KR100915670B1 - 야로위아 리폴리티카 유래의 신규 ＹｌＭＰＯ１ 유전자 및이의 파쇄 균주를 이용한 만노스 인산이 제거된 당단백질생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산업용 효모 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)의 만노스 인산화(mannosylphosphorylation)　과정에서 중요한 역할을 수행하는 신규 유전자 YlMPO1과 이 유전자를 파쇄하여 만노스 인산이 부가되지 않는 재조합 당단백질 생산 숙주를 만드는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 YlMPO1 유전자 파쇄는 인간에게 없는 만노스 인산이 부가되지 않게 해주어 야로위아 리폴리티카 효모의 당사슬 생합성 경로를 인간화하는데 효율적으로 사용될 수 있다.

Description

야로위아 리폴리티카 유래의 신규 ＹｌＭＰＯ１ 유전자 및 이의 파쇄 균주를 이용한 만노스 인산이 제거된 당단백질 생산 방법{A novel YlMPO1 gene derived from Yarrowia lipolytica and a process for preparing a glycoprotein not being mannosylphosphorylated by using a mutated Yarrowia lipolytica in which YlMPO1 gene is disrupted}

본 발명은 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)의 N-결합형 당사슬에 만노스 인산이 부가되는 반응에서 중요한 역할을 담당하는 YlMPO1(Mannosyl Phosphorylation of Oligosaccharide) 유전자와 상기 MPO1 유전자가 결손된 야로위아 리폴리티카 변이주 및 이러한 변이주를 이용하여 재조합 당단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

대부분의 의약용 단백질들은 세포의 분비 경로를 거치는 동안 단백질의 특정 아미노산 잔기에 당사슬들이 부착하는 당단백질들이다. 부착된 당사슬들은 단백질의 활성과 기능 유지에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 이러한 당단백질들은 인체에서의 면역반응 유발 등의 문제점들을 해결하기 위해서 주로 동물세포에서 생산되고 있으나, 낮은 생산성과 높은 생산 비용 및 바이러스와 프라이온 등의 오염 가능성 등과 같은 많은 문제점들이 존재한다. 이러한 단점들을 해소하기 위하여 대체 생산 세포주로서 경제성과 생산성이 높으며 N-결합형 당화 과정의 초기 단계가 비슷한 진핵 미생물인 효모를 이용하려는 시도들이 각광을 받고 있다.

효모는 진핵 미생물로서 고농도의 단백질을 신속하게 생산할 수 있으며, 유전자 조작이 용이하여 다루기 쉽고, 인간과 동물들의 바이러스와 프라이온 등에 감염되지 않으므로 안전성 또한 매우 높다는 많은 장점들을 가지고 있다. 그러나 효모에서 합성된 최종 당사슬 구조는 인간의 것과 매우 상이하여 면역 반응을 일으키곤 한다. 따라서 이와 같은 문제점들을 해결하기 위해서 인간의 것과 동일한 당사슬을 가진 당단백질을 생산할 수 있는 효모를 만들기 위해서 당사슬 생합성 경로를 인간화하기 위한 연구들이 큰 관심을 끌고 있다.

전통효모인 사카로마이세스 세레비지아의 N-결합형 당사슬은 핵심 당사슬(core oligosaccharide chain)에 약 50개에서 200개의 만노스(mannose) 당이 연속적으로 결합되어 있는 고 만노스(hypermannosylation) 형태로, 각 가지의 말단에 알파1,3 결합형 만노스(α 1,3-linked mannose)가 연결되어 있다(Dean, Biochim. Biophys. Acta., 1426, p.309-322, 1999). 또한, 만노스 인산이 당사슬의 핵심 및 외쇄 부위에 부가되며 (Ballow, 1990, Methods Enzymol. 185: 440-470), 만노스 인산이 부가된 당사슬이 부착된 당단백질을 동물에게 투여하면 면역반응 유발된다는 사실이 보고되었다(Rosenfeld and Ballou, 1974, J. Biol. Chem. 249: 2319-2321). 때문에, 당외쇄 개시 반응에서 중요한 역할을 하는 OCH1 유전자와 더불어 만노스 인산의 부가에 중요한 역할을 하는 MNN4 유전자 등을 파쇄시켜 합성되는 당사슬을 인간화하려는 시도가 있었다(Jigami and Odani, Biochim. Biophys. Acta 1426, 335-345, 1999). 그러나, MNN4 유전자를 파쇄시킨 균주에서도 만노스 인산의 부가가 야생형 균주의 것보다 감소는 했으나, 완전히 제어되지는 못하였다(Odani et al., Glycobiology, 6, p.805-810, 1996).

전통 효모 외에도 메탄올자화 효모인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서도 만노스 인산의 부가 반응을 제거하여 당사슬 생합성 경로를 인간화하기 위한 연구들이 보고되었다. 일본의 Miura 박사 그룹에서 사카로마이세스 세레비시아의 MNN4 유전자 서열을 탐침으로 이용해 피키아 파스토리스에서 만노스 인산의 부가에 중요한 역할을 하는 PNO1(Phosphorylmannosylation of N-linked Oligosacharides) 유전자를 클로닝하였고, 이를 파쇄하였을 때 당사슬의 만노스 인산의 부가가 제어될 수 있다는 보고를 하였다(WO 01/88143; Miura et al., 2004, Gene 324: 129-137).

그러나, 미국의 글라이코파이(GlycoFi) 사는 PNO1 유전자의 파쇄로 만노스 인산의 부가를 저해할 수는 있으나 이를 완전히 제어할 수는 없다는 사실을 발견하고, 이를 극복하기 위한 방법을 특허로 출원하였다(US2006/0160179). 이들은 사카로마이세스 세레비시아의 Mnn4 단백질의 아미노산 서열을 이용하여 피키아 파스토리스의 유전체 정보(Integrated Genomics, Chicago, III)를 BLAST 서치(search)하여 유사성이 높은 유전자들을 발견하고, 이들을 각각 MNN4A, MNN4B와 MNN4C로 명명하였다. 그리고, 이들 중에서 MNN4A 유전자와 PNO1 유전자를 이중 파쇄하면 만노스 인산의 부가를 완전히 제어할 수 있음을 보여주었다.

야로위아 리폴리티카는 오래전부터 시트르산(citric acid) 생산, 단세포 단백질(single-cell protein) 생산과 같은 분야에서 산업적으로 유용하게 이용되는 비병원성 이형효모(dimorphic yeast)로, 단백질 분해효소(protease)나 지질분해효소(lipase) 등의 단백질들을 세포 외부로 과량 분비하는 특성을 갖고 있다. 또한, 야로위아 리폴리티카는 전통 효모인 사카로마이세스보다 높은 단백질 분비 효율을 보이고, 동물세포와 유사한 단백질의 동시 번역 수식(co-translational modification) 과정을 가지며(Boisrame et al., J. Biol. Chem., 273, p.30903-30908, 1998), 핵심 당사슬에 결합된 만노스의 수가 사카로마이세스 세레비지애보다 적고(Madzak et al., J. Biotechnol., 109, p.63-81, 2004) 면역반응 유발원인 알파1,3-결합형 만노스가 존재하지 않는다는 점에서 의약용 당단백질 생산 균주로서 사카로마이세스 세레비지애보다 우수한 숙주로 여겨지고 있다. 인체 유래의 의약용 당단백질들을 야로위아 리폴리티카에서 발현 분비하기 위해서는 야로위아 리폴리티카의 당화 과정을 이해하는 것이 필수적이지만, 최근까지 야로위아 리폴리티카의 당화 과정은 극히 일부분만 밝혀졌다(Jaagar et al., Yeast, 20, p.633-644, 2003, Barnay-Verdier et al., Microbiology, 150, p.2185-2195, 2004).

본 발명자들은 야로위아 리폴리티카를 의약용 당단백질을 발현 분비하는 숙주로 개발하기 위하여 야로위아 리폴리티카의 당화 과정을 조사하고 당외쇄 개시 반응 효소인 YlOCH1 유전자(GenBank accession number: AJ563920)를 파쇄한 균주를 제작하였다. 그러나 YlOCH1 유전자의 파쇄 시, 인간에서는 나타나지 않는 비인간 당사슬인 만노스 인산의 부가가 보다 활발해지는 현상을 관찰하였다.

이에, 본 발명자들은 만노스 인산의 부가 과정에서 중요한 역할을 수행하는 사카로마이세스 세레비지아 Mnn4 단백질의 아미노산 서열을 이용하여 야로위아 리폴리티카의 유전체 데이터베이스(http://cbi.labri.fr/Genolevures/elt/YALI)로부터 상동성 비교를 통하여 야로위아 리폴리티카의 새로운 유전자 YlMPO1 을 찾았으며, 이 유전자를 파쇄시킨 균주(Ylmpo1 Δ)를 제작하여 분비 단백질 및 세포벽의 주요 성분을 분석한 결과, 상기 유전자만을 파쇄시킴으로써 야로위아 리폴리티카에서는 만노스 인산의 부가가 완전히 제어된 당사슬을 생합성할 수 있다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 야로위아 리폴리티카의 당사슬 생합성 경로에서 만노스 인산의 부가에 중요한 역할을 하는 새로운 유전자 YlMOP1을 제공하는 것을 첫 번째 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자를 파쇄시킴으로써 만노스 인산이 부가되지 않는 당단백질을 생산할 수 있는 야로위아 리폴리티카의 재조합 변이주를 제공하는 것을 두 번째 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자가 파쇄된 야로위아 리폴리티카 변이주에 외래 단백질을 코딩하는 핵산분자를 도입하여 발현시킴으로써, 효모 특이적인 만노스 인산이 부가되지 않아 의료용 등에 유용하게 사용될 수 있는 재조합 당단백질의 생산방법을 제공하는 것을 세 번째 목적으로 한다.

본 발명은 산업용 효모 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)의 만노스 인산화(mannosylphosphorylation)　과정에서 중요한 역할을 수행하는 신규 유전자 YlMPO1와 이 유전자를 파쇄하여 만노스 인산이 부가되지 않는 재조합 당단백질 생산 숙주를 만드는 방법에 관한 것이다.

본 명세서에서 용어 “당단백질(glycoprotein)"이란 하나 이상의 아스파라긴 잔기 또는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기 상에서 당화되거나 아스파라긴 및 세린 또는 트레오닌 잔기 상에서 당화된 단백질을 의미한다. 본 명세서에서 ”만노스 인산 (mannosylphophate)"이란 효모와 곰팡이 등에서 발견되는 비인간 당사슬구조로서 당사슬의 핵심 및 당외쇄 부위에 각각 2개 씩 부가되는 위치를 갖고 있다(Jigami Y & Odani T, Biochimica et Biophysica Acta 1426, p.335-345, 1999).

본 발명자는 만노스 인산의 부가 과정에서 중요한 역할을 수행하는 사카로마이세스 세레비지아 Mnn4 단백질의 아미노산 서열을 이용하여 야로위아 리폴리티카의 유전체 데이터베이스(http://cbi.labri.fr/Genolevures/elt/YALI)로부터 상동성 비교를 통하여 YlMPO1 유전자를 찾았다. 이 유전자 서열은 서열번호 1에 기재되었으며, 이로부터 예상되는 Ylmpo1 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타내었다.

따라서, 하나의 양태로서 본 발명은 서열번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 가지는 만노스 인산의 부가에 중요한 역할을 하는 Ylmpo1 단백질을 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 Ylmpo1 단백질을 코딩하는 핵산분자 및 상기 핵산분자의 서열과 75% 이상의 상동성, 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가지며 상기 Ylmpo1 단백질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산분자를 제공한다. 바람직하게는 상기 핵산분자는 서열번호 1의 핵산서열을 가지는 핵산 분자이며, 이의 유사체 또는 이의 단편도 포함한다.

본 발명에서 야로위아 리폴리티카 유래의 YlMPO1 유전자에 대해 사용된 용어 “상동성”이란 야생형(wild type) 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로, 본 발명의 YlMPO1 유전자의 DNA 염기서열과 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일한 염기 서열을 포함한다. 당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 당해 분야에 공지된 유전자 재조합 기술 등에 의해 본 발명에 따른 상기 YlMPO1 유전자의 하나 또는 그 이상의 염기서열을 용이하게 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 상기 상동성을 갖는 범위 내에서 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산분자를 용이하게 제조할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

신규 유전자와 그 발현 산물인 단백질은 여러 생물체에 존재하는 유사 단백질 군들과의 서열 비교를 통하여 그 기능을 예상해 볼 수 있다. 서열 비교는 상품화된 분석소프트웨어나 웹 기반 분석시스템을 이용하여 서열 비교가 가능하다. 본 발명에서는 웹 기반 분석시스템을 이용하여 야로위아 리폴리티카 신규 유전자의 발현 산물인 단백질을 유사 단백질 군들과 동일성(identity)과 유사성(similarity)을 비교하였다.

본 발명에서 야로위아 리폴리티카 유래의 YlMpo1 단백질에 대해 사용된 용어 “동일성”이란 여러 생물체 유래의 단백질들의 서열 비교 시 특정 위치에서 같은 아미노산 잔기가 있음을 의미하며, 전체 아미노산 잔기 중 특정위치에 동일한 아미노산 잔기가 존재하는 정도를 백분율(%)로 계산한 것이다. 또한, “유사성”이란 단백질들의 서열 비교 시 특정 위치에서 비슷한 화학적 성질을 갖는 아미노산 잔기가 있음을 의미하며, 전체 아미노산 잔기 중 특정위치에 유사한 성질의 아미노산 잔기가 존재하는 정도를 백분율(%)로 계산한 것이다.

본 발명자는 효모 야로위아 리폴리티카의 만노스 인산의 부가를 제어하여 보다 바람직한 인체형 당단백질 생산 숙주로 만들기 위해서, 상기에서 밝힌 만노스 인산의 부가에서 중요한 역할을 하는 YlMPO1 유전자를 중합효소 연쇄 반응을 통하여 확보한 후, 이를 이용하여 YlMPO1 유전자 파쇄용 벡터를 만들었다. 그리고 이를 야로위아 리폴리티카에 형질전환시켜 YlMPO1 유전자가 파쇄된 균주 (Yarrowia lipolytica mpo1 Δ)를 제작하였고(실시예3), 이를 2007년 3월 27일에 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 한국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁번호 제 KCTC 11102BP호로 기탁하였다.

따라서, 또 다른 양태로서, 본 발명은 만노스 인산의 부가에 중요한 역할을 하는 YlMPO1 유전자를 파쇄시켜 만노스 인산이 부가되지 않는 당단백질을 생산하는 변이주에 관한 것이며, 바람직하게 상기 변이주는 기탁번호 제 KCTC 11102BP호로 기탁된 야로위아 리폴리티카 변이주 Ylmpo1 Δ 이다.

지놈 상에서 목적한 유전자만의 특이적 파쇄, 즉 불활성화는 당업자라면 당 분야에서 확립된 방법들을 통하여 손쉽게 수행할 수 있으며, 방법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명자는 먼저 YlMPO1 유전자 DNA를 이용하여 YlMPO1 파쇄용 벡터를 제작하고, 이를 야로위아 리폴리티카에 형질전환시켜 지놈과 벡터 사이의 상동성에 의한 유전자 재조합을 유도하였다. YlMPO1 파쇄용 벡터 제작에 사용되는 선별마커 (selection marker)는 특별히 제한되지 않고, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있으며, 본 발명에서는 YlURA3를 선별 마커로 사용하였다.

*상기 방법으로 제작된 YlMPO1 유전자가 결손된 균주(Ylmpo1 Δ)에서 발현되는 당단백질들에 부착된 당사슬들을 분석하기 위하여 HPLC 프로파일 분석과 알시안 블루 염색 실험들을 수행하였다(도 6 참조). Ylmpo1 Δ 균주에서 발현되는 분비 단백질 및 세포벽 단백질들의 당사슬 프로파일 분석에서 중성 당사슬들은 야생형 균주의 것과 같은 양상을 보였지만, 만노스 인산이 부가되어 나타나는 산성 당사슬은 관찰되지 않았다. 또한, Ylmpo1 Δ 균주는 야생형에 비해서 알시안 블루의 결합이 잘 일어나지 않아 거의 염색이 되지 않은 것을 볼 수 있으며, 이는 Ylmpo1 Δ 균주의 세포벽 단백질의 당사슬에 부가되는 만노스 인산이 제어되었음을 의미한다.

상기의 결과들은 야로위아 리폴리티카의 단일 유전자 YlMPO1의 결손만으로 만노스 인산이 당사슬의 핵심 부위와 당외쇄 부위에 결합하는 것을 모두 제어할 수 있음을 보여준다. 기존에 연구되었던 효모 사카로마이세스 세레비지아에서는 ScMNN4 유전자의 결손 시 알시안 블루의 염색은 크게 감소되었으나, 당사슬 구조 분석 시 핵심 부위에 대한 만노스 인산의 부가가 완전히 제어되지 못했다. 마찬가지로 피키아 파스토리스에서는 PpPNO1 , PpMNN4A , PpMNN4B 및 PpMNN4C 등 4개의 상동 유전자가 존재하며, PpPNO1 및 PpMNN4B가 이중 결손이 되어야 만노스 인산의 부가가 완전히 제어 되었다. 특히, PpPNO1 유전자만의 파쇄로는 알시안 블루 염색의 감소가 관찰되지 않아서 PpPNO1은 당외쇄에 만노스 인산을 부가하는데 있어서는 중요한 역할을 못하는 것으로 생각되고 있다.

상기와 같이, 야로위아 리폴리티카에서는 단일 유전자의 결손만으로도 만노스 인산의 부가를 완전히 제어할 수 있어 사카로마이세스 세레비지아나 피키아 파스토리스 등에 비해서 우월한 장점을 갖는다. 이와 같은 장점은 여러 효모 특이적 유전자들을 결손시키고 다양한 새로운 유전자들을 도입해야만 하는 효모의 당사슬 생합성 경로의 인간화 연구에서는 더욱 우월성을 갖는다.

한편, 야로위아 리폴리티카에서는 당외쇄 개시 유전자인 YlOCH1과 만노스 인산 부가 유전자인 YlMPO1 을 이중 결손시키는 경우, 효모 특이적인 당사슬의 생합성을 완전히 제거할 수 있다.

따라서, 또 다른 양태로서, 본 발명은 YlMPO1 유전자 파쇄 균주(Ylmpo1 Δ)에 추가로 당사슬 수식 경로를 재설계함으로써 다양한 형태의 인간화 당사슬을 가지도록 조작하는 방법을 제공하며, 바람직한 한 예로서 상기한 바와 같이, YlMPO1 유전자 외에 YlOCH1 유전자를 추가로 파쇄시킨 변이주를 제공한다. 본원 실시예에서는 상기 YlMPO1 유전자와 YlOCH1 유전자를 동시에 파쇄시킨 야로위아 리폴리티카 변이주(Yarrowia lipolytica och1 △/ mpol △)를 제조하였으며(실시예4), 이를 2007년 4월 26일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 한국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁번호 제 KCTC 11126BP호로 기탁하였다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, 상기 야로위아 리폴리티카 변이주들을 이용하여 다양한 인체형 당단백질을 생산하는 방법 및 이러한 방법에 따라 생산된 인체형 당단백질에 관한 것이다.

본 발명에 따라 YlMPO1 유전자 또는 상기 유전자와 YlCHO1 유전자를 함께 결손시킨 야로위아 리폴리티카 변이주에서 당단백질을 발현시키는 경우, 제조되는 당단백질은 인간화된 당사슬을 가져 인체 내에서 면역반응을 덜 유발할 뿐만 아니라 용해도, 단백질 분해효소에 대한 감수성, 트래픽킹, 트랜스포트, 분비, 다른 단백질 또는 인자에 의한 인식 등의 반응이 인간에서 생성된 단백질과 동일하거나 유사하므로 의료용 단백질 등으로 인체에 적합하게 사용될 수 있다.

생산된 당단백질은 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있으며, 정제될 특정 단백질의 특성에 따라 정제 프로토콜을 결정한다. 이러한 결정은 당업자에게 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어 침전, 면역흡착, 분획화 또는 다양한 크로마토그래피와 같은 전형적인 분리 기술에 의해 정제할 수 있다.

본 발명에 따라 생산될 수 있는 당단백질은 예를 들어 사이토카인 (예: EPO, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, G-CSF 등), 응집인자 (예: VIII 인자, IX 인자, 인간 단백질 C), 치료용 항체류 (예: 면역글로블린, Fab, 이중특이 항체, 단일체인 항체, diabody 등) 및 Fc 융합 단백질, 효소 치료제 (예: 글루코세레브로시데이즈, 알파-갈락토시데이즈, 알파-L-이듀로니데이즈, 알파-글루코시데이즈 등), 내피성장인자, 성장호르몬 방출인자, 티파노소마크루지 트랜스-시알리다제 (Typanosoma cruzi trans-sialidase), HIV 외피 단백질(HIV envelope protein), 인플루엔자 바이러스 A 헤마글루티닌 (influenza virus A haemagglutinin), 인플루엔자 뉴라미니다제 (influenza neuraminidase), 소의 엔테로카이네이즈 (enterokinase) 활성인자, 소의 포진 바이러스 타입-1 당단백질 D (Bovine herpes virus type-1 glycoprotein D), 인간 안지오스타틴(human angiostatin), 인간 B7-1, B7-2 및 B-7 수용체 CTLA-4, 인간 조직 인자 (human tissue factor), 성장인자 (예: 혈소판-유래 성장인자), 인간 알파-앤티트립신(human alpha-antitrypsin), 조직 플라즈미노겐활성화인자 (tissue plasminogen activator), 플라즈미노겐 활성화인자 억제인자-1(plasminogen activator inhibitor-1), 우로키나제 (urokinase), 플라즈미노겐, 트롬빈 등을 포함하며 이들에 제한되는 것이 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 권리 범위는 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시 예 1: YlMPO1 유전자의 동정

본 발명의 야로위아 리폴리티카의 YlMPO1 유전자는 만노스 인산의 부가 과정에서 중요한 역할을 수행하는 사카로마이세스 세레비지아 Mnn4 단백질의 아미노산 서열을 이용하여 야로위아 리폴리티카의 유전체 데이터베이스를 Blast 서치하여 찾았으며, 이 상동 유전자는 644개의 아미노산으로 구성된 단백질을 인코딩하였다 (도 1).

본 발명자들 또한 MNN4 유전자들 및 이에 상응하는 유전자군들을 아스퍼질러스 푸미가투스, 캔디다 알비칸스, 뉴로스포라 크라사, 피키아 파스토리스, 사카로마이세스 세레비지아, 야로위아 리폴리티카를 포함한 진핵생물에서 찾을 수 있었으며, 이들이 인코딩하는 단백질 서열들을 비교할 수 있었다(도 2a 내지 도 2c). YlMpo1 단백질은 사카로마이세스의 세레비지아 Mnn4 단백질에서 나타나는 4개의 라이신(lysine; Lys)과 4개의 글루탐산(glutamic acid; Glu)으로 이루어진 반복 서열 (Lys-Lys-Lys-Lys-Glu-Glu-Glu-Glu)을 포함하고 있지는 않았다.

도 3에서는 이 단백질 군의 종간의 연관 관계를 알아보기 위해 상동성 및 동일성 분석(도 3A)과 계통도(도 3B)를 보여준다. 야로위아 리폴리티카의 Mpo1 단백질은 사카로마이세스 세레비지아의 것과 40%의 동일성을, 캔디다 알비칸스의 것과는 34%의 동일성을, 피키아 파스토리스의 Pno1 단백질과는 33%의 동일성을, 피키아 파스토리스의 Mnn4A 단백질과는 32%의 동일성을, 피키아 파스토리스의 Mnn4B 단백질과는 27%의 동일성을, 피키아 파스토리스의 Mnn4C 단백질과는 33%의 동일성을, 뉴로스포라 크라사의 것과는 41%의 동일성을, 아스퍼질러스 푸미가투스의 것과는 37%의 동일성을 나타내었다. 도 3B의 계통도에서 나타내는 바와 같이, YlMpo1 단백질은 사카로마이세스 세레비지아 Mnn4 단백질이나 피키아 파스토리스의 Pno1 단백질과는 계통도 상 다른 가지에 위치하며, 뉴로스포라 크라사와 아스퍼질러스 푸미가투스 같은 곰팡이 유래의 Mnn4 단백질들과 분류상 유사한 것을 알 수 있었다. 따라서 YlMpo1 단백질은 효모 및 곰팡이 등에서 만노스 인산의 부가에 중요한 역할을 담당하는 단백질 그룹에 속하나, 기존에 특성이 밝혀진 사카로마이세스 세레비지아의 Mnn4 단백질이나 피키아 파스토리스의 Pno1 및 Mnn4A, Mnn4B, Mnn4C 등과 다른 특성들을 보일 것이라 예상할 수 있었다.

실시 예 2 : YlMPO1 유전자 파쇄용 벡터의 제조

야로위아 리폴리티카에서 YlMPO1 유전자를 파쇄하기 위하여 도 4A의 YlURA3 선택 표지 카세트를 이용한 파쇄 벡터를 다음과 같이 제조하였다. 야로위아 리폴리티카 SMS397A(MATA ade1 ura3 xpr2) 균주의 지노믹 DNA를 대상으로 Pfu 폴리머래이즈(뉴로틱스, 한국)를 이용하여 YlMPO1-F1(CAACACACCATCGGAGAC)(서열번호 3)와 YlMPO1-R1 (CCATGGATCCGTAGATCTCTGCCGAAAATCAGACAG)(서열번호 4) 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응 (PCR)으로 571bp 절편을, YlMPO1-F2(AGATCTACGGATCCATGGATCCAGGAGAGACCAGAG)(서열번호 5)와 YlMPO1-R2(GTTGCGTCATTCTCTCCA)(서열번호 6) 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응으로 477bp 절편을 각각 얻었다. 그리고 상기의 두 절편을 다시 주형으로 하고 YlMPO1-F1와 YlMPO1-R2 프라이머를 사용하여 Ex Taq 폴리머래이즈(타카라, 일본)를 이용한 융합 중합효소 연쇄반응(fusion PCR)을 수행하여, linker sequence(18bp; AGATCTACGGATCCATGG)(서열번호 7)에 의해 상기의 두 절편이 접합된 절편(1,066bp) 을 얻을 수 있었다. 그리고, 이 접합 절편을 pGEM T easy 벡터 (프로메가, 미국)에 클로닝하여 pT-YlMPO1+ (4,084bp)를 제조하였다. 그리고 tc-YlURA3 - tc 선택 표지를 pYLUB 벡터(Song et al., J. Microbiology, 41, p121-128, 2003)에서 제한 효소 BamHI과 BglII로 잘라내고 이 절편(2,783bp)을 pT-YlMPO1+ 벡터의 BglII 절편에 클로닝하여 Ylmpo1 :: tc - YlURA3 - tc 파쇄 벡터, pT-YlMPO1D 벡터 (6,867bp)를 완성하였다.

실시 예 3 : 야로위아 리폴리티카 Ylmpo1 파쇄 균주 제조

상기 실시 예 2에서 제작한 유전자 파쇄 벡터를 이용하여 야로위아 리폴리티카의 YlMPO1 유전자를 파쇄하였다. YlMPO1 유전자를 파쇄시킨 균주(M4D3)와 다시 이로부터 YlURA3 선택 표지를 제거시킨 균주(M4D3P1)는 다음과 같이 제조하였다. 우선, YlMPO1 유전자를 파쇄하기 위하여 Ylmpo1 :: tc - YlURA3 - tc 파쇄 벡터, pT-YlMPO1D을 NotI 제한 효소로 자른 절편 (3,849bp)을 야생형 SMS397A 균주에 형질 전환하였으며, SC-URA 선택배지 (2% glucose, 0.67% yeast nitrogen base w/o amino acid, DO supplement -URA)에서 형질 전환체를 선별하였다. 그리고, 선별된 형질전환체들을 대상으로 중합효소 연쇄 반응을 통하여 YlMPO1 유전자가 파쇄된 균주를 선별 확인하고 M4D3(Ylmpo1 :: tc - YlURA3 - tc)라 명명하였다. 그리고, 다시 선별된 M4D3 균주를 5-플로로오르틱 액시드(5-FOA, 0.675g/liter)가 첨가된 배지에서 배양하여 YlURA3 선택 표지 카세트가 팝-아웃(pop-out)된 균주를 얻었고, 이를 M4D3P1(Ylmpo1Δ, Ylmpo1 :: tc)이라 명명하였다. 이 모든 균주들은 써던 블럿팅 (Southern Blotting)을 이용하여 확인하였고, 도 4B (lane 1: SMS397A, lane 2: M4D3P1, lane 3: M4D3)에 제시하였다.

실시 예 4 : 야로위아 리폴리티카 Yloch1 / Ylmpo1 이중 파쇄 균주 제조

야로위아 리폴리티카에서 YlOCH1 유전자를 파쇄한 균주를 만들기 위하여 YlURA3 선택 표지 카세트를 이용한 YlOCH1 파쇄 벡터를 실시 예 2에서 사용한 방법으로 제작하였다. 야로위아 리폴리티카 SMS397A 균주의 지노믹 DNA를 대상으로 YlOCH1-F1 (ACTTTTTGCATCTGCGGAC)(서열번호 8)와 YlOCH1-R1 (CCATGGATCCGTAGATCTAGGAGTTCGAAGACGTTG)(서열번호 9) 프라이머들과 YlOCH1-F2 (AGATCTACGGATCCATGGGACCGACTCTGTCTTCGA)(서열번호 10)와 YlOCH1-R2 (CATCCTCCTGATATACGC)(서열번호 11) 프라이머들을 이용한 중합효소 연쇄반응으로 YlOCH1 유전자의 N-말단과 C-말단 일부가 포함된 절편들을 얻었다. 그리고 상기의 두 절편들을 다시 주형으로 하고 YlOCH1-F1와 YlOCH1-R2 프라이머를 사용한 융합 중합효소 연쇄반응을 수행하여, 실시예 2에서 사용한 서열번호 7의 linker sequence에 의해 상기의 두 절편들이 접합된 절편을 얻었고, 이 접합 절편을 pGEM T easy 벡터 에 클로닝 하여 pT-YlOCH1+를 제조하였다. 그리고 tc-YlURA3 - tc 선택 표지를 pYLUB 벡터에서 잘라내고, 이 절편을 pT-YlOCH1+ 벡터에 클로닝 하여 Yloch1::tc-YlURA3-tc 파쇄 벡터, pT-YlOCH1D 벡터를 완성하였다. YlOCH1 유전자를 파쇄하기 위하여, pT-YlOCH1D를 NotI 제한 효소로 자른 DNA 절편을 야로위아 리폴리티카 야생형균주에 형질 전환으로 도입하였으며, SC-URA 선택배지에서 자란 형질 전환체를 선별하였다. 선별된 형질전환체들을 대상으로 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 YlOCH1 유전자가 파쇄된 균주를 확인하였고, 선별 확인된 균주를 5-플로로오르틱 액시드가 첨가된 배지에 배양하여 YlURA3 선택 표지 카세트가 팝-아웃된 균주(Yloch1 Δ, Yloch1 :: tc)를 얻었다. 또한, 야로위아 리폴리티카 Yloch1 Δ/ Ylmpo1 Δ 이중 파쇄균주(Yloch1::tc Ylmpo1::tc)는 상기의 방법으로 제작된 균주(Yloch1 Δ)를 대상으로 실시 예 2에서 제작한 pT-YlMPO1D 벡터를 사용하여 상기 실시 예 3에서 수행한 유전자 재조합 방법을 통하여 동일하게 제작하였다.

실시 예 5: 모델 당단백질 발현용 숙주 제작

야로위아 리폴리티카의 야생형 균주 및 당사슬 생합성 유전자 파쇄 균주들에서 발현되는 당단백질의 당사슬 분석을 손쉽게 하기 위하여, 트리코더마 리세이 유래의 글루칸 분해효소인 엔도글루카나제 (endoglucanase I, EGI)가 발현되는 균주들을 다음과 같은 방법으로 제작하였다. EGI 발현벡터인 pXCSIn(His)(Park et al. Appl Biochem Biotechnol, 87, 1-15, 2000)로부터 EcoRI과 ClaI을 처리하여 야로위아 유래의 분비형 단백질 분해효소인 AEP(alkaline extracellular protease)를 인코딩하는 XPR2 유전자의 프로모터와 C-말단 (carboxy terminus)에 6개의 히스티딘(histidine) 잔기들이 부착된 엔도글루카나제 유전자(EGI) 그리고 XPR2 유전자의 터미네이터 서열들이 포함된 약 3.5kb 길이의 EcoRI/ClaI 단편을 분리하고, 이 단편을 EcoRI과 ClaI을 처리한 pAUX-1 (pIMR53, Sohn et al., J Bacteriol, 180, 6736-42, 1998)에 도입하여 pAUXEGI 벡터를 완성하였다(도 5).

그리고, 이 벡터를 야로위아 리폴리티카에 도입하기 위하여 one-step transformation 방법(Chen et al., Appl. Microbiol Biotechnol. 48, p.232-235, 1997)을 사용하였다. 즉, 야생형 균주와 Ylmpo1 Δ 균주를 각각 YPD 고체배지에 도말하여 16-24시간 동안 배양한 후 loop로 5×10⁷cell 정도를 긁어서 100㎕ one-step buffer[50％(w/v) PEG 4000; 2M DTT; 2M lithium acetate(pH6.0); single-strand carrier DNA(10 ㎍/㎕)]에 풀고 재조합 pAUXEGI을 500ng이상 넣은 후 충분히 섞어 주였다. 이것을 39℃ 항온 수조에서 1시간 동안 배양한 후 선택 최소 배지에 깔고 28℃에서 3-4일 배양하여 형질 전환체를 얻어냈다.

실시 예 6: Ylmpo1 파쇄 균주들의 N -결합형 당사슬 구조 분석

야로위아 리폴리티카의 야생형 및 Ylmpo1 Δ, Yloch1 Δ, Yloch1 Δ/ Ylmpo1 Δ 변이 균주들에서 분비 발현되는 당단백질에 부착된 당사슬의 구조를 분석하기 위하여 다음과 같은 방법을 사용하였다. 먼저, YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) 배지에서 전배양한 균주들을 YPDm(1% yeast extract, 1% proteose peptone 0.1% glucose, 50mM 인산나트륨 완충용액(pH6.8)) 배지에 접종하여 28℃에서 30시간 동안 배양하였다. 배양액으로 분비되는 EGI 단백질을 셀룰로스막(cellulose membrane, YM-30, Millipore)을 이용하여 회수하고, 니켈 컬럼(nickel column)을 통과시켜 C-말단에 6개의 히스티딘이 부착된 EGI 단백질을 선택적으로 분리하였다. 분리된 EGI 단백질에 펩타이드 N-글리코시다제 F(PNGase-F)를 처리하여 EGI 단백질에 결합된 당사슬을 자르고, PGC(porous graphite column)를 이용하여 당사슬만을 분리 정제하였다. 형광 발색단인 2-아미노피리딘(2-aminopyridine, PA)을 정제한 당사슬 말단에 붙인 후, HPLC 분석을 수행하여 두 균주 간 N-결합형 당사슬 프로파일을 비교하였다. HPLC 분석(Waters, 미국)은 아민컬럼(Asahipak NH2P-504E, Showa denko, 일본)을 이용하여 용매 A(0.2M 트리에틸아민-초산 용액:아세토니트릴 용액=1:9, pH 7.3)와 용매 B(0.2M 트리에틸아민-초산 용액:아세토니트릴 용액=9:1, pH 7.3)를 분당 1 ml 유속으로 52분 동안 80:20에서 5:95 비율의 선형구배 (linear gradient)를 만들어 수행하였다. 형광 발색단이 부착된 당사슬들은 HPLC에 연결된 형광 검출기로 여기 파장(excitation wavelength) 320 nm와 방출파장 (emission wavelength) 400 nm로 설정하여 검출하였다.

또한, 야로위아 리폴리티카 야생형 및 Ylmpo1 Δ 균주 유래 세포벽의 만노단백질(mannoprotein) 분석을 위해서는 성장이 정지기 달했을 때의 세포벽 만노단백질들로부터 얻은 당사슬의 프로파일 분석도 다음과 같이 수행하였다. YPD 배지에서 전배양한 균주들을 200 ㎖ YPD 배지에 접종하여 정지기까지 배양하였다. 두 균주들을 원심 분리하여 회수한 후, 세포벽 만노프로테인은 시트르산 완충용액(citric acid buffer, pH 7.0)으로 현탁하고 고압 멸균 (121℃, 1시간) 하였다. 에탄올을 첨가하고 원심 분리하여 세포벽 단백질을 회수하였고, 여기에 펩타이드 N-글리코시다제 F (PNGase F)를 처리하여 당사슬를 절단하고 PGC (porous graphite column)를 이용하여 당사슬만을 분리 정제하였다. 형광 발색단인 2-aminopyridine (PA)을 정제한 당사슬 말단에 붙이고 상기와 같은 조건에서 HPLC 분석을 수행하여 당사슬 프로파일을 비교하였다. HPLC 분석은 아민컬럼 (Asahipak NH2P-504E, Showa denko, 일본)을 이용하여 용매 A (100% 아세토니트릴 용액)와 용매 B (0.2M 트리에틸아민-초산 용액, pH7.0)를 분당 1 ml 유속으로 60분 동안 60:40에서 25:75 비율의 선형구배 (linear gradient)를 만들어 수행하였다. 형광 발색단이 부착된 당사슬은 여기파장 (excitation wavelength) 315 nm와 방출파장 (emission wavelength) 380 nm로 설정하여 검출하였다.

도 6A와 6B에서 보는 바와 같이 Ylmpo1 Δ 균주의 중성 당사슬(neutral sugar chain) 영역의 프로파일은 야생형 균주와 같은 양상을 보였지만, 만노스 인산이 부가되어있는 산성 당사슬(acidic sugar chain) 프로파일 (* 표시 영역)은 관찰되지 않았다. 이는 단일 YlMPO1 유전자의 파쇄로 N-결합형 당사슬에 만노스 인산의 부가를 완전히 제어할 수 있음을 보여준다.

실시 예 7: 알시안 블루 ( Alcain blue ) 염색

알시안 블루는 양전하를 띄는 프탈로시아닌(phthalocyanine)계 염색시약으로서 음전하를 띄는 세포 표면에 결합하는 특징을 지니고 있어서, 이에 의한 염색 정도는 세포 표면의 만노 단백질에 부가되어 있는 만노스 인산의 양과 비례 관계에 있다. 따라서, 야생형 균주와 Ylmpo1 Δ 균주(M4D3P1)를 대상으로 알시안 블루에 의한 염색 정도를 비교하여 세포 표면에 노출된 만노스 인산의 양을 추정하였다.

우선, 28 ℃에서 16시간 동안 YPD에서 배양하여 정지기에 도달한 두 균주들을 회수하고, 0.02 N 염산 용액(pH3.0)으로 세척하였다. 0.1% 알시안 블루(시그마, 미국)가 포함된 0.02 N 염산 용액으로 30분간 상온에서 반응시킨 다음, 증류수로 세척하고 96-well 조직배양접시에 옮긴 후 색깔차이를 비교했다. 도 6C에 나타난 것처럼, Ylmpo1 Δ 균주는 야생형에 비해서 알시안 블루의 결합이 잘 일어나지 않아 거의 염색이 되지 않은 것을 볼 수 있었다. 이는 Ylmpo1 Δ 균주의 세포벽 단백질의 당사슬에 부가되는 만노스 인산이 제어되었음을 의미한다

야로위아 리폴리티카의 당사슬 생합성 경로를 인간화하여 인체 유래의 고부가가치의 의약용 당단백질 분비 발현용 효모를 제작하기 위해서는 효모 특이적인 만노스 인산의 부가 반응을 제어하는 것이 필수적이다. 상기 실시 예 등을 통하여 살펴본 바와 같이, 본 발명을 통하여 개발된 YlMPO1 유전자가 결손된 Ylmpo1 Δ 균주는 HPLC 당사슬 프로파일 분석이나 알시안 블루 염색 실험 등을 통하여 당사슬의 핵심 및 당외쇄에 부가되는 만노스 인산의 부가가 완전히 제어됨을 볼 수 있었다. 이와 같이 단일 유전자의 결손만으로 만노스 인산의 부가가 완전히 제어되는 현상은 사카로마이세스 세레비지애나 피키아 파스토리스 등에서는 볼 수 없었던 것이다.

따라서, 본 발명의 YlMPO1 유전자를 파쇄하여 만노스 인산의 부가를 억제하는 방법을 다른 당사슬 생합성 경로 재설계 기술들과 함께 사용한다면, 인체형 당단백질을 분비 발현하는 균주를 제작하는데 매우 유용하게 활용될 것이다. 즉, 본 발명은 야로위아 리폴리티카 효모를 인체 유래의 의약용 당단백질 생산을 위한 기반 숙주로 개발하여 의약용 당단백질들을 고품질, 고효율로 대량 생산할 수 있는 숙주 시스템을 제공할 수 있는 의약 산업상의 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 YlMPO1 유전자에 해당하는 2,135 bp 뉴클레오타이드 서열과 예상되는 YlMpo1 단백질의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 2a 내지 도 2c는 효모와 곰팡이 등에서 만노스 인산화(mannosylphosphorylation)에 중요한 역할을 담당하는 Mnn4 단백질과 이에 상응하는 단백질들 및 야로위아 리폴리티카의 YlMpo1 단백질의 아미노산 서열을 상동성 비교 프로그램 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 이용하여 비교한 것으로서, 각 단백질의 종 명, GeneBank Accession Number 또는 PCT 특허 출원번호 등의 정보는 각각 다음과 같다: AfMnn4p (Aspergillus fumigatus, XP_752633); CaMnn4p (Candida albicans, AAL86704); NcLac1p (Neurospora crassa, CAB91733); PpMnn4Ap (Pichia pastoris , WO2005/060519); PpMnn4Bp (Pichia pastoris , WO2005/060519); PpMnn4Cp (Pichia pastoris , WO2005/060519); PpPno1p (Pichia pastoris, BAD06252); ScMnn4p (Saccharomyces cerevisiae, NP_012721); YlMpo1p (Yarrowia lipolytica)).

도 3은 야로위아 리폴리티카의 YlMpo1 단백질과 효모와 곰팡이 등에서 만노스 인산화 과정에서 중요한 역할을 수행할 것으로 예상되는 단백질들 사이의 연관 관계를 분석하기 위한 동일성 및 유사성 비교 테이블(도 3A)과 근연 관계를 나타낸 계통도(도 3B)를 나타낸 것이다(인터넷 웝사이트 http://align.genome.jp/에 있는 프로그램을 사용하여 그렸음).

도 4는 야로위아 리폴리티카 YlMPO1 유전자를 파쇄하기 위한 세포내 유전자 재조합에 관한 모식도(도 4A)와 이러한 방법으로 파쇄된 균주를 써던 블럿팅(southern blotting) 방법으로 확인한 결과(도 4B)를 나타낸 것이다. 써던 블럿팅에 있는 각 레인(lane)은 각각 다음의 균주들을 확인한 것이다. 레인 1: 야생형 균주 (YlMPO1), 레인 2: YlURA3 선택 표지가 팝-아웃(pop-out)된 Ylmpo1 파쇄균주 (Ylmpo1::tc-YlURA3-tc), 레인 3: Ylmpo1 파쇄균주 (Ylmpo1 :: tc).

도 5는 트리코더마 리세이 유래의 글루칸 분해효소인 엔도글루카나아제를 발현하는 재조합 발현벡터의 제작 모식도이다.

도 6는 Ylmpo1 파쇄 균주들의 당사슬 생합성과 관련된 특징들을 분석한 결과로서, 도 6A는 야생형과 YlOCH1 파쇄 균주를 모균주로 하여 제작된 Ylmpo1 파쇄 균주에서 각각 배지로 분비되는 당단백질(Endoglucanase I, EGI)의 N-당사슬 프로파일을 HPLC로 비교 분석한 결과이다. (a) 야생형 균주, (b) Ylmpo1 파쇄균주, (c) Yloch1 파쇄균주, (d) Ylmpo1 / Yloch1 이중 파쇄 균주. 도 6B는 야생형과 YlMPO1 파쇄 균주에서 유래된 세포벽의 주요 구성 성분인 만노단백질(mannoprotein)의 N-당사슬 프로파일을 HPLC로 비교 분석한 결과이다. 각각 배지와 세포벽으로부터 분리 정제한 EGI와 만노단백질에 당사슬 절단효소인 펩타이드 N-글리코시다제 F(PNGase F)를 처리하여 당사슬을 분리한 후, 환원 말단에 형광발색단을 부착하고 HPLC 분석을 수행하였다. 구조와 크기를 알고 있는 표준 당사슬의 검출시간을 화살표로 표시하였으며(M7, Man₇GlcNAc₂-PA; M8, Man₈GlcNAc₂-PA; M9, Man₉GlcNAc₂-PA; M10, Man₁₀GlcNAc₂-PA), 만노스 인산이 부착되어 있는 당사슬에 해당하는 피크들은 *로 표시하였다. *¹은 모노만노스 인산(monomannosylphosphate)이 부착된 M8 형태의 당사슬에 해당되며, *²는 모노만노스 인산(monomannoyslphosphate)이 부착된 M9 형태의 당사슬에 해당된다.

도 6C는 Ylmpo1 파쇄균주(Ylmpo1::tc)가 야생형 균주와 비교해서 알시안 블루(Alcian blue)에 염색되는 정도가 감소된 것을 나타낸다. 알시안 블루에 의해서 염색되는 정도와 세포벽의 주요 구성성분인 만노 단백질의 당사슬에 부가되어 있는 만노스 인산의 양과 비례 관계에 있으므로, Ylmpo1 파쇄 균주에서 만노스 인산의 양이 현저히 적어진 것을 알 수 있다. 정지기까지 배양한 균주들을 0.1% 알시안 블루로 30분간 상온에서 반응시킨 후 두 균주 간 염색 정도를 스캔하여 나타나는 색깔의 차이를 비교하였다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A novel YIMPO1 gene derived from Yarrowia lipolytica and a process for preparing a glycoprotein not being mannosylphosporylated by using a mutated Yarrowia lipolytica in which YIMPO1 gene is disrupted <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2135 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 1 cagccgcaga cactgtcatg tatcgtgccc acgttcttac taactcaggg acattgaaaa 60 acaaacgcat cggtcgccgt accgctcgaa agcactgagc atggtgctgc acccgtttcg 120 cctgctgcgc acatctcttg tgagcaagct cgtcgtcatt ctcataacct gtctgatttt 180 cggcagctta ctcaacttga ccgacaagct gcccgacgga gtcaagtcac gggtcgccta 240 catgaccgac gtgggcttag tcagcggcgg tgcccgctcg aaagccatgg ccggcaactc 300 gtctgtgcgc atcagtcacg tgccactgac gaaaatcaag tttgccgaaa acgaaaagga 360 attcaacccc aagtgggccc agaagaaggc tctggactcg tcgtcggatt actcattcga 420 gtggaaagac tgggtcgact tgaccgaggt cacgggtcta ttcagagcca tcgaggtcgg 480 ctcgtgtggc aaaaacaaac aatgccttag taagctccag gtcaccggac ccccgactca 540 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gacggtgatg tccagatgcc gatccgcgaa ttcgaccggt ttgcccgcct 1440 ctataatcag tcgttggtaa ttgatgagtc agccggcggc cggtattatg tcgatgtggg 1500 tccctcctac gtcgagcgcc tccgaggcaa cggcaagaat gtcattgatg ctcggtttat 1560 cgacgttgat agtggcatgt acattgacat taccgccttg gcgtatgccg agcagcagga 1620 aaagttccac tgcaaaaact ggcatcggta tgagttggag agcgtttctc cgctgcgtcg 1680 gacgctgttt gagggcaagg aggcttacat tccaaacaat ttcgagtcca ttttgaacca 1740 ggagtacaag aaggcgccgc tggtgaacac ccggttcgag ggccacttct ggaacaagtt 1800 tatcaaaatg tgggttcagc aggaccagtg tgaaatgtta cagattgagg agaatgtgga 1860 ccagcgggca gtgagggaaa acggtgaacc cacaactttt ggcgcttgtt atcgaccgga 1920 gtatctcaag aggtatcacg agacccacaa gatgagtaag gctcatgagg gggagatgga 1980 ggcaatcagg caaaaggccg atgtttggga atggattcgc gaggagtttg agtagaaggg 2040 gtgacggcgt gagagaggtc acgtgagaac atcacatgag gaaagggatc caggagagac 2100 cagagcacgt ggattgtagc tcacctcaga gatgg 2135 <210> 2 <211> 644 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <400> 2 Met Val Leu His Pro Phe Arg Leu Leu Arg Thr Ser Leu Val Ser Lys 1 5 10 15 Leu Val Val Ile Leu Ile Thr Cys Leu Ile Phe Gly Ser Leu Leu Asn 20 25 30 Leu Thr Asp Lys Leu Pro Asp Gly Val Lys Ser Arg Val Ala Tyr Met 35 40 45 Thr Asp Val Gly Leu Val Ser Gly Gly Ala Arg Ser Lys Ala Met Ala 50 55 60 Gly Asn Ser Ser Val Arg Ile Ser His Val Pro Leu Thr Lys Ile Lys 65 70 75 80 Phe Ala Glu Asn Glu Lys Glu Phe Asn Pro Lys Trp Ala Gln Lys Lys 85 90 95 Ala Leu Asp Ser Ser Ser Asp Tyr Ser Phe Glu Trp Lys Asp Trp Val 100 105 110 Asp Leu Thr Glu Val Thr Gly Leu Phe Arg Ala Ile Glu Val Gly Ser 115 120 125 Cys Gly Lys Asn Lys Gln Cys Leu Ser Lys Leu Gln Val Thr Gly Pro 130 135 140 Pro Thr Gln Val Glu Pro Gln Ala Phe Phe Asn Arg Val Gly Lys Val 145 150 155 160 Phe Leu Asp Gln Thr Met Pro Lys Pro Lys Gln Leu Ile Tyr Leu Thr 165 170 175 Glu Lys Glu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Glu Pro Val Glu Ile Glu Ser 180 185 190 His Val Pro Val Val Arg Glu Pro Glu Leu Gly Asp Phe Ser Arg Ser 195 200 205 Arg Asp Ala Lys Ser Ile Gln Asn Ala Lys Arg Glu Ala Thr Glu Glu 210 215 220 Ala Thr Gly Glu Ser Ala Asn Glu Gly Gln Ser Arg Asp Ser Ala Arg 225 230 235 240 Ala Ser Ala Arg Asp Ile Ala Phe Ser Glu Ala Asp Pro Val His Glu 245 250 255 Asp Ser Tyr Asp Asp Asp Glu Asn Gly Thr Ile Leu Val Pro Thr Ala 260 265 270 Glu Ser Glu Glu Glu Leu Gln Glu Tyr Ala Asp Lys Asp Ala Ala Ala 275 280 285 Lys Ser Tyr Leu Arg Ser Gly Trp Ser Arg Gly Gln Lys Tyr Val Glu 290 295 300 Leu Pro Arg Glu Leu Phe Thr Trp Asp Ile His Glu Glu Ile Asp Lys 305 310 315 320 Gly Leu Thr Lys Lys Ser Val Asp Ser Asp Asp Pro Ser Arg Glu Gln 325 330 335 Val Ala His Ser Gln Phe Leu Ser Gln His Trp Lys His Ile Lys Lys 340 345 350 Ser Gly Lys His Phe Ser Glu Ala Trp Val Val Gly Asp Thr Lys Ala 355 360 365 Ala Gly Val His Tyr Asp Trp Arg Phe Phe Ser Glu Leu Asn Thr Ile 370 375 380 Asp Glu Lys Arg Val Ile Leu Arg Lys Leu Val Arg Ala Trp Leu Asp 385 390 395 400 Phe Thr Ser Arg Glu Gly Ile Ile Thr Trp Leu Ala His Gly Thr Leu 405 410 415 Leu Gly Trp Tyr Trp Asn Gly Gln Ser Leu Pro Trp Asp Phe Asp Gly 420 425 430 Asp Val Gln Met Pro Ile Arg Glu Phe Asp Arg Phe Ala Arg Leu Tyr 435 440 445 Asn Gln Ser Leu Val Ile Asp Glu Ser Ala Gly Gly Arg Tyr Tyr Val 450 455 460 Asp Val Gly Pro Ser Tyr Val Glu Arg Leu Arg Gly Asn Gly Lys Asn 465 470 475 480 Val Ile Asp Ala Arg Phe Ile Asp Val Asp Ser Gly Met Tyr Ile Asp 485 490 495 Ile Thr Ala Leu Ala Tyr Ala Glu Gln Gln Glu Lys Phe His Cys Lys 500 505 510 Asn Trp His Arg Tyr Glu Leu Glu Ser Val Ser Pro Leu Arg Arg Thr 515 520 525 Leu Phe Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Ile Pro Asn Asn Phe Glu Ser Ile 530 535 540 Leu Asn Gln Glu Tyr Lys Lys Ala Pro Leu Val Asn Thr Arg Phe Glu 545 550 555 560 Gly His Phe Trp Asn Lys Phe Ile Lys Met Trp Val Gln Gln Asp Gln 565 570 575 Cys Glu Met Leu Gln Ile Glu Glu Asn Val Asp Gln Arg Ala Val Arg 580 585 590 Glu Asn Gly Glu Pro Thr Thr Phe Gly Ala Cys Tyr Arg Pro Glu Tyr 595 600 605 Leu Lys Arg Tyr His Glu Thr His Lys Met Ser Lys Ala His Glu Gly 610 615 620 Glu Met Glu Ala Ile Arg Gln Lys Ala Asp Val Trp Glu Trp Ile Arg 625 630 635 640 Glu Glu Phe Glu <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for pT-YIMPO1+ <400> 3 caacacacca tcggagac 18 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for pT-YIMPO1+ <400> 4 ccatggatcc gtagatctct gccgaaaatc agacag 36 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for pT-YIMPO1+ <400> 5 agatctacgg atccatggat ccaggagaga ccagag 36 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for pT-YIMPO1+ <400> 6 gttgcgtcat tctctcca 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 7 agatctacgg atccatgg 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for pT-YIOCH1+ <400> 8 actttttgca tctgcggac 19 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for pT-YIOCH1+ <400> 9 ccatggatcc gtagatctag gagttcgaag acgttg 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for pT-YIOCH1+ <400> 10 agatctacgg atccatggga ccgactctgt cttcga 36 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for pT-YIOCH1+ <400> 11 catcctcctg atatacgc 18

Claims (9)

1. 서열번호 2 또는 이와 90% 이상의 유사성을 가지는 아미노산 서열을 가지며 단백질의 만노스 인산 부가 활성을 가지는 폴리펩티드.
2. 제 1항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드는 야로위아 리폴리티카로부터 유래한 것인 폴리펩티드.
3. 제 1항의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자.
4. 제 3항에 있어서, 서열번호 1 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가지는 핵산 분자.
5. 서열번호 1로 표시되는 야로이와 리폴리티카의 YlMOP1 유전자가 파쇄되어 만노스 인산의 부가가 감소된 당단백질을 생산하는 야로위아 리폴리티카 변이주.
6. 제 5 항에 있어서, 기탁번호 제 KCTC 11102BP 호 변이주.
7. 제 5항에 있어서, YlOCH1 유전자(GenBank accession number: AJ563920)가 추가 파쇄되어 효모 특이적 당사슬 생합성이 제거된 변이주.
8. 제 7항에 있어서, 기탁번호 제 KCTC 11026BP 변이주.
9. 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 변이주에 외래 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 도입하여 발현시킴으로써 효모 특이적인 만노스 인산의 부가가 감소된 당단백질을 생산하는 방법.