KR101419266B1 - 한세눌라 폴리모르파 유래의 단백질 ｏ-만노실 전이효소의 신규 유전자 및 이 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 변이주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 외래 단백질 생산 균주인 한세눌라 폴리모르파의 단백질 O-만노실 전이효소의 신규 유전자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 신규 단백질 O-만노실 전이효소 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 변이균주 및 이 변이균주를 사용하여 O-만노실화가 감소된 재조합 외래 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 한세눌라 폴리모르파 변이균주는 이 효모 특이적인 O-만노실화가 감소되어 외래 단백질 본래 활성을 보유한 재조합 단백질을 생산하는데 사용될 수 있는 숙주 세포로 개발될 수 있다.

Description

한세눌라 폴리모르파 유래의 단백질 Ｏ-만노실 전이효소의 신규 유전자 및 이 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 변이주{A Novel Hansenula polymorpha Gene Coding for Protein O-mannosyltransferase and Hansenula polymorpha Mutant Strain Deficient in The Same Gene}

본 발명은 재조합 외래 단백질 생산균주인 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 단백질 O-만노실 전이효소(protein O-mannosyltransferase)의 신규 유전자, 이 신규 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 변이균주, 및 이 변이균주를 사용하여 O-만노실화가 감소된 재조합 외래 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

효모를 비롯한 모든 진핵세포와 원핵세포들에서 세포 밖으로 분비되거나 세포막 표면에 위치하는 분비 또는 막단백질들은 대부분 N-결합 또는 O-결합 당사슬(N- or O-linked glycan)이 부착된다. 특히 미생물의 세포 상호간 교신(intercellular communication)이나 병원성에 중요한 기능을 담당하는 세포막 당단백질은 다량의 O-당사슬 수식이 일어난다. 단백질 O-결합 당사슬은 다음의 과정을 통해 형성된다: 소포체(ER)에서 새롭게 합성되는 분비 또는 막단백질들이 소포체 루멘(ER lumen)으로 이동되면서 폴리펩타이드 세린/트레오닌 잔기에 진화적으로 상당히 보존되어 있는 Pmt 단백질에 의해 돌리콜-인산화-만노오스(Dol-P-Man)로부터 만노오스가 부가되어 핵심 O-결합 당사슬이 합성되고, 이어서 골지체로 이동되어 α1,2-만노실 전이효소(KTR family)에 의해 GDP-만노오스로부터 만노오스가 추가로 부가된다.

대규모 재조합 단백질 합성에 사용되는 메탄올자화 효모 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)는 사카로마이시스 세레비지애(S. cerevisiae)와 유사하게 α1,2-연결형 Man1-4-세린/트레오닌 O-결합 당사슬이 형성되고, 부가적으로 가지형 Man6-인산화 O-결합 당사슬이 소량 존재하며 최근에는 말단에 β1,2-만노오스 결합이 존재함이 보고되었다(Biosci. Biotechnol. Biochem. 71, 1415, 2007). 표적 단백질에 대한 기질 특이성을 가지고 있는 Pmt 패밀리는 ScPmt1, ScPmt2, 및 ScPmt4의 계통학적 연관성에 따라 PMT1, PMT2 및 PMT4의 세 개의 아과(subfamily)로 나누며, 전통 효모 사카로마이시스 세레비지애는 6종류의 Pmt 아형이 존재한다. ScPMT1은 ScPMT2 또는 ScPMT3와 이형복합체를 형성하고, ScPMT2는 ScPMT6와도 이형복합체를 형성하며, ScPMT3은 ScPMT5와 이형복합체를 형성하는 반면 ScPMT4는 동형복합체를 형성하여 상호 작용 한다(EMBO J. 15, 5752, 1996; J. Biol. Chem. 278, 12554, 2003). 다른 효모나 진균류에서도 사카로마이시스 세레비지애 PMT의 종분화적 상동성(orthology)을 발견하였는데, 이들 또한 사카로마이시스 세레비지애의 Pmt 단백질과의 상동성에 따라 PMT1, PMT2 및 PMT4 아과로 분류된다. 캔디다 알비칸스(Candida albicans)에는 5개의 PMT 패밀리 멤버(CaPMT1-2, CaPMT4-6)가 있고, 스키조사카로마이시스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 진균성 병원균 크립토코쿠스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)는 PMT 아과마다 한 멤버씩 Pmt1, Pmt2, 및 Pmt4존재한다(Mol. Microbiol. 55, 546, 2005; PLoS One. 4, e6321, 2009; Eukaryot. Cell. 6, 222, 2007).

생물체마다 다양한 형태를 지닌 O-결합 당사슬의 생리적 기능 및 그 중요성은 근래에 들어서 부각되고 있는데, 효모나 균류에서 단백질 O-만노실화는 세포의 성장, 세포의 극성 생장, 세포의 접합, 외부 환경 신호 물질의 인지 등과 같은 세포의 분화(Biochim. Biophys. Acta. 1426, 297, 1999; J. Cell. Biol. 145, 1177, 1999)와, 단백질의 안정성 및 적합한 위치로의 수송과 역수송, 세포벽의 합성과 유지 등에 대해 관련됨이 보고되고 있다. 게다가 최근에 들어서는 인체의 신경계와 근육 세포에서 세포막 단백질인 α-디스트로글리칸(dystroglycan) 단백질의 O-만노실화의 중요성이 보고되고(Biochem. Biophys. Acta, 1473, 237, 1999; J. Biol. Chem. 272, 2156, 1997), 선충류를 제외한 모든 동물에서 O-만노실화 수식이 발견되고 있어 포유류에서도 그 기능이 더 중요시 되고 있다. 더 나아가 O-만노실화는 크립토코쿠스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)나 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)과 같은 병원성 미생물에서 병원성의 중요 인자로 규명되었고(PLoS ONE 4, e6321, 2009; Science 309, 941, 2005), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서도 Pmt 상동 유전자가 존재하며 미생물 세포 상호간 교신에 중요한 기능을 담당하는 당단백질의 당화에 관여한다는 것이 보고되면서(FEMS Microbiol. Lett. 259. 226, 2006), O-만노실화의 중요성이 더욱 주목받고 있다.

인간 유전체 해독 이후 쏟아져 나오는 대량의 표적 단백질들이 신약 후보 물질로 개발될 향후 바이오 의약품 시장에서, 의약용 단백질들을 고품질, 고효율로 생산할 수 있는 단백질 당수식화 제어 및 최적화로 재설계된 분비 기구 등을 갖춘 차세대 분비 발현 시스템의 개발은 무엇보다 중요하다. 특히 메탄올자화 효모인 한세눌라 폴리모르파와 피키아 파스토리스의 경우 사카로마이시스 세레비지애가 지닌 낮은 분비 효율 및 과만노오스 당화(hyper-mannosylation)의 문제점, 동물 세포에서의 이질성 당단백질의 생산 문제점 등을 해결할 수 있는 차세대 당단백질 분비 생산 시스템으로 개발될 잠재력이 매우 높다고 평가되고 있다(Biotechnol. Appl. Biochem. 28, 39, 1998; Glycobiology. 14, 243, 2004; Biosci. Biotechnol. Biochem. 71, 1415, 2007). 피키아 파스토리스의 경우, 미국의 글라이코파이사(Glycofi inc.)에서 N-당질화 경로를 리모델링하여 인간화 N-당사슬을 가진 당단백질과 항체를 효모에서 생산해 낼 수 있음을 보고하였다(Science 301, 1244, 2003; Science 313, 1441, 2006). 한편 일본 연구팀에서 또 다른 메탄올자화효모인 오가타 미뉴타(Ogataea minuta)를 숙주로 개발하여 재조합 항체를 생산할 때 예상치 못한 O-만노실화가 일어나는 문제점을 제기하고 이를 캔디다 알비칸스의 Pmt1 저해제로 알려져 있는 로다민-3-아세트산(rhodanine-3-acetic acid) 유도체를 배지에 첨가하여 O-만노실 당사슬이 감소된 항체를 생산할 수 있음을 보고하였다(Appl. Environ. Microbiol. 74, 446, 2008). 최근 피키아 파스토리스에서 분비 발현한 재조합 인체형 항체(humanized IgG)의 경우도 O-만노실화가 일어남이 보고됨으로써(MAbs. 3, 453, 2011), 효모 발현 시스템에서 N-당질화외에도 O-만노실화 제어 기술을 개발해야 하는 필요성 및 중요성이 크게 인식되기 시작하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 한세눌라 폴리모르파를 숙주로 사용하는 재조합 단백질의 효율적인 발현 및 분비 시스템에 관한 연구를 수행해왔다. 이러한 연구의 일환으로써 한세눌라 폴리모르파에서 재조합 단백질 생산 시 단백질 활성을 악화시키는 O-만노실 당화를 감소시켜 재조합 단백질 본래의 활성을 유지케 하는 숙주를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 한세눌라 폴리모르파의 O-당화 수식 효소인 단백질 O-만노실 전이효소(HpPMT, Hansenula polymorpha Protein O-mannosyltransferase)의 신규 유전자를 동정하였고, 이 유전자의 기능을 성공적으로 확인하였으며, 이 유전자가 결손된 변이주가 재조합 단백질의 O-만노실화를 감소시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 한세눌라 폴리모르파 유래의 단백질 O-만노실 전이효소(HpPMT)를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 한세눌라 폴리모르파 유래의 단백질 O-만노실 전이효소를 코딩하는 핵산분자를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 O-만노실 전이효소를 코딩하는 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 변이주를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2 또는 서열번호 4에 개시된 아미노산 서열 또는 이 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 단백질 O-만노실 전이효소(protein O-mannosyltransferase) 활성을 갖는 분리된 단백질을 제공한다.

본 발명에서 용어 “단백질 O-만노실화(protein O-mannosylation)”은 단백질 O-당질화(O-glycosylation)의 일종으로서, 세포내 소포체에서 돌리콜-일인산-활성화 만노오스의 만노오스를 분비 단백질의 세린 또는 트레오닌 아미노산 잔기로 이전시키는 반응에 의해 개시된다.

본 발명에서 용어 “단백질 O-만노실 전이효소”는 상기 단백질의 아미노산 잔기로의 만노오스의 전이 반응을 촉매하는 효소를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 단백질 O-만노실 전이효소는 메탄올자화 효모인 한세눌라 폴리모르파로부터 분리된 단백질이다.

본 발명의 상기 단백질 O-만노실 전이효소는 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열 또는 서열번호 4에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.

본 명세서에서 개시하는 단백질 O-만노실 전이효소는 메탄올자화 효모 한세눌라 폴리모르파 DL-1 유전체 정보를 토대로 한세눌라 폴리모르파 DL-1 균주(Appl. Microbiol. 26, 982, 1973)에서 기존의 사카로마이시스 세레비지애(S. cerevisiae)유래 단백질 O-만노실 전이효소 ScPMT1의 상동체로 그 기능이 규명된 HpPMT1 (Yeast. 2005 15, 22, 1037) 이외에 신규로 동정된 HpPMT 단백질이다.

본 명세서에서 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 한세눌라 폴리모르파 유래 단백질 O-만노실 전이효소는 “HpPMT5”으로 명명하여 기재하며, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 한세눌라 폴리모르파 유래 단백질 O-만노실 전이효소는 “HpPMT6”으로 명명하여 기재한다.

본 명세서 하기 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 단백질 O-만노실 전이효소는 이의 유전자를 파쇄(disruption)하여 제작한 유전자 결손 변이균주를 대상으로 한 실험을 통해 단백질에 만노오스를 전이시키는 단백질 당화 기능이 확인되었다.

한편, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있으며(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979), 생물학적 균등성을 고려한다면, 본 발명의 상기 단백질 O-만노실 전이효소는 단백질 O-만노실 전이 효소 활성을 보유하는 범위내에서 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 실질적인 동일성(identity)을 나타내는 아미노산 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 여기에서 실질적인 동일성은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 바람직하게는 최소 61％의 동일성, 보다 바람직하게는 70％의 동일성, 보다 더 바람직하게는 80％의 동일성, 가장 바람직하게는 90％ 이상의 동일성을 나타내는 서열을 의미한다. 상기 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 단백질 O-만노실 전이효소는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 보다 더 바람직하게는 97％ 이상의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술된 본 발명의 단백질 O-만노실 전이효소를 코딩하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.

본 발명에서 용어 “핵산 분자”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 바람직하게는 DNA 분자이다. 상기 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 핵산 분자는 서열번호 1 또는 서열번호 3에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HpPMT5 유전자 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HpPMT6 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파의 변이 균주를 제공한다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은 HpPMT5 유전자 또는 HpPMT6 유전자 결손에 추가하여 서열번호 5에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HpPMT1 유전자가 더 결손된 한세눌라 폴리모르파(H. polymorpha) 변이균주를 제공한다.

상기 HpPMT 유전자의 “결손”은 상기 유전자로부터 HpPMT 단백질의 발현을 애초에 차단하거나 발현된 변이 단백질이 정상적인 활성이 나타나지 않게 하는 하는 유전자 변이의 종류를 모두 포함하는 의미이며, 바람직하게는 HpPMT 유전자의 파쇄(disruption)를 의미한다.

본 발명의 HpPMT 유전자가 결손된 상기 한세눌라 폴리모르파(H. polymorpha) 변이균주는 단백질 O-만노실 전이효소의 활성이 결손되어 있으므로, 야생형 균주에 비해 O-만노실화가 감소된 단백질을 생산한다.

본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 한세눌라 폴리모르파 PMT5 유전자 단일 결손 변이균주는 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 과학로 125 번지 한국생명공학연구원)에 2012년 3월 26일 수탁번호 KCTC 12172BP으로 수탁된 균주이다.

본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 한세눌라 폴리모르파 PMT6 유전자 단일 결손 변이균주는 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 과학로 125번지 한국생명공학연구원)에 2012년 3월 26일 수탁번호 KCTC 12175BP으로 수탁된 균주이다.

본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 한세눌라 폴리모르파 PMT1 및 PMT5 유전자 이중 결손 변이균주는 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 과학로 125번지 한국생명공학연구원)에 2012년 3월 26일 수탁번호 KCTC 12173BP으로 수탁된 균주이다.

본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 한세눌라 폴리모르파 PMT1 및 PMT6 유전자 이중 결손 변이균주는 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 과학로 125번지 한국생명공학연구원)에 2012년 3월 26일 수탁번호 KCTC 12174BP으로 수탁된 균주이다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 O-만노실화(O-mannosylation)가 감소된 외래 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다: (a) 상술된 한세눌라 폴리모르파 변이균주에 외래 재조합 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터를 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환 변이균주를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 형질전환 변이균주의 배양물로부터 상기 외래 재조합 단백질을 회수하는 단계.

본 발명의 외래 재조합 단백질 발현벡터는 외래 재조합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 이 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되며 진핵세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터를 포함한다.

본 발명에서 용어 “프로모터”는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다.

본 발명에서 용어 “작동가능하게 연결된(operatively linked)”은 핵산 발현 조절 서열(예컨대 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

본 발명의 발현벡터는 폴리 아데닐화 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998(1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393(1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876(1998)), β-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113(1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790(1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 발현 목적의 외래 단백질은 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자 , 혈액 응고 인자 또는 백신 단백질을 포함한다. 보다 상세하게는, 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, BMP(bone morphogenetic protein), TGF(transforming growht factor), EPO(Erythropoietin), G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor), GM-CSF(granulocyte/macrophage-colony stimulating factor), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-1 알파 및 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGF(epidermal growth factor), 칼시토닌(calcitonin), ACTH(adrenocorticotropic hormone), TNF(tumor necrosis factor), TNFR(tumor necrosis factor receptor), IDS(iduronate-2-sulfatase), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A(dynorphin A), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRH-II(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20(enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin) 또는 지코노타이드을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 상기 발현 벡터를 한세눌라 폴리모르파에 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지된 진핵 세포에 벡터를 형질전환하는 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)), 초산-리튬 DMSO법(Hill et al., Nucleic Acid Res., 19, 5791(1991)) 등을 이용할 수 있다.

본 발명에서 형질전환된 한세눌라 폴리모르파를 배양하는 방법은 효모를 배양하는 당업계의 통상의 방법에 따라 행한다. 예를 들어, 한세눌라 폴리모르파 배양을 위한 배지는 효모가 효율적으로 이용할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염 등을 포함한다면 천연 배지 또는 합성 배지를 모두 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스와 같은 탄수화물; 녹말, 녹말의 가수분해물; 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기산; 메탄올, 에탄올, 프로판과 같은 알코올 등을 포함한다. 질소원은 암모니아; 염화암모늄, 암모늄설페이트, 암모늄아세테이트 및 암모늄포스페이트와 같은 무기산 또는 유기산의 암모늄염; 펩톤, 육추출물(meat extract), 이스트추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두추출물, 대두가수분해물; 다양한 발효된 세포 및 이들의 분해물 등을 포함한다. 무기염은 포타슘디하이드로젠 포스페이트, 다이포타슘하이드로젠 포스페이트, 마그네슘 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 소디엄 클로라이드, 망간 설페이트, 구리 설페이트, 칼슘 카보네이트 등을 포함한다.

배양은 통상적으로 진탕배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 15 내지 40℃에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5 시간 내지 7 일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 암피실린 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다.

본 발명에서 배양된 한세눌라 폴리모르파 세포로부터 발현된 외래 재조합 단백질을 분리하는 방법은 당업계에서 통상적으로 이용되는 단백질의 분리 및 정제 방법을 사용하여 행할 수 있다. 예컨대, 암모늄 설페이트 또는 PEG 등을 이용한 용해도에 따른 분리(solubility fractionation), 분자량에 따른 한외여과 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 다양한 방법이 이용될 수 있고, 통상적으로는 상기한 방법의 조합을 이용하여 분리 및 정제한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.

(i) 본 발명은 재조합 외래 단백질 생산 균주인 한세눌라 폴리모르파의 단백질 O-만노실 전이효소의 신규 유전자에 관한 것이다.

(ⅱ) 또한, 본 발명은 상기 신규 단백질 O-만노실 전이효소 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 변이균주 및 이 변이균주를 사용하여 O-만노실화가 감소된 재조합 외래 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

(ⅲ) 본 발명의 한세눌라 폴리모르파 변이균주는 이 효모 특이적인 O-만노실화가 감소되어 외래 단백질 본래 활성을 보유한 재조합 단백질을 생산하는데 사용될 수 있는 숙주 세포로 개발될 수 있다.

도 1a는 한세눌라 폴리모르파에서 유전체 염기서열을 기반으로 PMT 유전자 패밀리(family)의 상동성을 분석한 것이다. 한세눌라 폴리모르파 HpPMT1, HpPMT2, HpPMT4, HpPMT5, 및 HpPMT6 유전자의 번역된 아미노산 서열을 다른 종 유래의 Pmt 단백질군 상동체들의 아미노산 서열과 비교한 것이다. Sc, 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae); Ca, 캔디다 알비칸스(Candida albicans); Sp, 스키조사카로마이시스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); Hp, 한세눌라 폴리모르파.
도 1b는 한세눌라 폴리모르파 HpPMT1, HpPMT2, HpPMT4, HpPMT5, 및 HpPMT6 유전자가 코딩하는 단백질 및 진균류 유래 Pmt 단백질들의 아미노산 서열을 바탕으로 계통학적 유연관계를 나타낸 도면이다.
도 2a는 한세눌라 폴리모르파 HpPMT5 유전자 파쇄(gene disruption)를 위한 벡터와 세포내 유전자 상동 재조합에 관한 모식도를 나타낸다.
도 2b은 한세눌라 폴리모르파 HpPMT6 유전자 파쇄를 위한 벡터와 세포내 유전자 상동 재조합에 관한 모식도이다.
도 3는 한세눌라 폴리모르파 HpPMT1 유전자, HpPMT5 유전자, HpPMT6 유전자의 단일 결손 변이주들의 생리학적 특징을 분석한 결과이다. 패널 A는 세포벽 저해 물질인 칼코플로어 화이트(calcofluor white, CFW), 카페인(caffeine), SDS(sodium dodecyl sulfate)를 첨가한 배지 조건에서의 성장을 분석한 결과이다. 패널 B는 Pmt1 단백질 저해제 처리 조건에서의 성장을 분석한 것이다. 지수기에 있는 한세눌라 폴리모르파 야생형 균주와 HpPMT 유전자 단일 결손 균주들의 배양액(OD₆₀₀=1.0)을 10배씩 연속적으로 희석하여 25μM의 Pmt1 단백질 저해제 R3A-1c가 첨가된 YPD (1％ 효모 추출물, 2％ 박토-펩톤, 2％ 포도당) 배지에 2 ㎕씩 스팟팅한 후 하루 또는 이틀간 37℃에서 배양하였다. 또한, 온도 민감성을 분석하기 위해 45℃에서 추가로 배양하였다. WT: 야생형 한세눌라 폴리모르파; Δpmt1: HpPMT1 유전자 단일 결손 변이주; Δpmt5: HpPMT5 유전자 단일 결손 변이주; Δpmt6: HpPMT6 유전자 단일 결손 변이주.
도 4는 한세눌라 폴리모르파 HpPMT 유전자 단일 또는 이중 결손 변이주들의 성장 특징에 관한 것이다. 지수기에 있는 한세눌라 폴리모르파 야생형 균주와 HpPMT 유전자 결손 균주들의 배양액(OD₆₀₀=1.0)을 10 배씩 연속적으로 희석하여 여러 물질이 첨가된 YPD (1％ 효모 추출물, 2％ 박토-펩톤, 2％ 포도당) 배지에 2 ㎕씩 스팟팅한 후 2 일간 37℃ 또는 43℃에서 배양하였다. 사용한 배지는 YPD 배지, 그리고 0.6 ㎍/㎖ 앰포테리신 B, 10 mM 카페인, 0.8 ㎍/㎖ 카스포펀진, 50 ㎍/㎖ 칼로플로어 화이트, 1.5 ㎍/㎖ 콩고 레드, 10 ㎍/㎖ 하이그로마이신 B, 0.2 M NaCl, 0.01％ SDS, 0.35 ㎍/㎖ 튜니카마이신 또는 25 μM의 Pmt1 단백질 저해제 R3A-1c가 각각 첨가된 YPD 배지이다. WT: 야생형 한세눌라 폴리모르파; Δpmt1: HpPMT1 유전자 단일 결손 변이주; Δpmt5: HpPMT5 유전자 단일 결손 변이주; Δpmt6: HpPMT6 유전자 단일 결손 변이주; Δpmt1pmt5: HpPMT1 및 HpPMT5 유전자의 이중 결손 변이주; Δpmt1pmt6: HpPMT1 및 HpPMT6 유전자의 이중 결손 변이주.
도 5는 한세눌라 폴리모르파 HpPMT 유전자 단일 또는 이중 결손 변이주들에서 PMT 패밀리 (family) 유전자의 전사체 발현 변화를 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응 (qRT-PCR)으로 분석한 결과이다. 한세눌라 폴리모르파에서 분석된 PMT 패밀리인 HpPMT1, HpPMT2, HpPMT4, HpPMT5, 및 HpPMT6 유전자들을 HpPMT 유전자 결손 변이주들에서 전사량 발현 변화를 실시간 중합효소 연쇄반응으로 분석한 결과이다.
도 6은 한세눌라 폴리모르파 HpPMT 유전자 결손 변이주들에서의 분비 당단백질인 키틴분해효소(chitinase)와 세포 표면 센서 당단백질인 Wsc1과 Mid2의 O-당화 수식 정도를 분석한 결과이다. 패널 A는 야생형 균주와 HppmtΔ 유전자 결손 변이주들의 키틴분해효소를 전기영동 후 실버 염색한 결과이고, 패널 B는 세포 표면 센서 단백질 Wsc1을, 패널 C는 또 다른 세포 표면 단백질인 Mid2를 웨스턴 블롯(Western blot)으로 분석한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 한세눌라 폴리모르파 PMT 유전자 동정 및 서열분석

한세눌라 폴리모르파에서 O-만노실 당사슬 생합성에 관련된 PMT (Protein Mannosyl Transferase) 유전자를 찾기 위하여, 먼저 사카로마이시스 유전체 데이터베이스(SGD, http://www.yeastgenome.org/)에서 PMT 관련 유전자의 아미노산 서열 정보(ScPmt1, ScPmt2, ScPmt3, ScPmt4, ScPmt5, 및 ScPmt6 단백질의 아미노산 서열 정보)를 확보하였다. 이어서, 본 발명자들이 구축한 한세눌라 폴리모르파 DL-1 유전체 사업 정보 데이터베이스에서 tblastn 프로그램을 이용하여 상기 확보한 사카로마이시스 세레비지애의 Pmt 단백질 아미노산 서열과 유사한 5개의 한세눌라 폴리모르파 PMT 유전자들인 HpPMT1, HpPMT2, HpPMT4, HpPMT5, HpPMT6을 선별하였다. 서열분석 결과 HpPmt1 단백질은 ScPmt1과 51％ 동일성(identity)을, HpPmt2 단백질은 ScPmt2와 63％ 동일성을, HpPmt4 단백질은 ScPmt4와 56％ 동일성을, HpPmt5 단백질은 ScPmt5와 25％ 동일성을, HpPmt6 단백질은 ScPmt6과 50％ 동일성을 나타냄을 확인하였다.

한세눌라 폴리모르파 Pmt 단백질과 다른 효모나 진균류들의 Pmt 단백질들 간의 유사성을 알아보기 위하여, HpPmt 단백질 군, ScPmt 단백질 군, CaPmt 단백질 군 및 SpPmt 단백질 군들의 아미노산 서열의 상동성을 소프트웨어(ClustalW, http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html)을 사용하여 분석하였다. 그 결과 한세눌라 폴리모르파의 모든 PMT 유전자들에서 Pmt 단백질 군에서 보이는 보존적인 아미노산 서열 및 활성 도메인이 존재함을 확인하였다(도 1a 참조). 또한, 계통학적 분석 방법을 통해 동정한 5개의 한세눌라 폴리모르파 PMT 유전자들은 두 개의 PMT1 아과(HpPMT1, HpPMT5), 두 개의 PMT2 아과 (HpPMT2, HpPMT6), 하나의 PMT4 아과(HpPMT4)로 분류됨을 확인하였다(도 1b 참조).

실시예 2 : HpPMT5 또는 HpPMT6 유전자 단일 결손 변이 균주의 제작

HpPMT5 유전자의 기능을 알아보기 위하여, 도 2a에 도시된 바와 같이 HpPMT5 유전자 파쇄(disruption) 실험을 수행하였다. 우선 HpPMT5 파쇄 카세트를 제조하기 위하여, HpPMT5 유전자 절편 사이에 HpURA3 선택 표지를 클로닝하였다. 자세히 기술하면, 한세눌라 폴리모르파 DL1-L 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 프라이머 HpPMT5d-N-f (5’-taccgggtacagattagagc-3’: 서열번호 7)와 HpPMT5d-N-r (5’-ctcgagaagctagctcaatgctattgccgcaac-3’: 서열번호 8)을 이용하여 HpPMT5의 N-말단 절편(450 bp)을, HpPMT5d-C-f (5’-gctagcttctcgagtacctgaaaccgctgcaat -3’: 서열번호 9)와 HpPMT5d-C-r (5’- agacacgaaatcagcacg 3’: 서열번호 10)을 이용하여 C-말단 절편(388 bp)을 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 얻었다. HpPMT5d-N-f와 HpPMT5d-C-r를 이용한 융합 PCR을 통하여 HpPMT5의 N-C 말단 융합 절편을 얻은 후, pGEM T-vector에 클로닝하여 pTHpPMT5D를 제작하였다. 완성된 벡터를 N-말단 절편과 C-말단 절편 사이에 존재하는 유일한 NheI 자리로 pTHpURA3LZ 벡터에서 NheI으로 잘라낸 lacZ-HpURA3-lacZ 카세트를 삽입하여 Hppmt5::lacZ-HpURA3-lacZ 파쇄 카세트를 갖는 pTHpPMT5DU 벡터를 제작하였다. 그 다음으로, HpPMT5 유전자를 파쇄시키기 위하여 pTHpPMT5DU 벡터를 NotI으로 잘라 선형화시킨 후 한세눌라 폴리모르파 야생형 DL1-LdU 균주에 도입하였으며, SC-URA 최소 배지에서 형질전환체를 얻었다(도 2a 참조). 상기 과정을 통해 얻은 한세눌라 폴리모르파 PMT5 유전자 단일 결손 변이균주는 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 과학로 125 번지 한국생명공학연구원)에 2012년 3월 26일 수탁번호 KCTC 12172BP으로 기탁하였다.

HpPMT6 유전자의 기능을 알아보기 위하여, 도 2b에 도시된 바와 같이 HpPMT6 유전자 파쇄 실험을 수행하였다. 우선 HpPMT6 파쇄 카세트를 제조하기 위하여, HpPMT6 유전자 절편 사이에 HpURA3 선택 표지를 클로닝하였다. 자세히 기술하면, 한세눌라 폴리모르파 DL1-L 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 프라이머 HpPMT6D_1F (5’-cacctcttcgccaaacat-3’: 서열번호 11)와 HpPMT6D_2B (5’-ctcgagttgctagctttctgcgcattgggtttg-3’: 서열번호 12)를 이용하여 HpPMT6의 N-말단 절편(456bp)을, HpPMT6D_3F (5’-gctagcaactcgagtctcaccacaaccttcaag-3’: 서열번호 13)와 HpPMT6D_4B (5’-ctcagcaggtagtacttg-3’: 서열번호 14)을 이용하여 C-말단 절편(389 bp)을 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 얻었다. HpPMT6d-N-f와 HpPMT6d-C-r를 이용한 융합 PCR을 통하여 HpPMT6의 N-C 말단 융합 절편을 얻은 후, pGEM T-vector에 클로닝하여 pTHpPMT6D를 제작하였다. 완성된 벡터를 N-말단 절편과 C-말단 절편 사이에 존재하는 유일한 NheI 자리로 pTHpURA3LZ 벡터에서 NheI으로 잘라낸 lacZ-HpURA3-lacZ 카세트를 삽입하여 Hppmt6::lacZ-HpURA3-lacZ 파쇄 카세트를 갖는 pTHpPMT6DU 벡터를 완성하였다. 그 다음으로, HpPMT6 유전자를 파쇄시키기 위하여 pTHpPMT6DU 벡터를 NotI으로 잘라 선형화시킨 후 한세눌라 폴리모르파 야생형 DL1-LdU 균주에 도입하였으며, SC-URA 최소 배지에서 형질전환체를 선별하였다(도 2b 참조). 상기 과정을 통해 얻은 한세눌라 폴리모르파 PMT6 유전자 단일 결손 변이균주는 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 과학로 125번지 한국생명공학연구원)에 2012년 3월 26일 수탁번호 KCTC 12175BP으로 기탁하였다.

하기 표 1에는 본 발명에서 제작한 한세눌라 폴리모르파 유전자 파쇄용 벡터 및 균주를 정리하여 나타내었다.

실시예 3: HpPMT5 또는 HpPMT6 유전자 단일 결손 변이 균주의 생리적 특징 분석

한세눌라 폴리모르파 야생형 DL1-L 균주와 HpPMT5 또는 HpPMT6 유전자 단일 결손 변이주(Hppmt5Δ 또는 Hppmt6Δ)의 성장 특징, 특히 세포벽 저해 물질에 대한 감수성을 비교 분석하였다(도 3 참조). 이들 효모 균주들을 2 ㎖ YPD 배지에 220 rpm으로 37℃에서 16 시간 동안 전 배양하여, 무균물 100 ㎕에 처음 OD₆₀₀ 값을 1.0으로 시작하여 연속적으로 1/10 비율로 희석하여, 50㎍/㎖ 칼코플로어 화이트 (Calcofluor white, CFW), 10mM 카페인 (Caffeine), 0.01％ 도데실 황산나트륨 (sodium dodecyl sulfate, SDS), 및 25μM의 R3A-1c가 각각 포함된 YPD 배지에 2 ㎕씩 스팟팅하여, 37℃에서 하루 또는 이틀 동안 배양하였다. 또한, 열 스트레스에 대한 감수성을 알아보기 위해 YPD 배지에 스팟팅하여 45℃에서 하루 동안 배양하였다.

한세눌라 폴리모르파 PMT5 또는 PMT6 유전자의 단일 결손 변이주들의 표현형 분석 결과, 보통의 조건에서 야생형 균주에 비해 HpPMT1 유전자 결손 변이주(Δpmt1)의 성장 속도가 약간 느렸다(도 3의 패널 A 참조). 높은 온도에서 Hppmt1Δ 변이주가 세포 성장에 큰 영향을 받았고, 또한 칼코플로어 화이트(CFW), 카페인(Caffein) 및 도데실황산나트륨(SDS)에 높은 민감성을 보였다. 흥미롭게도 Hppmt5Δ 변이주와 Hppmt6Δ 변이주는 세포벽 저해 물질 처리 조건에서 야생형과 별 다른 차이를 보이지 않았지만(도 3의 패널 A 참조), Pmt1 억제제 R3A-1c에 대해서는 매우 높은 민감성을 나타내었다(도식 3의 패널 B 참조). 상기 결과들은 한세눌라 폴리모르파에서 단백질 O-만노실화를 담당하는 PMT 유전자는 세포의 생장뿐만 아니라 세포벽 합성 및 유지에 중요한 역할을 하는데, 특별히 Pmt1 단백질이 Pmt5 또는 Pmt6 단백질과 상호 작용하여 그 기능을 수행한다는 것을 시사한다.

실시예 4 : HpPMT1/HpPMT5 및 HpPMT1/HpPMT6 이중 결손 변이 균주의 제작과 생리적 특징 분석

HpPMT1 유전자와 HpPMT5 유전자가 동시에 결손된 균주를 제작하기 위하여 먼저 NheI으로 자른 pTHpPMT5D에 pTHpLEU2 벡터를 NheI과 SpeI으로 잘라 얻어낸 HpLEU2 유전자를 클로닝하여 pTHpPMT5DL 벡터를 추가로 완성하였다. 이어서, 완성된 벡터를 제한효소 NotI으로 잘라내어 HpPMT5 유전자의 파쇄 카세트를 얻었고, 한세눌라 폴리모르파 PMT1 유전자 결손 변이주에 형질전환시켜 1M 소르비톨(sorbitol)을 넣어준 SC-LEU 배지에서 37℃에서 배양하여 형질전환체를 수득하였다. 상기 과정을 통해 얻은 한세눌라 폴리모르파 PMT1 및 PMT5 유전자 이중 결손 변이균주는 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 과학로 125번지 한국생명공학연구원)에 2012년 3월 26일 수탁번호 KCTC 12173BP으로 기탁하였다.

또한, HpPMT1 유전자와 HpPMT6 유전자가 동시에 결손된 균주를 제작하기 위하여 먼저 NheI으로 자른 pTHpPMT6D에 pTHpLEU2 벡터를 NheI과 SpeI으로 잘라 얻어낸 HpLEU2 유전자를 클로닝하여 pTHpPMT6DL 벡터를 추가로 완성하였다. 이어서, 완성된 벡터를 제한 효소 NotI으로 잘라내어 HpPMT6 유전자의 파쇄 카세트를 얻었고, 한세눌라 폴리모르파 PMT1 유전자 결손 변이주에 형질 전환하여 SC-LEU 배지에서 37℃에 배양하여 형질전환체를 수득하였다. 상기 과정을 통해 얻은 한세눌라 폴리모르파 PMT1 및 PMT6 유전자 이중 결손 변이균주는 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 과학로 125번지 한국생명공학연구원)에 2012년 3월 26일 수탁번호 KCTC 12174BP으로 기탁하였다.

한세눌라 폴리모르파 야생형 DL1-L 균주와 한세눌라 폴리모르파 PMT 유전자 단일 또는 이중 결손 변이주들의 성장 특징, 특히 세포벽 저해 물질에 대한 감수성을 비교 분석하였다(도 4 참조). 이들 효모 균주들을 2 ㎖ YPD 배지에 220 rpm으로 37 ℃에서 16 시간 동안 전 배양하여, 무균물 100 ㎕에 처음 OD₆₀₀ 값을 1.0으로 시작하여 연속적으로 1/10 비율로 희석하여, 0.6 ㎍/㎖ 앰포테리신 B (Amphotericin B, AMB), 10 mM 카페인(Caffeine), 0.8 ㎍/㎖ 카스포펀진(Caspofungin, CAS), 50 ㎍/㎖ 칼코플로어 화이트(Calcofluor white, CFW), 1.5 ㎍/㎖ 콩고 레드(Congo red), 10 ㎍/㎖ 하이그로마이신 B(Hygromycin B, HgB), 0.2 M 염화나트륨(NaCl), 0.01％ 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS), 0.35 ㎍/㎖ 튜니카마이신(Tunicamycin, TM), 및 25 μM의 R3A-1c가 각각 포함된 YPD 배지에 2 ㎕씩 스팟팅하여, 37℃에서 2일 동안 배양하였다. AMB와 CFW, R3A-1c는 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹여 배지에 첨가했기 때문에 대조군으로 YPD 배지에 동일한 양의 DMSO를 넣어주었다. 또한, 열 스트레스에 대한 감수성을 알아보기 위해 YPD 배지에 스팟팅하여 43℃에서 2일 동안 배양하였다.

한세눌라 폴리모르파 PMT 유전자 단일 또는 이중 결손 변이주들의 표현형을 분석한 결과, 보통의 조건에서 야생형 균주에 비해, HpPMT1와 HpPMT5 및 HpPMT6 유전자의 이중 결손 변이주(Hppmt1Δ/Hppmt5Δ 및 Hppmt1Δ/Hppmt6Δ)의 성장 속도가 느렸다(도 4 참조). 높은 온도에서는 Hppmt1Δ 변이주가 세포 성장에 큰 영향을 받았고, 또한 카페인, 칼코플로어 화이트, SDS, 및 튜니카마이신에 매우 높은 민감성을 보였다. 흥미롭게도 Hppmt1Δ/Hppmt5Δ 와 Hppmt1Δ/Hppmt6Δ 이중 결손 변이주는 Hppmt1Δ 단일 변이주가 보인 민감성보다 심각한 성장 결함을 나타냈다. 특히, Hppmt1Δ 변이주에서는 별다른 영향을 보이지 않은 콩고 레드와 하이그로마이신 B에 대해 Hppmt1Δ/Hppmt5Δ 변이주와 Hppmt1Δ/Hppmt6Δ 변이주는 민감성을 확실하게 보였다. 그러나, 앰포테리신 B, 카스포펀진, 삼투 스트레스에 대해서는 어떤 Hppmt 결손 변이주도 영향을 받지 않았다. 상기 결과들은 단백질 O-만노실화를 담당하는 PMT 유전자는 한세눌라 폴리모르파에서 세포의 생장과 형태뿐만 아니라 세포벽의 합성과 유지에 매우 중요한 역할을 할 것을 시사한다. 특별히, 한세눌라 폴리모르파 PMT5와 PMT6 유전자는 PMT1 유전자와 중복된 기능을 지니고 있어 세포 성장과 세포벽 보존에 부수적인 기능을 할 것으로 사료된다.

실시예 5: 한세눌라 폴리모르파 pmt 유전자 변이균주에서 PMT 유전자의 발현 분석

한세눌라 폴리모르파 야생균 DL1-L과 HpPMT 유전자의 단일 또는 이중 결손 변이 균주를 2 ㎖ YPD 배지에 220 rpm으로 37℃에서 16 시간 동안 전 배양한 후, 100 ㎖ YPD 배지에 초기 OD₆₀₀이 0.25가 되도록 접종한 후 같은 조건으로 본 배양하여 최종 OD₆₀₀가 1.0이 되는 시점에서 세포들을 회수하였다. 회수한 세포는 DEPC (Diethylpyrocabohydrate) 처리한 증류수로 세척한 후, 액체질소에서 급속 냉각시켜 -70℃에 보관하였다. 냉동시킨 세포를 얼음에서 천천히 녹인 후 TES(10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.5％ SDS) 용액으로 세척한 후, 다음과 같은 방법으로 총 RNA를 분리 정제하였다. 750 ㎕의 TES 용액을 넣고 같은 양의 산성 페놀-클로로포름을 넣은 후 65℃에서 10 분간 가열하고 10초간 세게 흔들어주는 과정을 1시간 동안 반복하고, 14,000 rpm으로 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다.

650㎕ 상등액을 조심스럽게 새 튜브로 옮기고 같은 양의 산성 페놀-클로로포름을 넣어 잘 섞어주고, 4℃에서 14,000rpm으로 10분 동안 원심 분리하였다. 다시 600 ㎕의 상등액을 조심스럽게 새 튜브로 옮긴 후, 같은 양의 클로로포름-아이소아밀 알코올을 넣어 잘 섞어주고 상기 조건과 동일하게 원심 분리하였다. 최종적으로 550 ㎕ 상등액만을 취해 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨(sodium acetate)과 2.5 배 부피의 100％ 에탄올을 넣어, 10번 정도 인버팅(intverting)한 후, -70℃에서 30 분(-20℃에서 약 16시간) 동안 보관하였다. 이어서, 4℃에서 14,000rpm으로 15분 동안 원심 분리한 뒤, 70％ 에탄올을 넣어 10분 간 세척하고, 다시 4℃에서 14,000rpm으로 10분 동안 원심 분리한 뒤, 상등액은 버리고 침전물을 공기 중에서 건조시켰다. 건조된 침전물을 핵산분해효소가 포함되어 있지 않은 물에 녹인 후 분리한 RNA의 정량을 위해 OD₂₈₀ 및 OD₂₆₀의 값을 측정하고, 1.2％ 아가로즈 젤 전기영동을 통해 순도를 확인하였다.

상기와 같은 방법으로 정제한 5 ㎍의 RNA 샘플에 DNA 분해효소 I (Fermentas)을 37℃에서 1시간 처리하여 DNA를 모두 제거하였고, 에탄올 침전을 통해 RNA를 농축한 후 정량을 하였다. 다음으로 1 ㎍ RNA 샘플에 oligo-dT (18 mer) 프라이머와 10 mM dNTP를 넣고 65℃에서 5분 간 반응을 준 뒤, 1 분간 얼음에서 식힌 후, RNA 분해 효소 저해제, FS 버퍼, 그리고 0.1M 디티오트레이톨(DTT)를 넣고 37℃에서 2분 간 반응시킨 뒤, M-MLV 역전사 효소(Invitrogen)를 첨가하여 37℃에서 50분 동안 반응시켰으며, 70℃에서 15 분간 두어 역전사 효소를 불활성화 시켜 반응을 중지시켰다.

완성된 cDNA 1 ng을 주형으로 표 2 에 제시된 PMT 유전자 아과(subfamily)들에 대한 프라이머를 가지고 Invitrogen 사의 Maxima SYBR Green qPCR Master Mix를 사용하여 PCR 분석을 수행하였다. PCR 반응 조건은 95℃에서 5분간 Taq 중합효소를 활성화시키고, 62℃에서 30초간 결합 및 신장, 95℃에서 10초 간 변성하는 PCR 반응을 총 40회 반복 수행하였다. 하기 표 2에 본 발명에서 qRT-PCR을 통한 PMT 유전자 발현 분석에 사용된 프라이머를 정리하여 나타내었다.

정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR) 결과, 각각의 HpPMT 유전자 단일 또는 이중 결손 변이주에서 해당하는 결손 유전자의 발현이 전혀되지 않는 것을 확인함으로써 모든 Hppmt 유전자 결손 변이주가 정상적으로 제조되었다는 것을 확실하게 확인할 수 있었다(도 5 참조). 또한 야생형 균주에서 형광 시그널이 역치를 넘어가기 위해 필요한 중합효소반응의 주기 수를 의미하는 Ct값이 PMT1, PMT2, 및 PMT4 유전자는 평균 24인 반면, PMT5 유전자와 PMT6 유전자는 각각 평균 26과 28을 보였다. 이는 PMT5와 PMT6 유전자의 발현 정도가 다른 PMT 유전자들에 비해 약하다는 것을 의미하고, 결과적으로 Pmt5 단백질과 Pmt6 단백질은 주된 기능을 지닌 Pmt1 단백질과 Pmt2 단백질과 중복되는 기능을 보조적으로 수행할 것을 시사한다.

야생형 균주와 비교하여 HpPMT5 유전자 결손 변이주 및 HpPMT6 유전자 결손 변이주에서는 어떤 PMT 유전자도 눈에 띄는 발현양의 변화를 보이지 않았다. 반면, Hppmt1Δ/HPpmt5Δ의 이중 결손 변이주에서는 PMT4와 PMT6 유전자의 발현양이 각각 2.0배, 1.4배로 증가하였고, Hppmt1Δ/HPpmt6Δ의 이중 결손 변이주에서는 PMT2, PMT4 및 PMT6 유전자의 발현양이 각각 1.9배, 2.9배, 2.2배 증가하였다. 특히, PMT1과 PMT6가 동시에 결손된 균주에서 PMT1과 PMT5가 동시에 결손된 균주에서보다 다른 PMT 유전자들의 발현양이 더 크게 증가하였는데, 이것은 서로 다른 군에 속하는 PMT 유전자들이 함께 결손됨으로써 PMT 기능에 더 큰 영향을 주었기 때문인 것으로 사료된다. 또한 이러한 결과는 Pmt 단백질들이 서로의 결함된 기능을 보완하는 일종의 보상 기작이 존재할 것을 시사한다.

실시예 6 : HpPMT 유전자 결손 변이주들에서 분비 당단백질의 O-만노실화 양상의 분석

PMT 유전자 결손이 분비 당단백질의 O-만노실화에 미치는 영향을 조사하기 위해 N-당질화 없이 O-만노실화만 되는 당단백질로 알려진 한세눌라 폴리모르파 키틴분해효소의 당질화 양상을 분석하였다. 한세눌라 폴리모르파 야생형 DL1-L 균주와 HpPMT 유전자 단일 또는 이중 결손 변이주들을 25 ㎖ YPD 배지에 OD₆₀₀ = 0.05로 초기 접종하여, 24 시간 동안 배양하여 얻은 세포 배양액을 2500 rpm으로 20 분간 원심 분리하여 상등액만을 얻어내었다. 이 상등액에 미리 준비한 멸균수로 세척한 키틴-비드(chitin-bead)를 넣고 4 시간 동안 배양하였다. 이 혼합물을 다시 3000 rpm으로 원심분리하고, PBS 완충액[137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄ (pH 7.4)]로 세척한 후, 샘플 로딩 버퍼와 1:1 비율로 혼합하여 5 분간 끓인 후 샘플을 6％ SDS-PAGE젤에 전개하였고, 실버 염색법(silver staining)을 통해 단백질을 확인하였다.

분석 결과, 기존에 보고된 바와 같이(Yeast. 222, 1037, 2005), DL1-L 균주 유래의 Hppmt1Δ 단일 결손 변이주의 경우에는 키틴분해효소의 크기가 작아져 전기영동 이동 속도가 증가함을 알 수 있었다. 또한, 본 발명에서 제작된 Hppmt1Δ/Hppmt5Δ와 Hppmt1Δ/Hppmt6Δ 이중 결손 변이주의 경우에는 전기영동 이동 속도가 더욱 증가하여 효소의 크기가 단일 결손 변이주에 비해 보다 더 감소하였음을 알 수 있었다(도 6의 패널 A 참조). 이러한 결과는 키틴분해효소의 O-당화 정도가 감소하여 단백질의 전체적인 크기가 감소하였기 때문에 나타난 결과이다. 이를 통해 한세눌라 폴리모르파 PMT1 유전자가 키틴분해효소의 O-당화에 중요하게 작용함을 알 수 있었으며, 본 발명에서 신규로 확인된 HpPMT5와 HpPMT6 유전자는 HpPMT1 유전자와 O-당화 기능에서 중복되어 상호보완적인 기능을 한다는 것을 알 수 있었다. 반면, Hppmt5Δ와 Hppmt6Δ 단일 결손 변이주의 경우에서는 O-당화에 별다른 변화를 관찰할 수 없었다.

실시예 7 : HpPMT 유전자 결손 변이주에서 세포 표면 당단백질들의 O-당화 분석

효모의 세포 표면을 구성하는 대부분의 단백질들은 N-당질화외에도 O-만노실화가 많이 되는 당단백질들로서, 전통효모의 경우 세포표면 센서 당단백질로 알려진 Wsc1과 Mid2 단백질들이 O-만노실화가 됨이 보고되어 있다(Mol. Cell. Biol. 19, 3969, 1999; Mol. Cell. Biol. 21, 271, 2001). 따라서 아미노산 상동성 분석을 통해 한세눌라 폴리모르파에서도 이들 세포 표면 센서 단백질(HpWsc1p, HpMid2p)이 존재함을 확인하고, 이들에 대한 당화 양상을 분석하였다. 먼저, 6HA가 달린 Wsc1 발현 벡터를 제작하기 위하여 지오신-내성 유전자(zeocin-resistant gene)를 포함하는 pHIGAZ-6HA 발현 벡터를 BglII와 AscI으로 잘라 GAPDH 프로모터를 제거하고, 그 사이에 PCR을 통해 얻은 HpWSC1 유전자의 프로모터와 오픈 리딩 프레임(ORF)를 동일한 제한효소로 잘라 클로닝하여 HpWSC1의 C-말단에 6HA가 결합된 pHINZ-HpWSC1-6HA 벡터를 제작하였다. 이어서, 6HA가 결합된 Wsc1 발현 균주를 만들기 위해 완성된 pHINZ-HpWSC1-6HA 벡터를 원형 형태로 DL1-L, Hppmt1Δ, Hppmt5Δ, Hppmt6Δ, Hppmt1Δ/Hppmt5Δ, 및 Hppmt1Δ/Hppmt6Δ 균주에 각각 형질전환시켜, YPD + 100 ㎍/㎖ 지오신 또는 YPD + 100 ㎍/㎖ 지오신 + 1M 소르비톨(sorbitol)에서 선별하였다.

다음으로, 네 개의 Flag가 달린 Mid2 발현 벡터를 제작하기 위하여 지오신-내성 유전자를 포함하는 pHIGAZ-4Flag 발현 벡터를 BglII와 AscI으로 잘라 GAPDH 프로모터를 제거하고 그 사이에 PCR을 통해 얻은 HpMID2 유전자의 프로모터와 ORF를 동일한 제한효소로 잘라 클로닝하여 HpMID2의 C-말단에 4Flag가 결합된 pHINZ-HpMID2-4Flag 벡터를 제작하였다. 이어서, 4Flag가 결합된 Mid2 발현 균주를 만들기 위해, 완성된 pHINZ-HpMID2-4Flag 벡터를 원형 형태로 DL1-L, Hppmt1Δ, Hppmt5Δ, Hppmt6Δ, Hppmt1Δ/Hppmt5Δ, 및 Hppmt1Δ/Hppmt6Δ 균주에 각각 형질전환시켜 YPD + 100 ㎍/㎖ 지오신 또는 YPD + 100 ㎍/㎖ 지오신 + 1M 소르비톨(sorbitol)에서 선별하였다.

HA와 Flag가 각각 결합된 HpWsc1과 HpMid2의 발현 벡터를 발현하는 야생형 DL1-L 균주와 HpPMT 유전자의 단일 또는 이중 결손 변이주들을 50 ㎖ YPD 배지에 초기 OD값이 0.5가 되도록 접종하여 37℃에서 4시간 동안 배양한 뒤, 세포를 회수하고 멸균수로 한 번 씻어 주었다. 여기에 용해 완충액[50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.3 mM MgCl₂, 1 mM PMSF, 1x PIC]를 넣어 세포를 현탁한 후, 지름 0.4 mm 유리 구슬(glass bead)을 넣고 1 분간 볼텍싱(vortexing)하고 1분간 얼음에 두는 과정을 5회 반복하여 세포를 용해시켰다. 5,000 rpm에서 5분 간 원심 분리하여 세포 용해물의 총 단백질을 얻었다. 얻은 단백질은 10％ SDS-PAGE 젤에 전개하여, PVDF 막으로 옮겨주었고, 단백질이 옮겨간 PVDF 막을 5％ 탈지유(skim milk) 용액으로 블로킹(blocking) 해주고, 항-HA 항체(1:2000, Sigma)나 항-Flag 항체 (1:1000, Sigma)를 이용하여 4℃에서 하룻밤 일차 항체 반응을 시켜주었다. 다음에 TBST [50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.05％ Tween 20] 용액으로 15분씩 3번을 씻어준 후, 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase, AP)가 결합되어 있는 항-랫트(Rat) 항체(1:10000, Sigma)나 항-생쥐(mouse) 항체(1:10000, Sigma)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 이차 항체 반응을 시켜주었다. TBST 용액으로 15분씩 3번을 씻어준 후, NBT/BCIP 기질을 이용한 발색 반응을 통해 단백질을 검출하였다.

실험 결과, 야생형 균주에서 두 센서 단백질 모두 O-당화 수식이 많이 된다는 것을 확인할 수 있었고, Hppmt1Δ, Hppmt5Δ 및 Hppmt6Δ 결손 변이주에서는 야생형 균주에서와 비슷한 결과를 보였다(도 6의 패널 B 및 패널 C 참조). 반면, Hppmt1Δ/Hppmt5Δ과 Hppmt1Δ/Hppmt6Δ 이중 결손 변이주에서는 Wsc1과 Mid2 단백질이 야생형 균주에서보다 그 크기가 확연히 감소된 것을 관찰하였는데, 이는 두 단백질이 O-당화 수식을 덜 받았다는 것을 보여주는 것이다. 이러한 결과를 통해 Pmt1, Pmt5, Pmt6 단백질들이 세포표면에 존재하면서 세포벽 보전 신호전달 경로에서 센서로 기능하는 Wsc1 및 Mid2 단백질의 O-당화 수식에 관여함을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원 KCTC12173BP 20120326 한국생명공학연구원 KCTC12174BP 20120326 한국생명공학연구원 KCTC12172BP 20120326 한국생명공학연구원 KCTC12175BP 20120326

<110> CHUNG-ANG University Industry Academic Cooperation Foundation Korea Reasearch Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A Novel Hansenula polymorpha Gene Coding for Protein O-mannosyltransferase and Hansenula polymorpha Mutant Strain Deficient in the Same Gene <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1893 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <400> 1 atggatatgc ccaaaaaaca ccgaatacaa ttggtggccg ttgcggcaat agcattgggc 60 ctacggctgt acaacatcgg ctctcctcag gtcctggttc ccgaggaatc caaaattcac 120 gactccgtgt caaattacct gtcgggcagt ttttacctcg ctcctgaccc accgcttcca 180 ggcctcatat acgcggctat tgtgtttctt ggaggtggaa gtgtatcatg gtctcttctt 240 cgatcgctga gcgcactttt cggaacagct accgtgctcc tcacgtacaa aactttgcaa 300 gcgtgtcggg tcagccacaa gatcgcactt tctggcgctc ttttggtggc cttcgacaac 360 tcgtttgtgc aggagtccag actggccact ggggtctcac caacgctgtt tttcttcagt 420 caggcaatag ccctaaccaa gacgctggac gggaagccta gcaaaaaacg caaagttgca 480 gcacttttgg gcagctcgat tgcactagga tgtctggtgg cctccaactg gataggactg 540 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Asn Leu Leu His Ser His Pro Ser Lys Tyr Pro Ala Gly Ser 340 345 350 Glu Gln His Gln Val Thr Thr Tyr Gly Phe Lys Asp Ala Asn Asn Asn 355 360 365 Phe Ile Val Arg Pro Ala Arg Thr Gln Arg Asn Tyr Gly Pro Phe Ile 370 375 380 Gln Asn Gly Asp Ala Ile Arg Leu Gln His Glu Leu Thr Lys Ala Asn 385 390 395 400 Leu His Ser His Ala Ile His Ala His Val Ser Glu Arg Tyr Trp Glu 405 410 415 Val Ser Gly Tyr Gly Asp Glu Thr Val Gly Asp Ala Lys Asp Asp Trp 420 425 430 Val Val Glu Ile Val Glu Gln Leu His Ser Gly Asn Lys Ser Tyr Ala 435 440 445 Ala Thr Glu Asn Gly Pro Asp Phe Tyr Ser Thr Val His Pro Leu Thr 450 455 460 Thr Thr Phe Lys Leu Arg His Lys Val Leu Gly Cys Tyr Leu Ala Thr 465 470 475 480 Thr Gly Glu Ser Tyr Pro Thr Trp Gly Phe Lys Gln Gly Glu Val Val 485 490 495 Cys Arg Pro Asp Thr Arg Leu Pro Phe Asp Arg Ser Thr Leu Trp Asn 500 505 510 Val Glu Met His Glu Asn Asp Asp Leu Ala Val Glu Ser Asp Tyr Val 515 520 525 Tyr Pro Ser Pro Arg Phe Leu Val Asp Phe Phe Met Val Gln His Gly 530 535 540 Met Leu Ala Ser Asn Asn Ala Leu Val Pro Asp Val His Lys His Asp 545 550 555 560 Glu Ile Ala Ser Phe Trp Trp Gln Trp Pro Phe Ala Leu Val Gly Leu 565 570 575 Arg Met Cys Ser Trp Gly Pro His Val Thr Lys Tyr Tyr Leu Leu Ser 580 585 590 His Pro Phe Thr Thr Trp Phe Ser Thr Ala Cys Leu Gly Val Phe Val 595 600 605 Leu Leu Ala Val Arg Leu Leu Leu Leu Trp Gln Arg Gln Gln Leu Ala 610 615 620 Val Ser Ala Asp Gln Leu Trp Lys Phe Thr Ile Cys Gly Leu Val Pro 625 630 635 640 Phe Val Gly Trp Leu Leu His Tyr Leu Pro Phe Ile Val Met Gly Arg 645 650 655 Val Thr Tyr Val His His Tyr Met Pro Ala Leu Tyr Phe Ala Met Tyr 660 665 670 Val Ala Gly Phe Val Val Glu Tyr Val Thr Gly Ser Ser Arg Ile Arg 675 680 685 Tyr Val Val Tyr Gly Val Leu Tyr Ala Leu Val Gly Tyr Leu Phe Trp 690 695 700 Tyr Phe Ser Pro Leu Cys Leu Gly Met Ser Gly Arg Ala Ser Asp Tyr 705 710 715 720 Ala Tyr Leu Asn Trp Leu Pro Gly Trp Asn Ile Ala Lys *** 725 730 <210> 5 <211> 3163 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <400> 5 ctcgagtttg gccagtgcaa agaaggacga gaaggttttg gccagaatcg agcggtcgca 60 gagcaagctc gggtacgagc tcaagccgta ccaatttaat atgaaacagg tggaggcgtt 120 ccggtaccgg atggaggact cgttccggtc cgtgacccgt gcggctgtgc gagatgcccg 180 actacgggag attaaacagg agctgatggc ctctgagaag ctgaaacgcc attttgagga 240 gaacccgcag gacctggtca ctttgcgcca cgacaaagac ctggccagcg tgcgtgcgga 300 cgcacatctg aaaagagtgc cgacgtacct gctaccagag ggggcgcggc cgaggagaag 360 aagttgggtt tgtgccgttc acaaggtgaa gaagggccgt ggcaagaaga gaggcaagaa 420 ggtggatgtg ctgaaggggg ttggaaagag aagaaaaaca tagctcgcca ataacgcata 480 ttaaatgtca aaaaaaaata aaaaaatgaa tatttttctt ttaagctcgt cgttattttt 540 ttcgtgtctt gttttcatca tggcaaagaa acccgtcaag ctggctccgt ctacgacgga 600 ttccactaca gaacttcctt tacagcccgg ccctgtccgc agatacttat cgacgacgct 660 ggggccgcag acaatggcta atcgccgtgt ttcctcgggt aaggagatgg ggctcgttgt 720 gctgttggcc ctgttcatcg ccgtgattcg gctccgcagc ctcgatttcc ccgactcagt 780 ggtgtttgac gaggtgcatt ttggcggatt cgcgagaaaa tacattctgg gccgtttttt 840 catggacgtc catcctcctc tggccaagct gttatttgcg gcggtgggtg cccttggagg 900 atttaatggc aagtttgaat ttgccgaaat cggcgacaag ttccccgacg acgtgccgta 960 cgtcctcatg agacagctga gcgccttctt gagcgtcggt accgtggtcc tcatgtactt 1020 gactctcaga accaccggct gcaagccact ggtttccttc ctgacgtcat cgttgctggt 1080 gctcgagagt gccaatgcca ccatctcgcg gtttgttttg ctcgactcgc cgctgctctt 1140 cttcattgcc gccgccacct atgccagctc caagctcaac attgagactc cattcactct 1200 caactggtgg aaatctttgg tgctgaccgg cgtcggtctg ggctttgcct catcctccaa 1260 atgggtcggc ttctttactg ttgcgtgggt gggcgtttgc tgtgccatca agctctggtt 1320 cgcggttgga gacctcaaac tgtcggccaa aaacatcgct tctcagactg tcaccaagtt 1380 cgtggtcctg cttggactcc cggccatcat ctacctggct tcatttgcca tccatctctc 1440 gttgctgccc tacgagggtg acggtgctgc attcctgtca tctgcgttca gaacctcgtt 1500 caaagacact actgttccta aaaccaccct cgcagacgtt ggtatcggct ctgtcgtgac 1560 cctgagacat gtgaatacca atggcggata cctacattcc cacaaccatc tgtacgaggg 1620 aggctctggg caacagcaga tcacgctgta tccacacctt gacgacaaca acaagtggct 1680 tgttgagctg tacaatgcca ccgaggagcc aacagctttc gagccgctga ccgacggaac 1740 caagatcaga ctgaagcatt tgttgacaca cagaagactg cactcgcacg atatccgtcc 1800 atctgtttct gaaatcgact ggcagaacga ggcctcgtgc tacgggtacg agggctttga 1860 aggcgatccg aacgacgact ttattgtcga gatcgttaaa gacgagtctg ttccgggaaa 1920 agcgcaggag acagtcaagg ctatagacac cattttcagg ctcagacacg ccatgacagg 1980 ctgctacctg ttctcgcacg agaccaagct gcctaaatgg ggcttcgaac aacaggaggt 2040 cacgtgtgca ggccagggca tcaagccgct ctcgtactgg tacattgagc agaacgagaa 2100 ccagttcctg gatccagcga ctgcagaaaa ggtctcctac aaggagctgt ctttcctgca 2160 aaaaatggca gagctgcaca gcaaaatgtg gaagatcaac aggggactta aggcacccca 2220 tgcgttcgag tcgagaccgg agtcatggcc atttttgcag cgcggcatct cgtactggaa 2280 acaaggcgac agacaggtgt acttgcttgg aaaccctatt gtttggtggc tgtcgtcgtc 2340 tttgtttgtt ccgttcgggc ttttcgtcgt ctaccacgtg ctgagatggc agctgggcta 2400 cccgcttccg gaaagctctg ttgttttcaa ctactctctc aacacattgc aatttcttct 2460 tggctggttc attcactact atccttcgtt cctgatggac agacagctgt ttttgcacca 2520 ctatctgcct gccctatact ttggcatttt gaccttgggc cagtcgtttg aggtgatcta 2580 ctcggccgtt ttgaaaaaca gaaaatctgt ggctatcgtg ctgttccttg ctgtctttgc 2640 aggcgctgcc cacatgtttg tgaagagatc gccgatcgtg ttcggctccg cgtggaccaa 2700 gtcggcctgc gaagcggcca agatgctcaa ctgggacttc gactgcaaaa tttacccaga 2760 cgagctgccg ctgaccggcg gcctcaaaga tgagctctag gtatataaaa gataaaagac 2820 gtcaattttt gttcattaga cacaaatgca tttagtgcga gcgcgactcg tcaatgagcg 2880 tccgcagctg gcggatatcg gctggccccg tgcgacagca cccgcccacg atgcccacgc 2940 gcttgtactg cagacactgc ttcacggcct cgacaaaatg gctcggctcg cccgaccatt 3000 tcttcgtcgt gccgtcgtac acctctcccg agttcggata cagcacaatc cgggcgtttc 3060 gcaggttctg cgagtccgag agccgacggt cgagctcttc caccactggc aaagccaccc 3120 ttacaccaca gcagttgaca ccgaccgcga cgatattgcg atc 3163 <210> 6 <211> 746 <212> PRT <213> Hansenula polymorpha <400> 6 Met Ala Lys Lys Pro Val Lys Leu Ala Pro Ser Thr Thr Asp Ser Thr 1 5 10 15 Thr Glu Leu Pro Leu Gln Pro Gly Pro Val Arg Arg Tyr Leu Ser Thr 20 25 30 Thr Leu Gly Pro Gln Thr Met Ala Asn Arg Arg Val Ser Ser Gly Lys 35 40 45 Glu Met Gly Leu Val Val Leu Leu Ala Leu Phe Ile Ala Val Ile Arg 50 55 60 Leu Arg Ser Leu Asp Phe Pro Asp Ser Val Val Phe Asp Glu Val His 65 70 75 80 Phe Gly Gly Phe Ala Arg Lys Tyr Ile Leu Gly Arg Phe Phe Met Asp 85 90 95 Val His Pro Pro Leu Ala Lys Leu Leu Phe Ala Ala Val Gly Ala Leu 100 105 110 Gly Gly Phe Asn Gly Lys Phe Glu Phe Ala Glu Ile Gly Asp Lys Phe 115 120 125 Pro Asp Asp Val Pro Tyr Val Leu Met Arg Gln Leu Ser Ala Phe Leu 130 135 140 Ser Val Gly Thr Val Val Leu Met Tyr Leu Thr Leu Arg Thr Thr Gly 145 150 155 160 Cys Lys Pro Leu Val Ser Phe Leu Thr Ser Ser Leu Leu Val Leu Glu 165 170 175 Ser Ala Asn Ala Thr Ile Ser Arg Phe Val Leu Leu Asp Ser Pro Leu 180 185 190 Leu Phe Phe Ile Ala Ala Ala Thr Tyr Ala Ser Ser Lys Leu Asn Ile 195 200 205 Glu Thr Pro Phe Thr Leu Asn Trp Trp Lys Ser Leu Val Leu Thr Gly 210 215 220 Val Gly Leu Gly Phe Ala Ser Ser Ser Lys Trp Val Gly Phe Phe Thr 225 230 235 240 Val Ala Trp Val Gly Val Cys Cys Ala Ile Lys Leu Trp Phe Ala Val 245 250 255 Gly Asp Leu Lys Leu Ser Ala Lys Asn Ile Ala Ser Gln Thr Val Thr 260 265 270 Lys Phe Val Val Leu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Ile Tyr Leu Ala Ser 275 280 285 Phe Ala Ile His Leu Ser Leu Leu Pro Tyr Glu Gly Asp Gly Ala Ala 290 295 300 Phe Leu Ser Ser Ala Phe Arg Thr Ser Phe Lys Asp Thr Thr Val Pro 305 310 315 320 Lys Thr Thr Leu Ala Asp Val Gly Ile Gly Ser Val Val Thr Leu Arg 325 330 335 His Val Asn Thr Asn Gly Gly Tyr Leu His Ser His Asn His Leu Tyr 340 345 350 Glu Gly Gly Ser Gly Gln Gln Gln Ile Thr Leu Tyr Pro His Leu Asp 355 360 365 Asp Asn Asn Lys Trp Leu Val Glu Leu Tyr Asn Ala Thr Glu Glu Pro 370 375 380 Thr Ala Phe Glu Pro Leu Thr Asp Gly Thr Lys Ile Arg Leu Lys His 385 390 395 400 Leu Leu Thr His Arg Arg Leu His Ser His Asp Ile Arg Pro Ser Val 405 410 415 Ser Glu Ile Asp Trp Gln Asn Glu Ala Ser Cys Tyr Gly Tyr Glu Gly 420 425 430 Phe Glu Gly Asp Pro Asn Asp Asp Phe Ile Val Glu Ile Val Lys Asp 435 440 445 Glu Ser Val Pro Gly Lys Ala Gln Glu Thr Val Lys Ala Ile Asp Thr 450 455 460 Ile Phe Arg Leu Arg His Ala Met Thr Gly Cys Tyr Leu Phe Ser His 465 470 475 480 Glu Thr Lys Leu Pro Lys Trp Gly Phe Glu Gln Gln Glu Val Thr Cys 485 490 495 Ala Gly Gln Gly Ile Lys Pro Leu Ser Tyr Trp Tyr Ile Glu Gln Asn 500 505 510 Glu Asn Gln Phe Leu Asp Pro Ala Thr Ala Glu Lys Val Ser Tyr Lys 515 520 525 Glu Leu Ser Phe Leu Gln Lys Met Ala Glu Leu His Ser Lys Met Trp 530 535 540 Lys Ile Asn Arg Gly Leu Lys Ala Pro His Ala Phe Glu Ser Arg Pro 545 550 555 560 Glu Ser Trp Pro Phe Leu Gln Arg Gly Ile Ser Tyr Trp Lys Gln Gly 565 570 575 Asp Arg Gln Val Tyr Leu Leu Gly Asn Pro Ile Val Trp Trp Leu Ser 580 585 590 Ser Ser Leu Phe Val Pro Phe Gly Leu Phe Val Val Tyr His Val Leu 595 600 605 Arg Trp Gln Leu Gly Tyr Pro Leu Pro Glu Ser Ser Val Val Phe Asn 610 615 620 Tyr Ser Leu Asn Thr Leu Gln Phe Leu Leu Gly Trp Phe Ile His Tyr 625 630 635 640 Tyr Pro Ser Phe Leu Met Asp Arg Gln Leu Phe Leu His His Tyr Leu 645 650 655 Pro Ala Leu Tyr Phe Gly Ile Leu Thr Leu Gly Gln Ser Phe Glu Val 660 665 670 Ile Tyr Ser Ala Val Leu Lys Asn Arg Lys Ser Val Ala Ile Val Leu 675 680 685 Phe Leu Ala Val Phe Ala Gly Ala Ala His Met Phe Val Lys Arg Ser 690 695 700 Pro Ile Val Phe Gly Ser Ala Trp Thr Lys Ser Ala Cys Glu Ala Ala 705 710 715 720 Lys Met Leu Asn Trp Asp Phe Asp Cys Lys Ile Tyr Pro Asp Glu Leu 725 730 735 Pro Leu Thr Gly Gly Leu Lys Asp Glu Leu 740 745 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 taccgggtac agattagagc 20 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 ctcgagaagc tagctcaatg ctattgccgc aac 33 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 gctagcttct cgagtacctg aaaccgctgc aat 33 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 agacacgaaa tcagcacg 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 cacctcttcg ccaaacat 18 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 ctcgagttgc tagctttctg cgcattgggt ttg 33 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 13 gctagcaact cgagtctcac cacaaccttc aag 33 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 ctcagcaggt agtacttg 18 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 15 ttaaggcacc ccatgcgttc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 16 cgacgacagc caccaaacaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 17 gacaagcgga cctggtggaa 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 18 tcatggcgat gttgagctgg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 19 ttccctccct gaatcctggc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 20 agacccactt cgagccacca 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 21 agagctcggt tcgaagcggt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 ttcgtcgtgt ccttctgccc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 23 ccaggtgacg acgtacgggt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 24 ttggtgagct cgtgctgcag 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 25 tccaggctgt gctgtcgttg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 26 ccggccaagt cgattctcaa 20

Claims (10)

1. 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지며 단백질 O-만노실 전이효소(protein O-mannosyltransferase) 활성을 갖는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)로부터 분리된 단백질.
   
2. 삭제
3. 상기 제 1 항 기재의 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
   
5. 삭제
6. 서열번호 1에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HpPMT5 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파(H. polymorpha) 변이 균주(수탁번호: KCTC12172BP).
   
7. 삭제
8. 서열번호 5에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HpPMT1 유전자 및 서열번호 1에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HpPMT5 유전자가 이중 결손된 한세눌라 폴리모르파(H. polymorpha) 변이균주(수탁번호: KCTC 12173BP).
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 변이균주는 야생형 균주에 비해 O-만노실화가 감소된 단백질을 생산하는 것을 특징으로 하는 한세눌라 폴리모르파 변이균주.
   
10. 다음의 단계를 포함하는 O-만노실화(O-mannosylation)가 감소된 외래 재조합 단백질을 생산하는 방법:
    (a) 제 8 항 기재의 한세눌라 폴리모르파 변이균주에 외래 재조합 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터를 형질전환시키는 단계;
    (b) 상기 형질전환된 변이균주를 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 배양된 형질전환된 변이균주의 배양물로부터 상기 외래 재조합 단백질을 회수하는 단계.
    

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