ES2558160T3

ES2558160T3 - Glicoproteínas que tienen glicosilación de tipo humano

Info

Publication number: ES2558160T3
Application number: ES10170881.6T
Authority: ES
Inventors: Tatsuji Seki; Kazuhito Fujiyama
Original assignee: Phyton Holdings LLC
Current assignee: Phyton Holdings LLC
Priority date: 1998-12-09
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2016-02-02
Anticipated expiration: 2019-12-08
Also published as: AU771908B2; IL207261A0; BR9917026A; NZ512185A; JP2014054263A; EP2264177B1; EP1137789B1; PT1137789E; MXPA01005778A; JP2009028054A; BR9917026B1; DE69942636D1; US8853370B2; ZA200104695B; US8241909B2; CA2354377C; DK1137789T3; EP2264177A1; IL143641A; US7388081B2

Abstract

Una glicoproteína producida por una planta que comprende una cadena de azúcar de tipo humano, que comprende un residuo galactosa unido a un residuo N-acetilglucosamina, en donde el residuo galactosa en la cadena de azúcar de tipo humano es un residuo de azúcar terminal y en donde no hay xilosa ni fucosa unidas a la cadena de azúcar de tipo humano.

Description

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(i) Se utilizó DNA genómico humano como el molde y se utilizaron hGT-5Eco y hGT-7Spe como los iniciadores; (ii) se utilizó cDNA de placenta humana como el molde y se utilizaron como los iniciadores hGT-2Sal y hGT6Spe. Se combinaron ambos y se llevó a cabo una reacción PCR en las condiciones siguientes. Se obtuvieron luego fragmentos de 0,4 kb y fragmentos de 0,8 kb que contenían áreas codificadas de hGT.

(Mezcla de reacción PCR) 1 μl de DNA molde, 5 μml de solución tampón 10 xPCR, 4 μl dNTPs (200 mM), los iniciadores (10 pmol), y 0,5 μl (Takara Shuzo Co., Ltd.) de polimerasa Tag (o 0,2 μl de polimerasa Tub), y se añadió agua para completar hasta 50 μl.

(Condiciones de la reacción PCR) (primera etapa): 1 ciclo, desnaturalización (94ºC) 5 minutos, reasociación (55ºC) 1 minuto, extensión (72ºC) 2 minutos. Segunda etapa: 30 ciclos, desnaturalización (94ºC) 1 minuto, reasociación (55ºC) 1 minuto, extensión (72ºC) 2 minutos. Tercera etapa: 1 ciclo, desnaturalización (94ºC), 1 minuto, reasociación (55ºC) 2 minutos, extensión (72ºC) 5 minutos.

Se combinaron los dos fragmentos para formar cDNA del gen hGT y se clonaron en pBluescript II SK+ (SK). El pBluescript II SK+ (SK) se adquirió de Stratagene Co., Ltd. FIG 2 muestra la estructura de un plásmido que contenía cDNA del gen hGT. Éste exhibe la secuencia No. 5 en la secuencia de nucleótidos del gen hGT y la secuencia No. 6 en la secuencia de aminoácidos estimada. Esta secuencia de nucleótidos difería de la secuencia de hGT publicada por Masri et al. (véase anteriormente) en los aspectos siguientes: a) los nucleótidos son diferentes en el sentido de que A en la Posición No. 528 es G, C en la Posición No. 562 es T y A en la Posición No. 1047 es G; sin embargo, en la secuencia de aminoácidos codificada no cambia; b) faltan nueve nucleótidos en las posiciones desde la Posición No. 622 a la Posición No. 630; c) G en la Posición No. 405 es A y T en la Posición No. 408 es A. Estos cambios de nucleótidos se hicieron durante la preparación de los iniciadores de tal modo que el fragmento de 0,4 kb y el fragmento 0,8 kb están conectados. Existen dos codones de partida (ATG) en el cDNA del gen hGT. En este experimento, sin embargo, el gen está diseñado de tal modo que la traducción comienza desde el segundo codón inicial (Posición No. 37).

(Ejemplo 2) Introducción del Gen hGT en una Célula Cultivada de Tabaco

(1) Se ha consignado que hGT se expresa en forma activa en Escherichia coli (Aoki, D. et al., EMBO J., 9, 3171, 1990 y Nakazawa, K. et al., J. Biochem, 113, 747, 1993). A fin de que una célula cultivada de tabaco expresara hGT, el vector de expresión pGAhGT tuvo que estructurarse como se muestra en FIG 3. Se utilizó como el promotor un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (promotor CaMV 35S), que dirige constitutivamente la expresión del gen en células de planta. Se utilizó como marcador de selección un gen de resistencia a la kanamicina. El pGAhGT se introdujo en la célula cultivada de tabaco por el método de Agrobacterium.

El método de Agrobacterium se llevó a cabo utilizando el método de apareamiento triparental de Bevan et al. (Bevan, M., Nucleic Acids Res., 12, 8711, 1984). Escherichia coli DH5α (suE44, DlacU169, (φ801acZDM15), hsdR17) (Bethesda Research Laboratories Inc.: Focus 8 (2), 9, 1986) con plásmidos de tipo pGA (An. G., Methods Enzymol. 153, 292, 1987) y Escherichia coli HB101 con el plásmido adyuvante pRK2013 (Bevan, M., Nucleic Acid Res., 12, 8711, 1984) se dejaron en reposo durante una noche a 37ºC en un medio 2 x YT que contenía 12,5 mg/l de tetraciclina y 50 mg/l de kanamicina, y Agrobacterium tumefaciens EHA101 se dejó en reposo durante dos noches a 28ºC en un medio 2 x YT que contenía 50 mg/l de kanamicina y 25 mg/l de cloranfenicol. A continuación, se retiraron 1,5 ml de cada medio cultivado y se pusieron en un tubo Eppendorf. Después que se hubieron recogido las células de cada cepa, se lavaron 3 veces las células en un medio LB. Las células obtenidas de este modo se suspendieron luego en 100 μl de un medio 2 x YT, se mezclaron con 3 tipos de bacterias, se aplicaron a un medio de agar 2 x YT, y se cultivaron a 28ºC, con lo cual los plásmidos de tipo pGA sufrieron luego una transferencia conyugal de E. coli a Agrobacterium. Dos días más tarde, se retiraron algunas de las colonias que aparecían en la placa de agar 2 x YT utilizando un asa de siembra de platino, y se aplicaron a una placa de agar LB que contenía 50 mg/l de kanamicina, 12,5 mg/l de tetraciclina, y 25 mg/l de cloranfenicol. Después de cultivar el contenido durante 2 días a 28ºC, se seleccionó una colonia simple.

La transformación de las células de tabaco cultivadas se realizó utilizando el método descrito en An, G., Plant Mol. Bio. Manual, A3, 1. En primer lugar, 100 μl de Agrobacterium EHA101 con plásmidos de tipo pGA cultivados durante 36 horas a 28ºC en un medio LB que contenía 12,5 mg/l de tetraciclina y 4 ml de una suspensión de células cultivadas de tabaco Nicotiana tabacum L. cv. amarillo brillante 2 (Cepa No. BY-2 obtenida utilizando el Catálogo No. RPC1 del Grupo de Desarrollo de Células de Plantas del Gene Bank en el Life Science Tsukuba Research Center), en su cuarto día de cultivo, se mezclaron juntos concienzudamente en una cápsula y se dejaron en reposo en un sitio oscuro a 25ºC. Dos días más tarde, se retiró de la cápsula parte de la solución y se separó el sobrenadante utilizando una centrífuga (1000 rpm, 5 minutos). El sedimento de células se introdujo en un medio nuevo y se centrifugó una vez más. Las células se inocularon en una placa de agar LS modificada con 150-200 mg/l de kanamicina y 250 mg/l de carbenicilina. Se dejó el todo en reposo en la oscuridad a 25ºC. Después de 2 a 3 semanas, las células que habían crecido hasta la etapa de callo se transfirieron a una nueva placa y se seleccionaron clones. Al cabo de 2 a 3 semanas, se transfirieron los clones a un medio LS modificado de 30 ml con kanamicina y carbenicilina. Este proceso de selección se repitió a lo largo de aproximadamente un mes. Se seleccionaron aleatoriamente 6 cepas resistentes de las cepas resistentes obtenidas de este modo (GT 1, 4, 5, 6, 8 y 9).

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(2) Verificación de los Genes hGT Introducidos

En las cepas resistentes, se confirmó un fragmento de 2,2 kb que contenía un promotor CaMV35S y un terminador cDNA-NOS del gen hGT en el T-DNA en el DNA genómico de las células de tabaco cultivadas utilizando un análisis de transferencia Southern. El método Southern se llevó a cabo después que se había preparado el DNA genómico a partir de las cepas resistentes arriba mencionadas y se había digerido con EcoRI y HindIII.

La preparación del DNA cromosómico a partir de las células de tabaco cultivadas se realizó utilizando el método de Watanabe (Watanabe, K., Cloning and Sequence, Plant Biotechnology Experiment Manual, Nouson Bunka Co., Ltd.). En primer lugar, se congelaron 10 ml de las células de tabaco cultivadas utilizando nitrógeno líquido, y se redujeron luego a polvo por trituración utilizando un almirez. Se pusieron aproximadamente 5 gramos del polvo en un tubo de centrífuga (40 ml) rápidamente a fin de que el polvo triturado no se fundiera y se mezclaron con 5 ml de una solución de 2 x CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio) precalentada a 60ºC. Se mezcló bien el todo lentamente durante 10 minutos, y se dejó luego en reposo a 60ºC. A continuación, se añadieron 5 ml de una solución cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), y la mezcla se agitó y se emulsionó. Se centrifugó luego la mezcla (2800 rpm, 15 minutos, temperatura ambiente). La capa superficial se transfirió después a un nuevo tubo de centrífuga de 40 ml y se repitió el proceso de extracción utilizando la solución cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). Después que la capa de la superficie se hubo mezclado con un volumen 1/10 de 10% CTAB, se centrifugó la misma (2800 rpm, 15 minutos, temperatura ambiente). La capa de la superficie se transfirió a un nuevo tubo de centrífuga y se mezcló después con un volumen igual de isopropanol frío. La mezcla disolvente así obtenida se centrifugó luego (4500 rpm, 20 minutos, temperatura ambiente). Después que se hubo retirado el sobrenadante utilizando un aspirador, se añadió el mismo a 5 ml de una solución tampón TE que contenía cloruro de sodio 1 M. Se disolvió el todo completamente a 55-60ºC. Se mezcló esto concienzudamente con 5 ml de isopropanol congelado y se observó el DNA. Se puso el mismo en la punta de un chip, se transfirió a un tubo Eppendorf (que contenía etanol al 80% congelado), y se lavó después. El DNA se lavó luego en etanol al 70% y se secó. El pelet seco se disolvió en la cantidad apropiada de la solución tampón TE. A continuación, se añadieron 5 ml de RNAsa A (10 mg/ml), y se dejaron reaccionar durante una hora a 37ºC; Composición de la Solución 2 x CTAB: 2% CTAB, Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0), cloruro de sodio 1,4 M, 1% polivinilpirrolidona (PVP), composición de la solución 10% CTAB: 10% CTAB, cloruro de sodio 0,7 M.

El método de transferencia Southern se realizó de la manera siguiente:

(i) Electroforesis y Desnaturalización con Álcali del DNA: Después que se hubieron digerido completamente 40 μg del DNA cromosómico por la enzima de restricción, se utilizó el método estándar, y se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (50 V). Se tiñó luego con bromuro de etidio y se fotografió. Se sacudió luego el gel durante 20 minutos en 400 ml de HCl 0,25 M, se retiró el líquido, y se permeó el gel con 400 ml de una solución desnaturalizante (NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M, sacudiendo lentamente durante 45 minutos. A continuación, se retiró el líquido, se añadieron 400 ml de solución neutra (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M de pH 7,4), y se sacudió lentamente la solución durante 15 minutos. A continuación, se añadieron una vez más 400 ml de la solución neutra, y se suspendió lentamente de nuevo la solución durante 15 minutos. (ii) Transferencia: Después de la electroforesis, se transfirió el DNA a una membrana de nailon (Hybond-N Amersham) utilizando 20 x SSC. La transferencia llevó más de 12 horas. Después de dejar secar la membrana transferida a la temperatura ambiente durante una hora, se realizó la fijación UV durante 5 minutos. Composición de 20 x SSC: NaCl 3 M, citrato de sodio 0,3 M. (iii) Preparación de la Sonda de DNA: La preparación de la sonda de DNA se realizó utilizando un kit Random Prime Labeling (Takara Shuzo Co., Ltd.). A continuación, se preparó la solución de reacción en un tubo Eppendorf. Después de calentar el tubo durante 3 minutos a 95ºC, se enfrió el mismo rápidamente en hielo. Seguidamente, se añadieron 25 ng del DNA molde y 2 μl del Iniciador Aleatorio para completar 5 μl. Seguidamente, se añadieron 2,5 μl de solución tampón 10 x, 2,5 μml de dNTPs, y 5 μl [α-32P] dCTP (1,85 MBq, 50 mCi), y se añadió agua para llevar el volumen de la mezcla de reacción a 24 μl. Se añadió a continuación 1 μl de un fragmento Klenow y la solución se dejó en reposo durante 10 minutos a 37ºC. Se pasó luego la misma a través de una columna NAP10 (Pharmacia Co., Ltd.) para preparar el DNA purificado. Después de calentar durante 3 minutos a 95ºC, se enfrió rápidamente en hielo, y se utilizó como sonda de hibridación. (iv) Hibridación: Se añadió 0,5% (p/v) de SDS a la Solución de Pre-hibridación siguiente, se sumergió la membrana de (ii) en la solución, y se realizó la pre-hibridación durante más de 2 horas a 42ºC. Después de ello, se añadió la sonda de DNA preparada en (iii), y se realizó la hibridación durante más de 12 horas a 42ºC. Composición de la Solución de Pre-hibridación: 5 x SSC, fosfato de sodio 50 mM, 50% (p/v) formamida, 5 x solución de Denhardt (preparada por dilución de la solución de Denhardt 100x), 0,1% (p/v) SDS. Composición de la solución de Denhardt 100x: 2% (p/v) BSA, 2% (p/v) Ficol 400, 2% (p/v) polivinilpirrolidona (PVP). (v) Autorradiografía: Después de lavar de la manera descrita más adelante, la autorradiografía se realizó utilizando el método estándar. Se llevó a cabo la misma 2 veces durante 15 minutos a 65ºC en 2 x SSC y 0,1% SDS, y una sola vez durante 15 minutos a 65ºC en 0,1 x SSC y 0,1% SDS.

Los resultados del análisis de la transferencia Southern del DNA genómico preparado a partir de las cepas resistentes se muestran en FIG 4. Como se muestra en FIG 4, se comprobó la presencia del gen hGT en 4 cepas (GT1, 6, 8 y 9).

(Ejemplo 3). Análisis del Transformante de Galactosiltransferasa

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fraccionamiento por tamaños (FIG 14B-II). Los resultados indican que un residuo galactosa está unido a la GlcNAc en el término no reductor con el enlace β-1,4. La eliminación de la galactosa se confirmó por los pesos moleculares obtenidos a partir del análisis IS-MS/MS. [M+2H] 2+ era 759 y [M+H] era 1518,0. La espectrometría de masas indicaba iones fragmentarios derivados de GlcNAc1Man5GlcNAc2-PA con una señal parental de m/z 1518,0. El valor m/z de 1314 indicaba Man5GlcNAc2-PA, el valor m/z de 1152 indicaba Man4GlcNAc2-PA, el valor m/z de 990 indicaba Man3GlcNAC2-PA, el valor m/z de 827,5 indicaba Man2GlcNAc2-PA, el valor m/z de 665,5 indicaba Man1GlcNAc2-PA, el valor m/z de 503 indicaba GlcNAc2-PA, y el valor m/z de 300 indicaba GlcNAc-PA. Cuando se digirió la GlcNAc1Man5GlcNAc2-PA se digirió con una N-acetil-β-D-glucosaminidasa derivada de Diplococcus pneumoniae, el producto digerido se eluia en la misma posición que la del estándar Man5GlcNAc2-PA en la HPLC de fraccionamiento por tamaños (FIG 14B-III). Incluso cuando se trató con α-1,2-manosidasa derivada de Aspergillus saitoi, la posición de elución no cambiaba (FIG 14B-IV). Sin embargo, cuando se trató con α-manosidasa de frijol machete, el mismo se eluía en la misma posición que la del estándar Man1GlcNAc2-PA en la HPLC de fraccionamiento por tamaños (FIG 14B-V). Esto indica la eliminación de 4 residuos manosa en el término no reductor. Estos resultados indican que en la cadena de azúcar PA, ninguno de los 5 residuos manosa está enlazado en α-1,2 a los residuos manosa que están enlazados en α-1,3. La digestión con exoglicosidasa, el mapeado bidimensional de las cadenas de azúcar, y el análisis IS-MS/MS indican una estructura de las cadenas de azúcar de GalGNM5 como la representada por L en FIG 15.

FIG 20 es un sumario de los resultados anteriores en lo que respecta a la estructura de los glucanos unidos por N y la relación de cada glucano unido por N en la línea de células GT6 junto con las correspondientes en la línea de células de tipo salvaje BY2 determinadas análogamente. En FIG 20, □ denota GlcNAc, ○ denota manosa, ● denota lactosa, □ con líneas de sombreado en su interior denota xilosa y ○ con puntos en su interior denota fucosa, respectivamente.

En la línea de células GT6, se observaron los isómeros Man7-, Man6-y Man5GlcNAc2. Dado que dichos oligosacáridos de tipo rico en manosa serán sustratos para β-1,4-galactosiltransferasa (GalT), la introducción de cDNAs de GlcNAc I, Man I y Man II puede conducir más eficientemente el oligosacárido Man7-5GlcNAc2 a GlcNAc-Man3GlcNAc2, que puede ser un sustrato de GalT (FIG 21).

El mutante A. thaliana cglI, que carece de gnT I, no puede sintetizar N-glucanos de tipo complejo (von Schaewen, A., Sturm, A., O'Neill, J., y Chrispeels, MJ., Plant Physiol., 1993 Aug;102(4):1109-1118, Isolation of a mutant Arabidopsis plant that lacks N-acetyl glucosaminyl transferase I and is unable to synthesize Golgi-modified complex Nlinked glycans). La complementación con la GnT I humana en el mutante cglI indicaba que la enzima de mamífero podría contribuir al camino de N-glicosilación de las plantas (Gómez, L. y Chrispeels, M.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994 March 1;91(5):1829-1833, Complementation of an Arabidopsis thaliana mutant that lacks complex asparagine-linked glycans with the human cDNA encoding N-acetylglucosaminyltransferase I.) Adicionalmente, el cDNA de GnT I aislado de A. thaliana complementaba la deficiencia en N-acetilglucosaminiltransferasa I de las células Lec1 de CHO (Bakker, H., Lommen, A., Jordi, W., Stiekema, W., y Bosch, D., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999 Aug 11:261(3):829-32, An Arabidopsis thaliana cDNA complements the N-acetylglucosaminyltransferase I deficiency of CHO Lec1 cells). Se aislaron y secuenciaron cDNAs que codificaban Man I y Man II humanas (Bause, E., Bieberich, E., Rolfs, A., Volker, C. y Schmidt, B., Eur J Biochem 1993 Oct 15;217(2):535-40, Molecular cloning and primary structure of Man9-mannosidase from human kidney; Tremblay, L.O., Campbell, Dyke, N. y Herscovics, A., Glycobiology 1998 Jun;8(6):585-95, Molecular cloning, chromosomal mapping and tissue-specific expression of a novel human alpha 1,2-mannosidase gene involved in N-glycan maturation; y Misago. M., Liao, Y.F., Kudo, S., Eto, S., Mattei, M.G., Moremen, K.W., Fukuda, M.N., Molecular cloning and expression of cDNAs encoding human alphamannosidase II and a previously unrecognized alpha-mannosidase IIx isozyme). Man I humana tiene dos isozimas, Man IA y Man IB, y se mostró la estructura de nucleótidos del cDNA de las isozimas (Bause, E., et al., y Tremblay, L.O., supra).

Por transformación de estos cDNAs en la línea de células BY, puede obtenerse una línea de células productora eficiente de glicoproteína de tipo humano. La β-1,4-galactosiltransferasa (GalT) utiliza UDP-galactosa como sustrato donante y GlcNAc2Man3GlcNAc2 como sustrato aceptor. El suministro eficiente de UDP-galactosa mejorará la reacción de la enzima GalT, y se producirá más oligosacárido galactosilado (FIG 22).

(Ejemplo 7) Análisis Estructural de las Cadenas de Azúcar en la HRP en las Células Transformantes Dobles GT6-HRP

Se obtuvo un lisado de células bruto a partir del homogeneizado de 50 g de células GT6-HRP cultivadas o células BY2-HRP de control que se habían desarrollado durante 7 días, respectivamente. Esta solución de lisado de células bruto se aplicó a una columna de CM Sepharose FF (1 x 10 cm) (Pharmacia Co., Ltd.) equilibrada con 10 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 6,0). Después de lavar la columna, se midió la peroxidasa eluida a una absorbancia de 403 nm. La fracción agrupada se concentró utilizando un ultrafiltro (punto de corte por peso molecular: 10.000, Advantec Co., Ltd.), se dializó contra 50 mM de un tampón de fosfato de sodio (pH 7,0), y se aplicó luego a una columna de afinidad ácido benzhidroxamínico-agarosa equilibrada (1 x 10 cm) (KemEn Tech, Dinamarca). Después de lavar la columna en 15 volúmenes de tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0), se eluyó la HRP absorbida utilizando ácido bórico 0,5 M preparado en el mismo tampón. La fracción activa de peroxidasa obtenida se agrupó luego, se dializó, y se concentró.

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La HRP purificada preparada a partir de las células transformantes dobles GT6-HRP o las células BY2-HRP se aplicó a una columna de agarosa RCA120 de 1 x 10 cm. La columna se lavó luego con 15 volúmenes de acetato de amonio 10 mM (pH 6,0). Las proteínas absorbidas se eluyeron luego y se ensayaron utilizando métodos convencionales.

Se realizó luego la tinción con lectina sobre la HRP purificada eluida de la cromatografía de afinidad RCA120 cuya especificidad es específica para la galactosa con enlace β-1,4. La lectina RCA120 se fijaba sólo a la HRP producida por la célula transformada GT6-HRP. Dado que la fijación de la lectina se reducía espectacularmente por preincubación con la galactosa que puede competir con la lectina (FIG 16b-III), la fijación es específica para carbohidratos. Incluso cuando la HRP purificada se somete a pretratamiento con β-galactosidasa de D. pneumoniae, la fijación de RCA120 se inhibía. Estos resultados indican que RCA se fijaba específicamente a la galactosa con enlace β-1,4 en el extremo no reductor del glucano unido por N en la HRP. La ausencia de glicoproteínas unidas a RCA en las células BY2-HRP indica que estas células no pueden transferir el residuo galactosa enlazado en β-1,4 al término no reductor del glucano HRP.

La HRP de fase inversa de los derivados PA que se derivaban de HRP purificada utilizando RCA120 indicaba que las cadenas de azúcar en las proteínas HRP purificadas a partir de GT6-HRP aparecen como un solo pico (FIG 17). En la HPLC de fase inversa, se utilizó una columna Cosmosil 5C18-P o una columna Asahipak NH2P en un dispositivo Jasco 880-PU HPLC con un Espectrofluorómetro Inteligente Jasco 821-FP. No se observaron proteínas combinadas ni picos detectables en las fracciones HRP purificadas de BY2-HRP. El pico obtenido de la GT6-HRP en la cromatografía de fraccionamiento por tamaños era homogéneo. El análisis por mapeado bidimensional del pico y la cromatografía del pico al mismo tiempo con la cadena de azúcar estándar indicaban que el oligosacárido contenido en el pico era Gal1GlcNAc1Man5GlcNAc2-PA. La confirmación de esta estructura se consiguió utilizando digestión continua con exoglicosidasa. Las cadenas de azúcar estándar utilizadas eran cadenas de azúcar preparadas previamente (Kimura, Y. et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56 (2), 215-222, 1992) o adquiridas (Wako Pure Chemical, Industries, Ltd. Osaka y Takara Shuzo Co., Ltd.).

La cadena de azúcar PA digerida con β-galactosidasa (D. pneumoniae) coincidía con la posición de elución del estándar GlcNAc1Man5GlcNAc2-PA, lo que indicaba la eliminación de un residuo galactosa enlazado en β-1,4 a una GlcNAc terminal no reductora. La digestión ulterior con N-acetil-β-D-glucosaminidasa de D. pneumoniae de los productos digeridos con β-galactosidasa producía una cadena de azúcar equivalente que se eluye en la misma posición de elución de Man5GlcNAc2-PA, lo que indica la eliminación de un residuo GlcNAc enlazado en β-1,2 a un residuo manosa terminal no reductor. Se cree que el residuo GlcNAc eliminado está enlazado a α-1,3-manosa enlazada a un residuo manosa β-1,4 teniendo en cuenta la ruta de procesamiento de tipo unido por N de la planta. Con objeto de confirmar la posición de enlace del residuo GlcNAc, se incubó Man5GlcNAc2-PA (M5) con α-1,2-manosidasa derivada de Aspergillus saitoi. Como era de esperar, no se detectó cambio en la posición de elución, lo que confirmaba que M5 tiene la estructura Man α-1-6 (Man α1,3), Man α-1-6 (Man α-1,3), Man β-1,4GlcNAc β-1,4GlcNAc de acuerdo con la predicción. Cuando la cadena de azúcar se digirió utilizando α-manosidasa de frijol machete, se eluía en las mismas posiciones de elución que la Man1GlcMan2PA conocida. Por consiguiente, la estructura de la cadena de azúcar correspondía a Man α1-6 (Man α1,3)Man α1-6 (Gal β 1,4GlcNAc β 1,2Man α 1, 3)Man β 1,4GlcNAc β 1,4GlcNAc (Gal1GlcNAc1Man5GlcNA2). Estos resultados indican que la cadena de azúcar en la célula GT6 tiene la estructura representada en FIG 15, y que la estructura de la cadena de azúcar en una proteína HRP derivada del transformante doble GT6-HRP es Man α-1-6 (Man α-1,3)Man α-1-6 (Gal β-1,4 GlcNAc β-1,2 Man α-1,3)Manβ-1,4 GlcNAc β-1,4 GlcNAc (Gal1GlcNAc1Man5GlcNA2).

Análogamente, el N-glucano galactosilado en HRP derivada de las células transformantes GT6-HRP no reaccionaba con un antisuero que, según se ha demostrado, reacciona específicamente con el residuo β-1,2-xilosa, que es indicativo de los N-glucanos de plantas. Esto indica que uno de los residuos azúcar que se ha demostrado son antigénicos en los glucanos complejos de plantas, es decir, el residuo xilosa, no está presente (Garcia-Casado, G. et al., Glycobiology 6 (4): 471-477, 1996) (FIG 18).

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona un método para fabricación de una glicoproteína con una cadena de azúcar de tipo humano. La misma proporciona también células de plantas que tienen un mecanismo de adición de cadenas de azúcar capaz de efectuar una reacción en la que un residuo galactosa se transfiere a un residuo acetilglucosamina en el terminal no reductor, en donde el mecanismo de adición de la cadena de azúcar es capaz de unir una cadena de azúcar que contiene una cadena de azúcar interior y una cadena de azúcar exterior, en donde la cadena de azúcar interior está constituida esencialmente por una pluralidad de manosa y acetilglucosamina, y la cadena de azúcar exterior contiene una porción de cadena de azúcar terminal que contiene una galactosa en el terminal no reductor. La presente invención proporciona adicionalmente una glicoproteína con una cadena de azúcar de tipo humano obtenida por la presente invención. Una glicoproteína con una cadena de azúcar de tipo mamífero, v.g. de tipo humano de la presente invención, no es antigénica debido a que la glicosilación es de tipo humano. Por consiguiente, la misma puede ser útil para administración a animales con inclusión de humanos.

Definiciones

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Claims

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