DE19744873A1 - Sterol-Glycostyltransferasen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die für Sterol-Glycosyltransferasen kodieren, sowie deren Verwendung zur Veränderung des Gehalts und/oder der Struktur von Sterylglycosiden und/oder deren synthetischen Folgepro­ dukte in transgenen Organismen.

Sterylglycoside und die biosynthetischen Folgeprodukte Steryloligoglycosi­ dede und acylierte Sterylglycoside sind in Pflanzen sowie in einigen Pilzen und Bakterien vorkommende Naturstoffe. Für diese Stoffe und deren Folge­ produkte sind viele physiologische Effekte beschrieben wie z. B. Hemmung der vasculären Permeabilität, Anti-Tumor-Aktivität, entzündungshemmende und haemostatische Wirkung (Okuyama, E. und Yamazaki, M. (1983) Yakugaku Zasshi 103: 43 ff; Normura, T.; Watanabe, M.; Inoue, K. und Ohata, K. (1978) Japan J. Pharmacol. 28, Suppl. 110P; Miles, D. H.; Stagg, D. D. und Parish, E.J. (1979) J. Nat. Prod. 42: 700 ff; King, M. L.; Ling, H. C.; Wang, C.T. und Su, M. (1979) J. Nat. Prod. 42: 701 ff.; Seki, J.; Okita, A.; Watanabe, M.; Na­ kagawa, T.; Honda, K.; Tatewaki, N. und Sugiyama, M. (1985) J. Pharm. Sci. 74: 1259-1264), die eine Anwendung als therapeutisch wirksame Substanzen beim Menschen nahelegen. Als Medikament erhältlich ist bislang nur aus Pflanzen isoliertes β-Sitosterin-β-D-Glucosid zur Behandlung der Prostata­ hyperplasie (z. B. als Harzol-Kapseln, Hoyer GmbH, Neuß).

Ein Nachteil dieser Substanzen ist dabei, daß sie in den Organismen nur in relativ geringen Mengen vorliegen und durch aufwendige Verfahren extra­ hiert und gereinigt werden müssen. Außerdem sind einige Organismen, die diese Substanzen enthalten humanpathogen und lassen sich nur mit großem Aufwand kultivieren, was ihre potentielle Verwendung als Medikament, De­ tergentien, Emulgatoren, als Grundstoff für Kunststoffe und für die Her­ stellung von Liposomen, wenn sie in größeren Mengen und höherer Reinheit vorliegen müssen, momentan wenig brauchbar erscheinen läßt.

Die enzymatische Synthese der Sterylglycoside in den Organismen aus Zuc­ kernukleotiden und Sterolen mit freier OH- Gruppe wird durch die zucker­ nukleotidabhängigen Sterol-Glycosyltransferasen (kurz: Sterol-Glycosyl­ transferasen) katalysiert. Diese Enzyme können zum Teil aus den Organis­ men isoliert und gereinigt werden, stehen aber für wirtschaftliche Anwen­ dungen nicht in ausreichenden Mengen und Qualitäten zur Verfügung.

Die Aktivität dieser Enzyme kann mit speziellen in vitro-Enzymnachweissy­ stemen nachgewiesen werden. In einem Fall konnte darüberhinaus eine Ste­ rol-Glucosyltransferase aus Hafer bis zur Homogenität gereinigt werden (Warnecke und Heinz, 1994). Es ist jedoch noch kein Gen oder eine andere Nukleinsäure bekannt, die für eine Sterol-Glycosyltransferase kodiert.

Weiterhin ist eine Reihe von Nukleinsäuresequenzen bekannt, die Ähnlich­ keit zu den in dieser Anmeldung beschriebenen Sequenzen besitzen. In kei­ nem Fall wurde für diese aber eine Sterol-Glycosyltransferase-Aktivität des zugehörigen Transkriptionsprodukts gezeigt oder auch nur diskutiert. Solche Nukleinsäuresequenzen können nun dazu verwendet werden, den Gehalt und/oder die Zusammensetzung an Sterylglycosiden und Folgepro­ dukten in bestimmten Organismen zu manipulieren und damit ökonomisch relevante Eigenschaften dieser Organismen positiv zu verändern. So können Kulturpflanzen mit verbesserter Toleranz oder Resistenz gegenüber schäd­ lichen Umwelteinflüssen wie Bodenversalzung, Trockenheit, Kälte und Frost erzeugt werden. Auch Mikroorganismen wie z. B. Bäcker- und Brauhefe kann hinsichtlich Ethanol und Temperaturtoleranz verbessert werden.

Neben dem Reaktionsprodukt Sterylglycosid kann aber auch das Enzym selbst wirtschaftlich nutzbar sein, wenn man es rein und in großer Menge gentechnisch herstellt. Als Beispiel sei hier die Anwendung zur Choleste­ rol-Quantifizierung genannt.

Weiterhin können die Sterol-Glycosyltransferasen - und die hierfür kodie­ renden DNA-Sequenzen - aufgrund der Ähnlichkeit von Solanidin mit Stero­ len - auch als Enzyme, bzw. für die Bereitstellung solcher Enzyme, verwen­ det werden, die für die Synthese von Solanin in Solanaceen verantwortlich sind. Hiermit ließen sich dann gentechnisch veränderte solaninarme oder -freie Pflanzen herstellen. Durch Wahl geeigneter Methoden kann eine sol­ che Reduzierung auf bestimmte Pflanzenteile oder Entwicklungsstadien be­ grenzt werden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Nukleinsäurefragmente zur Ver­ fügung zu stellen, mit denen sich transgene Organismen herstellen lassen, die verbesserte ökonomisch relevante Eigenschaften haben oder mit denen in vivo oder in vitro Sterylglycoside und deren Folgeprodukte erzeugt werden können. Diese Substanzen können

• a) in größeren Mengen erzeugt werden als in den Ausgangsorganismen; oder
• b) von Organismen erzeugt werden, die leichter und sicherer zu kultivieren sind als jene, in denen diese Stoffe natürlicherweise vorkommen; oder
• c) von neuartiger Struktur sein und für die Anwendung günstigere Eigen­ schaften aufweisen.

Es wurde ein Verfahren gefunden, die Synthese von Sterylglycosiden und deren Folgeprodukten zu kontrollieren. Dazu werden Nukleinsäurefragmente bereitgestellt, die für Sterol-Glycosyltransferasen kodieren, um chimäre Gene zu erzeugen. Diese chimären Gene können benutzt werden, um Zellen­ kulturen, Pflanzen, Tiere oder Mikroorganismen zu transformieren und da­ mit deren Sterylglycosidsynthese zu verändern.

Die Erfindung betrifft

• (1) ein isoliertes DNA-Fragment oder rekombinantes DNA-Konstrukt enthal­ tend mindestens einen Teil einer Sterol-Glycosyltransferase oder Sterol- Glycosyltransferase im engeren Sinn kodierenden Sequenz;
• (2) ein Protein das aus einer der in Fig. 1-3 oder 11-22 gezeigten Nuklein­ säuresequenzen abgeleitetet ist;
• (3) Plasmide, Viren oder andere Vektoren, die Nukleinsäuren wie in (1) de­ finiert, enthalten;
• (4) Genomische Klone die Gene oder Teile von Genen enthalten, die für eine Sequenz wie in (1) definiert, kodieren;
• (5) ein Chimäres Gen, das in der Lage ist, in einer transformierten Zelle den Gehalt an Sterol-Glycosyltransferase oder Sterol-Glycosyltransferase im engeren Sinn, insbesondere Sterol-Glucosyltransferase oder Sterol-Glu­ cosyltransferase im engeren Sinn, zu verändern;
• (6) transformierte Zellen, transformierte Mikroorganismen, Pflanzen oder Pflanzenteile, die ein chimäres Gen wie in (5) definiert, enthalten;
• (7) ein Verfahren zum Herstellen von Sterylclycosiden umfassend das Kulti­ vieren der in (6) definierten transformierten Organismen;
• (8) die durch das in (7) definierte Verfahren erhältlichen Sterylclycoside oder deren Folgeprodukte;
• (9) ein DNA-Fragment, erhältlich nach einem der folgenden Verfahren oder Teilen davon:
  • a) Verwenden von einer der in Fig. 1-3 oder 11-13 oder 17 gezeig­ ten Nukleinsäuresequenzen als Hybridisierungsprobe;
  • b) Verwenden der in Fig. 4, 5, 14-16, 18, 19, 21 oder 22 gezeigten Aminosäuresequenzen zur Synthese von Peptiden oder Proteinen, die zur Gewinnung von Antiseren dienen; oder
  • c) i) Vergleichen der in Fig. 1-3, 11-13 oder 17 gezeigten Nukleotid­ sequenzen oder der daraus abgeleiteten, in Fig. 4, 5, 14-16, 18, 19, 21 oder 22 gezeigten Aminosäuresequenzen untereinander oder mit bereits bekann­ ten Nukleotidsequenzen oder daraus abgeleiteten Aminosäuresequenzen,
  • ii) Ableiten und Synthetisieren von geeigneten spezifischen Oligo­ nukleotiden aus ähnlichen Bereichen dieser Sequenzen, und
  • iii) Benutzen dieser Oligonukleotide, um mit Hilfe eines sequenzab­ hängigen Protokolls, insbesondere der PCR-Methode, Nukleinsäuren herzu­ stellen, die für Sterol-Glycosyltransferasen oder Sterol-Glycosyltransfera­ sen im engeren Sinn, insbesondere Sterol-Glucosyltransferasen oder Sterol- Glucosyltransferasen im engeren Sinn oder Teilen davon kodieren;
• (10) ein chimäres Gen das ein in (9) definiertes DNA-Fragment enthält und das in der Lage ist, in einer transformierten Zelle den Gehalt an Sterol- Glycosyltransferase oder Sterol-Glycosyltransferase im engeren Sinn, ins­ besondere Sterol-Glucosyltransferase oder Sterol-Glucosyltransferase im engeren Sinn, zu verändern;
• (11) transformierte Zellen, die ein chimäres Gen, wie in (10) definiert, ent­ halten;
• (12) Organismen, insbesondere Mikroorganismen wie Bakterien und Hefen, deren Gen oder Gene, die für Sterol-Glycosyltransferasen oder Sterol-Gly­ cosyltransferasen im engeren Sinn, insbesondere Sterol-Glucosyltransfera­ sen oder Sterol-Glucosyltransferasen im engeren Sinn, kodieren, durch Transformation mit geeigneten chimären Genen deletiert oder unterbrochen sind;
• (13) Sterol-Glycosyltransferasen oder Sterol-Glycosyltransferasen im enger­ en Sinn, insbesondere Sterol-Glucosyltransferasen oder Sterol-Glucosyl­ transferasen im engeren Sinn, oder Teile davon oder Fusionsproteine mit den genannten Transferasen, die aus Organismen wie in (6) oder (11) defi­ niert, erhältlich sind; und
• (14) Antiseren, Produkte aus Antiseren, Antikörper oder Teile davon, die gegen Proteine wie in (13) definiert, gerichtet sind.

Die Nukleinsäurefragmente, die für Sterol-Glucosyltransferasen kodieren (Fig. 2, 17) konnten aus Avena sativa und Arabidopsis thalliana isoliert werden. Die von diesen Nukleinsäurefragmenten abgeleiteten Aminosäurese­ quenzen zeigen überraschend geringe Ähnlichkeiten zu den bekannten Se­ quenzen von Steroidhormon-Glucuronosyltransferasen. Es ist daher überra­ schend, daß wir mit unseren Methoden völlig neue Nukleinsäurefragmente isolieren konnten. Es sind bislang keine anderen Nukleinsäurefragmente identifiziert worden, die für Sterol-Glycosyltransferasen kodieren. Die iso­ lierten eukaryoten Nukleinsäurefragmente sind dadurch charakterisiert, daß sie überraschenderweise dazu geeignet sind, mit entsprechenden Steu­ ersequenzen versehen, sowohl in eukaryoten als auch in prokaryoten Orga­ nismen, und hierin also ohne die typisch eukaryote Prozessierung und Mo­ difizierung, die Synthese von enzymatisch aktiven Sterol-Glucosyltransfe­ rasen zu bewirken.

Die Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäurefragmente, deren abgelei­ tete Aminosäuresequenzen definierte Ähnlichkeiten zu den abgeleiteten Aminosäuresequenzen der in Fig. 12 oder 13 gezeigten Sequenzen haben. Die Erfindung betrifft ebenfalls alle Plasmide, Viren und andere Vektoren, die diese isolierten Nukleinsäurefragmente oder Teile davon enthalten.

Die in Fig. 4 und 18 dargestellten Aminosäuresequenzen zeigen auffällige Ähnlichkeiten mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz eines genomischen DNA-Stück aus S. cerevisiae (siehe Fig. 9) Dabei handelt es sich um das Chromosom XII Cosmid 9470 (Genbank Nr. gb U17246). Die Ähnlichkeit bezog sich auf den 3'-Bereich, des in reverser Richtung offenen Leserahmens von bp 32961-36557 (Gen L9470.23). Für dieses putative Gen ist bislang keine Funktion bekannt. Es werden verschiedene Teile dieses Gens mit geeigneten Steuersequenzen versehen und konnten nach Transformation von E. coli mit diesem chimären Gen überraschenderweise Sterol-Glucosyltransferase-Akti­ vität in Zellhomogenaten der transgenen Zellen nachweisen.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der Nukleinsäuresequen­ zen von Fig. 1-3, 11-13 und 17, oder den daraus abgeleiteten Aminosäurese­ quenzen zur Isolierung von Genen oder cDNAs, die für andere Sterol-Glyco­ syltransferasen kodieren. Dies betrifft z. B. die Verwendung der Sequenzen oder Teilen davon als Hybridisierungsproben, Verwendung von Antikörpern gegen ein Polypeptid, das von den Nukleinsäurefragmenten bzw. Derivaten davon kodiert wird. Außerdem ist die Ableitung von Oligonukleotiden und deren Verwendung in der PCR-Methode, aus den Nukleotid- oder Aminosäu­ resequenzen auch durch Vergleich mit anderen Sequenzen betroffen. Die Erfindung betrifft alle Plasmide, Viren, und andere Vektoren, die die Nukleinsäurefragmente aus den Fig. 1-3, 11-13, 17 oder Teile davon oder das Hefegen L9470.23 oder Teile davon oder Nukleinsäurefragmente oder Teile davon, die nach den im letzten Absatz beschriebenen Methoden iso­ liert wurden, enthalten und die zur Expression von Sterol-Glycosyltransfe­ rasen in transformierten Zellen geeignet sind. Schutzanspruch wird auch erhoben auf alle Organismen (Mikroorganismen, Tiere, Pflanzen, Teile da­ von, Zellkulturen), die diese chimären Gene enthalten und den Produkten oder Extrakten daraus, wenn die stoffliche Zusammensetzung dieser Orga­ nismen durch die Wirkung dieser chimären Gene verändert wurde.

Die Darstellung von Nukleinsäuren in den Abbildungen ist stets vom 5'-Ende zum 3'-Ende, die von Proteinen vom Aminoterminus zum Carboxyter­ minus. Die Aminosäuren sind im Ein-Buchstaben-Code benannt. Die Abbild­ ungen dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Sie zeigen:

Fig. 1 DNA-Teilsequenzen eines ca. 800 bp langen DNA-Fragments, das mit der PCR-Methode aus Hafer cDNA gewonnen wurde (siehe Beispiel 3.). A. 5'-terminale Sequenz wa18e. B. 3'-terminale Sequenz wa19er.

Fig. 2 DNA-Sequenz des Nukleinsäurefragments HaSGT, das aus einer cDNA- Expressionsgenbank aus Haferkeimlingen isoliert wurde. Sie hat eine Länge von 2317 Basenpaaren (bp) und enthält ein offenes Leseraster von Position 1 bis 1971. Start- bzw. Stopcodon finden sich bei den Positionen 148-150 bzw. 1972-1974.

Fig. 3 Vergleiche der DNA-Teilsequenzen wa18e und wa19er des 800 bp lan­ gen DNA-Fragments (Fig. 1) mit der Sequenz des Haferklons HaSGT (Fig. 2). Der Vergleich wurde mit Hilfe des Programs CLUSTAL (Higgins und Sharp, 1988, Gene 73, 237-244) durchgeführt. A. Vergleich zwischen wa18e und Ha- SGT. B. Vergleich zwischen wa19er und HaSGT. Die * markieren identische Basen.

Fig. 4 Aminosäuresequenz HaSGTP im Ein-Buchstaben-Code, die aus der DNA-Sequenz des Nukleinsäurefragments HaSGT abgeleitet wurde und die für eine Sterol-Glucosyltransferase mit einer molekularen Masse von 71 kD kodiert.

Fig. 5 Vergleich der N-terminalen Aminosäuresequenz des gereinigten En­ zyms (N-TERMINUS) mit der aus dem Haferklon HaSGT abgeleiteten Amino­ säuresequenz HaSGTP. Der Vergleich wurde mit Hilfe des Programs CLUSTAL (Higgins und Sharp, 1988, Gene 73, 237-244) durchgeführt. Die * markieren identische Aminosäuren. - bezeichnen nicht vorhandene oder unbekannte Aminosäuren.

Fig. 6 Dünnschichtchromatographische Analyse radioaktiver Produkte von in vitro Enzymassays, die mit zellfreien Homogenaten aus transformierten E. coli-Zellen durchgeführt wurden (Beispiel 5.).

Die organischen Phasen wurden auf Kieselgel 60 Platten (Merck, Darmstadt) aufgetragen, die mit dem Laufmittel Chloroform:Methanol 85 : 15 (A) bzw. Chloroform:Methanol:Ammoniak (25%ig) 65 : 35 : 5 (B) entwickelt wurden. Die Rf-Werte der radioaktiven, lipophilen Reaktionsprodukte wurden mit einem Berthold-TLC-Analyser bestimmt und mit authentischen Standards verglich­ en, die mit α-Naphthol-Schwefelsäure detektiert wurden. Es konnte jeweils nur ein Produkt nachgewiesen werden, das als Sterylglucosid identifiziert wurde. Der Rf-Wert des Sterylglucosids weicht bei A in diesem Fall von dem mit diesem Laufmittel üblichen Wert ab, weil das Laufmittel nicht frisch angesetzt wurde und eine Veränderung der Zusammensetzung durch Verdunstung stattgefunden hatte. A. Die E. coli Zellen wurden mit dem Plamid pBS-ATG (Beispiel 5.) transformiert. B. Die E. coli Zellen wurden mit dem Plamid pBS-HRP (Beispiel 5.) transformiert.

Fig. 7 Western-Blot von rekombinanten Sterol-Glucosyltransferasen. Je 40 µg Protein von E. coli Zellen, die verschiedene Teile des Haferklons HaSGT exprimieren wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese un­ terworfen und anschließend auf eine hydrophobe Membran übertragen. Die Immunofärbung wurde mit einem Antiserum gegen die aus Hafer gereinigte Sterol-Glucosyltransferase durchgeführt. Spur 1 und 2: Protein von E. coli- Zellen, die mit dem Plasmid pBS-HRP transformiert wurden. Spur 3: Protein von E. coli-Zellen, die mit dem Plasmid pBS-HATG transformiert wurden. Spur 4: Standardproteine mit den Molekularmassen von 31, 45, 66 und 97 kD. Die Proteine wurden mit Ponceaurot gefärbt, die Standardproteine mit einem Stift markiert und wieder entfärbt.

Fig. 8 Dünnschichtchromatographische Analyse radioaktiver Produkte eines in vitro Enzymassays, der mit zellfreiem Homogenat aus mit dem Plasmid pGALHAM1 transformierten S. cerevisiae-Zellen durchgeführt wurde (Bei­ spiel 6.). Die organischen Phase wurde auf eine Kieselgel 60 Platte (Merck, Darmstadt) aufgetragen, die mit dem Laufmittel Chloroform:Methanol 85 : 15 entwickelt wurde. Der Rf-Wert des radioaktiven, lipophilen Reaktionspro­ dukts wurde mit einem Berthold-TLC-Analyser bestimmt und mit authenti­ schen Standards verglichen, die mit α-Naphthol-Schwefelsäure detektiert wurden. Es konnte nur ein Produkt nachgewiesen werden, das als Steryl­ glucosid identifiziert wurde.

Fig. 9 Aus der DNA-Sequenz des S. cerevisiae-Gens L9470.23 abgeleitete Aminosduresequenz im Ein-Buchstaben-Code. Die Aminosäuren mit denen der zweite Abschnitt der Fusionsproteine beginnt, für die die Plasmide der Klonierungen 1 bis 4 kodieren (Beispiel 7.), sind markiert.

Fig. 10 Dünnschichtchromatographische Analyse radioaktiver Produkte von in vitro Enzymassays, die mit zellfreien Homogenaten aus transformierten S. cerevisiae-Zellen durchgeführt wurden (siehe Beispiel 7.). Die organischen Phasen wurden auf Kieselgel 60 Platten (Merck, Darmstadt) aufgetragen, die mit dem Laufmittel Chloroform:Methanol 85 : 15 entwickelt wurden. Die Rf-Werte der radioaktiven, lipophilen Reaktionsprodukte wur­ den mit einem Berthold-TLC-Analyser bestimmt und mit authentischen Standards verglichen, die mit α-Naphthol-Schwefelsäure detektiert wurden. Es konnte jeweils nur ein Produkt nachgewiesen werden, das als Sterylglu­ cosid identifiziert wurde. A. Die S. cerevisiae-Zellen wurden mit dem Plas­ mid der Klonierung 2 transformiert. B. Die S. cerevisiae-Zellen wurden mit dem Plamid der Klonierung 4 (Beispiel 5.) transformiert.

Fig. 11 DNA-Sequenz des DNA-Fragments Apcr, das mit der PCR-Methode aus Arabidopsis thalliana isoliert wurde (Beispiel 8.).

Fig. 12 DNA-Sequenz des DNA-Fragments Kpcr, das mit der PCR-Methode aus Solanum tuberosum wurde (Beispiel 8.).

Fig. 13 DNA-Teilsequenz des DNA-Fragments Cpcr, das mit der PCR-Methode aus Candida albicans isoliert wurde (Beispiel 8.).

Fig. 14 A. Aminosäuresequenz ApcrP im Ein-Buchstaben-Code, die aus der DNA-Sequenz des DNA-Fragments Apcr abgeleitet wurde. B. Vergleich der Aminosäuresequenz ApcrP mit der Hafersequenz HaSGTP. Der Vergleich wur­ de mit Hilfe des Programs CLUSTAL (Higgins und Sharp, 1988, Gene 73, 237-244) durchgeführt. Die * markieren identische Aminosäuren.

Fig. 15 A. Aminosäuresequenz KpcrP im Ein-Buchstaben-Code, die aus der DNA-Sequenz des DNA-Fragments Kpcr abgeleitet wurde. B. Vergleich der Aminosäuresequenz KpcrP mit der Hafersequenz HaSGTP. Der Vergleich wur­ de mit Hilfe des Programs CLUSTAL (Higgins und Sharp, 1988, Gene 73, 237-244) durchgeführt. Die * markieren identische Aminosäuren.

Fig. 16 A. Aminosäuresequenz CpcrP im Ein-Buchstaben-Code, die aus der DNA-Teilsequenz des DNA-Fragments Cpcr abgeleitet wurde. B. Vergleich der Aminosäuresequenze CpcrP mit der Hafersequenz HaSGTP. Der Vergleich wurde mit Hilfe des Programs CLUSTAL (Higgins und Sharp, 1988, Gene 73, 237-244) durchgeführt. Die * markieren identische Aminosäuren.

Fig. 17 DNA-Sequenz des Nukleinsäurefragments AtSGT, das aus einer cDNA-Expressionsgenbank aus Haferkeimlingen isoliert wurde (Beispiel 9.). Sie hat eine Länge von 2353 Basenpaaren (bp) und enthält ein offenes Le­ seraster von Position 1 bis 2023. Start- bzw. Stopcodon finden sich bei den Positionen 113-115 bzw. 2023-2025.

Fig. 18 Aminosäuresequenz AtSGTP im Ein-Buchstaben-Code, die aus der DNA-Sequenz des Nukleinsäurefragments AtSGT abgeleitet wurde.

Fig. 19 Vergleich der Aminosäuresequenzen HaSGTP und AtSGTP. Der Ver­ gleich wurde mit Hilfe des Programs CLUSTAL (Higgins und Sharp, 1988, Gene 73, 237-244) durchgeführt. Die * markieren identische Aminosäuren.

Fig. 20 Dünnschichtchromatographische Analyse radioaktiver Produkte ei­ nes in vitro Enzymassays, der mit zellfreiem Homogenat aus mit dem Plas­ mid pBS-AtSGT transformierten E. coli-Zellen durchgeführt wurde (Beispiel 10.). Die organischen Phase wurde auf Kieselgel 60 Platten (Merck, Darm­ stadt) aufgetragen, die mit dem Laufmittel Chloroform:Methanol 85 : 15 ent­ wickelt wurde. Der Rf-Wert des radioaktiven, lipophilen Reaktionsprodukts wurde mit einem Berthold-TLC-Analyser bestimmt und mit authentischen Standards verglichen, die mit α-Naphthol-Schwefelsäure detektiert wurden. Es konnte nur ein Produkt nachgewiesen werden, das als Sterylglucosid identifiziert wurde.

Fig. 21 Partielle Aminosäuresequenz der Sequenz HaSGTP im Ein-Buchsta­ ben-Code.

Fig. 22 Partielle Aminosäuresequenz der Sequenz AtSGTP im Ein-Buchsta­ ben-Code.

Fig. 23 Partielle Aminosäuresequenz im Ein-Buchstaben-Code, die aus dem S. cerevisiae-Gen L9470.23 abgeleitet wurde.

Die Erfindung wird im folgenden an Beispielen erläutert.

1. Reinigung der UDP-Glucose: Sterol-Glucosyltransferase, Antiserum, N-terminale Sequenzierung

Die Reinigung des Enzyms, die Produktion eines Antiserums gegen das Pro­ tein und die Western-Blot Analysen wurde nach bekannten Methoden Warn­ ecke, D. C. und Heinz, E. (1994) Plant Physiol. 105: 1067-1073 durchgeführt. Anschließend wurde eine Analyse von Teilsequenzen der Aminosäuresequenz des Proteins vorgenommen. Das bis zur Homogenität gereinigte Protein wurde einer SDS-PAGE unterworfen und elektrophoretisch auf eine Polyvi­ nylidendifluorid-Membran (Immobilon P, Millipore, Eschborn) übertragen. Das Protein wurde mit Coomassie Brilliant Blue R 250 (Biorad, München) gefärbt und die einer molekularen Masse von 56 kD entsprechende Bande aus der Membran ausgeschnitten. Das Protein wurde anschließend direkt N- terminal sequenziert oder proteolytisch geschnitten, um interne Bruchstüc­ ke zu erhalten. Das Protein wurde nach Bauw, G.; van den Bulcke, M.; van Damme, J.; Puype, M.; van Montagu, M. und Vandekerckhove, J. (1988) J. Prot. Chem. 7: 194-196 mit Trypsin verdaut und die proteolytischen Bruch­ stücke mit einer High-Performance-Liquid-Chromatography-Anlage (130A, Applied Biosystems, Weiterstadt) auf einer "reverse phase" Säule getrennt (Vydac C4, 300 Angström Porendurchmesser, 5 µm Partikelgröße). Die Peptide wurden mit einem linearen Gradienten (0-80% B, Lösung A: Wasser mit 0,1% Trifluoressigsäure, Lösung B: 70 Acetonitril mit 0,09% Trifluoressigsäure) mit einer Flußrate von 0,2 ml/min eluiert. Das Elutionsmuster der Peptide entsprach dem Muster, das typischerweise einem Trypsin-selbstverdau entspricht. Auch nach mehrfacher Wiederholung des Versuchs konnte kein Peptid aufgrund der Retentionszeit dem gereinigten Protein zugeordnet werden. Daraufhin wurden die meisten Peptide sequenziert. Die Sequenzen entsprachen jedoch alle der Aminosäuresequenz des Trypsins. Diese Versu­ che zeigten, das das gereinigte sehr hydrophobe Membranprotein dem Try­ psinverdau gut widersteht und daß die hydrophoben Peptidbruchstücke sich offenbar kaum noch von der Membran lösen lassen. Die Versuche wurden jedoch mit einer alternativen Strategie fortgesetzt. Nach erneuten Verdauungsversuchen wurden die eluierten Peptide einer Rechromatogra­ phie unterworfen (mit einer Nucleosil C8-Säule, 120 X 1,6 mm, Gradient wie oben). Dabei stellte sich überraschenderweise heraus, das ein schein­ bar homogenes Peptid des Trypsinselbstverdaus eine Nebenkomponente ent­ hielt, dessen Aminosäuresequenz nicht der von Trypsin entsprach. Diese Sequenz lautet im Ein- Buchstaben-Code: MTETTIIQALEMTGQ. Die Proteinse­ quenzierungen wurden nach der Standard-Edman-Degradation auf einem automatischen Sequenziergerdt (473A, Applied Biosystems, Weiterstadt) durchgeführt.

Es wurden die N-terminale Aminosäuresequenz auf einer Länge von 15 Ami­ nosäuren bestimmt. Diese lautet im Ein-Buchstaben-Code: DVGGEDGYGDVT- VEE. - Zusätzlich wurde die Sequenz eines Peptidbruchstücks auf einer Länge von 14 Aminosäuren bestimmt. Diese lautet im Ein-Buchstaben-Code: MTETIIQALEMTGQ.

2. Erstellung einer Hafer cDNA-Bank

Es wurde eine cDNA-Expressionsgenbank aus Hafer angelegt, um vollständi­ ge Klone der Sterol-Glucosyltransferase zu isolieren.

Zuerst wurde RNA aus 4 Tage alten und im Dunkeln kultivierten Haferkeim­ lingen (Avena sativa, Sorte Alfred) isoliert. Dazu wurden die Keimlinge in flüssigem Stickstoff zermörsert. Das Pulver wurde in einen Puffer mit Guanidinisothiocyanat aufgenommen und filtriert. Die RNA wurde durch eine Caesiumchloridlösung in der Ultrazentrifuge sedimentiert. Das Sedi­ ment wurde in Aqua dest. aufgenommen und die RNA mit 2 Teilen Ethanol und 0,05 Teilen Essigsäure gefällt und sedimentiert. Das Sediment wurde in Aqua dest. aufgenommen. Aus der Hafer RNA wurde mRNA isoliert. Dies wurde mit Dynabeads Oligo (dT) der Firma Dynal GmbH (Hamburg) nach der Gebrauchsanweisung durchgeführt. Mit Hilfe des ZAP-cDNA Synthesis Kit (Firma Stratagene, Heidelberg) wurde aus der isolierten mRNA nach Her­ stellerangaben cDNA synthetisiert und eine cDNA-Bank angelegt.

3. Isolation von partiellen DNA-Sequenzen der Sterol-Glucosyltransferase aus Hafer mit der PCR-Methode

Aus den Sequenzen der N-terminalen Aminosäuresequenzierung (siehe 1.) wurden Oligonukleotidprimer abgeleitet:

DW1 = 5'-GGITAYGGIGAYGTNACIGTIGARGA-3'(Vorwärtsprimer)
DW2 = 5'-GAYGTIGGIGGIGARGAYGGNTA-3'(Vorwärtsprimer)

als Reverseprimer diente

XXS4T = 5'-GATCTAGACTCGAGGTCGACTTTTTTTTTTTTTT-3'

Abkürzungen: Y = C und T - D = G und A und T - I = Inosin - N = A und G und C und T - R = G und A - K = G und T - S = G und C H = A und T und C - B = G und T und C - V = G und A und C - X = C und I - W = A und T - M = A und C.

Die Polymerase-Kettenreaktion-(PCR)-Methode wurde wie folgt durchgeführt:
Reaktionsmix: 46 µl Aqua dest.; 5 µl Boehringer (Mannheim) 10× PCR-Puffer; je 1 µl 10 mM dATP, dGTP, dCTP, dTDP; je 1 µl 100 PM DW1 (bzw. DW2), XXS4T; 0,25 µl Boehringer Taq-Polymerase; 0,5 µl cDNA aus Haferkeimlingen (siehe 2., Konzentration nicht bestimmt). Reaktionsbedingungen: 94°C, 3 min; 30x (94°C, 40 s; 53°C, 1 min; 72°C, 3 min); 72°C, 10 min.

Diese PCR-Reaktionen mit einem spezifischen Primer (DW1 bzw. DW2) und einem unspezifischen Primer (XXS4T), der an alle Klone der cDNA-Bank bin­ det, die ein sogenanntes PolyA-Ende enthalten, blieben erfolglos. Das heißt, es konnte kein DNA-Fragment amplifiziert, kloniert und sequenziert werden, das Sequenzteile enthielt, die den einge­ setzten Primern entsprachen.

Die PCR-Reaktion wurde in zahlreichen Modifikationen durchgeführt (anderes Temperaturprogramm, sogenannte Nested-PCR mit den Primern DW1 und DW2), blieb jedoch weiterhin erfolglos.

Daraufhin wurden Versuche zur Sequenzierung von Peptidbruchstücken des gereinigten Proteins unternommen (siehe 1), um PCR-Reaktionen mit zwei spezifischen Primern durchführen zu können.

Aus den Sequenzen der Peptid-Aminosäuresequenzierung (siehe 1.) wurde folgender Oligonukleotidprimer abgeleitet:

Wa1 = 5'-GCYTGDATDATIGTYTCIGTC-3' (Reverseprimer)

Die Polymerase-Kettenreaktion-(PCR)-Methode wurde wie folgt durchgeführt:
Reaktionsmix: 46 µl Aqua dest.; 5 µl Boehringer (Mannheim) 10× PCR-Puffer; je 1 µl 10 mM dATP, dGTP, dCTP, dTDP; je 1 µl 100 µM DW1, Wal; 0,25 µl Boehringer Taq-Polymerase; 0,5 µl cDNA aus Haferkeiml­ ingen (siehe 2., Konzentration nicht bestimmt).
Reaktionsbedingungen: 94°C, 3 min; 30x (94°C, 40 s; 53°C, 1 min; 72°C, 3 min); 72°C, 10 min.

Erst durch den Einsatz des spezifischen Reverseprimer Wa1 konnte eine erfolgreiche PCR-Reaktion durchgeführt werden: Eine Agarosegelelektro­ phorese mit 15 µl des Reaktionsansatzens ergab eine DNA-Band e von ca. 800 bp Länge.

Dieses DNA-Stück wurde mit dem SureClone Ligation Kit (Pharmacia, Freiburg) in einen Plasmidvektor kloniert und vom 5'- und 3'-Ende teil­ sequenziert. Diese Sequenzen (wa18e und wa19er) werden in Fig. 1 gezeigt.

4. Isolation vollständiger Klone

Das klonierte DNA-Stück (siehe 3.) wurde markiert und zum Absuchen einer cDNA-Bank (siehe 2.) verwendet, um vollständige Klone der Sterol-Glucosyl­ transferase zu isolieren.

Das DNA-Stück wurde mit dem PCR DIG Probe Synthesis Kit (Boehringer, Mannheim) nach Herstellerangaben nichtradioaktiv markiert, DIG = ein Di­ goxigenin-haltiges System zur Markierung von Nukleinsäuren von Boehrin­ ger (Mannheim). Anschließend wurde die markierte Probe zum Absuchen der Hafer cDNA-Bank verwendet. Die Methode ist im Boehringer DIG System User4s Guide for Filter Hybridization (Plaque Hybridization, Colorimetric Detection with NBT and BCIP) beschrieben. Es wurden 250.000 infektionsfä­ hige Phagenpartikel abgesucht (Hybridisierungstemperatur 69°C). Es wur­ den 50 positive Klone gefunden, von denen 13 einem zweiten und dritten Screening unterworfen wurden. Diese 13 positiven Klone wurden von der Phagenform in die Plasmidform überführt (in vivo excision nach Stratagene Protocol ZAP-cDNA-Synthesis Kit, Heidelberg).

Ein ca. 2300 bp langer Klon (im folgenden HaSGT genannt) wurde vollstän­ dig und doppelsträngig sequenziert. Diese Sequenz ist in Fig. 2 gezeigt: Die Teilsequenzen (wa18e und wa19er) des klonierten PCR-Fragments sind zu über 95% identisch mit dem Klon HaSGT (Fig. 3). Dieser Klon ist 2317 bp lang, und zeigt einen offenen Leserahmen von bp 1 bis bp 1971. Ein Start­ codon (ATG) für die Translation beginnt am bp 148. Wird der offene Leser­ ahmen in eine Aminosäuresequenz übersetzt (HaSGTP, Fig. 4), so zeigt die Aminosäuresequenz vollständige Identitäten mit der Aminosäuresequenz des Peptidbruchstücks des gereinigten Proteins und fast vollständige Identitä­ ten mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des gereinigten Proteins (14 Aminosäuren von 15 sind identisch, Fig. 5). Diese Übereinstimmung zeigt klar, daß die klonierte cDNA dem gereinigten Protein entspricht. Der Un­ terschied bei einer Aminosäure beruht vermutlich auf allelische Differen­ zen. Da die erste Aminosäure der N-terminalen Aminosäuresequenz des ger­ einigten Proteins (D) der Aminosäure 133 des offenen Leserahmens von Klon HaSGT entspricht, kann erwartet werden, daß der Klon für ein Prä­ protein kodiert, das in vivo zu einem reifen Protein geschnitten wird (pu­ tatives reifes Protein). Das Plasmid, das den 2317 bp langen Haferklon in dem Vektor pBluescript I SK enthält (zwischen der EcoRI- und der XhoI- Schnittstelle eingefügt), wird im folgenden pBS-HaSGT genannt.

5. Funktionale Expression von Teilen des Klons HaSGT in E. coli.

Um zu beweisen, daß die klonierte DNA-Sequenz (siehe 4.) für eine Sterol- Glucosyltransferase kodiert, wurden Teile des Klons HaSGT funktional in E. coli exprimiert.

• - Es wurden zwei Klonierungen in zur Expression geeignete Vektoren durch­ geführt:
• a) Diese Klonierung erzeugt ein Plasmid (pBS-HATG), das für ein Fusions­ protein kodiert, dessen erste Aminosäuren aus dem pBluescript lacZ-Ope­ ron und dem Polylinker stammen (normal gedruckt, siehe unten) und dessen folgende Aminosäuren denen nach dem Startmethionin, der in eine Amino­ säuresequenz übersetzten Nukleotidsequenz des HaSGT, entsprechen (unter­ strichen, siehe unten).
  Das Plasmid pBS-HaSGT wurde mit den Restriktionsenzymen EaeI und EagI geschnitten und der linearisierte Teil, der die Vectorsequenzen enthält, mit sich selbst zusammenligiert. Das entstehende Plasmid kodiert für ein Fusionsprotein, dessen Anfang wie folgt aussieht:
  MTMITPSSELTLTKGNKSWSSTAVAADADEPTGG . . .
• b) Diese Klonierung erzeugt ein Plasmid (pBS-HRP), das für ein Fusionspro­ tein kodiert, dessen erste Aminosäuren aus dem pBluescript lacZ-Operon und dem Polylinker stammen (normal gedruckt, siehe unten) und dessen zweiter Teil dem putativen reifen Protein aus Hafer entspricht (unterstri­ chen, siehe unten).
  Für diese Klonierung wird ein PCR-Versuch durchgeführt, bei dem DNA des Plasmids pBS-HaSGT als Matrix-DNA eingesetzt wurde. Es wurden folgende Primer verwendet:
  DW15 = GATGAGGAAATTCACTAGTTG
  DW20 = GATGGATCCACTTGATGTTGGAGG.

Ein PCR-Fragment von ca. 500 bp Länge wurde über ein Agarosegel gerei­ nigt, mit den Restriktionsenzymen BamHI und NdeI geschnitten und noch­ mals über ein Gel gereinigt, aus dem ein Fragment von ca. 450 bp Länge isoliert wurde.

Das Plasmid pBS-HaSGT wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und NdeI geschnitten und ein Fragment von ca. 4300 bp Länge aus einem Agarosegel eluiert. Dieses Fragment wurde mit dem geschnittenen PCR-Fragment li­ giert und zur Transformation von E. coli eingesetzt. Aus den transformier­ ten Zellen wurde Plasmid-DNA isoliert und teilweise sequenziert. Die Plas­ mid-DNA kodiert für das folgende Fusionsprotein:

MTMITPSSELTLTKGNKSWSSTAVAALELVDLDVGGEDGY . . .

Bei den mit den Plasmiden pBS-HATG und pBS-HRP transformierten E. coli- Zellen wurde überprüft, ob das entsprechende Fusionsprotein exprimiert wurde, indem ein in vitro Enzymnassay zum Nachweis von Sterol-Glucosyl­ transferase-Aktivität mit Zellhomogenaten durchgeführt wurde.

Die Zellen von 2 ml Übernachtkultur (2 ml LB-Ampicillin, 37°C, 14 h) wur­ den sedimentiert und in 1 ml Lysispuffer aufgenommen (50 mM Tris/HCl pH 8,0; 15% Glycerol; 5 mM DTT; 1 mg/ml Lysozym (aus Hühnerei, Boehringer, Mannheim); 200 µM Pefabloc (Merck, Darmstadt); 0,1% Triton X100. Nach 5minütiger Inkubation bei 20°C wurden die Suspensionen auf Eis gestellt und die Zellen durch 3 × 3 Sekunden Behandlung mit dem Ultraschallstab aufgebrochen.

Die Reaktionslösung des in vitro Enzymassays hatte ein Volumen von 60 µl und war wie folgt zusammengesetzt (17.1.1996):
100 mM Tris/HCl pH 8,0 (bei 30°C); 1 mM DTT; 0,2% Triton X100; 1 mM Cho­ lesterol, 5 µl E. coli-Homogenat (1-2 mg Protein/ml), 100.000 dpm UDP-[U- ¹⁴C]-Glucose (144 µM).

Die Reaktion wurde nach 20 min (bei 30°C) durch Mischen mit 0,5 ml Wasser und 1,6 ml Ethylacetat gestoppt. Nach der Phasentrennung durch kurze Zentrifugation wurde die obere organische Phase entnommen und die darin enthaltene Radioaktivität mit einem Scintillationszähler bestimmt:

E. coli Homogenat mit pBS-HaATG: 620 desintegrations per minute (radio­ aktive Zerfälle pro Minute) (dpm)
E. coli Homogenat mit pBS-HRP: 3100 dpm
E. coli Homogenat, untransformiert: 0 dpm.

Von länger inkubierten Parallelproben wurde die in der organischen Phase vorhandene Radioaktivität einer dünnschichtchromatographischen Analyse unterzogen:
Die organischen Phasen wurden auf Kieselgel 60 Platten (Merck, Darmstadt) aufgetragen, die mit dem Laufmittel Chloroform:Methanol 85 : 15 entwickelt wurden. Die Rf-Werte der radioaktiven, lipophilen Reaktionsprodukte wur­ den mit einem Berthold-TLC-Analyser bestimmt und mit authentischen Standards verglichen, die mit α-Naphthol-Schwefelsäure detektiert wurden. Es konnte jeweils nur ein Produkt nachgewiesen werden, das als Sterylglu­ cosid identifiziert wurde (siehe Fig. 6). Damit konnte nachgewiesen werden, daß die transformierten E. coli Zellen ein Protein exprimieren, das Sterol- Glucosyltransferase-Aktivität zeigt. Nichttransformierte Kontroll-Zellen zeigen keine Sterol-Glucosyltransferase-Aktivität.

Die Expression der pflanzlichen Peptidsequenzen wurde außerdem durch Western-Blot-Analysen nachgewiesen:
Je 40 µg Protein der E. coli Homogenate wurde mit 8% Trichloressigsäure gefällt und anschließend einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (10%) unterworfen (mit Biorad Mini Protean II Apparat, München). Die Proteine wurden durch Elektroblotting auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und eine Immunofärbung durchgeführt (Anti-Sterol-Glucosyltransferase An­ tiserum 1 : 1000, Färbung mit Wasserstoffperoxid und 4-Chlor-naphthol). Die Western-Blot-Membran ist in Fig. 7 abgebildet. Bei E. coli mit pBS-HRP ist eine Bande von ca. 59 kD deutlich angefärbt. Bei E. coli mit pBS-HaATG ist eine 74 kD Bande die am intensivsten gefärbte. Bei diesen Proteinen han­ delt es sich um die auf den Plasmiden kodierten Proteine.

6. Funktionale Expression eines Teils des Klons HaSGT in S. cerevisiae.

Dazu wurde ein Vektor hergestellt, der zur Expression der pflanzlichen cDNA in Saccharomyces cerevisiae geeignet ist.

• - Amplifikation des CYC1 Terminators Zaret, J. K. und Sherman, F. (1982) Cell 28 : 563-573 mit der PCR-Methode unter der Verwendung der Primer 5'-GATATCTAGAGGCCGCAAATTAAAGCCTTC-3' und 5'-CCCGGGATCCGAGGGCCGCATCATGTAATT-3' und Klonierung in den Vektor pRS316 Sikorski, R. S. und Hieter, P. (1989) Genetics 122: 193-27. Das resultierende Plasmid wurde pRS316t genannt.
• - Klonierung des GAL1 Promotors (0,5 kb SpeI/XbaI Fragment) aus dem pYES Vektor (Invitrogen) in den Vektor Bluescript KS (Stratagen, Heidelberg). Aus der Klonierung resultierte pGAL1.
• - Klonierung des GAL1 Promotors (0,5 kb XbaI/PvuII Fragment) aus pGAL1 in den Vektor Bluescript KS (HincII/XbaI). Das resultierende Plasmid wurde pGAL2 genannt.
• - Klonierung des Fragments über XhoI/SacI in den pYES2.0 Vektor (Invitro­ gen, Leek, Holland). Daraus resultierte pGAL3.
• - Klonierung des Fragments aus dem pGAL3 über KpnI/XhoI in den pRS316t.

Daraus entstand der single copy Hefeexpressionsvektor pGAL4 mit folgen­ den Eigenschaften:
single copy Plasmid, URA-Marker, GAL1 Promotor, CYC1 Terminator, MCS.

Ein Teil des Haferklons HaSGT wurde mit SalI/KpnI aus dem Plasmid pBS-HaSGT ausgeschnitten und in den pSP72 Vector (Promega, Heidelberg, SalI/KpnI) kloniert. Das SalI/KpnI-Fragment des resultierenden Plasmids pSPHAM1 umfaßt den entsprechenden Anteil des HaSGT und wurde in den Vektor pGAL4 (XhoI/BamHI) kloniert. Das resultierende Plasmid wurde pGALHAM1 und zur Transformation der Saccharomyces cerevisiae Stamm UTL-7A (MATa, ura3-52, trp1, leu2-3/112) eingesetzt.

Um die Sterol-Glucosyltransferase-Aktivität der exprimierten pflanzlichen Sequenz nachzuweisen wurde ein in vitro Enzymassay mit zellfreiem Homo­ genat der Hefezellen durchgeführt. Die Hefezellen wurden auf folgendem Medium angezogen (72 h bei 29°C aerob geschüttelt):
6,7 g/l Difco Yeast Nitrogen Base without Amino Acids; 10 mg/l Tryptophan; 60 mg/l Leucin; 1% Galactose.

Die Zellen einer 30 ml Kultur werden sedimentiert und in 1 ml Lysis-Puffer aufgenommen:
50 mM Tris/HCl pH 7,5; 15% Glycerol; 0,1% Triton X100; 200 µM Pefabloc (Merck, Darmstadt); 1 mM DTT; 0,5 mg/ml Lyticase (Sigma, Deisenhofen). Nach einer Inkubation von 25 min bei 20°C wurden die Zellen durch Ultraschall­ stab-Behandlung (3 × 10 s) aufgebrochen.

Die Reaktionslösung des in vitro Enzymassays hatte ein Volumen von 150 µl und war wie folgt zusammengesetzt (10.3.1996):
100 mM Tris/HCl pH 8;0 (bei 30°C); 1 mM DTT; 0,2% Triton X100; 1 mM Cho­ lesterol, 20 µl Hefe-Homogenat, 350.000 dpm UDP-[U-¹⁴C]-Glucose (4,2 µM). Die Reaktion wurde nach 45 min (bei 30°C) durch Mischen mit 0,5 ml Wasser und 1,6 ml Ethylacetat gestoppt. Nach der Phasentrennung durch kurze Zentrifugation wurde die obere organische Phase entnommen und die darin enthaltene Radioaktivität mit einem Scintillationszähler bestimmt:

Hefehomogenat mit pGAL4: 0 dpm
Hefehomogenat mit pGALHAM1: 13000 dpm.

Von Parallelproben wurde die in der organischen Phase vorhandene Radio­ aktivität einer dünnschichtchromatographischen Analyse unterzogen:
Die organischen Phasen wurden auf Kieselgel 60 Platten (Merck, Darmstadt) aufgetragen, die mit dem Laufmittel Chloroform:Methanol 85 : 15 entwickelt wurden. Die Rf-Werte der radioaktiven, lipophilen Reaktionsprodukte wur­ den mit einem Berthold-TLC-Analyser bestimmt und mit authentischen Standards verglichen, die mit α-Naphthol-Schwefelsäure detektiert wurden. Es konnte jeweils nur ein Produkt nachgewiesen werden, das als Sterylglu­ cosid identifiziert wurde (siehe Fig. 8). Damit konnte nachgewiesen werden, daß die transformierten Hefe-Zellen ein Protein exprimieren, das Sterol- Glucosyltransferase-Aktivität zeigt. Kontroll-Zellen zeigen keine Sterol- Glucosyltransferase-Aktivität.

7. Funktionale Expression von genomischen DNA-Sequenzen aus Saccharomy­ ces cerevisiae in E.coli.

Die aus der von uns klonierten Hafersequenz abgeleitete Aminosäurese­ quenz zeigte auffällige Ähnlichkeiten mit der abgeleiteten Aminosäurese­ quenz eines genomischen DNA-Stück aus S. cerevisiae (siehe Fig. 9) Dabei handelt es sich um das Chromosom XII Cosmid 9470 (Genbank Nr. gb U17246). Die Ähnlichkeit bezog sich auf den 34-Bereich, des in reverser Richtung offenen Leserahmens von bp 32961-36557 (Gen L9470.23). Für dieses putative Gen war bislang keine Funktion bekannt.

Teile dieses offenen Leserahmens wurden von uns in E. coli funktional exprimiert:
Dazu wurde durch Schneiden mit den Enzymen NdeI und SpeI aus einer Cosmid 9470-DNA-Präparation ein 6359 bp großes Fragment isoliert (Cosmid bp 31384-37744). Diese Sequenz einhielt den gewünschten Leserahmen und konnte durch Klonierung in den Vektor pBluescript II KS (mit EcoRV ge­ schnitten) für weitere Subklonierungen genutzt werden. Dieses Plasmid wurde pBS-HSC genannt. Es wurden vier Subklonierungen durchgeführt, die zur Expression verschieden langer Teile des offenen Leserahmens führen sollten. Diese Klonierungen sind unten tabellarisch aufgeführt:

Alle diese Klonierungen führen zu Plasmiden, die für Fusionsproteine ko­ dieren, die im ersten Abschnitt aus dem lacZ Operon und Teilen der Poly­ linker der Vektoren abgeleitet sind und im zweiten Abschnitt aus Polypep­ tiden bestehen, die Teilen des Gens L9470.23 entsprechen. Abb. 9 zeigt die abgeleitete Proteinsequenz des offenen Leserahmens (Gen L9470.23). In dieser Abbildung sind die Aminosäuren markiert, mit denen der zweite Ab­ schnitt der Fusionsproteine der verschiedenen Klone beginnt.

Die Plasmide der Klonierungen 1-4 wurden zur Transformation von E. coli eingesetzt. Zu unserer Überraschung konnten wir zellfreien Homogenaten dieser Zellen mit einem in vitro Enzymassay Sterol-Glucosyltransferase- Aktivität nachweisen. Dazu wurden die Zellen von 15 ml Übernachtkultur (15 ml LB-Ampicillin, 37°C, 14 h) sedimentiert und in 1,5 ml Lysispuffer aufgenommen (50 mM Tris/HCl pH 8,0; 15% Glycerol; 5 mM DTT; 1 mg/ml Ly­ sozym (aus Hühnerei, Boehringer, Mannheim); 200 µM Pefabloc (Merck, Darm­ stadt). Nach 5minütiger Inkubation bei 20°C wurden die Suspension auf Eis gestellt und die Zellen durch 3 × 3 Sekunden Behandlung mit dem Ultra­ schallstab aufgebrochen.

Die Reaktionslösung des in vitro Enzymassays hatte ein Volumen von 100 µl und war wie folgt zusammengesetzt (22.5.1996):
50 mM Tris/HCl pH 8,0 (bei 30°C); 1 mM DTT; 1 mM MgCl₂; 10 µl 2 mM Ergo­ sterol in Ethanol; 45 µl E. coli-Homogenat; 150.000 dpm UDP-[U-¹⁴C]-Glucose (2,2 µM).

Die Reaktion wurde nach 45 min (bei 30°C) durch Mischen mit 0,5 ml Wasser und 1,6 ml Ethylacetat gestoppt. Nach der Phasentrennung durch kurze Zentrifugation wurde die obere organische Phase entnommen und die darin enthaltene Radioaktivität mit einem Scintillationszähler bestimmt:

E. coli Homogenat mit Klon1: 7500 dpm
E. coli Homogenat mit Klon2: 10700 dpm
E. coli Homogenat mit Klon3: 35000 dpm
E. coli Homogenat mit Klon4: 32700 dpm
E. coli Homogenat, untransformiert: 2000 dpm.

Von Parallelproben von Klon 2 und 4 wurde die in der organischen Phase vorhandene Radioaktivität einer dünnschichtchromatographischen Analyse unterzogen:
Die organischen Phasen wurden auf Kieselgel 60 Platten (Merck, Darmstadt) aufgetragen, die mit dem Laufmittel Chloroform:Methanol 85 : 15 entwickelt wurden. Die Rf-Werte der radioaktiven, lipophilen Reaktionsprodukte wur­ den mit einem Berthold-TLC-Analyser bestimmt und mit authentischen Standards verglichen, die mit α-Naphthol-Schwefelsäure detektiert wurden.

Es konnte jeweils nur ein Produkt nachgewiesen werden, das als Sterylglu­ cosid identifiziert wurde (siehe Fig. 10). Damit konnten wir zu unserer Überraschung nachweisen, daß die transformierten E. coli Zellen ein Prote­ in exprimieren, das Sterol-Glucosyltransferase-Aktivität zeigt. Die organi­ schen Phasen von Assay mit nichttransformierten Kontroll-Zellen enthalten zwar auch etwas Radioaktivität; dies ist jedoch kein markiertes Sterylglu­ cosid. Die von dem Gen 9470.23 abgeleitete Aminosäuresequenz wird im Fol­ genden ScSGTP genannt (siehe Fig. 9).

8. PCR-Versuche mit Arabidopsis, Candida und Kartoffel

Aus ähnlichen Aminosäuresequenzbereichen zwischen HaSGTP (siehe 4.) und ScSGTP (siehe 7.) konnten Oligonukleotidprimer abgleitet werden, die für PCR-Versuche eingesetzt wurden:

DW3 = GSIWCIVSIGGIGAYGTHYWICC
WA3 = GTIGTICCISHICCISCRTGRTG
WA6 = GTISKIGTCCAIGGCATIGTRAA

Abkürzungen siehe 4.

Die Polymerase-Chain-Reaction-Methode wurde wie folgt durchgeführt:
Reaktionsmix: 40 µl Aqua dest.; 5 µl Boehringer (Mannheim) 10× PCR-Puffer; je 1 µl 10 mM dATP, dGTP, dCTP, dTDP; je 1 µl 100 µM Oligonukleotidprimer, 0,25 µl Boehringer Taq-Polymerase; 0,5 µl Matrix-DNA.
Reaktionsbedingungen: 94°C, 3 min; 30x (94°C, 45 s; 53°C, 1 min; 72°C, 2 min); 72°, 10 min.

• a.) Primer DW3 und Wa6, als Matrix-DNA wurde cDNA verwendet, die aus Arabidopsis mRNA synthetisiert wurde.
• b.) Primer DW3 und Wa6, als Matrix-DNA wurde ein Phagengemisch einer Lamda-ZAP-cDNA-Bank (Stratagene, Heidelberg) von Kartoffel mit ca. 1010 Plaque-bildenden-Einheiten pro ml verwendet.
• c.) Primer DW3 und Wa3, als Matrix-DNA wurde genomische DNA aus Candida albicans (ca. 50 ng/µl) verwendet.

Ergebnis: Eine Agarosegelelektrophorese mit 15 µl der Reaktionsansätze ergab DNA-Banden von ca. 340 bp Länge (Arabidopsis, Kartoffel) und ca. 940 bp Länge (Candida albicans).

Diese DNA-Stücke wurden mit dem pGEM-T Vector System (Promega, Heidel­ berg) in einen Plasmidvektor kloniert und teilweise oder vollständig se­ quenziert. Diese Sequenzen werden in Fig. 11-13 gezeigt (Arabidopsis = Apcr; Kartoffel = Kpcr; Candida = Cpcr). Die aus diesen Sequenzen abgelei­ teten Aminosäuresequenzen (ApcrP, KpcrP und CpcrP) wurden mit den Ami­ nosäuresequenzen des Haferklons HaSGTP bzw. des Hefegens L9470.23 (Sc-SGTP) verglichen (siehe Fig. 14-16):
Zu unserer Überraschung ist

• - die Kartoffelsequenz KpcrP zu 86% identisch mit dem entsprechenden Teil der Hafersequenz HaSGTP,
• - die Arabidopsissequenz ApcrP zu 90% identisch mit dem entsprechenden Teil der Hafersequenz HaSGTP und
• - die Candidasequenz CpcrP zu 64% identisch mit dem entsprechenden Teil der S. cerevisiae-Sequenz ScSGTP.

9. Isolation vollständiger Klone aus Arabidopsis

Der Arabidopsis-PCR-Klon Apcr wurde mit einer Methode wie unter 4. be­ schrieben zur Isolation von vollständigen Klonen aus einer Arabidopsis- Lamda-Zap-cDNA-Bank (erhalten vom Stock Center des MPI für Züchtungs­ forschung, Köln) genutzt. Es konnte ein ca. 2300 bp langer Klon (im Folgen­ den AtSGT genannt) vollständig und doppelsträngig sequenziert werden (Fig. 17). Dieser Klon ist 2353 bp lang, und zeigt einen offenen Leserahmen von bp 1 bis bp 2023. Ein Startcodon (ATG) für die Translation beginnt am bp 113. Wird der offene Leserahmen in eine Aminosäuresequenz übersetzt (AtSGTP, Fig. 18), so zeigt die Aminosäuresequenz große Ähnlichkeiten mit der Hafersequenz HaSGTP (siehe Fig. 19).

10. Funktionale Expression des Klons AtSGT in E. coli.

Um zu beweisen, daß der Klon AtSGT für eine Sterol-Glucosyltransferase kodiert, wurde er in E. coli exprimiert. Die Klonierung erzeugte ein Plas­ mid (pBS-AtSGT), das für ein Fusionsprotein kodiert, dessen erste Amino­ säuren aus dem pBluescript lacZ-Operon und dem Polylinker stammen (nor­ mal gedruckt, siehe unten) und dessen folgende Aminosäuren denen des offenen Leserahmens des Klons AtSGT entsprechen (unterstrichen, siehe unten).

Der Anfang des Fusionsprotein sieht wie folgt aus:

MTMITPSSELTLTKGNKSWSSTAVAAALELVDPPGCRNSEFGTPLILSFTFWD . . .

Bei den mit dem Plasmid pBS-AtSGT transformierten E. coli-Zellen wurde überprüft, ob das entsprechende Fusionsprotein exprimiert wurde, indem ein in vitro Enzymassay zum Nachweis von Sterol-Glucosyltransferase-Akti­ vität mit Zellhomogenaten durchgeführt wurde.

Die Zellen von 1,5 ml Übernachtkultur (1,5 ml LB-Ampicillin, 37°C, 14 h) wurden sedimentiert und in 1 ml Lysispuffer aufgenommen (50 mM Tris/HCl pH 8,0; 15% Glycerol; 5 mM DTT; 1 mg/ml Lysozym (aus Hühnerei, Boehrin­ ger, Mannheim); 200 µM Pefabloc (Merck, Darmstadt); 0,1% Triton X100. Nach 5minütiger Inkubation bei 20°C wurden die Suspension auf Eis gestellt und die Zellen durch 3 × 3 Sekunden Behandlung mit dem Ultraschallstab aufge­ brochen.

Die Reaktionslösung des in vitro Enzymassays hatte ein Volumen von 50 µl und war wie folgt zusammengesetzt (11.3.1996):
100 mM Tris/HCl pH 8,0 (bei 30°C); 1 mM DTT; 0,2% Triton X100; 1 mM Cho­ lesterol; 7,5 µl E. coli-Homogenat, 100.000 dpm UDP-[U-¹⁴C]-Glucose (2,8 µM). Die Reaktion wurde nach 20 min (bei 30°C) durch Mischen mit 0,5 ml Wasser und 1,6 ml Ethylacetat gestoppt. Nach der Phasentrennung durch kurze Zentrifugation wurde die obere organische Phase entnommen und die darin enthaltene Radioaktivität mit einem Scintillationszähler bestimmt:

E. coli Homogenat mit pBS-AtSGT: 1300 dpm
E. coli Homogenat, untransformiert: 100 dpm (Blindwert).

Von länger inkubierten Parallelproben wurde die in der organischen Phase vorhandene Radioaktivität einer dünnschichtchromatographischen Analyse unterzogen:
Die organischen Phasen wurden auf Kieselgel 60 Platten (Merck, Darmstadt) aufgetragen, die mit dem Laufmittel Chloroform:Methanol 85 : 15 entwickelt wurden. Die Rf-Werte der radioaktiven, lipophilen Reaktionsprodukte wur­ den mit einem Berthold-TLC-Analyser bestimmt und mit authentischen Standards verglichen, die mit α-Naphthol-Schwefelsäure detektiert wurden. Es konnte jeweils nur ein Produkt nachgewiesen werden, das als Sterylglu­ cosid identifiziert wurde (siehe Fig. 20). Damit konnte nachgewiesen wer­ den, daß die transformierten E. coli Zellen ein Protein exprimieren, das Sterol-Glucosyltransferase-Aktivität zeigt. Nichttransformierte Kontroll- Zellen zeigen keine Sterol-Glucosyltransferase-Aktivität.

Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte, die in den Beispielen nicht im Detail beschrieben sind, wurden falls nicht anders angegeben nach Ar­ beitsvorschriften aus Sambroock, J.; Fritsch, E.F. und Maniatis, T. (1989): Molecular cloning. A Laboratory Manual. Zweite Ausgabe. Cold Spring Har­ bor Laboratory Press, Cold Spring Habor, durchgeführt.

Definitionen

• - Als STEROLE werden hier Substanzen bezeichnet, die über folgende Struk­ turmerkmale verfügen: Sie bestehen aus einem 5α-Cholestan-3-β-ol- oder 5α- Cholestan-3-α-ol-Grundgerüst. Dieses Grundgerüst kann an der Seitenkette und/oder durch verschiedene Doppelbindungen in den Ringsystemen modifi­ ziert sein.
• - STEROLE IM ENGEREN SINN sind Cholesterol, Ergosterol, β-Sitosterol, Stigmasterol.
• - STERYLGLYCOSIDE sind Sterole oder Sterole im engeren Sinn, die über das Sauerstoffatom am C3-Atom mit einem Zuckermolekül oder verknüpft sind. Diese Zucker können z. B. Glucose, Galactose, Mannose, Xylose, Arab­ inose, andere Zucker oder Zuckerderivate in furanosidischer oder pyrano­ sidischer Form und in α- oder β-Verknüpfung sein. Verbindungen, die Glu­ curonsäure enthalten, sind aus dieser Definition ausgeschlossen.
• - FOLGEPRODUKTE VON STERYLGLYCOSIDEN sind zum einen Sekundärproduk­ te, die in Organismen oder in in vitro-Systemen enzymatisch aus Sterylgly­ cosiden synthetisiert werden können (z. B. Steryldiglycoside, -triglyco­ side, -oligoglycoside oder acylierte Sterylglycoside). Zum anderen sind dies Sub­ stanzen, die mit Methoden der organischen Chemie aus Sterylglycosiden dargestellt werden können.
• - STEROL-GLYCOSYLTRANSFERASEN sind Enzyme, die ein Zuckermolekül, besonders aus aktivierten Zuckern oder aktivierten Zuckerderivaten, speziell aus Zuckernukleotiden oder Zuckerderivatnukleotiden auf die OH-Gruppe am C3-Atom von Sterolen oder Sterolen im eigenen Sinn übertragen. Die Übertragung von Glucuronsäure ist aus dieser Definition ausgeschlos­ sen.
• - STEROL-GLUCOSYLTRANSFERASEN sind Enzyme, die ein Glucosemolekül, besonders aus aktivierter Glucose, speziell aus Uridindiphosphat auf die OH-Gruppe am C3-Atom von Sterolen oder Sterolen im eigenen Sinn über­ tragen.
• - STEROL-GLYCOSYLTRANSFERASEN IM ENGEREN SINN sind Enzyme, die ein Zuckermolekül, besonders aus aktivierten Zuckern oder aktivierten Zuc­ kerderivaten, speziell aus Zuckernukleotiden oder Zuckerderivatnukleoti­ den auf die OH-Gruppe am C3-Atom von Sterolen im engeren Sinn übertra­ gen. Die Übertragung von Glucuronsäure ist aus dieser Definition ausge­ schlossen.
• - STEROL-GLUCOSYLTRANSFERASEN IM ENGEREN SINN sind Enzyme, die ein Glucosemolekül, besonders aus aktivierter Glucose, speziell aus Uridindi­ phosphat auf die OH-Gruppe am C3-Atom von Sterolen im engeren Sinn übertragen.
• - ZUCKER sind in diesem Sinn Hexosen oder Pentosen in furanosidischer oder pyranosidischer Form.
• - ZUCKERDERIVATE sind Zucker, die durch Oxidation oder Reduktion oder durch Zufügung oder Entfernung funktionaler Gruppen in ihrer Struktur modifiziert sind. Als Beispiel seien hier N-Acetylglucosamin und Desoxyri­ bose genannt.
• - ZUCKERNUKLEOTIDE in dem hier verwendeten Sinn, sind Substanzen, bei denen eine der organischen Basen Thymin, Adenin, Guanin, Uracil oder Cy­ tosin mit einer Ribose bzw. Desoxyribose verknüpft ist und dieser Zucker wiederum über zwei Phosphorsäurereste mit einem weiteren Zuckermolekül verknüpft ist.
• - PFLANZENTEILE sind Teile einer Pflanze wie z. B. Blätter, Wurzeln, Samen oder Früchte.
• - VEKTOREN sind Nukleinsäurefragmente, die unter bestimmten Bedingungen zur Vervielfältigung befähigt sind und für den Einbau von fremden Nu­ kleinsäurefragmenten zum Zweck der Vermehrung dieses Fragments oder der Expression dieses Fragments (beispielsweise zur Herstellung eines Pro­ teins) benutzt werden. Typische Beispiele sind Plasmide und Phagen.
• - CHIMÄRES GEN ist ein Nukleinsäurefragment, das aus verschiedenen Teilen zusammengesetzt ist und in dieser Form natürlicherweise nicht vorkommt. Es umfaßt eine für eine für ein Polypeptid kodierende Sequenz und geeig­ nete Steuersequenzen, die die Expression ermöglichen. Die kodierende Se­ quenz kann dabei hinsichtlich der Steuersequenzen in "sense"- oder "anti­ sense"-Orientierung vorliegen.
• - ISOLIEREN ist die Gewinnung bestimmter Dinge aus einem Gemisch ver­ schiedener Dinge. Die Dinge können dabei Substanzen (z. B. Proteine, Nu­ kleinsäurefragmente, mRNA, DNA, cDNA, cDNA-Klone, Gene), Zellteile (z. B. Membranen), Zellen (z. B. Bakterienzellen, Pflanzenzellen, Protoplasten), Zel­ linien oder Organismen und deren Nachkommen sein.

Literaturverzeichnis

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4. Normura, T.; Watanabe, M.; Inoue, K. und Ohata, K. (1978) Japan J. Phar­ macol. 28, Suppl. 110P
5. Okuyama, E. und Yamazaki, M. (1983) Yakugaku Zasshi 103: 43 ff.
6. Seki, J.; Okita, A.; Watanabe, M.; Nakagawa, T.; Honda, K.; Tatewaki, N. und Sugiyama, M. (1985) J. Pharm. Sci. 74: 1259-1264
7. Sikorski, R. S. und Hieter, P. (1989) Genetics 122: 19-27
8. Warnecke, D. C. und Heinz, E. (1994) Plant Physiol. 105: 1067-1073
9. Zaret, J. K. und Sherman, F. (1982) Cell 28: 563-573
10. Sambroock, J.; Fritsch, E.F. und Maniatis, T. (1989): Molecular cloning. A Laboratory Manual. Zweite Ausgabe. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor.

Claims (37)

1. Isoliertes DNA-Fragment oder rekombinantes DNA-Konstrukt, das mindestens einen Teil einer Sterol-Glycosyltransferase oder Sterol-Glyco­ syltransferase im engeren Sinn kodierenden Sequenz enthält.

2. Isoliertes DNA-Fragment oder rekombinantes DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 1, das mindestens einen Teil einer Sterol-Glucosyltransferase oder eine Sterol-Glucosyltransferase im engeren Sinn kodierenden Sequenz enthält.

3. Isoliertes DNA-Fragment oder rekombinantes DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 1 oder 2, das mindestens eine enzymatisch aktive Sterol-Glyco­ syltransferase oder Sterol-Glycosyltransferase im engeren Sinn, insbeson­ dere Sterol-Glucosyltransferase oder Sterol-Glucosyltransferase im engeren Sinn, kodiert, wobei das kodierte Protein nach Expression direkt oder nach Prozessierung oder Modifikation in vivo oder in vitro unter geeigne­ ten Bedingungen enzymatisch wirksam ist.

4. Isoliertes DNA-Fragment oder rekombinantes DNA-Konstrukt gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-3, wobei die Nukleinsäure aus

• a) Pflanzen oder
• b) Pflanzen, Pilzen und Bakterien oder
• c) Eukaryonten oder
• d) vielzelligen Eukaryonten oder
• e) Pilzen oder
• f) Bakterien

isolierbar ist.

5. Isoliertes DNA-Fragment oder rekombinantes DNA-Konstrukt gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-4, das die folgenden Eigenschaften aufweist:

• a) die abgeleitete Aminosäuresequenz umfaßt mindestens 14 aufein­ anderfolgende Aminosäuren, die mit den aus Fig. 4 oder 18 aufgeführten Sequenzen identisch sind, und
• b) die abgeleitete Aminosäuresequenz umfaßt die Aminosäurese­ quenz HHGG.

6. Isoliertes DNA-Fragment oder rekombinantes DNA-Konstrukt gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-4, das aus Pflanzen isolierbar ist und dessen abgeleitete Aminosäuresequenz die Aminosäuresequenz HHGGxxxxxxxxxxxxPxxxxxxxxxQ, wobei x beliebige Aminosäuren darstellt, umfaßt.

7. Isoliertes DNA-Fragment oder rekombinantes DNA-Konstrukt gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-4, das

• a) aus Pflanzen isolierbar ist,
• b) eine Länge von mindestens 400 bp aufweist, und
• c) dessen abgeleitete Aminosäuresequenz mindestens 8 aufeinander­ folgende Aminosäuren umfaßt, die mit den aus Fig. 4 oder 18 aufgeführten Sequenzen identisch sind.

8. Isoliertes DNA-Fragment oder rekombinantes DNA-Konstrukt gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-4, dessen abgeleitete Aminosäurese­ quenz

• a) über eine Länge von mindestens 350 Aminosäuren mindestens zu 75%, insbesondere zu 90%, speziell zu 100%, identisch zu den Sequenzen in Fig. 21 oder 22 ist,
• b) über eine Länge von mindestens 150 Aminosäuren mindestens zu 70% identisch mit der Sequenz in Fig. 16 ist, oder
• c) über eine Länge von 100 Aminosäuren mindestens zu 93% iden­ tisch mit der Sequenz in Fig. 15 ist.

9. Protein das aus einer der in Fig. 1-3 oder 11-22 gezeigten Nuklein­ säuresequenzen abgeleitetet ist.

10. Plasmide, Viren oder andere Vektoren, dadurch gekennzeichnet, daß sie Nukleinsäuren entsprechend einem oder mehreren der Ansprüche 1-8 enthalten.

11. Genomische Klone, dadurch gekennzeichnet, daß sie Gene oder Teile von Genen enthalten, die für eine Sequenz oder Teile davon entsprechend einem oder mehreren der Ansprüche 1-8 kodieren.

12. Chimäres Gen, das in der Lage ist, in einer transformierten Zelle den Gehalt an Sterol-Glycosyltransferase oder Sterol-Glycosyltransferase im engeren Sinn, insbesondere Sterol-Glucosyltransferase oder Sterol-Glu­ cosyltransferase im engeren Sinn, zu verändern.

13. Chimäres Gen gemäß Anspruch 12, das ein Nukleinsäurefragment umfaßt, dessen abgeleitete Aminosäuresequenz mindestens zu 60% der Se­ quenz in Fig. 23 oder Teilen davon entspricht und das in wirksamer Form mit geeigneten Steuersequenzen verknüpft ist.

14. Chimäres Gen gemäß Anspruch 12, das ein in einem oder mehreren der Ansprüche 1-8 definiertes DNA-Fragment umfaßt.

15. Chimäres Gen gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 12-14, da­ durch gekennzeichnet, daß es in der Lage ist in einer transformierten Zel­ le

• a) die Synthese von Sterylglycosiden oder biosynthetischen Folge­ produkten, wie acylierte Sterylglycoside oder Steryloligoglycoside, auszu­ lösen
• b) den Gehalt an Sterylglycosiden oder Folgeprodukten zu verän­ dern, oder
• c) neue Sterylglycoside oder Folgeprodukte hervorzubringen.

16. Chimäres Gen gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Lage ist in einer transformierten Zelle die Synthese von Sterylglycosi­ den auszulösen, den Gehalt an Sterylglycosiden zu verändern oder neue Sterylglycoside hervorzubringen.

17. Chimäres Gen gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 12-16, da­ durch gekennzeichnet, daß die Konstruktion in "sense" und/oder "antisen­ se"-Orientierung vorliegt.

18. Transformierte Zellen, transformierte Mikroorganismen, Pflanzen oder Pflanzenteile, die ein chimäres Gen gemäß einem oder mehreren der An­ sprüche 12-18 enthalten.

19. Transformierte Zellen, transformierte Mikroorganismen, Pflanzen oder Pflanzenteile gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie Sterol- Glycosyltransferasen oder Sterol-Glycosyltransferasen im engeren Sinn, insbesondere Sterol-Glucosyltransferasen oder Sterol-Glucosyltransferasen im engeren Sinn enthalten, die in diesen natürlicherweise nicht oder in anderer Form oder in anderer Konzentration vorkommen.

20. Transformierte Zellen, transformierte Mikroorganismen, Pflanzen oder Pflanzenteile gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie Sterol- Glycosyltransferase-Aktivitäten oder Sterol-Glycosyltransferase-Aktivitäten im engeren Sinn, insbesondere Sterol-Glucosyltransferase-Aktivitäten oder Sterol-Glucosyltransferase-Aktivitäten im engeren Sinn, zeigen, die in die­ sen natürlicherweise nicht oder in anderer Höhe oder in anderer Spezifität vorkommen.

21. Transformierte Zellen, transformierte Mikroorganismen, Pflanzen oder Pflanzenteile gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie Steryl- Glycoside oder Folgeprodukte enthalten, die in diesen natürlicherweise nicht oder in anderer Menge oder in anderer Form, insbesondere mit ande­ ren Sterol oder Zuckerkomponente oder anderer Verknüpfung, vorkommen.

22. Pflanzen oder Pflanzenteile gemäß einem oder mehreren der Ansprü­ che 18-21, dadurch gekennzeichnet, daß sie toleranter oder resistenter ge­ genüber einem oder mehreren der schädlichen Umwelteinflüsse

• - Trockenheit,
• - hohe Salzkonzentration im Substrat,
• - Kälte oder Frost,
• - Pilzbefall

sind als nichttransformierte Kontrollpflanzen.

23. Pflanzen oder Pflanzenteile gemäß Anspruch 22, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie toleranter oder resistenter gegenüber Kälte oder Frost sind als nichttransformierte Kontrollpflanzen.

24. Transformierte Mikroorganismen gemäß einem oder mehrerer der An­ sprüche 18-22, insbesondere Bakterien oder Hefen, dadurch gekennzeichnet, daß sie resistenter oder toleranter gegenüber einem oder mehreren der Umwelteinflüsse

• - hohe Salz- oder Ethanolkonzentration im Medium,
• - Kälte oder Frost,
• - hohe Temperaturen

sind als nichttransformierte Mikroorganismen.

25. Verfahren zum Herstellen von Sterylglycosiden oder Folgeprodukten umfassend das Kultivieren von transformierten Zellen, transformierte Mikro­ organismen, Pflanzen oder Pflanzenteilen gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 18-24.

26. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, da Homogeni­ sate oder Extrakte der transformierten Zellen, transformierten Mikroorga­ nismen, Pflanzen oder Pflanzenteile in vitro kultiviert werden.

27. Sterylglycoside oder Folgeprodukte erhältlich durch das Verfahren gemäß Anspruch 25 oder 26.

28. DNA-Fragment, erhältlich nach einem der folgenden Vorfahren oder Teilen davon:

• a) Verwenden von einer der in Fig. 1-3 oder 11-13 oder 17 gezeig­ ten Nukleinsäuresequenzen als Hybridisierungsprobe;
• b) Verwenden der in Fig. 4, 5, 14-16, 18, 19, 21 oder 22 gezeigten Aminosäuresequenzen zur Synthese von Peptiden oder Proteinen, die zur Gewinnung von Antiseren dienen; oder
• c) i) Vergleichen der in Fig. 1-3, 11-13 oder 17 gezeigten Nukleotid­ sequenzen oder der daraus abgeleiteten, in Fig. 4, 5, 14-16, 18, 19, 21 oder 22 gezeigten Aminosäuresequenzen untereinander oder mit bereits bekann­ ten Nukleotidsequenzen oder daraus abgeleiteten Aminosäuresequenzen,
• ii) Ableiten und Synthetisieren von geeigneten spezifischen Oligo­ nukleotiden aus ähnlichen Bereichen dieser Sequenzen, und
• iii) Benutzen dieser Oligonukleotide, um mit Hilfe eines sequenzab­ hängigen Protokolls, insbesondere der PCR-Methode, Nukleinsäuren herzu­ stellen, die für Sterol-Glycosyltransferasen oder Sterol-Glycosyltransfera­ sen im engeren Sinn, insbesondere Sterol-Glucosyltransferasen oder Sterol- Glucosyltransferasen im engeren Sinn oder Teilen davon kodieren.

29. Chimäres Gen, das ein DNA-Fragment gemäß Anspruch 28 enthält und das in der Lage ist, in einer transformierten Zelle den Gehalt an Sterol- Glycosyltransferase oder Sterol-Glycosyltransferase im engeren Sinn, ins­ besondere Sterol-Glucosyltransferase oder Sterol-Glucosyltransferase im engeren Sinn, zu verändern.

30. Transformierte Zellen, die ein chimäres Gen gemäß Anspruch 29 ent­ halten.

31. Transformierte Zellen gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß sie Sterol-Glycosyltransferasen oder Sterol-Glycosyltransferasen im engeren Sinn, insbesondere Sterol-Glucosyltransferasen oder Sterol-Gluco­ syltransferasen im engeren Sinn, enthalten, die in diesen natürlicherweise nicht oder in anderer Form oder in anderer Konzentration vorkommen.

32. Organismen, insbesondere Mikroorganismen wie Bakterien und Hefen, deren Gen oder Gene, die für Sterol-Glycosyltransferasen oder Sterol-Gly­ cosyltransferasen im engeren Sinn, insbesondere Sterol- Glucosyltransferasen oder Sterol-Glucosyltransferasen im engeren Sinn, kodieren, durch Transformation mit geeigneten chimären Genen deletiert oder unterbrochen sind.

33. Organismen gemäß Anspruch 32, die eine Veränderung des Gehalts an Sterylglycosiden und/oder Folgeprodukten aufweisen.

34. Organismen gemäß Anspruch 32 oder 33, wobei das chimäre Gen ein DNA-Fragment gemäß einem oder mehreren der Ansprüchen 1-9 oder 28 um­ faßt.

35. Sterol-Glycosyltransferasen oder Sterol-Glycosyltransferasen im engeren Sinn, insbesondere Sterol-Glucosyltransferasen oder Sterol-Gluco­ syltransferasen im engeren Sinn, oder Teile davon oder Fusionsproteine mit den genannten Transferasen, die aus Organismen gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 18-25 oder 30-32 erhältlich sind.

36. Antiseren oder Produkte aus Antiseren, die gegen ein Protein gemäß Anspruch 35 oder Teilen davon gerichtet und durch Immunisierung von Tieren erhältlich sind.

37. Antikörper oder Teile davon, die gegen ein Protein gemäß Anspruch 35 oder Teilen davon gerichtet sind und nicht durch klassische Immunisie­ rung von Tieren erhältlich sind.