CN113549560B - 一种用于糖蛋白制备的工程化酵母构建方法及其菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于糖蛋白制备的工程化酵母构建方法及其菌株。本发明提供了一种具有特定哺乳动物细胞糖型修饰能力的酵母工程菌的构建方法，包括：失活受体酵母内源的α‑1,6‑甘露糖转移酶、磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶、β甘露糖转移酶I‑IV、O甘露糖转移酶I；表达外源甘露糖苷酶I、N‑乙酰葡萄糖胺转移酶I、甘露糖苷酶II、N‑乙酰葡萄糖胺转移酶II、半乳糖异构酶和外源半乳糖转移酶。本发明所得酵母工程菌构建周期短、生长快、易于大规模生产、安全性高等特点，使其不仅可用于制备普通糖蛋白疫苗，而且非常适合在突发新型传染病等应急条件下，进行疫苗高效研发和大规模生产。这在医药用途方面具有重要意义。

Description

一种用于糖蛋白制备的工程化酵母构建方法及其菌株
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种用于糖蛋白制备的工程化酵母构建方法及其菌 株。
背景技术
酵母作为重要的重组蛋白表达系统，已广泛用于各种重组蛋白表达。它具有像原核细胞 系统生长快、便于基因操作和可大规模培养等优点，同时又具有真核细胞翻译后加工、能产 生具有生物活性的重组蛋白等特点。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(也称为毕赤酵母)是 近年来发展较快的外源蛋白表达宿主菌。除一般酵母所具有的特点外，毕赤酵母还具有很多优点，如毕赤酵母具有甲醇诱导启动子，可严格调控外源蛋白的表达；外源基因的表达产物 既可存在于胞内，也可分泌至胞外，能高效获取外源基因的产物；表达载体能稳定遗传；可 进行高密度高产量的发酵培养，便于工业化生产等，除此之外，还可进行很多典型的高等真 核生物的蛋白翻译后修饰，如糖基化修饰。
糖基化对蛋白质的正确折叠、稳定性和，至关重要。在人体内，糖基化是影响蛋白质的 药物动力学特性(如组织分布和在血液中的清除)的原因之一(郭振楚，《糖类化学》，化学 工业出版社，2005)。糖蛋白的糖基分为N-糖基和O-糖基两种类型。N-糖链连接在Asn-X-Thr/Ser保守序列中的Asn上(其中的X为除脯氨酸以外的任意氨基酸残基)。O-糖链的结构比N-糖链简单，连接位点比N-糖链多，常出现在丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)上。 糖基化对蛋白质的正确折叠、稳定性和生物活性至关重要。但酵母表达蛋白的糖基化修饰， 常产生过度甘露糖基化，正常的N-糖基修饰，一般每个糖基含10-20个单糖，分子量为 1500-4000。而过度糖基化修饰时，每个糖基可以含数十至上百个甘露糖，分子量为5000至数万，表现为糖蛋白分子量明显增大，而且由于过度糖基化修饰往往不均一，因而糖蛋白分 子量也不均一，SDS-PAGE分析时可出现明显“拖尾”。N-糖基化修饰会发生在其保守的N- 糖基化修饰位点上(N-X-S/T)，但由于O-糖基化修饰没有保守的糖基化位点，一般认为会发 生在富集丝氨酸或苏氨酸的氨基酸上，不同的蛋白是否发生O-糖基化修饰，以及发生在哪一 个氨基酸上，O-糖基化修饰的程度是有所不同的。蛋白的丝氨酸或苏氨酸都可能是O-糖基化的潜在位点，但并不是每一个丝氨酸或苏氨酸都会发生O-糖基化修饰，也并非每一个含有丝 氨酸或苏氨酸的蛋白会发生O-糖基化修饰，不同的蛋白在不同的表达系统中的糖基化修饰也有所不同。而过度甘露糖基化的糖蛋白，在人体中半衰期短、免疫原性高、易被清除。由于 该缺陷，限制了毕赤酵母在大部分糖蛋白类药物生产方面的应用。
发明内容
本发明旨在提供一种具有特定哺乳动物细胞糖型修饰能力的工程化巴斯德毕赤酵母菌 株及其构建方法，要解决的第一个技术问题是构建酵母底盘细胞，需要灭活一系列酵母自身 相关糖基化修饰酶，但因糖基化修饰酶种类繁多，很多糖基修饰的灭活会使酵母死亡，因此这涉及到修饰酶的选择不确定性。要解决的第二个技术问题是在酵母底盘细胞上构建具有特 定哺乳动物细胞糖型修饰能力的工程化毕赤酵母菌株，因真核生物具有糖基化修饰现象(近 年来在原核生物中也发现具有糖基化修饰现象)，因此将糖基化修饰酶引入酵母底盘细胞就存 在多种选择，不同的物种、不同的细胞器定位方式，不同的温度和pH调控方式(因有些生物耐寒、耐热、耐酸、耐碱等等)、不同的生物活性高低，这些因素都需要考虑其中，需要进 行大量的组合实验和分析，通过多年的探索和尝试。本发明提供了一种具有特定哺乳动物细 胞糖型修饰能力的工程化巴斯德毕赤酵母，利用该工程化酵母表达的宿主蛋白的糖型为特定 哺乳动物细胞糖型：GalaGlcNAcbMancGlcNAc2，其中a：0-2个；b：0-2个；c：3-5个(Gal： 半乳糖，GlcNAc：N-乙酰葡萄糖胺；Man：甘露糖)；同时酵母O糖基化修饰现象进一步降 低。
第一方面，本发明要求保护一种具有特定哺乳动物细胞糖型修饰能力的巴斯德毕赤酵母 工程菌的构建方法。
本发明所要求保护的具有特定哺乳动物细胞糖型修饰能力的巴斯德毕赤酵母工程菌的 构建方法，可包括如下步骤：
(A1)失活受体巴斯德毕赤酵母内源的α-1,6-甘露糖转移酶、磷酸甘露糖转移酶、磷酸 甘露糖合成酶、β甘露糖转移酶I、β甘露糖转移酶II、β甘露糖转移酶III和β甘露糖转移酶 IV，得到重组酵母1；
(A2)在所述重组酵母1中表达如下外源蛋白中的至少一种：外源甘露糖苷酶I、外源 N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、外源甘露糖苷酶II、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II、外源半乳糖 异构酶和外源半乳糖转移酶，得到重组酵母2；所述重组酵母2即为具有所述特定哺乳动物细胞糖型修饰能力的酵母工程菌；
所述特定哺乳动物细胞糖型为GalaGlcNAcbMancGlcNAc2，其中a：0-2个；b：0-2个；c： 3-5个(Gal：半乳糖，GlcNAc：N-乙酰葡萄糖胺；Man：甘露糖)。
当灭活α-1,6-甘露糖转移酶、磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶、β甘露糖转移酶 I-IV后，N糖基化修饰明显降低、糖基内环境更趋向于相对“干净”，带来的新问题是：如何降低O糖基化修饰？O糖基化家族成员众多，哪一种酶的灭活可以适用于本发明，并且达到预期效果？我们都知道，N-糖基化修饰会发生在其保守的N-糖基化修饰位点上(N-X-S/T)， 但由于O-糖基化修饰没有保守的糖基化位点，一般认为会发生在富集丝氨酸或苏氨酸的氨基 酸上，不同的蛋白是否发生O-糖基化修饰，以及发生在哪一个氨基酸上，O-糖基化修饰的程度是有所不同的。蛋白的丝氨酸或苏氨酸都可能是O-糖基化的潜在位点，但并不是每一个丝 氨酸或苏氨酸都会发生O-糖基化修饰，也并非每一个含有丝氨酸或苏氨酸的蛋白会发生O- 糖基化修饰，不同的蛋白在不同的表达系统中的糖基化修饰也有所不同。如果发生O-糖基化 修饰，糖链上的糖基则多是甘露糖，虽然糖链比较短，但由于其糖链数量较多，酵母表达蛋 白的表面可能会有大量裸露的甘露糖。这种具有甘露糖化的糖蛋白，在人体中半衰期短、免 疫原性高、易被清除。由于该缺陷，限制了毕赤酵母在大部分蛋白类药物生产方面的应用。
根据O糖基转移酶家族成员的同源性将其分为三个亚科：PMT1亚科、PMT2亚科和PMT4亚科。不同的物种中PMT1亚科、PMT2亚科的成员数目或许不同，共有7个家庭成 员：PMT1\PMT2\PMT3\PMT4\PMT5\PMT6\PMT7。酿酒酵母的PMT1亚科包括 PMT1\PMT5\PMT7，PMT2亚科包括PMT2\PMT3\PMT638。Pmt1p亚科(Pmt1p,Pmt5p)和Pmt2p 亚科(Pmt2p,Pmt3p)成员互相形成异聚双体，Pmt4p会形成同聚双体，而Pmt6p既不能与Pmtp 家族其他成员形成异源双体，也不能和它本身形成同源双体。在野生型酵母中，Pmt1p亚科和Pmt2p亚科成员形成的复合体主要是Pmt1p–Pmt2p和Pmt5p–Pmt3p复合体，也有很少量的 Pmt1p–Pmt3p和Pmt2p–Pmt5p复合体。然而在本发明中，我们发现在α-1,6-甘露糖转移酶灭 活、磷酸甘露糖转移酶灭活、磷酸甘露糖合成酶灭活和β甘露糖转移酶I-IV灭活基础上，进 一步灭活O甘露糖转移酶I，同时表达特定来源的某一型外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡 萄糖胺转移酶I、外源甘露糖苷酶II、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II、外源半乳糖异构酶GalE 和外源半乳糖转移酶GalT，这种组合方式可以显著地降低工程酵母表达的蛋白的O糖基化修 饰，并且获得具有特定哺乳动物细胞糖型。
相应的，所述方法还可包括如下步骤(A3)：
(A3)失活所述重组酵母2内源的O甘露糖转移酶I，得到重组酵母3；所述重组酵母3也为具有所述特定哺乳动物细胞糖型修饰能力的酵母工程菌。
步骤(A3)使得酵母O糖基化修饰现象进一步降低。
当所述特定哺乳动物细胞糖型为Man5GlcNAc2时，步骤(A2)中在所述重组酵母1中表达的外源蛋白为外源甘露糖苷酶I。
当所述特定哺乳动物细胞糖型为GlcNAcMan5GlcNAc2时，步骤(A2)中在所述重组酵母1中表达的外源蛋白为外源甘露糖苷酶I和外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I。
当所述特定哺乳动物细胞糖型为GalGlcNAcMan5GlcNAc2时，步骤(A2)中在所述重组 酵母1中表达的外源蛋白为外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I，以及外源半乳 糖异构酶和外源半乳糖转移酶。
当所述特定哺乳动物细胞糖型为GalGlcNAcMan3GlcNAc2时，步骤(A2)中在所述重组 酵母1中表达的外源蛋白为外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、外源半乳糖异 构酶和外源半乳糖转移酶，以及外源甘露糖苷酶II。
当所述特定哺乳动物细胞糖型为Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2时，步骤(A2)中在所述重 组酵母1中表达的外源蛋白为外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、外源半乳糖 异构酶和外源半乳糖转移酶、外源甘露糖苷酶II，以及外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II。
步骤(A1)和(A3)中，失活上述糖基修饰酶，可以通过突变基因一个或者多个核苷酸序列、或者通过缺失部分或完整基因序列来实现、也可以利用插入核苷酸破坏原有阅读框、 提前终止蛋白质合成等方式来实现失活该基因或该基因编码的蛋白质活性。上述突变、缺失 和插入失活等可以用常规的诱变、敲除等方法获得。这些方法已有许多文献报道，如J.萨姆 布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。也可用本领域已知的其它方法来构建基因失活的酵母菌株。其中较优的菌株是通过敲除甘露糖转移酶基因的部分序列获得 的。该序列至少大于三个碱基，较优的是大于100碱基，更优的是包括50％以上的编码序列。 这种通过敲除糖基修饰酶基因的部分序列获得的菌株不易产生回复突变，菌株的稳定性比利 用点突变等方法构建的稳定性更高，更有利于应用于医疗和工业范围内。
敲除糖基化修饰酶基因的部分序列的方法可以包括：首先构建敲除该基因的质粒：质粒 上包括待敲除基因两侧的同源臂序列，两个同源臂应选择在目标基因两侧，所述同源臂的长 度至少大于200bp，最优的大小在500bp-2000bp。也可以利用插入灭活的方式，获得一个氨 基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，致使没有功能活性的核苷酸 序列，并构建到质粒。质粒上还带有URA3(orotidine-5′-phosphatedecarboxylase)基因、或博莱霉素、或潮霉素B、或Blasticidin或G418等作为筛选标记。编码侧翼区同源臂片段的核 酸多聚核苷酸序列、欲被破坏功能的蛋白的核苷酸序列，可以从公开的美国国立生物技术信 息中心(NCBI)获得。利用PCR方法，以毕赤酵母宿主基因组为模板，获得灭活基因所需的一定长度的侧翼同源区，分别包括目的基因(其序列在NCBI中已经公开)基因编码区上游和 下游侧翼同源区，并在引物部分添加合适的酶切位点。根据序列获得多聚核苷酸可以用本领 域周知的方法，如PCR(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)、RT-PCR方法、人工合成的方法、基因组DNA和构建筛选cDNA文库的方法等获得。若需要 可用本领域公知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入、和与其它多聚核苷酸连接等。 将分别得到的上游(5′)和下游(3′)侧翼区同源臂片段进行融合，在保持各自片段大小不变 的前提下，可以用本领域周知的各种方法，如通过重叠PCR的方法，所用标准的分子克隆过 程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.) 的叙述。可用本领域公知的方法分别将含欲灭活基因同源臂序列融合片段的核酸克隆到各种 适用于酵母的载体中去。或者利用各自同源臂上酶切位点分别插入载体特定区域。所用标准 的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出 版社，1995.)的叙述。构建重组敲除质粒。原始质粒可以选用适于酵母的表达载体、穿梭载体，可以带有复制位点，筛选标记，营养缺陷型标记(URA3,HIS,ADE1,LEU2,ARG4)等， 这些载体的构建方法已在许多文献公开(如J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版， 科学出版社，1995)，也可以从各种公司购得(如Invitrogen life technologies,Carlsbad, California 92008,USA)，优先的载体有pPICZαA、pYES2酵母表达载体。灭活载体都是穿梭 质粒，先在大肠杆菌中复制扩增，然后被导入宿主酵母细胞，载体应该带有抗性标记基因，或者营养缺陷型标记基因，以利于后期转化子的筛选。
将欲灭活基因两侧同源区(上游称之为5′臂，下游称之为3′臂)分别构建至酵母载体， 形成重组敲除载体。进一步利用同源臂的线性化位点线性化敲除载体，通过电转化方法，转 化至毕赤酵母或其改构体中的一种，进行培养。转化所需核酸至宿主细胞中去可用通常方法得到，如制备感受态细胞、电穿孔、醋酸锂法等(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》， 科学出版社，2000)。成功转化的细胞，即含有欲敲除基因的同源区的细胞，可以通过人们熟 知的技术加以鉴定，如细胞经收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鉴定基因型；而之前 选择正确的表型可以通过营养缺陷型或者抗性标记的筛选而得以实现。一次重组正确的转化 子，经过在酵母基本培养基培养后，涂布在含尿嘧啶的5-氟乳清酸平板等二次重组筛选平板， 长出的克隆，再进一步进行基因型的PCR鉴定。分别筛选到正确的缺失了预期的基因编码区 的转化子。
在本发明的具体实施方式中，步骤(A1)中，所述失活受体巴斯德毕赤酵母内源的α-1,6- 甘露糖转移酶、磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶、β甘露糖转移酶I、β甘露糖转移酶 II、β甘露糖转移酶III和β甘露糖转移酶IV均是采用同源重组的方式进行基因敲除。
在本发明的具体实施方式中，步骤(A2)中，在所述重组酵母1中表达所述外源蛋白是 通过向所述重组酵母1中导入所述外源蛋白的编码基因实现的。
进一步地，所述外源蛋白的编码基因是以重组载体的形式导入所述重组酵母1中的。
进一步地，所述外源甘露糖苷酶I的编码基因和所述外源甘露糖苷酶II的编码基因均向 所述重组酵母1中导入两次。
在本发明的具体实施方式中，步骤(A3)中，失活所述重组酵母2内源的O甘露糖转移酶I，本发明没有按照传统敲除基因的方式，而是巧妙的通过对所述重组酵母2的基因组DNA中的O甘露糖转移酶I编码基因进行插入失活(通过插入灭活的方式破坏其相应的核苷酸序列)实现的。
在本发明中，具体是在所述重组酵母2的基因组DNA中的O甘露糖转移酶I编码基因的靶标片段的前端和末端各装上不同组合的终止密码子，并且在末端的终止密码子之后装上 终止子(如CYC1TT终止子)。前端和末端各装上不同组合的终止密码子后的所述靶标片段具体为以毕赤酵母JC308的基因组DNA为模板，利用引物PMT1-IN-5和PMT1-IN-3进行PCR扩增所得的片段。
PMT1-IN-5：5’-tctatgcattaatgatagttaatgactaatagagtaaaacaagtcctcaagaggt-3’；
PMT1-IN-3：5’-tgacataactaattacatgatctattagtcattaactatcattagatcagagtggggacgactaagaaa gc-3’。
接下来的技术问题是在酵母底盘细胞中构建具有哺乳动物细胞糖型修饰能力的工程化 毕赤酵母菌株，参与哺乳动物细胞糖基修饰的糖基修饰酶繁多复杂，什么样的酶修饰会获得什么样的糖型？以及获得糖型的比例组合在未研究之前都不得而知。本发明通过以下技术方法来实现：
所述外源甘露糖苷酶I来源于绿色木霉，且C端融合内质网保留信号HDEL。
所述外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I可以是来源于哺乳动物等的N-乙酰葡萄糖胺转移酶 I，如人N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(GenBank NO NM 002406)、白色念珠菌N-乙酰葡萄糖胺转 移酶I(GenBank NO NW_139513.1)、盘基网柄菌N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(GenBank NONC_007088.5)等等，可以在N-端或C-端融合内质网或内侧高尔基体定位信号，如ScGLS、ScMNS1、PpSEC12、ScMNN9等等；优选的为来源于人，且含有mnn9定位信号；
所述外源甘露糖苷酶II可以是来源于丝状真菌、植物、昆虫、爪哇、哺乳动物等的甘露 糖苷酶II，如果蝇甘露糖苷酶II(GenBank NOX77652)、线虫甘露糖苷酶II(GenBankNO NM 0735941)、人甘露糖苷酶II(GenBank NO U31520)等等；表达的甘露糖苷酶II可以在N- 端或C-端融合内质网或内侧高尔基体定位信号，如ScGLS、ScMNS1、PpSEC12、ScMNN9 等等，优选的为来源于线虫，含有mnn2定位信号；
外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II，可以是来源于哺乳动物等的N-乙酰葡萄糖胺转移酶II， 如人N-乙酰葡萄糖胺转移酶II(GenBank NO Q10469)、鼠N-乙酰葡萄糖胺转移酶II(GenBank NO Q09326)等等；表达的N-乙酰葡萄糖胺转移酶II可以在N-端或C-端融合内质网或内侧 高尔基体定位信号，如ScGLS、ScMNS1、PpSEC12、ScMNN9等等，优选的为来源于人，含有mnn2定位信号；
所述甘露糖苷酶II和所述N-乙酰葡萄糖胺转移酶II均含有mnn2定位信号；
所述半乳糖异构酶和所述半乳糖转移酶为融合蛋白，选择均来源于人，且共用一个kre2 定位信号。
半乳糖转移酶可以是来源于哺乳动物等的半乳糖转移酶，如人β-1,4-半乳糖转移酶 (GenBank NO gi:13929461)、鼠β-1,4-半乳糖转移酶GenBank NO NC_000081.6)等等。表达的 半乳糖转移酶可以在N-端或C-端融合内质网或内侧高尔基体定位信号，如ScKRE2、ScGLS、 ScMNS1、PpSEC12、ScMNN9等等，本发明实施例半乳糖转移酶来源于人，且共有一个kre2 定位信号；
所述α-1,6-甘露糖转移酶可为如下B1)或B2)：
B1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
B2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有99％以上、95％ 以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
所述磷酸甘露糖转移酶可为如下B3)或B4)：
B3)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
B4)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有99％以上、95％ 以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
所述磷酸甘露糖合成酶可为如下B5)或B6)：
B5)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；
B6)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有99％以上、95％ 以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
所述β甘露糖转移酶I可为如下B7)或B8)：
B7)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
B8)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列具有99％以上、95％ 以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
所述β甘露糖转移酶II可为如下B9)或B10)：
B9)氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质；
B10)将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.5所示的氨基酸序列具有99％以上、95％ 以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
所述β甘露糖转移酶III可为如下B11)或B12)：
B11)氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质；
B12)将SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.6所示的氨基酸序列具有99％以上、95％ 以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
所述β甘露糖转移酶IV可为如下B13)或B14)：
B13)氨基酸序列是SEQ ID No.7的蛋白质；
B14)将SEQ ID No.7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.7所示的氨基酸序列具有99％以上、95％ 以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
所述O甘露糖转移酶I可为如下B15)或B16)：
B15)氨基酸序列是SEQ ID No.8的蛋白质；
B16)将SEQ ID No.8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.8所示的氨基酸序列具有99％以上、95％ 以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
所述外源甘露糖苷酶I可为如下B17)或B18)：
B17)氨基酸序列是SEQ ID No.9的蛋白质；
B18)将SEQ ID No.9所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.9所示的氨基酸序列具有99％以上、95％ 以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
所述外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I可为如下B19)或B20)：
B19)氨基酸序列是SEQ ID No.10的蛋白质；
B20)将SEQ ID No.10所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.10所示的氨基酸序列具有99％以上、95％ 以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
由所述半乳糖异构酶和所述半乳糖转移酶组成的所述融合蛋白可为如下B21)或B22)：
B21)氨基酸序列是SEQ ID No.11的蛋白质；
B22)将SEQ ID No.11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.11所示的氨基酸序列具有99％以上、95％ 以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
所述甘露糖苷酶II可为如下B23)或B24)：
B23)氨基酸序列是SEQ ID No.12的蛋白质；
B24)将SEQ ID No.12所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.12所示的氨基酸序列具有99％以上、95％ 以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
所述N-乙酰葡萄糖胺转移酶II可为如下B25)或B26)：
B25)氨基酸序列是SEQ ID No.13的蛋白质；
B26)将SEQ ID No.13所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.13所示的氨基酸序列具有99％以上、95％ 以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
所述外源甘露糖苷酶I的编码基因可为如下C1)或C2)：
C1)核苷酸序列是SEQ ID No.14的DNA分子；
C2)与SEQ ID No.14所示的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上 或者80％以上同源性且编码所述外源甘露糖苷酶I的DNA分子，或在严格条件下与C1)限 定的DNA分子杂交且编码所述外源甘露糖苷酶I的DNA分子。
所述外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I的编码基因可为如下C3)或C4)：
C3)核苷酸序列是SEQ ID No.15的DNA分子；
C4)与SEQ ID No.15所示的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上 或者80％以上同源性且编码所述外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I的DNA分子，或在严格条件 下与C3)限定的DNA分子杂交且编码所述外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I的DNA分子。
由所述半乳糖异构酶和所述半乳糖转移酶组成的所述融合蛋白的编码基因可为如下C5) 或C6)：
C5)核苷酸序列是SEQ ID No.16的DNA分子；
C6)与SEQ ID No.16所示的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上 或者80％以上同源性且编码所述融合蛋白的DNA分子，或在严格条件下与C5)限定的DNA 分子杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子。
所述甘露糖苷酶II的编码基因可为如下C7)或C8)：
C7)核苷酸序列是SEQ ID No.17的DNA分子；
C8)与SEQ ID No.17所示的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上 或者80％以上同源性且编码所述甘露糖苷酶II的DNA分子，或在严格条件下与C7)限定的DNA分子杂交且编码所述甘露糖苷酶II的DNA分子。
所述N-乙酰葡萄糖胺转移酶II的编码基因可为如下C9)或C10)：
C9)核苷酸序列是SEQ ID No.18的DNA分子；
C10)与SEQ ID No.18所示的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以 上或者80％以上同源性且编码所述N-乙酰葡萄糖胺转移酶II的DNA分子，或在严格条件下 与C9)限定的DNA分子杂交且编码所述N-乙酰葡萄糖胺转移酶II的DNA分子。
上述蛋白质中，同源性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站 点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1 中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用 BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置 为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述基因中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点 测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中， 通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62 作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和 0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质和基因中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。 所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性 可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、 83％、84％的同一性。
上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂 洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃， 0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的 混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为： 在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC， 0.1％SDS各洗膜一次。
本发明所有糖基修饰酶相关信息都可以在美国国立生物技术信息中心(NCBI)或者公开 的文献中获得，相关酶的功能、定义也可以在文献中获得。即使是同一种菌或物种，由于来 源不同等，各种酶的氨基酸会略有差别，但其功能基本相同，因此，本发明所述酶也可包括 这些变异体。
第二方面，本发明要求保护利用前文第一方面所述方法构建得到的巴斯德毕赤酵母工程 菌。
进一步地，所述巴斯德毕赤酵母工程菌为在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心保藏的保藏编号为CGMCCNo.19488的菌株。
第三方面，本发明要求保护前文第二方面所述的巴斯德毕赤酵母工程菌在制备修饰有所 述特定哺乳动物细胞糖型的目的蛋白中的应用。
第四方面，本发明要求保护一种制备修饰有所述特定哺乳动物细胞糖型的目的蛋白的方 法。
本发明所要求保护的制备修饰有所述特定哺乳动物细胞糖型的目的蛋白的方法，可包括 如下步骤：在前文第二方面所述的巴斯德毕赤酵母工程菌中表达所述目的蛋白，得到重组酵 母工程菌；培养所述重组酵母工程菌，制备具有所述特定哺乳动物细胞糖型的目的蛋白。
在本发明的具体实施方式中，所述目的蛋白具体为抗Her2抗体。
本发明的实验证明，本发明获得的巴斯德毕赤酵母工程菌株，其自身N-糖基和O-糖基 降低，且其具有动物细胞糖型修饰能力，这个工程酵母菌株制备的糖蛋白避免了真菌型糖基 化修饰可能引起过敏等问题，工程化巴斯德毕赤酵母菌株构建周期短、生长快、易于大规模 生产、安全性高等特点，使其不仅可用于制备普通糖蛋白疫苗，而且非常适合在突发新型传染病等应急条件下，进行疫苗高效研发和大规模生产。这在医药用途方面具有重要意义。
保藏说明
菌株拉丁名：Pichia pastoris
参椐的生物材料：GJK30
建议的分类命名：巴斯德毕赤酵母
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2020年03月18日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.19488
附图说明
图1为GJK01菌中och1基因的鉴定以及糖型分析结果。A为och1基因鉴定结果。M代表Marker；1：GJK01菌(已敲除och1)；2：X33菌(未敲除och1)。B为GJK01菌(敲除 och1)表达的抗体的DSA-FACE糖型分析结果。
图2为pno1基因鉴定结果。M代表Marker；1：GJK02菌(已敲除pno1)；2：X33菌 (未敲除pno1)。
图3为mnn4b基因鉴定结果。M代表Marker；1：GJK03菌(已敲除mnn4b)；2：X33 菌(未敲除mnn4b)。
图4为GJK01、GJK02、GJK03菌(已敲除och1、pno1、mnn4b)的DSA-FACE糖型分 析结果。
图5为ARM2基因鉴定结果。M代表Marker；1：GJK04菌(已敲除ARM2)；2：X33 菌(未敲除ARM2)。
图6为ARM1基因鉴定结果。M代表Marker；1：GJK05菌(已敲除ARM1)；2：X33 菌(未敲除ARM1)。
图7为ARM3基因鉴定结果。M代表Marker；1：GJK07菌(已敲除ARM3)；2：X33 菌(未敲除ARM3)。
图8为ARM4基因鉴定结果。M代表Marker；1：GJK18菌(已敲除ARM4)；2：X33 菌(未敲除ARM4)。
图9为GJK18菌的DSA-FACE糖型分析结果。
图10为W10菌的TrmdsI基因鉴定结果和DSA-FACE糖型分析结果。A为TrmdsI基因鉴定结果。M代表Marker；1：W10菌中导入TrmdsI；X33菌中无TrmdsI。B为W10菌的 DSA-FACE糖型分析结果。
图11为1-8菌的GnTI基因鉴定结果和DSA-FACE糖型分析结果。A为GnTI基因鉴定结果。M代表Marker；1：1-8菌中导入GnTI；2：X33菌中无GnTI。B为1-8菌的DSA-FACE 糖型分析结果。
图12为1-8-4菌的GalE-GalT基因鉴定结果和DSA-FACE糖型分析结果。A为GalE-GalT 基因鉴定结果。M代表Marker；1：1-8-4菌中导入GalE-GalT；2：X33菌中无GalE-GalT。B为1-8-4菌的DSA-FACE糖型分析结果。
图13为52-60和150L2菌的mdsII基因、GnTII基因鉴定结果和DSA-FACE糖型分析结果。A为MdsII基因鉴定结果。M代表Marker；1：52-60菌中导入MdsII；2：X33菌中无 MdsII。B为GnTII基因鉴定结果。M代表Marker；1：150L2菌中导入GnTII；2：X33菌中 无GnTII。C为52-60菌的DSA-FACE糖型分析结果。
图14为PMT1插入失活基因鉴定结果。M代表Marker；1：X33菌PMT1未失活；2： GJK30(PMT1失活)。
图15为GJK30工程菌的糖型结构分析结果。A为前期Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2结构低于50％；B为GJK30工程菌获得的Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2结构所占糖型比例大于60％；C为通过糖苷酶(New England Biolabs，Beijing)对该糖型进行酶切分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人通 常理解的相同的意思。示例性的方法和材料描述如下，虽然与本文描述的类似或等同的方法 和材料也可以用于实施本发明，这对本领域技术人员来说是显而易见的。本文提及的所有出版物和其它参考文献都以引用的方式引入其全文.在不一致的情况下，以本说明书，包括定义， 为准。材料，方法和实施例仅是举例说明而不是进行限制。
pPICZαA、pYES2载体、X33、GS115毕赤酵母为Invitrogen公司产品。
毕赤酵母GJK01 CGMCC No.1853(记载发明专利ZL200610164912.8中，公开号为CN101195809，为失活了α-1,6-甘露糖转移酶的毕赤酵母。
实验中所使用的Pyrobest酶、LA Taq酶、dNTPs、限制性内切酶、T4连接酶等购自大连 宝生物工程有限公司，pfu酶、试剂盒、DH5α感受态细胞为北京全式金有限公司产品。全基 因合成、核苷酸合成、引物合成、测序等由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。
下述实施例中所涉及的相关修饰酶的序列信息如表1所示。
表1本发明所涉及的相关修饰酶
实施例1、构建具有特定哺乳动物细胞糖型修饰能力的工程化巴斯德毕赤酵母
一、磷酸甘露糖转移酶基因灭活的酵母菌株构建
本发明采用的基础菌株为我们前期构建的GJK01菌株，保藏号为CGMCC No.1853，菌 株授权专利号：ZL200610164912.8。该菌株为α-1,6-甘露糖转移酶灭活的毕赤酵母菌株。α-1,6- 甘露糖转移酶(OCH1)的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
磷酸甘露糖转移酶基因灭活的酵母菌株GJK02为将毕赤酵母GJK01中编码SEQ IDNo.2 所示磷酸甘露糖转移酶的DNA分子部分敲除而获得，即敲除GJK01酵母基因组中的磷酸甘 露糖转移酶基因，得到的重组酵母。
1、构建磷酸甘露糖转移酶基因灭活载体
用于敲除甘露糖转移酶(PNO1)基因的敲除质粒pYES2-pno1为将甘露糖转移酶(PNO1) 对应的基因片段(SEQ ID No.20)插入载体pYES2的KpnI和XbaI酶切位点间得到的载体。 其中SEQ ID No.20自5’末端第7-1006位核苷酸为敲除甘露糖转移酶(PNO1)基因片段的上 游同源臂；SEQ ID No.20自5’末端第1015-2017位核苷酸为敲除甘露糖转移酶(PNO1)基因 片段的下游同源臂。
具体如下：
用玻璃珠制备法(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)提取 毕赤酵母X33的基因组DNA，以该基因组DNA为模板扩增甘露糖转移酶(PNO1)基因两 侧的同源臂，PNO1两侧的同源臂分别约为1kb，中间缺失约1.4kb的编码基因。
扩增pno1上游侧翼区同源臂(PNO1 5′同源臂)所用的引物为PNO-5-5和PNO-5-3，引 物序列分别为：
5′-AGTGGTACCGCAGTTTAATCATAGCCCACTGC-3′(划线部分为Kpn I识别位点)；
5′-ATTCCAATACCAAGAAAGTAAAGTgcggccgcAAGTGGAACTGGCGCACCGGT-3′ (划线部分为Not I识别位点)。
扩增PNO1下游侧翼区同源臂(PNO13′同源臂)所用的引物为PNO-3-5和PNO-3-3，引物序列分别为：
5′-ACCGGTGCGCCAGTTCCACTTgcggccgcACTTTACTTTCTTGGTATTGGAAT-3′(划线 部分为Not I识别位点)；
5′-TGTTCTAGATCCGAGATTTTGCGCTATGGAGC-3′(划线部分为Xba I识别位点)。
两个同源臂的PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸1min30sec进行30次循环，最后72℃延伸10min；目的片段大小在1kb左 右。将PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收(购自鼎国生物技术有限公司，北京)。 利用重叠延伸PCR的方法融合PNO1 5′同源臂和3′同源臂(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995)，以PNO1 5′同源臂和3′同源臂PCR产物为模 板，以PNO-5-5/PNO-3-3为引物，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性1min、 55℃复性1min、72℃延伸3min30sec进行30次循环，最后72℃延伸10min；目的片段大小 在2kb左右。PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。
Kpn I/Xba I双酶切(本试验所用的限制性内切酶均来自宝生物工程有限公司，大连)PCR 产物，酶切后产物插入同样双酶切处理的载体pYES2(Invitrogen Corp.USA)中，T4连接酶 16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上筛选阳性克 隆。用Kpn I/Xba I双酶切鉴定阳性克隆的质粒，得到4200bp左右和2000bp左右片段的重组 载体命名为pYES2-pno1，即为用于敲除甘露糖转移酶(PNO1)基因的敲除质粒，pno1基因 上下游同源臂并经最终测序验证正确。
2、敲除质粒对毕赤酵母的转化
采用电转化法将敲除质粒pYES2-pno1转化入毕赤酵母GJK01(记载发明专利ZL200610164912.8中，公开号为CN101195809)中，电转化的方法为本领域所共知的(如 A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)。电转化前，先将敲除质粒用 5’同源臂上游BamH I酶切位点线性化，然后电转入制备好的感受态细胞中，涂布于含有精氨酸和组氨酸的MD培养基(YNB 1.34g/100mL，生物素4×10-5g/100mL，葡萄糖2g/100mL， 琼脂1.5g/100mL，精氨酸100mg/ml，组氨酸100mg/ml)上。待培养基上长出克隆后，随机 挑取几个克隆提取基因组，通过PCR的方法鉴定敲除质粒是否正确整合到了染色体上的目标 位点，PCR反应所用的两对引物分别是：PNO1基因5’同源臂外的引物序列PNO-5-5OUT： 5′-GCAGTTTAATCATAGCCCACTGCTA-3′和载体上的引物序列inner01： 5′-AGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCA-3′。PCR反应所用的酶为rTaq(宝生物工程有限公 司)，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延 伸3min进行30次循环，最后72延伸10min。通过凝胶电泳分析PCR产物条带的大小，引物所扩增的条带在2.3kb左右为阳性克隆。
3、PCR鉴定阳性工程菌株
将其中一个阳性克隆接种于YPD培养基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖)中，25℃摇床培养12小时后，将菌液涂布于腺嘌呤缺陷的5-FOA培养基(YNB 1.34g/100mL，生物素4×10-5g/100mL，葡萄糖2g/100mL，琼脂1.5g/100mL，精氨酸100mg/ml, 组氨酸100mg/ml，尿嘧啶100mg/ml，5-FOA 0.1％)(其中，YNB，为无氨基酸酵母氮源， 为北京欣经科生物技术有限公司产品，5-FOA为5-氟尿嘧啶，来自Sigma-aldrich P.O.BOX14508,St.Louis,MO 63178 USA)，置于25℃培养。
待5-FOA培养基上长出克隆后，提取这些克隆的基因组，进行PCR鉴定：以基因组为模板，鉴定引物为染色体上pno1基因同源臂外的序列PNO1-ORF01和PNO1-ORF02，引物 序列分别为：
PNO1-ORF01：5′-GGGAAAGAAAACCTTCAATTT-3′；
PNO1-ORF02：5′-TACAAGCCAGTTTCGCAATAA-3′。
同时将以野生型X33菌株(Invitrogen公司)的基因组为模板的PCR反应体系设为对照。 PCR反应所用的酶为LA Taq(宝生物工程有限公司)，PCR扩增条件如下：94℃变性5min 后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸3min进行30次循环，最后72延伸10min。
为了鉴定α-1,6-甘露糖转移酶是否敲除，本发明在获得GJK01工程菌后引入了一个报告 蛋白，本发明以抗Her2抗体为报告蛋白，抗Her2抗体的表达载体的构建方法、载体转化方 法已经在申请专利中公开(公开号：CN101748145A)。利用该方法将抗Her2抗体表达载体转 入至GJK01宿主菌中，获得了表达抗Her2抗体的GJK01-HL工程菌株。DSA-FACE糖型分 析方法已经公开报道“刘波,等.一种利用DSA-FACE分析寡糖链的方法.生物技术通讯.2008.19(6).885-888”
将产物进行琼脂糖凝胶电泳。图1中A为GJK01宿主菌的鉴定结果；图1中B为GJK01-HL 菌(敲除och1)的DSA-FACE糖型分析结果所示。图2中泳道1为PON1缺陷型，泳道2为 野生型；以野生型X33菌株基因组为模板的PCR产物大小在490bp左右，PON1缺陷型工程 菌无扩增条带，也证明了PNO1基因的丢失，磷酸甘露糖转移酶敲除的菌株构建正确，命名 为GJK02，为磷酸甘露糖转移酶敲除的重组毕赤酵母菌。
二、磷酸甘露糖合成酶基因灭活的酵母菌株构建
磷酸甘露糖合成酶基因灭活的酵母菌株GJK03为将毕赤酵母GJK02中编码SEQ IDNo.3 所示磷酸甘露糖合成酶的DNA分子部分敲除而获得，即敲除GJK02酵母基因组中的磷酸甘 露糖合成酶基因，得到的重组酵母；即该酵母的α-1,6-甘露糖转移酶、磷酸甘露糖转移酶和 磷酸甘露糖合成酶灭活。
构建载体的方法与步骤一相同。
1、构建磷酸甘露糖合成酶基因灭活载体
用于敲除磷酸甘露糖合成酶基因的敲除质粒pYES2-MNN4B为将磷酸甘露糖合成酶对应 的欲敲除除基因片段的上下游同源臂插入载体pYES2的Stu I和Spe I酶切位点间得到的载体。
利用同上述一的方法，用玻璃珠制备法提取毕赤酵母X33的基因组DNA，以该基因组 DNA为模板扩增敲除甘露糖合成酶(MNN4B)基因片段，MNN4B两侧的同源臂分别约为1kb，中间缺失约1kb的编码基因。
扩增MNN4B上游侧翼区同源臂(ARM25′同源臂)所用的引物为MNN4B-5-5和 MNN4B-5-3，引物序列分别为：
5′-AGTAGGCCTTTCAACGAGTGACCAATGTAGA-3′(划线部分为Stu I识别位点)；
5′-TATCTCCATAGTTTCTAAGCAGGGCGGCCGCAATATGTGCGGTGTAGGGAGAAA-3 ′(划线部分为Not I识别位点)。
扩增MNN4B下游侧翼区同源臂(MNN4B 3′同源臂)所用的引物为MNN4B-3-5和MNN4B-3-3，引物序列分别为：
5′-TTTCTCCCTACACCGCACATATTGCGGCCGCCCTGCTTAGAAACTATGGAGATA-3′ (划线部分为Not I识别位点)；
5′-TGTACTAGTTGAAGACGTCCCCTTTGAACA-3′(划线部分为Spe I识别位点)。
两个同源臂的PCR扩增条件、回收方法、以及酶切方法都同步骤1，最终构建获得pYES2-MNN4B敲除载体，并经最终测序验证正确。
2、敲除质粒对毕赤酵母的转化
敲除质粒采用电转化法将敲除质粒转化入上述一构建的毕赤酵母工程菌株GJK02中，电 转化的方法、鉴定方法同步骤一。
PCR反应所用的两对引物分别是：mnn4b基因5’同源臂外的引物序列MNN4B-5-5OUT： 5′-TAGTCCAAGTACGAAACGACACTA-3′和载体上的引物序列inner01： 5′-AGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCA-3′，引物所扩增的条带在2kb左右为阳性克隆。
3、PCR鉴定阳性工程菌株
将其中一个阳性克隆接种于5-FOA培养基(配方同前)上长出克隆后，提取这些克隆的 基因组，进行PCR鉴定：以基因组为模板，鉴定引物为染色体上mnn4b基因同源臂外的序 列MNN4B-ORF01和MNN4B-ORF02，引物序列：
MNN4B-ORF01：5'-AAAACTATCCAATGAGGGTCTC-3'；
MNN4B-ORF02：5'-TCTTCAATGTCTTTAACGGTGT-3'。
以阳性克隆基因组DNA为模板，利用引物MNN4B-ORF01和MNN4B-ORF02进行PCR 扩增。结果如图3所示，泳道1为MNN4B缺陷型，泳道2为野生型；以野生型X33菌株基 因组为模板的PCR产物大小在912bp左右，MNN4缺陷型工程菌无扩增条带，也证明了磷酸 甘露糖合成酶敲除的，命名为GJK03，为磷酸甘露糖转移酶和磷酸甘露糖合成酶敲除的重组 毕赤酵母菌。
GJK02、GJK03菌(已敲除och1、pno1、mnn4b)的DSA-FACE糖型分析结果(方法同 实施例一中所述)如图4所示，可见pno1、mnn4b敲除后糖型中的磷酸甘露糖部分被去除了。
三、β甘露糖转移酶基因ARM2灭活的酵母菌株构建
磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶ARM2(即β甘露糖转移酶II) 基因灭活的酵母菌株GJK04为毕赤酵母GJK03中编码SEQ ID No.5所示β甘露糖转移酶ARM2的DNA分子部分敲除而获得，即敲除GJK03酵母基因组中的β甘露糖转移酶ARM2 基因，得到的重组酵母；即酵母基因组中的α-1,6-甘露糖转移酶、磷酸甘露糖转移酶基因、 磷酸甘露糖合成酶基因和β甘露糖转移酶ARM2已被灭活。
1、构建β甘露糖转移酶ARM2基因灭活载体
载体构建方法同步骤一，具体如下：
利用同上述一的方法，用玻璃珠制备法提取毕赤酵母X33的基因组DNA，以该基因组 DNA为模板扩增β甘露糖转移酶(ARM2)基因两侧的同源臂，ARM2两侧的同源臂分别约 为0.6kb，中间缺失约0.6kb的编码基因。
扩增ARM2上游侧翼区同源臂(ARM2 5′同源臂)所用的引物为ARM2-5-5和ARM2-5-3， 引物序列分别为：
5′-ActTGGTACCACACGACTCAACTTCCTGCTGCTC-3′(划线部分为Kpn I识别位点)；
5′-actGCGGCCGCCACGAAACTTCTTACCTTTGACAA-3′(划线部分为Not I识别位 点)。
扩增ARM2下游侧翼区同源臂(ARM23′同源臂)所用的引物为ARM2-3-5和ARM2-3-3，引物序列分别为：
5′-TTGTCAAAGGTAAGAAGTTTCGTGGCGGCCGCTATCTTGACATTGTCATTCAGTG A-3′(划线部分为Not I识别位点)；
5′-caaTCTAGAGCCTCCTTCTTTTCCGCCT-3′(划线部分为Xba I识别位点)。
2、敲除质粒对毕赤酵母的转化
敲除质粒采用电转化法将敲除质粒转化入上述一构建的毕赤酵母工程菌株GJK03中，电 转化的方法、鉴定方法同上述一。
PCR反应所用的两对引物分别是：ARM2基因5’同源臂外的引物序列ARM2-5-5OUT：5′-TTTTCCTCAAGCCTTCAAAGACAG-3′和载体上的引物序列inner01： 5′-AGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCA-3′，引物所扩增的条带在0.8kb左右为阳性克隆。
3、PCR鉴定阳性工程菌株
将其中一个阳性克隆接种于5-FOA培养基(配方同前)上长出克隆后，提取这些克隆的 基因组，进行PCR鉴定：以基因组为模板，鉴定引物为染色体上ARM2基因同源臂外的序列Arm-ORF01和Arm-ORF02，引物序列：
Arm2-ORF-09：5'-gggcagaagatcctagag-3'；
Arm2-ORF-10：5'-tcgtctccattgctatctacgact-3'。
以阳性克隆基因组DNA为模板，用引物Arm2-ORF-09和Arm2-ORF-10进行PCR扩增，结果如图5所示，泳道1为ARM2缺陷型，泳道2为野生型；结果以野生型X33菌株基因组 为模板的PCR产物大小在600bp左右，ARM2缺陷型工程菌无扩增条带，也证明了β甘露糖 转移酶(ARM2)敲除的，命名为GJK04，为磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘 露糖转移酶II(ARM2)基因敲除的重组毕赤酵母菌。
四、β甘露糖转移酶ARM1、ARM3、ARM4基因灭活的酵母菌株构建
根据上述步骤一至三，同β甘露糖转移酶基因ARM2灭活的酵母菌株构建的设计方法和 构建过程，在GJK04工程菌的基础上先后敲除β甘露糖转移酶ARM1、ARM3、ARM4(即 β甘露糖转移酶I、III和IV，氨基酸序列分别为SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7)， 分别构建获得GJK05、GJK07、GJK18工程菌株。
1、构建β甘露糖转移酶ARM1、ARM3、ARM4基因灭活载体
载体构建方法同步骤三，差别之处在于：
扩增ARM1上游侧翼区同源臂(ARM1 5′同源臂)所用的引物为ARM1-5-5和ARM1-5-3， 引物序列分别为：
ARM1-5-5：5'-TCAACGCGTTGGCTCTGGATCGTTCTAATA-3'(划线部分为MluI识别 位点)；
ARM1-5-3：5'-ttctccgttctcctttctccgtGCGGCCGCcagcagcaaggaagataccaa-3'(划线部分为NotI 识别位点)。
扩增ARM1下游侧翼区同源臂(ARM1 3′同源臂)所用的引物为ARM1-3-5和ARM1-3-3， 引物序列分别为：
ARM1-3-5：5'-ttggtatcttccttgctgctgGCGGCCGCacggagaaaggagaacggagaa-3'(划线部分为 NotI识别位点)；
ARM1-3-3：5'-TCAACGCGTTGGCTGGAGGTGACAGAGGAA-3'(划线部分为MluI识 别位点)。
扩增ARM3上游侧翼区同源臂(ARM3 5′同源臂)所用的引物为ARM3-5-5和ARM3-5-3， 引物序列分别为：
ARM3-5-5：5'-TCAACGCGTTAGTAGTGCCGTGCCAAGTAGCG-3'(划线部分为MluI 识别位点)；
ARM3-5-3：5'-tcctactttgcttatcatctgccGCGGCCGCggtcaggccctcttatggttgtg-3'(划线部分为 NotI识别位点)。
扩增ARM3下游侧翼区同源臂(ARM3 3′同源臂)所用的引物为ARM3-3-5和ARM3-3-3， 引物序列分别为：
ARM3-3-5：5'-_cacaaccataagagggcctgaccGCGGCCGCggcagatgataagcaaagtagga-3'(划线部分 为NotI识别位点)；
ARM3-3-3：5'-TCAACGCGTCATAGGTAATGGCACAGGGATAG-3'(划线部分为MluI 识别位点)。
扩增ARM4上游侧翼区同源臂(ARM4 5′同源臂)所用的引物为ARM4-5-5和ARM4-5-3， 引物序列分别为：
ARM4-5-5：5'-TCAACGCGTGCAGCGTTTACGAATAGTGTCC-3'(划线部分为MluI识 别位点)；
ARM4-5-3：5'-gcatagggctgaagcatactgtGCGGCCGCaatgatatgtacgttcccaaga-3'(划线部分为 NotI识别位点)。
扩增ARM4下游侧翼区同源臂(ARM4 3′同源臂)所用的引物为ARM4-3-5和ARM4-3-3， 引物序列分别为：
ARM4-3-5：5'-tcttgggaacgtacatatcattGCGGCCGCacagtatgcttcagccctatgc-3'(划线部分为NotI 识别位点)；
ARM4-3-3：5'-TCAACGCGTGAGGTGGACAAGAGTTCAACAAAG-3'(划线部分为MluI 识别位点)。
2、敲除质粒对毕赤酵母的转化
同步骤三，差别之处在于，PCR反应所用的两对引物分别是：
ARM1基因5’同源臂外的引物序列ARM1-5-5OUT：5′-GTTCTGGTATGCGTTCTA TTCTTC-3′和载体上的引物序列inner01：5′-AGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCA-3′，引物 所扩增的条带在3.5kb左右为阳性克隆。
ARM3基因5’同源臂外的引物序列ARM3-5-5OUT：5′-TATTTGCCTTCTTCACCGT TAT-3′和载体上的引物序列inner01：5′-AGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCA-3′，引物所扩增的条 带在3.7kb左右为阳性克隆。
ARM4基因5’同源臂外的引物序列ARM4-5-5OUT：5′-TCCGTTGAGGGTGCTAAT GGTA-3′和载体上的引物序列inner01：5′-AGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCA-3′，引物所 扩增的条带在3.7kb左右为阳性克隆。
3、PCR鉴定阳性工程菌株
同步骤三，差别之处在于，利用下面引物对工程菌进行鉴定，可以发现基因已被敲除(图 6、图7和图8)：
Arm1-ORF-09：5'-TAGTCTGGTTTGCGGTAGTGT-3'；
Arm1-ORF-10：5'-AGATTGAGCATAGGAGTGGC-3'。
Arm3-ORF-09：5'-AAACGGAGTCCAGTTCTTCT-3'；
Arm3-ORF-10：5'-CAACTTTGCCTGTCATTTCC-3'。
Arm4-ORF-09：5'-CGCTTCAGTTCACGGACATA-3'；
Arm4-ORF-10：5'-GCAACCCAGACCTCCTTACC-3'。
GJK18菌的DSA-FACE糖型分析结果如图9所示。因β甘露糖的修饰仅仅添加在甘露糖 的个别末端，尽管糖型分析结果并没有实质性的变化，但β甘露糖是潜在的引起免疫原性的 糖，因此对于用于人体的药物来源，存在潜在的风险，本发明将所有的β甘露糖均灭活，因 此从根本上解决了存在β甘露糖的问题，且糖型结构没有被改变。
五、具有哺乳动物Man5GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株构建
首先，为了鉴定外源甘露糖苷酶I(MDSI)是否正确地发挥了作用，本发明提前在GJK18 工程菌中引入了一个报告蛋白，本发明以抗Her2抗体为报告蛋白，因此构建了抗Her2抗体 的表达载体。该载体的构建方法、载体转化方法已经在申请专利中公开(公开号：CN101748145A)。利用该方法将抗Her2抗体表达载体转入至GJK18宿主菌中，获得了表达 抗Her2抗体的W2工程菌株。
其次，具有哺乳动物Man5GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株W10为 C端融合HDEL序列的MDSI(TrmdsI，核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，编码SEQ ID No.9所示MDSI蛋白)插入宿主菌W2的基因组中，得到的工程菌。
1、外源甘露糖苷酶I(MDSI)表达载体的构建
表达外源甘露糖苷酶I重组载体pPIC9-TrmdsI为将SEQ ID No.14所示的DNA分子插入 pPIC9载体的Xho I和EcoR I酶切位点间得到的重组载体。
其中，SEQ ID No.14自5’末端第1-1524位核苷酸为优化后的甘露糖苷酶I编码基因，自 5’末端第1525-1536位核苷酸为内质网保留信号——HDEL编码基因。
(1)甘露糖苷酶I(MDSI)基因
外源甘露糖苷酶I可以是来源于丝状真菌、植物、昆虫、爪哇、哺乳动物等的甘露糖苷 酶I，本实施例选取绿色木霉的甘露糖苷酶I(詹洁.绿色木霉α-1,2-甘露糖苷酶在毕赤酵母 中的克隆表达与活性鉴定[学位论硕士文].)，并在甘露糖苷酶I的C-端融合了内质网保留信号 ——HDEL。
根据詹洁.绿色木霉α-1,2-甘露糖苷酶在毕赤酵母中的克隆表达与活性鉴定[学位论硕士 文].公布的绿色木霉的甘露糖苷酶I序列，根据酵母偏爱密码子和基因高表达原则优化编码基因，并在C端融合HDEL序列，得到基因片段(SEQ ID No.14)。
(2)设计并合成如下引物：
TrmdsI-5：5’-TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTATCCAAAGCCGGGC GCCAC-3’；下划线所示序列为Xho I酶切识别位点。
TrmdsI-3：5’-AGGGAATTCTTACAACTCGTCGTGAGCAAGGTGGCCGCCCCGT CGTGATG-3’；下划线所示序列为EcoR I酶切识别位点。
(3)以上述(1)得到的基因片段为模板，以TrmdsI-5和TrmdsI-3为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，命名为TrmdsI，该产物含有SEQ ID No.14。
(4)Xho I和EcoR I双酶切上述(3)获得的PCR产物，得到基因片段；Xho I和EcoR I双酶切pPIC9载体得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pPIC9-TrmdsI。将pPIC9-TrmdsI测序，结果正确。
2、表达外源甘露糖苷酶I的重组酵母的构建
将约10μg pPIC9-TrmdsI质粒，用Sal I线性化，用1/10体积的3M醋酸钠和3倍体积的 无水酒精沉淀线性化的质粒。用体积百分含量为70％的乙醇水溶液洗两次以除去其中的盐， 晾干，加入约30μL水重悬沉淀，获得用于转化的pPIC9-TrmdsI线性化质粒。
以下步骤中制备酵母电转化感受态细胞的方法参照Invitrogen公司的相关手册和 “Molecular Cloning，A laboratory Manual(Fourth Edition)”,2012Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New YorK。选用的宿主菌是上述构建的W2工程菌。
具体如下：
将毕赤酵母W2在YPD平板(酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L)上用划线法分离单克隆，28℃温箱培养2天。接种一个单克隆至一个装有10mL YPD液体培养基(酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)的50mL三角瓶中，28℃ 过夜培养至OD600约为2，得到菌液。再将0.1-0.5mL菌液接种到含有500mL YPD液体培养 基的3.5L摇瓶中，培养过夜至OD600至1.3-1.5之间。将菌液转移至无菌的离心瓶中，4℃， 1500g离心10分钟。用500mL预冷的无菌水重悬菌体，4℃，1500g离心10分钟收获细胞， 用250mL预冷的无菌水再洗一次。用20mL预冷的无菌1M山梨醇重悬菌体，4℃，1500g离 心10分钟收获细胞，用预冷的1M山梨醇重悬菌体至终体积为1.5mL，得到菌悬液。
取80μL菌悬液与10μL用于转化的pPIC9-TrmdsI线性化质粒，在微量离心管中混匀， 得到混合物，将其置冰上5min，将混合物转移到一个冰冷的0.2cm电转杯中，电穿孔细胞 (Bio-Rad Gene Pulser，2000V，25μF，200Ω)，再立即向电转杯中加入1mL冰冷的1M山梨醇，并小心地将混合物(转化细胞)转移至15mL培养管中。
将培养管放在28℃温箱孵育1h，不要摇动。然后加入1mL YPD液体培养基后在28℃， 250rpm的摇床中孵育3h。取200μL转化细胞涂布到含MD平板上(1.34g/100ml的YNB， 4×10-5g/100ml Biotin，2g/100ml的葡萄糖)。28℃温箱培养2-5天，至形成单克隆，即W2-Tr，命名为W10。
用玻璃珠制备法提取W10的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以TrMDSI-1.3kb-01和TrMDSI-1.3kb-02为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物约1.3kb，证明MDSI已插入到基因组中，即为阳性工程菌(图10中A)。
TrMDSI-1.3kb-01：5’-GAACACGATCCTTCAGTATGTA-3’；
TrMDSI-1.3kb-02：5’-TGATGATGAACGGATGCTAAAG-3’。
W10菌的DSA-FACE糖型分析结果(方法同实施例一中所述方法)如图10中B所示，可见转入TrmdsI后，W10菌表达蛋白的糖型结构为Man5GlcNAc2、Man6GlcNAc2，其中以Man5GlcNAc2为主。
六、具有哺乳动物GlcNAcMan5GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株构 建
具有哺乳动物GlcNAcMan5GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株1-8为 将含mnn9定位信号的N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(GnTI)(核苷酸序列如SEQ ID No.15所示， 编码SEQ ID No.10所示蛋白)的DNA片段插入宿主菌W10基因组中，得到的工程菌。
其中，SEQ ID No.15自5’末端第1-114位核苷酸为mnn9定位信号，自5’末端第115-1335 位核苷酸为N-乙酰葡萄糖胺转移酶I编码基因。
1、含mnn9定位信号的N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(GnTI)表达载体的构建
(1)调取人gnt1基因
用人gnt1基因上游引物(mnn9-GnTI-01：5’-tcagtcagcgctctcgatggcgaccccg-3’)和下游引 物GnTI-02：5’-GCGAATTCTTAGTGCTAATTCCAGCTAGGATCATAG-3’(下划线为EcoR I酶切位点)，用PCR的方法从人肝胎cDNA文库(购自Clontech Laboratories Inc.1290TerraBella Ave.Mountain View，CA94043,USA)获得人gnt1基因全长片段，PCR反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸1分钟30秒，循环30次；最后 72℃延伸10分钟。PCR扩增产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA回收试剂盒进行回 收。
(2)含定位信号mnn9的GnTI DNA片段
S.cere MNN9高尔基体定位信号：ScMNN9-03：tatAATattATGTCACTTTCTCTTGTATCGTACCGCCTAAGAAAGAACCCGTGGGTTAACATT TTTCTACCTGTTTTGGCCATATTTCTAATATATATAATTTTTTTCCAGAGAGATCAATCTtcagtcagcgctctcgatggcgaccccg
以含有S.cere MNN9高尔基体定位信号编码序列的上游引物ScMNN9-03 (tatAATattATGTCACTTTCTCTTGTATCGTACCGCCTAAGAAAGAACCCGTGGGTTAACA TTTTTCTACCTGTTTTGGCCATATTTCTAATATATATAATTTTTTTCCAGAGAGATCAATCTtcagtcagcgctctcgatggcgaccccg，下划线为SspI酶切位点)和GnTI催化结构域编码区下游引物 GnTI-02，通过PCR反应将回收纯化的1.2kb GnTI片段和S.cere MNN9高尔基体定位信号编 码序列相连接，使用Pyrobest DNA聚合酶扩增mnn9-gnt1基因片段(SEQ ID No.15)。
PCR反应条件：94℃变性2分钟，52℃退火30秒、72℃延伸5分钟，之后94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸1分钟30秒，循环30次；最后72℃延伸10分钟。
PCR扩增产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳(8V/cm，15分钟)分离，紫外灯下用洁净的刀 片切下1.3kb的目的条带，用DNA回收试剂盒进行回收，方法同上。
(3)PGE-URA3-GAP1-mnn9-GnTI表达载体的构建
Ssp I和EcoR I双酶切上述(2)获得的mnn9-gnt1基因片段PCR产物，得到基因片段； Ssp I和EcoR I双酶切PGE-URA3-GAP1(杨晓鹏,刘波,宋淼,巩新,唱韶红,薛奎晶,吴军. Man5GlcNAc2哺乳动物甘露糖型糖蛋白的毕赤酵母表达系统构建.生物工程学报.2011；27:108-17.)载体得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其 命名为PGE-URA3-GAP1-mnn9-GnTI。测序，结果正确。
PGE-URA3-GAP1-mnn9-GnTI为将SEQ ID No.15所示的DNA分子插入 PGE-URA3-GAP1载体的酶切位点Ssp I和EcoR I之间后得到的重组载体。
2、表达外源甘露糖苷酶I的重组酵母的构建
将约10μg PGE-URA3-GAP1-mnn9-GnTI质粒，用Nhe I线性化，获得用于转化的PGE-URA3-GAP1-mnn9-GnTI线性化质粒，制备酵母电转化感受态细胞的方法上述步骤五。
选用的宿主菌是上述步骤五构建的的W10工程菌。转化后在MD平板上形成的单克隆， 命名为1-8。
用玻璃珠制备法提取1-8的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以HuGnTI-0.9k-01和HuGnTI-0.9k-02为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物约0.9kb，证明GnTI已插入到 基因组中，即为阳性工程菌(如图11中A)。
HuGnTI-0.9k-01：5’-TGGACAAGCTGCTGCATTATC-3’；
HuGnTI-0.9k-02：5’-CGGAACTGGAAGGTGACAATA-3’。
1-8菌的DSA-FACE糖型分析结果(方法同实施例一中所述方法)如图11中B所示，可见转入GnTI后，宿主菌表达蛋白的主要糖型结构为GlcNAcMan5GlcNAc2。
七、具有哺乳动物GalGlcNAcMan5GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌构 建
具有哺乳动物GalGlcNAcMan5GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株 1-8-4为将kre2-GalE-GalT基因片段(核苷酸序列如SEQ ID No.16所示，编码SEQ IDNo.11 所示蛋白)插入宿主菌1-8基因组中，得到的工程菌1-8-4。
其中，SEQ ID No.16自5’末端第1-294位核苷酸为kre2定位信号，自5’末端第295-1317 位核苷酸为半乳糖异构酶GalE编码基因、自5’末端第1325-2394位核苷酸为半乳糖转移酶GalT编码基因。
1、含kre2定位信号的半乳糖转移酶(GalE+T)表达载体的构建
(1)调取人GalE、GalT基因
用人GalE基因上游引物GalE5’和下游引物GalE3’，用人GalT基因上游引物GalT5’和下 游引物GalT3’，用PCR的方法分别从人肝胎cDNA文库(购自Clontech LaboratoriesInc.1290Terra Bella Ave.Mountain View，CA94043,USA)获得人GalE、GalT基因全长片段，PCR反 应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸1分钟30秒，循环 30次；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物分别用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA回收试剂盒分别进行回收。
GalE5’：5’-ATGAGAGTTCTGGTTACCGGTGGTA-3’；
GalE3’：5’-AGGGTACCATCGGGATATCCCTGTGGATGGC-3’(KpnI)；
GalT5’：5’-ATGGTACCGGTGGTGGACGTGACCTTTCTCGTCTGCCA-3’(KpnI)。
GalT3’：5’-GCatttaaatttaGCTCGGTGTCCCGATGTCCACTGTGAT-3’(SwaI)。
(2)含定位信号kre2的GalE-GalT DNA片段
Kre2 5’：5’-ATAATattAAACGATGGCCCTCTTTCTCAGTAAGAG-3’(下划线SspI I位点)；
Kre2 3’+GalE5’：5’-CACCGGtAACCAGaACTctCatGATCGGGGCAtctgccttttcagcggcagctttcagagccttggattc-3’。
用PCR的方法从酿酒酵母S.cere基因组DNA中调取kre2定位信号片段。PCR条件同上。
以含有S.cere kre2高尔基体定位信号编码序列的上游引物Kre2和GalE+GalT催化结构域 编码区下游引物GalT3’，通过PCR反应将回收纯化的GalE、GalT片段和S.cerekre2高尔基 体定位信号编码序列相连接，使用Pyrobest DNA聚合酶扩增kre2-GalE-GalT基因片段。
PCR反应条件：94℃变性2分钟，52℃退火30秒、72℃延伸5分钟，之后94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸4分钟30秒，循环30次；最后72℃延伸10分钟。
PCR扩增产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳(8V/cm，15分钟)分离，紫外灯下用洁净的刀 片切下2.4kb的目的条带，用DNA回收试剂盒进行回收，方法同上。
(3)PGE-URA3-GAP1-kre2-GalE-GalT载体的构建
先用SwaI酶切上述kre2-GalE-GalT的DNA分子，再用T4 PNK酶(大连宝生物有限公司)磷酸化该基因片段；Ssp I和SwaI双酶切PGE-URA3-GAP1载体得到载体大片段；将基 因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为PGE-URA3-GAP1-kre2-GalE-GalT。 测序，结果正确。
PGE-URA3-GAP1-kre2-GalE-GalT为将SEQ ID No.16所示的kre2-GalE-GalT的DNA分 子插入PGE-URA3-GAP1载体的Ssp I和SwaI酶切位点得到的重组载体。
2、表达外源UDP-Gal和乳糖转移酶的重组酵母的构建
将约10μg PGE-URA3-GAP1-kre2-GalE-GalT质粒，用Nhe I线性化，获得用于转化的 PGE-URA3-GAP1-kre2-GalE-GalT线性化质粒，制备酵母电转化感受态细胞的方法同上述步 骤五。
选用的宿主菌是步骤六构建的1-8工程菌。转化后在MD平板上形成的单克隆，命名为 1-8-4。
用玻璃珠制备法提取1-8-4的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别以GalE-T(1.5k)-01 (5’-TGATAACCTCTGTAACAGTAAGCGC-3’)和GalE-T(1.5k)-02 (5’-GGAGCTTAGCACGATTGAATATAGT-3’)为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物 分别为1.5kb，证明GalE-T已插入到基因组中，即为阳性工程菌(如图12中A)。
1-8-4菌的DSA-FACE糖型分析结果(方法同实施例一中所述方法)如图12中B所示，可见转入半乳糖异构酶和半乳糖转移酶后，宿主菌表达蛋白的主要糖型结构为GalGlcNAcMan5GlcNAc2。
八、具有哺乳动物GalGlcNAcMan3GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株 构建
具有哺乳动物GalGlcNAcMan3GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株 52-60为将MDSII DNA分子(核苷酸序列如SEQ ID No.17所示，编码SEQ ID No.12所示蛋白)插入宿主菌1-8-4的基因组中，得到的工程菌52-60。
其中，SEQ ID No.17自5’末端第1-108位核苷酸为甘露糖苷酶II编码基因的mnn2定位 信号，自5’末端第109-3303位核苷酸为甘露糖苷酶II编码基因。
1、含mnn2定位信号的甘露糖苷酶II(MDSII)表达载体的构建
(1)全基因合成方式合成含mnn2定位信号的MDSII基因
根据序列利用全基因合成方式合成含mnn2的MDSII基因(SEQ ID No.17)，由南京金瑞 斯公司合成并克隆至pUC57克隆载体中，获得pUC57-MDSII。
设计MDSII基因上游引物(mnn2-MDSII-01： 5’-ATAATattAAACCatgctgcttaccaaaaggttttcaaagctgttc-3’)(下划线为SspI酶切位点)和下游引 物(MDSII-02：5’-GCTATTTA AATctattaCCTCAACTGGATTCGGAATGTGC TG ATTTCCATTG-3’)(下划线为SwaI酶切位点)，用PCR的方法从pUC57-MDSII获得人MDSII 基因全长片段PCR产物，PCR反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，52℃退火30 秒，72℃延伸4分钟30秒，循环30次；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物(序列17) 用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA回收试剂盒进行回收。
(2)PGE-URA3-arm3-GAP-mnn2-MDSII表达载体的构建
先用SwaI酶切上述PCR产物，再用T4 PNK酶(大连宝生物有限公司)磷酸化该基因片段；Ssp I和SwaI双酶切PGE-URA3-GAP1载体得到载体大片段；将基因片段与载体大片 段连接，得到重组质粒，将其命名为PGE-URA3-arm3-GAP-mnn2-MDSII。测序，结果正确。
PGE-URA3-arm3-GAP-mnn2-MDSII为将SEQ ID No.17所示DNA分子插入 PGE-URA3-GAP1载体的Ssp I和Swa I酶切位点得到的重组载体。
2、表达外源甘露糖苷酶II的重组酵母的构建
将约10μg PGE-URA3-arm3--GAP-mnn2-MDSII质粒，用Msc I线性化，获得用于转化的 PGE-URA3-arm3-GAP-mnn2-MDSII线性化质粒，制备酵母电转化感受态细胞的方法同上述步 骤五。
选用的宿主菌是步骤七构建的1-8-4工程菌。转化后在MD平板上形成的单克隆，命名 为52-60。
用玻璃珠制备法提取52-60的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别以 CeMNSII-1.2k-01和CeMNSII-1.2k-02为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物分别为1.2kb，证明MDSII已插入到基因组中，即为阳性工程菌(图13中A)。
CeMNSII-1.2k-01：5’-CAGATGGATGAGCATAGAGTTA-3’；
CeMNSII-1.2k-02：5’-GACAAGAGGATAATGAAGAGAC-3’。
52-60菌的DSA-FACE糖型分析结果如图13中C所示。可见，转入后外源甘露糖苷酶II， 宿主菌表达蛋白的主要糖型结构为GalGlcNAcMan3GlcNAc2。
九、具有哺乳动物Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌 株构建
具有哺乳动物Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株 150L2为将GnT II DNA分子(核苷酸序列如SEQ ID No.18所示，编码SEQ ID No.13所示蛋 白)插入宿主菌52-60的基因组中，得到的工程菌150L2。
其中，SEQ ID No.18自5’末端第1-108位核苷酸为N-乙酰葡萄糖胺转移酶II编码基因的 mnn2定位信号，自5’末端第109-1185位核苷酸为N-乙酰葡萄糖胺转移酶II。
1、mnn2定位信号的N-乙酰葡萄糖胺转移酶II(GnTII)表达载体的构建
(1)全基因合成方式合成GnTII基因
根据序列利用全基因合成方式合成含mnn2的GnTII基因(SEQ ID No.18)，由南京金瑞 斯公司合成并克隆至pUC57克隆载体中，获得pUC57-GnTII。
设计GnTII基因上游引物(mnn2-GnTII-01：5’-ATAATattAAACCatgctgcttaccaaaaggttttcaaagctgttc-3’)(下划线为SspI酶切位点)和下游引物(GnTII-02：5’-GCTatttaaa tTTAtcactgcagtcttctataacttttac-3’)(下划线为SwaI酶切位点)，用PCR的方法从pUC57-GnTII 获得含mnn2定位信号的N-乙酰葡萄糖胺转移酶II(GnTII)DNA分子，PCR反应条件：94℃ 预变性5分钟，94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸2分钟30秒，循环30次；最后 72℃延伸10分钟。PCR扩增产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA回收试剂盒进行回 收。
(2)PGE-URA3-arm3-GAP-mnn2-GnTII表达载体的构建
酶切及构建方法与PGE-URA3-arm3-GAP-mnn2-MDSII构建方法一致，得到重组质粒， 将其命名为PGE-URA3-arm3-GAP-mnn2-GnTII。测序，结果正确。
PGE-URA3-arm3-GAP-mnn2-GnTII为将SEQ ID No.18所示DNA分子插入 PGE-URA3-GAP1载体的Ssp I和Swa I酶切位点得到的重组载体。
2、表达外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II的重组酵母的构建
将约10μg PGE-URA3-arm3-GAP-mnn2-GnTII质粒，用Msc I线性化，获得用于转化的 PGE-URA3-arm3-GAP-mnn2-GnTII线性化质粒，制备酵母电转化感受态细胞的方法同上述步 骤五。
选用的宿主菌是步骤八构建的52-60工程菌。转化后在MD平板上形成的单克隆，命名 为150L2。
用玻璃珠制备法提取150L2的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别RnGnTII-0.8k-01 和RnGnTII-0.8k-02为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物为0.8kb，证明GnTII已插入到基因组中，即为阳性工程菌(图13中B)。
RnGnTII-0.8k-01：5’-ATCAACAGTCTGATCTCTAGTG-3’；
RnGnTII-0.8k-02：5’-AGTTCATGGTCCCTAATATCTC-3’。
十、工程化菌株中抗her2抗体基因的敲除
抗her2抗体基因灭活的酵母菌株3-5-11为将SEQ ID No.19所示的DNA分子(抗her2 抗体轻重链基因敲除序列)导入毕赤酵母150L2中，与150L2基因组中的同源序列发生同源 重组，敲除酵母基因组中的抗her2抗体轻重链基因，得到的重组酵母。
构建抗her2抗体轻重链基因灭活载体、敲除质粒对毕赤酵母的转化、PCR鉴定阳性工程 菌株与前述步骤方法相同，抗her2抗体基因灭活的酵母菌株命名为3-5-11。
十一、工程化菌株中灭活O-甘露糖转移酶I基因
因发现宿主菌存在不稳定性，容易丢失MDSI和MDSII基因，因此在O-甘露糖转移酶I 基因灭活之前，按照本实施例步骤八和步骤五的同样技术方法，在3-5-11中宿主菌先后转入 SEQ ID No.17(MDSII)和SEQ ID No.14(MDSI)，保证了工程菌内这两个基因的双拷贝，构建获得了670宿主菌。
O-甘露糖转移酶I基因灭活的酵母菌株7b为将编码SEQ ID No.8所示的O-甘露糖转移酶 I的DNA分子在毕赤酵母670中进行插入灭活，得到的酵母，命名为7b，即GJK30。GJK30 已经于2020年03月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.19488。
1、O-甘露糖转移酶基因灭活载体的构建
以质粒pPIC9(invitrogen公司)为模板，通过PCR方法获取终止子AOXTT序列。所用PCR钓取终止子引物AOXTT-5和AOXTT-3(5’-AOX1TT-5tctacgcgtccttagacatgactgttcctcagt-3’； AOX1TT-3：5’-tctacgcgtaagcttgcacaaacgaacttc-3’)。将得到的PCR产物用PCR产物回收纯化 试剂盒纯化回收(鼎国生物技术有限公司，北京)，得到AOX1TT终止子片段。
本发明所用的载体pYES2(invitrogen公司)具有酵母的URA3筛选标记，可用于后续筛 选工作。为了防止载体上的URA3基因的启动子对载体上其他基因的影响，本发明在URA3 基因末端添加AOX1TT终止子。具体构建方法为：将上述获得的AOX1TT终止子片段回收后用MluI酶切，得到酶切片段；将该酶切片段与用同样用Mlu1处理过的载体pYES2连接， 将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Trans5α(北京全式金生物技术有限公司，目录号CD201)扩增，将序列正确的克隆命名为Trans5α-pYES2-URA3-AOX1TT，提取质粒，得到URA3基 因末端添加AOX1TT终止子的重组载体，记为pYES2-URA3-AOX1TT。
为了使构建的载体能够定点整合到毕赤酵母PMT1基因中，本发明利用PCR钓取PMT1 基因中ORF区的一个片段作为同源重组片段。为了确保失活载体整合到PMT1基因上能够引 起PMT1基因的失活，本研究在引物两端加上不同组合的终止密码子，在钓取的PMT1基因 片段3′末端加上CYCTT终止子。
以毕赤酵母JC308(Invitrogen公司)基因组为模板，用玻璃珠制备法(A.亚当斯等，《酵 母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)提取毕赤酵母JC308的基因组DNA，以该基 因组DNA为模板，利用引物PMT1-IN-5和PMT1-IN-3进行PCR扩增钓取PMT1基因片段。
PMT1-IN-5：5’-tctatgcattaatgatagttaatgactaatagagtaaaacaagtcctcaagaggt-3’；
PMT1-IN-3：5’-tgacataactaattacatgatctattagtcattaactatcattagatcagagtggggacgactaagaaa gc-3’。
钓取的PMT1基因片段两端加入具有不同组合的终止密码子，命名为PMT1-IN。
PCR钓取PMT1基因片段反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min40s。共进行25个循环，最后72℃延伸10min。回收PCR产物即为钓取的PMT1 基因片段。
以含有CYCTT终止子的质粒pYES2为模板，利用引物CYC1TT-5和CYC1TT-3(CYC1TT-5：5’-gctttcttagtcgtccccactctgatctaatgatagttaatgactaatagatcatgtaattagttatgtca-3’； CYC1TT-3：5’-gcaaattaaagccttcgagcgtc-3’)进行PCR扩增钓取CYC1TT终止子片段。PCR反 应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min。共进行25个循环， 最后72℃延伸10min。回收PCR产物，即为CYC1TT终止子片段。
再以回收的PCR产物CYC1TT终止子片段和PMT1-IN片段(钓取的PMT1基因片段) 为模板，利用引物PMT1-IN-5和CYC1TT-3进行PCR扩增，连接PMT1-IN和CYC1TT片段， 构建PMT1-IN-CYC1TT融合片段。PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃ 退火30s，72℃延伸2.4min。共进行25个循环，最后72℃延伸10min。回收PCR产物，即为 PMT1-IN和CYC1TT终止子的连接片段——PMT1-IN-CYC1TT融合片段。回收后的产物用 Nsi1酶切后磷酸化，然后与pYES2-URA3-AOX1TT经Nsi1和Stu1酶切得到的载体骨架连接， 得到的序列正确的重组载体为PMT1插入失活载体PMT1-IN-pYES2。
在钓取的PMT1基因片段的前端和末端各装上不同组合的终止密码子，并且在末端的终 止密码子之后又装了CYC1TT终止子，即保证如果基因组整合正确PMT1基因便不会表达。 pYES2载体上含有毕赤酵母的URA3基因，为防止URA3基因启动子对PMT1基因的启动，在URA3基因后插入AOX1TT终止子。根据设计的引物，获得CYC1TT终止子(272bp)片 段和PMT1(907bp)片段，与理论大小一致。PMT1-IN片段与CYC1TT融合片段大小是1135bp， 通过以上PCR鉴定和测序等证明载体PMT1-IN-pYES2构建成功。
2、PMT1基因灭活菌株的构建
制备酵母670感受态细胞，制备方法为：
挑取670单菌落接种于2mL YPD+U培养基(该培养基为向YPD培养基中添加尿嘧啶得 到的尿嘧啶浓度为100μg/mL的培养基)中，在25℃摇床以170r/min培养48h；然后取500μL 培养物，接种于100mL YPD+U培养基中，25℃下以170r/min培养24h，OD600到达1.0；然 后在4℃以6000r/min离心6min，用15mL的冷无菌水重悬菌体；相同条件下再次离心，用 15mL的冷无菌水重悬菌体；4℃下以6000r/min离心6min，用15mL冷的1mol/L山梨醇重 悬菌体；相同条件下再次离心；倒掉上清，用1mL冷的1mol/L山梨醇重悬菌体，体积约1.5mL， 即酵母670感受态细胞，置于冰上备用。
PMT1插入失活载体PMT1-IN-pYES2的电击转化：将PMT1插入失活载体 PMT1-IN-pYES2利用EcoRV酶切线性化后回收，终产物溶于20μL ddH2O，即为线性化质粒； 将85μL的670感受态细胞与线性化质粒混合于电转杯中，冰上放置5min，按毕赤酵母电转 化手册上的条件进行电转化(2kV)，电击后立即加入700μL的1M的山梨醇，转移至1.5mL 离心管中，25℃下放置1h，涂布于MD+RH平板(该平板为向MD培养基中添加组氨酸和 精氨酸得到的组氨酸和精氨酸浓度分别为100μg/mL和100μg/mL的固体培养基)，置于25℃ 下培养，待平板上长出的克隆提取基因组DNA，利用PMT1基因组外围引物 PMT1-ORF-OUT-5和PMT1-ORF-OUT-3做PCR鉴定，基因组鉴定正确的克隆命名为7b，即 GJK30。
PMT1-ORF-OUT-5：5’-aagacccatgccgaacacgac-3’；
PMT1-ORF-OUT-3：5’-gctctgaggcaccttgggtaa-3’。
利用插入失活载体插入整合的方式整合到毕赤酵母染色体中，由于载体中含有PMT1基 因同源片段，理论上载体的整合属于定点整合，即插入在PMT1基因上，可以通过设计的特 定引物进行鉴定和筛选。利用毕赤酵母的URA3筛选标记，通过压力筛选，鉴定MD+RH平板上长出的克隆。通过PMT1基因外围引物PMT1-ORF-OUT-5和PMT1-ORF-OUT-3做PCR 鉴定。如果PMT1-IN-pYES2载体正确整合到PMT1基因中，利用上面的引物可以得到8.6kb 大小的片段；对照(即酵母X33)为3kb大小的片段(图14)；由可知，此PMT1-IN-pYES2 载体正确整合到PMT1基因中，命名为7b，即GJK30。由于插入载体上设计了不同的终止密 码子和终止子，因此，基因整合正确，PMT1基因便不会表达。
十二、GJK30工程菌的糖型结构分析
为了观察最终获得的GJK30的糖型结构是否正确，本发明在获得GJK30工程菌后引入 了一个报告蛋白，同实施例一的方法，以抗Her2抗体为报告蛋白，抗Her2抗体的表达载体 的构建方法、载体转化方法已经在申请专利中公开(见实施例一)。利用该方法将抗Her2抗 体表达载体转入至GJK30宿主菌中，获得了表达抗Her2抗体的GJK30-HL工程菌株。糖型与前期获得的糖型(将Her2抗体表达载体转入至中国专利申请201410668305.X的实施例1构建的GJK08菌株中获得的对照重组工程菌，即与本发明GJK30-HL工程菌株相比，差别之处有三：本发明敲除的β甘露糖转移酶是I-IV，对照重组工程菌仅敲除了β甘露糖转移酶II；本发明还失活了O甘露糖转移酶I，对照重组工程菌没有；本发明导入外源MDSI和MDSII 是导入两次，对照重组工程菌是导入一次)尽管均含有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2结构，但 两者的比例明显不同，前期Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2结构低于50％(图15中A)，而GJK30 工程菌获得的Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2结构所占糖型比例大于60％，且整体糖型更为简单 且均一(图15中B)。据众多文献报道，这种Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型结构会影响蛋 白的生物活性，如抗体的ADCC、CDC活性，因此它所占的比重就直接影响到蛋白的很多特性。通过商业化购买的糖苷酶(New England Biolabs，Beijing)对该糖型进行酶切分析，如 图15中C示，由于Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(G2)末端没有N-乙酰葡萄糖胺，所以在β-N- 乙酰氨基葡糖苷酶的作用下，Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2结构不会发生改变，而可以在外切 酶β1,4-半乳糖苷酶的作用，剪切去除两个半乳糖，而形成GlcNAc2Man3GlcNAc2(G0)的 结构；而同时在这两个外切酶的作用下，即先后剪切去除了半乳糖Gal和N-乙酰葡萄糖胺 GlcNAc，因而糖基结构变为Man3GlcNAc2结构，证明表达的糖型正确。
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<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 404
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Met Ala Lys Ala Asp Gly Ser Leu Leu Tyr Tyr Asn Pro His Asn Pro
1 5 10 15
Pro Arg Arg Tyr Tyr Phe Tyr Met Ala Ile Phe Ala Val Ser Val Ile
20 25 30
Cys Val Leu Tyr Gly Pro Ser Gln Gln Leu Ser Ser Pro Lys Ile Asp
35 40 45
Tyr Asp Pro Leu Thr Leu Arg Ser Leu Asp Leu Lys Thr Leu Glu Ala
50 55 60
Pro Ser Gln Leu Ser Pro Gly Thr Val Glu Asp Asn Leu Arg Arg Gln
65 70 75 80
Leu Glu Phe His Phe Pro Tyr Arg Ser Tyr Glu Pro Phe Pro Gln His
85 90 95
Ile Trp Gln Thr Trp Lys Val Ser Pro Ser Asp Ser Ser Phe Pro Lys
100 105 110
Asn Phe Lys Asp Leu Gly Glu Ser Trp Leu Gln Arg Ser Pro Asn Tyr
115 120 125
Asp His Phe Val Ile Pro Asp Asp Ala Ala Trp Glu Leu Ile His His
130 135 140
Glu Tyr Glu Arg Val Pro Glu Val Leu Glu Ala Phe His Leu Leu Pro
145 150 155 160
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Asp Phe Phe Arg Tyr Leu Ile Leu Phe Ala
165 170 175
Arg Gly Gly Leu Tyr Ala Asp Met Asp Thr Met Leu Leu Lys Pro Ile
180 185 190
Glu Ser Trp Leu Thr Phe Asn Glu Thr Ile Gly Gly Val Lys Asn Asn
195 200 205
Ala Gly Leu Val Ile Gly Ile Glu Ala Asp Pro Asp Arg Pro Asp Trp
210 215 220
His Asp Trp Tyr Ala Arg Arg Ile Gln Phe Cys Gln Trp Ala Ile Gln
225 230 235 240
Ser Lys Arg Gly His Pro Ala Leu Arg Glu Leu Ile Val Arg Val Val
245 250 255
Ser Thr Thr Leu Arg Lys Glu Lys Ser Gly Tyr Leu Asn Met Val Glu
260 265 270
Gly Lys Asp Arg Gly Ser Asp Val Met Asp Trp Thr Gly Pro Gly Ile
275 280 285
Phe Thr Asp Thr Leu Phe Asp Tyr Met Thr Asn Val Asn Thr Thr Gly
290 295 300
His Ser Gly Gln Gly Ile Gly Ala Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Ala Leu
305 310 315 320
Ser Leu Glu Glu Arg Asp Ala Leu Ser Ala Arg Pro Asn Gly Glu Met
325 330 335
Leu Lys Glu Lys Val Pro Gly Lys Tyr Ala Gln Gln Val Val Leu Trp
340 345 350
Glu Gln Phe Thr Asn Leu Arg Ser Pro Lys Leu Ile Asp Asp Ile Leu
355 360 365
Ile Leu Pro Ile Thr Ser Phe Ser Pro Gly Ile Gly His Ser Gly Ala
370 375 380
Gly Asp Leu Asn His His Leu Ala Tyr Ile Arg His Thr Phe Glu Gly
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Ser Trp Lys Asp
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Ser Ala Asn His Glu Gly Lys Glu Asn Lys Ala Phe Ser Met Ile Ser
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Pro Lys Lys Leu Ile Asn Lys Leu Ser Lys Ser Ser Val Ser Ser Asn
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Ile Glu Ile Glu Asn Ser Phe Ser Asp Arg Ser Val Ser Glu Val Asp
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370 375 380
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Phe Pro Arg Thr Arg Ile Ala Asn Cys Gly Cys Ser Arg Thr Thr Tyr
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Glu Arg Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Ala Glu Arg Lys Lys Leu Gln
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Glu Arg Lys Glu Arg Val Arg Lys Ile Ala Glu Lys Gln Arg Lys Glu
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Ile Cys Glu Lys Glu Phe Val Ser Gly Asp Asp Gly Gln Asn His Gly
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Ile Gly Ile Phe Arg Gly Gly Ser Asn Leu Val Pro Phe Pro Thr Ser
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Leu Ile Pro Asn Gly Ile Asp Ser Trp Asp Val Ser Lys Lys Gln Gly
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Gly Lys Ser Asp Ile Leu Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ala Asp Arg Asn
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485 490 495
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Glu Lys Leu Ala Lys Glu Gln Glu Glu Ala Glu Lys Leu Glu Ala Lys
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Lys Lys Leu Tyr Gln Leu Gln Glu Glu Glu Arg Ser
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Pro Glu Asn Val Pro Tyr Val Leu Met Arg Tyr Leu Pro Ser Gly Met
145 150 155 160
Gly Val Gly Thr Cys Ile Met Leu Tyr Leu Thr Leu Arg Ala Ser Gly
165 170 175
Cys Gln Pro Ile Val Cys Cys Ser Asp Asn Arg Ser Leu Ile Ile Glu
180 185 190
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195 200 205
Leu Phe Phe Ile Ala Ser Thr Val Tyr Ser Phe Lys Lys Phe Gln Ile
210 215 220
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Phe Ala Ile His Leu Gln Val Leu Thr Lys Glu Gly Asp Gly Gly Ala
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Phe Met Ser Ser Val Phe Arg Ser Thr Leu Glu Gly Asn Ala Val Pro
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cagtatgccc agcttgcgca gaagggcgag tcgtatctcc tgaatccaaa gggaagcccg 660
gaggcatggc ctggcctgat tggaacgttt gtcagcacga gcaacggtac ctttcaggat 720
agcagcggca gctggtccgg cctcatggac agcttctacg agtacctgat caagatgtac 780
ctgtacgacc cggttgcgtt tgcacactac aaggatcgct gggtccttgc tgccgactcg 840
accattgcgc atctcgcctc tcacccgtcg acgcgcaagg acttgacctt tttgtcttcg 900
tacaacggac agtctacgtc gccaaactca ggacatttgg ccagttttgc cggtggcaac 960
ttcatcttgg gaggcattct cctgaacgag caaaagtaca ttgactttgg aatcaagctt 1020
gccagctcgt actttgccac gtacaaccag acggcttctg gaatcggccc cgaaggcttc 1080
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tactcgtcgg caggattctg ggtgacggca ccgtattaca tcctgcggcc ggagacgctg 1200
gagagcttgt actacgcata ccgcgtcacg ggcgactcca agtggcagga cctggcgtgg 1260
gaagcgttca gtgccattga ggacgcatgc cgcgccggca gcgcgtactc gtccatcaac 1320
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gaggcgctca agtatgcgta cctgatcttt gcggaggagt cggatgtgca ggtgcaggcc 1440
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<210> 15
<211> 1338
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
atgtcacttt ctcttgtatc gtaccgccta agaaagaacc cgtgggttaa catttttcta 60
cctgttttgg ccatatttct aatatatata atttttttcc agagagatca atcttcagtc 120
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tactttcggg ccacctatcc gctgctgaag gccgacccct ccctgtggtg cgtctcggcc 720
tggaatgaca acggcaagga gcagatggtg gacgccagca ggcctgagct gctctaccgc 780
accgactttt tccctggcct gggctggctg ctgttggccg agctctgggc tgagctggag 840
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ctgggtgtca tggatgacct taagtcgggg gttccgagag ctggctaccg gggtattgtc 1260
accttccagt tccggggccg ccgtgtccac ctggcgcccc cactgacgtg ggagggctat 1320
gatcctagct ggaattag 1338
<210> 16
<211> 2397
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
atggccctct ttctcagtaa gagactgttg agatttaccg tcattgcagg tgcggttatt 60
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<210> 17
<211> 3306
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 17
atgctgctta ccaaaaggtt ttcaaagctg ttcaagctga cgttcatagt tttgatattg 60
tgcgggctgt tcgtcattac aaacaaatac atggatgaga acacgtcgcc tgcaggcgtg 120
gaggatggtc cgaaaagttc acaaagcaat ttcagccaag gtgctggctc acatcttctg 180
ccctcacaat tatccctctc agttgacact gcagactgtc tgtttgcttc acaaagtgga 240
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gctggacttt ctcacatgct tatccagaga gttcattatg cagttaaaaa acactttgca 840
ctgcataaaa cattggagtt tttttggaga cagaattggg atctgggatc tgtcacagat 900
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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atgctgctta ccaaaaggtt ttcaaagctg ttcaagctga cgttcatagt tttgatattg 60
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<210> 19
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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agagcagacg tcgtgattat gtttgaaagc ttcaatatag taatgacatg atccaactga 4800
gcagcgtctc cgtgaaactc tttgtaaata ttaatatgac gagagacaag atccaccaca 4860
cattctgaaa caatgtcatg cttgataatt tcatctctgt attcctcgtt gttggacgtt 4920
a 4921
<210> 20
<211> 2023
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 20
ggtaccgcag tttaatcata gcccactgct aagccagaat tctaatatgt aactacgtac 60
ctttcctttt aataaatgat ctgtattttc cacctagtag cagatcaaat tgttcaactt 120
taagtctttg gtccctcaag cgagagaact tgcgatgaca ctcaggagtg ccataaaagc 180
cagaacctca aaaggactga tcggagctgt tattatagcc tcaataatat ttttcaccac 240
agtaaccttc tacgatgaaa gcaaaattgt cggcataata agagtttctg atacttatac 300
aggccatagc gctgtatctt caactttcaa tgcttcttcc gttgttagtg acaacaagat 360
caacggatat ggacttcctt tgattgacac ggaatcaaat agccgttatg aggatccaga 420
cgatatttcc attgaaaacg aattgcgcta tagaattgcc caatctacca aagaggaaga 480
aaacatgtgg aaactcgata ccactctcac ggaagcaagc ttgaaaatcc ccaacataca 540
gtcgtttgag ctgcagccgt tcaaagaaag acttgataat tcactttaca attctaagaa 600
cataggaaac ttttacttct atgacccaag gcttacattc tcagtttact tgaagtatat 660
caaggataaa ttggcctctg gaagcacaac aaatcttaca atacccttca actgggcaca 720
ttttagagat ttatcgtcac tgaatcctta tttggacata aaacaagaag ataaggtcgc 780
atgtgattac ttttatgaat caagtaataa agacaaacga aaacccacgg gtaactgtat 840
tgagtttaaa gatgttcgtg atgagcacct gatacagtat gggatttcat caaaagacca 900
tctacctggt ccttttattt taaagtcact tggaattccc atgcagcata cagccaagcg 960
actggaatca aatctttatc tattaaccgg tgcgccagtt ccacttgcgg ccgcacttta 1020
ctttcttggt attggaattc attgatgttc ccttgggatt atgatattga tgtgcaaatg 1080
ccaatcaaga gtttgaacaa tctatgtgct aacttcaacc aatcattaat aattgaggat 1140
cttactgaag gatattcttc ttttttcttg gattgcggat caagtatcac gcatagaaca 1200
aaaggcaaag gattaaactt cattgatgca agattcataa atgttgaaac aggcctttat 1260
atcgatatca ctggattaag taccagtcag tcagctcgac cgccaaggtt tagtaacgct 1320
tcgaagaaag atcctattta caattgcagg aataatcatt tctactctca taacaatata 1380
gcacctctca aatacacgtt gatggagggg gttcccagtt tcattcctca acagtatgaa 1440
gaaatattga gagaggagta tacaactggt ttgacttcga aacactacaa cggcaacttt 1500
tttatgactc aattgaattt gtggcttgaa agagatccaa tgctagcact tgtgccttca 1560
tccaaatacg aaattgaagg tggaggggtg gaccataaca agattatcaa gtctattctt 1620
gaactttcca acatcaaaaa attggaattg ttggatgata atcccgatat attagaggag 1680
gtgatcagga catacgaact gacttccatt caccataaag agatgcagta tctttccagt 1740
gtcaaaccag atggggacag gtccatgcag tcaaatgaca taaccagttc ttaccaggag 1800
tttctagcaa gtctgaagaa attccagcct ttacgcaaag atttgttcca atttgagcgg 1860
atagaccttt ctaagcatag aaaacagtga gcagccgttt tgcctaaaat gttccagaaa 1920
ctataggata aatatataca gtaatgaatt aggtgatgtt agcatttagt ccccaaaaat 1980
acctcgaatc tccagctcca tagcgcaaaa tctcggatct aga 2023

Claims (25)

1.一种具有特定哺乳动物细胞糖型修饰能力的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法，所述特定哺乳动物细胞糖型为Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
（A1）失活受体巴斯德毕赤酵母内源的α-1,6-甘露糖转移酶、磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶、β甘露糖转移酶I、β甘露糖转移酶II、β甘露糖转移酶III和β甘露糖转移酶IV，得到重组酵母1；
（A2）在所述重组酵母1中表达如下外源蛋白：外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、外源甘露糖苷酶II、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II、外源半乳糖异构酶和外源半乳糖转移酶，得到重组酵母2；
（A3）失活所述重组酵母2内源的O甘露糖转移酶I，得到重组酵母3；所述重组酵母3为具有所述特定哺乳动物细胞糖型修饰能力的酵母工程菌；
步骤（A2）中，在所述重组酵母1中表达所述外源蛋白是通过向所述重组酵母1中导入所述外源蛋白的编码基因实现的；
所述外源蛋白的编码基因是以重组载体的形式导入所述重组酵母1中的；
所述外源甘露糖苷酶I的编码基因和所述外源甘露糖苷酶II的编码基因均向所述重组酵母1中导入两次；
所述外源甘露糖苷酶I来源于绿色木霉，且C端融合内质网保留信号HDEL；
所述外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I来源于人，且含有mnn9定位信号；
所述外源甘露糖苷酶II来源于线虫；
所述N-乙酰葡萄糖胺转移酶II来源于人，且均含有mnn2定位信号；
所述外源半乳糖异构酶和所述外源半乳糖转移酶为融合蛋白，均来源于人，且共用一个kre2定位信号。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（A1）中，所述失活受体巴斯德毕赤酵母内源的α-1,6-甘露糖转移酶、磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶、β甘露糖转移酶I、β甘露糖转移酶II、β甘露糖转移酶III和β甘露糖转移酶IV均是采用同源重组的方式进行基因敲除。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（A3）中，失活所述重组酵母2内源的O甘露糖转移酶I，是通过对所述重组酵母2的基因组DNA中的O甘露糖转移酶I编码基因进行插入失活实现的。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述α-1,6-甘露糖转移酶为氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磷酸甘露糖转移酶为氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磷酸甘露糖合成酶为氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述β甘露糖转移酶I为氨基酸序列是SEQID No.4的蛋白质。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述β甘露糖转移酶II为氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述β甘露糖转移酶III为氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述β甘露糖转移酶IV为氨基酸序列是SEQ ID No.7的蛋白质。
11. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述O甘露糖转移酶I为氨基酸序列是SEQ ID No.8的蛋白质。
12. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述外源甘露糖苷酶I为氨基酸序列是SEQ ID No.9的蛋白质。
13. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I为氨基酸序列是SEQ ID No.10的蛋白质。
14. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：由所述半乳糖异构酶和所述半乳糖转移酶组成的所述融合蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.11的蛋白质。
15. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述甘露糖苷酶II为氨基酸序列是SEQID No.12的蛋白质。
16. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述N-乙酰葡萄糖胺转移酶II为氨基酸序列是SEQ ID No.13的蛋白质。
17. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述外源甘露糖苷酶I的编码基因为核苷酸序列是SEQ ID No.14的DNA分子。
18. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I的编码基因为核苷酸序列是SEQ ID No.15的DNA分子。
19. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：由所述半乳糖异构酶和所述半乳糖转移酶组成的所述融合蛋白的编码基因为核苷酸序列是SEQ ID No.16的DNA分子。
20. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述甘露糖苷酶II的编码基因为核苷酸序列是SEQ ID No.17的DNA分子。
21. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述N-乙酰葡萄糖胺转移酶II的编码基因为核苷酸序列是SEQ ID No.18的DNA分子。
22.利用权利要求1-21中任一所述方法构建得到的巴斯德毕赤酵母工程菌。
23.根据权利要求22所述的巴斯德毕赤酵母工程菌，其特征在于：所述巴斯德毕赤酵母工程菌为在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏编号为CGMCCNo.19488的菌株。
24.权利要求22或23所述的巴斯德毕赤酵母工程菌在制备修饰有所述特定哺乳动物细胞糖型的目的蛋白中的应用。
25.一种制备修饰有特定哺乳动物细胞糖型的目的蛋白的方法，所述特定哺乳动物细胞糖型为Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，其特征在于：所述方法包括如下步骤：在权利要求22或23所述的巴斯德毕赤酵母工程菌中表达所述目的蛋白，得到重组酵母工程菌；培养所述重组酵母工程菌，制备具有所述特定哺乳动物细胞糖型的目的蛋白。
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