JP2013509181A - ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を欠くピチア・パストリスにおける治療用タンパク質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1つの実施形態においては、本発明は、ジペプチジルアミノペプチダーゼ(DAP)活性を欠く酵母細胞系における治療用タンパク質の製造方法である。この実施形態は、DAP活性が排除されている遺伝的に修飾されたピチア・パストリス(Pichia pastoris)細胞系を、該治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドベクターで形質転換し、該形質転換細胞を培養して該治療用タンパク質を得ることを含む。DAP活性は、STE13、DAP2およびDPPIIIが欠失または破壊されるようにピチア・パストリス(Pichia pastoris)細胞系を修飾することにより排除されうる。もう1つの実施形態においては、DAP活性は、STE13およびDAP2が欠失または破壊されるようにピチア・パストリス(Pichia pastoris)細胞系を修飾することにより排除される。
定義
本明細書中で用いる「ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性」または「DAP活性」なる語は、STE13、DAP2またはDPPIIIと称される遺伝子により産生されるポリペプチドの酵素的切断を意味する。
以下の略語が本明細書に全体において使用される。
URA5:オロタートホスホリボシルトランスフェラーゼ(OPRTアーゼ)アイソザイム
ScSUC2:サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)インベルターゼ
OCH1:アルファ−1,6−マンノシルトランスフェラーゼ
KlGlcNAcTr:ケイ・ラクチス(K.lactis)UDP−GlcNAc輸送体
BMT2:ベータ−マンノース−転移(ベータ−マンノース排除)
MNN4B:MNN4A様遺伝子(電荷排除)
MmGlcNAcTr:UDP−GlcNAc輸送体のマウスホモログ
PNO1:N−グリカンのホスホマンノシル化(電荷排除)
MNN4A:マンノシルトランスフェラーゼ(電荷排除)
ADE1:N−スクシニル−5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボチドシンテターゼ
MNS1:ScSEC12リーダーに融合したマウスマンノシダーゼIA触媒ドメイン
GnTI:PpSEC12リーダーに融合したヒトGlcNAcトランスフェラーゼI触媒ドメイン
HIS1:ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ
GalTI:ScKRE2リーダーに融合したトランケート化ヒトガラクトシルトランスフェラーゼ1触媒ドメイン
GalE:サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)UDP−グルコース4−エピメラーゼ
UDP−GalTr:UDP−ガラクトース輸送体
ARG1:アルギノスクシナートシンテターゼ
MNSII:ScMNN2リーダーに融合したドロソフィラ(Drosophila)マンノシダーゼII触媒ドメイン
GnTII:ScMNN2リーダーに融合したラットGlcNAcトランスフェラーゼII触媒ドメイン
PRO1:ガンマ−グルタミルキナーゼ
TrMNS1:ScαMATに融合した分泌性ティー・レーセイ(T.reseei)マンノシダーゼI触媒ドメイン
AOX1:アルコールオキシダーゼI
TNFRII−Fc:IgG1のFcドメインに融合したヒト腫瘍壊死因子受容体II
Zeo:ゼオシン耐性マーカー
STE13:ジペプチジルアミノペプチダーゼ
DAP2:ジペプチジルアミノペプチダーゼ
DPPIII:ジペプチジルアミノペプチダーゼ
Nat:ナーセオスリシン(nourseothricin)耐性マーカー。
ヒトまたは他の動物から単離されるタンパク質の大部分はグリコシル化されている。治療に使用されるタンパク質のうちの約70%はグリコシル化されている。治療用タンパク質が酵母のような微生物宿主において産生され、内在性経路を用いてグリコシル化される場合、典型的には、その治療効力は著しく低下する。それにもかかわらず、そのような糖タンパク質はヒトにおいて免疫原性であり、投与後のインビボにおける半減期の減少を示す(Takeuchi,Trends in Glycoscience and Glycotechnology,9:S29−S35,1997)。
酵母細胞系ピチア・パストリス(Pichia pastoris)から分泌される組換え融合タンパク質TNFRII−Fcのペプチド配列(その配列は図3(配列番号3)に示されている)の分析は、産生されるペプチドの全てがN末端において2アミノ酸だけトランケート化されていたことを示した。本出願人は、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)細胞系における2つの遺伝子STE13およびDAP2が全てのDAP活性を排除し、完全長TNFRII−Fcの産生をもたらすことを確認した。出願人はまた、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)が第3のジペプチジルアミノペプチダーゼDPPIIIを有することを確認している。したがって、1つの実施形態においては、本発明は、DAP活性を欠く酵母細胞系における治療用タンパク質の製造方法である。この実施形態は、DAP活性が排除された遺伝的に修飾されたピチア・パストリス(Pichia pastoris)細胞系を、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドベクターで形質転換し、該形質転換宿主細胞を培養して、該治療用タンパク質を産生させることを含む。DAP活性は、STE13およびDAP2および/またはDPPIIIが欠失または破壊されるようにピチア・パストリス(Pichia pastoris)細胞系を修飾することにより排除される。本発明の特定の実施形態においては、DAP活性は、STE13およびDAP2が欠失または破壊されるようにピチア・パストリス(Pichia pastoris)細胞系を修飾することにより排除された。
ポリペプチドのアミノ末端から2つのアミノ酸をトランケート化することが知られているプロテアーゼのサブクラスであるジペプチジルアミノペプチダーゼ(DAP)の活性に関連した遺伝子が酵母において特定されている。サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)の非接合性アルファ−細胞突然変異体は、アルファ接合因子フェロモンの不完全なプロセッシングによるものであると考えられている(Juliusら,Cell,32(3),839−52,1983)。更に、Ste13p活性を欠損したサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)突然変異株をスクリーニングすることにより、第2のジペプチジルペプチダーゼDap2pが特定された(Suarez RenduelesおよびWolf,Journal of Bacteriology,169(9),4041−48,1987)。サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)STE13のピチア(Pichia)ホモログのノックアウトが、N末端にアミノ酸HG(His−Gly)を有するタンパク質のインビボでのタンパク質切断を妨げ、完全長インスリン指向性(insulinotropic)ペプチドの産生を可能にしたことも報告されている(Melarkodeら,WO 2007/148345;Prabhaら,Protein Expression and Purification,64,155−161,2009)。逆に、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のDAP2ピチア(Pichia)ホモログの破壊はN末端タンパク質分解切断を妨げなかった(Melarkodeら,WO 2007/148345;Prabhaら,Protein Expression and Purification,64,155−161,2009)。
商業的に入手可能な任意のピチア・パストリス(Pichia pastoris)株、例えばNRRL−Y11430(American Type Culture Collection(ATCC),Manassas,VA,カタログ番号76273)が本発明に使用可能であるが、好ましい実施形態においては、本発明に使用される株は、糖操作されたピチア・パストリス(Pichia pastoris)株、例えば、実施例3に記載されているGS5.0株、または後記の糖操作された株(これは、発現に際してヒト様グリコシル化プロファイルを与える修飾を含む)であろう。例えば、実施例3のGS5.0株の場合、そのような修飾には、Δoch1、Δpno1、Δmnn4B、Δbmt2およびΔura5の欠失、またはケイ・ラクチス(K.lactis)およびエム・ムスクルス(M.musculus)UDP−GlcNAc輸送体、エム・ムスクルス(M.musculus)α−1,2−MsnI、ホモ・サピエンス(H.sapiens)β−1,2−GlcNAcトランスフェラーゼ1活性、アール・ノルベギクス(R.norvegicus)β−1,2−GlcNAcトランスフェラーゼII活性、キイロショウジョウバエ(D.melanogaster)MnsII活性、エス・ポンベ(S.pombe)Galエピメラーゼ、キイロショウジョウバエ(D.melanogaster)UDP−Gal輸送体およびホモ・サピエンス(H.sapiens)β−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の挿入のために行われるものが含まれる。GS5.0株は、ガラクトースを末端とするN−グリカン、例えばGalGlcNAc2MAN3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2またはそれらの混合物を有する糖タンパク質を産生しうる。他の代表的な糖操作株には、YJN201(Choiら,PNAS,100(9):5022−5027,2003)、YSH44(Hamiltonら,Science,301(5637):1244−1246,2003)、RDP36−1(Davidsonら,Glycobiology,14(4):1−9,2004)、PBP6−5(Bobrowiczら,Glyoobiology,14(9):757−766,2004)、YSH597(Hamiltonら,Science,313(5792):1441−1443,2006)が含まれる。
大腸菌(Escherichia coli)株TOP10(Invitrogen,Carlsbad,CA)またはXL10−Gold(Stratagene,Santa Clara,CA)を組換えDNA実験に使用した。制限および修飾酵素はNew England BioLabs,Ipswich,MAから入手し、製造業者の指示どおりに使用した。オリゴヌクレオチドはIntegrated DNA Technologies,Coralville,IAから入手した。塩および緩衝剤はSigma,St.Louis,MOから得た。ここで使用した最少培地は1.4% 酵母窒素ベース、2% デキストロース、1.5% 寒天および4×10−5% ビオチンおよびアミノ酸(適宜補足されるもの)を含むものであった。YMDに富む培地は1% 酵母エキス、2% マルトン(martone)、2% デキストロースおよび1.5% 寒天(プレート用)である。ナーセオスリシン(nourseothricin)はUS Biologicals,Swampscott,MA(カタログ番号N5375−74)から得られ、YMDに富む培地に100μg/mlの最終濃度で加えられる。
A.ste13::URA5ノックアウトベクターの作製
PfuUltra(商標)DNAポリメラーゼ(Stratagene,Santa Clara,CA)および鋳型としてのピチア・パストリス(Pichia pastoris)株NRRL−Y11430由来のゲノムDNAを使用して、STE13オープンリーディングフレームに対応する5’および3’フランキング領域に対応するDNA断片(配列番号41および42)を増幅した。表1に示されているプライマーペアSH774(配列番号13)およびSH775(配列番号14)ならびにSH776(配列番号15)およびSH777(配列番号16)を使用して、それぞれSTE13の5’および3’に関する771bpおよび949bpの断片を増幅した。ExTaq(商標)(TaKaRa,Bio.Inc.,Japan)の存在下の72℃で10分間のインキュベーションの後、該増幅断片をpCR2.1(Invitrogen,Carlsbad,CA)内にクローニングし、TOP10コンピテント細胞内に形質転換した。DNA配列決定は、STE13 5’およびSTE13 3’フランキング領域が正確であることを証明した。得られたベクターをそれぞれpGLY4511およびpGLY4512と命名した。
表1に示されているプライマーセットSH782(配列番号21)およびSH783(配列番号22)ならびにSH784(配列番号23)およびSH785(配列番号24)を使用して、DAP2 5’および3’フランキング領域(配列番号43および44)を、前記のとおりにピチア・パストリス(Pichia pastoris)ゲノムDNAから増幅して、それぞれ1003bpおよび1142bpの断片を得た。pCR2.1内へのクローニングおよび配列決定の後、該ベクターをpGLY4513およびpGLY4514(それぞれDAP2 5’およびDAP2 3’領域をコードする)と命名した。前記実施例2Aに類似したアプローチに従い、995bpのDAP2 5’領域(図11A、配列番号52の下線領域により表される)をUra5−ブラスターベクターpGLY13b内のEcoRI部位内にサブクローニングして、中間構築物pGLY4519を得た。ついで1133bpのDAP2 3’領域(図11B、配列番号53の下線領域により表される)をpGLY4519のHindIII部位内にサブクローニングして、dap2::URA5ノックアウトベクターpGLY4521(図1Bに図示されている)を得た。
PCR融合体を使用して、STE13およびDAP2の両方のノックアウトベクターを作製した。表1に示されているプライマーセットSH774(配列番号13)およびSH801(配列番号29)ならびにSH804(配列番号32)およびSH777(配列番号16)を使用し、PfuUltra(商標)DNAポリメラーゼを使用して、STE13 5’およびSTE13 3’断片をpGLY4520から増幅した。アシビア・ゴシッピィ(Ashbya gossypii)転写伸長因子(TEF)プロモーターおよびターミネーター(図12の通常文字により表される)(それぞれ、太字のオープンリーディングフレームの5’および3’側に位置する)の発現制御下でストレプトマイセス・ノウルセイ(Streptomyces noursei)からのナーセオスリシン(nourseothricin)アセチルトランスフェラーゼのオープンリーディングフレーム(図12、配列番号54の太字で表されている)を含有するナーセオスリシン(NATR)マーカーカセット(配列番号45)を、プライマーSH802(配列番号30)およびSH803(配列番号31)を使用して、pAG25(GoldsteinおよびMcCusker,Yeast,15,1541−1553,1999)から増幅した。該PCR反応をDNAアガロースゲル上で行い、それぞれSTE13 5’、STE13 3’およびNatマーカーに対応する779bp、958bpおよび1249bpの断片を単離した。ついでそれぞれ20ngを合わせ、PfuUltra(商標)DNAポリメラーゼならびにプライマーペアSH774(配列番号13)およびSH777(配列番号16)を使用して互いに融合させた。ExTaq(商標)DNAポリメラーゼ(TaKaRa,Bio.Inc.,Japan)の存在下の72℃で10分間のインキュベーションの後、該増幅(2896bp)断片をpCR2.1内にクローニングし、TOP10コンピテント細胞内に形質転換した。DNA配列決定は、該ste13::NATR融合体が正確であることを証明した。得られたベクターをそれぞれpGLY5018と命名した。このベクターを図1Cに図示する。
GS5.0グリカンを発現するピチア・パストリス(Pichia pastoris)栄養要求性糖操作細胞系YGLY7406[Δoch1、Δpno1、Δmnn4B、Δbmt2、Δura5、K.lactisおよびM.musculus UDP−GlcNAc輸送体、M.musculus α−1,2−MnsI、H.sapiens β−1,2−GlcNAcトランスフェラーゼI、R.norvegicus β−1,2−GlcNAcトランスフェラーゼII、D.melanogaster MnsII、S.pombe Galエピメラーゼ、D.melanogaster UDP−Gal輸送体およびH.sapiens β−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ](例えば、Bobrowiczら,Glycobiology,14(9):757−766,2004;Hamiltonら,Science,313(5792):14411−1443,2006);米国公開出願第20060040353号を参照されたい)を全ての操作の出発株として使用した。この株および後続の株をどのようにして作製したかに関する流れ図は、図7(A〜C)を参照されたい。GS5.0株は、一方または両方の末端の非還元性末端上のβ−1,4−ガラクトース残基を末端とする二分岐アフコシル化N−結合グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる(Bobrowiczら,Glycobiology,14(9):757−766,2004;Hamiltonら,Science,313(5792):14411−1443,2006)。株YGLY7406は、ジペプチジルペプチダーエ活性に関するレポータータンパク質として使用される、IgG1のFcドメインに融合した完全長ヒト腫瘍壊死因子受容体II(TNFRII−Fc)を発現する。
1% 酵母エキス、2% ペプトン、100mM リン酸カリウムバッファー(pH6.0)、1.34% 酵母窒素ベース、0.00004% ビオチンおよび1% グリセロールからなる増殖培地としての200mlの緩衝化グリセロール−複合培地(BMGY)内でタンパク質発現を26℃で72時間行った。BMGYにおけるグリセロールの代わりに1.5% メタノールからなる20mlの緩衝化メタノール−複合培地(BMMY)内で誘導を48時間行った。
同様に、PpSte13pおよびPpDap2pを排除するための前記実施例に記載されている方法を、PpDppIIIpを排除するために用いることが可能である。1つのそのような方法は、実施例2でPpSTE13およびPpDAP2に関して示されているのに類似した方法でノックアウトベクターを設計することであろう。プライマーは、PpDPPIII遺伝子(図13、配列番号54)の5’および3’フランキング領域を増幅するように設計されるであろう。なぜなら、ゲノム配列の必須領域、例えば、機能的PpDppIIIp活性に必要な領域は省かれるからである。PpDppIIIp活性は、これらのフランキング領域を選択マーカーと組合せることにより排除されうる。適合性選択マーカーとの組合せにより、PpDppIIIp活性は、個々に、あるいはPpSte13pおよび/またはPpDap2活性の排除と共に排除されうる。PpSte13p、PpDap2pおよびPpDppIIIp活性が排除されている株は、いずれかの潜在的ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を欠く株を与えるであろう。
Claims (20)
- ジペプチジルアミノペプチダーゼ(DAP)活性を欠く酵母宿主細胞における組換えタンパク質の製造方法であって、
a.DAP活性が排除されている遺伝的に修飾された酵母細胞を、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドベクターで形質転換し、
b.該タンパク質の発現を誘導する条件下、該形質転換宿主細胞を培養し、
c.該形質転換宿主細胞または培地から該タンパク質を単離することを含む製造方法。 - 該酵母細胞がピチア・パストリス(Pichia pastoris)である、請求項1記載の製造方法。
- 酵母細胞ゲノムからのSTE13およびDAP2遺伝子の欠失または破壊によりDAP活性が排除されている、請求項1または2記載の製造方法。
- 該宿主細胞が、ヒト様N−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、請求項1記載の酵母。
- 該ヒト様N−グリカンが、ハイブリッドおよび複合N−グリカンからなる群から選択される、請求項4記載の酵母。
- Man5GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2、NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2、GlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAc(1−4)Man3GlcNAc2、Gal(1−4)GlcNAc(1−4)Man3GlcNAc2およびNANA(1−4)Gal(1−4)GlcNAc(1−4)Man3GlcNAc2から選択されるN−グリカンを主として有する糖タンパク質を産生するように該宿主細胞が遺伝的に操作されている、請求項1記載の酵母。
- 該酵母が更に、ヒト糖タンパク質を発現する、請求項1記載の製造方法。
- STE13およびDAP2をコードするゲノムDNAが酵母細胞ゲノムから欠失または破壊されている酵母細胞系を含む、ジペプチジルアミノペプチダーゼ(DAP)活性を欠く遺伝的に修飾された酵母細胞。
- 該酵母細胞がピチア・パストリス(Pichia pastoris)である、請求項8記載の酵母細胞。
- 該宿主細胞が、ヒト様N−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、請求項6記載の製造方法。
- 該ヒト様N−グリカンが、ハイブリッドおよび複合N−グリカンからなる群から選択される、請求項10記載の製造方法。
- Man5GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2、NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2、GlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAc(1−4)Man3GlcNAc2、Gal(1−4)GlcNAc(1−4)Man3GlcNAc2およびNANA(1−4)Gal(1−4)GlcNAc(1−4)Man3GlcNAc2から選択されるN−グリカンを主として有する糖タンパク質を産生するように該宿主細胞が遺伝的に操作されている、請求項6記載の製造方法。
- 該タンパク質がヒト糖タンパク質である、請求項6記載の製造方法。
- N末端認識部位Xaa−ProまたはXaa−Ala(ここで、Xaaはいずれかのアミノ酸を表す)を有する治療用タンパク質の、酵母細胞における製造方法であって、
a.DAP活性が排除されている遺伝的に修飾された酵母細胞を、Xaa−ProおよびXaa−Alaからなる群から選択されるN末端認識部位を有する該治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドベクターで形質転換し、
b.該治療用タンパク質の発現を誘導する条件下、該形質転換宿主細胞を培養し、
c.該形質転換宿主細胞から該治療用タンパク質を単離することを含む製造方法。 - 該酵母細胞がピチア・パストリス(Pichia pastoris)である、請求項8記載の製造方法。
- 酵母細胞ゲノムからのSTE13およびDAP2の欠失または破壊によりDAP活性が排除されている、請求項14または15記載の製造方法。
- 該宿主細胞が、ヒト様N−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、請求項14記載の製造方法。
- 該ヒト様N−グリカンが、ハイブリッドおよび複合N−グリカンからなる群から選択される、請求項17記載の製造方法。
- Man5GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2、NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2、GlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAc(1−4)Man3GlcNAc2、Gal(1−4)GlcNAc(1−4)Man3GlcNAc2およびNANA(1−4)Gal(1−4)GlcNAc(1−4)Man3GlcNAc2から選択されるN−グリカンを主として有する糖タンパク質を産生するように該宿主細胞が遺伝的に操作されている、請求項14記載の製造方法。
- 該タンパク質がヒト糖タンパク質である、請求項14記載の製造方法。
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