SK286416B6 - Gén na fukozyltransferázu - Google Patents

Gén na fukozyltransferázu Download PDF

Info

Publication number
SK286416B6
SK286416B6 SK1118-2001A SK11182001A SK286416B6 SK 286416 B6 SK286416 B6 SK 286416B6 SK 11182001 A SK11182001 A SK 11182001A SK 286416 B6 SK286416 B6 SK 286416B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
sequence
dna molecule
glcnac
fucosyltransferase
plant
Prior art date
Application number
SK1118-2001A
Other languages
English (en)
Other versions
SK11182001A3 (sk
Inventor
Friedrich Altmann
Original Assignee
Friedrich Altmann
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=3486087&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK286416(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Friedrich Altmann filed Critical Friedrich Altmann
Publication of SK11182001A3 publication Critical patent/SK11182001A3/sk
Publication of SK286416B6 publication Critical patent/SK286416B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Je opísaná molekula DNA, ktorá obsahuje sekvenciupodľa SEQ ID NO: 1 s otvoreným čítacím rámcom od bázového páru 211 po bázový pár 1 740 alebo má aspoň 50 % homológiu s uvedenou sekvenciou, alebo za stringentných podmienok hybridizuje s uvedenou sekvenciou, alebo obsahuje sekvenciu, ktorá je dôsledkom genetického kódu degenerovaná k uvedenej sekvencii, pričom sekvencia kóduje rastlinný proteín s fukozyltransferázovou aktivitou alebo je k takejtokomplementárna.

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka polynukleotidov, ktoré kódujú fukozyltransferázu. Ďalej sa vynález týka čiastkových sekvencií týchto polynukleotidov, ako aj vektorov s týmito polynuklcotidmi, rekombinovaných hostiteľských buniek, rastlín a hmyzu transfekovaného polynukleotidmi, alebo z nich odvodenou DNA, ako aj glykoproteínov produkovaných v týchto systémoch.
Doterajší stav techniky
Glykoproteíny sa vyznačujú mnohorakosťou a komplexnosťou sacharidových jednotiek, pričom zloženie a usporiadanie sacharidov je charakteristické pre rôzne organizmy. Oligosacharidové jednotky glykoproteínov majú celý rad úloh, sú napr. dôležité pri regulácii látkovej výmeny, podieľajú sa na sprostredkovaní medzibunkových interakcii, určujú cirkulačnú dobu proteínov v krvnom obehu a sú určujúce pri rozoznávaní epitopov v reakciách protilátok s antigénmi.
Glykozylácia glykoproteínov sa začína v endoplazmatickom retikule (ER), kde sa oligosacharidy pripájajú prostredníctvom N-glykozidickej väzby na bočné reťazce asparagínu, alebo prostredníctvom O-glykozidickej väzby na bočné reťazce serínu alebo treonínu. Oligosacharidy s N-glykozidickou väzbou obsahujú spoločné jadro z pentasacharidovej jednotky, ktorá sa skladá z troch manózových a dvoch N-acetylglukozaminových zvyškov. Na ďalšiu modifikáciu sacharidových jednotiek sa proteíny transportujú z ER do Golgiho komplexu. Štruktúra glykoproteínov, ktoré majú oligosacharidy viazané N-glykozidickou väzbou, je daná ich konformáciou a zložením glykozyltransferáz v tých kompartmentoch Golgiho aparátu, v ktorých dochádza k ich spracovaniu.
Ukázalo sa, že v Golgiho komplexe niektorých buniek rastlín a hmyzu sa pentasacharidové jadro substituuje xylózou a fukózou viazanou ccl,3 väzbou (P. Lerouge et al. 1998 Plánt Mol. Biol. 38, 31-48; Rayon et al. 1998 L. Exp. Bot. 49, 1463-1472). Vytvorený heptasacharid „MMXFJ“ je hlavným typom oligosacharidu v rastlinách (Kurosaka et al. 1991 J. Biol. Chem., 266, 4168-4172). Takéto al,3-fukózové zvyšky viazané na sacharidové jadro obsahuje napr. v chrenová peroxidáza, karotén β-fruktozidáza, lecitín Erythrina cristagalli, ako aj fosfolipáza A2 jedu včelieho jedu alebo neuronálne membránové glykoproteíny embryí hmyzu. Tieto štruktúry sa nazývajú aj komplexné N-glykány, prípadne manózo-deficientné alebo skrátené N-glykány. Ďalej sa môžu cc-manozylové zvyšky nahrádzať za GlcNAc, na ktorých je naviazaná galaktóza a fukóza, takže vzniká štruktúra zodpovedajúca ľudskému Lewis a epitopu (Melo et al. 1997 FEBS Lett. 415, 186-191; Fitchette-Laine et al. 1997 Plánt J. 12, 1411-1417).
Ani xylóza, ani fukóza s cti,3 väzbou sa nenachádzajú v glykoproteinoch cicavcov. Ukázalo sa, že jadro s a 1,3-fukózou hrá dôležitú úlohu pri rozpoznávaní epitopu protilátkami proti rastlinným alebo hmyzím oligosacharidom s N-väzbou (I. B. H. Wilson et al., Glycobiology Vol. 8, č. 7, 651-661, 1998) a tým spúšťa imunitnú odpoveď v ľudskom alebo zvieracom tele proti týmto oligosacharidom. Zdá sa, že Ctl,3-fukózový zvyšok je tiež jednou z hlavných príčin rozšírenej krížovej alergickej reakcie medzi rozličnými alergénmi rastlinného a hmyzieho pôvodu (Tretter et al., Int. Árch. Allergy Immunol. 1993: 102:259-266) a nazýva sa aj „krížovo reagujúci determinant“ (CCD). Pri štúdiu epitopov paradajok a peľov tráv sa tiež zistili fukózové zvyšky s a 1,3 väzbou ako spoločné determinanty, ktoré spôsobujú často sa vyskytujúcu spoločnú alergiu na paradajky a peľ tráv (Petersen et al. 1996, J. Allergy Clin. Immunol., Vol 98, 4; 805-814). Výskyt CCD zahmlieva diagnózu alergií prostredníctvom často sa vyskytujúcich krížových reakcii.
Imunologické reakcie, ktoré v ľudskom tele vyvolávajú rastlinné proteíny, sú hlavným problémom pri medicínskom použití rekombinantných ľudských proteínov produkovaných v rastlinách. Na vyriešenie tohto problému by bolo potrebné zabrániť ctl,3-fukozylácii jadra. V jednej štúdii sa podarilo ukázať, že oligosacharidy obsahujúce namiesto L-fukózy (6-deoxy-L-galaktóza) L-galaktózu, si zachovávajú úplnú biologickú aktivitu (E. Zablackis et al. 1996, Science, Vol 272). Podľa inej štúdie bol izolovaný mutant rastliny Arabidopsis thaliana, ktorému chýba N-acetyl-glukozaminyl-transferáza, ktorá je prvým enzýmom v biosyntéze komplexných glykánov. V týchto mutantoch je zablokovaná biosyntéza komplexných glykoproteínov. Napriek tomu sú tieto mutované rastliny za určitých podmienok schopné normálneho vývoja (A. Schaewen et al. 1993, Plánt Physiol. 102; 1109-1118).
Ak sa má cielene zamedziť viazaniu ccl,3-fukózy na jadro (Core) oligosacharidu bez toho, aby sa zasiahlo do iných glykozylačných krokov, musel by sa zablokovať len enzým, ktorý je priamo zodpovedný za túto špecifickú glykozyláciu, t. j. Core-al,3-fukozyltransferáza. Po prvýkrát bola izolovaná z bôbov Mungo a následne charakterizovaná, pričom sa zistilo, že aktivita tohto enzýmu závisí od prítomnosti neredukovaných zakončení GlcNAc (Staudacher et al., 1995, Glycoconjugate J. 12, 780-786). Táto transferáza, ktorá sa nachádza len v bunkách rastlín a hmyzu, ale nie v bunkách ľudí alebo iných stavovcov, by sa musela cielene inaktivovať alebo potlačiť, aby bolo možné vyrábať ľudské proteíny v rastlinách, rastlinných bunkách alebo v hmyze alebo hmyzích bunkách bez toho, aby obsahovali imunogénny epitop.
Publikácia, ktorú napísal John M. Búrke „Dláždenie cesty pre ribozýmy (Clearing the way for ribozymes)“ (Náture Biotechnology 15:414-415; 1997), sa týka všeobecného spôsobu činnosti ribozýmov.
Publikácia od autorov Pooga et al. „PNA konštrukty prenikajúce do buniek regulujú hladinu galanínového receptora a modifikujú prenos bolesti in vivo (Celí penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and modify pain transmission in vivo)“ (Náture Biotechnology 16:857-861; 1998) sa týka molekúl PNA vo všeobecnosti, špecificky sa zaoberá molekulou PNA komplementárnou k mRNA pre ľudský galanínový receptor typu 1.
US 5 272 066 A sa týka postupu na zmenu eukaryotických a prokaryotických proteinov s cieľom predĺžiť ich cirkuláciu in vivo. Dochádza pri tom k zmene viazaných oligosacharidov pomocou rozličných enzýmov vrátane GlcNAc-α 1 >3 (4)-fukozyltransferázy.
EP 0 643 132 sa týka klonovania al,3-fukozyltransferázy izolovanej z ľudských buniek (ΊΉΡ-1). Sacharidové reťazce opísané v publikácii zodpovedajú ľudským oligosacharidom Sialyl Lewis x- a Sialyl Lewis a-. Špecifickosť enzýmu z ľudských buniek je iná, než fukozyltransferáza z rastlinných buniek.
Podstata vynálezu
Cieľom predkladaného vynálezu je klonovať a sekvenovať gén kódujúci rastlinnú fukozyltransferázu, pripraviť vektory obsahujúce tento gén, úseky DNA z tohto génu alebo zmenené, alebo z neho odvodené úseky DNA, transfekovať týmito vektormi rastliny alebo hmyz, ako aj ich bunky, produkovať glykoproteíny bez normálne sa vyskytujúceho jadra s ccl,3-fukózou a poskytnúť tomu zodpovedajúce postupy.
Vyriešením úlohy podľa tohto vynálezu bude molekula DNA, ktorá obsahuje sekvenciu podľa SEQ ID No: 1 (v tejto publikácii sa používa kód IUPAC, v ktorom „N“ označuje inozín) s otvoreným čítacím rámcom od bázového páru 211 po bázový pár 1740, alebo vykazuje aspoň 50 % homológiu k uvedenej sekvencií, alebo hybridizuje s uvedenou sekvenciou za stringentných podmienok, alebo obsahuje sekvenciu, ktorá je degenerovaná vo vzťahu k uvedenej DNA v dôsledku genetického kódu, pričom táto sekvencia kóduje rastlinný proteín s fukozyltransferázovou aktivitou alebo je k nej komplementárna.
Takáto sekvencia, ktorá nebola doteraz opísaná, sa vynikajúco hodí na ľubovoľné experimenty, analýzy a produkčné procesy súvisiace s rastlinnou fukozyltransferázovou aktivitou. Zaujímavá je sekvencia DNA, ako aj proteín kódovaný takouto sekvenciou, najmä však sekvencia DNA zabraňujúca fukozyltransferázovej aktivite.
Otvorený čítací rámec sekvencie č. SEQ ID No: 1 kóduje proteín zložený z 510 aminokyselinových zvyškov s teoretickou molekulovou hmotnosťou 56,8 kDa, pričom sa predpokladá existencia transmembránového segmentu medzi Asn36 a Gly54. Vypočítaná hodnota pl proteínu kódovaného sekvenciou podľa SEQ ID No: 1 je 7,51.
Aktivita rastlinnej fukozyltransferázy sa dá dokázať a merať prostredníctvom postupu, pri ktorom sa fukozyltransferáza pridá k zmesi označenej fukózy a akceptora (napr. glykoproteínu) viazaného na nosič, napr. Sepharose. Po určitej reakčnej dobe sa vzorka prepláchne a meria sa obsah naviazanej fukózy. Fukozyltransferázová aktivita sa považuje za pozitívnu, keď je nameraná hodnota aktivity minimálne o 10-20 %, v ideálnom prípade však aspoň o 30-50 % väčšia než aktivita nameraná v negatívnej kontrolnej vzorke. Štruktúru glykoproteínu je možné navyše overiť prostredníctvom HPLC. Takéto postupy zodpovedajú súčasnému stavu technológií (Staudacher et al. 1998, Anál. Biochem. 246, 96-101; Staudacher et al. 1991, Eur. J. Biochem. 199, 745-751).
Je možné napríklad pridať fukozyltransferázu k vzorke zloženej z rádioaktívne označenej fukózy a akceptora, ktorým je napr. GlcNAcpi-2Manal-3(GlcNAcpi-2Manal-6)Manpi-4GlcNAcpi-4GlcNAcpi-Asn. Po určitej reakčnej dobe sa vzorka prečistí chromatografiou na anexe a odmeria sa obsah viazanej fukózy. Aktivita sa dá vypočítať z rozdielu množstva rádioaktivity nameranej vo vzorke s akceptorom a množstva rádioaktivity nameranej v negatívnej kontrolnej vzorke bez akceptora. Fukozyltransferázová aktivita sa považuje za pozitívnu, ak je nameraná rádioaktivita aspoň o 30-40 % vyššia, než rádioaktivita nameraná v negatívnej kontrolnej vzorke.
Vytváranie párov z dvoch molekúl DNA sa dá ovplyvňovať výberom teploty a iónovej sily vzorky. Za stringentné podmienky sa považujú v zmysle tohto vynálezu také podmienky, ktoré umožňujú vznik exaktnej, stringentnej väzby. Molekuly DNA sa hybridizujú napr. v prítomnosti 7 % dodecylsíranu sodného (SDS), 0,5 M NaPO4 pH 7,0; 1 mM EDTA pri 50 °C a premývajú sa v roztoku 1 % SDS pri 42 °C.
Či majú sekvencie aspoň 50 % homológiu so sekvenciou č. SEQ ID No: 1, sa dá zistiť prostredníctvom programu FastDB z Európskeho laboratória pre molekulárnu biológiu (EMBL) alebo databázy SWISSPROT.
V ideálnom prípade kóduje sekvencia molekuly DNA v zmysle tohto vynálezu proteín s GlcNAc-al,3-fukozyltransferázovou aktivitou, najmä však s Core-al,3-fukozyltransferázovou aktivitou. Ako už bolo uvedené, vyskytuje sa Core-al,3-fukozyltransferázová aktivita v bunkách rastlín a hmyzu, nie však v ľudskom organizme, takže je práve táto sekvencia DNA vhodná na použitie v špecifických analýzach týkajúcich sa fukozyltransferázy, ako aj v produkčných postupoch. Pod Core-ocl,3-fukozyltransferázou sa rozumie najmä GlcNAc-al,3-fukozyltransferáza viazaná na GDP-L-Fuc:Asn. V rámci predkladaného vynálezu sa pod al,3-fukozyltransferázou rozumie spravidla Core-al,3-fukozyltransferáza. Na uvedené meranie aktivity slúžia najmä akceptory s neredukujúcim GlcNAc koncom. Takýmito akceptormi sú napríklad Glc-ΝΑοβ 1 -2Manal -3(GlcNAcP 1 -2Manal -6)ManP 1 -4GlcNAcP 1 -4GlcNAcP 1 -Asn, GlcNAcP 1 -2Mana 1 -3 (GlcNAcP 1 -2Mana 1 -6)ManP 1 -4GlcNAcp 1 -4(Fuca 1 -6(GlcNAcP 1 -Asn a GlcNAcP 1 -2Manal -3 [Manot 1 -3(Manal-6)Man al-6]Manpi-4GlcNAcpi-4GlcNAcpi-Asn. Či je fukóza naviazaná, to sa dá zistiť meraním necitlivosti na N-glykozidázu F a dokázať pomocou hmostnostnej spektrometrie.
Uprednostňuje sa, aby mala molekula DNA v zmysle vynálezu aspoň 70-80 % homológiu, v ideálnom prípade však aspoň 95 % homológiu k sekvencii podľa č. SEQ ID No: 1. Táto sekvencia kóduje obzvlášť aktívnu GlcNAc-al,3-fukozyltransferázu. Keďže sa sekvencia DNA môže viac či menej líšiť podľa druhu rastliny alebo hmyzu, vykazuje sekvencia, ktorá má napr. 70 % homológiu so sekvenciou podľa SEQ ID No: 1, tiež fukozyltransferázovú aktivitu, ktorá postačuje na jej využitie pri analýzach, experimentoch alebo vo výrobe.
V ďalšej vhodnej podobe obsahuje táto molekula DNA 2 150 až 2 250, v ideálnom prípade 2 198 bázových párov. V molekule DNA je 100 až 300, v ideálnom prípade 210 bázových párov protismerne (upstream) pred štartovacím kodónom, a tiež 350 až 400, v ideálnom prípade 458 bázových párov v súhlasnom smere (downstream) za stop-kodónom otvoreného čítacieho rámca, pričom v ideálnom prípade sa na konci molekuly DNA nachádza 3'-Poly(A) sekvencia. Tým sa zabezpečí bezproblémová regulácia na úrovni translácie a k dispozícii bude molekula DNA, ktorá obzvlášť efektívne a bezproblémovo kóduje aktívnu GlcNAc-al,3-fukozyltransferázu.
Predkladaný vynález sa ďalej týka molekuly DNA obsahujúcej sekvenciu podľa SEQ 1D No: 3 alebo sekvenciu, ktorá vykazuje aspoň 85 %, v ideálnom prípade aspoň 95 %, najmä aspoň 99 % homológiu k uvedenej sekvencii, alebo ktorá hybridizuje s uvedenou sekvenciou za stringentných podmienok, alebo obsahuje sekvenciu, ktorá je degenerovaná vo vzťahu k uvedenej DNA v dôsledku genetického kódu. Uprednostňuje sa pritom stanovenie homológie pomocou programu, ktorý rozoznáva inzercie a delécie a neberie ich do úvahy pri výpočte homológie. Táto nukleotidová sekvencia kóduje konzervovaný peptidový motív, t. j. väčšina aktívnych a funkčných GlcNAc-al,3-fukozyltransferáz obsahuje aminokyselinový reťazec kódovaný touto sekvenciou. Sekvencia môže mať tú istú veľkosť, ako sekvencia podľa SEQ ID No: 3, alebo môže samozrejme byť aj väčšia. Táto sekvencia je kratšia, než sekvencia kódujúca celý proteín, a je preto menej citlivá na rekombinácie, delécie alebo iné mutácie. Z dôvodu konzervovaného motívu a zvýšenej stability je táto sekvencia zvlášť vhodná na testy rozoznávania sekvencie.
SEQ ID No: 3 má nasledujúcu sekvenciu: 5'-GAAGCCCTGAAG-CACTACAAATTTAGCTTAGCGTTTG AAAATTCGAATGAGGAAGATTATGTAACTGAAAAATTCTTCCAATCCCTTGTTGCTGGAACTGT CCCT-3'
Podľa ďalšieho hľadiska sa predkladaný vynález týka molekuly DNA, ktorá obsahuje čiastkovú sekvenciu uvedených molekúl DNA a má veľkosť od 20 do 200, v ideálnom prípade však 30-50 bázových párov. Táto molekula DNA sa dá použiť napríklad ako sonda na viazanie komplementárnych sekvencii Glc-NAc-al,3-fukozyltransferáz, čo umožni ich selekciu zo vzorky. Týmto spôsobomje možné selektovať, izolovať a charakterizovať ďalšie GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy z rôznych druhov rastlín a hmyzu. Dajú sa pri tom použiť rozličné, respektíve viaceré čiastkové sekvencie, najmä však časť konzervovaného motívu opísaného skôr.
Veľkou výhodou je pri tom kovalentné naviazanie uvedenej molekuly DNA na markerovú zlúčeninu, ktorá sa dá stanoviť. Ako markerová zlúčenina prichádza do úvahy ľubovoľný použiteľný marker, ako napríklad fluorescenčný, luminiscenčný alebo rádioaktívny marker, neizotopový marker ako biotín a pod. Dostaneme tak k dispozícii užitočné metódy na dôkaz, výber a kvantitatívne stanovenie zodpovedajúcich molekúl DNA vo vzorkách pevných pletív rastlín alebo na hybridizáciu v tekutých vzorkách.
Ďalší aspekt vynálezu sa týka biologicky funkčného vektora, ktorý obsahuje jednu z uvedených molekúl DNA, alebo ich časti rozličnej dĺžky, najmenej však 20 bázových párov. Na transfekciu hostiteľských buniek je potrebný samostatný vektor, ktorý je schopný rozmnoženia, pričom je možné použiť vhodný vektor v závislosti od typu hostiteľskej bunky, mechanizmu transfekcie, úlohy alebo veľkosti molekuly DNA. Keďže je známy veľký počet rozličných vektorov, ich výpočet by presiahol rozsah prihlášky a preto sme od neho upustili. Ďalším dôvodom je aj to, že odborníkom sú tieto vektory dobre známe (vektory a všetky ostatné použité metódy a pojmy sú opísané v publikácii autorov Sambrook a Maniatis). V ideálnom prípade má vektor nízku molekulovú hmotnosť a mal by niesť selekčné markery, ktoré vedú v bunke k ľahko identifikovateľnému fenotypu, ktorý umožni jednoduchú selekciu hostiteľských buniek s vektorom a bez vektora. Aby bolo možné získať vysoké výťažky DNA a zodpovedajúcich génových produktov, mal by vektor niesť silný promótor, ako aj enhancér, signály na génovú amplifikáciu a regulačné sekvencie. Na autonómnu replikáciu vektora je dôležitý počiatok replikácie. Za správne procesovanie transkriptov mRNA zodpovedajú polyadenylačné sig4
SK 286416 Β6 nály a signály pre splicing. Ak sa ako vektory používajú fágy, vírusy alebo vírusové častice, potom zbaľovanie vektorovej DNA riadia zbaľovacie signály.
Ak vnesieme vektor podľa opisu tohto vynálezu do rastliny alebo rastlinnej bunky, dosiahne sa posttranskripčné potlačenie génovej expresie endogénneho génu pre ocl,3-fukozyltransferázu prostredníctvom transkripcie k nemu homologického transgénu alebo jeho časti v smere reťazca. Bližší opis tejto metódy je v publikáciách Baulcombe 1996, Plánt. Mol. Biol. 9:373-382 a Brigneti et al. 1998, EMBO J. 17:6739-6746. Táto stratégia „umlčania“ génu predstavuje účinnú možnosť na potlačenie expresie génu pre al,3-fukozyltransferázu, pozri aj Waterhouse etal. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13959-13964.
Vynález sa ďalej týka biologicky funkčného vektora, ktorý obsahuje molekulu DNA v uvedenom uskutočnení, alebo jej časti rozličnej dĺžky, v obrátenej orientácii vzhľadom na promótor. Ak sa tento vektor transfekuje do hostiteľskej bunky, dochádza k čítaniu anti-sense mRNA, ktorá je komplementárna k mRNA GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy a vytvára s ňou komplex. Táto väzba buď blokuje správne procesovanie, transport a stabilitu, alebo tým, že zamedzuje väzbe ribozómov blokuje transláciu a následne normálnu génovú expresiu GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy.
Aj keď by bolo možné zabudovať do vektora celú sekvenciu molekuly DNA, môžu byť za určitým cieľom výhodné aj časti tejto sekvencie, z dôvodu ich menšej veľkosti. Pri anti-sense metóde je napríklad dôležité, aby bola molekula DNA dostatočne veľká, aby vznikala aj dostatočne veľká anti-sense mRNA, ktorá sa viaže na mRNA transferázy. Vhodná anti-sense mRNA obsahuje napríklad 50 až 200 nukleotidov, keďže mnohé zo známych prirodzene sa vyskytujúcich anti-sense mRNA molekúl majú približne 100 nukleotidov.
Na zvlášť efektívnu inhibíciu expresie aktívnej al,3-fukozyltransferázy je vhodná kombinácia obidvoch opísaných metód (Waterhouse et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13959-13964).
Je výhodné použiť rýchlo hybridizujúce molekuly RNA. Účinnosť anti-sense RNA molekúl, ktoré majú viac než 50 nukleotidov, závisí od väzbovej kinetiky in vitro. Napríklad rýchlo hybridizujúce anti-sense RNA molekuly vykazujú silnejšiu inhibíciu expresie proteínov, než pomaly hybridizujúce molekuly RNA (Wagner et al. 1994, Annu. Rev. Microbiol., 48:713-742' Rittner et al. 1993, Nucl. Acids Res., 21:1381-1387). Takéto rýchlo hybridizujúce molekuly anti-sense RNA majú predovšetkým vysoký počet externých báz (voľné konce a väzobné sekvencie), vysoký počet štruktúrnych subdomén (zložiek), ako aj malý počet slučiek (Patzel et al. 1998; Náture Biotechnology, 16; 64-68). Hypotetické sekundárne štruktúry' molekúl anti-sense RNA sa dajú predpovedať napríklad prostredníctvom počítačových programov, ktorý umožní vyhľadanie vhodnej sekvencie anti-sense RNA.
Do vektora sa dajú zabudovať rozličné sekvenčné oblasti molekuly DNA. Existuje tu možnosť zabudovať do vektora len tú časť, ktorá je zodpovedná za väzbu ribozómov. Blokovanie v tejto oblasti mRNA postačuje na zastavenie celej translácie. Vysoká účinnosť anti-sense molekúl sa dosahuje aj pri použití 5'- alebo 3'- netranslatovaných oblastí génu.
Molekula DNA v zmysle vynálezu je tvorená sekvenciou, ktorá zahrnuje mutáciu typu delécie, inzercie a/alebo substitúcie. Počet mutovaných nukleotidov je pritom variabilný a siaha od jediného, až po viaceré deletované, inzertované alebo substituované nukleotidy. V dôsledku mutácie môže dôjsť aj k posunu čítacieho rámca. Pri takomto géne je dôležité len to, aby inhiboval expresiu génu pre GlcNAc-al,3-fukozyltransferázu a tvorbu aktívneho, funkčného enzýmu. Umiestnenie mutácie môže byť variabilné, len musí dochádzať k inhibícii expresie enzymaticky aktívneho proteínu. Uprednostňuje sa mutácia v katalytickej oblasti enzýmu, ktorá sa nachádza v C-terminálnej oblasti. Metódy zavádzania mutácii do sekvencií DNA sú odborníkovi dostatočne známe, takže tu upúšťame od bližšieho opisu rozličných možností mutagenézy. Je pri tom možné použiť náhodnú mutagenézu, najmä však cielenú mutagenézu, napr. mutagenézu zameranú na konkrétne miesto (site-directed), mutagenézu riadenú oligonukleotidmi, alebo mutagenézu pomocou reštrikčných enzýmov.
Predmetom vynálezu je ďalej molekula DNA, ktorá kóduje ribozým obsahujúci dva sekvenčné úseky s dĺžkou minimálne 10 až 15 bázových párov, ktoré sú komplementárne k opísaným sekvenčným úsekom molekuly DNA v zmysle vynálezu a ktorý vytvára komplex a štiepi mRNA transkribovanej z prirodzenej molekuly DNA kódujúcej GlcNAc-al,3-fukozyltransferázu. Ribozým rozoznáva mRNA pre GlcNAc-al,3-fukozyltransferázu prostredníctvom komplementárneho párovania báz s touto mRNA. Následne dochádza k vyštiepeniu a degradácii RNA sekvenčne špecifickým spôsobom ešte pred transláciou enzýmu. Po disociácii od degradovaného substrátu ribozým opätovne hybridizuje s molekulou mRNA a funguje ako špecifická endonukleáza. Vo všeobecnosti je možné pripraviť ribozýmy určené na inaktiváciu špecifickej mR -NA aj v prípade, že nie je známa celá sekvencia DNA, ktorá kódujúcej proteín. Ribozýmy sú efektívne najmä v prípade, keď sa ribozómy pohybujú pozdĺž mRNA pomaly. V tom prípade môže ribozým ľahšie nájsť na mRNA úsek bez ribozómov. Z toho dôvodu sú ako systém pre ribozýmy vhodné mutanty s pomalými ribozómami (J. Búrke, 1997, Náture Biotechnology; 15, 414-415). Takáto molekula DNA je obzvlášť vhodná na potlačenie, prípadne zastavenie expresie rastlinnej GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy.
SK 286416 Β6
Existuje aj možnosť použiť pozmenenú formu ribozýmu, minizým. Minizýmy sú účinné najmä na štiepenie väčších molekúl mRNA. Minizým je ribozým, ktorý má na mieste Stem/Loop II krátky oligonukleotidový linker. Zvlášť účinné sú minizýmové diméry (Kuwabara et al., 1998, Náture Biotechnology, 16; 961-965).
V tomto zmysle sa vynález týka aj biologicky funkčného vektora, ktorý obsahuje jednu z posledne menovaných molekúl DNA (molekulu s mutáciami, alebo molekulu ribozýmovej DNA). Pri tom platí to, čo už bolo uvedené o vektoroch. Takýto vektor jc možné vniesť napríklad do mikroorganizmu a použiť ho na produkciu vysokých koncentrácii opísaných molekúl DNA. Ďalej je takýto vektor vhodný najmä na vnesenie špecifickej molekuly DNA do organizmu rastliny alebo hmyzu na účely obmedzenia alebo úplného zastavenia produkcie GlcNAc-al,3-fúkozyltransferázy v tomto organizme.
V zmysle vynálezu bude k dispozícii postup na vytvorenie cDNA, ktorá bude obsahovať opísanú molekulu DNA. Pri tomto postupe sa izoluje RNA z buniek hmyzu alebo rastlín, najmä z buniek hypokotylu, a po pridaní reverznej transkriptázy a primérov sa uskutoční reverzná transkripcia. Jednotlivé kroky tohto postupu sa uskutočnia podľa známych postupov. V prípade reverznej transkripcie existuje možnosť syntetizovať pomocou oligo(dT) primérov cDNA z celkovej mRNA a až následne vykonať PCR so zvolenými primármi a pripraviť tak molekuly DNA obsahujúce gén pre GlcNAc-ocl,3-fukozyltransferázu. Ďalšou možnosťou je použiť zvolené priméry priamo na reverznú transkripciu a získať tak kratšiu, špecifickú cDNA. Vhodné priméry sa dajú pripraviť napríklad synteticky, podľa predlohy zo sekvencií cDNA pre transferázu. Pomoci tohto postupu sa dá veľmi rýchlo, jednoducho a s nízkou chybovosťou pripraviť veľké množstvo molekúl cDNA v zmysle vynálezu.
Vynález sa ďalej týka postupu na klonovanie GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy, pri ktorom sa naklonuje molekula DNA v zmysle vynálezu do vektora, ktorý sa transfekuje do hostiteľskej bunky, prípadne do hostiteľa, pričom sa prostredníctvom selekcie a amplifikácie transfekovaných hostiteľských buniek získajú bunkové línie, ktoré exprimujú aktívnu GlcNAc-al,3-fukozyltransferázu. Molekula DNA sa napríklad vloží do vektora pomocou reštrikčných endonukleáz. Pre vektor platia opäť uvedené podmienky. Pri tomto postupe je dôležité, aby sa zvolil systém s efektívnym hostiteľským vektorom. Na produkciu aktívneho enzýmu sú vhodné najmä eukaryotické hostiteľské bunky. Jednou z možností je transfekcia vektora do buniek hmyzu. Pri tom sa môže použiť vírus hmyzu ako vektor, ako napr. bakulovírus.
Je samozrejme možné transfekovať ľudské bunky alebo bunky iných stavovcov, ktoré by exprimovali cudzorodý enzým.
V ideálnom prípade bude k dispozícii postup na prípravu rekombinantných hostiteľských buniek, predovšetkým buniek rastlín a hmyzu, s potlačenou alebo úplne zastavenou produkciou GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy. Tieto bunky sa vyznačujú tým, že majú vložený vektor v zmysle tohto vynálezu, ktorý obsahuje molekulu DNA podľa tohto vynálezu, t. j. mutovanú molekulu DNA, alebo molekulu DNA kódujúcu ribozým, alebo ktorý obsahuje molekulu DNA v obrátenej orientácii vzhľadom na promótor. Pri tom platí to, čo bolo o transfekcii opísané.
Ako hostiteľské bunky sa môžu použiť napríklad rastlinné bunky, pričom do úvahy prichádza napríklad Ti-plazmid v systéme Agrobacterium. So systémom Agrobacterium je možné priamo transfekovať rastlinu: Agrobaktérie zapríčiňujú u rastlín tvorbu koreňových hľuziek. Keď agrobaktérie infikujú poranenú rastlinu, neprenikajú do rastliny samotné baktérie, ale vnesú do rastlinných buniek rekombinantný úsek DNA, tzv. T-DNA z kruhového, extrachromozomálneho Ti-plazmidu, ktorý spôsobuje tvorbu tumorov. T-DNA a s ňou aj vložená molekula DNA sa stabilne vsunie do chromozómovej DNA bunky, aby sa mohli v rastline exprimovať gény T-DNA.
Existuje veľký počet známych, efektívnych transfekčných mechanizmov pre rôzne hostiteľské systémy. Sú to napríklad elektroporácia, metóda s fosforečnanom vápenatým, mikroinjekcia alebo lipozómová metóda.
Transfekované bunky sa následne selektujú, napr. na základe rezistencie k antibiotikám, pre ktorú nesie vektor patričné gény, alebo na základe iných markerových génov. Potom sa amplifikujú transfekované bunkové línie, buď v malých množstvách napr. na Petriho miskách, alebo vo veľkom, napr. vo fermentoroch. Okrem toho vykazujú rastliny zvláštnu schopnosť - sú totiž schopné vyvinúť sa opätovne z jedinej (transfekovanej) bunky, prípadne z protoplastu na kompletnú rastlinu, ktorú sa môže pestovať.
Podľa druhu použitého vektora dochádza v hostiteľovi k procesom, ktoré potlačia alebo úplne zastavia expresiu enzýmu:
Ak sa transfekuje vektor s molekulou DNA s delečnou, inzerčnou alebo substitučnou mutáciou, dochádza k homologickej rekombinácii: zmutovaná molekula DNA rozpozná napriek mutácii identickú sekvenciu v genóme hostiteľskej bunky a zabuduje sa na tom istom mieste, takže vznikne tzv. „knock-out“ gén. Takýmto spôsobom sa vnesie do génu pre GlcNAc-otl,3-fukozyltransferázu mutácia, ktorá môže inhibovať bezproblémovú expresiu GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy. Ako už bolo opísané, pri tejto metóde je dôležité, aby mutácia dostatočne bránila expresii aktívneho proteínu. Po selekcii a amplifikácii je možné na dodatočnú kontrolu gén sekvenovať, aby sa overil úspech homologickej rekombinácie, prípadne stupeň mutácie.
Ak sa transfekuje vektor s molekulou DNA, ktorá kóduje ribozým, exprimuje sa v hostiteľskej bunke aktívny ribozým. Ribozým vytvára komplex s komplementárnou sekvenciou mRNA pre GlcNAc-al,3-fukozyl transferázu minimálne na jednom mieste, štiepi ju na tomto mieste a takýmto spôsobom môže inhibovať transláciu enzýmu. V tejto hostiteľskej bunke, ako aj v bunkových líniách alebo rastlinách, ktoré z nej pochádzajú, nedochádza k žiadnej expresii GlcNAc-ocl,3-fukozyltransferázy.
V prípade vektora, ktorý obsahuje molekulu DNA v zmysle vynálezu, ktorá je orientovaná po smere alebo proti smeru promótora, exprimuje sa v transfekovanej bunke (prípadne rastline) „sense“ alebo „anti-sense“ mRNA. Anti-sense mRNA je komplementárna aspoň k časti sekvencie mRNA pre GlcNAc-al,3-fukozyltransferázu a môže tiež inhibovať transláciu enzýmu. Príklad postupu na potlačenie génovej expresie technikou anti-sense je v publikácii Smith et al. 1990, Mol. Gen. Genet. 224:477-481, kde sa opisuje inhibícia expresie génu, ktorý sa zúčastňuje procesu dozrievania paradajok.
Vo všetkých systémoch dochádza minimálne k potlačeniu expresie GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy, v ideálnom prípade k jej úplnému potlačeniu. Stupeň inhibície génovej expresie závisí od stupňa vytvárania komplexov, homologickej rekombinácie, od prípadných následných náhodných mutácií a od ostatných procesov v oblasti genómu. Transfekované bunky sa kontrolujú a selektujú podľa aktivity GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy.
Ďalej existuje možnosť ešte zosilniť opísanú inhibíciu expresie GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy tým, že sa do hostiteľa vnesie okrem opísaného vektora aj vektor obsahujúci gén, ktorý kóduje cicavčí proteín, napríklad pl,4-galaktozyltransfeiázu. Fukozylácia sa dá obmedziť pôsobením iných cicavčích enzýmov, pričom je zvlášť efektívna kombinácia inhibície expresie aktívnej ccl,3-fukozyltransferázy prostredníctvom vektora v zmysle vynálezu spolu s vektorom s cicavčím enzýmom.
Na transfekciu sa dá použiť ľubovoľný rastlinný druh, napríklad bôby Mungo, tabak, paradajka a/alebo zemiak.
Iný výhodný postup na prípravu rekombinantných hostiteľských buniek, najmä buniek rastlín alebo hmyzu, je založený na princípe vnesenia molekuly DNA, ktorá obsahuje mutáciu, do genómu hostiteľskej bunky, prípadne rastliny alebo hmyzu, namiesto nemutovanej, homologickej sekvencie (Schaefer et al. 1997, Plánt J.; 11(6):1195-1206). Pri tomto postupe sa nepoužíva vektor, ale čistá molekula DNA. Aby sme vymenovali aspoň tri metódy, molekula DNA sa vnesie napríklad bombardovaním, mikroinjekciou alebo elektroporáciou. Ako už bolo uvedené, molekula DNA sa zrovná s homologickou sekvenciou v genóme hostiteľa, takže dôjde k homologickej rekombinácii a vneseniu delečnej, inzerčnej alebo substitučnej mutácie do genómu: Môže pritom dochádzať k potlačeniu alebo úplnému zastaveniu expresie GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy.
Ďalší aspekt vynálezu sa týka rastlín, prípadne rastlinných buniek, ako aj hmyzu alebo buniek hmyzu, v ktorých klesla GlcNAc-al,3-fukozyltransferázová aktivita pod 50 %, najmä však pod 20 % a v ideálnom prípade na 0 % prirodzenej aktivity GlcNAc-al,3-íukozyltransferázy v rastlinách alebo rastlinných bunkách, prípadne v hmyze alebo bunkách hmyzu. Výhodou je, že takéto rastliny alebo rastlinné bunky produkujú glykoproteíny s nulovým alebo s minimálnym množstvom fukózy viazanej al,3 väzbou. Ak sa produkty takýchto rastlín alebo hmyzu dostanú do tela človeka alebo iných stavovcov, nevyvolávajú imunitnú reakciu proti al,3-fukózovému epitopu.
V ideálnom prípade budú k dispozícii rekombinantné rastliny alebo rastlinné bunky, ktoré boli pripravené podľa opísaného postupu a v ktorých bola potlačená alebo úplne zastavená produkcia GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy.
Vynález sa týka aj rekombinantného hmyzu alebo buniek hmyzu, ktoré boli pripravené podľa opísaného postupu a v ktorých bola potlačená alebo úplne zastavená produkcia GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy. Aj v tomto prípade sa neprodukujú glykoproteíny s fukozylovými zvyškami viazanými al,3 väzbou, takže tiež nevyvolávajú imunitnú reakciu proti al,3-fukózovému epitopu.
Vynález sa vzťahuje aj na molekulu PNA so sekvenciou báz, ktorá je komplementárna k sekvencií molekuly DNA v zmysle vynálezu alebo k jej čiastkovej sekvencií. PNA (kyselina peptidnukleotidová) je sekvencia podobná DNA, v ktorej sú nukleotidové bázy naviazané na pseudopeptidovú kostru. Vo všeobecnosti hybridizuje PNA s komplementárnymi DNA-, RNA- alebo PNA-oligomérmi podľa Watson-Crickovho párovania a vytvára helikálnu konformáciu. Peptidová kostra je zodpovedná za zvýšenú rezistenciu proti enzýmovej degradácii. Molekula PNA predstavuje zlepšené anti-sense agens. Ani nukleázy ani proteázy nie sú schopné molekulu PNA štiepiť. Stabilita molekuly PNA naviazanej na komplementárnu sekvenciu vykazuje dostatočne stérické blokovanie DNA a RNA polymeráz, reverznej transkriptázy, telomerázy a ribozómov.
Ak má molekula PNA opísanú sekvenciu, naviaže sa na DNA, prípadne na časť tej DNA, ktorá kóduje GlcNAc-al,3-fukozyltransferázu, a tak môže inhibovať transkripciu enzýmu. Keďže molekula PNA sa netranskribuje ani netranslatuje, pripravuje sa synteticky, napríklad pomocou t-Boc metódy.
V ideálnom prípade bude k dispozícii molekula PNA so sekvenciou báz, ktorá zodpovedá sekvencií molekuly DNA v zmysle vynálezu, ako aj jej čiastkovým sekvenciám. Táto molekula PNA vytvára komplexy s mRNA, prípadne s časťami mRNA pre GlcNAc-ccl,3-fukozyltransferázu, takže dochádza k inhibícii translácie enzýmu. Výsledok je podobný ako v prípade použitia anti-sense mRNA. Tak napríklad zvlášť eťektívnou oblasťou na tvorbu komplexov je oblasť iniciácie translácie, alebo 5' netranslatované oblasti mRNA.
SK 286416 Β6
Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka postupu na prípravu rastlín alebo hmyzu, prípadne buniek, najmä však buniek rastlín alebo hmyzu, ktoré vykazujú blokovanú expresiu GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy na úrovni transkripcie prípadne translácie a ktoré sa vyznačujú tým, že do buniek bola vnesená molekula PNA v zmysle vynálezu. Na vnesenie molekuly PNA, pripadne molekúl PNA do bunky sa použijú opäť bežné metódy, ako napríklad elektroporácia alebo mikroinjekcia. Zvlášť účinný je prenos v prípade naviazania PNA oligomérov na peptidy penetrujúce do bunky, napríklad transportán alebo pAntp (Pooga et al. 1998, Náture Biotechnology, 16; 857-861).
Vynález poskytuje aj postup na prípravu rekombinantných glykoproteínov, ktoré sa vyznačujú tým, že rekombinantné rastliny alebo rastlinné bunky, prípadne hmyz alebo bunky hmyzu, v ktorých je potlačená alebo úplne zastavená produkcia GlcNAc-ccl,3-fukozyltransferázy, alebo rastliny a hmyz, prípadne bunky, do ktorých bola postupom v zmysle vynálezu vnesená molekula PNA s génom, ktorý kóduje glykoproteín, sú transfekované takže dochádza k expresii rekombinantných glykoproteínov. Ako už bolo opísané, dochádza pri opísaných vektoroch obsahujúcich gény pre želané proteíny k transfekcii do hostiteľa, prípadne hostiteľských buniek. Transfekované bunky rastlín alebo hmyzu exprimujú želané proteíny, ktoré nemajú žiadnu alebo skoro žiadnu fukózu naviazanú a 1,3 väzbou. V dôsledku toho nespúšťajú spomenutú imunitnú reakciu v tele človeka alebo iných stavovcov. V týchto systémoch sa dajú produkovať ľubovoľné proteíny.
V ideálnom prípade bude k dispozícii postup na produkciu rekombinantných humánnych glykoproteínov, ktorý sa vyznačuje tým, že rekombinantné rastliny, prípadne rastlinné bunky, ako aj rekombinantný hmyz, prípadne bunky hmyzu v zmysle vynálezu, v ktorých je potlačená alebo úplne zastavená produkcia GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy, alebo rastliny alebo hmyz, prípadne bunky, do ktorých bola vnesená molekula PNA postupom v zmysle vynálezu, sú transfekované génom kódujúcim glykoproteín, takže dochádza k expresii glykoproteínu. Tento postup umožní produkovať v rastlinách (alebo v bunkách) ľudské glykoproteíny, ktoré po vnesení do ľudského tela nevyvolávajú imunitnú reakciu proti fukózovým zvyškom viazaným cti,3 väzbou. Existuje pritom možnosť použiť na produkciu rekombinantných glykoproteínov rastlinné druhy, ktoré slúžia ako zdroj potravy, napríklad banány, zemiaky a/alebo paradajky. Pletivá týchto rastlín obsahujú rekombinantný glykoproteín, takže je možné vpraviť rekombinantný glykoproteín do ľudského tela napríklad po extrakcii rekombinantného glykoproteínu z pletiva a jeho následným podávaním alebo priamym požívaním rastlinných pletív.
V ideálnom prípade je k dispozícii postup na produkciu rekombinantných ľudských glykoproteínov na medicínske účely prostredníctvom rekombinantných rastlín prípadne rastlinných buniek, ako aj rekombinantného hmyzu, pripadne buniek hmyzu v zmysle vynálezu, v ktorých bola potlačená alebo úplne zastavená produkcia GlcNAc-al,3-ŕukozyltransferázy, alebo prostredníctvom rastlín alebo hmyzu, prípadne buniek, do ktorých boli postupom v zmysle vynálezu vnesené molekuly PNA obsahujúce gén kódujúci glykoproteín, ktoré sú transfekované tak, aby exprimovali rekombinantný glykoproteín. Do úvahy pri tom prichádza ľubovoľný glykoproteín, ktorý je zaujímavý z medicínskeho hľadiska.
Ďalej sa predkladaný vynález týka rekombinantných glykoproteínov, ktoré boli pripravené podľa opísaného postupu v rastlinných alebo hmyzích systémoch a ktoré obsahujú menej než 50 %, najmä však menej než 20 %, v ideálnom prípade 0 % fukózových zvyškov viazaných al,3 väzbou, v porovnaní s proteínmi exprimovanými v rastlinných alebo hmyzích systémoch, v ktorých nebola potlačená hladina fukozyltransferázy. Uprednostňujú sa pritom samozrejme glykoproteíny, ktoré nemajú žiadne fukózové zvyšky viazané a 1,3 väzbou. Množstvo fukózy naviazanej a 1,3 väzbou závisí, do akého stupňa bol potlačená hladina GlcNAcal ,3-fukozyltransferázy.
Výhodne sa vynález týka rekombinantných humánnych glykoproteínov, ktoré boli pripravené podľa opísaného postupu v rastlinných alebo hmyzích systémoch, a ktoré na svojej peptidovej sekvencií obsahujú menej než 50 %, najmä však menej než 20 %, v ideálnom prípade 0 % fukózových zvyškov viazaných al,3 väzbou, v porovnaní s proteínmi exprimovanými v rastlinných alebo hmyzích systémoch, v ktorých nebola potlačená hladina fukozyltransferázy.
Obzvlášť výhodne sa však uskutočnenie týka rekombinantných humánnych glykoproteínov na medicínske použitie, ktoré boli pripravené podľa opísaného postupu v rastlinných alebo hmyzích systémoch, a ktoré na svojej peptidovej sekvencií obsahujú menej než 50 %, najmä však menej než 20 %, v ideálnom prípade 0 % fukózových zvyškov viazaných al,3 väzbou, v porovnaní s proteínmi exprimovanými v rastlinných alebo hmyzích systémoch, v ktorých nebola potlačená hladina fukozyltransferázy.
Tieto glykoproteíny v zmysle vynálezu môžu obsahovať iné naviazané oligosacharidové jednotky, ktoré sú špecifické pre rastliny alebo hmyz, čím sa tieto glykoproteíny - v prípade humánnych glykoproteínov - odlišujú od prirodzených glykoproteínov. Napriek tomu však glykoproteíny v zmysle vynálezu nevyvolávajú v ľudskom tele žiadnu alebo len minimálnu imunitnú reakciu, keďže, ako už bolo napísané v úvode, hlavnou príčinou imunitnej reakcie alebo krížovej imunitnej reakcie proti proteínom rastlín alebo hmyzu sú fukózové zvyšky viazané <xl,3 väzbou.
Ďalší aspekt sa týka farmaceutického prípravku, ktorý obsahuje glykoproteíny v zmysle vynálezu. Okrem glykoproteínov v zmysle vynálezu obsahuje farmaceutický prípravok aj ďalšie zložky, bežné v takýchto pri
SK 286416 Β6 pravkoch. Sú to napríklad vhodné riediace roztoky s tlmivými zložkami (napríklad Tris-HCl, octan, fosforečnan), zložkami na úpravu pH a iónovej sily, aditíva, ako napríklad tenzidy a rozpúšťadlá (napríklad Tween 80, Polysorbát 80), konzervačné látky (napr. Thimerosal, benzylalkohol), adjuvantné látky, antioxidanty (napr. kyselina askorbová, tiosiran sodný), emulgátory, plnidlá (napr. laktóza, manitol), kovalentne na proteín naviazané polyméry, ako polyetylénglykol, alebo prostriedky na viazanie materiálu do polymémych častíc, ako polymér kyseliny mliečnej, kyseliny polyglykolovej, alebo do lipozómov a ďalej pomocné látky alebo nosiče, ktoré sú užitočné pri danej liečbe. Takéto prípravky ovplyvňujú fyzikálny stav glykoproteínov v zmysle vynálezu, ich stabilitu, rýchlosť uvoľňovania in vivo a rýchlosť vylučovania in vivo.
Vynález dáva k dispozícii aj postup na selekciu molekúl DNA kódujúcich GlcNAc-al,3-fukozyltransferázu vo vzorke, pričom sa označené molekuly DNA v zmysle vynálezu pridajú ku vzorke a naviažu sa na molekuly DNA, ktoré kódujú GlcNAc-al,3-íukozyltransferázu. Hybridizované molekuly DNA sa môžu detekovať, kvantifikovať a selektovať. Aby vzorka obsahovala jednovláknovú DNA, s ktorou môžu označené molekuly DNA hybridizovať, denaturuje sa napríklad zohrievaním.
Existuje aj možnosť skúmanú DNA po prípadnom pridaní endonukleáz oddeliť gélovou elektroforézou v agarózovom géli. Po prenesení na nitrocelulózovú membránu sa pridajú označené molekuly DNA podľa vynálezu, ktoré hybridizujú so zodpovedajúcou homologickou molekulou DNA („Southem Blotting“).
Ďalšou možnosťou je vyhľadávanie homologických génov iných biologických druhov pomocou postupu založenom na PCR, s použitím špecifických a/alebo degenerovaných primárov odvodených od sekvencie molekuly DNA v zmysle vynálezu.
Prednostne obsahuje vzorka na uvedený postup podľa vynálezu genómovú DNA organizmu rastliny alebo hmyzu. Prostredníctvom tohto postupuje možné preskúmať rýchlym a účinným spôsobom veľký počet druhov rastlín a hmyzu na prítomnosť génu pre GlcNAc-al,3-fukozyltransferázu. Tak je možné selektovať rastliny alebo hmyz, ktorý neobsahuje tento gén, prípadne je možné v druhoch rastlín alebo hmyzu, ktoré daný gén obsahujú, postupom v zmysle vynálezu potlačiť alebo úplne zastaviť expresiu GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy a použiť ich na transfekciu a produkciu (ľudských) glykoproteínov.
Vynález sa tiež týka molekúl DNA kódujúcich GlcNAc-al,3-fukozyltransferázu, ktoré boli vyselektované a izolované zo vzorky prostredníctvom opísaných postupov. Tieto molekuly sa môžu použiť na ďalší výskum. Je možné ich sekvenovať a taktiež použiť ako DNA sondy na hľadanie GlcNAc-al,3-fukozyltransferáz. Takéto - označené - molekuly DNA sa používajú s väčšou účinnosťou pri organizmoch, ktoré sú príbuzné s organizmami, z ktorých boli molekuly DNA izolované, než molekuly DNA podľa vynálezu.
Ďalší aspekt vynálezu sa týka prípravy' GlcNAc-ctl,3-fukozyltransferázy klonovanej v zmysle vynálezu, ktorá vykazuje izoformy s hodnotami pi medzi 6,0 až 9,0, najmä však medzi 6,8 až 8,2. Hodnota pi proteínu zodpovedá takej hodnote pH, pri ktorej je jeho celkový elektrický náboj nulový a závisí od sekvencie aminokyselín, glykozylačného vzorca, ako aj od priestorovej štruktúry proteínu. GlcNAc-al,3-fukozyltransferáza má aspoň 7 izoforiem, ktoré majú hodnotu pi v tomto rozsahu. Dôvodom pre existenciu rozličných izoforiem transferázy sú napríklad rozdielna glykozylácia alebo limitovaná proteolýza. Pokusy ukázali, že semenáčiky bôbov Mungo z rozličných materských rastlín obsahujú rozdielny pomer izozýmov. Hodnota pi sa dá určiť postupom, ktorý odborníci poznajú a ktorý sa nazýva izoelektrická fokusácia.
Hlavná izoforma enzýmu má zjavnú molekulovú hmotnosť 54 kDa.
Enzým v zmysle vynálezu má izoformy s hodnotami pi 6,8; 7,1 a 7,6.
Vynález sa tiež týka postupu na prípravu „rastlinných“ sacharidových jednotiek z glykoproteínov ľudí a iných stavovcov, pričom sa ku vzorke obsahujúcej sacharidovú jednotku prípadne glykoproteín pridajú fukózové jednotky a GlcNAc-al,3-fukozyltransferáza kódovaná opísanou molekulou DNA, takže Glc-NAc-al,3-fukozyltransferáza naviaže fukózu väzbou a 1,3 na sacharidovú jednotku, prípadne na glykoproteín. Postup na klonovanie GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy v zmysle vynálezu umožňuje prípravu veľkých množstiev vyčisteného enzýmu. Aby sa dosiahla úplná účinnosť transferázy, pripravia sa vhodné reakčné podmienky. Ukázalo sa, že transferáza má obzvlášť vysokú aktivitu pri približnej hodnote pH 7, ak sa ako tlmivý roztok použije 2-(N-morfolino)metánsulfonát-HCl. V prítomnosti dvojmocných katiónov, najmä Mn2+ sa aktivita rekombinantnej transferázy zvyšuje. Sacharidové jednotky sa pridávajú ku vzorke buď vo voľnej forme, alebo viazané na proteín. Rekombinantná transferáza si zachováva aktivitu v oboch prípadoch.
Vynález bude ďalej objasnený pomocou nasledovných príkladov a obrázkov, nie je však samozrejme na ne obmedzený.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na výkresoch predstavujú obr. la a lb celkové množstvo proteínov a nameranú enzýmovú aktivitu v jednotlivých frakciách eluátu v podobe krivky; obr. 2 zobrazuje elektroforézny gél s GlcNAc-ccl,3-fukozyltransferázou; na obr. 3 je výsledok izoelektrickej fokusácie a nameraná transferázová aktivita jednotlivých izoforiem; na obr. 4 sú A-terminálne sekvencie 4 tryptických peptidov 1-4 ako aj sekvencia DNA troch primérov
SI, A2 a A3; na obr. 5a a 5b je sekvencia cDNA pre al,3-fukozyltransferázu; na obr. 6a a 6b je z cDNA odvodená aminokyselinová sekvencia al,3-fukozyltransferázy; na obr. 7 je schematické zobrazenie al,3-fukozyltransferázy a hydrofóbnosť aminokyselinových zvyškov; na obr. 8 je porovnanie konzervovaných motívov rozličných fukozyltransferáz; na obr. 9 je porovnanie fukozyltransferázovej aktivity z buniek transfekovaných génom pre GlcNAc-ocl,3-fukozyltransferázu s negatívnou kontrolou; na obr. 10a a 10b je štruktúra rozličných akceptorov al,3-fukozyltransferázy; obr. 11 a 12 zobrazujú hmotnostné spektrá a obr. 13 zobrazuje výsledok HPLC.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Izolácia jadra s al,3-fukozyltransferázou
Všetky kroky sa robili pri 4 °C. Semenáčiky bôbov Mungo sa zhomogenizovali v mixéri s použitím 0,75 objemu extrakčného tlmivého roztoku na kg bôbov. Homogenát sa následne prefiltroval cez dve vrstvy bavlnenej tkaniny a filtrát sa centrifúgoval 40 min. pri 30 000xg. Kvapalná frakcia sa odstránila a pelet sa extrahoval cez noc v rozpúšťačom tlmivom roztoku za stáleho miešania. Po následnej centrifúgácii 40 min. pri 30 000x g sme dostali Triton-extrakt.
Triton-extrakt sa prečistil nasledovne:
Krok 1: Triton-extrakt sa naniesol na kolónu mikrogranulámeho dietylaminoetylcelulózového ionexu DE52 (5x28 cm, firma Whatman), ktorý bol predtým kalibrovaný tlmivým roztokom A. Nenaviazaná frakcia sa ďalej spracovala v kroku 2.
Krok 2: Vzorka sa naniesla na kolónu Affi-Gel Blue (2,5x32) kalibrovanú tlmivým roztokom A. Po premytí kolóny týmto tlmivým roztokom sa adsorbovaný protein vymyl tlmivým roztokom A s 0,5 M NaCl.
Krok 3: Po dialýze eluátu z kroku 2 oproti tlmivému roztoku B sa vzorka naniesla na tým istým tlmivým roztokom kalibrovanú kolónu S-Sepharose. Naviazaný protein sa eluoval lineárnym gradientom od 0 do 0,5 M NaCl v tlmivom roztoku B. Frakcie s GlcNAc-al,3-fukozyltransferázou sa spojili a dialyzovali oproti tlmivému roztoku C.
Krok 4: Dialyzovaná vzorka sa naniesla na kolónu GnGn-Sepharose, ktorá bola kalibrovaná tlmivým roztokom C. Naviazaný protein sa eluoval tlmivým roztokom C, ktorý obsahoval 1 M NaCl namiesto MnCb.
Krok 5: Enzým sa následne dialyzoval oproti tlmivému roztoku D a naniesol sa na kolónu GDP-Hexanolamin-Sepharose. Po premytí kolóny tlmivým roztokom D sa transferáza eluovala náhradou MgCl2 a NaCl za 0,5 mM GDP. Aktívne frakcie sa spojili a dialyzovali sa oproti tlmivému roztoku 20 mM Tris-HCl, pH 7,3 a nakoniec lyofilizovali.
Enzýmová aktivita GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy sa určovala s použitím GnGn-peptidu a GDP-L-[U-l4C]-fúkózy s koncentráciou substrátu 0,5 a 0,25 v tlmivom roztoku 2-(N-morfolino)mctánsulfonát-HCl za prítomnosti Triton X-100, MnCl2 GlcNAc a AMP (podľa Staudacher et al. 1998 Glycoconjugate J. 15, 355-360; Staudacher et al. 1991 Eur. J. Biochem. 199, 745-751).
Koncentrácia proteínov sa určovala metódou s kyselinou bicinchonínovou (Pierce) alebo v posledných krokoch purifikácie proteínu analýzou aminokyselín (Altmann 1992 Anál. Biochem. 204, 215-219).
Na obr. la a lb je sú namerané hodnoty množstva proteínov a nameranej enzýmovej aktivity v jednotlivých frakciách eluátu v podobe krivky. Obr. la zobrazuje opísané delenia na kolóne S-Sepharose, obr. lb delenie na kolóne GnGn-Sepharose pričom krúžky označujú množstvo proteínov, plné čierne krúžky označujú GlcNAc-al,3-íúkozyltransferázu a štvorce označujú N-acetyl-ä-glukozaminidázu. Jedna enzýmová jednotka (U) je definovaná ako množstvo enzýmu, ktoré prenesie na akceptor 1 μιηοΐ fukózy za minútu.
Tabuľka 1 ukazuje jednotlivé kroky pri purifikácii transferázy.
Tabuľka 1
Purifikačný krok Celkové množstvo proteínov Celková aktivita Špecifická aktivita Purifikačný faktor Výťažok
mg mU mU/mg -násobok %
Triton X-100 extrakt 91 500 4 846 0,05 1 100
DE52 43 700 4 750 0,10 2 98,0
Affigel Blue 180,5 4 134 23 460 85,3
S-Sepharose 8,4 3 251 390 7 800 67,1
GnGn- Sepharose 0431 1044 8 030 160 000 21,5
GDP-Hexanolamin-Sepharose 0,02' 867 43 350 867 000 17,9
stanovené analýzou aminokyselín
Extrakčný tlmivý roztok:
0,5 mM ditiotreitol mM EDTA
0,5 % polyvinylpyrolidón
0,25 M sacharóza mM Tris-HCl tlmivý roztok, pH 7,3
Rozpúšťači tlmivý roztok:
0,5 mM ditiotreitol mM EDTA
1,5% Trithon X-100 mM Tris-HCl tlmivý roztok, pH 7,3
Tlmivý roztok A:
mM Tris-HCl tlmivý roztok, pH 7,3
0,1 % Trithon X-100
0,02 % NaN3
Tlmivý roztok B:
mM Na-citrátový tlmivý roztok, pH 5,3
0,1 % Trithon X-100
0,02 % NaN3
Tlmivý roztok C:
mM Tris-HCl tlmivý roztok, pH 7,3 mM MnCl2
0,02 % NaN3
Tlmivý roztok D:
mM Tris-HCl tlmivý roztok, pH 7,3 lOmMMgCl,
0,1 M NaCl
0,02 % NaN3
Príklad 2
SDS-PAGE a izoelektrická fokusácia
SDS-PAGE bola robená v aparatúre Biorad-Mini-Protein na géloch zložených z 12,5 % akrylamidu a 1 % bisakrylamidu. Gély sa farbili buď v Coomassie Brilliant Blue R-250, alebo striebrom. Izoelektrická fokusácia fukozyltransferázy sa robila na hotových géloch s rozsahom pi 6-9 (Servalyt precotes 6-9, Serva). Gély sa farbili striebrom podľa protokolu výrobcu. Na dvojrozmernú elektroforézu sa prúžky vyrezali z fokusačného gélu, opracovali sa S-alkylačnými činidlami a SDS a vykonala sa SDS-PAGE podľa uvedeného opisu.
Obr. 3 predstavuje výsledky izoelektrickej fokusácie. Dráha A bola zafarbená striebrom, na dráhe B bola testovaná aktivita izoforiem transferázy. Aktivita sa pritom udáva ako % fukózy prenesenej ako GDP-fukóza na substrát.
SK 286416 Β6
Príklad 3
Sekvenovanie peptidu
Na sekvenovanie proteínu sa vyrezali prúžky z SDS-polyakrylamidového gélu zafarbeného farbivom Coomassie, opracovali sa karboxyamidometylačným činidlom a štiepili trypsínom, ako bolo publikované v Gorg et al. 1998, Electrophoresis, 9, 681-692. Tryptické peptidy sa delili pomocou HPLC s reverznou fázou na kolóne Vydac C18 1,0*250 mm pri 40 °C s prietokom 0,05 ml/min. v aparatúre HP 1100 (Hewlett-Packard). Izolované peptidy sa sekvenovali podľa protokolu výrobcu v aparatúre Hewlett-Packard G1005A. Zmes peptidov sa analyzovala aj metódou ineglového natrávenia s MALDI-TOF MS (pozri ďalej).
Obr. 4 predstavuje N-termmálne sekvencie 4 tryptických peptidov 1-4 (SEQ ID No: 5-8). Podľa prvých troch peptidov sa pripravili priméry SI, A2 a A3 (identifikačné číslo sekvencie 9-11).
Príklad 4
RT-PCR a klonovanie cDNA
Izolovala sa celková RNA z trojdňových hypokotylov bôbov Mungo s použitím systému SV Total RNA izolačného systému od spoločnosti Promega. Na vytvorenie prvého vlákna cDNA sa inkubovala celková RNA 1 h pri 48 °C s AMV reverznou transknptázou a oligo(dT) primármi, s použitím systému Reverse Transcription Systém spoločnosti Promega.
Prvé vlákno cDNA sa použilo v reakcii PCR s kombináciou sense a anti-sense primérov:
K 10 μΐ zmesi z reverznej transkripcie sa pridali nasledovné zložky:
μΐ roztoku s 0,1 μιηοΐ každého priméru; 0,1 mM dNTP (deoxyribonukleotid-trifosfáty), 2 mM MgCl2; 10 mM Tris-HCl tlmivý roztok s pH 9,0; 50 mM KC1 a 0,1 % Triton X-100.
Po prvom kroku na denaturáciu, 2 min. pri 95 °C, prebehlo 40 cyklov 1 min. pri 95 °C, 1 min. pri 49 °C a 2 min. pri 72 °C. Posledný predlžovací krok prebehol 8 min. pri 95 °C. Produkty PCR sme subklonovali do vektora pCR2.1 s použitím súpravy TA Cloning Kit od spoločnosti Invitrogen a následne sekvenovali. Produktmi PCR boli dva fragmenty DNA s dĺžkou 744 bp a 780 bp, pričom obidva fragmenty DNA mali rovnaký 5' koniec (pozri aj obr. 7).
Na základe týchto dvoch fragmentov DNA sa pripravili aj chýbajúce 3' a 5' oblasti cDNA prostredníctvom rýchlej amplifikácie 5'- a 3'- koncov cDNA (RAČE) s použitím súpravy RAČE Kit od spoločnosti Gibco-BRL. Ako anti-sense primér sme použili univerzálny amplifikačný primér zo súpravy, ako sense primér buď sekvenciu 5'-CTGGAACTGTCCCTGTGGTT-3' (SEQ ID No: 12) alebo sekvenciu 5'-AGTGCACTAGA GGGCCAGAA-3' (SEQ ID No: 13). Ako sense primér sme použili aj skrátený kotviaci primér zo súpravy a ako anti-sense primér sekvenciu 5'-TTCGAGCACCACAATTGGAAAT-3' (SEQ ID No: 14) alebo sekvenciu 5'-GAATGCAAAGACGGCACGATGAAT-3' (SEQ ID No: 15).
PCR prebiehala s anelačnou teplotou 55 °C za podmienok opísaných skôr. Produkty 5' a 3' RAČE sme subklonovali do vektora pCR2.1 a následne sekvenovali: Sekvencie subklonovaných fragmentov sme sekvenovali dideoxynukleotidovou metódou (reakčná súprava ABI PRISM Dye Terminátor Cycle Sequencing Ready a analyzátor ABI PRISM 310 - Perkin Elmer). Na sekvenovanie produktov klonovaných vo vektore pCR2.1 sa použili dopredné priméry T7 a M13. Obidve vlákna kódujúcej oblasti sekvenovala služba Vienna VBC Genomics-Sequencing Service s použitím priméru s infračerveným značením (IRD700 a IRD800) a sekvenátora LI-COR Long Read IR 4200 (Lincoln, NE).
Obr. 5a a 5b predstavujú celkovú cDNA s dĺžkou 2 198 bp a s otvoreným čítacím rámcom s dĺžkou 1 530 bp (SEQ ID No: 1). Otvorený čítací rámec (štartovací kodón tvoria bázové páry 211-213, stop-kodón tvoria bázové páry 1740-1743) kóduje protein zložený z 510 aminokyselín s molekulovou hmotnosťou 56,8 kDa a teoretickou hodnotou pi 7,51.
Obr. 6a a 6b predstavujú aminokyselinovú sekvenciu GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy odvodenú od cDNA (SEQ ID No: 2). Miesta na glykozyláciu asparagínu sú na pozíciách Asn346 a Asn429.
Na obr. 7 je schematické znázornenie GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy (hore) a odvodený index hydrofóbnosti kódovaného proteínu (dolu), pričom pozitívny index hydrofóbnosti znamená zvýšenú hydrofóbnosť. Medzi tým je znázornená veľkosť obidvoch spomenutých PCR produktov v porovnaní s úplnou cDNA. Kódujúca oblasť je znázornená pruhom, pričom „C“ označuje cytoplazmatickú oblasť, „T“ označuje predpokladanú transmembránovú oblasť a „G“ označuje predpokladanú katalytickú oblasť transferázy, ktorá je orientovaná dovnútra Golgiho komplexu. Analýza sekvencie DNA programom „TMpred“ (EMBnet, Švajčiarsko) predpokladá pravdepodobnú transmembránovú oblasť medzi Asn36 a Gly54. C-terminálna oblasť enzýmu pravdepodobne obsahuje katalytickú oblasť a mala by byť teda orientovaná dovnútra Golgiho komplexu. Podľa toho sa zdá, že transferáza je transmembránovým proteínom typu II tak, ako všetky doteraz analyzované glykozyltransferázy, ktoré sa zúčastňujú biosyntézy glykoproteínov (Joziasse, 1992 Glycobiology 2, 271-277). Sivé oblasti predstavujú štyri tryptické peptidy, šesťuholníky predstavujú potenciálne N-glykozylačné miesta. Rešerš BLASTP v dostupných databázach, prístupný cez NCBI, preukázal podobnosť medzi GlcNAc-al,3-fukozyltransferázou a inými al,3/4-fukozyltransferázami, napr. ľudskou fukozyltransferázou-VI. S percentuálnym koeficientom 18-21 % (porovnanie pomocou SIM-LALNVIEW, Expase, Švajčiar sko) je celková podobnosť ďaleko od akejkoľvek významnosti. Napriek tomu vykazuje časť sekvencie s dĺžkou 35 aminokyselín (SEQ ID No: 4) nápadne vysokú homológiu s inými al,3/4-fukozyltransferázami (obr. 8). Táto oblasť sekvencie sa nachádza medzi Glu267 a Pro301 v SEQ ID No: 2.
Príklad 5
Expresia rekombinantnej GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy v bunkách hmyzu
Kódujúcu oblasť predpokladanej GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy vrátane cytoplazmatickej a transmembránovej oblasti, sme amplifikovali s dopredným primérom 5'-CGGCGGATCCGCAATTGAATGATG-3' (SEQ ID No: 16) a so spätným primérom 5'-CCGGCTGCAGTACCATTTAGGCCAT-3' (SEQ ID No: 10 17) v PCR systéme Expand High Fidelity PCR Systém od spoločnosti Boehringer Mannheim. Produkt PCR sa štiepil pomocou Pst I a Bam Hl a subklonoval do bakulovirálneho transferového vektora pVL1393, ktorý bol predtým opracovaný alkalickou fosfatázou a štiepený enzýmami Pst I a Bam HL Aby bola zaručená homologická rekombinácia, bol vektor kotransfekovaný spolu s vírusovou DNA Baculo Gold (PharMingen, San Diego, Califomia) do buniek hmyzu Sf9 v médiu IPL-41 s lipofektínom. Po inkubácii 5 dní pri 27 °C sa 15 odobrali rozličné objemy média na infekciu hmyzích buniek Sf21. Po inkubácii 4 dni pri 27 °C v médiu IPL-41 s 5 % FCS sa zbierali bunky Sfl a premyli sa 2* v soľnom roztoku s fosfátovým tlmivým roztokom. Bunky sa suspendovali v 25 mM Tris-HCl tlmivom roztoku s pH 4,4 a 2 % Triton X-100 a rozbili sonifikáciou v ľadovom kúpeli.
Príklad 6
Stanovenie GlcNAc-al,3-fukozyltransferázovej aktivity
Homogenát a médium z buniek sa použili na stanovenie GlcNAc-al,3-fukozyltransferázovej aktivity. Ako kontrola boli použité vzorky s rekombinantným bakulovírusom kódujúcim GlcNAc-transferázu z tabaku (Strasser et al. 1999, Glycobiology, v tlači).
Obr. 9 ukazuje nameranú enzýmovú aktivitu rekombinantnej GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy a negatívnej kontrolnej vzorky. V najlepšom prípade bola enzýmová aktivita v kotransfekovaných bunkách a ich médiu 30x vyššia než v negatívnej kontrolnej vzorke. Táto endogénna aktivita, ktorá sa dá namerať v neprítomnosti rekombinantnej transferázy, pochádza najmä z hmyzej ocl,6-fukozyltransferázy a len nízke percento pochádza z GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy. Na základe toho je zvýšenie GlcNAc-al,3-fiikozyltransferázy 30 pochádzajúcej z rekombinantných bakulovírusov viac než 100-násobné.
Ak sme aktivitu merali v tlmivom roztoku kyseliny 2-(N-morfolino)etánsulfónovej-HCl, mal enzým širokú maximálnu aktivitu v okolí pH 7,0. Ako je zjavné z tabuľky 2, aktivita rekombinantnej transferázy sa zvyšuje po pridaní dvojmocných katiónov, najmä Mn2+.
Tabuľka 2
Pridaná látka (koncentrácia 10 mM) Pomerná aktivita (akceptor: GnGn-peptid) %
žiadna 21
EDTA 18
MnCl, 100
CaCl2 82
MgCl2 52
CdCl2 44
CoCl2 35
CuCl2 3
NiCl2 24
ZnCl2 0,6
Tabuľka 3 ukazuje, že spomedzi použitých akceptorov vykazuje za štandardných pokusných podmienok najväčšiu rýchlosť inkorporácie GnGn-peptid, hneď po ňom GnGnF6-peptid a M5Gn-Asn. K žiadnemu transferu nedochádzalo na ΜΜ-peptid, ktorý nemá redukujúci GlcNAc koniec na 3-viazanej manóze. Zdá sa, že 40 táto štruktúra je pre Core-fukozyltransferázu potrebná. Rekombinantná transferáza bola ďalej inaktívna čo sa týka akceptorov použiteľných na určovanie al,3/4-fukozyltransferáz krvných skupín, ktoré prenášajú fukózu na GlcNAc na neredukujúcich koncoch oligosacharidov. Zjavné hodnoty Km pre akceptorové substráty GnGn-peptid, GnGnFs-peptid, M5Gn-Asn a pre donorový substrát GDP-fukóza sa odhadli na 0,19; 0,13; 0,23 a 0,11. Štruktúra týchto molekúl je znázornená na obr. 10a a 10b.
SK 286416 Β6
Tabuľka 3
Akceptorový substrát Pomerná aktivita % Hodnota Km mM
GnGn-peptid 100 0,19
GnGnF6-peptid 87 0,13
M5Gn-Asn 71 0,23
MM-peptid 0
Gaipi-4GlcNAc 0
Gaip 1-3 GlcNAc 0
Galpl-3GlcNAcpl-3Gaipi-4Glc 0
Príklad 7
Hmotnostná spektrometria produktov fukozyltransferázy
Dabsylovaný GnGn-hexapeptid (2 nmol) sa inkuboval s homogenátom hmyzích buniek spolu s rekombinantnou GlcNAc-al,3-fukozyltransferázou (0,08 mU) za prítomnosti nerádioaktívnej GDP-L-fukózy (10 nmol), tlmivého roztoku 2-(N-morfolino)metánsulfonát-HCl, Triton X-100, MnCl2, GlcNAc a AMP. Negatívna kontrola pozostávala z homogenátu buniek infikovaných ako negatívna kontrola. Vzorky sa inkubovali 16 hodín pri 37 °C a analyzovali hmotnostnou spektrometriou MALDI TOF.
Hmotnostná spektrometria prebehla na prístroji DYNAMO (Therrmo BioAnalysis, Šanta Fe, NM) typu MALDI-TOF MS, ktorý je schopný robiť dynamickú extrakciu (synonymum pre oneskorenú extrakciu). Použili sme dva spôsoby prípravy matice vzoriek: Peptidy a dabsylované glykopeptidy sme rozpustili v 5 % kyseline mravčej a alikvóty sme nanášali na cieľ, vysušili na vzduchu a pokryli 1 % kyselinou a-kyano-4-hydroxyškoricovou. Pyridylaminované sacharidy, redukujúce oligosacharidy a glykopeptidy bez derivátov sme zriedili vodou, naniesli na cieľ a vysušili na vzduchu. Po pridaní 2 % kyseliny 2,5-dihydroxybenzoovej sme vzorky okamžite vysušili vo vákuu.
Obr. 11 zobrazuje hmotnostné spektrum týchto vzoriek, pričom A predstavuje negatívnu kontrolu. Hlavný vrchol krivky (S) ukazuje substrát dabsyl-Val-Gly-Glu-(GlcNAc4Man3)Asn-Arg-Thr s vypočítanou hodnotou [M+H]+ 2 262,3. Tento substrát sa prejavuje aj pri (S ) ako produkt adície sodíka a ako menší ión, ktorý vznikol fragmentáciou azo-funkcie dabsylovej skupiny. Malé množstvo produktu (P, [M+H]+ = 2 408.4) sa dá pripísať endogénnej al,6-fukozyltransferáze. Vrchol krivky pri m/z = 2 424,0 ukazuje neúplnú degalaktozidáciu substrátu. Hmotnostné spektrum B ukazuje vzorku s rekombinantnou al,3-fukozyltransferázou. Hlavný vrchol krivky (P) predstavuje fukozylovaný produkt, (P ) jeho fragmentovaný ión.
Okrem toho sme zmiešali alikvóty obidvoch vzoriek, aby sme dosiahli podobnú koncentráciu substrátu a produktu (vzorka A). Túto zmes sme zriedili 0,1 M roztokom octanu amónneho pH 4,0 s 10 μΐ N-glykozidázy A (vzorka B) alebo s 50 mM Tris-HCl pH 8,5 so 100 pU (1 U hydrolyzuje 1 umol substrátu za minútu) N-glykozidázy F (vzorka C). Po 2 a 20 h sme odobrali alikvóty z týchto zmesí a analyzovali pomocou MALDI-TOF MS.
Na obr. 12 sú znázornené hmotnostné spektrá vzoriek A, B a C. Neštiepená vzorka A vykazuje dva vrcholy krivky: Substrát pri 2 261,4 m/z a fukozylovaný produkt pri 2 407,7 m/z. Prostredná krivka ukazuje hmotnostné spektrum vzorky B opracovanej N-glykozidázou A, ktorá hydrolyzuje obidva peptidy. Vrchol krivky pri 963,32 predstavuje deglykozylovaný produkt. Spodná krivka ukazuje hmotnostné spektrum vzorky C. N-glykozidáza F nie je schopná hydrolyzovať a 1,3-fukozylovaný substrát, takže v spektre je zjavný vrchol krivky pri 2 407,6 m/z fukozylovaného produktu, zatiaľ čo vrchol krivky patriaci hydrolyzovanému substrátu sa objavuje pri 963,08 m/z.
Príklad 8
HPLC analýza pyridylaminovaného produktu fukozyltransferázy
Obidve opísané vzorky (fukozylovaný produkt a negatívna kontrola) boli štiepené N-glykozidázou A. Takto získané oligosacharidy sme pyridylaminovali a analyzovali HPLC s reverznou fázou (Wilson et al. 1998 Glycobiology 8, 651-661; Kubelka et al. 1994 Árch. Biochem. Piophys. 308, 148-157; Haase et al. 1984 J. Biochem. 95, 197-203).
Na obr. 13 je na hornom diagrame B negatívna kontrola, pri ktorej je okrem zvyšného substrátu (GnGn-peptid) viditeľný aj al,6-fukozylovaný produkt. Na diagrame A je viditeľný vrchol krivky s očividne kratším retenčným časom, čo je špecifické pre fukózu naviazanú na redukujúci GlcNAc- al,3.
Na spodnom diagrame je porovnanie izolovaného transferázového produktu (krivka A) a po štiepení N-acetyl-P-glukozaminidázou (krivka B) s MMF3 z fosfolipázy A2 včely medonosnej (krivka C).
Sekvenačný protokol <110> Altmann Dr., Friedrich
SK 286416 Β6 < 120> alfa 1,3-fukozyltransferáza R36247 <130>R36247 <140>
<141>
<160>17 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211>2198 <212> DNA <213> rastlina <400> 1
actaactcaa acgctgcatt ttcttttttc tttcagggaa ccatccaccc ataacaacaa 60
aaaaaacaac agcaagctgt gtttttttta tcgttctttt tctttaaaca agcaccccca 120
tcatggaatc gtgctcataa cgccaaaatt ttccatttcc ctttgatttt tagtttattt 180
tgcggaattg gcagttgggg gcgcaattga atgatgggtc tgttgacgaa tcttcgaggc 240
tcgagaacag atggtgccca acaagacagc ttacccgttt tggctccggg aggcaaccca 300
aagaggaaat ggagcaatct aatgcctctt gttgttgccc ttgtggtcat cgcggagatc 360
gcgtttctgg gtaggttgga tatggccaaa aacgccgcca tggttgactc cctcgctgac 420
ttcttctacc gctctcgagc ggtcgttgaa ggtgacgatt tggggttggg tttggtggct 480
tctgatcgga attctgaatc gtatagttgt gaggaatggt tggagaggga ggatgctgtc 540
acgtattcga ggggcttttc caaagagcct atttttgttt ctggagctga tcaggagtgg 600
aagtcgtgtt cggttggatg taaatttggg tttagtgggg atagaaagcc agatgccgca 660
tttgggttac ctcaaccaag tggaacagct agcattctgc gatcaatgga atcagcagaa 720
tactatgctg agaacaatat tgccatggca agacggaggg gatataacat cgtaatgaca 780
accagtctat cttcggatgt tcctgttgga tatttttcat gggctgagta tgatatgatg 840
gcaccagtgc agccgaaaac tgaagctgct cttgcagctg ctttcattCc caattgtggt 900
gctcgaaatt tccggttgca agctcttgag gcccttgaaa aatcaaacat caaaattgat 960
tcttatggtg gttgtcacag gaaccgtgat ggaagagtga acaaagtgga agccctgaag 1020
cactacaaat ttagcttagc gtttgaaaat tcgaatgagg aagattatgt aactgaaaaa 1080
ttcttccaat cccttgttgc tggaactgtc cctgtggttg ttggtgctcc aaatattcag 1140
gactttgctc cttctcctgg ttcaatttta catattaaag agatagagga tgttgagtct 1200
gttgcaaaga ccatgagata tctagcagaa aatcccgaag catataatca atcattgagg 1260
tggaagtatg agggtccatc tgactccttc aaggcccttg Ľggatatggc agctgtgcat 1320
tcatcgtgcc gtctttgcat tcacttggcc acagtgagta gagagaagga agaaaataat 1380
ccaagcctta agagacgtcc ttgcaagtgc actagagggc cagaaaccgt atatcatatc 1440
tatgtcagag aaaggggaag gtttgagatg gagtccattt acctgaggtc tagcaattta 1500
actctgaatg ctgtgaaggc tgctgttgtt Ľtgaagttca catccctgaa tcttgtgcct 1560
gtatggaaga ctgaaaggcc tgaagttata agagggggga gtgctttaaa actctacaaa 1620
atatacccaa ttggcttgac acagagacaa gctctttata ccttcagctt caaaggtgat 1680
gctgatttca ggagtcactt ggagaacaat ccttgtgcca agtttgaagt catttttgtg 1740
tagcatgcgc taaatggtac ctctgctcta cctgaattag cttcacttag ctgagcacta 1800
gctagagttt taggaatgag tatggcagtg aatatggcat ggctttattt atgcctagtt 1860
tcttggccaa ctcattgatg ttttgtataa gacatcacac tttaatttta aacttgtttc 1920
tgtagaagtg caaatccata tttaatgctt agttttagtg ctcttatctg atcatctaga 1980
agtcacagtt cttgtatatt gtgagtgaaa actgaaatct aatagaagga tcagatgttt 2040
cactcaagac acattattac ttcatgttgt tttgatgatc tcgagctttt ttagtgtctg 2100
gaactgtccc tgtggtttga gcacctgtta ttgcttcagt gttactgtcc agtggttatc 2160
gtttttgacc tctaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2198
SK 286416 Β6 <210>2 <211>510 <212>PRT <213> rastlina <400> 2
Met 1 Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Arg Gly Ser Arg Thr Asp Gly 15 Ala
5 10
Gin Gin Asp Ser Leu Pro Val Leu Ala Pro Gly Gly Asn Pro Lys Arg
20 25 30
Lys Trp Ser Asn Leu Met Pro Leu Val Val Ala Leu Val Val íle Ala
35 40 45
Glu íle Ala Phe Leu Gly Arg Leu Asp Met Ala Lys Asn Ala Ala Met
50 55 60
Val Asp Ser Leu Ala Asp Phe Phe Tyr Arg Ser Arg Ala Val Val Glu
65 70 75 80
Gly Asp Asp Leu Gly Leu Gly Leu Val Ala Ser Asp Arg Asn Ser Glu
85 90 95
Ser Tyr Ser Cys Glu Glu Trp Leu Glu Arg Glu Asp Ala Val Thr Tyr
100 105 110
Ser Arg Gly Phe Ser Lys Glu Pro íle Phe Val Ser Gly Ala Asp Gin
115 120 125
Glu Trp 130 Lys Ser Cys Ser Val 135 Gly Cys Lys Phe Gly 140 Phe Ser Gly Asp
Arg Lys Pro Asp Ala Ala Phe Gly Leu Pro Gin Pro Ser Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ser íle Leu Arg Ser Met Glu Ser Ala Glu Tyr Tyr Ala Glu Asn Asn
165 170 175
íle Ala Met Ala Arg Arg Arg Gly Tyr Asn íle Val Met Thr Thr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Asp Val Pro Val Gly Tyr Phe Ser Trp Ala Glu Tyr Asp
195 200 205
Met Met Ala Pro Val Gin Pro Lys Thr Glu Ala Ala Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Phe íle Ser Asn Cys Gly Ala
Arg Asn Phe Arg
Leu
Gin Ala Leu Glu
225
230
235
240
Ala Leu Glu Lys Ser Asn íle Lys íle Asp > Ser Tyr Gly Gly Cys ; His
245 250 255
Arg Asn Arg Asp Gly Arg Val Asn Lys Val Glu i Ala Leu Lys ; His : Tyr
260 265 270
Lys Phe Ser Leu Ala Phe Glu Asn Ser Asn Glu Glu Asp i Tyr Val Thr
275 280 285
Glu Lys Phe Phe Gin Ser Leu Val Ala Gly Thr Val Pro Val Val Val
290 295 300
Gly Ala Pro Asn íle Gin Asp Phe Ala Pro Ser Pro Gly Ser íle Leu
305 310 315 320
His íle Lys Glu íle Glu Asp Val Glu Ser Val Ala Lys Thr Met Arg
325 330 335
Tyr Leu Ala Glu Asn Pro Glu Ala Tyr Asn Gin Ser Leu Arg Trp Lys
340 345 350
Tyr Glu Gly Pro Ser Asp Ser Phe Lys Ala Leu Val Asp Met Ala Ala
355 360 365
Val His Ser Ser cys Arg Leu Cys íle His Leu Ala Thr Val Ser Arg
370 375 380
Glu Lys Glu Glu Asn Asn Pro Ser Leu Lys Arg Arg Pro Cys Lys Cys
385 390 395 400
Thr Arg Gly Pro Glu Thr Val Tyr His íle Tyr Val Arg Glu Arg Gly
405 410 415
Arg Phe Glu Met Glu Ser íle Tyr Leu Arg Ser Ser Asn Leu Thr Leu
420 425 430
Asn Ala Val Lys Ala Ala Val Val Leu Lys Phe Thr Ser Leu Asn Leu
435 440 445
Val Pro Val Trp Lys Thr Glu Arg Pro Glu Val íle Arg Gly Gly . Ser
450 455 460
Ala Leu Lys Leu Tyr Lys íle Tyr Pro íle Gly Leu Thr Gin Arg Gin
465 470 475 480
Ala Leu Tyr Thr Phe Ser Phe Lys Gly Asp Ala Asp Phe Arg Ser His
485 490 495
Leu GLu Asn Asn Pro Cys Ala Lys Phe Glu ' VaL íle Phe Val
500 505 510
SK 286416 Β6 <210> 3 <211> 105 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: cDNA <400> 3 gaagccctga agcactacaa atttagctta gcgtttgaaa attcgaatga ggaagttat 60 gtaactgaaa aattcttcca atcccttgtt gctggaactg tccct 105 <210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid <400> 4
Glu Ala Leu Lys His Tyr Lys Phe Ser Leu Ala Phe Glu Asn Ser Asn 1 5 10 15
Glu Glu Asp Tyr Val Thr Glu Lys Phe Phe Gin Ser Leu Val Ala Gly 20 25 30
Thr Val Pro <210>5 <211> 15 <212> PRT <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid <400> 5
Lys Pro Asp Ala Xaa Phe Gly Leu Pro Gin Pro Ser Thr Ala Ser
5 10 15 <210>6 <211> 10 <212>PRT <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid <400> 6
Pro Glu Thr Val Tyr His íle Tyr Val Arg
5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid <400> 7
Met Glu Ser Ala Glu Tyr Tyr Ala Glu Asn Asn íle Ala
5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid <400> 8
Gly Arg Phe Glu Met Glu Ser íle Tyr Leu
5 10 <210> 9 <211> 29 <212>DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: DNA <400> 9 gcngartayt aygcngaraa yayaathgc 29 <210> 10 <211> 22 <212>DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: DNA <400> 10 crtadatrtg rtanacngty tc 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: DNA <400> 11 tadatnswyt ccatytcraa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: DNA <400> 12 ctggaactgt ccctgtggtt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: DNA <400> 13 agtgcactag agggccagaa 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: DNA <400> 14 ttcgagcacc acaattggaa at 22 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: DNA <400> 15 gaatgcaaag acggcacgat gaat 24 <210> 16 <211> 24 <212>DNA <213> umelá sekvencia
SK 286416 Β6 <220>
<223> Opis umelej sekvencie: DNA <400> 16 cggcggatcc gcaattgaat gatg 24 <210> 17 <211> 25 <212>DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: DNA <400> 17 ccggctgcag taccatttag cgcat 25

Claims (25)

1. Molekula DNA, vyznačujúca sa tým, že obsahuje sekvenciu podľa SEQ ID NO: 1 s otvoreným čítacím rámcom od bázového páru 211 po bázový pár 1 740, alebo vykazuje aspoň 50 % identitu s uvedenou sekvenciou, alebo ktorá hybridizuje s uvedenou sekvenciou za striktných podmienok, alebo ktorá obsahuje sekvenciu, ktorá je dôsledkom genetického kódu degenerovaná k uvedenej DNA sekvencii, pričom sekvencia kóduje rastlinný proteín s fukozyltransferázovou aktivitou alebo je k takejto komplementárna.
2. Molekula DNA podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, žekódujeproteínsGlcNAc-a 1,3-fukozyltransferázovou aktivitou, najmä však s Core-al,3-fukozyltransferázovou aktivitou.
3. Molekula DNA podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúca sa tým, že vykazuje aspoň 70 až 80 % identitu, obzvlášť výhodne aspoň 95 % identitu k sekvencii podľa SEQ ID NO: 1.
4. Molekula DNA podľa jedného z nárokov 1 až 3, vyznačujúca sa tým, že obsahuje 2 150 až 2 250, najmä však 2 198 bázových párov.
5. Molekula DNA, vyznačujúca sa tým, že obsahuje sekvenciu podľa SEQ ID NO: 3 alebo sekvenciu, ktorá vykazuje aspoň 85 % identitu, najmä však aspoň 95 % identitu k uvedenej sekvencii alebo ktorá za striktoých podmienok hybridizuje s uvedenou sekvenciou alebo ktorá obsahuje sekvenciu, ktorá je dôsledkom genetického kódu degenerovaná k uvedenej DNA sekvencii.
6. Molekula DNA, vyznačujúca sa tým, že zahrnuje čiastkovú sekvenciu molekuly DNA podľa jedného z nárokov 1 až 4 a ktorá vykazuje aspoň 80 % identitu k SEQ ID NO: 1, ako aj veľkosť od 20 do 200, výhodne 30 až 50 bázových párov.
7. Molekula DNA podľa jedného z nárokov 1 až 6, vyznačujúca sa tým, že je kovalentne naviazaná na detekovateľnú značkovaciu látku.
8. Biologicky funkčný vektor, vyznačujúci jedného z nárokov 1 až 7.
9. Biologicky funkčný vektor, vyznačujúci sa tým, že obsahuje molekulu DNA podľa sa tým, že obsahuje molekulu DNA podľa jedného z nárokov 1 až 7, v inverznej orientácii k promótora.
10. Molekula DNA, ktorá kóduje ribozým a vyznačujúca sa tým, že obsahuje dva úseky sekvencie, každý s dĺžkou 10 až 15 bázových párov, ktoré sú komplementárne k úsekom sekvencie molekuly DNA podľa jedného z nárokov 1 až 7, takže ribozým vytvára komplex a štiepi mRNA, ktorá vzniká transkripciou z prirodzenej molekuly DNA pre GlcNAc-al,3-fukozyltransferázu.
11. Biologicky funkčný vektor, vyznačujúci sa tým, že obsahuje molekulu DNA podľa nároku 10.
12. Spôsob výroby cDNA, ktorá obsahuje molekulu DNA podľa jedného z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že sa izoluje RNA z buniek rastlín, najmä však z buniek hypokotylu a po pridaní reverznej transkriptázy a primárov, ktoré sú špecifické pre DNA molekulu podľa jedného z nárokov 1 až 5, alebo primérov, ktoré sú DNA molekulou podľa jedného z nárokov 1 až 5 hybridizované, sa vykoná reverzná transkripcia.
13. Spôsob klonovania GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy, vyznačujúci sa tým, že sa do vektora klonuje molekula DNA podľa jedného z nárokov 1 až 5 a tento sa následne transfekuje do hostiteľskej bunky prípadne hostiteľa, pričom sa prostredníctvom selekcie a amplifikácie transfekovaných hostiteľských buniek získajú bunkové línie, ktoré exprimujú aktívnu GlcNAc-ccl,3-fukozyltransferázu.
14. Spôsob výroby rekombinantných hostiteľských buniek, najmä buniek rastlín, alebo rastlín s potlačenou alebo úplne zastavenou produkciou GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy, vyznačujúci sa tým, že aspoň jeden z vektorov podľa nároku 8, 9 alebo 11 prípadne vektor obsahujúci molekulu DNA podľa jedného z nárokov 1 až 7, ktorá obsahuje delečnú, inzerčnú a/alebo substitučnú mutáciu, sa vnesie do hostiteľskej bunky, prípadne rastliny.
SK 286416 Β6
15. Spôsob výroby rekombinantných hostiteľských buniek, najmä buniek rastlín alebo rastlín, vyznačujúci sa tým, že sa do genómu hostiteľskej bunky, prípadne rastliny, vnesie molekula DNA podľa jedného z nárokov 1 až 7, ktorá obsahuje delečnú, inzerčnú a/alebo substitučnú mutáciu, na miesto nemutovanej, homologickej sekvencie.
16. Rekombinantné rastliny prípadne rastlinné bunky, vyznačujúce sa tým, že aspoň jeden z vektorov podľa nárokov 8, 9, alebo 11, prípadne vektor zahrnujúci DNA-molekulu podľa jedného z nárokov 1 až 7, pričom DNA-molekula zahrnuje delečnú, inzertnú, a/alebo substitučnú mutáciu, je do nich vnesená a má potlačenú alebo úplne zastavenú endogénnu produkciu GlcNAc-al,3-fukozyltransferázy.
17. Rekombinantné rastliny prípadne rastlinné bunky, vyznačujúce sa tým, že DNA molekula podľa jedného z nárokov 1 až 7, pričom DNA molekula zahrnuje delečnú, inzertnú a/alebo substitučnú mutáciu, je vnesená do genómu buniek, prípadne rastlín namiesto nemutovanej homologickej sekvencie, a že má potlačenú alebo úplne zastavenú endogénnu produkciu GlcNAc-α 1,3-fukozyltransferázy.
18. Molekula kyseliny peptidnukleovej (PNA), vyznačujúca sa tým, že obsahuje sekvenciu báz, ktorá je komplementárna k sekvencii molekuly DNA podľa jedného z nárokov 1 až 6, kódujúcej GlcNAc-α 1,3-fukozyltransferázu.
19. Molekula kyseliny peptidnukleovej (PNA), vyznačujúca sa tým, že obsahuje sekvenciu báz, ktorá zodpovedá sekvencii molekuly DNA podľa jedného z nárokov 1 až 6, kódujúcej GlcNAc-a 1,3-fukozyltransferázu.
20. Spôsob výroby rastlín prípadne buniek, najmä rastlinných buniek, ktoré vykazujú blokovanie expresie GlcNAc-al,3-fukozyltransferáz na úrovni transkripcie prípadne translácie, vyznačujúci sa tým, že sa do buniek vnesie molekula PNA podľa nároku 18 alebo 19.
21. Spôsob výroby rekombinantných glykoproteínov, vyznačujúci sa tým, že rekombinantné rastliny, rastlinné bunk,y prípadne rastlinné tkanivá, podľa nároku 16 alebo 17, alebo rastliny, rastlinné tkanivá prípadne bunky, do ktorých je vnesená molekula PNA podľa nároku 18 alebo 19, a ktoré vykazujú blokovanie expresie GlcNAc-al,3-fukozyltransferáz na úrovni transkripcie prípadne translácie, sú transfekované génom kódujúcim glykoproteín, takže sa exprimujú rekombinantné glykoproteíny.
22. Spôsob výroby rekombinantných ľudských glykoproteínov, vyznačujúci sa tým, že rekombinantné rastliny, rastlinné bunky, prípadne rastlinné tkanivá podľa nároku 16 alebo 17, alebo rastliny, rastlinné tkanivá, alebo bunky, do ktorých je vnesená molekula PNA podľa nároku 18 alebo 19, a ktoré vykazujú blokovanie expresie GlcNAc-al,3-fukozyltransferáz na úrovni transkripcie prípadne translácie, sú transfekované génom kódujúcim glykoproteín, takže sa exprimujú rekombinantné glykoproteíny.
23. Spôsob výroby rekombinantných ľudských glykoproteínov na použitie v medicíne, vyznačujúci sa tým, že rekombinantné rastliny, rastlinné bunky, prípadne rastlinné tkanivá, podľa nároku 16 alebo 17, alebo rastliny, rastlinné tkanivá, prípadne bunky, do ktorých je vnesená molekula PNA podľa nároku 18 alebo 19, a ktoré vykazujú blokovanie expresie GlcNAc-al,3-íukozyltransferáz na úrovni transkripcie, prípadne translácie sú transfekované génom kódujúcim glykoproteín, takže sa exprimujú rekombinantné glykoproteíny.
24. Spôsob selekcie molekúl DNA kódujúcich GlcNAc-al,3-fukozyltransferázu zo vzorky, vyznačujúci sa tým, že sa ku vzorke pridajú molekuly DNA podľa nároku 7, ktoré sa naviažu na molekuly DNA kódujúce GlcNAc-orí ,3-fukozyltransferázu.
25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že vzorka zahrnuje genómovú DNA organizmu rastliny.
SK1118-2001A 1999-02-18 2000-02-17 Gén na fukozyltransferázu SK286416B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0027099A AT408446B (de) 1999-02-18 1999-02-18 Fucosyltransferase-gen
PCT/AT2000/000040 WO2000049153A1 (de) 1999-02-18 2000-02-17 Fucosyltransferase-gen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK11182001A3 SK11182001A3 (sk) 2002-01-07
SK286416B6 true SK286416B6 (sk) 2008-09-05

Family

ID=3486087

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1118-2001A SK286416B6 (sk) 1999-02-18 2000-02-17 Gén na fukozyltransferázu

Country Status (29)

Country Link
US (3) US8198078B2 (sk)
EP (3) EP1151109B1 (sk)
JP (2) JP5514386B2 (sk)
KR (1) KR20010108234A (sk)
CN (1) CN1360633A (sk)
AT (2) AT408446B (sk)
AU (1) AU771995B2 (sk)
BG (1) BG65140B1 (sk)
BR (1) BR0010114A (sk)
CA (1) CA2362964C (sk)
CZ (2) CZ299622B6 (sk)
DE (1) DE50011116D1 (sk)
DK (2) DK1151109T3 (sk)
EE (1) EE200100432A (sk)
ES (2) ES2246222T3 (sk)
HR (1) HRP20010681A2 (sk)
HU (1) HU230075B1 (sk)
IL (2) IL144777A0 (sk)
IS (1) IS6041A (sk)
MX (1) MXPA01008372A (sk)
NO (1) NO20013993L (sk)
NZ (1) NZ513685A (sk)
PL (2) PL205785B1 (sk)
PT (1) PT2062977E (sk)
SK (1) SK286416B6 (sk)
TR (1) TR200102393T2 (sk)
WO (1) WO2000049153A1 (sk)
YU (1) YU58901A (sk)
ZA (1) ZA200106735B (sk)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2264177B1 (en) 1998-12-09 2015-09-30 Phyton Holdings, LLC Glycoproteins having human-type glycosylation
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen
ES2568899T3 (es) 1999-04-09 2016-05-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
NZ518532A (en) 1999-10-26 2004-02-27 Plant Res Internat B Transgenic plant expressing mammalian beta-1,4- galactosyltransferase
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
WO2002057468A2 (en) 2001-01-19 2002-07-25 The Dow Chemical Company Method for secretory production of glycoprotein having human-type sugar chain using plant cell
CA2923247A1 (en) 2002-03-19 2003-09-25 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Optimizing glycan processing in plants
CA2819867A1 (en) 2002-03-19 2003-09-25 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Gntiii (udp-n-acetylglucosamine:beta-d mannoside beta (1,4)-n-acetylglucosaminyltransferase iii) expression in plants
AU2003236020B2 (en) * 2002-04-09 2009-03-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
AR042145A1 (es) 2002-11-27 2005-06-08 Dow Agrociences Llc Produccion de inmunoglobulinas en plantas con una fucocilacion reducida
ATE426033T1 (de) 2003-08-11 2009-04-15 Greenovation Biotech Gmbh Promoter sequenzen aus moos und dessen verwendung
FI20055398A0 (fi) 2005-07-08 2005-07-08 Suomen Punainen Risti Veripalv Menetelmä solupopulaatioiden evaluoimiseksi
BRPI0707290A2 (pt) 2006-01-17 2011-08-16 Biolex Therapeutics Inc composições e métodos para humanização e otimização de n-glicanas em plantas
US20090060921A1 (en) * 2006-01-17 2009-03-05 Biolex Therapeutics, Inc. Glycan-optimized anti-cd20 antibodies
CN102094019B (zh) * 2007-01-15 2012-11-28 燕秋 用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶Ⅳ的RNA干涉序列及重组干涉质粒
CN102094020B (zh) * 2007-01-15 2012-11-28 燕秋 用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶I的RNA干涉序列及重组干涉质粒
EP2147108B1 (en) 2007-04-17 2014-03-05 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Mammalian-type glycosylation in plants by expression of non-mammalian glycosyltransferases
CA2698374C (en) * 2007-09-07 2018-04-03 Children's Hospital Medical Center Use of secretor, lewis and sialyl antigen levels as predictors for disease
AU2007360682A1 (en) * 2007-10-31 2009-05-07 Bayer Bioscience N.V. Method to produce modified plants with altered N-glycosylation pattern
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
DK2944690T3 (en) 2010-10-11 2018-04-03 Jennewein Biotechnologie Gmbh UNKNOWN FUCOSYL TRANSFERASES AND THEIR APPLICATIONS
KR101293658B1 (ko) * 2010-12-30 2013-08-07 대한민국 알파-1,3-푸코실트랜스퍼라아제 및/또는 베타-1,2-자일로실트렌스퍼라아제 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 벡터 및 형질전환된 벼
DK2479263T3 (da) * 2011-01-20 2014-02-03 Jennewein Biotechnologie Gmbh Nye fucosyltransferaser og deres anvendelser
EP2789686A1 (en) 2013-04-11 2014-10-15 Greenovation Biotech GmbH Expression of phosphorylated glycoproteins in plants
EP3050973A1 (en) * 2015-01-30 2016-08-03 Jennewein Biotechnologie GmbH Fermentation process for producing monosaccharides in free form from nucleotide-activated sugars
CN110317799A (zh) * 2019-07-18 2019-10-11 江南大学 一种人源岩藻糖转移酶8的原核表达方法及其产品
EP3871687A1 (en) 2020-02-27 2021-09-01 eleva GmbH Enzyme replacement therapy for treating pompe disease

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5272066A (en) 1986-03-07 1993-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Synthetic method for enhancing glycoprotein stability
DE69434749T2 (de) 1993-03-29 2007-04-26 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Alpha-1,3-Fucosyltransferase
US6509149B2 (en) * 1995-06-06 2003-01-21 Hybridon, Inc. HPV-specific oligonucleotides
US5770420A (en) * 1995-09-08 1998-06-23 The Regents Of The University Of Michigan Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0200394A3 (en) 2006-06-28
BG105899A (en) 2002-12-29
HRP20010681A2 (en) 2003-08-31
WO2000049153A1 (de) 2000-08-24
TR200102393T2 (tr) 2002-04-22
EP2062977B1 (de) 2014-01-08
PL363438A1 (en) 2004-11-15
PL205785B1 (pl) 2010-05-31
BR0010114A (pt) 2002-06-04
EP1151109B1 (de) 2005-09-07
JP5514386B2 (ja) 2014-06-04
CN1360633A (zh) 2002-07-24
JP2011120592A (ja) 2011-06-23
US20080234471A1 (en) 2008-09-25
KR20010108234A (ko) 2001-12-07
AU771995B2 (en) 2004-04-08
EP2062977A1 (de) 2009-05-27
ATA27099A (de) 2001-04-15
AT408446B (de) 2001-11-26
IL144777A0 (en) 2002-06-30
CZ308081B6 (cs) 2019-12-27
US20090199306A1 (en) 2009-08-06
AU2646000A (en) 2000-09-04
ES2444126T3 (es) 2014-02-24
CZ299622B6 (cs) 2008-09-24
IL144777A (en) 2007-12-03
US8198078B2 (en) 2012-06-12
NO20013993D0 (no) 2001-08-16
MXPA01008372A (es) 2003-06-06
EP1151109A1 (de) 2001-11-07
ES2246222T3 (es) 2006-02-16
HU230075B1 (hu) 2015-06-29
BG65140B1 (bg) 2007-03-30
NZ513685A (en) 2001-09-28
YU58901A (sh) 2004-03-12
EP1642979A1 (de) 2006-04-05
EE200100432A (et) 2002-12-16
ZA200106735B (en) 2002-08-15
PT2062977E (pt) 2014-04-07
CA2362964C (en) 2012-03-27
ATE304053T1 (de) 2005-09-15
HUP0200394A2 (hu) 2002-05-29
DE50011116D1 (en) 2005-10-13
PL205710B1 (pl) 2010-05-31
CZ20012943A3 (cs) 2002-04-17
DK2062977T3 (da) 2014-04-07
US8895806B2 (en) 2014-11-25
DK1151109T3 (da) 2006-01-16
SK11182001A3 (sk) 2002-01-07
IS6041A (is) 2001-08-08
NO20013993L (no) 2001-10-17
JP2002536978A (ja) 2002-11-05
CA2362964A1 (en) 2000-08-24
US20130212740A1 (en) 2013-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8895806B2 (en) Fucosyl transferase gene
US20070186311A1 (en) BETA 1,2-xylosyltransferase-gene from arabidopsis
KR20090077059A (ko) 갈락토실트랜스퍼라아제

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Expiry of patent

Expiry date: 20200217