirani glikani, reducirani oligosaharidi i ne-derivirani glikopeptidi otope se s vodom, apliciraju na nosač i osuše u struji zraka. Nakon dodavanja 2% 2.5-dihidroksi-benzojeve kiseline, uzorci se odmah osuše u vakuumu.
Slika 11 prikazuje maseni spektar uzoraka, A je negativna kontrola: glavni pik (S) prikazuje Dabsyl-Val-Gly-Glu-(GlcNAc4Man3) Asn-Arg-Thr substrat, izračunata [M4-H]+ vrijednost je 2262.3. Taj supstrat se također pojavljuje kao natrijev dodatni produkt i kao manji ion koji je formiran fragmentacijom Azo funkcije Dabsyl grupe, na (S*). Mala količina produkta (P, [M+H]+= 2408.4) je posljedica endogene al,6-fukozil transferaze. Pik na m/z= 2424.0 pokazuje nepotpunu de-galaktosilaciju supstrata. B prikazuje maseni spektar uzorka s rekombiniranom α1,3-fukozil transferazom. Glavni pik (P) predstavlja fukusilirani produkt, a (P*) je fragmentirani ion.
Nadalje, alikvoti oba uzorka pomiješani su sa svakim pojedino dobivenim supstratom jednakih koncentracija i produkta (uzorak A). Ta smjesa se razrijedi s 0.1 M amonijevim acetatom, pH 4.0 obuhvaća 10 mU N-glikosidaze A (uzorak B), ili s 50 mM Tris/HCl, pH 8.5, obuhvaća 100 mU (1U hidroliziranog 1 mmol supstrata na min) N-glikosidaze F (uzorak C). Nakon 2120 sati, uzme se mali alikvot smjese i analizira na MALDI-TOF MS.
Slika 12, ilustrira tri masena spektra uzorka A, B i C. Nedigestirani uzorak A pokazuje glavne pikove: supstrata na 2261.4 m/z, a fukusilirani produkt na 2407.7 m/z. Srednja krivulja pokazuje maseni spektar uzorka B, tretiranog s N-glikozidazom A, koja je hidrolizirala oba glikopeptida. Pik na 936.32 tvori deglikosilatirani produkt. Niža krivulja predstavlja maseni spektar uzorka C. N-glikozidaza F nije dostupna hidrolizi α1,3-fukoziliranog supstrata, tako da spektar ima pik na 2406.7 m/z fukoziliranog produkta, budući da se pik hidroliziranog supstrata pojavljuje na 963.08 m/z.
Primjer 8:
HPLC analiza piridil-aminiranog fukozil transferaza produkta
Dva gore opisana uzorka (fukoziliranog produkta i negativne kontrole) se digestiraju s N-glikozidazom A. Dobiveni oligosaharidi se piridil-aminiraju i analiziraju s reverznom fazom HPLC (Wilson et al. , 1998, glycobiology 8, 651-661; Kubelka et al., 1994, Arch. Biochem. Giophys. 308, 148-157; Hase et al., 1984, J. Biochem. 95, 197-203).
Na Slici 13, dijagram na vrhu predstavlja negativnu kontrolu, gdje je očekivana suma s ostatkom supstrata (GnGn-peptid) α1,6-fukoziliranog produkta. A ima pik na bitno skraćeno vrijeme retencije, koje je specifično za reducirane fukoza veze s GlcNAc-α1,3.
Dijagram na dnu, prije izolirani transferaza produkt (krivulja A) i kojeg slijedi (krivulja B) digestija s N-acetil-pglukozamidaza je uspoređena s MMF3 pčelinjom fosfolipazom A2 (krivulja C).
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]

Claims (26)

1. DNA molekula, naznačena time, da obuhvaća sekvencije u skladu s SEQ ID NO 1 s otvorenim lancem od parova baza 211 do parova baza 1740, ili je najmanje 50% homolognih s gore navedenim sekvencijama, ili hibridiziranu s gore navedenim sekvencijama pod određenim uvjetima, ili obuhvaćaju sekvencije koje su degenerirane s gore navedenim sekvencijama točnog genetskog koda, sa sekvencijama kodiranim za biljni protein koji ima aktivnost fukozil transferaze ili im je komplementaran.
2. DNA molekula u skladu sa zahtjevom 1, naznačena time, da je kodirana za protein koji ima GlcNAc-α1,3-fukozil transferaza aktivitet, posebno jezgra-α1,3-fukozil transferaza aktivitet.
3. DNA molekula u skladu sa zahtjevom 1 i 2, naznačena time, da je najmanje 70-80%, osobitu prednost ima najmanje 95% homologna s sekvencijama u skladu s SEQ ID NO 1.
4. DNA molekula u skladu sa bilo kojim od zahtjeva 1 do 3, naznačena time, da obuhvaća 2150 do 2250, osobito 2198 pari baza.
5. DNA molekula, naznačena time, da obuhvaća sekvenciju u skladu sa SEQ ID NO 3, ili obuhvaća sekvenciju koja je najmanje 85%, osobito najmanje 95% homologne s gore navedenom sekvencijom ili hibridizirana gore navedenom sekvencijom pod određenim uvjetima ili degenerirane s gore navedenim DNA sekvencijama s određenim genetskim kodom.
6. DNA molekula, naznačena time, da obuhvaća parcijalne sekvencije DNA molekule u skladu sa bilo kojim zahtjevom 1 do 4 i najmanje je 80% homologna s SEQ ID NO: 1 ima dužinu 20 do 200, prednost ima 30 do 50 pari baza.
7. DNA molekula u skladu s bilo kojim zahtjevom 1 do 6, naznačena time, da je kovalentno povezana s detektabilnim markerom.
8. Biološko funkcionalni vektor, naznačen time, da obuhvaća DNA molekulu u skladu s bilo kojim zahtjevom 1 do 7 ili njezinim djelom različite dužine s najmanje 20 pari baza.
9. Biološko funkcionalni vektor, naznačen time, da obuhvaća DNA molekulu u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 7 ili njezinim djelom različite dužine koji je obrnuto orijentiran u odnosu na promotor.
10. DNA molekula kodirana za ribozim, naznačena time, da ima dvije sekvencije, svaka od njih je dužine najmanje 10 do 15 pari baza i komplementarna je sa sekcijama sekvencija DNA molekule koja je u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 7 s navedenim ribozim kompleksima i reže mRNA transkribiranu s prirodnom GlcNAc-α1,3-fukozil transferaza DNA molekula.
11. Biološko funkcionalni vektor, naznačen time, da obuhvaća molekule u skladu sa zahtjevima 10.
12. Postupak pripremanja cDNA obuhvaća DNA molekulu u skladu s bilo kojim zahtjevom 1 do 5, naznačen time, da je RNA izolirana iz stanica insekta ili biljke, osobito iz hipokotilusa stanica, i s navedenom RNA reverzne transkripcije je učinkovita nakon dodavanja reverzne transkriptaze i primera.
13. Postupak kloniranja GlcNAc-α1,3-fokusil transferaze, naznačen t ime, da molekula DNA u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 5 je klonirana u vektor kasnije transfektiran u stanicu domaćina ili domaćina, linijskom stanicom je prinos u značenju selekcije i amplifikacije transfektiranih stanica domaćina, gdje linijske stanice istiskuju aktivnu GlcNAc-α1,3-fukozil transferazu.
14. Postupak pripremanja rekombiniranih stanica domaćina, osobito stanica biljaka i insekata, ili biljaka i insekata, odnosno, tako da je produkcija GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze suprimirana ili potpuno stopirana, naznačen time, da je najmanje jedan vektor u skladu sa zahtjevom 8, 9 ili 11 i da vektor obuhvaća DNA molekulu u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 7, odnosno, čime navedena sekvencija DNA obuhvaća deleciju, inseratciju i/ili supstituciju mutaciju, odnosno, insertirana je u navedenu stanicu domaćina, ili biljke ili insekta, pojedinačno.
15. Postupak pripremanja rekombiniranih stanica domaćina, osobito stanica biljaka ili insekata, ili biljaka ili insekata, odnosno, naznačen time, da DNA sekvencija je u skladu sa bilo kojim od zahtjeva 1 do 7, čime navedena DNA sekvencija obuhvaća deleciju, insertaciju i/ilisubstitucju mutacije, je insertirana u genom navedene stanice domaćina, ili biljke ili insekta, odnosno, na poziciju ne-mutirane, homologne sekvencije.
16. Rekombinirane biljke ili stanice biljaka, naznačene time, da su pripremljene u skladu s postupkom iz zahtjeva 14 ili 15 i da je njihova proizvodnja GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze suprimirana ili potpuno stopirana.
17. Rekombinirani insekti ili stanice insekata, naznačeni time, da su pripremljeni u skladu s postupkom iz zahtjeva 14 ili 15 i da njihova proizvodnja GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze je suprimirana ili potpuno stopirana.
18. PNA (peptide nucleic acid) molekula, naznačena time, da obuhvaća baze sekvencija koje su komplementarne sekvencijama DNA molekule u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 6 i njihovim parcijalnim sekvencijama.
19. PNA molekula, naznačena time, da obuhvaća baze sekvencija koje korespondiraju sa sekvencijama DNA molekule u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 6 i njihovim parcijalnim sekvencijama.
20. Postupak produkcije biljaka ili insekata, ili njihovih stanica, odnosno, osobito stanica biljaka i insekata koje imaju blokiranu ekspresiju GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze na razini transkripcije i translacije, naznačen time, da su te molekule PNA u skladu sa zahtjevom 18 ili 19 insertirane u stanice.
21. Postupak produkcije rekombiniranog glikoproteina, naznačen time, da je taj sistem u skladu sa zahtjevima 16 ili 17 ili biljkama ili insektima, ili stanicama, odnosno, koje su pripremljene u skladu s postupkom iz zahtjeva 20, je (su) transfektirane s genom za ekspresiju glikoproteina tako da je rekombinirani glikoprotein istisnut.
22. Postupak produkcije rekombininiranih humanih glikoproteina, naznačen time, da je sistem u skladu sa zahtjevima 16 ili 17 ili biljkama i insektima, ili stanicama, odnosno, koje su pripremljene u skladu sa zahtjevom 20, je (su) transfektirane s genom za ekspresiju glikoproteina tako da su rekombinirani glikoproteini istisnuti.
23. Postupak produkcije rekombiniranih humanih glikoproteina za medicinsku upotrebu, naznačen time, da u tom sistemu u skladu s zahtjevima 16 ili 17 ili biljkama ili insektima, ili stanicama, odnosno, koji su pripremljeni u skladu s postupkom koji je u skladu sa zahtjevom 20, je (su) transfektirane s genom za ekspresiju glikoproteina tako da su rekombinirani glikoproteini istisnuti.
24. Postupak selekcije DNA molekula kodiranih za GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze, u uzorku, naznačen time, da su molekule u skladu sa zahtjevom 7 dodane u navedeni uzorak kodirane za GlcNAc-α1,3-fukozil transferaze.
25. Postupak u skladu sa zahtjevom 24, naznačen time, da navedeni uzorak obuhvaća genomsku DNA biljnog ili organizma insekta.
26. DNA molekule kodirane za GlcNAc-α1,3-fukozil transferazu, u uzorku, naznačen time, da su selektirane u skladu s postupkom koji je u skladu sa zahtjevima 24 ili 25 i posljedično su izolirane iz uzorka.
HR20010681A 1999-02-18 2001-09-17 Fucosyl transferase gene HRP20010681A2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0027099A AT408446B (de) 1999-02-18 1999-02-18 Fucosyltransferase-gen
PCT/AT2000/000040 WO2000049153A1 (de) 1999-02-18 2000-02-17 Fucosyltransferase-gen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HRP20010681A2 true HRP20010681A2 (en) 2003-08-31

Family

ID=3486087

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HR20010681A HRP20010681A2 (en) 1999-02-18 2001-09-17 Fucosyl transferase gene

Country Status (29)

Country Link
US (3) US20080234471A1 (hr)
EP (3) EP1642979A1 (hr)
JP (2) JP5514386B2 (hr)
KR (1) KR20010108234A (hr)
CN (1) CN1360633A (hr)
AT (2) AT408446B (hr)
AU (1) AU771995B2 (hr)
BG (1) BG65140B1 (hr)
BR (1) BR0010114A (hr)
CA (1) CA2362964C (hr)
CZ (2) CZ308081B6 (hr)
DE (1) DE50011116D1 (hr)
DK (2) DK2062977T3 (hr)
EE (1) EE200100432A (hr)
ES (2) ES2246222T3 (hr)
HR (1) HRP20010681A2 (hr)
HU (1) HU230075B1 (hr)
IL (2) IL144777A0 (hr)
IS (1) IS6041A (hr)
MX (1) MXPA01008372A (hr)
NO (1) NO20013993L (hr)
NZ (1) NZ513685A (hr)
PL (2) PL205785B1 (hr)
PT (1) PT2062977E (hr)
SK (1) SK286416B6 (hr)
TR (1) TR200102393T2 (hr)
WO (1) WO2000049153A1 (hr)
YU (1) YU58901A (hr)
ZA (1) ZA200106735B (hr)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU771908C (en) 1998-12-09 2005-03-10 Phyton Holdings, Llc A method for manufacturing glycoproteins having human-type glycosylation
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
IL149271A0 (en) 1999-10-26 2002-11-10 Plant Res Int Bv Mammalian-type glycosylation in plants
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
ZA200306406B (en) 2001-01-19 2004-09-06 Dow Chemical Co Method for secretory production of glycoprotein having human-type sugar chain using plant cell.
NZ534881A (en) 2002-03-19 2006-09-29 Plant Res Internat B Mammalian GnTIII expression in plants
KR101196023B1 (ko) 2002-03-19 2012-10-30 스티칭 디엔스트 랜드보위쿤디그 온데조에크 식물에서 글리칸 프로세싱의 최적화
AU2003236020B2 (en) * 2002-04-09 2009-03-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
CL2003002461A1 (es) 2002-11-27 2005-01-07 Dow Chemical Company Agroscien Inmunoglobulina que comprende al menos un glicano afucosilado, composicion que la contiene, secuencia nucleotidica y vector que la comprende, procedimiento para producir dicha inmunoglobulina en plantas.
EP1510584B1 (en) 2003-08-11 2009-03-18 Greenovation Biotech GmbH Expression promoting sequences from mosses and their uses
FI20055398A0 (fi) 2005-07-08 2005-07-08 Suomen Punainen Risti Veripalv Menetelmä solupopulaatioiden evaluoimiseksi
AU2007205935B2 (en) 2006-01-17 2013-07-11 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and methods for humanization and optimization of N-glycans in plants
US20090060921A1 (en) * 2006-01-17 2009-03-05 Biolex Therapeutics, Inc. Glycan-optimized anti-cd20 antibodies
CN102094020B (zh) * 2007-01-15 2012-11-28 燕秋 用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶I的RNA干涉序列及重组干涉质粒
CN102094019B (zh) * 2007-01-15 2012-11-28 燕秋 用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶Ⅳ的RNA干涉序列及重组干涉质粒
AU2008237632B2 (en) 2007-04-17 2014-01-16 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Mammalian-type glycosylation in plants by expression of non-mammalian glycosyltransferases
JP5766947B2 (ja) * 2007-09-07 2015-08-19 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 臨床サンプルにおける分泌性のルイス抗原およびシアル化抗原のレベルの疾患リスクの予測指標としての使用
US20100242128A1 (en) * 2007-10-31 2010-09-23 Bayer BioSceince NV Method to produce modified plants with altered n-glycosylation pattern
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
ES2663627T3 (es) 2010-10-11 2018-04-16 Jennewein Biotechnologie Gmbh Fucosiltransferasas novedosas y sus aplicaciones
KR101293658B1 (ko) * 2010-12-30 2013-08-07 대한민국 알파-1,3-푸코실트랜스퍼라아제 및/또는 베타-1,2-자일로실트렌스퍼라아제 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 벡터 및 형질전환된 벼
ES2439507T3 (es) * 2011-01-20 2014-01-23 Jennewein Biotechnologie Gmbh Fucosiltransferasas novedosas y sus aplicaciones
EP2789686A1 (en) 2013-04-11 2014-10-15 Greenovation Biotech GmbH Expression of phosphorylated glycoproteins in plants
EP3050973A1 (en) * 2015-01-30 2016-08-03 Jennewein Biotechnologie GmbH Fermentation process for producing monosaccharides in free form from nucleotide-activated sugars
CN110317799A (zh) * 2019-07-18 2019-10-11 江南大学 一种人源岩藻糖转移酶8的原核表达方法及其产品
EP3871687A1 (en) 2020-02-27 2021-09-01 eleva GmbH Enzyme replacement therapy for treating pompe disease

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5272066A (en) 1986-03-07 1993-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Synthetic method for enhancing glycoprotein stability
JP3756946B2 (ja) 1993-03-29 2006-03-22 協和醗酵工業株式会社 α１，３−フコシルトランスフェラーゼ
US6509149B2 (en) * 1995-06-06 2003-01-21 Hybridon, Inc. HPV-specific oligonucleotides
US5770420A (en) * 1995-09-08 1998-06-23 The Regents Of The University Of Michigan Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen

Also Published As

Publication number Publication date
US8895806B2 (en) 2014-11-25
EP2062977A1 (de) 2009-05-27
EP1642979A1 (de) 2006-04-05
DK2062977T3 (da) 2014-04-07
CZ299622B6 (cs) 2008-09-24
IL144777A (en) 2007-12-03
NO20013993D0 (no) 2001-08-16
EP2062977B1 (de) 2014-01-08
PL363438A1 (en) 2004-11-15
WO2000049153A1 (de) 2000-08-24
AU2646000A (en) 2000-09-04
NO20013993L (no) 2001-10-17
AU771995B2 (en) 2004-04-08
JP2002536978A (ja) 2002-11-05
US20130212740A1 (en) 2013-08-15
CA2362964C (en) 2012-03-27
JP5514386B2 (ja) 2014-06-04
BG65140B1 (bg) 2007-03-30
IS6041A (is) 2001-08-08
EE200100432A (et) 2002-12-16
PL205785B1 (pl) 2010-05-31
BR0010114A (pt) 2002-06-04
KR20010108234A (ko) 2001-12-07
HUP0200394A3 (en) 2006-06-28
IL144777A0 (en) 2002-06-30
SK286416B6 (sk) 2008-09-05
AT408446B (de) 2001-11-26
JP2011120592A (ja) 2011-06-23
US8198078B2 (en) 2012-06-12
BG105899A (en) 2002-12-29
EP1151109B1 (de) 2005-09-07
ES2444126T3 (es) 2014-02-24
DK1151109T3 (da) 2006-01-16
ATE304053T1 (de) 2005-09-15
CZ308081B6 (cs) 2019-12-27
US20080234471A1 (en) 2008-09-25
PT2062977E (pt) 2014-04-07
CA2362964A1 (en) 2000-08-24
DE50011116D1 (en) 2005-10-13
EP1151109A1 (de) 2001-11-07
ES2246222T3 (es) 2006-02-16
HU230075B1 (hu) 2015-06-29
YU58901A (sh) 2004-03-12
HUP0200394A2 (hu) 2002-05-29
CZ20012943A3 (cs) 2002-04-17
NZ513685A (en) 2001-09-28
US20090199306A1 (en) 2009-08-06
MXPA01008372A (es) 2003-06-06
CN1360633A (zh) 2002-07-24
SK11182001A3 (sk) 2002-01-07
ZA200106735B (en) 2002-08-15
ATA27099A (de) 2001-04-15
PL205710B1 (pl) 2010-05-31
TR200102393T2 (tr) 2002-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8895806B2 (en) Fucosyl transferase gene
US20070186311A1 (en) BETA 1,2-xylosyltransferase-gene from arabidopsis
WO2008037492A1 (en) Galactosyltransferase

Legal Events

Date Code Title Description
A1OB Publication of a patent application
OBST Application withdrawn