DE69333112T2

DE69333112T2 - Modifizierte pilzzellen und methode zur herstelllung rekombinanter produkte

Info

Publication number: DE69333112T2
Application number: DE69333112T
Authority: DE
Inventors: Widmar Tanner; Sabine C/O Philipp Strahl Strahl-Bolsinger; Reinhard Fleer; Alain Fournier
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Priority date: 1992-08-14
Filing date: 1993-08-16
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2013-08-17
Also published as: US5714377A; DE4226971C2; EP0658203A1; FI121075B; JP3630424B2; NO950534D0; EP0658203B1; DE4226971A1; FI950628A; NO320349B1; AU679935B2; CA2140894A1; ZA935915B; DE69333112D1; AU4948293A; NO950534L; ATE245701T1; DE4244915C2; CA2140894C; JPH08500975A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf verbesserte Pilzzellen und auf Verfahren zur Herstellung rekombinanter Produkte mit verbesserter Qualität und in hohen Ausbeuten. Spezieller bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Pilzzellen, die innerhalb ihrer DNA-Sequenzen spezifische Modifikationen tragen, welche dafür verantwortlich sind, daß diese zumindest eine verringerte Fähigkeit zur O-Glycosylierung von homologen und/oder heterologen Proteinen zeigen, und auf die Verwendung dieser Zellen als Wirtszellen, um rekombinante Produkte in hoher Ausbeute herzustellen.
Die Entwicklung der rekombinanten DNA-Technologie hat die Herstellung von fremden Produkten in Wirtszellen möglich gemacht, in welche für diese Produkte codierende exogene DNA-Sequenzen eingebracht wurden. Der Vorteil dieser Technologie besteht darin, daß Produkte in hohen Ausbeuten, in hochreiner Form ohne Risiko einer Kontaminierung wie einer viralen Kontaminierung (AIDS, Hepatitis B, etc.) hergestellt werden können. Diese rekombinanten Techniken werden zur Herstellung von rekombinanten Proteinen in prokaryotischen sowie in eurokaryotischen Wirtszellen breit verwendet. Prokaryotische Wirtszellen umfassen E. coli [Nagata et al., Nature 284 (1980), 316; EP 001 929 ], Bacillus subtilis [Saunders et al., J. Bacteriol. 169 (1987), 2917] , Streptomyces, und Corynebacterium ( EP 433 117 ). Eukaryotische Wirtszellen umfassen Pflanzenzellen, Tierzellen und Pilzzellen.
Die Produktion rekombinanter Produkte im großen Maßstab durch diese Verfahren ist jedoch aufgrund der Probleme in der Expressionseffizienz dieser exogenen DNA-Sequenzen, auch aufgrund der Vektorinstabilität und des intrazellulären Abbaus der rekombinanten Produkte durch die Wirtszelle, in welcher dieser hergestellt werden, weiterhin eingeschränkt. Hinsicht- lich der Expressionseffizienz wurden Anstrengungen unternommen, um starke Promotoren zu isolieren, welche zu erhöhten Expressionsniveaus von exogenen DNA-Sequenzen, und somit zu erhöhten Produktionsmengen an rekombinanten Produkten führen. Verschiedene Systeme sind auch entwickelt worden, um die Stabilität der Vektoren innerhalb der Wirtszellen zu erhöhen, das davon am häufigsten verwendete System besteht in der Insertion eines Antibiotikaresistenzgens in den Vektor, welches Gen den rekombinanten Wirtszellen das Überleben und das Wachstum in einem selektiven Medium ermöglicht. Im Hinblick auf den intrazellulären Abbau sind verschiedene mutante Zellen beschrieben worden, welchen eine Proteaseaktivität fehlt oder die eine reduzierte Proteaseaktivität besitzen, wodurch die Kapazität dieser Zellen zum Abbau rekombinanter Produkte eingeschränkt wird.
Zusätzliche Probleme schränken jedoch weiterhin die Herstellung im großen Maßstab und die pharmazeutische Verwendung von rekombinanten Produkten ein. Eines davon beruht auf der Tatsache, daß rekombinant hergestellte Produkte von ihren natürlichen Gegenstücken oft verschieden sind. Beispielsweise besitzen bakterielle Wirtszellen nicht alle Post-Translationsmechanismen, welche zur Reifung von Säugetierpolypeptiden erforderlich sind. Die in Bakterien hergestellten Säugetierpolypeptide sind daher oft unreif oder nicht korrekt rückgefaltet. Darüber hinaus wird durch bakterielle Wirtszellen im allgemeinen ein zusätzliches N-terminales Methionin in die Produkte eingeführt.
Rekombinante Produkte, welche in heterologen eukaryotischen Wirten hergestellt werden, unterscheiden sich üblicherweise von ihren natürlich auftretenden Gegenstücken auch hinsichtlich ihres Glycosylierungsgehaltes. Dies kann das Vorhandensein gegen das Fehlen jeder beliebigen Kohlenhydratstruktur betreffen, die Lokalisierung der genannten Kohlenhydratstruk tur am Produkt sowie die Natur des Kohlenhydrats. Spezieller wurde gezeigt, daß aus Hefen stammende rekombinante Produkte im Vergleich zu ihrem natürlichen Gegenstück oft zusätzliche unnatürliche O-Glycane tragen. Beispielsweise wurde gezeigt, daß, obwohl der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor I (IGF-I) aus Humanserum nicht glycosyliert ist, seine rekombinante Form, die in S. cerevisiae produziert wird, O-glycosyliert ist und spezieller O-mannosyliert ist. [Hard et al., FEBS Letters 248 (1989) , 111] . Auf die gleiche Weise wurde gezeigt, daß humaner aus Blättchen erhaltener Wachstumsfaktor (PDGF) und humaner GM-CSF unnatürliche O-Mannosylstrukturen zeigen, wenn sie in S. cerevisiae hergestellt werden [Biomedic. Environ. Mass Spectrometry 19 (1990), 665; BIO/TECHNOLOGY 5 (1987), 831]. Diese abnormale O-Glycosylierung ist das Ergebnis von wichtigen Unterschieden zwischen den Glycosylierungsmechanismen von Säugetierzellen (Humanzellen) und jenen anderer eukaryotischer Zellen, wie Hefen. In dieser Hinsicht wurde beobachtet, daß die O-Glycosylierung in Pilzzellen (einschließlich Hefen und Fadenpilzen) in einer ähnlichen und unüblichen Weise erfolgt, welche bislang bei keinem anderen Organismus beobachtet wurde.
Das Auftreten dieser unerwünschten O-Glycosylierung bei aus Pilzen erhaltenen rekombinanten Produkten stellt einen wichtigen Nachteil für diese Technologie zur Herstellung von Pharmazeutika dar.
Der erste Grund besteht darin, daß Pilz-spezifische Glycane neue immunologische Determinanten auf einem Protein einführen können und daß ein Glycoprotein mit derartigen unnatürlichen Kohlenhydraten daher bei der Verabreichung an Menschen antigen sein kann. In dieser Hinsicht ist es beispielsweise bekannt, daß die meisten Menschen Antikörper besitzen, welche gegen N-gebundene Hefe-Mannan-Ketten gerichtet sind [Feizi und Childs, Biochem. J. 245 (1987), 1].
Ein weiterer Grund besteht darin, daß Proteine ohne geeignete Kohlenhydratstrukturen auch veränderte pharmakokinetische Eigenschaften besitzen können. Es wurde gezeigt, daß Kohlenhydratstrukturen von Glycoproteinen an der Festlegung ihrer in vivo Beseitigungsgeschwindigkeit teilnehmen, welche wesentlich zur Bestimmung der Effizienz eines Pharmazeutikums ist. Spezieller wurde ein Mannoserezeptor auf der Oberfläche von Lebe- rendothelzellen und residenten Makrophagen identifiziert, welcher offensichtlich ein Mittel zur Eliminierung von Glycoproteinen darstellt, welche Mannose-artige Oligosaccharide zeigen [Stahl, Cell. Mol. Biol. 2 (1990), 317]. Das Vorhandensein von unnatürlichen zusätzlichen Mannosestrukturen auf einem Protein kann daher seine Beseitigungsgeschwindigkeit beeinflussen und somit seine Plasmahalbwertszeit verringern.
Noch ein weiterer Grund besteht darin, daß, wie auch gezeigt wurde, die biologische Aktivität eines Glycoproteins, mit seinem Kohlenhydratgehalt, der Stellung und der Natur variiert. Beispielsweise wurde gezeigt, daß die Glycosylierung die biologischen Eigenschaften von rekombinantem humanem EPO [Takeuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 7819] und rekombinantem humanem tPA [Parekh et al., Biochemistry 28 (1989), 7644] beeinträchtigt.
Aus den vorstehend erwähnten Gründen ist es klar, daß die unnatürliche O-Glycosylierung von aus Pilzen erhaltenen rekombinanten Produkten deren immunologische, biologische und pharmakokinetische Eigenschaften deutlich beeinträchtigen kann, und daher deren Entwicklung für die humane therapeutische Anwendung verhindern kann.
Die vorliegende Erfindung löst das Problem der abnormalen O-Glycosylierung, auf welche vorstehend Bezug genommen wird, durch Bereitstellen modifizierter Pilzzellen, die eine genetische Modifikation (genetische Modifikationen) in ihren DNA- Sequenzen tragen, welche verursacht (verursachen), daß diese zumindest ein vermindertes Vermögen zur O-Glycosylierung von nativen oder fremden Proteinen besitzen.
Die Anmelderin hat festgestellt, daß es möglich ist, genetisch modifizierte Pilzzellen mit einem verminderten Vermögen zur O-Glycosylierung zu erhalten, welche weiterhin lebensfähig sind und gute Wachstumseigenschaften unter industriellen Fermentationsbedingungen zeigen. In unerwarteter Weise hat die Anmelderin auch gezeigt, daß die genannten genetischen Modifikationen die Stabilität dieser Pilzzellen, wenn sie mit exogener DNA transformiert werden, nicht beeinträchtigt. Die modifizierten Pilzzellen der vorliegenden Erfindung können vorteilhafterweise als Wirtszellen für die Herstellung von rekombinanten Produkten hoher Qualität verwendet werden, welche einer verringerten oder keinen Gehalt an unerwünschten O-Glycanen besitzen.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist eine Pilzzelle, welche eine genetische Modifikation (genetische Modifikationen) trägt, die in der codierenden Region oder in Regionen lokalisiert ist (sind), welche für die Expression und/oder die transkriptionale Regulierung des Gens verantwortlich oder darin involviert sind, welches Gen für ein Protein mit einer Dol-P-Man:Protein (Ser/Thr)-Mannosyl-Transferase (PMT1)-Aktivität codiert, welches von der Gruppe bestehend aus

(a) DNA-Molekülen, umfassend die in 4A dargestellte Nukleotidsequenz oder Fragmente hiervon;
(b) DNA-Molekülen, welche für ein Protein mit der in 4B dargestellten Aminosäuresequenz oder für Fragmente hiervon codieren; oder
(c) DNA-Molekülen, umfassend die in 7 dargestellte Sequenz des 126 bp Fragments des PMT1-Gens von Kluyveromyces lactis oder Fragmente hiervon; ausgewählt ist, welche verursacht (verursachen), daß die Zelle mindestens ein vermindertes O-Glycosylierungsvermögen aufweist, im Vergleich zu einer Pilzzelle, welche das entsprechende nicht-modifizierte DNA-Molekül, wie es in (a) bis (c) definiert ist, trägt.

Weitere Ziele der vorliegenden Erfindung sind ein DNA-Molekül, umfassend ein Gen, welches für die Dol-P-Man: Protein (Ser/Thr)-Mannosyl-Transferase einer Saccharomyces-Spezies codiert, welches Gen die in 4A angegebene Sequenz besitzt;
ein DNA-Molekül, umfassend ein Gen, welches für die Dol-P-Man:Protein (Ser/Thr)-Mannosyl-Transferase einer Kluyveromyces-Spezies codiert, welches Gen die Sequenz des 126 bp Fragments des PMT1-Gens von Kluyveromyces lactis, die in 7 angegeben ist, enthält; und
ein DNA-Molekül, umfassend ein Gen, welches für die Dol-P-Man:Protein (Ser/Thr)-Mannosyl-Transferase codiert,

(a) welches mit der DNA-Sequenz, wie sie vorstehend erwähnt ist, hybridisiert; und/oder
(b) Fragmente oder Derivate der DNA-Sequenz, wie sie vorstehend erwähnt ist, darstellt.

Die Pilzzelle der vorliegenden Erfindung kann unter Fadenpilzen und Hefen ausgewählt werden, wobei Kluyveromyces und Saccharomyces die bevorzugten Hefegattungen sind. Beispielhafte Stämme von Kluyveromyces, welche bevorzugte Ausführungsformen dieser Erfindung darstellen, umfassen K. lactis, K. fragilis, K. waltii, K. drosophilarum und dergleichen. Der bevorzugte Stamm von Saccharomyces ist S. cerevisiae.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet genetische Modifikation vorzugsweise jede beliebige Suppression, Substitution, Deletion oder Addition von einer oder mehreren Basen oder von einem Fragment der Pilzzellen-DNA-Sequenzen. Derartige genetische Modifikationen können in vitro (direkt auf isolierter DNA) oder in situ beispielsweise durch Genmanipulationsverfahren oder durch Aussetzen der Pilzzellen unter mutagene Mittel erhalten werden. Mutagene Mittel umfassen beispielsweise physikalische Mittel wie Energiestrahlen (Röntgenstrahlen, Gammastrahlen, W, etc.) oder chemische Mittel, welche zur Reaktion mit verschiedenen funktionellen Gruppen der DNA fähig sind, wie Alkylierungsmittel (EMS, NQO, etc.), Bisalkylierungsmittel, einschaltende Mittel, etc. Genetische Modifikation können auch durch ein genetisches Aufbrechen, beispielsweise nach dem Verfahren erhalten werden, welches von Rothstein et al. [Meth. Enzymol. 194 (1991), 281–301) beschrieben ist.
Nach diesen Verfahren wird ein Teil des Gens oder das gesamte Gen mittels homologer Rekombination durch eine in vitro modifizierte Version ersetzt.
Genetische Modifikation können auch durch jede beliebige Mutationsinsertion auf DNA-Sequenzen, wie Transposone, Phagen, etc. erhalten werden.
Zusätzlich ist bekannt, daß bestimmte Modifikationen, wie Punktmodifikationen, durch Zellmechanismen umgekehrt oder verstärkt werden können. Derartige Modifikationen können nicht die nützlichsten Formen von modifizierten Pilzzellen dieser Erfindung liefern, da ihre phenotypischen Eigenschaften nicht sehr stabil sein können. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung modifizierter Pilzzellen bereit, durch welches die Modifikationen (und dadurch die phenotypischen Eigenschaften) während der Segregation stabil und/oder nicht zurückkehrend und/oder non-leaky sind. Derartige modifizierte Pilzzellen sind als Wirte für die Produktion von rekombinanten Produkten besonders vorteilhaft.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist daher eine Pilzzelle, welche eine genetische Modifikation (genetische Modifikationen) trägt, die während der Segregation stabil und/oder nicht-zurückkehrend und/oder non-leaky ist (sind). Diese Modifikationen werden im allgemeinen durch Deletion (Deletionen) oder durch Spaltung (Spaltungen) erhalten.
Das verminderte Vermögen der erfindungsgemäßen Pilzzellen zur O-Glycosylierung von Proteinen kann daher von der Ausbildung von inaktiven Enzymen infolge der Struktur- und/oder Konformationsänderungen, von der Ausbildung von Enzymen mit veränderten biologischen Eigenschaften, von der fehlenden Ausbildung der genannten Enzyme oder von der Ausbildung der genannten Enzyme in geringen Mengen resultieren.
Der O-Glycosylierungpfad der Pilzzellen umfaßt die Bindung eines ersten Mannosylrestes an die Hydroxylgruppe von Seryl- und/oder Threonylaminosäuren von Proteinen oder Peptiden und anschließend die Verlängerung zu O-gebundenen Di- und Oligosacchariden durch darauffolgende Addition von Mannosylresten. Der erste Mannosylrest wird aus Dolicholmonophosphatmannose (Dol-P-Man) auf das Protein im endoplasmatischen Reticulum übertragen und die zusätzlichen Mannosylreste werden aus GPD-Man im Golgi transferiert. Im Gegensatz dazu folgen höhere eukaryotische (Nicht-Pilz-)Zellen bei der O-Glycosylierung einem unterschiedlichen Mechanismus, in welchem der Anfangsschritt in der kovalenten Bindung von N-Acetyl-galactosamin an Seryl- oder Threonylaminosäuren ist, es ist kein Lipid-gekuppelter Oligosaccharid-Donor in dieser ersten Reaktion involviert, der Anfangsschritt erfolgt im Golgi, die Strukturen der Kohlenhydrate sind verschieden, etc.
In der vorliegenden Erfindung tragen die modifizierten Pilzzellen eine genetische Modifikation (genetische Modifikationen) in einem Gen, dessen Expressionsprodukt in die Bindung eines Mannosylrestes an die Hydroxylgruppe von Seryl- oder Threonylaminosäuren involviert ist.
Spezieller tragen die modifizierten Pilzzellen eine genetische Modifikation (genetische Modifikationen) in einem Gen, dessen Expressionsprodukt im Transfer eines Mannosylrestes vom Dol-P-ManPrecursor zur Hydroxylgruppe von Seryl- oder Threonylaminosäuren involviert ist. Dadurch ist dieses Gen das Gen, welches für die Dol-P-Man:Protein (Ser/Thr)-Mannosyl-Transferase [DPM2 – auch als PMT1 bezeichnet] codiert, dessen Sequenz in 4A gezeigt ist oder welches für ein Protein codiert, wie es in 4B dargestellt ist, oder dessen Sequenz in 7 dargestellt ist, oder von Fragmenten hiervon.
Zusätzlich zu der Modifikation (den Modifikationen) im Gen, welches in der Bindung von Mannosylresten an die Hydroxylgruppe von Seryl- oder Threonylaminosäuren, wie vorstehend erwähnt, involviert ist, können die Pilzzellen der Erfindung auch eine Modifikation (Modifikationen) in den Genen tragen, welche in die darauffolgenden Additionen von Mannosylresten involviert sind, die zu Di- oder Oligosacchariden führen, oder in die Synthese des Mannosylreste-Donors (Dol-P-Man).
Spezifische Beispiele derartige Pilzzellen sind in den Beispielen beschrieben.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in einer Pilzzelle, wie sie vorstehend beschrieben ist, in welche eine exogene DNA-Sequenz eingebracht wurde.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt der Ausdruck exogene DNA-Sequenz jede beliebige DNA-Sequenz, die ein oder mehrere Gene umfaßt, welche für ein zu exprimierendes und/oder ein in die Zelle auszuscheidendes gewünschtes Protein codiert. Eine derartige DNA-Sequenz kann eine komplementäre DNA-Sequenz (cDNA), eine künstliche DNA-Sequenz, eine genomische DNA-Sequenz, eine Hybrid-DNA-Sequenz oder eine synthetische oder semisynthetische DNA-Sequenz sein, die in einer Expressionskassette enthalten ist, welche die Synthese der genannten Proteine in den Pilzzellen ermöglicht. Die Expressionskassette umfaßt vorzugsweise eine Transkriptions- und Translationsstartregion, welche an das 5'-Ende der Sequenz gebunden ist, die für das gewünschte Protein (die gewünschten Proteine) codiert, um so die Transkription und Translation der genannten Sequenz zu steuern und wahlweise zu regulieren. Die Auswahl dieser Regionen kann aufgrund der verwendeten Pilzzellen variieren. Im allgemeinen werden diese Sequenzen aus Promotoren und/oder Terminatoren ausgewählt, die von Pilzzellgenen abgeleitet sind, und, wenn eine Expression in Hefewirten gewünscht ist, aus Hefegenen. Von speziellem Interesse sind bestimmte Promotor- und/oder Terminatorregionen, welche aus glycolytischen Genen von Pilzzellen abgeleitet sind, wie, für Hefen, die Gene, welche für Phosphoglycerate-Kinase (PGK), Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GDP), Enolasen (ENO) oder Alkoholdehydrogenase (ADH) codieren, und für Fadenpilze, die Gene, welche für Triosephosphatisomerase (tpi) codieren. Die Promotor- und/oder Terminatorregionen können auch aus anderen stark exprimierenden Genen abgeleitet sein, wie, für Hefen, dem Lactase-Gen (LAC4), dem Säurephosphatase-Gen (PHO5), dem Alkoholoxidase-Gen (AOX) oder dem Methanoloxidase-Gen (MOX), und für Fadenpilze, dem Cellobiohydrolase-Gen (CBHI), dem Alkoholdehydrogenase-Gen (alcA, alcC), dem Glycoamylase-Gen (GAM) oder dem Acetamidase-Gen (amds), und dergleichen. Diese Transkriptions- und Translationsstarterregionen können weiter modifiziert sein, z.B. durch in-vitro-Mutagenese, durch Einbringen zusätzlicher Steuerungselemente oder synthetischer Sequenzen, oder durch Deletionen. Beispielsweise können die Transkription regulierende Elemente wie die sogenannten UAS, welche aus einem anderen Promotor stammen, verwendet werden, um Hybridpromotoren herzustellen, welche es ermöglichen, daß die Wach stumsphase der Pilzzellkultur von der Phase der Expression der für das gewünschte Protein (für die gewünschten Proteine) codierenden Sequenz (codierenden Sequenzen) getrennt ist. Eine Transkriptions- und Translationsterminationsregion, welche in der beabsichtigten Pilzzelle funktional ist, kann auch am 3'-Ende der codierenden Sequenz angeordnet sein. Zusätzlich kann am N-Terminus der Proteinsequenz ein Signalpeptid (Prä-Sequenz) eingebracht werden, um so das naszente Protein zum Ausscheidungspfad der verwendeten Pilzzelle zu steuern. Diese Prä-Sequenz kann der natürlichen Prä-Sequenz des Proteins entsprechen, wenn dieses Protein natürlich ausgeschieden wird, oder sie kann jeden beliebigen anderen Ursprungs sein, z.B. aus einem anderen Gen erhalten worden sein, oder sogar künstlich sein.
Vorzugsweise ist die exogene DNA-Sequenz Teil eines Vektors, welcher sich entweder autonom in der verwendeten Pilzzelle replizieren kann oder sich in deren eigene DNA-Sequenzen (das Chromosom) integriert. Sich autonom replizierende Vektoren können sich autonom replizierende Sequenzen enthalten, welche aus der chromosomalen DNA der Pilzzelle (ARS) abgeleitet sind oder aus natürlich auftretenden Pilzzellplasmiden wie pGKl-1 [de Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (1982), 737], pKD1 ( EP 241 435 ), 2 μm Plasmid (Broach, Cell 28 (1982), 203–204) und dergleichen. Sich integrierende Vektoren enthalten üblicherweise Sequenzen, die homolog zu Regionen des Pilzzellchromosoms sind, welche, nachdem sie in die genannte Zelle eingebracht wurden, die Integration durch in vivo-Rekombination ermöglichen. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung entsprechen die genannten homologen Sequenzen der Region des in der Pilzzelle zu modifizierenden Chromosoms, was einen einstufigen Modifikations-Intergrations-Mechanismus ermöglicht. Die Integration kann auch durch nicht-homologe Rekombination erfolgen.
Die exogene DNA-Sequenz kann in die Pilzzelle durch jedes beliebige technikbekannte Verfahren eingebracht werden und beispielsweise durch rekombinante DNA-Techniken, genetisches Kreuzen, Protoplastfusionen etc.. Was die rekombinanten DNA-Techniken betrifft, kann die Transformation, Elektroporation oder jedes beliebige andere in der Literatur beschriebene Verfahren verwendet werden. Spezieller kann, wenn die Wirtszelle eine Hefezelle ist, die Transformation gemäß den Verfahren von Ito et al. [J. Bacteriol. 153 (1983), 163], Durrens et al. [Curr. Genet. 18 (1990), 7] oder entsprechend dem in EP 361 991 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Die Elektroporation kann nach Karube et al. [FEBS Letters 82 (1985), 90] durchgeführt werden.
Die Pilzzellen der vorliegenden Erfindung können in vorteilhafter Weise als Wirtszellen für die Herstellung von rekombinanten Produkten wie heterologen Proteinen vom pharmazeutischen und/oder Agro-Nahrungsmittelinteresse verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Pilzzellen sind besonders vorteilhaft, da sie die Herstellung und/oder Sekretion von hochqualitativen Produkten ermöglichen, und da ihre genetischen Modifikationen die mitotische oder genetische Stabilität der genannten Expressionsvektoren der Produkte nicht beeinträchtigen. Die erfindungsgemäßen Zellen sind spezieller für die Herstellung von Proteinen geeignet, welche für therapeutische Anwendungen beim Menschen vorgesehen und für eine O-Glycosylierung durch die Wirtszelle anfällig sind.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung liegt daher in einem Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Produkten, wodurch eine Pilzzelle, wie sie vorstehend definiert ist, unter Bedingungen kultiviert wird, unter welchen die exogene DNA-Sequenz exprimiert und das Produkt gewonnen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das genannte Produkt in das Kulturmedium ausgeschieden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das genannte Produkt für eine O-Glycosylierung durch die Wirtszelle anfällig.
Die folgenden Proteine werden als Beispiele von heterologen Proteinen zitiert, welche mit den erfindungsgemäßen Pilzzellen hergestellt werden können: Enzyme (wie Superoxid-Dismutase, Katalase, Amylasen, Lipasen, Amidasen, Chymosin, etc., oder jedes beliebige Fragment oder Derivat hiervon), Blutderivate (wie Humanserum-Albumin, Alpha- oder Betaglobin, Faktor VIII, Faktor IX, van Willebrand-Faktor, Fibronectin, Alpha-1-Antitrypsin, etc., oder jedes beliebige Fragment oder Derivat hiervon), Insulin und dessen Varianten, Lymphokine [wie Interleukine, Interferone, Kolonie-stimulierende Faktoren (G-CSF, GM-CSF, M-CSF...), TNF, TRF, etc., oder jedes beliebige Fragment oder Derivat hiervon], Wachstumsfaktoren (wie Wachstumshormon, Erythropoietin, FGF, EGF, PDGF, TGF, etc., oder jedes beliebige Fragment oder Derivat hiervon), Apolipoproteine, antigene Polypeptide zur Herstellung von Vaccinen (Hepatitis, Cytomegalovirus, Eppstein-Barr, Herpes, etc.) oder jedes beliebige Fusionspolypeptid wie Fusionen, welche einen aktiven Rest umfassen, der an einen stabilisierenden Rest gebunden ist.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in einem DNA-Fragment, welches für ein Enzym codiert, das in die Bindung von Mannosylresten an die Hydroxylgruppe von Seryl- oder Threonylaminosäuren von Proteinen involviert ist. Die Anmelderin hat erstmalig DNA-Fragmente bereitgestellt, welche für derartige Enzyme codieren. Spezieller umfaßt das genannte DNA-Fragment das Dol-P-Man:Protein (Ser/Thr)-Mannosyl-Transferase-Gen, dessen Sequenz in 4A dargestellt ist, welches für ein Protein, wie es in 4B dargestellt ist, codiert, oder dessen Sequenz in 7 angeführt ist, oder Fragmente hiervon.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet homologes Gen jedes beliebige weitere Gen einer jeden beliebigen Pilzzelle, welches für ein Enzym mit der erforderlichen Aktivität codiert. Die genannten anderen Gene können beispielsweise durch Komplementieren einer mutanten Pilzzelle, welcher die genannte Aktivität fehlt, mit DNA, die aus einer Pilzzelle hergestellt wurde, die zur genannten Aktivität fähig ist, der Selektion der Transformanten mit der gewonnenen Aktivität und Isolieren ihrer insertierten DNA-Sequenz erhalten werden. Diese weiteren Gene können auch aus DNA-Banken durch Hybridisieren mit einer Sonde (Sonden) (einschließlich PCR-Primern) isoliert werden, welche die gesamte oder Teile der Sequenz, die in 4 dargestellt ist, umfassen. In dieser Hinsicht ist es auch ein Ziel dieser Erfindung, die bereitgestellten DNA-Fragmente oder jedweden Teil hiervon als Hybridisierungssonde (Hybridisierungssonden) oder zur Komplementierung von mutanten Phenotypen zum Erhalt homologer Gene von Pilzzellen zu verwenden.
Der Ausdruck Derivat bedeutet jedes beliebige andere DNA-Fragment, welches durch jede beliebige genetische und/oder chemische Modifikation (oder derartige Modifikationen) der vorstehend erwähnten Gene hergestellt wird. Die genannte genetische und/oder chemische Modifikation (die genannten genetischen und/oder chemischen Modifikationen) können jede beliebige Suppression, Substitution, Deletion oder Addition von einer oder mehreren Basen oder von einer Region der genannten Gene sein, was nach der Transformation in einer Pilzwirtszelle entweder zu einer erhöhten Enzymaktivität oder zum gleichen Aktivitätsniveau führt, oder zu einer verringerten oder Nullenzymaktivität führt.
Legende der Figuren
1 Restriktionskarte der Plasmide pDM3, pMT4 und pMT1.
2 Subklonierung von Plasmid pDM3.
3 Strategie des Sequenzierens des PMT1-Gens.
4a Nukleotidsequenz des PMT1-Gens (SEQ ID NR.1).
4b Aminosäuresequenz des PMT1-Gens (SEQ ID NR.2).
5 Konstruktion- und Restriktionskarte von pMT1.1/LTRA3.
6 O-Glycosylierungs-Aktivität von S. cerevisiae WT (Darstellung A) und MT (Darstellung B).
7 Teilnukleotidsequenz des K. lactis PMT1-Gens (SEQ ID NR. 3) .
8 Nukleotidsequenz (Darstellung A) und vorhergesagte Aminosäuresequenz (Darstellung B) Vergleich zwischen dem S. cerevisiae PMT1-Gen (obere Sequenzen) und dem K. lactis-Homologen (untere Sequenzen), isoliert durch PCR-Amplifikation von genomischer K. lactis-DNA. Punkte stellen eine Sequenzidentität dar, Fragezeichen weisen auf eine Sequenzungenauigkeit hin. Die zum Primer Sq3910 komplementäre Nukleotidsequenz ist unterstrichen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Isolierung einer höher gereinigten Mannosyltransferase von S. cerevisiae und Ausbildung von Peptiden
Die Mannosyltransferaseaktivität wurde aus Gesamthefemembranen solubilisiert und auf Hydroxylapatit nach Strahl-Bolsinger und Tanner (Eur. J. Biochem. 196 (1991), 185) gereinigt. Das Protein mußte dann durch (NH₄)₂SO₄-Fällung weiter angereichert werden, bevor eine zusätzliche Reinigung durch Affinitätschromatographie durchgeführt wurde. Das eluierte Material wurde anschließend auf SDS/PAGE aufgetrennt. Die entstehende 92 kDa-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten. Eine Trypsin-Verdauung (im Gel) lieferte mehrere nicht-überlappende Peptide, welche die Herstellung von Sonden ermöglichten.
E.1.1. (NH₄)₂SO₄-Fällung
100 ml Fraktionen der Hydroxylapatitsäule mit Mannosyltransferaseaktivität wurden mit (NH₄)₂SO₄ bis zu einer Endkonzentration von 30% (Gewicht/Volumen) vermischt und während einer Stunde in einem Eis/Salz-Bad leicht gerührt. Das Gemisch wurde während 30 Minuten zentrifugiert (8.000 × g). Das entstehende Pellet wurde in 8 ml AB-Puffer (10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 15% Glycerin (Vol.-%), 0,1% Lubrol (Vol.-%), 150 mM NaCl) resuspendiert und während einer Stunde gegen den gleichen Puffer dialysiert. Lagerung: –20°C.
E.1.2. Affinitätschromatographie
E.1.2.1. Bereitung der Affinitätschromatographiesäule
0,5 g gefriergetrocknetes Pulver von Protein A-Sepharose Cl 4B wurden in 10 ml 100 mM NaPi, pH 7,0 während 15 Minuten gequollen und auf einem Glassinterfilter (G3) mit 200 ml des gleichen Puffers gewaschen. Protein A-Sepharose Cl 4B wurde in 100 mM NaPi, pH 7,0, äquilibriert. Etwa 3 bis 6 ml Anti-Mannosyltransferase-Serum wurden während 2 Stunden gegen 1 l NaPi (100 mM), pH 7,0, dialysiert. Das dialysierte Serum wurde mit dem Säulenmaterial während 16 Stunden bei 4°C inkubiert. Das Serum wurde unter Verwendung eines Glassinterfilters (G3) entfernt. Das Säulenmaterial wurde zweimal mit 10 ml 100 mM NaPi, pH 8,5, gewaschen und in 50 ml des gleichen Puffers resuspendiert.
Für ein kovalentes Kuppeln wurden 0,75 mg/ml Dimethylsuberimidat zugesetzt. Der pH wurde auf pH 8,5 durch Zusetzen von 5 bis 6 Tropfen von 1 M NaOH eingestellt. Das Material wurde während einer Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Ein zweites Mal wurde Dimethylsuberimidat zugesetzt und der pH würde auf pH 8,5 mit 1 M NaOH eingestellt. Das Säulenmaterial wurde in Serie auf einem Glassinterfilter (G3) mit

a) 50 ml 100 mM NaPi, pH 8,0
b) 25 ml 100 mM NaPi, pH 8,0, 3 M Ammoniumrhodanid
c) 100 ml 100 mM NaPi, pH 8,0

Das Material wurde gewaschen und in AB-Puffer äquilibriert.
E.1.2.2. Reinigung des 92 kDa-Proteins
8 ml des (NH₄)₂SO₄ gefällten und dialysierten Proteins (E.1.1.) wurden mit dem Affinitätssäulenmaterial (E.1.2.1.) während 16 Stunden bei 4°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Eine Säule (2 cm × 0,5 cm) wurde gefüllt und mit 15 ml AB-Puffer gewaschen. Die Säule wurde mit 100 mM Glycin/HCl, pH 3,0, 0,05% Lubrol (Vol.-%), 15% Glycerin (Vol.-%), eluiert. Es wurde Fraktionen von 0, 9 ml gesammelt und sofort mit 1 M Tris (15 μl/0,9 ml Fraktion) neutralisiert.
Um das 92 kDa-Protein zu ermitteln, wurden 40 μl jeder eluierten Fraktion durch SDS/PAGE und Western-Blot-Analyse wie beschrieben (Strahl-Bolsinger und Tanner, 1991) analysiert. Die 92 kDa-Protein enthaltenden Fraktionen (Fraktionen 2 bis 6) wurden gesammelt und über Mikrokonzentratoren (Centricon/Amicon) durch Zentrifugieren bei 5.000 × g auf 100 μl aufkonzentriert. 0,9 ml 98% EtOH wurden zugesetzt und das Protein wurde während 16 Stunden bei –20°C gefällt. Das gefällte Protein wurde durch Zentrifugieren während 30 Minuten bei 10.000 × g pelletiert.
E.1.3. SDS-PAGE
Das gefällte Protein (E.1.2.2.) wurde in 150 μl SDS-Probenpuffer (0,07 M Na₂CO₃, 0,07% β-EtSH, 2% SDS, 12% Saccharose, 0,07% Bromphenolblau) resuspendiert. SDS-Gelelektrophorese nach Lämmli und Favre [J. Mol. Biol. 80 (1973), 575] wurde bei 50 bis 70 V unter Verwendung der BIORAD-Mini-Protean-Zelle durchgeführt. Proteinstandards: HMW-Standards/Gibco BRL.
Das Protein wurde durch Anfärben mit 0,05% Coomassie R250 (Gewicht/Volumen), 25% Isopropanol (Vol.-%), 10% Essigsäure (Vol.-%) und Entfärben in 7,5% Essigsäure (Vol.-%) ermittelt.
E.1.4. Trypsinverdauung und Konstruktion von Oligonukleotiden
Nach SDS-PAGE (E.1.3.) wurde die 92 kDa-Proteinbande ausgeschnitten (etwa 10 μg Protein). Das Gelfragment wurde in kleine Stücke geschnitten und dreimal während 30 Minuten in 5 ml 50% Methanol/10% Essigsäure und einmal während 30 Minuten in 5 ml 50% Methanol geschüttelt. Das Gel wurde während 3 Stunden lyophilisiert. Die Trypsinverdauung wurde in 0,3 ml 0,2 M Ammoniumhydrogencarbonat/2 μg Trypsin während 16 Stunden bei 37°C durchgeführt. Der Überstand wurde entfernt. Die Eluierung der Peptide erfolgte dreimal während einer Stunde bei 37°C in 0,2 ml 0,2 M Ammoniumhydrogencarbonat und einmal während einer Stunde bei 37°C in 0,2 ml 0,2 M Ammoniumhydrogencarbonat/30% Acetonitril. Das eluierte Material wurde gesammelt, lyophilisiert und in 0,2 ml 1 M Guanidiniumhydrochlorid/50 mM Tris/HCl, pH 7,5, wiederaufgelöst. Die Peptide wurden unter Verwendung einer Reversphasen-RP18-Kolonne, äquilibriert in 0,13% TFA, aufgetrennt. Die Peptide wurden durch Acetonitril (0 bis 70%) eluiert. Es konnten bis zu 40 verschiedene Peptidpeaks festgestellt werden. Fünf der Hauptpeaks wurden durch eine automatisierte Sequenzanalyse nach Edman (G. Allen in: Sequencing of proteins and peptides, Laboratory Techniques in Biochem, and Mol. Biol. 9. Ausg.: Burdon, R.H. & Knippenberg, P.H.; Elsevier (1989)) sequenziert. Unter den dadurch erhaltenen Sequenzen waren drei zur Herstellung von Oligonukleotiden geeignet, welche in der nachstehenden Tabelle 1 dargestellt sind.
Tabelle 1
Auf der Basis dieser Sequenzen wurden die Oligonukleotide A bis C chemisch synthetisiert unter Verwendung der Codonverwendung von S. cerevisiae (Guthrie und Abelson in: The molecular biology of the yeast Saccharomyces; Hrsg.: J.N. Strathern, E.W. Jones, J.R. Broach (1982)). Die Oligonukleotide A bis C besaßen die folgenden Eigenschaften:

– Oligonukleotid A: Peak: 23 Aminosäuresequenz: G F D G D A Oligodeoxynukleotid: 5'-G^T/_CGTCACCGTCGAANCC-3' achtfach degeneriert, codierender Strang, 17 Nukleotide
– Oligonukleotid B: Peak: 34 Aminosäuresequenz: E P H V Y E DNA-Sequenz: 5'-^C/_TTCGTAGAC^G/_ATG^A/_TGG^T _CTC-3' 16-fach degeneriert, codierender Strang, 18 Nukleotide
– Oligonukleotid C: Peak: 15 Aminosäuresequenz: I S Y K P A S F I S K DNA-Sequenz: 5'-ATTTC^T/_ATA^T/_CAA^A/_GCC^A/_TGCTTC^T/_ATT^T/_AAAA-3' 128-fach degeneriert, codierender Strang, 33 Nukleotide

Beispiel 2
Screenen einer Plasmidbank von genomischer Hefe-DNA
Die chemisch synthetisierten Oligodeoxynukleotide A bis C (E.1.4.) wurden verwendet, um die Plasmidbank von genomischer Hefe-DNA pCS19 (Sengstag und Hinnen, Nucl. Acids Res. 15 (1987), 233) zu Screenen. Die Bank wurde durch Teilverdauung von genomischer Hefe-DNA mit Sau3A und Klonieren in die BclI-Restriktionsstelle des Vektors pCS19 hergestellt.
E.2.1. Markierung von Oligodeoxynukleotiden
Die Oligonukleotide A bis C wurden durch Kinasereaktion markiert, welche nach Maniatis et al. (T. Maniatis, J. Sambrook, E.F. Fritsch (1989), Molecular cloning: A Laboratory manual, C.S.H. Press) durchgeführt wurde. 40 pMol Oligodeoxynukleotid wurden unter Verwendung von 50 μCi [y-^32p]-ATP markiert. Die freien radioaktiven Nukleotide wurden unter Verwendung von "NUC Trap Push columns" (Stratagene) gemäß dem Bedienungshandbuch des Herstellers entfernt.
E.2.2. Screenen der Bank
Die DNA-Bank (4992 verschiedene einzelne Kolonien) wurde von Mikrotiterplatten auf Nitrocellulose übergeführt. Die Koloniehybridisierung wurde nach Grunstein und Hogness (PNAS 72 (1975), 3961) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:

– Prähybridisierung: Die Filter wurden bei 44°C in 200 ml 5 × Denhardt's, 6 × NET, 0,1% SDS (Gewicht/Volumen), 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA, während mindestens 4 Stunden inkubiert (5 × Denhardt's: 0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% BSA; 6 × NET: 0,9 M NaCl, 90 mM Tris-HCl, pH 8,3, 6 mM EDTA, pH 8,0).
– Hybridisierung: Die Filter wurden bei 44°C in 100 ml 5 × Denhardt's, 6 × NET, 0,1% SDS (Gewicht/Volumen), 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA, markierten Oligodeoxynukleotiden A und B (jeweils 40 pMol) inkubiert. Die Hybridisierung wurde während 16 Stunden durchgeführt.
– Waschbedingungen: Die Filter wurden dreimal in 50 ml 6 × SSC, 0,1% SDS (Gewicht/Volumen) bei 0°C während 15 Minuten gewaschen.

Um positive Kolonien festzustellen, wurden die Filter während 16 Stunden bei –70°C Röntgenstrahlenfolien ausgesetzt. Unter diesen Bedingungen konnten 12. positiv reagierende Klone identifiziert werden.
Beispiel 3
Southern-Analyse der 12 positiven Klone
Die 12 positiven Klone wurden in Southern-Blots unter Verwendung von drei verschiedenen Oligodeoxynukleotiden analysiert. Diese Analyse führte zur Identifizierung eines positiven Klons, welcher mit allen drei Oligonukleotiden reagiert. Dieser Klon wurde als pDM3 bezeichnet.
Die 12 positiven Klone wurden in 5 ml LB-Medium, ergänzt mit Ampicillin, vermehrt und deren DNA wurde nach dem Verfahren von Birnbaum und Doly (Nucl. Acid. Res. 7, (1979), 1513) isoliert.
1/10 jeder isolierten Plasmid-DNA (Plasmide: pDMl–pDM12) wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRi-XhoI (jeweils 5 U), 1 × "one-for-all"-Puffer (Pharmacia) in einem Gesamtvolumen von 20 μl während einer Stunde bei 37°C verdaut. Die DNA-Fragmente wurden auf einem 1%-Agarosegel aufgetrennt und auf Nitrocellulose nach Maniatis et al. (loc. cit.) geblottet. Die Southern-Analyse wurde unter Verwendung von Oligo A und B unter Verwen dung der gleichen Bedingungen wie sie zuvor für den Bankscreen beschrieben sind, durchgeführt. Die Hybridisierungstemperatur für Oligo A betrug 48°C, für Oligo B 42°C. Die Klone 1, 2, 3, 5, 6, 7 und 11 reagierten positiv mit beiden Oligodeoxynukleotiden. Diese sieben Klone wurden durch Southern-Blot-Analyse weiter analysiert. Drei identische Blots wurden daher hergestellt, worin die DNA der Klone 1, 2, 3, 5, 6, 7 und 11 mit EcoRI-XhoI verdaut und wie beschrieben auf Nitrocellulose, geblottet wurden. Die Blots 1, 2 und 3 wurden prähybridisiert in 20 ml 5 × Denhardt's, 6 × NET, 0,1% SDS (Gewicht/Volumen), 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA bei 50°C während 4 Stunden. Jeder Blot wurde anschließend in 10 ml 5 × Denhardt's, 6 × NET, 0,1% SDS (Gewicht/Volumen), 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA, 40 pMol markierten Oligonukleotiden während 16 Stunden hybridisiert. Die Hybridisierungstemperatur ist nachstehend in Tabelle 2 angegeben. Das Waschen erfolgte während 10 Minuten bei jeder Temperatur in 50 ml 2 × SSC, 0,1% SDS (Gewicht/Volumen).
Tabelle 2
Der Klon 3 war der einzige Klon, welcher mit Oligo A, B und C reagierte. Der Klon wurde als pDM3 bezeichnet und weiter analysiert.
Beispiel 4
Analyse von pDM3
E.4.1. Verfahren
E.4.1.1. Verdauung mit Restriktionsendonukleasen
Die analytische Verdauung mit Endonukleasen wurde in 1 × "onefor-all"-Puffer (Pharmacia), 0,2 bis 0,5 μg DNA, 1–5 U Restriktionsenzym in einem Gesamtvolumen von 20 μl während einer Stunde bei 37°C durchgeführt.
Die präparative Verdauung wurde in einem Gesamtvolumen von 40 bis 80 μl mit 1 bis 10 μg DNA, 5 bis 20 μl Restriktionsenzym, 1 × "one-for-all"-Puffer während zwei Stunden bei 37°C durchgeführt .
E.4.1.2. DNA-Gelelektrophorese
Die Auftrennung von DNA-Fragmenten wurde nach Maniatis et al. (loc. cit.) durchgeführt.
E.4.1.3. Isolierung von DNA-Fragmenten
Nach der Auftrennung wurden die DNA-Fragmente unter Verwendung des "Gene-clean kit" (Stratagene) gemäß dem Bedienungshandbuch des Herstellers isoliert.
E.4.1.4. Behandlung mit alkalischer Phosphatase
Die DNA-Fragmente wurden mit alkalischer Phosphatase nach Maniatis et al. (loc. cit.) dephosphoryliert.
E.4.1.5. Ligation
Die DNA-Fragmente wurden in 1 × T4-Ligationspuffer (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM ATP) mit 1 U T4-DNA-Ligase (Gesamtvolumen 10 bis 15 μl) ligiert. Das molare DNA-Verhältnis von Vektor:Insert betrug 1:4 oder 1:8. Die absolute Menge an DNA betrug 20 bis 50 ng. Inkubationsdauer: 16 Stunden bei 14°C oder 5 Stunden bei 25°C.
E.4.1.6. Transformation von E. coli
Kompetente E. coli DH5α-Zellen wurden nach Hanahan (J. Mol. Biol. 166 (1983), 557) hergestellt. Die Transformation wurde wie von Maniatis et al. (loc. cit.) beschrieben, durchgeführt.
E.4.1.7. Herstellung von DNA
Plasmid-DNR wurde nach Birnbaum und Doly (loc. cit.) hergestellt.
E.4.1.8. Southern-Blot-Analyse
Die Southern-Blot-Analyse wurde unter Verwendung der gleichen Bedingungen wie in E.3. beschrieben, durchgeführt.
E.4.1.9. DNA-Sequenz-Analyse
Die DNA-Sequenzierung erfolgte nach dem Verfahren von Sanger et al. (PNAS 74 (1977), 5463). Es wurde nur Plasmid-DNA sequenziert. Es wurde ein T7-DNA-Polymerase-Sequenzierungskit (Pharmacia) verwendet; das radioaktive Nukleotid war [α-³⁵S]dATP (spez. Akt. 600 Ci/mMol).
E.4.2. Identifizierung des OLR
Dieses Beispiel beschreibt eine Restriktionsanalyse von pDM3, die Identifizierung von verschiedenen DNA-Fragmenten, welche durch Oligonukleotide A, B oder C erkannt werden und deren Subklonierung. Die Sequenzierung dieser Subklone ermöglichte die Identifizierung eines OLR.
E.4.2.1. Subklonierung von pDM3-DNA-Fragmenten, welche mit Oligo A, B oder C hybridisieren
pDM3-DNA wurde mit EcoRI, XhoI und EcoRI-XhoI verdaut. Die Southern-Blot-Analyse wurde unter Verwendung von Oligo A, B oder C als Target durchgeführt.
Das Oligo A erkennt ein 3,0 kb EcoRI-Fragment, Oligo B und C erkennen ein 1,1 kb EcoRI-XhoI-Fragment. Das 3,0 kb EcoRI-Fragment wurde in pUC19 (linearisiert mit EcoRI und dephosphoryliert) subkloniert. Das 1,1 kb EcoRI-XhoI-Fragment wurde in pUC18 (linearisiert mit EcoRI-SalI und dephosphoryliert) subkloniert. Die richtigen Subklone wurden durch Restriktionsanalysen und Southern-Blot-Analysen unter Verwendung von Oligo A bzw. B/C ermittelt.
Der 3,0 kb EcoRI-Subklon wurde als pMT4 bezeichnet, der 1,1 kb EcoRI-XhoI-Subklon wurde als pMT1 bezeichnet. Es wurde eine weitere Restriktionsanalyse von pMT4 und pMT1 unter Verwendung einer Anzahl verschiedener Restriktionsendonukleasen (beispielsweise: PstI, HindIII und BglII) durchgeführt. Die Southern-Blot-Analyse unter Verwendung von Oligo A oder B/C wurde durchgeführt, um die genaue Region eines möglichen OLR zu definieren.
Die Restriktionskarten von pDM3, pMT4 und pMT1 sind in 1 gezeigt.
E.4.2.2. Sequenzanalyse
Die DNA-Inserts der Plasmide pMT4 und pMT1 wurden von beiden Enden unter Verwendung der universalen und der reversen Primer sequenziert, wobei neben dem Polylinker von pUC19/pUC18 geprimt wurde. Auch die Oligos A, B und C wurden als Sequenzierungsprimer verwendet. Die Sequenzierungsdaten lieferten einen OLR von etwa 400 bp auf beiden Seiten des Inserts von pMT1. Auch pMT4 zeigte einen OLR von etwa 200 bp, wenn es mit dem reversen Primer sequenziert wurde. Unter Verwendung dieser Sequenzierungsdaten konnte eine Aminosäuresequenz hergeleitet werden. Diese AA-Sequenz zeigte Peptidsequenzen, welche von der Peptidanalyse des 92 kDa-Proteins bekannt sind (es wurden Peptide, welche den Peaks 15, 23, 34 entsprechen, aufgefunden). Nach diesen Daten konnte die 5'/3'-Orientierung des Gens vorhergesagt werden.
Es wurden mehrere andere Subklone konstruiert und sequenziert unter Verwendung des universalen und des reversen Primers von pUC18/19 (2).
Es wurden auch die folgenden Oligodeoxynukleotide zur Sequenzierung verwendet.
Diese Oligodeoxynukleotide stellen Teile der neu segenzierten DNA-Fragmente dar.
Zur Sequenzierung der 5'-Region des Gens wurden exoIII/-Mungobohnen-Deletionen des Vektors pMT4 vorgenommen. pMT4 wurde unter Verwendung von SphI (3'-Überlappung) linearisiert. Das Plasmid wurde anschließend unter Verwendung von BamHI (5'-Überlappung) geschnitten.
Die Exonuklease-III-Deletion wurde nach Roberts und Lauer (Meth. Enzymol. 68 (1979), 473), Henikoff (Meth. Enzymol. 155 (1987), 156) durchgeführt.
Die überlappenden Enden wurden durch Mungobohnennuklease entfernt. Die entstehenden Plasmide wurden durch Restriktionsanalyse unter Verwendung von HindIII und EcoRI analysiert.
Die Sequenzanalyse der Klone wurde unter Verwendung des reversen Primers von pUC19 durchgeführt. Die Sequenzstrategie ist in 3 gezeigt. Die Sequenzdaten sind in 4 angegeben.
Beispiel 5
Northern-Blot-Analyse: Identifikation von mRNA, welche für Mannosyltransferase codiert.
E.5.1. Verfahren
E.5.1.1. Isolierung von RNA
Gesamt-RNA wurde aus dem Hefestamm SEY2101 (Mat a, ade2-1, leu2-3, 112, ura3-52 (Emr et al. PNAS 80 (1983), 7080) nach Domdey et al. (Cell 39 (1984), 611) isoliert.
E.5.1.2. Northern-Blot
Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines Formaldehyd-Agarose-Gels getrennt und auf Nitrocellulose geblottet, wie von Maniatis et al. (loc. cit.) beschrieben.
E.5.1.3. Das DNA-Target
Das 1,1 kb-Insert von pMT1 wurde durch EcoRI-PstI-Verdauung isoliert. Das Fragment wurde unter Verwendung des "Gene-clean kit" (Stratagene) gereinigt.
200 ng des DNA-Fragments wurden mit [α-^32p]-dCTP (50 μCi) unter Verwendung des "megaprime"-Markierungskits (Amersham) gemäß dem Instruktionshandbuch des Herstellers markiert.
E.5.2. Ergebnisse
Das Nitrocellulosefilter wurde während 2 Stunden bei 42°C in 20 ml 5 × Denhardt's, 2 × SSC, 0,1% SDS (Gewicht/Volumen), 50% Formamid (Volumen/Volumen), 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA prähybridisiert. Die Hybridisierung wurde bei 42°C während 16 Stunden in 10 ml 1 × Denhardt's, 2 × SSC, 0,1% SDS (Gewicht/Volumen), 50% Formamid (Volumen/Volumen), 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA, 200 μg [α-^32p]-dCTP markiertes 1,1 kb EcoRI-PstI-Fragment von pMT1 durchgeführt. Das Waschen erfolgte zweimal bei Raumtemperatur und zweimal bei 50°C in 50 ml 0,1 × SSC, 0,1% SDS (Gewicht/Volumen). Die Hybridisierung des Targets wurde durch Aussetzen unter einen Röntgenfilm (–70°C, 16 Stunden) festgestellt. Es wurde eine einzelne mRNA mit einer Größe von 3 kb ermittelt.
Dieses Verfahren kann vom Fachmann mit anderen Sonden, welche aus der Sequenz von 4 abgeleitet sind, und mit RNA aus anderen Quellen (anderen Pilzzellen) leicht wiederholt werden.
Beispiel 6
Herstellung einer S. cerevisiae-Zelle, welche in der O-Glycosylierungsaktivität defizient ist
Eine S. cerevisiae-Zelle, welche in der O-Glycosylierungsaktivität defizient ist, wurde durch Genspaltung, durch Insertion des URA3-Gens in die HindIII-Restriktionsstelle des identifizierten OLR, bei bp 1595 der codierenden Sequenz hergestellt.
E.6.1. Konstruktion des Plasmids, welches für die Genspaltung verwendet wird
Das 1,1 kb Insert von pMT1 wurde als EcoRI-PstI-Fragment isoliert und in einen pUC18-Vektor (EcoRI/PstI linearisiert, dephosphoryliert, ohne HindIII-Restriktionsstelle im Polylinker) subkloniert. Der entstehende Vektor wurde als pMT1.1 bezeichnet.
pMT1.1 wurde mit HindIII linearisiert und dephosphoryliert. Das 1.1 kb HindIII-Fragment von YEp24 (Julius et al., Cell 37 (1984), 1075), enthaltend das URA3-Gen von S. cerevisiae wurde isoliert und in den mit HindIII linearisierten, dephosphorylierten Vector pMT1.1 subkloniert. Die Klone wurden durch Restriktionsanalysen identifiziert und als pMT1.1/URA3 bezeichnet (5).
pMT1.1/URA3 wies eine 0,24 kb PMT1-codierende Sequenz auf, welche eine Seite des URA3-Gens flankiert, und eine 0,86 kb PMT1-codierende Sequenz, welche die andere flankiert. CsCl-DNA von pMT1.1/URA3 wurde nach Maniatis et al. (loc. cit.) hergestellt.
E.6.2. Transformation von Hefe
40 μg pMT1.1/URA3 CsCl-DNA wurde mit SphI/EcoRI verdaut. Um die Vollständigkeit der Verdauung zu überprüfen, wurde ein Teil der verdauten DNA auf einem DNA-Agarose-Gel analysiert. Das verdaute Produkt wurde anschließend phenolisiert und die DNA wurde mit 98% EtOH (Maniatis et al., loc. cit.) gefällt. Die DNA wurde in 10 μl TE, pH 8.0, wiederaufgelöst.
Die S. cerevisiae-Stämme SEY2101/2102 (Mat a/α, ura3-52, leu2-3, 112 (Emr et al., loc. cit.) und SEY2101 (Mat a, ura3-52, leu2-3, 112, ade2-1) wurden mit 5 μl des EcoRI/SphI-verdauten Vektors pMT1.1/URA3 nach dem Verfahren von Ito et al. (J. Bacteriol. 153 (1983), 163) transformiert.
Die SEY2101/2102-Transformanten wurden auf Minimalmedium + Leu ausgewählt; SEY2101 Transformanten wurden auf Minimalmedium + Leu, + Ade ausgewählt.
Nach 3 bis 4 Tagen bei 30°C konnten die Transformanten gesammelt und auf dem gleichen Medium ein zweites Mal auf Platten aufgebraucht werden.
E.6.3. Genomischer Southern-Blot der Transformanten
Die genomische DNA von drei haploiden Transformanten und von Wild-Typ-Zellen wurde wie von Hoffmann und Winston (Gene 57 (1987), 267) beschrieben, isoliert. 1 μg der genomischen DNA wurde mit XhoI/EcoRI verdaut, auf einem Agarosegel aufgetrennt und auf Nitrocellulose geblottet, wie von Maniatis et al. (loc. cit.) beschrieben.
Der Blot wurde in 20 ml 5 × Denhardt's, 2 × SSC, 0,1% SDS (Gewicht/Volumen), 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA, 50% Formamid (Gewicht/Volumen) während 4 Stunden bei 42°C prähybridisiert.
Die Hybridisierung wurde in 10 ml der gleichen Lösung zugelassen durch Zusetzen von 200 ng [α-^32p]-dCTP markiertem 1,1 kb EcoRI/PstI-Fragment von pMT1.1 (siehe: E.5.1.3) während 16 Stunden bei 42°C. Das Waschen erfolgte zweimal bei Raumtemperatur in 50 ml 2 × SSC, 0,1% SDS (Gewicht/Volumen) und zweimal bei 68°C in 50 ml 1 × SSC, 0,1% SDS (Gewicht/Volumen). Die Signaldetektion erfolgte durch Röntgenfilme. Die Wild-Typ-Zellen zeigten ein einzelnes Signal bei 1,1 kb, was das EcoRI/XhoI-Fragment ohne URA3-Insertion widerspiegelt. In den gespaltenen Strängen fehlte dieses Signal. Anstelle dessen wurde ein neues 2,2 kb Fragment durch das 1,1 kb Target erkannt, welches das 1,1 kb EcoRI/XhoI-Fragment mit der 1,1 kb URA3-Insertion darstellt.
Beispiel 7
Charakterisierung der Mutanten
E.7.1. Wachstum
SEY2101-Wild-Typ-Zellen wurden entweder auf YPD (10 g/l Hefeextrakt; 10 g/l Pepton; 20 g/l Dextrose) oder auf Minimalmedium + Ade, + Leu, + Ura gezüchtet. SEY2101 PMT1::URA3 mutante Zellen wurden entweder auf YPD oder auf Minimalmedium + Ade, + Leu gezüchtet. Die Zellen wurden bei 30°C in einem Wasserbad-Schüttler gezüchtet. OD578 wurde alle 30 Minuten nach Beschallen der Zellen ermittelt. Die Wild-Typ- und die mutanten Zellen zeigten nahezu identes Wachstum auf beiden Medien, obwohl in einigen Fällen die mutanten Zellen aneinanderhaften können. Dennoch können derartige Zellen leicht durch Beschallen (30 Sekunden, Schallwasserbad) getrennt werden. Die Wachtumscharakteristika dieser Zellen sind nachstehend angeführt.

– Generationsdauer: – WT : 99' – MT : 93'
– Zellzahl: – WT : 1 OD = 1, 9 × 10 7 – MT : 1 OD = 1, 9 × 10 7
– Verdoppelungsrate: – WT : 0,61/h – MT : 0,65/h

In einer logarithmisch wachsenden Kultur zeigen 54,7% der Wild-Typ-Zellen und 56% der mutanten Zellen Knospen. Nach dem Wachsen während 24 Stunden auf YPD erreichten die Wild-Typ-Zellen eine OD578 von 11,4 und die mutanten Zellen von 12,3.
E.7.2. In vitro-Mannosyltransferaseaktivität und Western-Blot
E.7.2.1. Herstellung von rohen Membranen
SEY2101 wurde in 100 ml Minimalmedium + Ade + Leu + Ura auf OD578 = 0,5 gezüchtet. SEY2101 PMT1::URA3 wurde in 100 ml Minimalmedium + Ade, + Leu auf OD578 = 0,5 gezüchtet.
Es wurden zwei Herstellungen für jeden Stamm vorgenommen. Die Arbeit erfolgte auf Eis; alle Puffer wiesen 4°C auf. 40 OD Zellen wurden pelletiert und in 25 ml TMA (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 7,5 mM MgCl₂) gewaschen. Die Zellen wurden in 100 μl TMA resuspendiert und in ein Violax-Rohr übergeführt. 0,3 g Glaskugeln wurden zugesetzt und die Zellen wurden in einem Vortex viermal während 30 Sekunden aufgebrochen (Kühlen auf Eis zwischen den Aufbruchsinterwallen). Der Extrakt wird von den Glasperlen unter Verwendung einer Pasteur-Pipette entfernt. Die Glasperlen werden dreimal mit 250 μl TMA gewaschen. Alle Waschlösungen werden in einer Eppendorf-Schale gesammelt. Die Lösung wird während 15 Sekunden (10.000 × g) zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Pellet wird in 40 μl TMA (1 OD = 1 μl) resuspendiert.
E.7.2.2. Mannasyltransferase-Assay (in vitro)
1 und 5 μl der rohen Membranen (E.7.2.1) wurden hinsichtlich der Enzymaktivität wie von Strahl-Bolsinger und Tanner (loc. cit.) beschrieben, untersucht. Es wurden zwei parallele Proben vom Wild-Typ und mutanten Zellen gemessen. Die Mittelwerte dieser beiden unabhängigen Messungen sind gezeigt.
Im Gegensatz zu Wild-Typ-Zellen zeigen mutante Zellen keine in vitro Mannosyltransferase-Aktivität.
E.7.2.3. Western-Blot-Analyse
Die Membranen (1 μl von E.7.2.1) wurden in 20 μl SDS-Probenpuffer während 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden SDS/Page und Western-Blot durchgeführt wie von Strahl-Bolsinger und Tanner (loc. cit.) beschrieben. Für die Antikörperdetektion wurde der Peroxidase-ECL-Kit (Amersham) gemäß den Bedienungsanleitungen der Hersteller verwendet. Die Antikörper gegen das 92 kDa Protein reagieren spezifisch mit einem 92 kDa Protein von Wild-Typ-Membranen. In mutanten Membranen fehlt dieses 92 kDa-Signal.
E.7.3. In-vivo-O-Glycosylierung
Um die in-vivo-O-Glycosylierung zu untersuchen, wurden Wild-Typ- und mutante Zellen in Gegenwart von [³H]-Mannose gezüchtet. Anschließend wurde eine rohe Zellwand plus Membranfraktion isoliert und das O-glycosylierte Material wurde durch β-Eliminierung freigesetzt.
E.7.3.1 Behandlung mit [³H]-Mannose
Wild-Typ- und mutante Zellen wurden über Nacht in Minimalmedium, welches Saccharose als einzige C-Quelle enthielt, gezüchtet. 7,5 OD der Kultur (OD578 = 1–2) wurden pelletiert und mit 5 ml H₂O (vorgewärmt auf 30°C) gewaschen. Die Zellen wurden in 5 ml YP/0,5% Saccharose/250 μCi [³H]-Mannose in einem Wasserbadschüttler während 2 Stunden bei 30°C gezüchtet.
E.7.3.2. Isolierung der rohen Zellwand- und Membran-Fraktion
5 OD der mit [³H]-Mannose behandelten Zellen wurden zentrifugiert und dreimal mit 1 ml TMA gewaschen. Die Zellen wurden in 200 μl TMA resuspendiert und mit Glasperlen wie in E.7.2.1 beschrieben, aufgebrochen (es wurde eine 10 μl Probe zur Messung der Radioaktivität, welche der Gesamteinverleibung entspricht, verwendet). Der Extrakt wurde anschließend während 15 Minuten zentrifugiert (10.000 × g) und der Überstand wurde entfernt (es wurde eine 100 μl Probe verwendet, um die Radioaktivität, welche dem löslichen Material entspricht, zu messen).
E.7.3.3. β-Eliminierung
Das Pellet wurde in 1 ml 0,1 N NaOH resuspendiert (eine 10 μl Probe wurde verwendet, um die Radioaktivität, welche dem Material vor der β-Eliminierung entspricht, zu messen). Die Inkubation wurde während 24 Stunden bei 30°C durchgeführt.
E.7.3.4. Analyse von β-eliminiertem Material
Das β-eliminierte Material wurde mittels einer Dowex 50WS8/H⁺-Säule (0,5 cm × 6 cm) entsalzen. Die Säule wurde mit 0,5 M Mannose gesättigt und in H₂O äquilibriert. Die β-Eliminierungsprobe wurde auf die Säule aufgetragen und mit 1,5 μl H₂O gewaschen. Der Durchfluß wurde gesammelt (es wurde eine 100 μl Probe zur Messung der Radioaktivität, welche dem βeliminierten Material entspricht, verwendet) und auf 10 μl im Speed-vac eingeengt. Die Dünnschichtchromatographie wurde auf Silicagel 60 (Merck) in Aceton:Butanol:H₂O 70:15:15 durchgeführt. Standards: Mannose, Saccharose, Stachyose, Raffinose. Der Chromatographiedurchlauf wurde einmal wiederholt. Die Zukker wurden mit 0,5 g KMnO₄ in 100 ml 1N NaOH festgestellt. Die Radioaktivität wurde durch einen Dünnschichtscanner (Berthold) ermittelt (siehe 6).
Die mutanten Zellen zeigen eine verringerte Glycosylierung im Vergleich zu Wild-Typ-Zellen. Die O-Glycosylierung in mutanten Zellen ist etwa 40 bis 50% geringer als in Wild-Typ-Zellen.
Beispiel 8
Klonierung des PMT1-Homologen von Kluyveromyces lactis.
Die Hefe S. cerevisiae war das System der Wahl, wenn die Herstellung eines heterologen Proteins in einer Pilzwirtszelle gewünscht war. In den letzten Jahren wurde jedoch gezeigt, daß die Produktivität von Bäckerhefe oft eingeschränkt ist, insbesondere wenn die Sekretion des Produktes in das Kulturmedium erforderlich ist. Die Verwendung von anderen Pilzsystemen als S. cerevisiae ist daher in einer Anzahl von Fällen vorzuziehen [siehe Romanos et al., Yeast 8 (1992) 423–488; Fleer, Curr. Opinion Biotechnol. 3 (1992) 486–496]. Einer der alternativen Hefewirte wird von der Gattung Kluyveromyces gebildet, für welche bessere Sekretionsausbeuten im Hinblick auf mehrere Proteine von kommerziellem Interesse festgestellt wurden [z.B. Van den Berg et al., Bio/Technology 8 (1990) 135–139]. Das folgende Beispiel zeigt, daß die vorliegende Erfindung nicht auf Bäckerhefe beschränkt ist, da die Sequenz des PMT1-Gens, isoliert aus S. cerevisiae, in vorteilhafter Weise für die Identifizierung von Genen verwendet werden kann, welche für ähnliche enzymatische Aktivitäten in anderen Pilzspezies codieren. Darüber hinaus kann die in der vorliegenden Erfindung aufgefundene Sequenzinformation auch zur Identifizierung von verwandten für Mannosyltransferase codierenden Genen in S. cerevisiae verwendet werden.
E.8.1. Konstruktion von degenerierten PCR-Primern für die Amplifizierung von PMT1-verwandten Genen
Die Region der PMT1-Nukleotidsequenz, welche der zentralen hydrophilen Region des Mannosyltransferase-Proteins entspricht, wurde ausgewählt, um PCR-Primer [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki et al., Science 230 (1985) 1350–1354; Mullis & Faloona, Meth. Enzymol. 155 (1987) 335–350] für die Amplifizierung von homologen Genen zu entwerfen. Die Amplifizierung erfordert eine Hybridisierung, auch als Annelierung bezeichnet, dieser synthetischen Oligonukleotide mit ihrer Target-DNA. Die Spezifität, mit welcher einzelne Regionen der genomischen DNA amplifiziert werden, hängt von den Bedingungen der PCR-Reaktion und dem Homologiegrad zwischen den Primern und der zu amplifizierenden Nukleotidsequenz ab. Auf den Annelierungsschritt folgend, werden die Primer unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase verlängert. Nachdem der komplementäre Strang polymerisiert ist, werden die beiden Stränge durch Wärmedenaturierung getrennt und es kann ein neuer Zyklus des Annelierens und der Polymerisierung beginnen.
Vier Beispiele von Oligonukleotiden, welche als Primer für die PCR-Amplifikation von PMT1-Homologen geeignet sind, sind nachstehend in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Das Design dieser "degenerierten" Oligonukleotide berücksichtigt, daß mehrere Codons die Information für die Einverleibung der gleichen Aminosäure in eine naszente Polypeptidkette aufweisen können, welche oft in der dritten Stellung ("Wackelstellung") eines Tripletts variieren. Jeder Primer stellt daher ein Gemisch von Oligonukleotiden dar, worin Y C oder T kennzeichnet, R A oder G kennzeichnet und N A, C, G oder T kennzeichnet.
E.8.2. PCR-Amplifikation von genomischer K. lactis-DNA
Es wurde genomische DNA des K. lactis-Stammes CBS2359 wie von Sherman et al. ["Methods in Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1986) S. 127] beschrieben, hergestellt. 10 ng der genomischen DNA wurden in einer Standard-PCR-Reaktion verwendet [Sambrock et al., "Molecular Cloning – A Laboratory Manual", zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] in Gegenwart von 1 μg von jedem der Primer und 5% entionisiertem Formamid. Die Amplifikation wurde unter Verwendung eines "DNA Thermal Cycler" (Perkin Elmer Cetus) und "AmpliTag DNA Polymerase" (Perkin Elmer Cetus, 5 Units pro Reaktionsrohr) durchgeführt. Die Bedingungen der Denaturierung, Annelierung und Polymerisation (30 Zyklen) waren 91°C (1 min), 42°C (2 min) bzw. 72°C (3 min), mit Ausnahme des ersten Zyklus, worin die Denaturierung während 5 Minuten erfolgte. Die Ergebnisse der PCR-Amplifikationen unter Verwendung der vor stehend beschriebenen Primer sind nachstehend in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Diese Ergebnisse zeigen, daß es nicht nur möglich ist, Fragmente zu erhalten, welche die gleiche Größe zeigen, wie sie für das K. lactis-Homologe des S. cerevisiae PMT1-Gens erwartet wird, sondern daß zusätzlich DNA-Fragmente mit hoher Spezifität amplifiziert werden können, welche am wahrscheinlichsten einem anderen Gen entsprechen, das für eine eng verwandte enzymatische Aktivität codiert.
E.8.3. Partielle Sequenzcharakterisierung des K. lactis-Homologen
Das 400 bp Fragment, amplifiziert mit der Primerkombination Sq3908+Sq3910 wurde in den Vektor pCRII (TA Cloning^TM, Invitrogen Corp.) subkloniert, unter Befolgung der Angaben des Zulieferers, und nach dem in E.4.1.9. beschriebenen Verfahren unter Verwendung des Universalprimers teilweise sequenziert. Die erhaltene Sequenz ist in 7 gezeigt. Ein Sequenzvergleich zwischen dem S. cerevisiae PMT1-Gen und dem Fragment, welches aus genomischer K. lactis-DNR durch PCR-Amplifikation isoliert wurde, zeigt eine 75% und 80,5% Identität am Nukleo tid- bzw. Aminosäureniveau (8). Das amplifizierte 400 bp DNA-Fragment kann verwendet werden, um ein selektives Markergen auf den K. lactis PMT1 chromosomalen Locus in Analogie zum unter E.6. beschriebenen Experiment zu targetieren, was zu einem gespaltenen Gen führt. Dies wird einen K. lactis-Stamm mit einer verringerten Ser/Thr-spezifischen Mannosyltransferaseaktivität liefern. Zusätzlich kann das amplifizierte Fragment als homologe Hybridisierungssonde für das Klonieren des gesamten K. lactis PMT1-Gens unter Verwendung von Standardverfahren eingesetzt werden.

Claims

Pilzzelle, welche eine genetische Modifikation (genetische Modifikationen) trägt, die in der codierenden Region oder in Regionen lokalisiert ist (sind), welche für die Expression und/oder die transkriptionale Regulierung des Gens verantwortlich oder darin involviert sind, welches Gen für ein Protein mit einer Dol-P-Man:Protein (Ser/Thr)-Mannosyl-Transferase (PMT1)-Aktivität codiert, welches von der Gruppe bestehend aus (a) DNA-Molekülen, umfassend die in 4A dargestellte Nukleotidsequenz oder Fragmente hiervon; (b) DNA-Molekülen, welche für ein Protein mit der in 4B dargestellten Aminosäuresequenz oder für Fragmente hiervon codieren; oder (c) DNA-Molekülen, umfassend die in 7 dargestellte Sequenz des 126 bp Fragments des PMT1-Gens von Kluyveromyces lactis oder Fragmente hiervon; ausgewählt ist, welche verursacht (verursachen), daß die Zelle mindestens ein vermindertes O-Glycosylierungsvermögen aufweist, im Vergleich zu einer Pilzzelle, welche das entsprechende nicht-modifizierte DNA-Molekül, wie es in (a) bis (c) definiert ist, trägt.
Pilzzelle nach Anspruch 1, wobei die Modifikation (die Modifikationen) jedwede Suppression, Substitution, Deletion, Addition, Disruption und/oder Mutationsinsertion umfaßt (umfassen) .
Pilzzelle nach Anspruch 2, wobei die Modifikation (Modifikationen) während der Segregation stabil und/oder nichtzurückkehrend und/oder non-leaky ist (sind).
Pilzzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das verminderte O-Glycosylierungsvermögen von der Produktion in aktiver Enzyme, der Produktion von Enzymen mit veränderten biologischen Eigenschaften, der fehlenden Produktion der Enzyme oder der Produktion der Enzyme in geringen Mengen herrührt.
Pilzzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welche ferner eine Modifikation (Modifikationen) in einem oder in mehreren Genen umfaßt, welche (s) in darauffolgenden Additionen von Mannosylresten oder in die Synthese des Mannosylrestedonors (Dol-P-Man) involviert ist/sind.
Pilzzelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welche eine exogene DNA-Sequenz eingebracht wurde.
Pilzzelle nach Anspruch 6, wobei die exogene DNA-Sequenz ein oder mehrere Gene umfaßt, welche (s) für ein gewünschtes Protein, das in der genannten Zelle exprimiert und/oder in der Zelle ausgeschieden wird, codiert/codieren.
Pilzzelle nach Anspruch 7, wobei die genannte DNA-Sequenz in einer Expressionskassette enthalten ist, welche eine Transkriptions- und Translationsinitiationsregion umfaßt, die mit dem 5'-Ende der genannten DNA-Sequenz verbunden ist, welche für das gewünschte Protein (die gewünschten Proteine) codiert.
Pilzzelle nach Anspruch 8, wobei die Transkriptions- und Translationsinitiationsregion aus Promotoren, welche aus Pilzzellgenen erhalten werden, ausgewählt ist.
Pilzzelle nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Expressionskassette ferner eine Transkriptions- und Translationsterminationsregion am 3'-Ende der DNA-Sequenz umfaßt, welche für das gewünschte Protein (die gewünschten Proteine) codiert.
Pilzzelle nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die Expressionskassette ferner ein Signalpeptid (Prä-Sequenz) am N-Terminus der gewünschten Proteinsequenz umfaßt, um so das naszente Protein zum Ausscheidungspfad der genannten Pilzzelle zu lenken.
Pilzzelle nach einem der Ansprüche 6 bis 11, wobei die exogene DNA-Sequenz Teil eines Vektors ist, welcher sich in der Pilzzelle entweder autonom replizieren oder sich in deren eigene DNA-Sequenzen (das Chromosom) integrieren kann.
Pilzzelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, welche unter Fadenpilzen und Hefen ausgewählt ist.
Pilzzelle nach Anspruch 13, wobei die Hefe von der Gruppe bestehend aus Kluyveromyces und Saccharomyces ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Produkten, wobei eine Pilzzelle nach einem der Ansprüche 6 bis 14 unter Bedingungen kultiviert wird, unter welchen die exogene DNA-Sequenz exprimiert wird, und das Produkt gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das genannte Produkt in das Kulturmedium ausgeschieden wird.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei das genannte Produkt für eine O-Glycosylierung durch die Pilzzelle anfällig ist.
DNA-Molekül, umfassend ein Gen, welches für die Dol-P-Man: Protein (Ser/Thr)-Mannosyl-Transferase einer Saccharomy ces-Spezies codiert, welches Gen die in 4A angegebene Sequenz besitzt.
DNA-Molekül, umfassend ein Gen, welches für die Dol-P-Man:Protein (Ser/Thr)-Mannosyl-Transferase einer Kluyveromyces-Spezies codiert, welches Gen die Sequenz des 126 bp Fragments des PMT1-Gens von Kluyveromyces lactis, die in 7 angegeben ist, enthält.
DNA-Molekül, umfassend ein Gen, welches für die Dol-P-Man:Protein (Ser/Thr)-Mannosyl-Transferase codiert, (a) welches mit der DNA-Sequenz nach Anspruch 18 oder 19 hybridisiert; und/oder (b) Fragmente oder Derivate der DNA-Sequenz nach Anspruch 18 oder 19 darstellt.
Verwendung eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 18 bis 20 oder jedweden Teils hiervon als Hybridisierungssonde (Hybridisierungssonden) oder für die Komplementierung von mutanten Phenotypen, um homologe Gene von Pilzzellen zu erhalten.
DNA-Fragment, welches ein Fragment oder ein degeneriertes Fragment nach dem genetischen Code des Gens nach Anspruch 18 ist, und die folgende Sequenz aufweist: 5'ATGGAYGCNAAYAAYGAYTGG-3', 5'-GAYGCNAAYGAYGAYTGGGT-3', 5'-TCYTGYTGYTCRRANCCCCA-3' oder 5'-CTRTTRTTYTCNCCCCARTA-3'.
Verwendung des DNA-Fragments oder des degenerierten Fragmentes nach Anspruch 22 als PCR-Primer.