AT409381B - Xylosyltransferase-gen - Google Patents

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AT409381B AT0035500A AT3552000A AT409381B AT 409381 B AT409381 B AT 409381B AT 0035500 A AT0035500 A AT 0035500A AT 3552000 A AT3552000 A AT 3552000A AT 409381 B AT409381 B AT 409381B
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Description


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   Die Erfindung betrifft Polynukleotide, die für eine   &num;1,2-Xylosyltransferase   codieren. Weiters betrifft die Erfindung Vektoren mit diesen Polynukleotiden, rekombinante Wirtszellen, Pflanzen und 
Insekten, die mit den Polynukleotiden bzw. davon abstammender DNA transfektiert sind sowie in diesen Systemen produzierte Glykoproteine. 



   Glykoproteine weisen eine Vielfalt und Komplexität von Kohlehydrat-Einheiten auf, wobei die Zusammensetzung und Anordnung der Kohlehydrate für unterschiedliche Organismen charakteris- tisch ist. Die Oligosaccharid-Einheiten der Glykoproteine haben eine Reihe von Aufgaben, so sind sie z. B. wichtig in der Stoffwechselregulation, sie sind an der Vermittlung von Zell-Zellwechselwir- kungen beteiligt, sie bestimmen die Zirkulationszeiten von Proteinen im Blutkreislauf und sie sind ausschlaggebend für die Erkennung von Epitopen in Antigen-Antikörper-Reaktionen. 



   Die Glykosylierung von Glykoproteinen beginnt im endoplasmatischen Retikulum (ER), wo die Oligosaccharide entweder durch N-glykosidische Bindungen an Asparagin-Seitenketten oder durch O-glykosidische Bindungen an Serin- oder Threonin-Seitenketten gebunden werden. Die N-gebun- denen Oligosaccharide enthalten ein gemeinsames Core aus einer Pentasaccharid-Einheit, die aus drei Mannose- und zwei N-Acetylglucosaminresten besteht. Zur weiteren Modifikation der Kohle- hydrat-Einheiten werden die Proteine vom ER zum Golgi-Komplex transportiert. Die Struktur der N-gebundenen Oligosaccharideinheiten von Glykoproteinen wird von ihrer Konformation und der Zusammensetzung der Glykosyltransferasen der Golgi-Kompartimente bestimmt, in denen sie prozessiert werden. 



   Es wurde gezeigt, dass die Core-Pentasaccharideinheit der N-Glykane einiger Pflanzen durch   &num;1,2-gebundene   Xylose und a1,3-gebundene Fucose substituiert wird (Lerouge et al. 1998 Plant Mol. Biol. 38,31-48; Rayon et al. 1998 J. Exp. Bot. 49,1463-1472). Das Heptasaccharid "MMXF3" stellt den Hauptoligosaccharid Typ in Pflanzen dar (Kurosaka et al., 1991, J.Biol.Chem., 266,4168- 4172 ; Wilson und Altmann, 1998, Glycoconj. J. 15,1055-1070). Diese Strukturen werden auch komplexe N-Glykane bzw. Mannose-defiziente oder trunkierte N-Glykane genannt. Die a-Manno- sylreste können weiters durch GIcNAc ersetzt werden, an die Galaktose und Fucose gebunden sind, so dass eine Struktur hergestellt wird, die dem humanen Lewis a-Epitop entspricht (Melo et al. 1997, FEBS Lett. 415,186-191; Fitchette-Laine et al., 1997, Plant J. 12,1411-1417). 



   Weder die   &num;1,2-Xylose   noch die a1,3-gebundene Fucose kommen in Säugerglykoproteinen vor. Es stellte sich heraus, dass die   &num;1,2-Xylose   zusammen mit a1,3-Fucose eine wichtige Rolle in der Epitoperkennung von Antikörpern spielt. die gegen pflanzliche N-gebundene Oligosaccharide gerichtet sind und dadurch Immunreaktionen im menschlichen oder tierischen Körper gegen diese Oligosaccharide auslösen (Faye et al., 1993, Anal. Biochem. 209,104-108). Die N-Glykane enthaltende   &num;1,2-Xylose-   und/oder a1,3-Fucose scheint weiters eine der Hauptursachen für die weit verbreitete allergische Kreuzreaktivität zwischen verschiedenen pflanzlichen und Insekten- Allergenen zu sein und wird auch "kreuz reaktive Kohlehydrat Determinante" (CCD) genannt.

   Die CCDs verschleiern weiters durch das häufige Auftreten von immunologischen Kreuzreaktionen Allergie-Diagnosen. 



   Diese immunologischen Reaktionen, die von pflanzlichen Proteinen im menschlichen Körper ausgelöst werden, sind das Hauptproblem bei der medizinischen Verwendung von in Pflanzen produzierten, rekombinanten menschlichen Proteinen. Um dieses Problem zu umgehen, müsste die   &num;1,2-Xylosylierung   zusammen mit der Ó1,3-Fucoxylierung verhindert werden. Gemäss einer Studie wurde eine Mutante der Pflanze Arabidopsis thaliana isoliert, bei der die Aktivität von N-Acetyl-Glucosaminyl-Transferase I, dem ersten Enzym in der Biosynthese von komplexen Glykanen, fehlt. Die Biosynthese der komplexen Glykoproteine in dieser Mutante ist damit gestört. 



  Dennoch sind diese mutierten Pflanzen in der Lage, sich unter bestimmten Bedingungen normal zu entwickeln (A. Schaewen et al. 1993, Plant Physiol. 102 ; 1109-1118). 



   Um den Transfer der   &num;1,2-Xylose   in ein Oligosaccharid gezielt zu unterbinden, ohne auch in andere Glykosylierungsschritte einzugreifen, müsste nur das Enzym inaktiviert werden, das direkt für diese spezifische Glykosylierung verantwortlich ist, nämlich die   &num;1,2-Xylosyltransferase.   Diese Transferase, die nur in Pflanzen und in einigen Nicht-Vertebraten-Tierspezies, z. B. bei Schisto- soma sp. (Khoo et al., 1997, Glycobiology 7,663-677) und Schnecken (z.B. Mulder et al., 1995, Eur. J.

   Biochem., 232,272-283), jedoch nicht beim Menschen oder bei anderen Vertebraten vor- kommt, müsste gezielt inaktiviert oder unterdrückt werden, so dass menschliche Proteine, die in Pflanzen bzw. in pflanzlichen Zellen hergestellt werden, dieses Immunreaktionen auslösende 

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 Epitop nicht mehr wie bisher aufweisen. 



     &num;1,2-Xylosyltransferase   transferiert die D-Xylose von UDP-Xylose zur beta-gebundenen Man- nose von pflanzlichen N-gebundenen Oligosacchariden. 



   Dieses Enzym wurde aus Sojabohnen-Mikrosomen im Jahr 1997 gereinigt (Zeng et al.: J. Biol. 



  Chem., 272,31340-31347, 1997). Diesem Artikel gemäss war der beste Akzeptor für den Xylose- Transfer GlcNAc2Man3GlcNAc2-T, doch war auch GlcNAc1,Man3GlcNAc2 mit dem GLcNAc auf dem 3-Zweig, ein guter Akzeptor. Weiters waren eine Anzahl anderer N-gebundener Oligosacchande schlechte Akzeptoren, insbesondere jene mit Galaktose-Einheiten an den nicht-reduzierenden Termini. 



   Im Artikel von Rayon et al. (Plant Physiology, 1999,119, 725-733) ist erwähnt, dass Arabidop- sis-Proteine durch N-Glykane vom Typ mit hoher Mannose und durch Xylose- und Fucose-hältige Oligosaccharide N-glykosyliert werden. TEZUKA et al. (Eur. J. Biochem. 203,401-413 (1992)) ma- &num;en die Aktivitäten verschiedener Enzyme, beispielsweise von   &num;1,2-Xylosyltransferase   in der Gol- gi-Fraktion in Suspension gezüchteter Zellen der Platane. Sie wiesen nach, das Xylose duch   &num;1,2-   Xylosyltransferase auf die innere Mannose transferiert wurde. Weiters erwähnten sie, dass Xylose enthaltende Oligosaccharide im ganzen Pflanzenreich weit verbreitet sind, obwohl man Xylose ent- haltende, N-gebundene Oligosaccharide auch in Glykoproteinen aus Gastropoden und Chloro- phyceae fand. 



   Für die gezielte Unterdrückung oder Inaktivierung von Proteinen ist es am besten, diese auf der Ebene des Transkriptions- bzw. Translationsschrittes durchzuführen. Dazu ist es notwendig, die Nukleotidsequenz, die für das aktive Protein codiert, zu isolieren und sequenzieren. 



   Wie zuvor erwähnt, wurde die   Sojabohnen-&num;1,2-Xylosyltransferase   im Jahre 1997 isoliert und gereinigt. Es wurde jedoch nur ein Teil der Xylosyltransferase-cDNA isoliert (s. W099/29835 A1; SEQ ID NO 6 und 7), die gesamte cDNA, die für das aktive Protein codiert, konnte jedoch bisher nicht isoliert und charakterisiert werden. Der Grund dafür, dass die Nukleotidsequenz bisher noch nicht identifiziert wurde, könnte darin liegen, dass es grössere Verfahrensprobleme gibt, weil die mRNA, die für die Xylosyltransferase in den Organismen, wie beispielsweise Sojabohnen, codiert, nur in sehr geringen Mengen vorkommt.

   Obwohl mehrere Gruppen bisher versuchten, die gesamte Nukleotidsequenz dieses Gens, üblicherweise aus Sojabohnen, zu identifizieren, ist es nicht mög- lich gewesen, eine cDNA der gesamten Länge, die der Xylosyltransferase-mRNA entspricht, mit Hilfe herkömmlicher Methoden, die in normalen Fällen als wirksam bekannt sind, beispielsweise mit Hilfe der RACE-Amplifikation (rapid amplification of cDNA ends), zu erzeugen. Mit dieser Methode werden unbekannte Sequenzen mit Hilfe spezifischer Amplifikations-Primer amplifiziert. 



  Mögliche Gründe für erfolglose 5'RACE-Versuche können eine inadäquate Wahl spezifischer PCR- Primer sowie das Vorhandensein von Reverse-Transkriptase-inhibierenden Komponenten während der cDNA-Synthese sein. 



   Zusätzlich zum Problem der extrem geringen Konzentration der   &num;1,2-Xylosyltransferase-mRNA   gibt es weiters das Problem, dass die sekundäre Struktur am 5'-Ende der RNA die Amplifikation dieses Bereichs zu behindern scheint. In diesen Fällen führt die RACE-Amplifikation, die selbst ein empfindliches Verfahren ist, nicht zur richtigen und vollständigen Xylosyltransferase-cDNA- Sequenz. 



   Es ist natürlich auch sehr wahrscheinlich, dass die mRNA und die davon abstammende cDNA, ausser, dass sie nur in sehr geringen Konzentrationen vorliegt, sich im Verlauf verschiedener Manipulationen sehr leicht rekombiniert und mutiert. Aus diesen und anderen potentiellen Gründen war das Klonieren und die Expression dieses spezifischen Gens bisher unmöglich. 



   Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, das ganze Gen, das für eine pflanzliche   &num;1,2-Xylo-   syltransferase codiert, zu klonieren und zu sequenzieren, und Vektoren, die dieses Gen, oder eine geänderte DNA oder davon abgeleitete DNA umfassen, herzustellen, Pflanzen sowie Zellen davon mit einem dieser Vektoren zu transfektieren, Glykoproteine herzustellen, die die normalerweise vorkommende   &num;1,2-Xylose   nicht umfassen, sowie entsprechende Verfahren zur Verfügung zu stel- len. 



   Ein weiteres Ziel ist die Herstellung grosser Mengen von gereinigtem, rekombinantem Enzym, um eine in vitro-Synthese von homogenen N-Glykanen oder Glykokonjugaten enthaltend   &num;1,2-   Xylose zu ermöglichen. Dies wird dabei behilflich sein, die Rolle der   &num;1,2-Xylose   bei der Immuno- genität und Allergenität pflanzlicher Glykoproteine weiter zu klären. 

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   Die erfindungsgemässe Aufgabe wird gelöst durch ein DNA-Molekül, das eine Sequenz gemäss der SEQ ID NO : 8 mit einem offenen Leserahmen von Basenpaar 227 bis Basenpaar 1831 um- fasst oder zumindest 50% Homologie zur obengenannten Sequenz aufweist oder unter stringenten 
Bedingungen mit der oben genannten Sequenz hybridisiert oder eine Sequenz umfasst, die infolge des genetischen Codes zur oben genannten DNA-Sequenz degeneriert ist, wobei die Sequenz für ein pflanzliches Protein mit einer   &num;1,2-Xylosyltransferase-Aktivität   codiert oder dazu komplementär ist Diese vollständige Sequenz, die noch nie beschrieben wurde, ist besonders für Versuche, Ana- lysen und Herstellungsprozesse nützlich, die die   &num;1,2-Xylosyltransferase-Aktivität   betreffen.

   Diese Sequenz kann insbesondere für die Inaktivierung oder Unterdrückung der   &num;1,2-Xylosyltransferase   sowie für die Überexpression und Produktion des rekombinanten Enzyms verwendet werden. 



   Bei einer Suche in GenBank+EMBL+DDBJ+PDB-Datenbanken unter Verwendung der von Sojabohnen-Xylosyltransferase stammenden Peptide, wie oben erwähnt, fand man mehrere Poly- peptidsequenzen (von Arabidopsis und Drosophila) mit signifikanten Homologien. Diese Sequen- zen waren jedoch ansonsten weder miteinander noch mit der letztlich identifizierten   &num;1,2-Xylosyl-   transferase-Sequenz verwandt. Das erfolgreiche Auffinden der Anwärter-Sequenz für   &num;1,2-Xylosyl-   transferase war nur durch das richtige Zusammenfügen dreier von   Sojabohnen-&num;1,2-Xylosyltrans-   ferase stammender Peptidsequenzen zu einer einzigen Sequenz möglich.

   Alle von uns verwende- ten Suchstrategien gemäss dem Stand der Technik (d. h. indem die Peptidsequenzen einzeln oder in Kombination miteinander verwendet wurden) führten nicht zum erfolgreichen Auffinden der richti- gen Sequenz für   &num;1 ,2-Xylosyltransferase.   



   Die Isolierung und Reinigung dieses Gens wurde durch eine Suche in den DDBJ+ GenBank+EMBL+PDB-Datenbanken entsprechend den Sequenzen dreier bekannter Peptide (die als zusammengesetzte Peptide verwendet wurden) der Sojabohnen-Xylosyltransferase (Patent WO 99/29835 A1, SEQ ID NO:3 und 5) erreicht. Es zeigte sich, dass eine DNA-Sequenz von Arabidopsis thaliana, die bisher noch keinem Protein zugeschrieben wurde, eine Homologie mit zweien der drei Peptide aufwies. Mit Hilfe des Gen-Finder-Programms wurde eine vorausgesagte Proteinsequenz gefunden, gemäss welcher Sequenz spezifische Primer für eine RT-PCR entworfen wurden. Es war möglich, eine Erststrang-cDNA gemäss der mRNA des A. thaliana-Xylosyltransfe- rase-Gens herzustellen, wonach die Erststrang-cDNA einer PCR unter Verwendung der gezielt entworfenen Primer unterzogen wurde.

   Der Grund für die erfolgreiche Herstellung einer A. thalia-   na-Xvlosyltransferase-cDNA   kann einerseits darin liegen, dass die Xylosyl-Transferase-mRNA von A. thaliana weniger problematisch im Vergleich zu anderen Pflanzen-Spezies ist, und anderseits wurde die PCR mit optimal entworfenen, Gen-spezifischen Primern durchgeführt. 



   Der offene Leserahmen der SEQ ID NO : 8 codiert für ein Protein mit 534 Aminosäuren und mit einem theoretischen Molekulargewicht von 60,2 kDa, wobei im Bereich zwischen llell und Phe29 vermutlich ein transmembranes Stück vorliegt. Der errechnete pl-Wert des codierten Proteins der Sequenz gemäss der SEQ ID NO : 9 beträgt 7,52. 



   Die Aktivität der pflanzlichen   &num;1,2-Xylosyltransferase   wird durch ein Verfahren nachgewiesen und gemessen, wobei die Xylosyltransferase zu einer Probe enthaltend UDP-Xylose und einen markierten Akzeptor (z. B. ein Glykopeptid oder ein markiertes Oligosaccharid) zugesetzt wird. 



  Nach der Reaktionszeit wird der Gehalt an gebundener Xylose gemessen. Die Aktivität der Xylosyl- transferase wird dabei als positiv angesehen, wenn die Aktivitätsmessung zumindest um 10 bis 20%, insbesondere zumindest um 30 bis 50% höher liegt als die Aktivitätsmessung der Negativ- kontrolle. Die Struktur des Oligosaccharids kann zusätzlich mittels HPLC verifiziert werden. Solche Protokolle sind Stand der Technik (Staudacher et al. 1998, Anal. Biochem. 246,96-101; Stau- dacher et al. 1991, Eur. J. Biochem. 199, 745-751). Ob die Xylose an das Akzeptorsubstrat gebun- den ist oder nicht kann weiters durch Messen der Produktmasse mittels Massenspektrometrie bestimmt werden. 



   Die Paarung von zwei DNA-Molekülen kann durch die Wahl der Temperatur und lonenstärke der Probe verändert werden. Unter stringenten Bedingungen werden erfindungsgemäss Bedingun- gen verstanden, die eine exakte, stringente Bindung ermöglichen. Z. B. werden die DNA-Moleküle in 7% Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS), 0,5M NaP04 pH 7,0, 1mM EDTA bei 50 C hybridisiert und mit   1 %   SDS bei 42 C gewaschen. 



   Ob Sequenzen eine zumindest 50% Homologie zu SEQ ID NO : 8 aufweisen, kann z. B. mit dem Programm FastDB der EMBL oder SWISSPROT Datenbank ermittelt werden. 

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   Bevorzugterweise codiert die Sequenz des erfindungsgemässen DNA-Moleküls für ein Protein mit einer   &num;1,2-Xylosyltransferase-Aktivität.   Dieses spezifische Protein ist insbesondere zur Analy- se, für Versuche und Produktionsverfahren, die sich auf die   &num;1,2-Xylosyltransferase   beziehen, geeignet. 



   Bevorzugterweise weist das erfindungsgemässe DNA-Molekül zumindest 70-80%, besonders bevorzugt zumindest 95%, Homologie zur Sequenz gemäss SEQ ID NO : 8 auf. Diese Sequenz codiert für eine besonders aktive   &num;1,2-Xylosyltransferase.   Die Homologie wird vorzugsweise mit einem Programm bestimmt, das Insertionen und Deletionen erkennt und diese nicht bei der Homologie-Berechnung berücksichtigt. 



   Nach einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform umfasst das DNA-Molekül 1750 bis 1850, insbesondere 1831, Basenpaare. 



   Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn eines der oben genannten DNA-Moleküle kovalent mit einer nachweisbaren Markierungssubstanz assoziiert ist. Als Markierungssubstanz kann jeder gebräuchliche Marker verwendet werden, so z.B. fluoreszierende, luminiszierende, radioaktive Marker, Biotin, etc. So werden Reagenzien bereitgestellt, die für den Nachweis, die Selektion und Quantifizierung von entsprechenden DNA-Molekülen in festen Gewebeproben (z. B. von Pflanzen) oder auch in Flüssigkeitsproben durch Hybridisierungsverfahren nützlich sind. 



   Vorzugsweise weist das erfindungsgemässe DNA-Molekül eine Sequenz auf, die eine Deleti- ons-, Insertions- und/oder Substitutionsmutation umfasst. Die Anzahl der mutierten Nukleotide ist variabel und reicht von einem einzigen bis zu mehreren deletierten, insertierten oder substituierten Nukleotiden. Es ist auch möglich, dass durch die Mutation der Leserahmen verschoben ist. Wichtig bei einem derartigen "Knockout-Gen" ist lediglich, dass die Expression einer   &num;1,2-Xylosyltransfe-   rase gestört ist und die Bildung eines aktiven, funktionellen Enzyms verhindert wird. Dabei ist die Stelle der Mutation variabel, solange die Exprimierung eines enzymatisch aktiven Proteins unter- bunden ist. Vorzugsweise ist die Mutation im katalytischen Bereich des Enzyms, das sich im C- terminalen Bereich befindet.

   Die Verfahren zum Einführen von Mutationen in DNA-Sequenzen sind dem Fachmann bestens bekannt, so dass hier darauf verzichtet wird, näher auf die verschiedenen Möglichkeiten der Mutagenesen einzugehen. Es können sowohl zufällige Mutagenesen aber auch insbesondere zielgerichtete Mutagenesen, z. B. die site-directed-mutagenesis, die oligonukleotidge- steuerte Mutagenese oder Mutagenesen mit Hilfe von Restriktionsenzymen hier zur Anwendung kommen. 



   Die Erfindung stellt weiters ein DNA-Molekül zur Verfügung, das für ein Ribozym codiert, welches zwei Sequenzteile aufweist, von welchen jedes eine Länge von jeweils mindestens 10 bis 15 Basenpaaren aufweist, die zu den Sequenzteilen eines erfindungsgemässen DNA-Moleküls, wie oben beschrieben, komplementär sind, so dass das Ribozym die mRNA, die durch ein natürliches   &num;1,2-Xylosyltransferase-DNA-Molekül   transkribiert wird, komplexiert und schneidet. Die Veröffentli- chung von John M. Burke "Clearing the way for ribozymes" (Nature Biotechnology 15 :414-415; 1997) betrifft die allgemeine Funktionsweise von Ribozymen. Das Ribozym erkennt die mRNA der   &num;1,2-Xylosyltransferase   durch komplementäre Basenpaarung mit der mRNA.

   Anschliessend schnei- det und zerstört das Ribozym die RNA in einer sequenzspezifischen Art, bevor das Enzym trans- latiert wird. Nach Dissoziation vom geschnittenen Substrat, hybridisiert das Ribozym wiederholt mit RNA-Molekülen und wirkt als spezifische Endonuklease. Generell können Ribozyme spezifisch zur Inaktivierung einer bestimmten mRNA hergestellt werden, selbst wenn nicht die gesamte DNA- Sequenz, die für das Protein codiert, bekannt ist. Ribozyme sind besonders dann effizient, wenn die Ribosomen langsam an der mRNA entlang gleiten. In diesem Fall ist es für das Ribozym leichter, eine Ribosomen-freie Stelle an der mRNA zu finden. Aus diesem Grund sind langsame Ribosomen-Mutante als System für Ribozyme ebenfalls geeignet (J.Burke, 1997, Nature Biotech- nology; 15, 414-415). 



   Eine Möglichkeit besteht auch darin, eine abgewandelte Form eines Ribozyms einzusetzen, nämlich ein Minizym. Insbesondere für das Schneiden von grösseren mRNA-Molekülen sind Mini- zyme effizient. Ein Minizym ist ein Hammerkopf-Ribozym, das anstelle der Stem/Loop ll einen kurzen Oligonukleotid-Linker aufweist. Besonders effizient sind Dimer-Minizyme (Kuwabara et al. 



  1998, Nature Biotechnology, 16 ; 961-965). 



   Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen biologisch funktionellen Vektor, der eines der oben genannten DNA-Moleküle umfasst. Zur Transfektion in Wirtszellen ist ein eigenständiger, 

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 vermehrungsfähiger Vektor notwendig, wobei je nach Wirtszelle, Transfektionsmechanismus, Auf- gabe und Grösse des DNA-Moleküls ein passender Vektor verwendet werden kann. Da eine grosse Zahl an verschiedenen Vektoren bekannt ist, würde eine Aufzählung den Rahmen der Anmeldung sprengen, so dass hier darauf verzichtet wird, insbesondere, da die Vektoren dem Fachmann bestens bekannt sind (bezüglich Vektoren sowie allen in dieser Beschreibung verwendeten Tech- niken und Begriffe, die dem Fachmann bekannt sind, siehe auch Maniatis).

   Idealerweise weist der Vektor eine geringe Molekülmasse auf und sollte selektierbare Gene aufweisen, um in einer Zelle zu einem leicht erkennbaren Phänotyp zu führen, so dass eine einfache Selektion von vektor- hältigen und vektorfreien Wirtszellen möglich ist. Um eine hohe Ausbeute an DNA und entspre- chenden Genprodukten zu erhalten, sollte der Vektor einen starken Promotor, sowie einen Enhan- cer, Genamplifikationssignale und Regulatorsequenzen aufweisen. Für eine autonome Replikation des Vektors ist weiters ein Replikationsursprung wichtig. Polyadenylierungsstellen sind für eine korrekte Prozessierung der mRNA und Spleisssignale für die RNA-Transkripte verantwortlich. 



  Werden Phagen, Viren oder Viruspartikel als Vektoren verwendet, steuern Verpackungssignale die Verpakkung der Vektor-DNA. Z. B. sind für die Transkription in Pflanzen Ti-Plasmide geeignet und für die Transkription in Insektenzellen Baculoviren, bzw. in Insekten Transposons, wie das P Element. 



   Wird der oben beschriebene erfindungsgemässe Vektor in eine Pflanze oder Pflanzenzelle eingeschleust, so wird eine posttranskriptionelle Unterdrückung der Genexpression des endogenen   &num;1,2-Xylosyltransferase-Gens   durch Transkription eines zu diesem homologen Transgens oder Teilen davon in Sense-Orientierung erreicht. Für diese Sense-Technik wird weiters auf die Schriften Baucombe 1996,   Plant. Mol. Biol.,   9 :373-382 und Brigneti et al. 1998, EMBO J. 17:6739- 6746 verwiesen. Diese Strategie des "Gen-Silencing" ist ein wirkungsvoller Weg, die Expression des   &num;1,2-Xylosyltransferase-Gens   zu unterdrücken, s. auch Waterhouse et al. 1998,   Proc.Natl.Acad.Sci.USA,   95 :13959-13964. 



   Weiters betrifft die Erfindung einen biologisch funktionellen Vektor, der ein DNA-Molekül gemäss einer der oben beschriebenen Ausführungsformen in inverser Orientierung zum Promotor umfasst. Wird dieser Vektor in eine Wirtszelle transfektiert, wird eine "Antisense-mRNA" abge- lesen, die komplementär zur mRNA der   &num;1,2-Xylosyltransferase   ist und letztere komplexiert. Diese Bindung behindert entweder die korrekte Prozessierung, den Transport, die Stabilität, oder durch Verhinderung der Ribosomenanlagerung die Translation und damit die normale Genexpression der ss1,2-Xylosyltransfgerase. 



   Obwohl die gesamte Sequenz des DNA-Moleküls in den Vektor eingebaut werden könnte, können Teilsequenzen davon aufgrund der geringeren Grösse für bestimmte Zwecke vorteilhafter sein. Wichtig ist z. B. beim Antisense-Aspekt, dass das DNA-Molekül gross genug ist, um eine ausreichend grosse Antisense-mRNA zu bilden, die an die Transferase-mRNA bindet. Beispiels- weise umfasst ein geeignetes Antisense-RNA-Molekül 50 bis 200 Nukleotide, da viele der bekann- ten natürlich vorkommenden Antisense-RNA-Moleküle etwa 100 Nukleotide umfassen. 



   Für eine besonders effektive Inhibierung der Expression einer aktiven   &num;1,2-Xylosyltransferase   ist eine Kombination der Sense-Technik und Antisense-Technik geeignet (Waterhouse et al. 1998,   Proc.Nati.Acad.Sci.USA,   95:13959-13964). 



   Vorteilhafterweise werden schnell hybridisierende RNA-Moleküle eingesetzt. Die Effizienz von Antisense-RNA-Molekülen, die eine Grösse von über 50 Nukleotiden aufweisen, hängt von der Anlagerungskinetik in vitro ab. So zeigen z.B. schnell anlagernde Antisense-RNA-Moleküle eine stärkere Inhibition der Proteinexprimierung als langsam hybridisierende RNA-Moleküle (Wagner et al. 1994, Annu. Rev. Microbiol., 48 :713-742; Rittner et al. 1993, Nucl. Acids Res, 21:1381-1387). 



  Solche schnell hybridisierenden Antisense-RNA-Moleküle weisen insbesondere eine grosse Anzahl von externen Basen (freie Enden und Verbindungssequenzen), eine grosse Anzahl von strukturel- len Subdomänen (Komponenten), sowie einen geringen Grad an Schleifen (Patzel et al. 1998 ; Nature Biotechnology, 16 ; 64-68) auf. Die hypothetischen Sekundärstrukturen des Antisense-RNA- Moleküls können z.B. mit Hilfe eines Computerprogramms ermittelt werden, nach dem eine geeignete Antisense-RNA DNA-Sequenz ausgesucht wird. 



   Es können unterschiedliche Sequenzregionen des DNA-Moleküls in den Vektor eingebaut werden. Eine Möglichkeit besteht z. B. darin, nur den Teil, der für die Ribosomenanlagerung verantwortlich ist, in den Vektor einzubauen. Eine Blockierung in dieser Region der mRNA reicht 

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 aus, um die gesamte Translation zu stoppen. Eine besonders hohe Effizienz der Antisense- Moleküle ergibt sich auch für die 5'- und 3'-untranslatierten Regionen des Gens. 



   Die Erfindung betrifft auch einen biologisch funktionellen Vektor, der eines der beiden zuletzt erwähnten DNA-Moleküle (Mutations- oder Ribozym-DNA-Molekül) aufweist. Was voranstehend bezüglich der Vektoren gesagt wurde, gilt auch in diesem Fall. 



   Gemäss der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer cDNA umfassend das erfin- dungsgemässe DNA-Molekül zur Verfügung gestellt, wobei RNA aus einer pflanzlichen Zelle, insbesondere aus Blatt-Zellen, isoliert wird, mit der nach Zusetzen einer reversen Transkriptase und Primern eine reverse Transkription durchgeführt wird. Die einzelnen Schritte dieses Verfahrens werden nach Protokollen wie an sich bekannt durchgeführt. Für die reverse Transkription besteht einerseits die Möglichkeit, mit Hilfe von Oligo (dT)-Primern die cDNA der gesamten mRNA herzu- stellen und erst anschliessend mit ausgewählten Primern eine PCR durchzuführen, um DNA-Mole- küle umfassend das   &num;1,2-Xylosyltransferase-Gen   herzustellen.

   Andererseits können die ausge- wählten Primer direkt für die reverse Transkription eingesetzt werden, um eine kurze, spezifische cDNA zu erhalten. Die geeigneten Primer können z. B. synthetisch nach dem Muster von cDNA- Sequenzen der Transferase hergestellt werden. 



   Die Erfindung betrifft weiters ein Verfahren zum Klonieren einer   &num;1,2-Xylosyltransferase,   dadurch gekennzeichnet, dass das erfindungsgemässe DNA-Molekül in einen Vektor kloniert wird, der anschliessend in eine Wirtszelle bzw. einen Wirt transfektiert wird, wobei durch Selektion und Amplifikation von transfektierten Wirtszellen Zelllinien erhalten werden, die die aktive   &num;1,2-Xylosyl-   transferase exprimieren. Das DNA-Molekül wird beispielsweise mit Hilfe von Restriktionsendo- nukleasen in den Vektor eingefügt. Für den Vektor gilt das oben bereits Angeführte. Wichtig ist bei diesem Verfahren, dass ein effizientes Wirt-Vektor System gewählt wird. Um ein aktives Enzym zu erhalten sind eukaryotische Wirtszellen besonders geeignet. Eine Möglichkeit besteht darin, den Vektor in Insektenzellen zu transfektieren.

   Dabei wäre insbesondere ein Insektenvirus als Vektor zu verwenden, so z.B. Baculovirus. 



   Selbstverständlich können Pflanzen oder Pflanzenzellen, menschliche oder ander Wirbeltier- Zellen ebenfalls transfektiert werden, in welchem Falle letzere ein ihnen fremdes Enzym exprimie- ren würden. 



   Bevorzugterweise wird ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Wirtszellen, insbeson- dere Pflanzenzellen bzw. Pflanzen mit einer unterdrückten bzw. vollständig unterbundenen   &num;1,2-   Xylosyltransferase-Produktion zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass zumin- dest einer der erfindungsgemässen Vektoren, nämlich der umfassend das erfindungsgemässe DNA- Molekül, das mutierte DNA-Molekül oder das DNA-Molekül, das für Ribozyme codiert oder der umfassend das DNA-Molekül in inverser Orientierung zum Promotor, in die Wirtszelle bzw. Pflanze eingeschleust wird. Hier gilt ebenfalls das oben für die Transfektion bereits Beschriebene. 



   Als Wirtszellen können z.B. Pflanzenzellen verwendet werden, wobei hier beispielsweise das Ti-Plasmid mit dem Agrobacterium-System in Frage kommt. Es ist mit dem Agrobacterium-System möglich, direkt eine Pflanze zu transfektieren: Agrobakterien verursachen bei Pflanzen Wurzel- halsgallen. Wenn Agrobakterien eine verletzte Pflanze infizieren, gelangen die Bakterien selbst nicht in die Pflanze, sondern sie schleusen den rekombinanten DNA-Abschnitt, die sogenannte T-DNA aus dem ringförmigen, extrachromosomalen, tumorinduzierenden Ti-Plasmid in die Pflan- zenzellen ein. Die T-DNA, und damit auch das darin eingefügte DNA-Molekül, wird stabil in die chromosomale DNA der Zelle eingebaut, so dass die Gene der T-DNA in der Pflanze exprimiert werden. 



   Es gibt zahlreiche bekannte, effiziente Transfektionsmechanismen für verschiedene Wirtssy- steme. Einige Beispiele sind Elektroporation, die Calciumphosphatmethode, Mikroinjektion, Liposo- menmethode. 



   Die transfektierten Zellen werden anschliessend selektiert, z. B. aufgrund von Antibiotika-Resis- tenzen, für die der Vektor Gene aufweist, oder anderer Markergene. Danach werden die transfek- tierten Zelllinien amplifiziert, entweder in kleinen Mengen, z. B. in Petrischalen, oder in grossen Mengen, etwa in Fermentoren. Weiters weisen Pflanzen eine besondere Eigenschaft auf, sie sind nämlich in der Lage sich aus einer (transfektierten) Zelle bzw. aus einem Protoplasten zu einer vollständigen Pflanze wieder zu entwickeln, die gezüchtet werden kann. 



   Je nach eingesetztem Vektor kommt es zu Vorgängen im Wirt, so dass die Enzym-Expression 

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 unterdrückt oder vollständig unterbunden wird: 
Wird der Vektor umfassend das DNA-Molekül mit der Deletions-Insertions- oder Substitutions- mutation transfektiert, so kommt es zu einer homologen Rekombination : Das mutierte DNA-Mole- kül erkennt trotz Mutation die identische Sequenz im Genom der Wirtszelle und wird an genau der 
Stelle eingebaut, so dass ein "Knockout-Gen" entsteht. Auf diese Weise wird in das Gen für die   &num;1,2-Xylosyltransferase   eine Mutation eingebracht, die die einwandfreie Expression der   &num;1,2-Xylo-   syltransferase inhibieren kann. Wie oben dargelegt ist es bei dieser Technik wichtig, dass die 
Mutation ausreicht, um die Expression des aktiven Proteins zu unterbinden.

   Nach Selektion und 
Amplifikation kann als zusätzliche Überprüfung das Gen sequenziert werden, um den Erfolg der homologen Rekombination bzw. den Grad der Mutation festzustellen. 



   Wird der Vektor umfassend das DNA-Molekül, das für ein Ribozym codiert, transfektiert, so wird in der Wirtszelle das aktive Ribozym exprimiert. Das Ribozym komplexiert die komplementäre mRNA Sequenz der   &num;1,2-Xylosyltransferase   zumindest an einer bestimmten Stelle, schneidet diese Stelle und kann auf diese Weise die Translation des Enzyms inhibieren. In dieser Wirtszelle sowie in den von ihr abstammenden Zelllinien bzw. gegebenenfalls Pflanze wird keine   &num;1,2-Xylo-   syltransferase exprimiert. 



   Wenn der Vektor das erfindungsgemässe DNA-Molekül in Sense- oder inverser Richtung zum 
Promotor umfasst, wird in der transfektierten Zelle (bzw. Pflanze) eine Sense- oder Antisense- mRNA exprimiert. Die Antisense-mRNA ist komplementär zu zumindest einem Teil der mRNA- 
Sequenz der   &num;1,2-Xylosyltransferase   und kann ebenfalls die Translation des Enzyms inhibieren. 



  Als Beispiel für ein Verfahren zur Unterdrückung der Expression eines Gens durch Antisense- Technik wird auf die Veröffentlichung von Smith et al. 1990,   Moi.Gen.Genet.   224 :477-481 verwie- sen, wobei in dieser Veröffentlichung die Expression eines Gens, das im Reifungsprozess bei Tomaten involviert ist, inhibiert wird. Es zeigte sich kürzlich, dass doppelsträngige RNA (dsRNA) bei einer grossen Vielfalt von Organismen, einschliesslich Nematoden, Pflanzen, Trypanosomen, 
Fruchtfliegen und Planarien ein Sequenzspezifisches Gen-Silencing auslöst; es hat sich gezeigt, dass ein bisher noch nicht charakterisierter RNA-Auslöser in mehreren verschiedenen 
Pflanzensystemen eine DNA-Methylierung auslöst, die zu einer selektiven Störung der Genfunktion führt (vgl. Übersichtsartikel von Fire A., 1999, Trends Genet 15 (9) : 358-363). 



   In allen Systemen wird die Expression der   &num;1,2-Xylosyltransferase   zumindest unterdrückt, vorzugsweise sogar vollständig unterbunden. Der Grad der Störung der Genexpression hängt vom Grad der Komplexierung, homologen Rekombination, von eventuellen anschliessenden zufälligen Mutationen, und sonstigen Vorgängen im Bereich des Genoms ab. Die transfektierten Zellen werden auf   &num;1,2-Xylosyltransferase   Aktivität überprüft und selektiert. 



   Es besteht weiters die Möglichkeit, die oben beschriebene Unterdrückung der Expression der   &num;1,2-Xylosyltransferase   noch weiter zu verstärken, indem zusätzlich zur Einschleusung eines oben beschriebenen Vektors, ein Vektor umfassend ein Gen, das für ein Säugetier-Protein, z.B.   &num;1,4-   Galaktosyltransferase, codiert, in den Wirt eingeschleust wird. Die Xylosylierung kann durch die Wirkung anderer Säugetier-Enzyme vermindert werden, wobei die Kombination der Inhibierung der Exprimierung einer aktiven   &num;1,2-Xylosyltransferase   mit Hilfe eines erfindungsgemässen Vektors und mit Hilfe eines Säugetier-Enzym-Vektors besonders effizient ist. 



   Für die Transfektion kann jegliche Pflanzensorte eingesetzt werden, beispielsweise die Mungo- bohne, Tabakpflanze, Tomaten- und/oder Kartoffelpflanze. 



   Ein anderes, vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Wirtszellen, insbeson- dere Pflanzenzellen bzw. Pflanzen, besteht darin, dass das DNA-Molekül umfassend die Mutation in das Genom der Wirtszelle bzw. Pflanze an der Stelle der nichtmutierten, homologen Sequenz eingeschleust wird (Schaefer et al. 1997, Plant J.; 11 (6):1195-1206). Dieses Verfahren funktioniert demnach nicht mit einem Vektor, sondern mit einem reinen DNA-Molekül. Das DNA-Molekül wird z. B. durch Genbombardement, Mikroinjektion oder Elektroporation, um nur drei Beispiele zu nennen, in den Wirt eingeschleust. Wie bereits dargelegt, legt sich das DNA-Molekül an die homologe Sequenz im Genom des Wirts an, so dass es zu einer homologen Rekombination und damit zur Aufnahme der Deletions-, Insertions- bzw.

   Substitutionsmutation im Genom kommt :    Exprimierung der &num;1 ,2-Xylosyltransferase kann unterdrückt bzw. vollständig unterbunden werden.   



   Vorzugsweise sind rekombinante Pflanzen bzw. Pflanzenzellen vorgesehen, die mittels eines der oben beschriebenen Verfahren hergestellt worden sind, wobei ihre   &num;1,2-Xylosyltransferase-   

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Produktion unterdrückt bzw. vollständig unterbunden ist. Vorzugsweise ist ihre   &num;1,2-Xylosyltrans-   ferase-Aktivität weniger als 50%, insbesondere weniger als 20%, besonders bevorzugt 0%, der in natürlichen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen vorkommenden   &num;1,2-Xylosyltransferase-Aktivität.   Der Vorteil dieser Pflanzen bzw. Pflanzenzellen liegt darin, dass die Glykoproteine, die von ihnen produziert werden, keine bzw. kaum   &num;1,2-gebundene   Xylose aufweisen.

   Werden nun Produkte dieser Pflanzen vom menschlichen oder Wirbeltier-Körper aufgenommen, kommt es zu keiner 
Immunreaktion infolge des   &num;1,2-Xylose-Epitop.   



   Die Erfindung bezieht sich auch auf ein   PNA-Molekül,   das eine Basensequenz umfasst, die komplementär zur Sequenz des erfindungsgemässen DNA-Moleküls ist. PNA (Peptid Nukleinsäure) ist eine DNA ähnliche Sequenz, wobei die Nukleobasen an ein Pseudopeptidrückgrat gebunden sind. PNA hybridisiert im allgemeinen mit komplementären DNA-, RNA- oder PNA-Oligomeren durch Watson-Crick Basenpaarung und Helixformation. Das Peptidrückgrat gewährleistet eine grössere Resistenz gegenüber enzymatischem Abbau. Das PNA-Molekül stellt dadurch ein verbes- sertes Antisense-Agens dar. Weder Nukleasen noch Proteasen sind in der Lage, ein PNA-Molekül anzugreifen.

   Die Stabilität des PNA-Moleküls, wenn es an eine komplementäre Sequenz gebunden ist, weist eine ausreichende sterische Blockierung von DNA und RNA Polymerasen, der reversen Transkriptase, Telomerase und der Ribosome auf. Die Veröffentlichung von Pooga et al., "Cell penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and modify pain transmission in vivo" (Nature Biotechnology 16 :857-861; 1998) bezieht sich auf PNA-Moleküle im allgemeinen und insbesondere auf ein PNA-Molekül, welches zur Human-Galanin-Rezeptor Typ 1-mRNA komple- mentär ist. 



   Weist das PNA-Molekül die oben genannte Sequenz auf, so bindet sie an die DNA bzw. an eine Stelle der DNA, die für ss1,2-Xylosyltransferase codiert, und kann auf diese Weise die Trans- kription dieses Enzyms inhibieren. Das PNA-Molekül wird, da es weder transkribiert noch trans- latiert wird, synthetisch hergestellt, z. B. mit Hilfe der t-Boc-Technik. 



   Vorteilhafterweise wird ein PNA-Molekül zur Verfügung gestellt, das eine Basensequenz umfasst, die der Sequenz des erfindungsgemässen DNA-Moleküls entspricht. Dieses PNA-Molekül komplexiert die mRNA oder eine Stelle der mRNA der   &num;1,2-Xylosyltransferase,   so dass die Trans- lation des Enzyms inhibiert ist. Hier trifft Ähnliches wie für die Antisense-RNA zu. So ist z. B. ein besonders effizienter Komplexierungsbereich die Translationsstart-Region oder auch die 5'-nicht- translatierten Regionen der mRNA. 



   Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, insbesondere Pflanzenzellen, die eine blockierte Expression der   &num;1,2-Xylosyltransferase   auf der Ebene der Transkription bzw. Translation aufweisen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass erfindungsgemässe PNA-Moleküle in die Zellen eingeschleust werden. 



  Um das PNA-Molekül bzw. die PNA-Moleküle in die Zelle einzuschleusen, werden wiederum die herkömmlichen Methoden, wie z.B. Elektroporation oder Mikroinjektion angewandt. Besonders effizient ist das Einschleusen, wenn die PNA-Oligomere an Zellen-Penetrationspeptide, z. B. Trans- portan oder pAntp, gebunden sind (Pooga et al. 1998, Nature Biotechnology, 16 ; 857-861). 



   Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Glykoproteinen zur Verfügung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die erfindungsgemässen, rekombinanten Pflan- zen bzw. Pflanzenzellen, deren   &num;1,2-Xylosyltransferase-Produktion   unterdrückt bzw. vollständig unterbunden ist, oder Pflanzen bzw. Zellen, in die gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren PNA-Moleküle eingeschleust worden sind, mit dem Gen, das das Glykoprotein exprimiert, transfek- tiert sind, so dass die rekombinanten Glykoproteine exprimiert werden. Dabei werden wie oben schon beschriebene Vektoren umfassend Gene für die gewünschten Proteine in den Wirt bzw. 



  Wirtszellen wie ebenfalls oben schon beschrieben transfektiert. Die transfektierten Pflanzenzellen exprimieren die gewünschten Proteine, wobei sie keine oder kaum   &num;1,2-gebundene   Xylose aufwei- sen. Dadurch lösen sie die oben bereits erwähnten Immunreaktionen im menschlichen oder Wirbeltier-Körper nicht aus. Es können jegliche Proteine in diesen Systemen produziert werden. 



   Vorteilhaft wird ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten humanen Glykoproteinen zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die erfindungsgemässen, rekombinanten Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, deren   &num;1,2-Xylosyltransferaseproduktion   unterdrückt bzw. vollstän- dig unterbunden ist, oder Pflanzen bzw. Zellen, in die nach dem erfindungsgemässen Verfahren PNA-Moleküle eingeschleust worden sind, mit dem Gen transfektiert sind, das das Glykoprotein 

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 exprimiert, so dass die rekombinanten Glykoproteine exprimiert werden. Durch dieses Verfahren wird es möglich, menschliche Proteine in Pflanzen (Pflanzenzellen) zu produzieren, die, wenn sie durch den menschlichen Körper aufgenommen sind, keine gegen   &num;1,2-gebundene   Xylosereste gerichtete Immunreaktion auslösen.

   Dabei besteht die Möglichkeit, Pflanzensorten zur Produktion der rekombinanten Glykoproteine einzusetzen, die als Nahrungsmittel dienen, z. B. Banane, Kartof- fel und/oder Tomate. Die Gewebe dieser Pflanze umfassen das rekombinante Glykoprotein, so dass z. B. durch Extraktion des rekombinanten Glykoproteins aus dem Gewebe und anschliessende Verabreichung bzw. direkt durch den Verzehr des pflanzlichen Gewebes das rekombinante Glykoprotein in den menschlichen Körper aufgenommen wird. 



   Bevorzugterweise ist dabei ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten humanen Glyko- proteinen zur medizinischen Verwendung vorgesehen, das die erfindungsgemässen, rekombinan- ten Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, deren   &num;1,2-Xylosyltransferase-Produktion   unterdrückt bzw. voll- ständig unterbunden ist, oder Pflanzen bzw. Zellen, in die nach dem erfindungsgemässen Verfahren PNA-Moleküle eingeschleust worden sind, mit dem Gen, das das Glykoprotein exprimiert, transfek- tiert sind, so dass die rekombinanten Glykoproteine exprimiert werden. Hierbei kommt jegliches Protein in Frage, das medizinisch von Interesse ist. 



   Weiters betrifft die vorliegende Erfindung rekombinante Glykoproteine gemäss einem oben beschriebenen Verfahren, wobei sie in pflanzlichen Systemen hergestellt wurden und wobei ihre Peptidsequenz unter 50%, insbesondere unter 20%, besonders bevorzugt 0%, der &num;1,2-gebunde- nen Xylose-Reste aufweist, welche in Proteinen vorkommen, die in nicht Xylosyltransferase redu- zierten pflanzlichen Systemen exprimiert sind. Vorzuziehen sind natürlich Glykoproteine, die keine   &num;1,2-gebundenen   Xylose-Reste aufweisen. Die Menge an   &num;1,2-gebundener   Xylose ist vom Grad der oben beschriebenen Unterdrückung der   &num;1 ,2-Xylosyltransferase   abhängig. 



   Bevorzugterweise betrifft die Erfindung rekombinante humane Glykoproteine, die in pflanzli- chen Systemen gemäss einem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, und deren Peptidsequenz unter 50%, insbesondere unter 20%, besonders bevorzugt 0%, der   &num;1,2-gebunde-   nen Xylose-Reste aufweist, welche in den Proteinen vorkommen, die in nicht Xylosyltransferase reduzierten pflanzlichen Systemen exprimiert sind. 



   Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft rekombinante humane Glykoproteine zur medizinischen Verwendung, die gemäss einem oben beschriebenen Verfahren in pflanzlichen Systemen hergestellt wurden. und deren Peptidsequenz unter 50%, insbesondere unter 20%, besonders bevorzugt 0%, der   &num;1,2-gebundenen   Xylose-Reste aufweist, welche in den Proteinen vorkommen, die in nicht Xylosyltransferase reduzierten pflanzlichen Systemen exprimiert sind. 



   Die erfindungsgemässen Glykoproteine können andere gebundene Oligosaccharid-Einheiten, die für Pflanzen spezifisch sind, aufweisen, wodurch sie sich - im Falle von humanen Glykopro- teinen - von diesen natürlichen Glykoproteinen unterscheiden. Nichtsdestotrotz wird durch die erfindundungsgemässen Glykoproteine eine geringere bzw. gar keine Immunreaktion im mensch- lichen Körper ausgelöst, da, wie in der Beschreibungseinleitung schon dargestellt, die   &num;1,2-gebun-   denen Xylose-Reste zusammen mit den a1,3-Fucose-Resten, die Hauptursache der Immunreaktio- nen bzw. Kreuz-Immunreaktion gegen pflanzliche Glykoproteine sind. 



   Ein weiterer Aspekt umfasst eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die erfindungsge- mässen Glykoproteine umfasst. Zusätzlich zu den erfindungsgemässen Glykoproteinen umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung weitere, für solche Zusammensetzungen übliche Zusätze. 



  Dies sind z. B. geeignete Verdünnungsmittel verschiedenen Puffergehalts (z. B. Tris-HCI, Acetat, Phosphat), pH und lonenstärke, Zusatzmittel, wie etwa Tenside und Lösungsvermittler (z. B. Tween 80, Polysorbate 80), Konservierungsmittel (z. B. Thimerosal, Benzylalkohol), Adjuvantien, Antioxi- dationsmittel (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Emulgatoren, Füllstoffe (z. B. Lactose, Mannit), kovalente Bindungen von Polymeren, wie etwa Polyethylenglykol, an das Protein, Einbau des Materials in teilchenförmige Zusammensetzungen von polymeren Verbindungen, wie etwa Polymilchsäure, Polyglykolsäure, etc. oder in Liposome, Hilfsstoffe und/oder Trägersubstanzen, die bei der jeweiligen Behandlung nützlich sind.

   Solche Zusammensetzungen werden den physikali- schen Zustand, die Stabilität, die Geschwindigkeit der in-vivo Freisetzung und die Geschwindigkeit der in-vivo Ausscheidung der erfindungsgemässen Glykoproteine beeinflussen. 



   Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Selektieren von DNA-Molekülen zur Verfügung, die für eine   &num;1,2-Xylosyltransferase   codieren, in einer Probe, wobei die erfindungsgemässen, markier- 

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 ten DNA-Moleküle oder Teilsequenzen davon zur Probe zugesetzt werden, die an die DNA- 
Moleküle, die für eine   &num;1,2-Xylosyltransferase   codieren, binden. Die hybridisierten DNA-Moleküle können detektiert, quantifiziert und selektiert werden. Damit die Probe Einzelstrang-DNA aufweist, mit der die markierten DNA-Moleküle hybridisieren können, wird die Probe, z. B. durch Erwärmen, denaturiert. 



   Eine Möglichkeit besteht darin, die zu untersuchende DNA, gegebenenfalls nach Zusetzen von 
Endonukleasen, durch Gelelektrophorese auf einem Agarosegel abzutrennen. Nach Überführen auf eine Membran aus Nitrozellulose werden die erfindungsgemässen markierten DNA-Moleküle zugesetzt, die an das entsprechende homologe DNA-Molekül hybridisieren ("Southern Blotting"). 



   Eine andere Möglichkeit besteht darin, homologe Gene aus anderen Spezies durch PCR- abhängige Verfahren unter Verwendung von spezifischen und/oder degenerierten Primern, die aus der Sequenz des erfindungsgemässen DNA-Moleküls stammen, aufzufinden. 



   Vorteilhaft werden die markierten DNA-Moleküle der Erfindung oder Teilsequenzen derselben auf Träger-Matrizen immobilisiert. Die Verwendung von DNA-Mikroanordnungen ("Gen-Chips") ist eine weitere Möglichkeit, homologe Gene zu finden oder die Expressionsmenge homologer Gene zu untersuchen. Zu diesem Zweck wird DNA, die entweder die gesamte Genom-Gensequenz, die cDNA-Sequenz der gesamten Länge, Teile dieser Sequenzen oder irgendeine Kombination von Teilsequenzen darstellt, auf Träger-Matrizen immobilisiert, damit homologe Gene nach Zugabe der 
Probe zu den Träger-Matrizen mit den markierten DNA-Molekülen hybridisieren (für Beispiele, vgl. beispielsweise Ferea T. L. & Brown, P.O., 1999, Current Opinion in Genetics & Development 9 :715- 
722, und hierin zitierte Literaturstellen). 



   Vorzugsweise umfasst die Probe für das obengenannte erfinderische Verfahren genomische 
DNA eines pflanzlichen Organismus. Durch dieses Verfahren wird auf sehr schnelle und effiziente Weise eine grosse Anzahl von Pflanzen oder anderen Spezies auf das Vorhandensein des   &num;1,2-   Xylosyltransferase-Gens untersucht. Auf diese Weise können Pflanzen oder Individuen anderer Spezies, die dieses Gen nicht aufweisen, selektiert werden bzw. kann in solchen Pflanzen oder anderen Organismen, die dieses Gen aufweisen, durch ein oben beschriebenes, erfindungsge- mässes Verfahren die Exprimierung der   &num;1,2-Xylosyltransferase   unterdrückt bzw. vollständig unter- bunden werden, so dass sie anschliessend zur Transfektion und Produktion von (humanen) Glyko- proteinen eingesetzt werden können. 



   Die Erfindung betrifft ebenfalls DNA-Moleküle, die für eine   &num;1,2-Xylosyltransferase   codieren, die nach den drei zuletzt genannten Verfahren selektiert und anschliessend aus der Probe isoliert wurden. Diese Moleküle können für weitere Untersuchungen eingesetzt werden. Sie können sequenziert und ihrerseits auch als DNA-Sonden zum Auffinden von   &num;1,2-Xylosyltransferasen   ver- wendet werde. Diese - markierten - DNA-Moleküle werden für Organismen, die den Organismen, aus denen sie isoliert wurden, verwandt sind, effizienter als Sonden fungieren, als die erfindungs- gemässen DNA-Moleküle. 



   Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Präparation von erfindungsgemäss klonierter   &num;1,2-Xylosyltransferase,   die Isoformen mit pl-Werten zwischen 6,0 und 9,0, insbesondere zwi- schen 7,50 und 8,00, aufweist. Der pl-Wert eines Proteins ist derjenige pH-Wert, bei dem seine Nettoladung Null beträgt und ist abhängig von der Aminosäuresequenz, dem Glykosylierungs- muster als auch von der räumlichen Struktur des Proteins. Die   &num;1,2-Xylosyltransferase   kann mehrere Isoformen aufweisen, die einen   pl-Wert   in diesem Bereich haben. Der Grund für die verschiedenen Isoformen der Transferase sind z.B. unterschiedliche Glykosylierungen sowie limitierte Proteolyse. Der pl-Wert eines Proteins kann durch isoelektrische Fokussierung, die dem Fachmann bekannt ist, festgestellt werden. 



   Die Haupt-Isoform des Enzyms weist ein apparentes Molekulargewicht von 60,2 kDa auf. 



   Insbesondere weist die erfindungsgemässe Präparation eine Isoform mit einem   pl-Wert   von 7,52 auf. 



   Die Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur Herstellung von "verpflanzlichten" Kohlehydrat- Einheiten von menschlichen und anderen Wirbeltier-Glykoproteinen oder anderen Glykokonju- gaten, wobei zu einer Probe, die eine Kohlehydrat-Einheit bzw. ein Glykoprotein aufweist, UDP- Xylose sowie   &num;1,2-Xylosyltransferase,   codiert durch ein oben beschriebenes DNA-Molekül, zuge- setzt werden, so dass Xylose in   &num;1,2-Stellung   durch die   &num;1,2-Xylosyltransferase   an die Kohle- hydrat-Einheit bzw. an das Glykoprotein gebunden wird. Durch das erfindungsgemässe Verfahren 

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 zur Klonierung von   &num;1,2-Xylosyltransferase   ist es möglich, grosse Mengen gereinigtes Enzym herzustellen.

   Um eine voll aktive Transferase zu erhalten, werden geeignete Reaktionsbedingun- gen vorgesehen. 



   Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und der Zeichnungsfiguren, auf die sie selbstverständlich nicht eingeschränkt werden soll, weiter erläutert werden. Im Einzelnen zeigen in der Zeichnung 
Fig. 1 die Aminosäuresequenz des Sojabohnen-Peptids 2 und 3 (Patent W099/29835; SEQ ID 
NO : 3 und 5), die Homologie zwischen diesen Peptiden und einer A. thaliana-Sequenz, sowie die 
DNA-Sequenz von vier Primern 1-4; 
Fig. 2 die cDNA-Sequenz von   &num;1,2-Xylosyltransferase   einschliesslich 226 nt des 5'-nicht-trans- latierten Bereichs ; 
Fig. 3 die Aminosäuresequenz von   &num;1,2-Xylosyltransferase,   die davon stammt; 
Fig. 4a, 4b und 4c die Ausrichtung von A. thaliana   &num;1,2-Xylosyltransferase-cDNAs,   einer geno- mischen DNA und einer EST-Sequenz;

   
Fig. 5 die Ausrichtung von Aminosäure Sequenzen von   &num;1,2-Xylosyltransferase,   die von den cDNAs, von einer genomischen DNA und von einer EST-Sequenz stammt; 
Fig. 6 eine schematische Darstellung der   &num;1,2-Xylosyltransferase   sowie der PCR-Produkte und der Hydrophobität der Aminosäurereste; 
Fig. 7 einen Vergleich der   &num;1,2-Xylosyltransferase-Aktivität   von Insektenzellen, die mit dem   &num;1,2-Xylosyltransferase-Gen   transfektiert sind, mit jener einer Negativkontrolle; 
Fig. 8a und 8b die Struktur des Akzeptor-Substrats und-Produkts der   &num;1 ,2-Xylosyltransferase,   
Fig. 9 Massenspektren; und 
Fig. 10 die Analyse des   &num;1,2-Xylosyltransferase-Produkts   mittels Reverse-Phasen-HPLC. 



   Beispiel 1: 
RT-PCR und cDNA-Klonierung 
Primer für die Amplifizierung der putativen   &num;1,2-Xylosyltransferase-cDNA   mittels RT-PCR wurden, wie folgt, entworfen : Eine BLASTP-Suche in der DDBJ-Datenbank unter Verwendung von    zwei Sojabohnen-Peptiden (SEQ ID NO : 1 und 2 ; entsprechendSEQ ID NO : 3 und 5 in Fig. 4 in   Patent W099/29835 A1; die C-terminalen Aminosäuren LG wurden jedoch von SEQ !D NO : 5 weggelassen) (vgl. Fig. 1) zeigte eine Proteinsequenz, die von einer Arabidopsis thaliana-Genom- DNA-Sequenz (Akz. Nr. AB015479) stammte, mit mehr als 80%iger Homologie (SEQ ID NO : 3). 



  Die Primer 3 (SEQ ID NO : 4) und 4 (SEQ ID NO : 5) basierten auf der A. thaliana-Sequenz, die homolog zu den Sojabohnen-Peptiden 2 und 3 ist. Die Analyse der homologen Genom-DNA- Sequenz unter Verwendung des "Gen-Finder" am BCM Search Launcher ergab ein vorhergesag- tes Protein. Primer 1 (SEQ ID NO : 6) wurde so entworfen, dass er das Start-Codon des vorherge- sagten Proteins inkludiert, wogegen Primer 2 (SEQ ID NO : 7) das Stop-Codon des vorhergesagten Proteins enthält. 



   Die gesamte RNA wurde aus jungen Blättern von Arabidopsis thaliana var Columbia unter Verwendung des   TRlzol-Reagens   (Life Technologies) isoliert. Die RNA wurde mit DNAse (Pro- mega, RQI RNase Free DNase) behandelt, um Spuren der genomischen DNA zu entfernen. 



  Erststrang-cDNA wurde aus 1 ug der gesamten RNA bei 42 C unter Verwendung von Oligo(dT)- Primern (Sigma) und AMV-Revers-Transkriptase (Promega) synthetisiert. 



   Die Erststrang-cDNA wurde einer PCR unterzogen, wobei verschiedene Kombinationen von Sense- und Antisense-Primer verwendet wurden (in Fig. 6 veranschaulicht): Das Produkt von Primer 3 und Primer 4 war ein DNA-Fragment mit einer Länge von 174 bp (P1), das Produkt von Primer 1 und Primer 2 war ein 1605 bp (P2) -DNA-Fragment, das Produkt von Primer 1 und Primer 4 war ein DNA-Fragment mit einer Länge von 1525 bp (P3), und Primer 3 und Primer 4 erzeugten eine DNA von 254 bp (P4). Zur Amplifikation des putativen offenen Leserahmens wurden Primer 1 und Primer 2 verwendet. Eine PCR-Reaktionsmischung enthielt in einem Gesamtvolumen von 50 ug 0,2 umo.l von jedem Primer, 0,05 mM dNTPs, 2 mM MgS04, 20 mM Tris-HCI (pH 8,2 bei 25 C), 10 mM KCI, 10 mM   (NH4)2S04,   0,1 % Triton X-100, 5 ug Nuclease-freies BSA und 2,5 Ein- heiten Pfu-DNA-Polymerase von Promega.

   Nach einem ersten, 2 min langen Denaturierungsschritt bei 94 C wurden 30 Zyklen von 1 min bei 92 C, 40 s bei 53 C und 3 min und 30 s bei 72 C 

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 durchgeführt. Der letzte Verlängerungsschritt wurde 8 min lang bei 72 C durchgeführt. Die PCR- 
Produkte wurden in mit Smal linearisierten und entphosphorylierten puc19-Vektor subkloniert und sequenziert : Die Sequenzen der subklonierten Fragmente wurden mittels des Didesoxynucleotid- 
Verfahrens (ABI PRISM Dye Termination Cycle Sequencing Ready reaction Kit und ABI PRISM 
310 Genetic Analyzer von Perkin Eimer) erhalten. Als Ergebnis der RT-PCT wurden drei etwas verschiedene cDNA-Sequenzen erhalten.

   Die Sequenz der cDNA6, die eine Grösse von 1605 bp (xt-Ath6; SEQ ID NO : 8) hat und für ein Protein mit 534 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 60,2 kDA und mit einem theoretischen   pl-Wert   von 7,52 (vgl. Fig. 3) kodiert, ist mit der Nukleo- tidsequenz, die aus dem genomischen Klon nach Entfernen der beiden Introns (xt-Athgen. seq) stammt, identisch. Die cDNA 9 weist 4 Basenpaar-Veränderungen im Vergleich zur cDNA 6 auf, wogegen die cDNA 16 6 Basenpaar-Veränderungen im Vergleich zur cDNA 6 aufweist (in den 
Fig. 4a, 4b und 4c veranschaulicht). Daher weist die von der cDNA 9 stammende Aminosäure- sequenz zwei Veränderungen auf im Vergleich zur Aminosäure-Sequenz, die von der cDNA 6 stammt (SEQ ID NO : 8), und die Aminosäure-Sequenz der cDNA 16 weist vier veränderte Reste auf (in Fig. 5 veranschaulicht). 



   Fig. 3 zeigt die von cDNA stammende Aminosäure-Sequenz (SEQ ID NO : 9) der   &num;1,2-Xylosyl-   transferase (xt-Ath6; SEQ ID NO : 8). Potentielle Stellen für die Asparagin-gebundene Glykosy- lierung sind bei Asn51, Asn301 und Asn479. 



   Die Fig. 4a, 4b und 4c zeigen die Ausrichtung der   &num;1,2-Xylosyltransferase-Nukleotidsequenzen   der A. thaliana-cDNA 6 (xt-Ath6; SEQ ID NO : 8), der A. thaliana-cDNA 9 (xt-Ath9), der A. thaliana- cDNA 16 (xt-Ath.16), der A. thaliana Genom-DNA-Sequenz nach Entfernen der beiden Introns (xt- Athgen), und von einer A. thaliana-EST-Sequenz (xtAthEST). Die punktierte Linie steht für die Consensus-Sequenz ; die strichlierte Linie für eine Lücke. 



   Die Genom-Sequenz (xt-Athgen; Akz. Nr. AB015479, Start-Codon an Position 58185-58187, Stop-Codon an Position 60214-60216 der Genom-DNA) ergibt sich aus dem Entfernen der beiden putativen Introns (Intron 1 : von Position 58881 bis 59116 der Genom-DNA; Intron 2 : von Position 59268 bis 59458 der Genom-DNA) unter Verwendung des Spleiss-Stellenvorhersage-Servers NetPlantGene. Die A. thaliana-EST-Sequenz (xtAthEST; Akz. Nr.   AI994524)   ist das Ergebnis einer Datenbank-Abfrage unter Verwendung von BLASTN. 



   Fig. 5 zeigt die Ausrichtung der Aminosäuresequenzen von   &num;1,2-Xylosyltransferase,   die aus A. thaliana-cDNA 6 (xt-Ath6; SEQ ID NO : 9), aus A. thaliana-cDNA 9 (xt-Ath9), aus A. thaliana-cDNA 16 (xt-Ath16), aus der genomischen A. thaliana-Sequenz (xt-Athgen) und aus einer A. thaliana- EST-Sequenz (xt-AthEST) stammt. Die punktierte Linie steht für eine Consensus-Sequenz ;   diestrichlierte Linie steht für eine Lücke.   



   In Fig. 6 sind das schematisch vorhergesagte   &num;1,2-Xylosyltransferase-Protein   (oben) und der unter Verwendung von ProtScale erhaltene Hydrophobitätsindex des codierten Proteins (unten) veranschaulicht, wobei ein positiver Hydrophobitätsindex eine erhöhte Hydrophobität bedeutet. 



  Dazwischen sind die Grössen der vier oben angegebenen PCR-Produkte (P1-P4) im Verhältnis zur cDNA gezeigt. "C" codiert für den postulierten zytoplasmatischen Bereich, "T" für den postulierten Transmembranbereich und "G" für den postulierten Golgi-Lumen-katalytischen Bereich der Trans- ferase. Die Analyse der Proteinsequenz durch "TMpred" (von EMBnet) ergab einen angenomme- nen Transmembranbereich von llell bis Phe29. Der C-terminale Bereich des Enzyms umfasst vermutlich den katalytischen Bereich und sollte folglich in den Lumen des Golgi-Apparats zeigen. 



  Demgemäss scheint diese Transferase ein Typ   II-Transmembran-Protein   wie alle bisher analysier- ten Glykosyltransferasen zu sein, die in der Glykoprotein-Biosynthese (Joziasse, 1992, Glycobio- logy 2,271-277) eine Rolle spielen. Die grauen Bereiche repräsentieren die Position der beiden Peptide, die Hexagone stellen die potentiellen N-Glykosylierungsstellen dar. Eine BLAST-Suche in Datenbanken, die über NCBI zugänglich waren, zeigte nur eine hohe Homologie mit einer anderen Pflanzensequenz (Espen-Hybride, Akz. Nr. AI62640). 



   Beispiel 2: 
Expression der rekombinanten   &num;1,2-Xylosyltransferase   in Insektenzellen 
Die gesamte codierende Region der vermutlichen   &num;1,2   Xylosyltransferase samt cytoplasmati- scher und transmembraner Region wurde vom puc19-Vektor durch   BamHI-   und EcoRI-Verdau 

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 entfernt und in mit BamHI/EcoRI-verdauten und entphosphorylierten Baculovirus-Transfer-Vektor pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA) subkloniert. Die korrekte Klonierung wurde durch Sequen- zierung unter Verwendung des pVL1393-Vorwärts-Primers 5'-AACCATCTCGCAAATAAATAAGTA- 3' (SEQ ID NO : 10) und des pVL1393-Rückwärts-Primers 5'-GTCGGGTTTAACATTACGGATTTC- 
3' (SEQ ID NO : 11) bestätigt.

   Um eine homologe Rekombination zu gewährleisten, wurde 1 ug des Transfer-Vektors mit 200 ng linearer Baculo-Gold viraler DNA (PharMingen, San Diego, CA) in 
1 x 106 Sf-9-Zellen in IPL-41 Medium unter Verwendung von Lipofectin (Life Technologies) gemäss den Vorschriften des Herstellers co-transfektiert. Nach einer Inkubation von 5 Tagen bei 27 C wurden verschiedene Volumina des Überstandes mit dem rekombinanten Virus zur Infektion der Sf21-Insektenzellen verwendet. Die Zellen wurden 4 Tage lang bei 27 C in IPL-41-Medium, das mit 5% Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum ergänzt worden war, inkubiert, dann geerntet und 2x mit Phosphat gepufferter Salzlösung gewaschen.

   Die Zellen wurden im folgenden Puffer (1 ml pro   107-Zellen) resuspendiert und homogenisiert : mM MES-Puffer, pH 7,0, mit 1% Triton X-100,   
1 mM DDT, 1 mM PMSF, 5 ug/mi Leupeptin (Sigma), 5 ug/mi E-64 (Serva) und 30 min lang auf Eis inkubiert. 



   Beispiel 3 : 
Assay für die   &num;1,2-Xylosyltransferase-Aktivität   
Die Zellhomogenate wurden auf   &num;1,2-Xylosyltransferase-Aktivität   getestet. Negativkontrollen wurden mit der selben Anzahl nicht-infizierter Zellen durchgeführt. Die Testmischungen enthielten - bei einem Gesamtvolumen von 20 ul- 13 ul homogenisierter Zellen, 2 nmol dabsyliertes GnGn- Hexapeptid oder GnGn-Pyridylamin als Akzeptor-Substrat (Fig. 8a), 1 mM UDP-Xylose als Donor- Substrat, 10 mM ATP, 20 mM   MnCI2,   und 1 mM 2-Acetamido-1,2-didesoxynojirimycin wurde inkludiert, um einen Abbau des Produkts durch N-Acetylhexosaminidase zu verhindern. Die Proben wurden 1 h lang bei 37 C inkubiert und mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert. 



   Fig. 7 zeigt die gemessene Enzymaktivität der rekombinanten   &num;1,2-Xylosyltransferase   sowie der Negativkontrolle. Graue Balken zeigen die Aktivität, wenn GnGn-Hexapeptid als Substrat ver- wendet wurde, wogegen schwarze Balken die Verwendung von GnGn-Pyridylamin als Substrat anzeigen. Die Enzymaktivität der co-transfektierten Zellen war 30x höher als jene der Negativ- kontrollen. 



   Die Struktur des Akzeptor-Substrats von   &num;1,2-Xylosyltransferase   ist in Fig. 8a gezeigt, und das postulierte Produkt in Fig. 8b, worin R entweder einen Pyridylamin- oder einen dabsylierten Hexapeptid-Rest darstellt. 



   Beispiel 4: 
Massenspektrometrie des Xylosyltransferase-Produkts 
Die Massenspektrometrie wurde auf einem DYNAMO (BioAnalysis, Santa Fe, NM) durch- geführt, einem MALDITOF MS, welches zu einer dymanischen Extraktion fähig ist (Synonym für späte Extraktion). Zwei Typen von Proben-Matrix-Präparaten wurden verwendet: dabsylierte Glykopeptide wurden in 5%iger Ameisensäure gelöst, und Aliquots wurden an das Target angelegt, luftgetrocknet, und mit   1%iger   alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure bedeckt. Pyridylaminierte Glykane wurden mit Wasser verdünnt, auf das Target aufgetragen und luftgetrocknet. Nach Zugabe von 2%iger 2,5-Dihydroxybenzoesäure wurden die Proben sofort durch Anlegen von Vakuum ge- trocknet. 



   Fig. 9 zeigt das Massenspektrum dieser Proben, wobei (A) die Negativkontrolle ist : Der Haupt- Peak (S) zeigt das   Dabsyl-Val-Gly-Glu-(GlcNAc4Man3)Asn-Arg-Thr-Substrat,   wobei der berechnete [M+H]+-Wert 2262,3 ist. Dieses Substrat scheint auch als Natriumadditionsprodukt und als kleine- res Ion auf, das durch Fragmentierung der Azo-Funktion der Dabsyl-Gruppe, bei (S*), gebildet worden ist. Der Peak bei m/z = 2424,4 zeigt die unvollständige Ent-Galaktosylierung des Substrats. 



  Das Massenspektrum (B) zeigt die Probe mit rekombinanter   &num;1,2-Xylosyltransferase   nach 1hInku- bation bei 37 C. Der Haupt-Peak (P) mit einem [M+H]+-Wert von 2393,4 stellt das xylosylierte Produkt dar. 

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   Beispiel 5: 
HPLC-Analyse des Xylosyltransferase-Produkts 
Xylosyltransferase-Assays wurden, wie oben unter Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt, ausser dass 10 nmol GnGn-Pyridylamin als Akzeptor-Substrat verwendet wurden. Nach 4 h Inkubation wurde die Probe sowohl mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie als auch mittels Reverse- 
Phasen-HPLC analysiert, um die Struktur des Produkts zu verifizieren. Der vermutete Produkt- 
Peak, der kurz vor dem Substrat GnGn-PA eluierte, wurde gesammelt. Mittels MALDI-TOF MS wurde festgestellt, dass die Masse des Produkts 1550,9 ist, was gut damit übereinstimmte, dass es GnGnX-PA sei. Nach Verdau mit   &num;-N-Acetylglukosaminidase   aus Rinderniere (in 50 mM Natrium- zitrat-Puffer, pH 5,0,20 h lang bei 37 C mit 25 mE des Enzyms) eluierte das Glykan mit etwa der Retention von MM.

   Dies stimmt mit den veröffentlichten Daten über die Retention von MM-PA und MMX-PA überein (Wilson & Altmann, 1998, Gycoconj. J. 15,1055-1070). Weiterer Verdau mit alpha-Mannosidase aus Canavalia ensiformis ("jack beans") unter den gewählten Bedingungen (20 h bei 37 C mit 50 mE Enzym) führte zum Auftreten zweier neuer Peaks. Da die alpha-1,3- gebundene Mannose beträchtlich empfindlicher gegenüber Mannosidase ist als die alpha-1,6- gebundene Mannose, werden die Peaks OOX und MOX (in der Reihenfolge der Elution) zugeord- net. Tatsächlich coeluierte MOX-Pyridylamin, das aus Bromelain durch Entfucosylierung mit Säure hergestellt wurde, mit dem vermuteten MOX, das aus dem Xylosyltransferase-Produkt stammte. 



  Die relativ starke Verschiebung der Elutionszeit infolge des Entfernens des alpha-1,3-gebundenen Mannoserestes ist ein starkes Anzeichen dafür, dass die   #-Mannose   durch Xylose ersetzt ist (Will- son & Altmann, 1998, Glycoconj. J. 15, 1055-1070; Altmann, 1998, Glycoconj. J. 15, 79-82). 



   Fig. 10 zeigt die Analyse des Xylosyltransferase-Produkts mittels Reverse-Phasen-HPLC. (A) Transferaseinkubationsmischung ; (B) isoliertes Xylosyltransferase-Produkt; (C) isoliertes Xylosyl- transferase-Produkt nach Verdau mit   &num;-N-Acetylglucosaminidase;   (D) isoliertes Xylosyltransferase- Produkt nach weiterem Verdau mit alpha-Mannosidase. Die Zuordnung der Peaks ist wie folgt. 



  1 : GnGn-PA ; 2 : GnGnX-PA ; 3 : MMX-PA ; 4 : MOX-PA ; 5 : OOX-PAA; 6 : MO-PA (aus einer Spur von Substrat im isolierten Produkt). Bezüglich Abkürzungen von N-Glykan-Strukturen, vgl. Wilson   I.B.H.   und Altmann, F., 1998, Glycoconj. J. 15,1055-1070. 



   SEQUENZPROTOKOLL < 110 > Glössl Prof., Josef < 120 > xylosyltransferase-gene < 130 > xylosyltransferase-gene < 140 > < 141 > < 160 > 11 < 170 > Patentin Ver. 2.1 < 210 > 1 < 211 > 27 < 212 > PRT < 213 > Sojabohne < 400 > 1 Ser Gln Val gln Ala Ile His Asp Ala Ser Val Ile Ile Gly Ala His   1 5 10 15   

 <Desc/Clms Page number 15> 

 Gly Ala Gly Leu Thr His Ile Val Ser Ala Leu 
20 25 < 210 > 2 < 211 > 8 < 212 > PRT < 213 > Sojabohne < 400 > 2 Gly Leu Glu Tyr His Ala Ile Asn 
1 5 < 210 > 3 < 211 > 60 < 212 > PRT < 213 > arabidopsis thaliana < 400 > 3 Asp Gln Val Arg Ala Ile Gln Asp Ala Ser Val Ile Ile Gly Ala His 
1 5 10 15 Gly Ala Gly Leu Thr His Ile Val Ser Ala Thr Pro Asn Thr Thr Ile 
20 25 30 Phe Glu Ile Ile Ser Val Glu Phe Gln Arg Pro His Phe Glu Leu Ile 
35 40 45 Ala Lys Trp Lys Gly Leu Glu Tyr His Ala Met His 
50 55 60 < 210 > 4 < 211 > 21 < 212 > DNA < 213 

  > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 4 gatcaagtcc gagccattca a 21 < 210 > 5 < 211 > 21 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 5 cgcgtgatac tccaatcctt t 21 < 210 > 6 < 211 > 21 < 212 > DNA 

 <Desc/Clms Page number 16> 

 < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 6 atgagtaaac ggaatccgaa g 21 < 210 > 7 < 211 > 21 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:

  Primer < 400 > 7 ttagcagcca aggctcttca t 21 < 210 > 8 < 211 > 1831 < 212 > DNA < 213 > Arabidopsis thaliana < 400 > 8 aaatctgcag actctcaaaa ttccgattca tcttattgaa gaacaatttt ccggcgaaac 60 agccgatgaa gtctcgcctg aatcttctgt acctttcacc ggcgattgac ttcacttcag 120 aatcgagaga gaagaaatcg atggaaaact aaaaatagaa agagtttcaa attctcgctc 180 tctcttcaaa accgcaaatc aagggaacga gagacgagag agagagatga gtaaacggaa 240 tccgaagatt ctgaagattt ttctgtatat gttacttctc aactctctct ttctcatcat 300 ctacttcgtt tttcactcat cgtcgttttc accggagcag tcacagcctc ctcatatata 360 ccacgtttca gtgaataacc aatcggcgat tcagaaaccg tggccgatct taccttctta 420 cctcccatgg acgccgccgc agaggaatct accaactggc tcctgcgaag gttacttcgg 480 gaatggattt acaaagagag ttgacttcct taagccgagg attggaggag gaggagaagg 540 aagctggttc cgatgttttt acagtgagac attacagagt tcgatttgtg aaggaaggaa 600 tctgagaatg gttccggatc ggattgttat gtcgagagga ggtgagaagt tagaggaagt 660 

  tatggggagg aaagaggagg aggagcttcc tgcgtttcga caaggtgcgt ttgaggtagc 720 ggaagaggtt tcttcacggt taggttttaa gagacaccgt cgttttggtg gaggagaagg 780 aggtagtgcg gtttctcggc ggctggtgaa tgatgagatg ttgaatgaat atatgcaaga 840 aggtggaatt gatagacata caatgagaga tttggttgct tcgattcgtg ctgttgatac 900 caatgatttc gtttgtgaag agtgggtgga ggaaccgacc ttgcttgtca ctagattcga 960 gtacgcaaat ctcttccata ctgtgacaga ttggtatagt gcctatgttt cgtctagagt 1020 caccggtttg cctaatcgac ctcacgttgt tttcgttgac ggacactgca cgacgcagct 1080 agaagaaaca tggacagctt tgttttccgg aatcagatac gcaaagaact tcaccaaacc 1140 ggtttgtttc cgccacgcga ttctttcacc attgggatac gaaaccgctc tttttaaagg 1200 cttgtccgga gaaatagact gcaagggaga ttcagctcac aatctgtggc aaaacccgga 1260 cgataaaagg actgcgagga tatcagagtt tggtgaaatg atcagagcag ctttcgggtt 1320 gcctgtcaat agacaccgct cattagaaaa gccgctatca tcatcatcat catcagcctc 1380 agtttataat gttctttttg tccgccgtga agattactta 

  gcccatcctc gtcatggcgg 1440 taaagtccag tctcggctca tcaatgagga agaagtgttc gactcgttgc atcattgggt 1500 tgcaactggg tccaccggtc tgaccaaatg cgggattaac cttgtgaatg gcttgcttgc 1560 acacatgtca atgaaagatc aagtccgagc cattcaagat gcttcagtga tcataggagc 1620 tcatggagca ggactgactc acattgtctc tgcaacacca aacacaacga tatttgagat 1680 aataagcgtc gagtttcaga gacctcattt cgagcttata gctaagtgga aaggattgga 1740 gtatcacgcg atgcatctgg cgaactcacg agcggaacca acggctgtga ttgagaagtt 1800 

 <Desc/Clms Page number 17> 

 aacggagatc atgaagagcc ttggctgcta a 1831 < 210 > 9    < 211 > 534    < 212 > PRT < 213 > Arabidopsis thaliana < 400 > 9 Met Ser Lys Arg Asn Pro Lys Ile Leu Lys Ile Phe Leu Tyr Met Leu   1 5 10 15   Leu Leu Asn Ser Leu Phe Leu Ile Ile Tyr Phe Val Phe His Ser Ser 
20 25 30 Ser Phe Ser Pro Glu Gln Ser Gln Pro Pro His Ile Tyr His Val Ser 
35 40 45 Val Asn Asn Gln Ser Ala Ile 

  Gln Lys Pro Trp Pro Ile Leu Pro Ser 
50 55 60 Tyr Leu Pro Trp Thr Pro Pro Gln Arg Asn Leu Pro Thr Gly Ser Cys 
65 70 75 80 Glu Gly Tyr Phe Gly Asn Gly Phe Thr Lys Arg Val Asp Phe Leu Lys 
85 90 95 Pro Arg Ile Gly Gly Gly Gly Glu Gly Ser Trp Phe Arg Cys Phe Tyr 
100 105 110 Ser Glu Thr Leu Gln Ser Ser Ile Cys Glu Gly Arg Asn Leu Arg Met 
115 120 125 Val Pro Asp Arg Ile Val Met Ser Arg Gly Gly Glu Lys Leu Glu Glu 
130 135 140 Val Met Gly Arg Lys Glu Glu Glu Glu Leu Pro Ala Phe Arg Gln Gly 
145 150 155 160 Ala Phe Glu Val Ala Glu Glu Val Ser Ser Arg Leu Gly Phe Lys Arg 
165 170 175 His Arg Arg Phe Gly Gly Gly Glu Gly Gly Ser Ala Val Ser Arg Arg 
180 185 190 Leu Val Asn Asp Glu Met Leu Asn Glu Tyr Met Gln Glu Gly Gly Ile 
195 200 205 Asp Arg His Thr Met Arg Asp Leu Val Ala Ser Ile Arg Ala Val Asp 
210 215 220 Thr Asn Asp Phe Val Cys Glu Glu Trp Val Glu Glu Pro Thr Leu Leu 
225 230 235 

  240 Val Thr Arg Phe Glu Tyr Ala Asn Leu Phe His Thr Val Thr Asp Trp 
245 250 255 

 <Desc/Clms Page number 18> 

 Tyr Ser Ala Tyr Val Ser Ser Arg Val Thr Gly Leu Pro Asn Arg Pro 
260 265 270 His Val Val Phe Val Asp Gly His Cys Thr Thr Gln Leu Glu Glu Thr 
275 280 285 Trp Thr Ala Leu Phe Ser Gly Ile Arg Tyr Ala Lys Asn Phe Thr Lys 
290 295 300 Pro Val Cys Phe Arg His Ala Ile Leu Ser Pro Leu Gly Tyr Glu Thr 
305 310 315 320 Ala Leu Phe Lys Gly Leu Ser Gly Glu Ile Asp Cys Lys Gly Asp Ser 
325 330 335 Ala His Asn Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asp Lys Arg Thr Ala Arg Ile 
340 345 350 Ser Glu Phe Gly Glu Met Ile Arg Ala Ala Phe Gly Leu Pro Val Asn 
355 360 365 Arg His Arg Ser Leu Glu Lys Pro Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala 
370 375 380 Ser Val Tyr Asn Val Leu Phe Val Arg Arg Glu Asp Tyr Leu Ala His 
385 390 395 400 Pro Arg His Gly Gly Lys Val Gln Ser Arg Leu Ile Asn Glu Glu Glu 
405 410 415 

  Val Phe Asp Ser Leu His His Trp Val Ala Thr Gly Ser Thr Gly Leu 
420 425 430 Thr Lys Cys Gly Ile Asn Leu Val Asn Gly Leu Leu Ala His Met Ser 
435 440 445 Met Lys Asp Gln Val Arg Ala Ile Gln Asp Ala Ser Val Ile Ile Gly 
450 455 460 Ala His Gly Ala Gly Leu Thr His Ile Val Ser Ala Thr Pro Asn Thr 
465 470 475 480 Thr Ile Phe Glu Ile Ile Ser Val Glu Phe Gln Arg Pro His Phe Glu 
485 490 495 Leu Ile Ala Lys Trp Lys Gly Leu Glu Tyr His Ala Met His Leu Ala 
500 505 510 Asn Ser Arg Ala Glu Pro Thr Ala Val Ile Glu Lys Leu Thr Glu Ile 
515 520 525 Met Lys Ser Leu Gly Cys 
530 < 210 > 10 

 <Desc/Clms Page number 19> 

 < 211 > 24 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 10 aaccatctcg caaataaata agta 24 < 210 > 11 < 211 > 24 < 212 > DNA < 213 > Kunstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kunstlichen Sequenz:

  Primer < 400 > 11 gtcgggttta acattacgga tttc 24 
PATENTANSPRÜCHE: 
1. DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Sequenz gemäss SEQ ID NO : 8 mit einem offenen Leserahmen von Basenpaar 227 bis Basenpaar 1831 umfasst oder zumin- dest 50% Homologie zur obengenannten Sequenz aufweist oder unter stringenten Bedin- gungen mit der oben genannten Sequenz hybridisiert oder eine Sequenz umfasst, die in- folge des genetischen Codes zur oben genannten DNA-Sequenz degeneriert ist, wobei die 
Sequenz für ein pflanzliches Protein mit einer Xylosyltransferase-Aktivität codiert oder da- zu komplementär ist.

Claims (1)

  1. 2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es für ein Protein mit einer ss1,2-xylosyltransferae-Aktiveität codiert.
    3. DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es zumindest 70-80%, besonders bevorzugt zumindest 95%, Homologie zur Sequenz gemäss SEQ ID NO : 8 aufweist.
    4. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es 1780 bis 1880, insbesondere 1831 Basenpaare umfasst.
    5 DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es mit einer detektierbaren Marker-Substanz kovalent verbunden ist.
    6. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA- Sequenz eine Deletions-, Insertions- und/oder Substitutions-Mutation aufweist.
    7. DNA-Molekül, das für ein Ribozym codiert, dadurch gekennzeichnet, dass es zwei Se- quenzabschnitte hat, von welchen jeder eine Länge von mindestens 10 bis 15 Basenpaare hat und die komplementär zu den Sequenzabschnitten eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 sind, so dass das Ribozym die von einem natürlichen &num;1,2-Xylosyl- transferase-DNA-Molekül transkribierte mRNA komplexiert und schneidet.
    8. Biologisch funktioneller Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst.
    9. Biologisch funktioneller Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst, mit inverser Orientierung in Bezug auf den Promotor.
    10. Biologisch funktioneller Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er ein DNA-Molekül nach Anspruch 6 oder 7 umfasst.
    11. Verfahren zur Herstellung einer cDNA umfassend ein DNA-Molekül nach einem der An- sprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass RNA aus pflanzlichen Zellen, insbeson- <Desc/Clms Page number 20> dere aus Blattzellen, isoliert wird und mit dieser RNA nach Zusetzen einer reversen Trans- kriptase und Primern eine reverse Transkription durchgeführt wird.
    12. Verfahren zum Klonieren einer &num;1,2-Xylosyltransferase, dadurch gekennzeichnet, dass ein DNA-Molekül gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 in einen Vektor kloniert wird, der an- schliessend in eine Wirtszelle bzw. einen Wirt transfektiert wird, wobei durch Selektion und Amplifikation von transfektierten Wirtszellen Zelllinien erhalten werden, die die aktive &num;1,2- Xylosyltransferase exprimieren.
    13. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Wirtszellen, insbesondere Pflanzenzellen oder Pflanzen, wobei die Produktion von &num;1 ,2-Xylosyltransferase unterdrückt oder vollstän- dig unterbunden ist, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest einer der Vektoren nach einem der Ansprüche 8 bis 10 in die Wirtszelle bzw. Pflanze eingeschleust wird.
    14. Verfahren zur Herstellung rekombinanter Wirtszellen, insbesondere Pflanzenzellen bzw.
    Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Molekül nach Anspruch 6 in das Ge- nom der Wirtszelle bzw. Pflanze an der Stelle der nicht-mutierten, homologen Sequenz eingeschleust wird.
    15. Rekombinante Pflanzen oder Pflanzenzellen, dadurch gekennzeichnet, dass sie nach einem Verfahren nach Anspruch 13 oder 14 hergestellt sind und dass ihre &num;1,2-Xylosyl- transferaseproduktion unterdrückt bzw. vollständig unterbunden ist.
    16. PNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Basensequenz umfasst, die kom- plementär zur Sequenz eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 4 ist.
    17. PNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Basensequenz umfasst, die der Se- quenz eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 4 entspricht.
    18. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, insbesondere Pflanzenzellen, die eine blockierte Expression von &num;1,2-Xylosyltransferase auf Transkriptions- oder Trans- lationsebene aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass PNA-Moleküle nach Anspruch 16 oder 17 in die Zellen eingeschleust werden.
    19. Verfahren zur Herstellung rekombinanter Glykoproteine, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzen oder Pflanzenzellen nach Anspruch 15 oder Pflanzen bzw. Zellen, die gemäss einem Verfahren nach Anspruch 18 hergestellt sind, mit dem Gen, das das Glykoprotein exprimiert, transfektiert sind, so dass die rekombinanten Glykoproteine exprimiert werden.
    20. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten humanen Glykoproteinen, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Pflanzen oder Pflanzenzellen nach Anspruch 15 oder Pflanzen bzw.
    Zellen, die gemäss einem Verfahren nach Anspruch 18 hergestellt sind, mit dem Gen, das das Glykoprotein exprimiert, transfektier sind, so dass die rekombinanten Glykoproteine exprimiert werden.
    21. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten humanen Glykoproteinen zur medizinischen Verwendung, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzen oder Pflanzenzellen nach An- spruch 15 oder Pflanzen bzw. Zellen, die gemäss einem Verfahren nach Anspruch 18 her- gestellt sind, mit dem Gen, das das Glykoprotein exprimiert, transfektiert sind, so dass die rekombinanten Glykoproteine exprimiert werden.
    22. Rekombinante Glykoproteine, dadurch gekennzeichnet, dass sie gemäss dem Verfahren nach Anspruch 19 in pflanzlichen Systemen hergestellt werden und dass ihre Peptidse- quenz unter 50%, insbesondere unter 20%, besonders bevorzugt 0%, der &num;1,2-gebunde- nen Xylose-Reste aufweist, welche in Proteinen vorhanden sind, die in nicht-Xylosyl- transferase-reduzierten pflanzlichen Systemen exprimiert worden sind.
    23. Rekombinante humane Glykoproteine, dadurch gekennzeichnet, dass sie gemäss dem Ver- fahren nach Anspruch 20 in pflanzlichen Systemen hergestellt werden und dass ihre Pep- tidsequenz unter 50%, insbesondere unter 20%, besonders bevorzugt 0%, der &num;1,2-ge- bundenen Xylose-Reste aufweist, welche in Proteinen vorhanden sind, die in nicht-Xylosyl- transferase-reduzierten pflanzlichen Systemen exprimiert worden sind.
    24. Rekombinante humane Glykoproteine zur medizinischen Verwendung, dadurch gekenn- zeichnet, dass sie gemäss dem Verfahren nach Anspruch 21 in pflanzlichen Systemen her- gestellt werden und dass ihre Peptidsequenz unter 50%, insbesondere unter 20%, beson- ders bevorzugt 0%, der &num;1,2-gebundenen Xylose-Reste aufweist, welche in Proteinen vor- handen sind, die in nicht-Xylosyltransferase-reduzierten pflanzlichen Systemen exprimiert <Desc/Clms Page number 21> worden sind 25. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie rekombinante Glykoproteine nach einem der Ansprüche 22 bis 24 umfasst.
    26. Verfahren zum Selektieren von DNA-Molekülen, die für eine &num;1,2-Xylosyltransferase codie- ren, in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass DNA-Moleküle nach Anspruch 5 zur Probe zugesetzt werden, welche Moleküle an die DNA-Moleküle, die für eine &num;1,2-Xylo- syltransferase codieren, binden.
    27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe genomische DNA eines pflanzlichen oder Nicht-Vertebraten-Organismus umfasst.
    28. DNA-Moleküle, die für eine &num;1,2-Xylosyltransferase codieren, dadurch gekennzeichnet, dass sie gemäss dem Verfahren nach Anspruch 26 oder 27 selektiert und anschliessend aus der Probe isoliert werden.
    29. Präparation von &num;1,2-Xylosyltransferase, die gemäss einem Verfahren nach Anspruch 12 kloniert wurde, dadurch gekennzeichnet, dass sie Isoformen mit pl-Werten zwischen 6,0 und 9,0, insbesondere zwischen 7,50 und 8,00, aufweist.
    30. Präparation nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Isoform mit einem pl-Wert von 7,52 aufweist.
    31. Verfahren zur Herstellung von verpflanzlichten Kohlehydrat-Einheiten von menschlichen und anderen Wirbeltier-Glykoproteinen, dadurch gekennzeichnet, dass zu einer Probe um- fassend eine Kohlehydrat-Einheit oder ein Glykokonjugat bzw. Glykoprotein, UDP-Xylose und &num;1,2-Xylosyltransferase, die von einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert worden ist, zugegeben werden, so dass Xylose in &num;1,2-Stellung durch die &num;1,2- Xylosyltransferase an die Kohlehydrat-Einheit oder das Glykokonjugat bzw. das Glyko- protein gebunden wird.
    32. Verwendung eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder Teilsequenzen davon oder Kombinationen von Teilsequenzen davon zur Immobilisierung auf DNA-Mikro- anordnungen, beispielsweise zum Auffinden homologer Sequenzen oder für Expressions- untersuchungen bei Pflanzen oder Nicht-Vertebraten.
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