JP2002536978A - フコシルトランスフェラーゼ遺伝子 - Google Patents

フコシルトランスフェラーゼ遺伝子

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Abstract

(57)【要約】 塩基対２１１から塩基対１７４０までのオープンリーディングフレームを有する配列番号１に記載の配列または上記配列と少なくとも５０％の相同性を有する配列、または厳格な条件下で上記配列とハイブリダイズする配列を含むか、あるいは遺伝コードのせいで上記ＤＮＡ配列と縮重した配列を含むＤＮＡ分子であって、該配列がフコシルトランスフェラーゼ活性を有する植物タンパク質をコードするか、あるいはそれと相補的であるＤＮＡ分子を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明はフコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドに関する
。さらに、本発明はこのポリヌクレオチドの部分配列、ならびにこのポリヌクレ
オチドを含むベクター、そのポリヌクレオチドまたはそれから派生するＤＮＡの
それぞれでトランスフェクトされた組換え宿主細胞、植物および昆虫ならびにこ
れらの系で産生される糖タンパク質に関する。
【０００２】 糖クンパク質は多様かつ複雑な炭水化物単位を有し、その組成および配列は種
々の生物で特徴的である。糖タンパク質のオリゴ糖単位は多くの役割を担ってお
り、例えば物質代謝を調節するのに重要であり、細胞同士の相互作用の伝達に関
与し、循環中のタンパク質の循環期間を決定し、および抗原抗体反応において認
識エピトープを決定する。
【０００３】 糖タンパク質のグリコシル化は小胞体（ＥＲ）中で開始され、そこでオリゴ糖
がＮ−グリコシド結合によってアスパラギン側鎖に結合するか、Ｏ−グリコシド
結合によってセリンまたはスレオニン側鎖に結合する。Ｎ−結合オリゴ糖は、マ
ンノース３つおよびＮ−アセチルグルコースアミン残基２つから成る５糖単位由
来の共通コアを含む。さらに、その炭水化物単位の修飾のため、そのタンパク質
はＥＲからゴルジ複合体へ輸送される。糖タンパク質のＮ−結合オリゴ糖単位の
構造は、それらが処理されるゴルジ区画のグリコシルトランスフェラーゼのコン
フォメーションおよびその組成によって決まる。
【０００４】 幾つかの植物細胞および昆虫細胞のゴルジ複合体におけるコア５糖単位は、キ
シロースおよびα１,３−結合フコースに置換されていることが示された(P. Ler
ouge et al., 1998, Plant Mol. Biol. 38, 31-48; Rayon et a1., 1998, L Exp
. Bot. 49, 1463-1472)。7糖「ＭＭＸＦ３」形成は、植物の主なオリゴ糖型である
(Kurosaka et a1., 1991, J. Bio1. Chem., 266, 4168-4172)。従って、例えば
ホースラディシュペルオキシダーゼ、ニンジンβ−フルクトシダーゼおよびアメ
リカデイコ(Erythrina cristagalli)は、レクチンおよびミツバチ毒ホスホリパ
ーゼＡ２またはグリカンコアに結合する昆虫胚α１,３−フコース残基由来の神
経細胞膜糖タンパク質を含有する。これらの構造はそれぞれ、複合Ｎ−グリカン
またはマンノース欠乏若しくは断頭Ｎ−グリカンと称される。さらに、α−マン
ノシル残基はＧｌｃＮＡｃで置換し、ガラクトースおよびフコースが結合して、
ヒトルイス(Lewis)ａ−エピトープに相当する構造体を調製することができる(Me
lo et al., 1997, FEBS Lett 415, 186-191; Fitchette-Laine et al., 1997, P
lant J. 12, 1411-1417)。
【０００５】 キシロースおよびα1,3−結合フコースはいずれも、哺乳類の糖タンパク質に
は存在しない。コア−α１,３−フコースは、植物および昆虫のＮ−結合オリゴ
糖に対する抗体のエピトープ認識に重要な役割があり(I. B. H. Wilson et al.,
Glycobiology Vol. 8, No, 7, pp. 651-661, 1998)、その結果これらのオリゴ
糖に対するヒト人体または動物体中の免疫反応を引き起こすことが知られている
。さらに、α１,３−フコース残基は種々の植物および昆虫アレルゲン間での広
範囲におよぶアレルギー交差反応を引き起こす主要な原因の1つのようであり(Tr
etter et al., Int. Arch. A11ergy lmmunol. 1993; 102: 259-266)、「交差反応
炭性水化物決定因子」(ＣＣＤ)と称される。トマトおよび花粉のエピトープの研
究においても、α１,３−結合フコース残基が共通する決定因子として見出され
、それが、トマトおよび花粉アレルギーがいっしょに患者において頻繁に生じる
理由であると考えられる(Petersen et al., 1996, J. A11ergy Clin. Immunol.,
Vol. 98, 4; 805-814)。免疫交差反応が頻繁に発生することから、ＣＣＤはさ
らにアレルギー診断を妨害する。
【０００６】 ヒト人体において植物タンパク質が引き金となる免疫反応は、植物中で産生さ
れる組換えヒトタンパク質の医療上の使用において主要な問題である。この問題
を回避するためには、α１,３−コア−フコシル化を阻止しなければならないで
あろう。ある研究では、Ｌ−フコース(６−デオキシ−Ｌ−ガラクトース)の代わ
りにＬ−ガラクトースを含むオリゴ糖であったにも関わらず、十分に生物学的活
性があることが実証された(E. Zablackis et al., 1996, Science, Vol. 272)。
別の研究では、Ｎ−アセチルーグルコサミニルトランスフェラーゼＩ(複合グリ
カンの生合成中の第一酵素)を喪失している植物シロイヌナズナ(Arabiodopsis t
haliana)の変異体が単離された。この変異体中の複合糖タンパク質の生合成は阻
害される。それにも関わらず、これらの変異体植物は特定の条件下で正常に発育
することができる(A. Schaewen et a1, 1993, Plant Physiol. 102; 1109-1118)
。
【０００７】 他のグリコシル化過程を妨害することなくオリゴ糖中のコア−α１,３−フコ
ースの結合を意図的に遮断するには、単にこの特有なグリコシル化を直接担う酵
素、即ちコア−１,３−フコシルトランスフェラーゼを不活性化しなければなら
ないだろう。この酵素はマングビーンから初めて単離、特徴づけされ、そしてこ
の酵素活性が、非還元ＧｌｃＮＡｃ末端の存在に依存することが見出された(Sta
udacher et a1., 1995, Glycoconjugate J. 12, 780-786)。人間および他の脊椎
動物にはなく、植物および昆虫にのみ生じるこのトランスフェラーゼを意図的に
不活性化、または抑圧しなければならないであろう、そうすることで植物若しく
は植物細胞、または昆虫若しくは昆虫細胞のそれぞれ中で産生されるヒトタンパ
ク質は、従来では存在していた免疫反応を引き起こすエピトープをもはや含まな
くなる。
【０００８】 John M. Burke ″Clearing the way for ribozymes″（Nature Biotechnology
15: 414-415; 1997）による文献は、リボザイム機能の一般的形態に関する。
【０００９】 Pooga et al., ″Cell penetrating PNA constructs regulate galanin recep
tor levels and modify pain transmission in vivo″（Nature Biotechnology
16：875-861; 1998）による文献は、ＰＮＡ分子一般に関し、具体的にはヒトガ
ラニン受容体１型ｍＲＮＡに相補的なＰＮＡ分子に関する。
【００１０】 米国 5, 272, 066 A号公報は、真核および原核タンパク質をin vivo（生体内
）での循環を延長させるように改変させる方法に関する。この例としては、結合
したオリゴ糖を、種々の酵素、その中でもＧｌｃＮＡｃ−α１→３（４）−フコ
シルトランスフェラーゼを使って改変させる。
【００１１】 欧州特許0 643 132 A1号公報はヒト細胞（ＴＨＰ−１）から単離されるα１,
３−フコシルトランスフェラーゼのクローニングに関する。この公報に記載され
ている炭水化物鎖は、ヒトシアリルルイスｘ−およびシアリルルイスａ−オリゴ
糖に相当する。ヒト細胞由来酵素の特性は、植物細胞由来のフコシルトランスフ
ェラーゼの特性とは全く違う。
【００１２】 本発明の目的は、植物フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をクロ
ーニングし、配列決定すること、およびこの遺伝子を含むベクター、そのＤＮＡ
断片、またはその改変ＤＮＡ若しくはそこから派生したＤＮＡを調製し、植物お
よび昆虫ならびにそれらの細胞にこれらのベクターの１つをトランスフェクトし
、正常では存在するα１,３−コア−フコースを含まない糖タンパク質を産生す
ること、ならびに相当するそれらの方法を提供することである。
【００１３】 本発明の目的は、２１１塩基対から１７４０塩基対のオープンリーディングフ
レームを持つ配列番号：１（本明細書では、ＩＵＰＡＣコードを用いることもあ
り、「Ｎ」はイノシンを意味する）に記載の配列、またはこの配列と少なくとも
５０％相同する配列、若しくは以上に示した配列と厳格な(ストリンショントな)
条件下でハイブリダイズする配列を含むＤＮＡ分子、または上のＤＮＡ配列とは
遺伝コードが縮重している配列を含むＤＮＡ分子であって、該配列はフコシルト
ランスフェラーゼ活性を持つ植物タンパク質をコードしており、または上記配列
に相補しているＤＮＡ分子、によって達成される。
【００１４】 これまでに開示されていないこの配列は、植物フコシルトランスフェラーゼ活
性に関する全ての実験、分析および生産等に関する方法に完全に使用することが
できる。ここで、ＤＮＡ配列およびこの配列によってコードされるそのタンパク
質も興味深い。しかし、特にそのＤＮＡ配列がフコシルトランスフェラーゼ活性
の阻害に使用され得る。
【００１５】 配列番号１：のオープンリーディングフレームは、５１０アミノ酸を有し理論
分子量５６.８ｋＤａであるタンパク質をコードし、膜貫通部分が恐らくはＡｓ
ｎ３６およびＧｌｙ５４間の領域に存在する。配列番号１の配列をコード化した
タンパク質の理論的ｐＩ値は、７.５１である。
【００１６】 植物フコシルトランスフェラーゼの活性は、標識したフコースおよび担体（例
えば、セファロース）に結合した受容体（例えば、糖タンパク質）を含む試料に
フコシルトランスフェラーゼを添加する方法および測定によって決定される。反
応時間後、その試料を洗浄し、結合したフコースの含有量を測定する。この場合
にフコシルトランスフェラーゼの活性は、活性測定値がネガティブコントロール
の活性測定値よりも少なくとも１０から２０％、特に少なくとも３０から５０％
高い場合は、ポジティブであると考える。さらに、糖タンパク質の構造はＨＰＬ
Ｃ測定によって証明し得る。このようなプロトコールは既に知られている(Staud
acher et al., 1998, Anal. Biochem, 246, 96-101; Staudacher et al. 1991,
Eur. J. Biochem. 199, 745-751）を参照のこと。
【００１７】 例えば、フコシルトランスフェラーゼを、放射活性標識したフコースおよび受
容体（例えば、ＧｌｃＮＡcβ１−２Ｍａｎα１−３（ＧｌｃＮＡβ１−２Ｍａ
ｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａｓｎ）
を含む試料に混合する。その反応時間後、その試料を陰イオン交換クロマトグラ
フィーによって精製し、結合したフコースの量を測定する。受容体を伴う試料の
放射活性測定および受容体を伴わないネガティブコントロールの放射活性測定の
差から活性を計算できる。フコシルトランスフェラーゼの測定した放射活性が、
ネガティブ試料の測定した放射活性よりも少なくとも３０−４０％高ければ、フ
コシルトランスフェラーゼ活性はポジティブであると評価される。
【００１８】 ＤＮＡ分子２つの対合は、温度の選択および試料のイオン強度によって変化さ
せることができる。本発明では、厳格な条件とは、条件が正確かつ厳格な結合を
可能とする条件と理解される。例えば、ＤＮＡ分子を５０℃、７％ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、ｐＨ７.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ中
でハイブリダイズさせ、４２℃、１％ ＳＤＳで洗浄する。
【００１９】 配列が配列番号１と少なくとも５０％の相同性があるかは、例えばＥＭＢＬの
プログラムＦａｓｔＤＢまたはＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータバンクの手段によって
決定することができる。
【００２０】 好ましくは、本発明のＤＮＡ分子の配列は、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシ
ルトランスフェラーゼ活性、持にコア−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ
活性を持つタンパク質をコードしている。
【００２１】 既述のように、α１,３−フコシルトランスフェラーゼのコアは植物および昆
虫に存在するが、ヒト人体には存在しないので、特に、このＤＮＡ配列はフコシ
ルトランスフェラーゼ特異的な分析および実験ならびにその生産方法に有用であ
る。
【００２２】 コア−α１,３−フコシルトランスフェラーゼとは、具体的にはＧＤＰ−Ｌ−
Ｆｕｃ：Ａｓｎ−結合ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼと
考えられる。本発明の範囲内では、用語α１,３−フコシルトランスフェラーゼ
は、原則として特にコア−α１,３−フコシルトランスフェラーゼを意味する。
既述の活性測定に関しては、特に非還元ＧｌｃＮＡｃ末端を持つ受容体を使用す
る。そのような受容体は、例えば、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３(Ｇｌ
ｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６)Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４Ｇｌｃ
ＮＡｃβｔ−Ａｓｎ、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３(ＧｌｃＮＡｃβ１
−２Ｍａｎα１−６)Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４(Ｆｕｃα１−６)Ｇ
ｌｃＮＡｃβ１−ＡｓｎおよびＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３[Ｍａｎα
１−３(Ｍａｎα１−６)Ｍａｎα１−６]Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４
ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａｓｎである。さらに、フコースが結合するか否かは、Ｎ−
グリコシダーゼＦに対する非感受性を測定することによって決定でき、それは質
量分光測定方法によって検出できる。
【００２３】 好ましくは、本発明のＤＮＡ分子は、配列番号１の配列と少なくとも７０−８
０％、特に好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する。この配列は、特に活
性なＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼをコードする。
【００２４】 ＤＮＡ配列は植物または昆虫に応じて多かれ少なかれ変化し得るので、例えば
、配列番号１の配列と７０％の相同性を示す配列もまた、既述のような分析、実
験または生産方法に使用するのに十分なフコシルトランスフェラーゼ活性を持つ
。
【００２５】 更に有利な態様によれば、ＤＮＡ分子は２１５０個の塩基対から２２５０個の
塩基対、特に２１９８個の塩基対を含む。このＤＮＡ分子は開始コドンの上流に
ある１００個の塩基対から３００個の塩基対、特に２１０個の塩基対を含み、同
様にオープンリーディングフレームのストツプコドン後の下流にある３５０個の
塩基対から４４０個の塩基対、特に４５８個の塩基対を含み、好ましくは、その
ＤＮＡ分子末端は３’−ポリ（Ａ）−テールを含む。この様式では、翻訳レベル
において欠陥のない調節が約束され、活性なＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシル
トランスフェラーゼをコードするうえで、特に効果的かつ確実なＤＮＡ分子が提
供される。
【００２６】 本発明はさらに、配列番号３の配列を含むＤＮＡ分子、または以上で特定した
配列と少なくとも８５％、特に好ましくは少なくとも９５％、とりわけ少なくと
も９９％の相同性を持つ配列を含むＤＮＡ分子、または以上で特定した配列と厳
格な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分子、または以上で特定したＤＮＡ配列
とは遺伝コードが縮重しているＤＮＡ分子に関する。相同性の決定は、好ましく
は、挿入および欠失を認識し、それを相同性計算では考慮しないプログラムを用
いて行なう。このヌクレオチド配列は保存ペプチドモチーフをコードしており、
このことは多数の活性かつ機能性ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフ
ェラーゼがそれによってコードされるアミノ酸配列を含んでいることを意味する
。例えば、その配列は配列番号３の配列と同じ大きさを含んでもよく、もちろん
、それより大きいサイズもあり得る。本配列は完全なタンパク質をコードする配
列よりも短かいので、組換え、欠失または他の変異に対して感受性が小さい。保
存モチーフおよびその高い安定性がおかげで、本配列は特に配列認識試験に有利
である。
【００２７】 配列番号３は以下の配列： ５”−ＧＡＡＧＣＣＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＡＣＡＡＡＴＴＴＡＧＣＴＴＡＧＣＧ
ＴＴＴＧＡＡＡＡＴＴＣＧＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＴＡＴＧＴＡＡＣＴＧＡＡ
ＡＡＡＴＴＣＴＴＣＣＡＡＴＣＣＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣＣＴ
−３’： を含有する。
【００２８】 さらなる態様に関して、本発明は既述のＤＮＡ分子の１つの部分配列を含み、
２０塩基対から２００塩基対、好ましくは３０塩基対から５０塩基対の大きさを
持つＤＮＡ分子に関する。そのＤＮＡ分子は、例えばプローブとしてＧｌｃＮＡ
ｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの相補的配列に結合することで、そ
れらを試料から選択することができる。この様式では、さらに大部分の変動する
植物および昆虫由来のＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼを
選択し、単離し、特徴付けることができる。また、任意の所望の配列または幾つ
かの種々の部分配列、具体的にはすでに既述した保存モチーフの一部を使用し得
る。
【００２９】 これを行なうにあたり、既述のＤＮＡ分子の１つがに検出可能な標識物質と共
有結合すれば、特に好都合である。標識物質としては、任意の一般的なマーカー
、例えば、蛍光、発光、放射性マーカー、非同位体マーカー（例えば、ビオチン
）を使用することができる。この様式では、ハイブリッド形成法の手段を用いた
固体組織試料中（例えば、植物から）、さらに液体試料中において相当するＤＮ
Ａ分子の検出、選択および定量に適した試薬が提供される。
【００３０】 本発明のさらなる態様は、既述のＤＮＡ分子の１つ、または少なくとも２０塩
基対を持つ種々の長さであるそれらの部分を含む、生物学的に機能するベクター
に関する。宿主細胞中にトランスフェクトするのに関して、独立して増幅可能な
ベクターが必要であり、宿主細胞、翻訳機構、ＤＮＡ分子の役割および大きさに
依存して、好ましいベクターを使用することができる。多くのベクターが知られ
ているために、それらを列挙することは本明細書の制限を越えることになり得、
特にそれらのベクターは当業者には周知であるので、本明細書中では列挙しない
（本明細書中で使用する全ての技術および用語と同様に、それらのベクターは当
業者に周知である、Sambrook Maniatisも参照のこと）。理想的に、ベクターは
分子量が小さく、ベクターを含む宿主細胞か、ベクターを含まない宿主細胞かの
選択が容易に行なえるよう、細胞中で容易に認識可能な表現型を導入するような
選択遺伝子を含ませるべきである。ＤＮＡおよび相当する遺伝産物の収量を大量
に得るために、ベクターは強力なプロモーターと同様にエンハンサー、遺伝子増
幅シグナルおよび調節配列を含ませるべきである。ベクターの自律的増殖とは、
さらに複製開始点が重要である。ポリアデニル化部位はｍＲＮＡの正確な処理お
よびＲＮＡ転写に関するスプライシング信号を担う。仮にファージ、ウイルスま
たはウイルス粒子をベクターとして使用する場合、パッケージ化信号はベクター
ＤＮＡのパッケージ化を調節し得る。例として、植物中の転写とはＴｉプラスミ
ドが適しており、昆虫細胞中の転写とはバキュロウイルスが、そして昆虫とは、
それぞれＰエレメントのようなトランスポゾンが適している。
【００３１】 既述の発明ベクターを植物または植物細胞中に挿入すれば、内因性のα１,３
−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の遺伝子発現である転写後の抑圧は、それ
らに相同性のある導入遺伝子またはそれらの部分のセンス方向の転写によって達
成される。このセンス技術に関しては、さらに文献としてBaucombe 1996, Plant
. Mo1. Bio1., 9: 373-382およびBrigneti et al., 1998, EMB0 J. 17: 6739-67
46で公表されている。この「遺伝子サイレンシング」はα１,３−フコシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子の発現を抑圧する効果的な方法である（Waterhouse et al
., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 13959-13964も参
照）。
【００３２】 さらに、本発明は既述の態様の１つのＤＮＡ分子、またはプ口モータに対して
逆方向に種々の長さを持つそれらの部分を含む生物学的に機能するベクターに関
する。このベクターを宿主細胞中にトランスフェクトすれば、ＧｌｃＮＡｃ−α
１,３−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡに相補し、後に複合体を形成す
る「アンチセンスｍＲＮＡ」を読むことになるだろう。この結合は正確なプロセ
ッシング、輸送、安定性を阻害し、またはリボソームのアニーリングを妨げるこ
とにより、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの転写および
正常な遺伝子発現を阻害する。
【００３３】 ＤＮＡ分子はその完全な配列をベクター中に挿入することができるが、それら
の部分配列は、大きさが小さいためいに、特定の目的には有利となり得る。アン
チセンス態様に関しては、例えばそのトランスフェラーゼｍＲＮＡに結合し得る
十分に大きいアンチセンスｍＲＮＡを形成させるのに、ＤＮＡ分子は十分な大き
さであることが重要である。天然に生じるアンチセンスＲＮＡ分子がおおよそ１
００ヌクレオチドであることがよく知られているので、アンチセンスｍＲＮＡ分
子は例えば５０から２００ヌクレオチドを含むことが好ましい。
【００３４】 活性α１,３−フコシルトランスフェラーゼの発現阻害に特に効果的であるの
で、センス技術およびアンチセンス技術を組み合わせることが好ましい（Waterh
ouse et a1., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95: 13959-13964）。
【００３５】 素早くハイブリダイズするＲＮＡ分子を使用のが都合良い。５０ヌクレオチド
以上の大きさを持つアンチセンスＲＮＡ分子の効率は、in vitro(無細胞系)での
アニーリング反応速度論に依存する。従って、例えば素早くアニーリングするア
ンチセンスＲＮＡ分子は、ゆっくりハイブリダイズするＲＮＡ分子よりタンパク
質発現を阻害することが顕著である(Wagner et al., 1994, Annu. Rev. Microbi
ol., 48: 713-742; Rittner et al., 1993, Nuc1, Acids Res., 21: 1381-1387)
。そのように素早くハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡ分子は、特に多くの
外部塩基(遊離末端および連結配列)、多くの構造上のサブドメイン(構成要素)お
よび低度の輪状構造を含む(Patzel et a1. 1998; Nature Biotechnology, 16; 6
4-68)。アンチセンスＲＮＡ分子の仮説上の２次構造を、例えばコンピューター
プログラムを使用して決定することができ、それに応じて好ましいアンチセンス
ＲＮＡ ＤＮＡ配列を選ぶ。
【００３６】 ＤＮＡ分子の種々の配列領域をベクター中に挿入し得る。可能性の１つとして
は、例えばリボソームがアニーリングするその部分のみをベクター中に挿入する
ことがある。ｍＲＮＡのこの領域を遮断すれば、翻訳全体を停止させるのに十分
である。また、特に高効率のアンチセンス分子は、遺伝子の５'および３'非翻訳
領域に関する結果である。
【００３７】 好ましくは、本発明のＤＮＡ分子は、欠失、挿入および/または置換変異から
成る配列を含む。変異ヌクレオチドの多くは可変であり、単一ヌクレオチドから
幾つかの欠失、挿入および置換したヌクレオチドに変わる。また、リーディング
フレームが変異によってずれることもあり得る。そのような「ノックアウト遺伝
子」の場合は、単にＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの発現
を妨害するのに重要なだけであり、活性、機能性酵素の形成を防ぐ。これを行な
うにあたり、変異の位置は可変であるので、酵素の活性クンパク質の発現を阻止
する。好ましくは、酵素のＣ末端領域にある触媒領域中の変異である。ＤＮＡ配
列に変異を挿入する方法は当業者に周知であり、従って種々の突然変異生成の可
能性をここで詳細に記載する必要はない。偶然一致する変異と同様に、具体的に
は特異的突然変異、例えば、部位特異的突然変異、オリゴヌクレオチド制御(oli
gonucleotide-controlled)突然変異、または制限酵素を用いた変異を、この例と
して用いる。
【００３８】 さらに本発明は、既述の本発明ＤＮＡ分子の部分配列と相補的である少なくと
も各々が１０から１５塩基対の部分配列２つを含むリボザイムをコードするＤＮ
Ａ分子を提供し、該リボザイムは天然ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトラン
スフェラーゼＤＮＡ分子から転写されたｍＲＮＡと複合体形成し、開裂させる。
そのリボザイムはＧｌｃＮＡｃ−αｌ,３−フコシルトランスフエラーゼのｍＲ
ＮＡの相補的な塩基対合によって、そのｍＲＮＡを認識するのだろう。続いて、
そのリボザイムは、酵素が翻訳される前に配列特異的様式(sequence-specific m
anner)によりＲＮＡを分解し、破壊する。開裂させた基質から解離した後、その
リボザイムはＲＮＡ分子と繰り返しハイブリダイズし、特定のエンドヌクレアー
ゼとして作用しする。一般に、リボザイムはタンパク質をコードする全ＤＮＡ配
列が知られていなくても、特定のｍＲＮＡを不活性化するために個別に調製する
ことができる。リボソームがｍＲＮＡに沿ってゆっくり移動する場合、リボザイ
ムは特に効果的である。この場合、リボザイムはｍＲＮＡ上のリボソームがくっ
ついていない部位を見つけることが容易である。この理由により遅いリボソーム
の変異体もリボザイムに適した系として好ましい(J. Burke, 1997, Nature Biot
echnology; 15, 414-415)。このDNA分子は植物ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシ
ルトランスフェラーゼの発現の下方調節および阻害それぞれに、特に都合がよい
。
【００３９】 可能な方法の１つに、リボザイムの多様型(例えば、ミニザイム)を使用するこ
ともある。ミニザイムは大きいｍＲＮＡ分子の開裂に特に効果的である。ミニザ
イムはステム/ループIIの代わりに短いオリゴヌクレオチドリンカーを持つハン
マー状頭の(hamer head)リボザイムである。二量体−ミニザイムは特に効果的で
ある(Kuwabara et al., 1998, Nature Biotechnology, 16; 961-965)。そういっ
た訳で、本発明は最後に挙げた２つのＤＮＡ分子 (変異またはリボザイム−ＤＮ
Ａ分子)の内１つを含む生物学的機能性ベクターにも関するものである。以上の
ベクターに関して述べたことは、この場合に適用する。そのようなベクターは、
例えば微生物中に挿入することができ、既述の高濃度ＤＮＡ分子の製造に使用す
ることができる。さらに、そのようなベクターは、植物および昆虫体中、Ｇｌｃ
ＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼを下方調節または完全に阻害す
る目的で、この生体中へ特定のＤＮＡ分子を挿入することに期待できる。
【００４０】 本発明は本発明のＤＮＡ分子を含むｃＤＮＡの調製方法を提供するものであり
、それは、ＲＮＡを昆虫または植物細胞、特に胚軸細胞から分離し、逆転写酵素
およびプライマーを混合した後、逆転写を行なうことである。本方法の各段階は
、本質的に既知手順に従って行なわれる。一方で、逆転写についてオリゴ(ｄＴ)
プライマーを使用して全長のｍＲＮＡのｃＤＮＡを生成することができ、その後
ただＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
分子を調製するために選択したプライマーを用いてＰＣＲをすることができる。
もう一方で、その選択したプライマーを、短く、特定のｃＤＮＡを得るために逆
転写に直接用い得る。その好ましいプライマーは、例えばトランスフェラーゼの
ｃＤＮＡ配列パターンに従って合成的に調製することができる。本方法を用いる
ことで、大分子量の発明ｃＤＮＡ分子を単純な方法で、失敗もほとんどなく、素
早く製造することができる。
【００４１】 さらに、本発明はＧｌｃｅＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼを
クローニングする方法に関するものであり、本発明ＤＮＡ分子を、後に宿主細胞
および宿主中それぞれヘトランスフェクトするベクターに組換え、活性ＧｌｃＮ
Ａｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼを発現するトランスフェクト宿主
細胞、細胞株を選択し、増幅することを特徴とする。そのＤＮＡ分子は、例えば
制限エンドヌクレアーゼを用いてベクター中に挿入する。そのベクターに関して
は、既に以上で述べたことを適用する。本方法では効果的な宿主−ベクター系を
選ぶことが重要である。活性酵素を得るためには、真核宿主細胞が持に好ましい
。可能な方法の１つに、昆虫細胞中にそのベクターをトランスフェクトすること
がある。そうする場合、特に昆虫ウイルス、例えばバキュロウイルスをベクター
として使用しなければならないだろう。
【００４２】 ヒトまたは他の脊椎動物細胞にもトランスフェクトすることができるのは当然
であり、その場合、後者は外来の酵素を発現するだろう。
【００４３】 好ましくは、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ生産を抑
圧または完全に停止させた組換え宿主細胞、特に植物細胞若しくは昆虫細胞また
は植物若しくは昆虫それぞれの調製方法を提供し、それは、本発明のベクター、
即ち本発明ＤＮＡ分子、変異ＤＮＡ分子またはリボザイムをコードしたＤＮＡ分
子を含むもの、若しくはプロモーターに対して逆向きのＤＮＡ分子を含むものの
少なくとも１つを宿主細胞または植物若しくは昆虫へ挿入することを特徴とする
。トランスフェクションに関して以上に述べたことは、本件中にも適応する。
【００４４】 宿主細胞として、例えば植物細胞を使用する場合、例えばアグロバクテリアを
用いるＴｉプラスミド系が適格である。アグロバクテリア系とは、直接植物にト
ランスフェクトすることができる(アグロバクテリアは植物において根茎虫こぶ
を生じさせる)。傷つけた植物にアグロバクテリアを感染させた場合、そのバク
テリア自身はその植物中に入り込まず、輪状の染色体外の腫瘍誘導Ｔｉ−プラス
ミドから派生する組換えＤＮＡ部分(Ｔ−ＤＮＡと称される)を植物細胞中へ挿入
する。そのＴ−ＤＮＡ、およびそこに挿入されたＤＮＡ分子もまた、細胞の染色
体に安定な様式で組み込まれ、植物中でそのＴ−ＤＮＡ遺伝子を発現する。
【００４５】 種々の宿主系に関して、既知の効果的なトランスフェクト機構が多数存在する
。その例の幾つかは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、マイクロ
インジェクション、リポソーム法である。
【００４６】 続いて、トランスフェクトした細胞を、例えばベクターが持つ抗生物質耐性遺
伝子、または他のマーカー遺伝子に基づいて選択する。その後、トランスフェク
トした細胞株を小規模、例えばぺトリ皿にて、または大規模、例えば発酵槽にて
増幅する。さらに、植物は特異な特性を持っており、即ち１つの（トランスフェ
クトされた）細胞またはプロトプラストから発育させることのできる完全な植物
体へと再生することができる。
【００４７】 使用するベクターに応じた過程が宿主中に生じる結果、酵素発現が抑圧または
完全に停止され得る：
【００４８】 欠失、挿入または置換変異のあるＤＮＡ分子を含むベクターをトランスフェク
トした場合、相同組換えが生じる：その変異ＤＮＡ分子はその変異にも関わらず
、宿主細胞のゲノム中の同一配列を認識し、その場所に完全に挿入される結果、
「ノックアウト遺伝子」が形成される。この様式では、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３
−フコシルトランスフェラーゼの完全な発現を阻害し得る変異を、ＧｌｃＮＡｃ
−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子中に導入する。以上で説明し
たように、この技術を用いることで、その変異が活性タンパク質の発現を遮断す
るのに十分であることは重要である。選択し、増幅した後、さらに相同組換えま
たは変異度のそれぞれを決定するために、その遺伝子を調べるように配列決定し
得る。
【００４９】 リボザイムをコードするＤＮＡ分子を含むベクターをトランスフェクトした場
合、その活性リボザイムを宿主細胞中で発現させ得る。そのリボザイムは、Ｇｌ
ｅＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの相補ｍＲＮＡと少なくとも
特定の部位で複合体を形成し、この部位を開裂し、この様式でその酵素の翻訳を
阻害することができる。この宿主細胞および細胞株、それから派生した任意に植
物では、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼは発現し得ない
。そのベクターがプロモーターに対してセンスまたは逆方向に本発明ＤＮＡ分子
を含む場合、センスまたはアンチセンスｍＲＮＡがトランスフェクト細胞（また
は、植物、それぞれ）中で発現し得る。そのアンチセンスｍＲＮＡは、少なくと
もＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡの一部と相
補的であり、同様にその酵素の翻訳を阻害し得る。アンチセンス技術による遺伝
子発現の抑圧方法の例としては、文献Smith et al., 1990, Mol. Gen. Genet. 2
24: 447-481によって公表され、この文献中において、トマトの成熟過程に関わ
る遺伝子の発現が阻害されるとある。
【００５０】 上記すべての系において、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラ
ーゼの発現は、少なくとも抑圧され、好ましくは更に完全に停止される。遺伝子
発現の妨害の程度は、そのゲノムの領域内における複合体形成度、相同組換え頻
度、後に同時発生し得る突然変異、および他の過程に依存し得る。そのトランス
フエクト細胞をＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ活性に関
して調べ、選択する。
【００５１】 その上、既述したベクターの挿入に加えて、哺乳類のタンパク質、例えばβ１
,４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むベクターを宿
主中に導入することで、α１,３−フコシルトランスフェラーゼの発現の抑圧を
、既述するよりもより強めることができる。他の哺乳類の酵素作用、本発明ベク
ターおよび特に効果的な哺乳類の酵素ベクターを用いた活性α１,３−フコシル
トランスフェラーゼの発現の阻害の組み合わせによって、フコシル化を減少させ
ることができる。
【００５２】 あらゆる植物型、例えばマングビーン、タバコ植物、トマトおよび/またはポ
テト植物をトランスフェクションに使用することができる。組換え宿主細胞、特
に植物細胞若しくは昆虫細胞、または植物若しくは昆虫のそれぞれを作成する他
の有利な方法は、突然変異を含むＤＮＡ分子を宿主細胞、または植物若しくは昆
虫のそれぞれのゲノム中、突然変異のない相同配列の個所に挿入することである
(Schaefer et al., 1997, Plant J.; 11(6)：1195-1206)。従って、この方法は
ベクターではなく、純粋なＤＮＡ分子によって機能する。そのＤＮＡ分子を宿主
中へ、例えば遺伝子照射(gene bombardment)、マイクロインジェクションまたは
エレクトロポレーション(ちょうど３つの実施例で言及する)によって挿入する。
すでに既述したように、ＤＮＡ分子は宿主のゲノム中の相同配列に結合すること
で、相同組換えした後、欠失、挿入または置換変異のそれぞれをゲノム中で受け
ることになる：ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの発現は
、それぞれ抑圧または完全に遮断され得る。
【００５３】 さらに本発明の他の態様は、天然の植物または植物細胞それぞれ、および昆虫
または昆虫細胞それぞれに生じるＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフ
ェラーゼ活性が５０％以下、特に２０％以下、特に好ましくは０％である植物ま
たは植物細胞それぞれ、および昆虫または昆虫細胞それぞれのＧｌｃＮＡｃ−α
１,３−フコシルトランスフェラーゼ活性に関する。これらの植物または植物細
胞それぞれの利点は、それらによって産生される糖タンパク質が、あらゆるα１
,３−結合フコースをほとんどまたは完全に含まないことである。これらの植物
または昆虫それぞれの産物をヒト人体または脊椎動物体に用いた場合、α１,３
−フコースエピトープに対して免疫反応を示さないだろう。
【００５４】 好ましくは、既述の方法の１つを用いて作成した組換え植物または植物細胞の
それぞれを提供し、それらのＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラ
ーゼ生産は、それぞれ抑圧または完全に遮断している。
【００５５】 また、本発明は既述の方法の１つを用いて作成した昆虫または昆虫細胞それぞ
れに関するものであり、それらのＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフ
ェラーゼ生産は、それぞれ抑圧または完全に遮断している。また、この例として
は、α１,３−結合フコース残基を持たない糖タンパク質を産生すること、α１,
３−フコースエピトープに対して同様に免疫反応を示さなくなる
【００５６】 また、本発明は、本発明に基づくＤＮＡ分子配列、およびそれらの部分配列と
相補的な塩基配列を含むＰＮＡ分子に関する。ＰＮＡ（ペプチド核酸）はＤＮＡ
様の配列であり、その核酸塩基はシュードペプチド骨格に結合する。ＰＮＡは一
般に、ワトソン−クリツク型塩基対合およびヘリツクス形成によって相補的なＤ
ＮＡ−、ＲＮＡ−またはＰＮＡ−オリゴマーとハイブリダイズする。そのペプチ
ド骨格は、酵素分解に対して耐性が増強されている。従って、ＰＮＡ分子は改善
されたアンチセンス物質である。ヌクレアーゼもプロテアーゼもＰＮＡ分子を攻
撃できない。ＰＮＡ分子の安定性には、相補配列に結合する場合における、ＤＮ
ＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼおよびリボソームに対
する十分な立体障害が含まれる。ＰＮＡ分子が既述の配列を含む場合、ＧｌｃＮ
Ａｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡまたはＤＮＡ
の部位それぞれに結合し、この方法でこの酵素の転写を阻害することができる。
転写および翻訳せさないようなＰＮＡ分子は、例えばｔ−Ｂｏｃ技術によって合
成的に調製し得る。有利なことに、本発明ＤＮＡ分子の配列およびそれらの部分
配列に相当する塩基配列を含むＰＮＡ分子を提供する。このＰＮＡ分子はＧｌｃ
ＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの部
分と複合体を形成することで、その酵素の翻訳を阻害し得る。アンチセンスＲＮ
Ａについて記載する同様の議論は、この場合に適用する。従って、例えば特に効
果的な複合体形成領域は、ｍＲＮＡの翻訳開始領域、または５’−非翻訳領域で
もある。
【００５７】 本発明の更なる態様は転写または翻訳レベルそれぞれで、ＧｌｃＮＡｃ−α１
,３−フコシルトランスフェラーゼの発現の遮断を含む植物若しくは昆虫または
細胞それぞれ、特に、植物細胞または昆虫細胞の作成方法に関するものであり、
それは本発明ＰＮＡ分子を細胞中に挿入することを特徴とする。ＰＮＡ分子(mol
ecule)またはＰＮＡ分子(molecules)それぞれの細胞中への挿入には、再び従来
の方法、例えばエレクト口ポレーションまたはマイクロインジェクションを使用
する。ＰＮＡオリゴマーが細胞侵入ペプチド、例えばトランスポゾンまたはｐＡ
ｎｔｐに結合する場合、特に効率的であるのは挿入である（Pooga et al., 1998
, Nature Biotechnology, 16; 857-861）。
【００５８】 本発明は、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ生産がそれ
ぞれ抑圧または完全に遮断された本発明組換え植物または植物細胞それぞれおよ
び昆虫または昆虫細胞それぞれ、または本発明方法によって、ＰＮＡ分子が挿入
された植物若しくは昆虫または細胞それぞれに、糖タンパク質を発現する遺伝子
をトランスフェクトすることで組換え糖タンパク質を発現させることを持微とす
る、糖タンパク質の製造方法を提供する。これを行なう場合、すでに既述したよ
うに、所望のタンパク質に対する遺伝子を含むベクターを宿主または宿主細胞中
それぞれに、すでに既述したようにトランスフェクトする。トランスフェクト植
物細胞または昆虫細胞が所望のタンパク質を発現するようになり、それらはほと
んどまたは完全にα１,３−結合フコースを持たない。従って、それらがヒト人
体または脊椎動物体で、既述の免疫反応を引き起こすことはない。あらゆるタン
パク質を、これらの系で産生し得る。有利なことに、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−
フコシルトランスフェラーゼ生産が抑圧または完全に遮断された組換え植物また
は植物細胞それぞれおよび組換え昆虫または昆虫細胞それぞれ、または本発明方
法によって、ＰＮＡ分子が挿入された植物若しくは昆虫、または細胞それぞれに
、糖タンパク質を発現する遺伝子をトランスフェクトすることで組換え糖タンパ
ク質を発現することを特徴とする組換えヒト糖タンパク質の製造方法を提供する
。この方法によって、植物体(植物細胞)中でヒトタンパク質を産生させることが
できるようになり、それをヒト人体に用いた場合、α１,３−結合フコース残基
に対して直結する全ての免疫反応を引き起こすことはない。そこで、組換え糖タ
ンパク質を産生するために食料品として出す植物類、例えばバナナ、ポテトおよ
び/またはトマトを利用することができる。この植物組織は組換え糖タンパク質
を含むので、例えばその組織から組換え糖タンパク質を抽出し、続いて処理する
、または直接植物組織を摂食することそれぞれによって、ヒト人体に組換え糖タ
ンパク質を取り込む。好ましくは、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランス
フェラーゼ生産がそれぞれ抑圧または完全に遮断された本発明の組換え植物また
は植物細胞それぞれと同様に組換え昆虫または昆虫細胞それぞれ、または本発明
方法によって、ＰＮＡ分子が挿入された植物若しくは昆虫、または細胞それぞれ
に糖タンパク質を発現する遺伝子をトランスフェクトすることで、組換え糖タン
パク質を発現する医療に適した組換えヒトタンパク質の製造方法を提供する。こ
れを行なうにあたり、医療的に関心のあるあらゆるタンパク質を使用することが
できる。
【００５９】 その上、本発明は既述の方法によって、組換え糖タンパク質を植物系または昆
虫系中で調製し、それらのペプチド配列が、フコシルトランスフェラーゼを縮減
させていない植物系または昆虫系で発現されたタンパク質に生じるα１,３−結
合フコシル残基の５０％以下、特に２０％以下、特に好ましくは０％を含む組換
え糖タンパク質に関する。α１,３−結合フコース残基を含まない糖タンパク質
が当然好ましい。α１,３−結合フコースの量は、既述のＧｌｃＮＡｃ−α１,３
−フコシルトランスフェラーゼの抑圧の程度に依存し得る。
【００６０】 好ましくは、本発明は既述の方法によって、植物系または昆虫系で産生された
組換えヒト糖タンパク質に関するものであり、それらのペプチド配列はフコシル
トランスフェラーゼを縮減させていない植物系または昆虫系で発現されたクンパ
ク質に生じるα１,３−結合フコシル残基の５０％以下、特に２０％以下、特に
好ましくは０％を含む。
【００６１】 具体的に好ましい態様は既述の方法によって、医療使用に適した組換えヒト糖
タンパク質に関するものであり、それらのペプチド配列はフコシルトランスフェ
ラーゼを縮減させていない植物系または昆虫系で発現されたクンパク質に生じる
α１,３−結合フコシル残基の５０％以下、特に２０％以下、特に好ましくは０
％を含む。
【００６２】 本発明の糖タンパク質は、持定の植物または昆虫それぞれで異なるオリゴ糖結
合単位を含むことができ、それによってヒト糖タンパク質の場合、それはこの天
然糖タンパク質と異なる。それにもかかわらず、本発明に基づく糖タンパク質に
よって、ヒト人体においてわずかな免疫反応しか引き起こさず、または全く免疫
反応を引き起こすことはなく、それは、本明細書の導入部分ですでに述べたよう
に、α１,３−結合フコシル残基が植物および昆虫糖タンパク質に対する免疫反
応または交差免疫反応それぞれに対する主要な要因だからである。
【００６３】 更なる態様は、本発明の糖タンパク質を含む製薬的な組成を含む。本発明の糖
タンパク質に加え、さらに製薬的な組成はそのような組成に一般的な添加物を含
む。これらは、例えば種々のバッファー内容物（例えば、トリスーＨＣｌ、酢酸
塩、リン酸塩、ｐＨ、およびイオン強度）、添加剤、例えば、界面活性剤および
可溶化剤(例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０、ポリソルビン酸塩 ８０)、防腐剤(例え
ば、チメロサール、ベンジルアルコール)、補助剤、酸化防止剤(例えば、アルコ
ルビン酸、メタ亜硫酸水素ナトリウム)、乳化剤、充填剤(例えば、ラクトース、
マンニトール)、共有結合ポリマー、例えばポリエチレングリコール、タンパク
質に対する多因子化合物の粒子組成における物質の取り込み、例えば、ポリ乳酸
、ポリグリコール酸など、またリポソームにおいて、それぞれの処置に好ましい
助剤および/または担体物質である。そのような組成は、物理的条件、安定性、
本発明の糖タンパク質のin vivoでの遊離速度およびin vivoでの分泌速度が影響
し得る。
【００６４】 また、本発明は、試料中に標識した本発明のＤＮＡ分子を混合し、それがＧｌ
ｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子に結
合することで、試料中のＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ
をコードするＤＮＡ分子を選択する方法も提供する。そのハイブリダイズしたＤ
ＮＡ分子を検出し、定量し、かつ選択することができる。標識したＤＮＡ分子は
一本鎖ＤＮＡを含む試料に対してハイブリダイズすることができ、その試料を例
えば加熱によって変成させる。可能な方法の１つとして、エンドヌクレアーゼを
添加した後に、アガロースゲルを用いたゲル電気泳動によってＤＮＡを分離し、
アッセイすることができる。ニトロセルロース膜に移行させた後、本発明の標識
したＤＮＡ分子を混合し、相当する相同ＤＮＡ分子にハイブリダイズさせる(サ
ザンブロッティング)。
【００６５】 他の可能な方法には、本発明のＤＮＡ分子配列から派生した特定のおよび/ま
たは縮重したプライマーを使用するＰＣＲによる方法によって他種から相同遺伝
子を見つけることがある。
【００６６】 好ましくは、以上で定義した本発明方法に関する試料は、植物または昆虫組織
の染色体ＤＮＡを含む。この方法によって、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシル
トランスフェラーゼ遺伝子の存在に関して、多くの植物または昆虫を、とても素
早くかつ効率的な様式でアツセイできる。この様式では、この遺伝子を含まない
植物または昆虫をそれぞれ選択することができ、または既述の本発明方法によっ
て、この遺伝子を含む植物および昆虫中でのＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシル
トランスフェラーゼの発現をそれぞれ抑圧または完全に遮断することによって、
続いてそれらをトランスフェクトし、（ヒト）糖タンパク質の産生に使用し得る
。また、本発明は最後に挙げた２つの方法によって選択し、続いて試料中から単
離したＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮ
Ａ分子に関する。これらの分子は更にアツセイに使用することができる。それら
の配列を決定し、次々にＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ
を探すＤＮＡプローブとして使用することができる。これらの−１ａと標識され
た−ＤＮＡ分子は生体に対して機能し、生体から単離したＤＮＡ分子は生体に共
通し、本発明のＤＮＡ分子よりもプローブとしてより効率的である。本発明の更
なる態様は、本発明に基づいてクローニングされ、ｐＩ値が６.０から９.０の間
、好ましくは６.８から８.２の間であるアイソマーを含むＧｌｃＮＡｃ−α１,
３−フコシルトランスフェラーゼの調製に関する。タンパク質におけるｐＩ値は
、そのタンパク質の総電荷であるｐＨが０となるものであり、アミノ酸配列、グ
リコシル化パターンと同様にタンパク質の立体構造に依存する。ＧｌｃＮＡｃ−
α１,３−フコシルトランスフェラーゼは、ｐＩ値がこの範囲で少なくとも７つ
のアイソマーを含む。トランスフェラーゼの種々のアイソマーに関する理由は、
例えば異なるグリコシル化およびタンパク質限定加水分解がある。検査は、種々
の植物であるマングビーンの種形成において、アイソマーは種々の関係を持つこ
とを示している。タンパク質のｐＩ値は、当業者に周知である等電点電気泳動に
よって決定することができる。本酵素の主なアイソフォームは見かけ上５４ｋＤ
ａの分子量を持つ。
【００６７】 特に、本発明の調製は、ｐＩ値が６.８、７.１および７.６を持つアイソフォ
ームを含む。
【００６８】 また、本発明はフコース単位および既述のＤＮＡ分子によってコードされたＧ
ｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼを、炭水化物単位または糖
タンパク質それぞれを含む試料中に混合することで、フコースのα１,３−位置
をＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼによって炭水化物単位
または糖クンパク質それぞれに結合する、ヒトおよび他の脊椎動物糖タンパク質
の「植物化（plantified）」炭水化物単位の製造方法に関する。ＧｌｃＮＡｃ−
α１,３−フコシルトランスフェラーゼをクローニングすることに関して本発明
に基づく方法により、精製した酵素を大量に産生することができる。完全な活性
トランスフェラーゼを得るために、適した反応条件を提供する。トランスフェラ
ーゼは、バツファーとして２−（Ｎ−モルホリノ）−エタン硫酸−ＨＣｌを使用
する場合、おおよそｐＨ７で、特にトランスフエラーゼ活性が高いことが示され
た。二価陽イオン、特にＭｎ２＋の存在下で、組換えトランスフェラーゼの活性
が亢進される。炭水化物単位を、タンパク質に対して非結合型または結合型のい
ずれかである試料に混合する。その組換えトランスフェラーゼはいずれの型に対
しても活性がある。本発明は以下の実施例および図式の方法によってより詳細に
説明するが、勿論それに制限されない。
【００６９】 図面の詳細は次の通りである： 図.１ａおよび１ｂは、溶出した個々のフラクションについてのタンパク質の量
および酵素活性を測定し、曲線で表したものである； 図.２は、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの電気泳動ゲル
分析を表したものである； 図.３は、アイソフォーム個々の等電点電気泳動およびトランスフェラーゼ活性
を測定した結果を表したものである； 図.４は、トリプシンペプチド４つ（１−４）のＮ末端配列と同様にプライマー
３つ、Ｓ１、Ａ２およびＡ３のＤＮＡ配列を示したものである； 図.５ａおよび５ｂは、α１,３−フコシルトランスフェラーゼのｃＤＮＡ配列を
示したものである； 図.６ａおよび６ｂは、それから派生したα１,３−フコシルトランスフェラーゼ
のアミノ酸配列を示したものである； 図.７は、α１,３−フコシルトランスフェラーゼと同様にアミノ酸残基の疎水性
の模式表示である； 図.８は、種々のフコシルトランスフェラーゼの保存モチーフの比較を表したも
のである； 図.９は、α１,３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトした
昆虫細胞のフコシルトランスフェラーゼ活性とネガティブコントロールのフコシ
ルトランスフェラーゼ活性との比較を表したものである； 図.１０ａおよび１０ｂは、α１,３−フコシルトランスフェラーゼの異なる受容
体の構造を示したものである； 図.１１および１２は、質量スペクトルを表したものである；および 図.１３はＨＰＬＣの結果を表したものである。
【００７０】 実施例１： コア−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの単離 すべての工程は４℃で行った。リョクトウ実生をミキサーでホモジナイズ（マ
メ１ｋｇ当たり０.７５容量の抽出バッファーを用いる）した。次いで、ホモジ
ネートを二層の綿布を通してろ過し、ろ液を３００００ｘｇで４０分間遠心した
。上清を廃棄し、ペレットを一晩攪拌しながら、溶解バッファーで抽出した。次
いで３００００ｘｇで４０分間遠心し、トリトン抽出物を得た。
【００７１】 トリトン抽出物を以下のように精製した： 工程１：あらかじめバッファーＡで平衡化しておいた Whatman のミクロ顆粒
状ジエチルアミノエチルセルロースアニオン交換ＤＥ５２セルロースカラム（５
ｘ２８ｃｍ）にトリトン抽出物をアプライした。非結合フラクションをさらに工
程２で処理した。 工程２：この試料をバッファーＡで平衡化した Affi-Gel Blue カラム（２,５
ｘ３２）カラムにアプライした。カラムをこのバッファーで洗浄した後、吸着し
たタンパク質を０.５Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーＡで溶出した。 工程３：工程２の溶出液をバッファーＢに透析した後、これを、同バッファー
で平衡化したＳ−セファロースカラムにアプライした。結合タンパク質をバッフ
ァーＢ中の０〜０.５Ｍ ＮａＣｌの直線状濃度勾配で溶出した。ＧｌｃＮＡｃ−
α１,３−フコシルトランスフェラーゼを含むフラクションをプールし、バッフ
ァーＣに透析した。
【００７２】 工程４：透析した試料を、バッファーＣで平衡化したＧｎＧｎ−セファロース
カラムにアプライした。結合タンパク質をＭｎＣｌ２のかわりに１Ｍ ＮａＣｌ
を含むバッファーＣで溶出した。 工程５：次いで、酵素をバッファーＤに透析し、ＧＤＰ−ヘキサノールアミン
−セファロースカラムにアプライした。カラムをバッファーＤで洗浄した後、Ｍ
ｇＣｌ２およびＮａＣｌを０.５ｍＭ ＧＤＰで置換してこのトランスフェラーゼ
を溶出した。活性フラクションをプールし、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファ
ー（ｐＨ７.３）に透析し、凍結乾燥した。
【００７３】 ２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸−ＨＣｌバッファー、トリトン Ｘ−
１００、ＭｎＣｌ２、ＧｌｃＮＡｃおよびＡＭＰの存在下、それぞれ基質濃度０
.５および０.２５のＧｎＧｎペプチドおよびＧＤＰ−Ｌ−[Ｕ−１４Ｃ]−フコー
スを用いて、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの酵素活性
を測定した（Staudacher et al., 1998, Gly-coconjugate J. 15, 355-360; Sta
udacher et al., 1991, Eur. J. Biochem. 199, 745-751 にしたがう）。
【００７４】 bicinchoninic acid 法（Pierce）を用いることによって、または酵素精製の
最終工程においてアミノ酸分析を用いて（Altmenn 1992, Anal. Biochem. 204,
215-219）タンパク質濃度を測定した。
【００７５】 図１ａおよび１ｂでは、溶出液の各フラクションにおけるタンパク質の測定量
および測定された酵素活性を曲線で示す。図１ａは上記Ｓ−セファロースカラム
での分離を示し、図１ｂはＧｎＧｎ−セファロースカラムでの分離を示す。円は
タンパク質を表し、黒い完全な円はＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランス
フェラーゼを表し、四角はＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼを表す。１Ｕ
は、１分間当たり１mmolのフコースをアクセプターに転移する酵素量と定義する
。
【００７６】 表１はトランスフェラーゼ精製の各工程を示す。 表１
【表１】 １アミノ酸分析によって測定
【００７７】 抽出バッファー： ０.５ｍＭ ジチオスレイトール １ｍＭ ＥＤＴＡ ０.５％ ポリビニルポリピロリドン ０.２５Ｍ スクロース ５０ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７.３ 溶解バッファー： ０.５ｍＭ ジチオスレイトール １ｍＭ ＥＤＴＡ １.５％ トリトン Ｘ−１００ ５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.３ バッファーＡ： ２５ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７.３、以下を含む： ０.１％ トリトン Ｘ−１００および ０.０２％ ＮａＮ３ バッファーＢ： ２５ｍＭ クエン酸Ｎａバッファー、ｐＨ５.３、以下を含む： ０.１％ トリトン Ｘ−１００および ０.０２％ ＮａＮ３ バッファーＣ： ２５ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７.３、以下を含む： ５ｍＭ ＭｎＣｌ２ｎｄ ０.０２％ ＮａＮ３ バッファーＤ： ２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.３、以下を含む： １０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０.１Ｍ ＮａＣｌおよび ０.０２％ ＮａＮ３
【００７８】 実施例２ ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび等電点電気泳動 Biorad Mini-protean cell において、１２.５％アクリルアミドおよび１％ビ
スアクリルアミドを含むゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。このゲルを Coomass
ie Brilliant Blue R-250 または Silver で染色した。フコシルトランスフェラ
ーゼの等電点電気泳動は、既成のｐＩ範囲６〜９を有するゲル（Servalyt preco
tes 6-9, Serva）で行った。製造元のプロトコルにしたがってこのゲルを銀で染
色した。二次元電気泳動用に、レーンを泳動ゲルから切り出し、Ｓ−アルキル化
剤およびＳＤＳで処理し、上記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。
【００７９】 図２はＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの電気泳動ゲル
の例を示す。二次元電気泳動を左側に示し、一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを右側に示
す。Ａと記されたレーンは標準であり、Ｂと記されたレーンはＧｎＧｎ−セファ
ロースカラム由来のＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼであ
り、Ｃと記されたレーンは「精製」ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランス
フェラーゼ、すなわちＧＤＰ ヘキサノールアミン セファロース カラムのフラ
クションである。５４および５６ｋＤａの２つのバンドはトランスフェラーゼの
イソ型を表す。
【００８０】 図３は等電点電気泳動の結果を示す。レーンＡは銀で染色し、レーンＢでは、
トランスフェラーゼのイソ型の活性を試験した。この活性はＧＤＰ−フコースか
ら基質に転移されたフコースの％で示す。
【００８１】 実施例３ ペプチド配列決定 タンパク質の配列決定用に、Coomasie で染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲルからバンドを切り出し、カルボキシアミド−メチル化し、トリプシンで分
解した（Goerg et al. 1988, Electrophoresis, 9, 681-692 にしたがう）。こ
のトリプシンペプチドを、１.０ｘ２５０ｍｍ Ｖｙｄａｃ Ｃ１８での逆相ＨＰ
ＬＣ（４０℃、流速０.０５ｍＬ／分、ＨＰ １１００装置（Hewlett-Packard）
を用いる）で分離した。製造元のプロトコルにしたがい、単離されたペプチドを
Hewlett-Packard G1005 A タンパク質配列決定系で分離した。さらに、このペ
プチド混合物を MALDI-TOF MS を用いる Ingel 消化によって分析した（以下を
参照）。 図４は４トリプシンペプチド１〜４のＮ末端配列を示す（配列番号５〜８）。
最初の３ペプチドから出発し、プライマーＳ１、Ａ２およびＡ３を調製した（配
列番号９〜１１）。
【００８２】 実施例４： ３日生育させたリョクトウ胚軸から、Promega のＳＶ全ＲＮＡ単離系（the SV
Total RNA Isolating System）を用いて完全ＲＮＡを単離した。第一鎖ｃＤＮ
Ａを調製するため、完全ＲＮＡを４８℃で１時間、ＡＭＶ逆転写酵素およびオリ
ゴ（ｄＴ）プライマーとインキュベートした。ここでは Promega の逆転写系（t
he Reverse Transcription System）を用いた。第一鎖ｃＤＮＡをＰＣＲに付し
、ここではセンスおよびアンチセンスプライマーを組み合わせて用いた： 逆転写反応混合物１０μＬに以下のものを加えた： 各プライマー０.１mmol、０.１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍ
Ｍ トリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ９.０、５０ｍＭ ＫＣｌおよび０.１％ ト
リトン Ｘ−１００を含む５０μＬ。 ９５℃で２分間の最初の変性工程の後、９５℃で１分間、４９℃で１分間およ
び７２℃で２分間を４０サイクル経過した。最後の伸展（extension）工程は７
２℃で８分間行った。Invitrogen のＴＡクローニングキットを用いて、ＰＣＲ
産物をｐＣＲ２.１ベクターにサブクローニングし、配列決定した。このＰＣＲ
の産物は、長さ７４４ｂｐおよび７８０ｂｐの２つのＤＮＡ断片であり、両ＤＮ
Ａ断片は同一５’末端を有していた（また図７も参照）。これらの２つのＤＮＡ
断片から出発し、ＲＡＣＥキット（Gibco-BRL）を用いるｃＤＮＡ末端の５’お
よび３’高速増幅（ＲＡＣＥ）によってｃＤＮＡの喪失５’および３’領域を得
た。アンチセンスプライマーとしてはキットのユニバーサル増幅プライマーを用
い、センスプライマーとしては５’−ＣＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＧＧＴ
Ｔ−３’（配列番号１２）または５’−ＡＧＴＧＣＡＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＡＧ
ＡＡ−３’（配列番号１３）のいずれかを用いた。センスプライマーとして、ま
た、キットの短くされたアンカープライマーを用い、アンチセンスプライマーと
して５’−ＴＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＡＡＴＴＧＧＡＡＡＴ−３’（配列番号１
４）または５’−ＧＡＡＴＧＣＡＡＡＧＡＣＧＧＣＡＣＧＡＴＧＡＡＴ−３’（
配列番号１５）を用いた。
【００８３】 このＰＣＲは、上記条件下、アニーリング温度５５℃で行った。５’および３
’ＲＡＣＥ産物をｐＣＲ２.１ベクターにサブクローニングし、配列決定した：
サブクローン化断片の配列はジデスオキシヌクレオチド法（ABI PRISM Dye Term
inator Cycle Sequencing Ready reaction Kit および ABI PRISM 310 Genetic
analyser (Perkin Elmer)）を用いて決定した。ベクターｐＣＲ２.１にクローニ
ングされた生成物の配列決定用にはＴ７およびＭ１３正方プライマーを用いた。
コーディング領域の両鎖を the Vienna VBC Genomics-Sequencing Service（赤
外線ラベルプライマー (IRD700 および IRD800) および LI-COR Long Read IR 4
200 Sequencer (Lincoln, NE) を用いる）によって配列決定した。
【００８４】 図５ａおよび５ｂは、サイズが２１９８ｂｐで、１５３０ｂｐのオープンリー
ディングフレームを有する完全ｃＤＮＡを示す（配列番号１）。このオープンリ
ーディングフレーム（出発コドン（塩基対２１１−２１３）、終止コドン（塩基
対１７４０−１７４３））は、分子量５６.８ｋＤＡ、理論的ｐＩ値７.５１を有
する５１０アミノ酸のタンパク質をコードする。
【００８５】 図６ａおよび６ｂは、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ
のｃＤＮＡ由来のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。アスパラギン結合グリコ
シル化部位はＡｓｎ３４６およびＡｓｎ４２９である。
【００８６】 図７では、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ−ｃＤＮＡ
の模式図（上）および得られたコード化タンパク質の疎水指数（下）を示す。正
の疎水指数は疎水性の増加を意味する。その間には、完全ｃＤＮＡとの関連にお
いて２つの上記ＰＣＲ産物のサイズを示す。コーディング領域は帯 (beam) によ
って示し、「Ｃ」は推定の細胞質内領域をコードし、Ｔは推定の膜貫通領域をコ
ードし、そしてＧはトランスフェラーゼの推定のゴルジルーメン触媒領域をコー
ドする。「TMpred」（EMBnet, Switzerland）によってこのＤＮＡ配列を分析し
たところ、Ａｓｎ３６とＧｌｙ５４間の推定の膜貫通領域がわかった。この酵素
のＣ末端領域はおそらく触媒領域を含み、その結果、ゴルジ装置のルーメン内へ
指向するはずである。このことから、このトランスフェラーゼは、これまでに分
析された、糖タンパク質の生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼのす
べて（Joziasse, 1992, Glycobiology 2, 271-277）と同様にＩＩ型膜貫通タン
パク質であると思われる。グレー領域は４つのトリプシンペプチドを表し、六角
形は潜在的Ｎ−グリコシル化部位を表す。ＮＣＢＩを介してアクセス可能なすべ
てのデータバンクにおけるＢＬＡＳＴＰサーチによりＧｌｃＮＡｃ−α１,３−
フコシルトランスフェラーゼと他のα１,３／４−フコシルトランスフェラーゼ
、例えばヒトフコシルトランスフェラーゼＶＩの類似性が示された。１８〜２１
％（SIM-LALN-VIEW, Expase, Switzerland）において、トータルの類似性は任意
の有意さを超えた。それにもかからわず、３５アミノ酸の配列領域（配列番号４
）は他のα１,３／４−フコシルトランスフェラーゼと非常に高い相同性を示す
（図８）。この配列領域は配列番号２のＧｌｕ２６７とＰｒｏ３０１間に位置す
る。
【００８７】 実施例５： 昆虫細胞における組換えＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラー
ゼの発現 細胞質内および膜貫通領域を含む、推定のＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシル
トランスフェラーゼのエンコーディング領域を、the Expand High Fidelity PCR
System (Boehringer Mannheim) により、正方（forward）プライマー：５’−
ＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＡＴＴＧＡＡＴＧＡＴＧ−３’（配列番号１６）お
よび逆方（reverse）プライマー：５’−ＣＣＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＣＡＴＴ
ＴＡＧＣＧＣＡＴ−３’（配列番号１７）を用いて増幅した。このＰＣＲ産物を
ＰａｔＩおよびＢａｍＨＩで二重消化し、あらかじめＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ
で消化されたアルカリホスファターゼ処理バキュロウイルストランスファーベク
ターｐＶＬ１３９３にサブクローニングした。相同組換えを確実にするために、
トランスファーベクターを Baculo Gold viral DNA (PharMingen, Sand Diego,
CA) とともに、リポフェクチンを含むＩＰＬ−４１培地のＳｆ９昆虫細胞に同時
トランスフェクションした。２７℃で５日間インキュベートした後、組換えウイ
ルスを含む種々の容量の上清をＳｆ２１昆虫細胞の感染に用いた。５％ ＦＣＳ
を含むＩＰＬ−４１培地中２７℃で４日間インキュベートした後、Ｓｆ１細胞を
収穫し、リン酸緩衝化塩溶液で２回洗浄した。２％ トリトン Ｘ−１００を含む
２５ｍＭ トリス ＨＣｌバッファー（ｐＨ７.４）にこの細胞を再懸濁し、氷上
で超音波処理して破砕した。
【００８８】 実施例６： ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ活性に関するアッセイ ホモジネートおよび細胞上清をＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフ
ェラーゼに関してアッセイした。盲検試料は、タバコ−ＧｌｃＮＡｃ−トランス
フェラーゼＩ（Strasser et al., 1999, Glycobiology, in the process of pri
nting）をコードする組換えバキュロウイルスを用いて実行した。
【００８９】 図９は組換えＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼおよび負
のコントロールの酵素活性の測定値を示す。同時トランスフェクションされた細
胞およびその上清の酵素活性は、最大で、負のコントロールの酵素活性より３０
倍高かった。組換えトランスフェラーゼの不存在下で測定可能なこの内因性の活
性は、実質的に昆虫−α１,６−フコシルトランスフェラーゼ由来であり、その
うち低いパーセンテージのみがＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェ
ラーゼ由来である。したがって、組換えバキュロウイルス由来のＧｌｃＮＡｃ−
α１,３−フコシルトランスフェラーゼの増加は１００倍を大きく超える。活性
を２−(Ｎ−モルホリノ)−エタンスルホン酸−ＨＣｌバッファー中で測定した場
合、この酵素はｐＨ７.０付近で広い最大活性を示した。表２において明らかで
あるように、２価のカチオン、特にＭｎ２＋を加えると組換えトランスフェラー
ゼの活性が高められる。
【００９０】 表２
【表２】
【００９１】 表３は、標準的試験条件下では、用いられるアクセプターのうち、ＧｎＧｎ−
ペプチドが最も高い包含率を示し、次いでＧｎＧｎＦ６eptide およびＭ５Ｇｎ
−Ａｓｎがそれにせまることを表す。３−結合マンノースの還元ＧｌｃＮＡｃ末
端を含まないＭＭペプチドへの転移は見られなかった。この構造はコアのフコシ
ルトランスフェラーゼに必要であると思われる。さらに、組換えトランスフェラ
ーゼは、一般に用いられるアクセプター、血液型の決定に用いられるα,３／４
−フコシルトランスフェラーゼ（これはフコースをオリゴ糖の非還元末端のＧｌ
ｃＮＡｃに転移させる）と比較して不活性であった。アクセプター基質ＧｎＧｎ
、ＧｎＧｎＦ６ペプチド、Ｍ５Ｇｎ−Ａｓｎおよびドナー基質ＧＤＰフコースに
関する見かけのＫｍ−値はそれぞれ、０.１９、０.１３、０.２３および０.１１
であると評価された。この分子の構造を図１０ａおよび１０ｂに示す。 表３
【表３】
【００９２】 実施例７： フコシルトランスフェラーゼ生成物の質量分析 ダブシル化ＧｎＧｎヘキサペプチド（２nmol）を、組換えＧｌｃＮＡｃ−α,
３−フコシルトランスフェラーゼ（０.０８ｍＵ）を含む昆虫細胞のホモジネー
トと、非放射能性ＧＤＰ−Ｌ−フコース（１０nmol）、２ (Ｎ−モルホリノ)−
エタンスルホン酸−ＨＣｌバッファー、トリトン Ｘ−１００、ＭｎＣｌ２、Ｇ
ｌｃＮＡｃおよびＡＭＰの存在下でインキュベートした。負のコントロールは盲
検試料に関する感染昆虫細胞のホモジネートを用いて行った。試料を３７℃で１
６時間インキュベートし、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析法によって分析した。質
量分析はＤＹＮＡＭＯ (Therrmo BioAnalysis, Santa Fe NM)、動的抽出（dynam
ic extraction、後期抽出（late extraction）の同義語）を可能にするＭＡＬＤ
Ｉ−ＴＯＦ ＭＳで行った。２つのタイプの試料マトリックス調製物を用いた：
ペプチドおよびダブシル化糖ペプチドを５％ギ酸に溶解し、部分試料を標的にア
プライし、空気乾燥し、１％ α−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸を注いだ。
ピリジルアミノ化グリカン、還元オリゴ糖および非誘導化糖ペプチドを水で希釈
し、標的にアプライし、空気乾燥した。２％ ２.５−ジヒドロキシ安息香酸を加
えた後、減圧して試料を直ちに乾燥した。
【００９３】 図１１はこれらの試料の質量スペクトルを示し、Ａは負のコントロールであり
：メインのピーク（Ｓ）はダブシル−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−(ＧｌｃＮＡｃ
４Ｍａｎ３)Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ 基質を示し、計算された [Ｍ＋Ｈ]＋値は
２２６２.３である。この基質はまた、ナトリウム添加産物として、ならびにダ
ブシル基のＡｚｏ官能基の断片化によって形成されたより小さいイオンとして（
Ｓ★）で現れる。小さい生成物の量（Ｐ、[Ｍ＋Ｈ]＋＝２４０８.４）は内因性
α１,６−フコシルトランスフェラーゼの結果である。ｍ／ｚ＝２４２４.０のピ
ークは基質の不完全な脱ガラクトシル化を示す。質量スペクトルＢは組換えα１
,３−フコシルトランスフェラーゼを含む試料を示す。メインのピーク（Ｐ）は
フコシル化産物を表し、（Ｐ★）はその断片化イオンを表す。
【００９４】 さらに両試料の部分試料を互いに混合し、同様の濃度の基質および生成物を得
た（試料Ａ）。この混合物を、１０ｍＵのＮ−グリコシダーゼＡ（試料Ｂ）を含
む０.１Ｍ 酢酸アンモニウム、ｐＨ４.０または１００ｍＵ（１Ｕは１分当たり
基質１mmolを加水分解する）のＮ−グリコシダーゼＦ（試料Ｃ）を含む５０ｍＭ
トリス／ＨＣｌ、ｐＨ８.５で希釈した。２および２０時間後、これらの混合物
の少量の部分試料を採り、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって分析した。
【００９５】 図１２では、試料Ａ、ＢおよびＣの３つの質量スペクトルを示す。未消化試料
Ａは２つのメインピークを示す：基質は２２６１.４ｍ／ｚ、フコシル化産物は
２４０７.７ｍ／ｚ。真ん中の曲線は試料Ｂの質量スペクトルを示す。これは両
糖ペプチドを加水分解するＮ−グリコシダーゼＡで処理されたものである。９６
３.３２のピークは脱グリコシル化産物を構成する。下の曲線は試料Ｃの質量ス
ペクトルを示す。Ｎ−グリコシダーゼＦはα１,３−フコシル化基質を加水分解
することができないので、スペクトルは、２４０６.７ｍ／ｚのフコシル化産物
のピークを有し、一方、加水分解された基質のピークは９６３.０８ｍ／ｚに現
れる。
【００９６】 実施例８： ピリジルアミノ化フコシルトランスフェラーゼ生成物のＨＰＬＣ−分析 上記２つの試料（フコシル化産物および負のコントロール）をＮ−グリコシダ
ーゼＡで消化した。得られたオリゴ糖をピリジル−アミノ化し、逆相ＨＰＬＣに
よって分析した（Wilson et al., 1998, glycobiology 8, 651-661; Kubelka et
al.,1994, Arch. Biochem. Giophys. 308, 148-157; Hase et al., 1984, J. B
iochem. 95, 197-203）。
【００９７】 図１３中、上の図Ｂは負のコントロールを表し、残留基質（ＧｎＧｎ−ペプチ
ド）に加えてα１,６−フコシル化産物が見られる。Ａは実質的に保持時間がよ
り短い時点でのピークを有し、これはＧｌｃＮＡｃ−α１,３と結合フコースの
減少を示すものである。
【００９８】 下の図では、Ｎ−アセチル−βグルコサミニダーゼ（N-acetyl-βglucosamini
dase）による消化前（曲線Ａ）および後（曲線Ｂ）の単離されたトランスフェラ
ーゼ生成物をＭＭＦ３ミツバチホスホリパーゼＡ２（曲線Ｃ）と比較した。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 溶出した個々のフラクションについてのタンパク質の量および
酵素活性を測定し、曲線で表したものである；
【図１ｂ】 溶出した個々のフラクションについてのタンパク質の量および
酵素活性を測定し、曲線で表したものである；
【図２】 ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの電気泳
動ゲル分析を表したものである；
【図３】 アイソフオーム個々の等電点電気泳動およびトランスフェラーゼ
活性を測定した結果を表したものである；
【図４】 トリプシンペプチド４つ(ｔ−４)のＮ末端配列と同様にプライマ
ー３つ、Ｓ１、Ａ２およびＡ３のＤＮＡ配列を示したものである；
【図５ａ】 α１,３−フコシルトランスフェラーゼのｃＤＮＡ配列を示し
たものである；
【図５ｂ】 α１,３−フコシルトランスフェラーゼのｃＤＮＡ配列を示し
たものである；
【図６ａ】 それから派生したα１,３−フコシルトランスフェラーゼのア
ミノ酸配列を示したものである；
【図６ｂ】 それから派生したα１,３−フコシルトランスフェラーゼのア
ミノ酸配列を示したものである；
【図７】 α１,３−フコシルトランスフェラーゼと同様にアミノ酸残基の
疎水性の模式表示である；
【図８】 種々のフコシルトランスフェラーゼの保存モチーフの比較を表し
たものである；
【図９】 α１,３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェク
トした昆虫細胞のフコシルトランスフェラーゼ活性とネガティブコントロールの
フコシルトランスフェラーゼ活性との比較を表したものである；
【図１０ａ】 α１,３−フコシルトランスフェラーゼの異なる受容体の構
造を示したものである；
【図１０ｂ】 α１,３−フコシルトランスフェラーゼの異なる受容体の構
造を示したものである；
【図１１】 質量スペクトルを表したものである；
【図１２】 質量スペクトルを表したものである；および
【図１３】 ＨＰＬＣの結果を表したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/08 Ｃ１２Ｎ 9/10 ４Ｂ０６５ 43/00 Ｃ１２Ｐ 19/44 ４Ｃ０８４ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 19/44 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ Ａ６１Ｋ 37/52 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 4B024 AA08 AA11 BA10 CA04 CA11 DA01 DA02 EA02 HA12 4B050 CC03 DD13 HH01 KK01 LL03 LL10 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR32 QR55 QS15 QS34 4B064 AG01 CA21 CB30 CD02 DA13 4B065 AA87Y AA88X AA88Y AA90X AB01 AC14 BA02 CA29 CA46 4C084 AA01 NA14 ZB13

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 塩基対２１１から塩基対１７４０までのオープンリーディン
    グフレームを有する配列番号１に記載の配列を含む、またはこの上記配列と少な
    くとも５０％の相同性を有する、または厳格な条件下でこの上記配列とハイブリ
    ダイズする、またはこの上記ＤＮＡ配列とは遺伝コードが縮重している配列を含
    む、ことを特徴とするＤＮＡ分子であって、該配列がフコシルトランスフェラー
    ゼ活性を有する植物タンパク質をコードするか、あるいはそれと相補的である該
    ＤＮＡ分子。
  2. 【請求項２】 ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ活性
    、特にコア−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を
    コードすることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
  3. 【請求項３】 配列番号１に記載の配列と少なくとも７０〜８０％、特に好
    ましくは少なくとも９５％の相同性を有することを特徴とする、請求項１または
    ２に記載のＤＮＡ分子。
  4. 【請求項４】 ２１５０〜２２５０個、特に２１９８個の塩基対を含むこと
    を特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ分子。
  5. 【請求項５】 配列番号３に記載の配列を含むか、あるいはこの配列と少な
    くとも８５％、特に少なくとも９５％の相同性を有する配列または厳格な条件下
    でこの配列とハイブリダイズする配列またはこのＤＮＡ配列とは遺伝コードが縮
    重している配列を含むことを特徴とするＤＮＡ分子。
  6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ分子の部分配列を含
    み、サイズが２０〜２００、好ましくは３０〜５０塩基対であることを特徴とす
    るＤＮＡ分子。
  7. 【請求項７】 検出可能なマーカー物質と共有結合していることを特徴とす
    る、請求項１〜６のいずれかに記載のＤＮＡ分子。
  8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ分子、または少なく
    とも２０塩基対を有する種々の長さのその複数の部分を含むことを特徴とする生
    物学的機能性ベクター。
  9. 【請求項９】 請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ分子または種々の長
    さのその複数の部分であって、そのプロモーターに対して逆向きに配向するもの
    を含むことを特徴とする生物学的機能性ベクター。
  10. 【請求項１０】 該ＤＮＡ配列が欠失、挿入および／または置換変異を含む
    ことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ分子。
  11. 【請求項１１】 リボザイムをコードするＤＮＡ分子であって、請求項１〜
    ７のいずれかに記載のＤＮＡ分子の配列セクションと相補的な、それぞれ少なく
    とも１０〜１５塩基対の長さを有する２つの配列セクションを有し、これにより
    該リボザイムが天然ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼＤＮ
    Ａ分子によって転写されるｍＲＮＡと複合体形成し、該ｍＲＮＡを切断すること
    を特徴とするＤＮＡ分子。
  12. 【請求項１２】 請求項１０または１１に記載のＤＮＡ分子を含むことを特
    徴とする生物学的機能性ベクター。
  13. 【請求項１３】 昆虫または植物細胞、特に胚軸細胞からＲＮＡを単離し、
    逆転写酵素およびプライマーを加えた後、該ＲＮＡを用いて逆転写を行うことを
    特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ分子を含むｃＤＮＡの調製
    方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ分子をベクターに
    クローニングした後、これを宿主細胞または宿主にトランスフェクトし、トラン
    スフェクトされた宿主細胞の選択および増幅によって、活性なＧｌｃＮＡｃ−α
    １,３−フコシルトランスフェラーゼを発現するセルラインを得ることを特徴と
    する、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼのクローニング方
    法。
  15. 【請求項１５】 ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの
    産生が抑制されているか、あるいは完全に停止されている組換え宿主細胞、特に
    植物もしくは昆虫細胞、または植物若しくは昆虫それぞれの調製方法であって、
    該宿主細胞、または植物若しくは昆虫それぞれに、請求項８、９または１２に記
    載のベクターのうち少なくとも１つを挿入することを特徴とする方法。
  16. 【請求項１６】 組換え宿主細胞、特に植物もしくは昆虫細胞、または植物
    若しくは昆虫それぞれの調製方法であって、該宿主細胞、または植物若しくは昆
    虫それぞれのゲノムに、請求項１０に記載のＤＮＡ分子を変異されていない相同
    配列の位置において挿入することを特徴とする方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１５または１６に記載の方法によって調製され、そ
    のＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ産生が抑制されている
    か、あるいは完全に停止されていることを特徴とする組換え植物または植物細胞
    。
  18. 【請求項１８】 請求項１５または１６に記載の方法によって調製され、そ
    のＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ産生が抑制されている
    か、あるいは完全に停止されていることを特徴とする組換え昆虫または昆虫細胞
    。
  19. 【請求項１９】 請求項１〜６のいずれかに記載のＤＮＡ分子の配列と相補
    的な塩基配列およびその部分配列を含むことを特徴とするＰＮＡ分子。
  20. 【請求項２０】 請求項１〜６のいずれかに記載のＤＮＡ分子の配列に対応
    する塩基配列およびその部分配列を含むことを特徴とするＰＮＡ分子。
  21. 【請求項２１】 ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの
    発現が転写または翻訳レベルでブロックされている植物若しくは昆虫、または細
    胞、特に植物もしくは昆虫細胞それぞれの作成方法であって、請求項１９または
    ２０に記載のＰＮＡ分子を細胞に挿入することを特徴とする方法。
  22. 【請求項２２】 組換え糖タンパク質の調製方法であって、請求項１７また
    は１８に記載の系、または請求項２１に記載の方法によって調製される植物若し
    くは昆虫または細胞それぞれを、その糖タンパク質を発現する遺伝子でトランス
    フェクトし、組換え糖タンパク質を発現させることを特徴とする方法。
  23. 【請求項２３】 組換えヒト糖タンパク質の調製方法であって、請求項１７
    または１８に記載の系、または請求項２１に記載の方法によって調製される植物
    若しくは昆虫または細胞それぞれを、その糖タンパク質を発現する遺伝子でトラ
    ンスフェクトし、組換え糖タンパク質を発現させることを特徴とする方法。
  24. 【請求項２４】 医療用の組換えヒト糖タンパク質の調製方法であって、請
    求項１７または１８に記載の系、または請求項２１に記載の方法によって調製さ
    れた植物若しくは昆虫または細胞それぞれを、その糖タンパク質を発現する遺伝
    子でトランスフェクトし、組換え糖タンパク質を発現させることを特徴とする方
    法。
  25. 【請求項２５】 植物または昆虫系において請求項２２に記載の方法によっ
    て調製され、そのペプチド配列が、フコシルトランスフェラーゼを減退させてい
    ない植物または昆虫系において発現されるタンパク質中に存在するα１,３−結
    合フコース残基の５０％未満、特に２０％未満、特に好ましくは０％を有するこ
    とを特徴とする組換え糖タンパク質。
  26. 【請求項２６】 植物または昆虫系において請求項２３に記載の方法によっ
    て調製され、そのペプチド配列が、フコシルトランスフェラーゼを減退させてい
    ない植物または昆虫系において発現されるタンパク質中に存在するα１,３−結
    合フコース残基の５０％未満、特に２０％未満、特に好ましくは０％を有するこ
    とを特徴とする組換えヒト糖タンパク質。
  27. 【請求項２７】 植物または昆虫系において請求項２４に記載の方法によっ
    て調製され、そのペプチド配列が、フコシルトランスフェラーゼを減退させてい
    ない植物または昆虫系において発現されるタンパク質中に存在するα１,３−結
    合フコース残基の５０％未満、特に２０％未満、特に好ましくは０％を有するこ
    とを特徴とする医療用の組換えヒト糖タンパク質。
  28. 【請求項２８】 請求項２５〜２７のいずれかに記載の組換え糖タンパク質
    を含むことを特徴とする医薬組成物。
  29. 【請求項２９】 試料中のＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェ
    ラーゼをコードするＤＮＡ分子の選択方法であって、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−
    フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子と結合する、請求項７に記
    載のＤＮＡ分子を該試料に加えることを特徴とする方法。
  30. 【請求項３０】 該試料が植物または昆虫生物のゲノムＤＮＡを含むことを
    特徴とする、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 請求項２９または３０に記載の方法によって選択され、次
    いで試料から単離されることを特徴とする、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシル
    トランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子。
  32. 【請求項３２】 ６.０〜９.０の範囲、特に６.８〜８.２の範囲のｐＩ値を
    有するイソ型を有することを特徴とする、請求項１４に記載の方法によってクロ
    ーニングされるＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの調製物
    。
  33. 【請求項３３】 ６.８、７.１および７.６のｐＩ値を有するイソ型を有す
    ることを特徴とする、請求項３２に記載の調製物。
  34. 【請求項３４】 ヒトまたは他の脊椎動物の糖タンパク質の植物化炭水化物
    単位の調製方法であって、炭水化物単位または糖タンパク質それぞれを含む試料
    にフコース単位および請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ分子によってコー
    ドされるＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼを加え、このＧ
    ｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼによってフコースを該炭水
    化物単位または該糖タンパク質それぞれとα１,３位で結合させることを特徴と
    する方法。
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