KR101638930B1 - YlMpo1 단백질을 이용한 만노스인산화 반응 - Google Patents

Abstract

본 발명은 YlMpo1 단백질을 이용한 만노스 인산화 반응에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 YlMpo1 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 YlMpo1을 이용하여 당사슬에 만노스-6-인산을 부가시키는 방법, 상기 방법을 이용한 만노스-6-인산이 부가된 당사슬이 부착된 당단백질 또는 유용화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 당사슬에 만노스-6-인산을 부가시키는 방법은 생체 외(in vitro)에서 효소 치료제로 사용되는 당단백질에 효과적으로 만노스 인산을 부가시킬 수 있으므로, 동물세포 또는 당사슬 생합성 경로가 재설계된 효모에서 만노스-6-인산 당사슬이 부착된 효소 치료제를 직접 생산하는 것보다 다양한 효소 치료제 제조에 응용될 수 있으며, 당단백질뿐만 아니라, 만노스-6-인산 당사슬을 내포 탈출을 위한 펩타이드, 지질 또는 나노물질과 결합시켜 라이소좀이 아닌 세포질 또는 핵 내로 유용물질을 전달하는데 활용할 수 있다.

Description

YlMpo1 단백질을 이용한 만노스인산화 반응{Mannosylphosphorylation Reaction Using YlMpo1 Protein}

본 발명은 YlMpo1 단백질을 이용한 만노스 인산화 반응에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 YlMpo1 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 YlMpo1을 이용하여 당사슬에 만노스-6-인산을 부가시키는 방법, 상기 방법을 이용한 만노스-6-인산이 부가된 당사슬이 부착된 당단백질 또는 유용화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

당질화를 통해서 당사슬이 부가되는 당단백질들은 현재 전세계 재조합 단백질 의약품 시장의 60% 이상을 차지하며 시장을 주도하고 있다. 특히, 당사슬은 당단백질 의약품의 치료 효능, 체내 지속성, 타겟팅 및 면역반응 등에서 중요한 역할을 하기에 의약품의 품질을 결정하는 주요 인자로 부각되고 있다. 당사슬이 부가되는 반응은 크게 N-결합 또는 O-결합 당질화(N-linked or O-linked glycosylation)의 두 가지 형태가 있으며, 이 중 N-결합 당질화를 통해서 부가되는 당사슬을 N-당사슬(N-glycan)이라 부르며 소포체에서 시작된다. 먼저 소포체 막에 존재하는 돌리콜 피로인산(dolichol pyrophosphate, PP-Dol)에 연결된 형태의 당사슬인 Glc₃Man₉GlcNAc₂-PP-Dol을 형성한다. 그리고 올리고당 전이효소(oligosaccharyltransferase)가 이를 co-translational translocation 기작으로 리보좀에서 소포체로 번역되어 나오는 단백질 중에서 N-X-S/T 서열의 N-당질화 시퀀 (sequon)에 전달한다. 소포체 안에 존재하는 당단백질 폴딩의 품질 제어를 담당하는 기작의 글루코시다아제(glucosidase)와 만노시다제(mannosidase)에 의해서 말단에 존재하는 포도당과 특정 만노스(mannose)가 제거되어 Man₈GlcNAc₂ 구조를 갖는 고만노스형(high-mannose type) 당사슬을 부착한 상태로 골지체에 옮겨지게 된다.

상기에서 소개한 소포체에서 이루어지는 N-당사슬의 초기 생합성 과정은 진핵 미생물인 효모에서 고등동물인 포유류에 이르기까지 거의 동일한 과정으로 보존되어 있다. 그러나, 골지체로 넘어간 당사슬은 각 종에 특이적으로 다양한 당사슬 수식 과정을 거치게 되며, 그 결과로 효모, 곤충, 식물 및 동물 등에서 완전히 다른 형태의 당사슬들이 만들어지게 된다. 고등 동물에서는 골지체로 들어온 당단백질의 당사슬들은 만노시다제들에 의해서 Man₅GlcNAc₂ 형태로 다듬어진다. 그리고 여기에 N-acetylglucosaminyltransferase (GNT) I이 작용해서 GlcNAc이 하나 부가된 후, 만노시다제 II가 작용해서 반대편 가지에 부가되어 있던 만노스 2개를 더 제거하여 trimannosyl core (Man₃GlcNAc₂) 당사슬에 GlcNAc이 하나 부가되어 있는 혼합형 구조가 만들어진다. 이후 만노스가 제거된 가지에 GNT II가 작용해서 GlcNAc이 하나 더 부가되면서 두 개의 안테나 구조를 갖는 당사슬이 생성된다. 이후에 GNT IV와 V 등이 작용해서 네 개의 안테나 구조가 만들어지기도 하며, 일부에서는 GNT VI, IX 또는 VB 등이 작용해서 6개의 안테나 구조까지 만들어지는 경우도 있다. GlcNAc이 부가되어 안테나의 골격이 만들어진 후에 골지체에 존재하는 β-galactosyltransferase와 α-sialyltrasnferase 등이 작용해서 GlcNAc 위에 갈락토즈와 시알산이 부가된 복합형(complex type) 당사슬 구조가 만들어진다.

동물세포에서는 많은 당단백질들이 상기에서 설명한 복합형 N-당사슬을 가지고 있으나 당단백질의 종류에 따라서는 소포체에서 넘어온 형태인 고만노스형 당사슬을 가지고 있는 경우들이 있다. 또한, 불필요한 물질들을 분해하여 재활용하도록 하는 소화와 자기 분해 기능을 가진 라이소좀으로 가는 당단백질들은 고만노스형 당사슬에 만노스-6-인산(mannose-6-phosphate)이 부가되기도 한다. 이 경우 골지체에서 N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase (GlcNAc-PT)가 라이소좀으로 이동할 당단백질들의 3차 구조를 인식하여 GlcNAc-인산을 당사슬의 만노스 잔기에 부가한다(도 1). 그리고, 여기에 uncovering 효소(N-acetylglucosamine-1-phosphodiester α-N-acetylglucosaminidase)가 작용하여 바깥쪽 GlcNAc 잔기만을 제거하는 2단계 과정으로 만노스-6-인산이 형성된다. 이렇게 형성된 만노스-6-인산을 양이온 의존적 만노스-6-인산 수용체(dependent mannose-6-phosphate receptor, CD-MPR)가 인식하여 이를 내포(endosome)를 거쳐 라이소좀으로 이동시킨다. 그러나, 이때 CD-MPR과 결합하지 못한 당단백질들은 세포 밖으로 분비되게 된다. 이렇게 분비된 당단백질들을 다시 내포 반응(endocytosis)를 통해서 라이소좀으로 이동시키는 “분비-재도입 (secretion-recapture)” 경로가 존재하며 주로 양이온 비의존적 만노스-6-인산 수용체(independent mannose-6-phosphate receptor, CI-MPR)가 그 기능을 한다고 알려져 있다.

라이소좀 저장질환(lysosomal storage disease)은 선천적인 유전자 이상으로 라이소좀에 존재하는 분해효소의 활성이 결핍되어 대사물질이 축적되어 발생하는 질환들이다. 이러한 질환을 선천적으로 갖고 태어난 환자들은 치료를 받지 못하면 대부분 젊은 나이에 죽음을 맞이하게 된다. 현재 거의 유일하게 승인을 받아서 사용되는 치료법은 효소 대체요법(enzyme replacement therapy)으로 정상적인 효소를 외부에서 주입해주는 방법이다. 미국 Genzyme은 1998년에 첫 번째 효소 치료제로서 고셔병 치료를 위한 세레자임(Cerezyme)을 시판한 이래 파브라자임(Fabrazyme), 알두라자임(Aldurazyme) 및 마이오자임(Myozyme) 등을 개발하여 이 분야에서 독보적인 영역을 구축하고 있다.

효소 치료제는 유전적 대사 질환을 가진 소수의 환자들을 대상으로 하고 있음에도 비싼 가격 때문에 전체 규모가 2.5조원이 넘는 큰 시장을 형성하고 있으나, 효소 치료제를 라이소좀으로 타겟팅하기 위해서는 당사슬을 제어하여 원하는 구조로 최적화해야 하는 높은 기술적 장벽을 갖고 있어서 소수의 기업이 전 세계 시장을 독점하는 비정상적인 구조를 보이고 있다.

고셔병 치료제인 세레자임(Cerezyme)은 CHO(Chinese hamster ovary) 세포에서 생산된 인간 글루코세레브로시다아제(glucocerebrosidase)로서 순차적인 엑소글리코시다아제(exoglycosidase) 효소 반응들에 의해서 만노스 잔기를 노출시킨 trimannosyl core 당사슬을 갖는다. 이러한 당사슬을 갖는 글루코세레브로시다아제는 문제가 되는 대식세포의 표면에 존재하는 만노스 수용체를 통해 세포 내로 받아들여진 후에 라이소좀으로 이동된다. 반면에 세레자임(Cerezyme)을 제외한 다른 효소 치료제들은 상기에서 설명한 만노스-6-인산이 부가된 당사슬을 가지고 있어서 만노스-6-인산 수용체를 통해서 세포 내 라이소좀으로 이동한다 (도 1).

즉, 환자들에게 만노스-6-인산 당사슬을 가진 재조합 효소를 투여하면, 상기에서 설명한 “분비-재도입 경로”의 만노스-6-인산 수용체인 CI-MPR이 이를 인식하고 내포 작용에 의해서 라이소좀으로 이동시켜서 축적된 대사물질을 대신 분해해 주는 것이다. 따라서, 효소 치료제에서는 만노스-6-인산 당사슬이 많이 부가되도록 하는 것이 품질 관리에 있어서 중요하다.

효모는 진핵 미생물로서 유전자 조작이 용이하여 다루기 쉽고 저렴한 비용으로 대량의 단백질을 생산할 수 있어서 경제성이 높을 뿐만 아니라, 인간을 감염시키는 바이러스와 프라이온 등에 오염이 될 가능성이 없는 등 안전성 또한 매우 높다는 많은 장점들을 가지고 있다. 그러나, 효모에서 합성된 당사슬 구조는 인간의 것과 매우 상이하여 인체 주입 시 면역 반응을 일으키는 문제점이 있다. 효모는 소포체까지는 고등동물과 동일한 당사슬 생합성 과정을 가지고 있으나, 골지(golgi) 이동한 후에는 만노스가 추가로 부가되는 효모 특이적인 당사슬 수식 경로를 갖는다. 즉, OCH1 유전자 산물에 의해서 소포체에서 넘어온 Man₈GlcNAc₂ 당사슬에 α(1,6)-결합으로 만노스가 부가되는 당사슬 외쇄(glycan outer chain) 개시 반응이 일어나며, 이를 시작으로 α(1,6)-결합 및 α(1,2)-결합으로 만노스가 연속적으로 부가되어 당사슬 외쇄가 합성된다. 전통효모인 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 경우에는 핵심 당사슬에 50-200개의 만노스가 연속적으로 부가되는 과당화 반응이 일어나기도 하며, 인체에서 항원으로 인지될 수 있는 α(1,3)-만노스가 MNN1 유전자 산물에 의해서 부가된다. 또한, 당사슬에 만노스-1-인산이 추가로 부가되는 만노스인산화(mannosylphosphorylation)를 통해서 산성 당사슬이 생성된다는 사실도 알려졌다. MNN6 유전자가 발현하는 효소에 의한 만노스인산화 반응에 의해서 일어나며(Wang et al , J Biol Chem , 272:18117, 1997), 이를 제어하는 단백질을 발현하는 유전자로 MNN4가 제시되었다 (Odani et al ., Glycobiol ., 6:805, 1996; Odani et al ., FEBS Lett ., 420:1860, 1997).

상기에서 기술한 바와 같이 효모에서 생산한 당단백질에 부착된 당사슬은 인간의 것과 구조가 달라서 인체 주입 시 면역 반응을 일으키기 때문에 의약용으로 사용할 수 없으므로, 이러한 문제를 해결하기 위해서 효모 특이적인 당사슬을 부가하는 당전이효소 유전자들을 파쇄하는 방법들이 제시되었다. 특히 S. cerevisiae 효모에서는 당사슬 외쇄 연장 반응을 개시하는 OCH1 유전자와 α(1,3)-만노스를 부가하는 MNN1 유전자 등을 파쇄하여 효모 특이적인 당사슬의 부가를 막는 방법들이 제시되었다 (Nakayama et al ., EMBO J, 11:2511, 1992; Nakanishi-Shindo et al ., J Biol Chem , 268:26338, 1993).

또한, 상기에서 언급한 MNN4 및 MNN6가 만노스 잔기에 만노스 인산을 부가하여 형성되는 만노스-6-인산-1-만노스(Man-6-P-1-Man)의 형태의 당사슬 가지도 인체 주입시 면역 반응을 일으킬 수 있으므로, 의약용 당단백질 생산을 위해서는 이를 제거해 주어야 한다. 효소 치료제의 경우에는 만노스-6-인산이 부가된 당사슬이 필요하므로 만노스-6-인산-1-만노스 구조에서 바깥쪽 만노스를 제거하여 만노스-6-인산 당사슬을 형성시키는 기술이 개발되었다.

일본 AIST (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) 그룹은 효모에서 효소 치료제를 발현하기 위해서 OCH1과 MNN1 등의 유전자를 파쇄하고, MNN4를 과발현해서 더 많은 만노스인산화를 유도하였으며(Chiba et al ., Glycobiol , 12:821, 2002; Akeboshi et al ., Glycobiol , 19:1002), 한국 등록특허 제0888316호에서는 셀룰로모나스(Cellulomonas) 속 세균의 배양액에서 유래된 α-만노시다제로 처리하여 바깥쪽 만노스를 제거하여 만노스-6-인산을 형성시키는 방법이 개시되었다.

상기 기술에서는 바깥쪽 만노스를 제거하는 캡핑 제거(uncapping) 활성을 가진 효소를 분자 수준까지 동정하지는 못하고 배양액으로부터 부분 정제한 효소 활성 용액을 사용하였으나, 벨기에 겐트 대학의 Callewaert 교수 연구팀은 Cellulosimicrobium cellulans으로부터 바깥쪽 만노스를 제거하여 만노스-6-인산을 형성할 수 있는 효소 CcGH92_5를 발굴하였으며(Tiels et al ., Nature Biotech , 30:1225, 2012), 이를 재조합 발현하여 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 효모에서 생산한 효소 치료제에 처리하여 만노스-6-인산을 노출시키는데 성공적으로 사용하였다.

전통 효모인 S. cerevisiae 외에도 메탄올자화 효모인 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)를 비롯한 여러 효모들에서도 만노스 인산의 부가 반응과 관련된 유전자들이 밝혀졌다. 일본 Miura 박사 그룹은 S. cerevisiae의 MNN4 유전자 서열을 탐침으로 이용해서 만노스 인산의 부가에서 중요한 역할을 하는 P. pstoris의 PNO1 유전자를 찾았고, 이를 파쇄하였을 때 만노스인산화 반응이 제어될 수 있다고 보고하였다 (Miura et al ., Gene , 324:129, 2004). 그러나 미국의 GlycoFi사는 PNO1 유전자의 파쇄로 만노스 인산의 부가를 어느 정도 저해할 수 있으나 이를 완전히 제거할 수 없다는 사실을 발견하였으며(미국등록특허 제07259007호), P. pastoris에서 S. cerevisiae의 Mnn4 단백질과 서열이 유사한 유전자들을 발견하고, 이들을 각각 MNN4A, MNN4B와 MNN4C로 명명하였다. 또한 이들 중에서 PNO1과 함께 MNN4B 유전자를 이중 파쇄하면 만노스 인산의 부가를 완전히 제어할 수 있음을 보여주었다.

본 발명자들은 이형효모인 Y. lipolytica로부터 S. cerevisiae의 MNN4와 서열 유사성이 높은 유전자를 발견하였고, 해당 유전자를 Y. lipolytica 효모에서 파쇄하면 만노스 인산의 부가가 완전히 제어된다는 사실을 발견하였다 (한국 등록특허 제0915670호). S. cerevisiae의 MNN4와 서열이 유사한 Y. lipolytica의 본 유전자는 단일 유전자의 파쇄만으로 만노스인산화를 완전히 제어할 수 있는 새로운 유전자로서 YlMPO1 (Y. lipolytica Mannosyl Phosphorylation of Oligosaccharide)이라 명명하였다. 그리고 더 나아가 추가적인 연구를 통하여 YlMPO1이 N-당사슬 뿐만 아니라 O-당사슬의 만노스인산화에 핵심적인 역할을 하며, 이는 모두 MNN6 유전자의 도움 없이 단독으로 이루어진다는 것을 보고하였다 (Park et al, Appl Env Microbiol, 77:1187, 2011).

이에 본 발명자들은 YlMpo1은 직접 만노스인산화 반응을 담당하는 효소라고 유추하고, 상기 효소를 이용하여 만노스인산화 반응을 수행하기 위해 노력한 결과, YlMpo1 생산능을 가지는 재조합 미생물을 제조하고, YlMpo1의 만노스인산화 반응을 이용하면 당사슬에 만노스-6-인산-1-만노스가 부가되는 것을 확인하였으며, 생성된 만노스-6-인산-1-만노스가 부가된 당사슬의 바깥쪽 만노스를 약산 가수분해 또는 캡핑 제거(uncapping) 반응 등을 통해 제거시키면 만노오스-6-인산(mannose-6-phosphate)이 형성되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

상기의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은

YlMpo1을 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 YlMpo1 생산능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 YlMpo1은 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 유래인 것을 특징으로 하며, 상기 YlMpo1는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 YlMpo1인 것을 특징으로 할 수 있다.

미국국립생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI)에는 Y. lipolytica CLIB122 strain의 유전체 염기 서열이 결정되어 있다. YlMpo1에 해당하는 염기 및 아미노산 서열이 XM_503217와 XP_503217에 기재되어 있으며, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 Mnn4의 homologue로 서술되어 있다. 본 발명자들은 선행연구에서 YlMpo1은 NCBI의 XP_503217에 기재되어 있는 서열보다 N-말단에 47개의 아미노산 서열(141개 염기 서열)이 더 있다는 사실을 발견하고 특허(한국 등록특허 제0915670호)에 기재하였다 (서열번호 1 염기서열, 서열번호 2 아미노산 서열). 본 발명에서는 Y. lipolytica SMS397A strain의 유전체 DNA로부터 YlMpo1 유전자를 중합효소연쇄반응을 이용하여 증폭하고 다시 서열을 결정하였는데, 646 및 655번째 염기가 기존에 공지된 서열과 다른 것을 확인하였다 (서열번호 3 염기 서열). 이 중 646번째 염기 서열의 변화는 아미노산 서열의 변화를 동반하여 216번 Asn이 His으로 변경된 것을 확인하였다 (서열번호 4 아미노산 서열).

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 YlMpo1은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자로, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 YlMpo1은 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 유전자로, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 YlMpo1은 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 유전자로, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 YlMpo1은 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 유전자로 코딩되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pET21-YlMpo1-dTM1, pET21-YlMpo1-dTM2 또는 pFN18A-YlMpo1인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 재조합 미생물은 통상의 방법에 따라 상기 유전자를 미생물의 염색체(chromosome) 상에 삽입시키거나, 상기 재조합 벡터를 미생물의 플라스미드(plasmid) 상에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli XL -1 Blue ( Stratagene ), E. coli DH5 α, E. coli JM101, E. coli K12 , E. coli W3110 , E. coli X1776 , E. coli BL21 등을 포함한다. 그러나 FMB101 , NM522 , NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera) 등이 또한 사용될 수 있다. 상기 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.

원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al ., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

본 발명에서 재조합 YlMpo1을 코딩하는 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 물리적인 방법으로서, microinjection(세포에 DNA를 직접 넣는 것), liposome, directed DNA uptake, receptor~mediated DNA transfer 또는 Ca⁺⁺을 이용한 DNA 운반 방법 등이 있으며, 최근에는 바이러스(virus)를 이용한 유전자 운반 방법이 많이 사용되고 있다. 일례로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 이용하는 방법 등이 있으며, 특히, 레트로바이러스는 유전자 전달 효율이 높고 gross deletion이나 숙주 DNA와 재정렬(rearrangement : 숙주 DNA 중 자기 DNA와 유사한 부위를 바꾸는 것으로 숙주 DNA 기능의 변화를 초래함)에 의한 결합 없이 넓은 범위의 세포들에서 사용할 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열 (pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서(enhancer)는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션 (연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커 (linker)를 사용한다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 Agrobacterium 속, Aspergillus 속, Acetobacter 속, Aminobacter 속, Agromonas 속, Acidphilium 속, Bulleromyces 속, Bullera 속, Brevundimonas 속, Cryptococcus 속, Chionosphaera 속, Candida 속, Cerinosterus 속, Escherichia 속, Exisophiala 속, Exobasidium 속, Fellomyces 속, Filobasidium 속, Geotrichum 속, Graphiola 속, Gluconobacter 속, Kockovaella 속, Curtzmanomyces 속, Lalaria 속, Leucospoidium 속, Legionella 속, Psedozyma 속, Paracoccus 속, Petromyc 속, Rhodotorula 속, Rhodosporidium 속, Rhizomonas 속, Rhodobium 속, Rhodoplanes 속, Rhodopseudomonas 속, Rhodobacter 속, Sporobolomyces 속, Spridobolus 속, Saitoella 속, Schizosaccharomyces 속, Sphingomonas 속, Sporotrichum 속, Sympodiomycopsis 속, Sterigmatosporidium 속, Tapharina 속, Tremella 속, Trichosporon 속, Tilletiaria 속, Tilletia 속, Tolyposporium 속, Tilletiposis 속, Ustilago 속, Udenlomyce 속, Xanthophilomyces 속, Xanthobacter 속, Paecilomyces 속, Acremonium 속, Hyhomonus 속, Rhizobium 속 등을 예시할 수 있으며, 대장균(Escherichia coli)인 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에서는 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 유래의 YlMpo1(서열번호 1 또는 3 염기서열, 서열번호 2 또는 4 아미노산 서열)의 N-말단 부분에 막투과 영역으로 예측되는 아미노산 서열을 제거한 YlMpo1_dTM1(서열번호 5 염기서열, 서열번호 6 아미노산 서열)과 그 뒤에 이어서 나오는 소수성 부위까지 함께 제거한 YlMpo1_dTM2(서열번호 7 염기서열, 서열번호 8 아미노산 서열)의 단백질을 발현시키기 위해 Y. lipolytica 효모의 유전체 DNA로부터 dTM1 및 dTM2 부분의 염기서열을 증폭시켰으며(도 3), pET21-YlMpo1-dTM1와 pET21-YlMpo1-dTM2 벡터를 제조하고 대장균에 형질전환시켜 His-tagged YlMpo1-dTM1 및 His-tagged YlMpo1-dTM2를 발현시켰다. 상기 발현된 His-tagged YlMpo1_dTM1과 His-tagged YlMpo1_dTM2를 분석한 결과, 막투과 영역 단백질(transmembrane regions)을 제거하였음에도 His-tagged YlMpo1_dTM1과 His-tagged YlMpo1_dTM2 모두 불용성 부분에서 대부분이 관찰되는 것을 확인하였으며(도 5), 이 후 His-tagged YlMpo1_dTM2를 발현시켜 정제하였다.

또한, Halo-tagged YlMpo1를 발현시키기 위해, pFN18A-YlMpo1 벡터를 제작하고, 대장균 KRX 균주에 형질전환시켜 발현 및 정제한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 예상했던 약 74 kDa의 YlMpo1 단백질이 분리, 정제되었음을 확인하였다.

상기 형질전환체는 KRX/pFN18A-YlMpo1으로 명명하고, 이를 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 규정에 따라, 2013년 9월 25일자로 한국생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KRIBB) 내 유전자은행(Korea Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁번호 제KCTC12493BP로 기탁하였다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) YlMpo1을 이용하여 당사슬에 만노스-6-인산-1-만노스를 부가시키는 단계; 및 (b) 상기 만노스-6-인산-1-만노스가 부가된 당사슬의 바깥쪽 만노스를 제거하여 만노스-6-인산이 부가된 당사슬을 생성시키는 단계를 포함하는 YlMpo1 단백질을 이용하여 당사슬에 만노스-6-인산을 부가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 YlMpo1은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되며, 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 당사슬은 고만노스형(high-mannose type) 및 포시만노스형(pauci-mannose type) 당사슬인 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로는 Man_{3 -9}GlcNAc₂ 당사슬(M3-9)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에서, pFN18A-YlMpo1 벡터(Halo-tagged YlMpo1)를 이용하여 발현시킨 YlMpo1이 생체 외(in vitro)에서 Man₈GlcNAc₂ (M8) 당사슬을 기질로하여 만노스 인산화 반응을 수행하는지 확인하였으며, DNA sequencer 분석을 통해 덱스트란 래더(Dextran ladder)를 이용한 글루코오스 유닛(glucose unit; GU)을 통해서 APTS로 표지된 당사슬들을 비교 분석하였다. 그 결과, M8 당사슬 피크는 GU 9 위치에서 검출되었고, YlMpo1에 의한 만노스 인산화 반응 후에는 만노스 인산이 하나 부가된 당사슬 피크는 GU 6 위치에서 검출되었으며, 두 개의 만노스 인산이 부가된 당사슬 피크는 GU 4 위치에서 검출되었다 (도 8). 즉, 본 발명의 방법으로 제조한 YlMpo1가 생체 외(in vitro)에서 당사슬에 만노스 인산을 부가시켜 만노스-6-인산-1-만노스 구조를 가진 당사슬을 제조할 수 있는 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 당사슬에 만노스-6-인산-1-만노스를 부가시키는 과정은 완충용액, 금속이온 및 GDP-만노스(mannose)가 추가로 첨가되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 완충용액은 pH 5.0 내지 8.0의 인산나트륨 (sodium phosphate)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 금속이온은 칼슘이온 또는 망간이온인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 (a) 단계에 계면활성제(surfactant)를 추가로 첨가할 수 있으며, 상기 계면활성제(surfactant)는 노닐 페녹시폴리에톡시에탄올(nonyl phenoxypolyethoxylethanol; NP-40), 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르(polyoxyethylene octyl phenyl ether; Triton X-100), 폴리옥시에칠렌소르비톨모노라우레이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate; Tween-20), 폴리옥시에틸렌 (23) 라우릴 에테르(Polyoxyethylene (23) lauryl ether; Brij-35) 및 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로페인셀퍼네이트(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate; CHAPS)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 재조합 YlMpo1의 만노스 인산화 활성을 증가시키기 위해, YlMpo1의 최적 반응조건을 확립하기 위해, 반응시간, YlMpo1처리 농도, pH 변화, 금속이온 및 계면활성제 첨가에 따른 만노스 인산화 활성을 분석하였다. 반응 시간에 따른 YlMpo1에 의한 만노스 인산화 반응의 차이를 분석한 결과, 반응 시간이 240분 일 때 나머지 반응 시간과 비교하여 만노스 인산화가 증가하였으나, 120분의 반응 시간을 주었을 때 가장 효율적인 것을 확인하고, 이 후의 실험들에서 반응시간은 2시간으로 진행하였다 (도 9A).

YlMpo1 농도가 증가할수록 만노스 인산이 부가된 당사슬의 비율이 증가하는 것을 확인하였으나, 농도에 따라 크게 증가하지 않는 것을 확인하였으며(도 9B), 최적의 pH을 확인하기 pH가 상이한 다양한 완충액을 사용하여 실험을 수행한 결과, pH 5.0 내지 8.0의 인산 나트륨(sodium phosphate) 완충액을 사용하였을 때 대체적으로 활성이 높게 나타났고, 특히 pH 6.0, 6.5, 7.0일 때 가장 높게 나타난 것을 확인하였다 (도 9C).

또한, 금속 이온이 YlMpo1의 만노산 인산화 반응에 미치는 영향을 분석한 결과, 이온을 포함하지 않았을 때보다 10 mM 칼슘이온(CaCl₂)을 넣고 반응할 때 가장 높은 활성을 보였으며, 망간이온(MnCl₂)를 넣었을 때 다음으로 높은 활성을 보였다(도 10A). 가장 크게 활성을 증가시키는 칼슘이온(CaCl₂)을 0.4 mM, 2 mM, 10 mM과 20 mM으로 첨가하여 만노스 인산화 활성을 분석한 결과, 2 mM의 칼슘이온에서 가장 높은 활성을 보이는 것을 확인하였다 (도 10B).

계면활성제(surfactant)가 YlMpo1에 만노스 인산화 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해, NP-40(nonyl phenoxypolyethoxylethanol), Triton-X100(polyoxyethylene octyl phenyl ether), Tween-20(Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate), Brij-35(Polyoxyethylene (23) lauryl ether), CHAPS((3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)를 첨가하여 분석한 결과, 계면활성제(surfactant)를 첨가하였을 때, 전반적으로 활성이 조금 증가하는 것을 관찰하였으며, 특히 Tween-20과 CHAPS가 있을 때 활성이 가장 높은 것을 확인하였으며(도 11A), Tween-20과 CHAPS의 농도에 따른 활성변화를 알아보기 위해서 두 종류의 계면활성제를 0.05%, 0.1%, 0.5%, 2% 농도별 처리한 결과, Tween-20의 경우 0.5% 일 때 가장 높은 활성을 보이고, 2%일 때 활성이 크게 감소한 반면, CHAPS의 경우에는 2%로 처리하였을 때 활성이 높게 나타났다 (도 11B 및 도 11C).

His-tagged YlMpo1_dTM2를 가용화시켜서 정제하고, 상기 조건으로 만노스 인산화 반응을 수행한 결과, 가용화 시킨 His-tagged YlMpo1에 의해서 M8 당사슬에 만노스 인산이 부가된 것을 확인하였으며, 만노스-6-인산-1-만노스 구조도 생성되는 것을 확인하였다 (도 12).

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 만노스-6-인산-1-만노스가 부가된 당사슬의 바깥쪽 만노스를 제거하는 과정은 약산 가수분해 또는 캡핑 제거(uncapping) 효소를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약산은 황산 또는 염산을 사용할 수도 있으나 바람직하게는 0.1 내지 5 M의 포름산(formic acid)인 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 0.5 mM의 포름산(formic acid)를 사용한다. 캡핑 제거(uncapping) 효소는 α-만노시다제(α-mannosidase)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 YlMpo1에 의해 당사슬에 부가된 만노스-6-인산-1-만노스 구조는 인간에게서 존재하지 않는 당사슬 구조이기 때문에 대부분의 의약용 당단백질 생산을 위해서는 이를 제거해주어야 한다. 만노스-6-인산-1-만노스 구조에서 바깥쪽 만노스를 제거하여 만노스-6-인산 당사슬을 형성시키는 방법은 약산 가수분해와 같은 당업계에 공지된 화학적인 방법을 이용할 수 있으며, 재조합 발현한 캡핑 제거(uncapping) 효소 CcGH92_5를 이용하거나(Tiels et al, Nature Biotech 30: 1225-1231, 2012), 셀룰로모나스(Cellulomonas) 속 세균의 배양액에서 유래된 α -만노시다제를 사용할 수 있다 (한국 등록특허 제0888316호).

본 발명의 실시예에서, 만노스-6-인산-1-만노스가 부가된 당사슬의 바깥쪽 만노스를 제거하고 만노스-6-인산이 부가된 당사슬을 제조하기 위해 셀룰로시마이크로비움 셀루란스(Cellulosimicrobium cellulans)유래 uncapping 효소인 CcGH92_5의 효소 활성 도메인(1-774)을 클로닝하여 발현시켰으며(도 13), 만노스-6-인산-1-만노스가 부가된 당사슬에 상기 분리 정제된 uncapping 효소를 처리하여 반응시킨 결과, 바깥쪽 만노스가 제거되어 형성된 만노스-6-인산이 부가된 당사슬이 생성되는 것을 확인하였다 (도 14).

또한, 만노스-6-인산-1-만노스가 부가된 당사슬에 0.5 M 포름산(formic acid)을 처리하여 약산 가수 분해를 진행한 결과, 만노스-6-인산이 부가된 당사슬이 형성되는 것을 확인하였으며, 상기 당사슬에 칼프 인텐스티날 알칼라인 포스파테이즈(calf intestinal alkaline phosphatase; CIP)처리하면, 인산이 완전히 제거되어 M8 당사슬로 변환되는 것을 확인하였다 (도 15).

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 당사슬에 만노스-6-인산을 부가시키는 방법에 의해 만노스-6-인산을 부가하는 것을 특징으로 하는 당단백질의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 당사슬에 만노스-6-인산을 부가시키는 방법에 의해 제조된 만노스-6-인산이 부가된 당사슬과 단백질을 화학적 또는 물리적인 방법으로 결합시키는 것을 특징으로 하는 당단백질의 제조방법에 관한 것이다.

상기의 방법은 동물세포 또는 당사슬 생합성 경로가 재설계된 효모에서 만노스-6-인산 당사슬이 부착된 효소 치료제를 직접 생산하는 것보다 훨씬 더 다양하고 융통성 있는 응용 가능성을 가진다는 장점을 가진다. 예를 들면 만노스가 포함된 당사슬에 생체 외(in vitro)에서 YlMpo1을 이용하여 만노스 인산을 부가하고 바깥 쪽 만노스를 캡핑 제거(uncapping)하여 제조된 만노스-6-인산을 화학적 또는 물리적인 방법으로 당단백질에 결합시킬 수 있다. 이러한 방법을 이용한다면 당사슬 부가 능력이 없으나 생산성과 경제성이 높은 대장균에서 효소 단백질을 생산하고, 여기에 상기에서 기술한 방법으로 만노스-6-인산 당사슬을 부착하는 방식으로 세포 내 라이소좀으로 타겟팅이 가능한 당단백질을 생산할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단백질은 병원체 단백질(pathogen protein), 라이소좀 단백질(lysosomal protein), 성장 인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 항체 또는 이의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment), 또는 융합 단백질(fusion protein)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 라이소좀 단백질(lysosomal protein)은 라이소좀 저장질환(lysosomal storage disease; LSD) 관련된 분해효소인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 라이소좀 저장질환은 파브리병(Fabry's disease), 점액다당류증 Ⅰ(mucopolysaccharidosis I), 파버 질병(Farberdisease), 고셰병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드증(GM1-gangliosidosis), 테이-샥스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성제 질병(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염성백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 샤이에 질병(Scheie disease), 헌터 질병(Hunter disease), 산필립포 질병(Sanfilippo disease), 모르키오병(Morquio disease), 마로토-라미 질병(Maroteaux-Lamy disease), 히알루로니다아제 결핍증 (hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코스아민뇨증 (aspartylglucosaminuria), 푸코시드축적증(fucosidosis), 만노시도시스 (mannosidosis), 쉰들러 병(Schindler disease), 사이알산축적증 유형 1(sialidosis type 1), 폼피병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 축적 질병(cholesterol ester storage disease), 월만병(Wolman disease), 다종 술파타아제 결손증 (Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴축적증(cystinosis), 시알산 축적 질병(sialic acid storage disorder), 마리네스코-쉐글렌 증후군(

)을 갖는 킬로미크론 보유 질병(chylomicron retention disease), 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease), 또는 겔레오피직 이형성증(Geleophysic dysplasia) 등이 포함된다.

본 발명에서는 YlMpo1을 이용하여 만노스-6-인산-1-만노스을 부가하고 바깥 쪽 만노스를 캡핑 제거(uncapping)하여 제조된 만노스-6-인산을 화학적 또는 물리적인 방법으로 당단백질에 결합시키는 방법을 사용하였으나, 이에 한정되지 않고, 만노스-6-인산-1-만노스가 부가된 당사슬을 당단백질에 결합시킨 후, 바깥쪽 만노스를 캡핑 제거(uncapping)하여 만노스-6-인산이 부가된 당단백질을 제조할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 당사슬에 만노스-6-인산을 부가시키는 방법에 의해 제조된 만노스-6-인산이 부가된 당사슬과 내포 탈출을 위한 펩타이드, 지질 또는 나노물질과 결합시켜 라이소좀이 아닌 세포질 또는 핵 내로 유용물질을 전달하는 수송체 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법으로 제조된 만노스-6-인산이 부가된 당사슬은 만노스-6-인산 수용체가 내포 과정을 통해서 세포 내 라이소좀으로 이동하므로, 만노스-6-인산 당사슬을 내포 탈출을 위한 펩타이드, 지질 또는 나노물질들과 결합시켜서 라이소좀이 아닌 세포질 또는 핵 내로 유용물질을 전달하는데 활용할 수 있다. 이러한 방식으로 세포 제어를 위한 전사인자, 항체, 신호전달 단백질 등뿐만 아니라 microRNA, siRNA, 플라스미드 DNA 등을 세포 내로 전달하는 도구로서 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 방법으로 제조된 재조합 YlMpo1을 이용한 만노스-6-인산이 부가된 당사슬의 제조방법은 생체 외(in vitro)에서 효소 치료제로 사용되는 당단백질에 효과적으로 만노스 인산을 부가시킬 수 있으므로, 동물세포 또는 당사슬 생합성 경로가 재설계된 효모에서 만노스-6-인산 당사슬이 부착된 효소 치료제를 직접 생산하는 것보다 다양한 효소 치료제 제조에 응용될 수 있으며, 당단백질뿐만 아니라, 만노스-6-인산 당사슬을 내포 탈출을 위한 펩타이드, 지질 또는 나노물질과 결합시켜 라이소좀이 아닌 세포질 또는 핵 내로 유용물질을 전달하는데 활용할 수 있다.

도 1은 만노스-6-인산 신호를 이용한 치료용 효소의 세포 내 라이소좀으로의 타겟팅 과정을 나타낸 모식도이다.
라이소좀으로 이동할 단백질들은 골지체에서 N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase (GlcNAc-PT)에 의해서 GlcNAc-인산이 부가되고, 다음 단계로 uncovering 효소에 의해서 바깥쪽 GlcNAc이 제거되면서 만노스-6-인산이 만들어진다. 두 종류의 만노스-6-인산 수용체(MPR)가 존재하며 각각 cation-dependent (CD)-MPR과 cation-independent (CI)-MPR로 불린다. 외부에서 재조합 효소를 넣어주면 세포막에 존재하는 CI-MPR이 이를 인식하고 결합하여 내포 과정을 거쳐서 라이소좀으로 타겟팅한다. 도면에서 당사슬을 나타내는 기호는 미국 Consortium for Functional Glycomics (htpp://www.functionalglycomics.org/)의 양식을 따랐으며, 인산은 P로 표시하였다(파랑 네모: GlcNAc, 녹색 원: 만노스, 인산: P)
도 2는 만노스-6-인산이 형성되는 과정에 대한 모식도로, (A)는 동물세포에서 GlcNAc-PT와 uncovering 효소에 의해서 만노스-6-인산이 형성되는 과정을, (B)는 유전자 조작을 통해서 엔지니어링이 된 효모를 이용해서 만노스-6-인산을 형성하는 과정을 나타낸다.
도 3은 재조합 YlMpo1의 아미노산 서열을 나타낸 그림이다.
막투과 도메인으로 예측되는 부위는 밑줄 및 굵은 글씨체로 나타내었으며, 막투과 도메인을 제외하고 발현하는 dTM1과 dTM2의 시작 부위는 화살표로 표시하였다. 효모의 MNN4 homologue들에서 발견되는 LicD 도메인은 박스와 이탤릭체로 표시하였다.
도 4는 His-tagged YlMpo1을 발현하기 위해서 구축한 벡터 pET21-YlMpo1_dTM1(A) 및 pET21-YlMpo1-dTM2(B)의 모식도이다.
도 5는 His-tagged YlMpo1의 발현정도를 나타낸 데이터이다 (1: Induction 전 수용성 부분, 2: Induction 전 불용성 부분, 3: Induction 후 수용성 부분, 4: Induction 후 불용성 부분, 화살표: YlMpo1 band).
도 6은 His-tagged YlMpo1의 정제 과정 및 정제 후의 순도를 나타낸 데이터이다.
(A) YlMpo1 정제 단계에 따른 순도(1: 세포 Lysis 후 불용성 부분을 8 M urea 버퍼(100 mM NaH₂PO₄, pH 8.0, 10 mM Tris-Cl, 8 M urea)에 가용화한 것, 2: 상기 용액을 Ni-NTA 컬럼에 loading한 후의 flow through, 3: 세척용액(100 mM NaH₂PO₄, pH 6.3, 10 mM Tris-Cl, 8 M urea), Elution D: 버퍼 D (100 mM NaH₂PO₄, pH 5.9, 10 mM Tris-Cl, 8 M urea)를 사용하여 용출한 용액, Elution E: 버퍼 E (100 mM NaH₂PO₄, pH 4.5, 10 mM Tris-Cl, 8 M urea)를 사용하여 용출한 용액).
(B) 정제 후 SDS-PAGE를 이용한 YlMpo1의 순도 및 대략적인 농도 확인(4: BSA 2 ㎍, 5: BSA 4 ㎍, 6: BSA 8 ㎍, 7: 농축한 YlMpo1 2 ㎕, 8: 농축한 YlMpo1 4 ㎕, 9: 농축한 YlMpo1 8 ㎕).
도 7은 Halo-tagged YlMpo1 발현 벡터의 모식도(A)와 정제 과정 중에 수득된 분획을 SDS-PAGE로 분석한 결과(B)를 나타낸 데이터이다 (1: YlMpo1 발현을 유도 하기 전 세포 용해물, 2: 발현이 유도된 후 세포 용해물, 3: 컬럼에 배양 상층액을 흘려 용출된 용액 (flow through), 4: 컬럼에 세척 완충액을 흘려 얻은 용출액, 5: 컬럼에 세척 완충액을 흘려 얻은 용출액, 6: TEV protease에 의한 cleavage 후, 컬럼에 용출 완충액을 흘려 얻은 용출액, 화살표: YlMpo1 밴드(band)).
도 8은 M8-APTS를 기질로 이용하여 YlMpo1의 만노스 인산화 반응을 DNA sequencer로 분석한 데이터이다 (도면에서 당사슬을 나타내는 기호는 도 1과 동일).
도 9는 YlMpo1의 만노스 인산화 반응에 있어서 반응 시간과 YlMpo1 효소 농도 조건에 따른 활성 변화와 최적의 pH 조건을 나타낸 그래프이다 (A: 반응시간에 따른 YlMpo1 활성 분석, B: YlMpo1 효소의 농도에 따른 활성 분석, C: pH에 따른 YlMpo1 활성 분석).
도 10은 YlMpo1의 만노스 인산화 활성에 금속이온이 미치는 효과를 분석한 데이터이다 (A: 10 mM CaCl₂, FeCl₃, CuSo₄, MgCl₂, MnCl₂, ZnSO₄ 이온 및 EDTA에 의한 효과, B: 칼슘이온의 농도(0.4, 2, 10 및 20 mM)에 따른 YlMpo1의 만노스 인산화 활성).
도 11은 YlMpo1의 만노스 인산화 활성에 계면활성제(surfactant)가 미치는 효과를 나타낸 데이터이다 (A; 0.5% NP-40, Triton-X100, Tween-20, Brij-35, CHAPS 처리에 따른 만노스 인산화 활성, B; Tween-20의 농도에 따른 만노스 인산화 활성, C: CHAPS의 농도에 따른 만노스 인산화 활성).
도 12는 가용화 시킨 His-tagged YlMpo1에 의한 만노스 인산화 활성을 DNA sequencer로 분석한 데이터이다.
도 13은 Halo-tagged uncapping 효소를 발현하는 벡터의 모식도(A)와 정제 과정 중에 수득된 분획을 SDS-PAGE로 분석한 결과(B)이다 (1: Uncapping 효소의 발현을 유도하기 전 세포 용해물, 2: 발현 유도 후 세포 용해물, 3: 발현 유도된 세포 용해물의 불용성 부분, 4: 발현 유도된 세포 용해물의 수용성 용액, 5-6: 컬럼에 세포 용해물 수용성 용액을 흘려 용출된 용액 (flow through), 7-8: 컬럼에 세척 완충액을 흘려 얻은 용출액, 9: TEV protease에 의한 cleavage 후, 컬럼에 용출 완충액을 흘려 얻은 용출액). 화살표는 uncapping 효소의 밴드(band)를 가리킨다.
도 14는 Uncapping 효소에 의해서 바깥쪽 캡핑된 만노스가 제거되는지를 확인한 데이타이다.
(A)는 덱스트란 래더(Dextran ladder)를 이용하여 확인한 글루코오스 유닛(glucose unit)을 나타내며, (B)는 M8 당사슬에 YlMpo1를 이용한 만노스인산화 반응을 통해서 생성된 만노스-6-인산-1-만노스가 부가된 당사슬들을 보여준다. 그리고 (C)는 uncapping 효소를 처리하여 바깥쪽 만노스를 제거하여 만노스-6-인산이 부가된 당사슬이 생성되는지를 확인한 결과이다.
도 15는 약산 가수분해에 의한 만노스 캠핑 제거 실험을 나타낸다. (A)는 Dextran ladder를 이용하여 확인한 glucose unit을 나타내며, (B)는 만노스-6-인산-1-만노스가 부가된 당사슬을 보여준다. (C)는 약산 가수분해를 통해서 캡핑된 만노스를 제거하여 만노스-6-인산이 부가된 당사슬을 형성한 것이며, (D)는 상기 당사슬에 calf intestinal alkaline phosphatase를 처리하여 인산이 제거되어 M8 당사슬로 변환되는 것을 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

재조합 YlMpo1 발현 벡터 제작

본 발명에서는 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 유래 YlMpo1을 사용하였다. YlMpo1은 N-말단 부분에 막투과 영역으로 예측되는 아미노산 서열을 가지고 있어서 이 부분을 제외한 부위를 Y. lipolytica SMS397A 효모의 유전체 DNA로부터 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭하였다(도 3). N-말단의 막투과 부위를 제거한 YlMpo1_dTM1(서열번호 5 염기서열, 서열번호 6 아미노산 서열)과 그 뒤에 이어서 나오는 소수성 부위까지 함께 제거한 YlMpo1_dTM2(서열번호 7 염기서열, 서열번호 8 아미노산 서열)의 두 종류의 단백질을 발현하였으며, 다음의 특정 프라이머들을 사용하였다.

1-1: His - tagged YlMpo1 발현 벡터 제작

His-tagged YlMpo1-dTM1은 다음의 서열번호 9와 11을 사용하고, His-tagged YlMpo1-dTM2는 서열번호 10과 11을 사용하여 통상의 PCR 방법으로 증폭하였다. 증폭한 DNA들은 각각 HindⅢ와 XhoⅠ제한효소로 절단하고, 통상의 유전자 재조합 방법을 이용하여 pET21a (Life Technologies, USA) 벡터에 클로닝하여, pET21-YlMpo1-dTM1와 pET21-YlMpo1-dTM2 벡터를 제작하였다(도 2)

YlMPO1_HindⅢ_1F:

[서열번호 9] 5'- CCCAAGCTTCGATGACCGACGTGGGCTTAGT-3'

YlMPO1_HindⅢ_2F:

[서열번호 10] 5'- CCCAAGCTTCGAAAGCCATGGCCGGCAACTC-3'

YlMPO1_XhoⅠ_R:

[서열번호 11] 5'-CCGCTCGAGCTCAAACTCCTCGCGAATCCA-3'

1-2: Halo - tagged YlMpo1 발현 벡터를 제작

Halo-tagged YlMpo1은 N-말단의 막투과 부위를 제거한 YlMpo1_dTM1에 해당하는 부위를 다음의 서열번호 12와 13을 이용하여 통상의 PCR 방법으로 증폭하였다. 증폭한 DNA는 SgfI과 BamHI 제한효소로 절단하고, 통상의 유전자 재조합 방법을 이용하여 pFN18A (Promega, USA)에 클로닝하여 pFN18A-YlMpo1 벡터를 제작하였다.

YlMPO1_SgfI_F:

[서열번호 12] 5'- ACGGCGATCGCCATGACCGACGT-3'

YlMPO1_BamHI_R:

[서열번호 13] 5'- AGCGGATCCCTACTCAAACTCCTCG-3'

His - tagged YlMpo1 의 발현, 정제 및 항체 제작

2-1 : His - tagged YlMpo1 의 발현

상기 실시예 1-1에서 제작된 pET21-YlMpo1-dTM1와 pET21-YlMpo1-dTM2 벡터를 이용하여 His-tagged YlMpo1 단백질들을 발현시키고 정제하였다.

pET21-YlMPO1-dTM1와 pET21-YlMPO1-dTM2 벡터를 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환 하여 His-tagged YlMpo1 단백질을 발현시켰다. 형질전환체는 암피실린이 포함된 Luria-Bertani (LB) 배지로 37℃에서 배양 후, 흡광도가 600 nm (OD600)에서 0.4에 도달하면 1mM IPTG를 첨가하고 37℃에서 4시간 배양하여 단백질 발현을 유도하였다.

상기 배양된 세포에서 초음파 분해 방법으로 세포를 용해(lysis)시킨 후, 원심분리를 통해서 수용성 부분과 불용성 부분의 단백질을 추출하였으며, 추출한 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE 후에 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue)로 염색하여 분석하였다.

그 결과, 막투과 영역 단백질(transmembrane regions)을 제거하였음에도 His-tagged YlMpo1_dTM1과 His-tagged YlMpo1_dTM2 모두 불용성 부분에서 대부분이 관찰되는 것을 확인하였으며(도 5), 이 후 His-tagged YlMpo1_dTM2를 발현시켜 정제하였다.

2-2 : His - tagged YlMpo1 의 정제 및 항체 제작

상기 실시예 2-1 방법으로 YlMpo1_dTM2를 발현시키고 초음파 분해 방법으로 세포를 용해하여 단백질을 추출한 다음, Ni-NTA 컬럼 제조사(Qiagen, USA)에서 제공하는 8 M 요소(urea)를 이용한 변성(denaturing) 방법을 사용하여 정제하였다.

pH가 다른 두 종류의 용출 버퍼 D (100 mM NaH₂PO₄, pH 5.9, 10 mM Tris-Cl, 8 M urea)와 E (100 mM NaH₂PO₄, pH 4.5, 10 mM Tris-Cl, 8 M urea)를 사용하여 2 단계로 용출하였으며, SDS-PAGE 후에 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue)로 염색하여 분석하였다 (도 6A).

또한, Ni-NTA 컬럼을 이용한 크로마토그래피를 통해서 정제된 YlMpo1_dTM2를 농축하고, 순도를 확인하기 위해서 SDS-PAGE를 수행하였으며, 정제한 YlMpo1_dTM2의 양을 측정하기 위해, 2, 4, 8 ㎍의 BSA를 같이 로딩(loading)하여 수행하였다 (도 6B).

그 결과, 용출 버퍼 E를 사용하여 정제를 수행하는 경우 YlMpo1_dTM2의 회수율이 높은 것을 확인하였다.

상기의 방법으로 정제한 YlMpo1_dTM2를 항원으로 이용하여 통상의 방법으로 토끼로부터 polyclonal 항-YlMpo1 항체를 얻었으며, 이 과정은 AbFrontier (Seoul, Korea)사에 의뢰하여 진행하였다.

Halo - tagged YlMpo1 의 발현 및 정제

3-1 : Halo-tagged YlMpo1의 발현

상기 실시예 1-2에서 제작된 pFN18A-YlMpo1 벡터를 이용하여 Halo-tagged YlMpo1 단백질들을 발현시키고 정제하였다.

pFN18A-YlMpo1 벡터를 대장균 KRX 균주(Promega, USA)에 형질전환하여 Halo-tagged YlMpo1 단백질을 발현시켰다. 형질전환체는 암피실린(100 ㎎/㎖)이 포함된 LB 배지로 37℃에서 하룻밤 배양하고, 다음날 이를 seed로 하여 Terrific Broth (TB)배지에 접종하여 37℃에서 본 배양을 수행하였다. 600 nm에서 흡광도가 0.8에 도달했을 때, 람노오스(rhamnose)를 최종 농도가 0.1%가 되도록 첨가하여 YlMPO1 유전자 발현을 유도하였다. 발현 유도 후 15℃에서 24시간을 더 배양하고, 6,000 X g, 4℃ 조건으로 20분 동안 원심분리하여 세포를 수확하였다.

His-tagged YlMpo1 단백질을 과발현 했을 때 대부분 불용성 부분에서 관찰된 것과는 달리 Halo-tagged YlMpo1의 과발현 시에는 수용성 부분에서 많이 관찰되었다.

상기 pFN18A-YlMpo1 벡터가 삽입된 형질전환체는 KRX/pFN18A-YlMpo1으로 명명하고, 이를 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 규정에 따라, 2013년 9월 25일자로 한국생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KRIBB) 내 유전자은행(Korea Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁번호 제KCTC12493BP로 기탁하였다.

3-2 : Halo - tagged YlMpo1 의 정제

Halo-tagged YlMpo1 단백질의 정제는 HaloTag Protein Purification System 제조사(Promega)에서 제공하는 정제 방법을 따라서 정제하였다.

상기 과정을 간략히 기술하면, 세포 침전물을 정제 완충액 (50 mM HEPES, pH7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.5 M EDTA, 0.005% IGEPAL)에 재현탁 시키고 초음파 분해로 세포를 용해시킨 다음, 세포 용해물을 6,000 X g, 4℃ 조건으로 20분 동안 원심분리한 후, 세포 용해물을 정제 완충액으로 미리 평형화 해 둔 HaloLink resin과 섞어서 4 ℃에서 24시간 동안 반응시켰다.

Halo-tag의 경우에는 HaloLink resion에 공유결합으로 연결되며, Halo-tagged YlMpo1 단백질이 결합한 resin을 컬럼에 채운 다음, resin 부피의 20배에 해당하는 양의 정제 완충액으로 세척하였다. 절단 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.5 mM EDTA)을 컬럼 볼륨과 동일하게 넣어주고 TEV protease (Promega)를 처리하여 1시간 동안 반응시킨 다음, 컬럼 부피의 2배의 정제 완충액을 흘려주어, TEV protease에 의해서 Halo-tag으로부터 잘려져 나온 YlMpo1 단백질을 용출하였다.

그 후, 용출된 용액에 섞여있는 His-tag이 부가되어 있는 TEV protease를 제거하기 위해서 His-link resin을 넣고 상온에서 20분 반응하였다. 1000 x g에서 1분간 원심분리 하여 resin을 침전시키고 상층액만 회수한 다음, 상기 각 단계에서 용출된 분획을 SDS-PAGE로 분석하였다.

그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, 예상했던 약 74 kDa의 YlMpo1 단백질이 분리, 정제되었음을 확인하였다. 용출된 분획을 최종적으로 20 mM 인산나트륨 완충액(sodium phosphate buffer, pH 7.4)에서 투석한 후 30 kDa 원심분리 필터장치 (Amicon Ultra centrifugal filter device, Millipore)를 이용해 6000 g에서 원심분리하여 농축한 후 -80℃에서 보관하였다.

YlMpo1 에 의한 만노스 인산화 반응 확인

상기 실시예 3을 통하여 분리 정제된 YlMpo1이 in vitro에서 Man₈GlcNAc₂ (M8) 당사슬을 기질로하여 만노스 인산화 반응을 수행하는지 확인하였다.

먼저, M8 당사슬을 기존에 보고된 방법을 따라서 8-Aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid (APTS)로 형광 표지하여 M8-APTS를 얻었다 (Laroy et al, Nature Protocols 1: 397-405, 2006). 이를 간략히 기술하면, 20 mM APTS가 녹여진 1.2 M의 구연산 (citric acid) 용액과 1 M 시아노브롬하이드리드 (cyanoborohydride)가 녹여진 다이메틸 설폭사이드를 1:1 비율로 섞어 준비한 다음, 58 mM M8를 5 ㎕ 취해 건조시킨 후, 상기에서 준비한 APTS 용액 5 ㎕를 건조된 M8에 넣고 37 ℃에서 16시간 이상 반응하였다. 그리고 반응 용액으로부터 반응 안 한 APTS와 염 등을 제거하고, M8-APTS만을 얻기 위해서 Sephadex G10 컬럼을 사용하여 탈염하였다. 이렇게 정제된 M8-APTS 용액을 모두 취해 건조한 후 50 ㎕ 정제수로 녹여 시료를 준비하였다.

상기의 방법을 통해서 준비된 M8-APTS를 기질로 하여, YlMpo1에 의한 in vitro 만노스 인산화 반응을 수행하였다.

전체 반응액 100 ㎕에 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MnCl₂, 2 mM GDP-mannose, M8-APTS, YlMpo1 (1 ㎎/㎖)를 넣어 30 ℃에서 2시간 반응시킨 다음, 100 ℃에서 5분간 끓여주어 반응을 멈추고 기존에 보고된 방법을 따라서 DNA sequencer를 이용하여 분석하였다(Laroy et al, Nature Protocols 1: 397-405, 2006). 반응액 10 ㎕를 DNA sequencer plate에 옮겨 담고, POP7-polyacrylamide linear polymer로 채워진 36 cm capillary array가 장착된 ABI 3130 DNA sequencer를 이용하여 분석하였다. DNA sequencer 분석 조건은 표 1에 기재된 바와 같으며, 데이터 분석은 GeneMapper 소프트웨어를 사용하였다.

DNA sequencer 분석 조건

Parameter
Oven temperature	60℃
Prerun voltage	15kV
Prerun time	180s
Infection voltage	1.2V
Injection time	16s
Run voltage	5kV
Run time	1,000s

덱스트란 래더(Dextran ladder)를 이용한 글루코오스 유닛(glucose unit; GU)을 통해서 APTS로 표지된 당사슬들을 비교 분석한 결과, M8 당사슬 피크는 GU 9 위치에서 검출되었고, YlMpo1에 의한 만노스 인산화 반응 후에는 만노스 인산이 하나 부가된 당사슬 피크는 GU 6 위치에서 검출되었으며, 두 개의 만노스 인산이 부가된 당사슬 피크는 GU 4 위치에서 검출되었다 (도 8). 즉, YlMpo1은 in vitro에서M8 당사슬에 만노스 인산을 부가하여 만노스-6-인산-1-만노스 구조를 생성하는 것을 확인하였다.

YlMpo1 의 최적 반응조건 탐색

상기 실시예 3을 통하여 분리 정제된 YlMpo1의 최적 반응조건을 분석하기 위한 실험을 수행하였다.

5-1 : 반응시간에 따른 YlMpo1의 만노스 인산화 활성

반응 시간에 따른 YlMpo1에 의한 만노스 인산화 반응의 차이를 알아보기 위하여 반응 시간을 제외한 조건은 상기 실시예 4에서 기재한 바와 동일하게 수행하였다. 반응 시간은 각각 30분, 60분, 120분, 240분으로 진행하였으며, YlMpo1에 의한 만노스 인산화 반응 결과물을 DNA sequencer를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 반응 시간이 240분 일 때 나머지 반응 시간과 비교하여 만노스 인산화가 증가 하였으나, 120분의 반응 시간을 주었을 때 가장 효율적인 것을 확인하고, 하기의 실험들에서 반응시간은 2시간으로 진행하였다 (도 9A).

5-2 : YlMpo1 농도에 따른 만노스 인산화 활성

YlMpo1 농도에 따른 반응조건을 분석하였다. 최종농도 0.25, 0.5, 0.75, 1 ㎎/㎖ 이 되도록 YlMpo1 농도를 달리하여 반응을 수행하였으며, 반응조건은 상기 실시예 4 및 5-1과 동일하게 수행하였다.

그 결과, YlMpo1 농도가 증가할수록 만노스 인산이 부가된 당사슬의 비율이 증가하는 것을 확인하였으나, 농도에 따라 크게 증가하지 않는 것을 확인하였다 (도 9B).

5-3 : pH 에 따른 YlMpo1 의 만노스 인산화 활성

최적의 pH을 확인하기 위해서 pH가 상이한 다양한 완충액을 사용하여 실험을 수행하였다.

pH 5.0와 5.5의 완충액으로는 아세트산 나트륨 (sodium acetate)를 사용하였고, pH 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5와 8.0에 대한 완충액은 인산나트륨 (sodium phosphate)을 사용했으며, pH 7.0, 7.5, 8.0에 대한 완충액은 트리스 (Tris-HCl)를 사용하였다. 반응 조건은 전체 반응액 100 ㎕에 상기의 50 mM 완충액 (sodium acetate, sodium phosphate 또는 Tris-HCl), 2 mM GDP-mannose, M8-APTS, YlMpo1 (1 ㎎/㎖)을 넣어 30 ℃에서 2시간 반응시켰다.

그 결과, 인산 나트륨 (sodium phosphate) 완충액을 사용하였을 때 대체적으로 활성이 높게 나타났고, 특히 pH 6.0, 6.5, 7.0일 때 가장 높게 나타났다. 반면에 아세트산 나트륨 (sodium acetate)이나 트리스 (Tris-HCl) 완충액을 사용하였을 때는 인산 나트륨 (sodium phosphate) 완충액을 사용했을 때보다 활성이 낮은 것을 확인하였다 (도 9C).

5-4 : 금속이온에 따른 YlMpo1 의 만노스 인산화 활성

금속 이온이 YlMpo1의 만노스 인산화 반응에 미치는 영향을 분석하기 위해, 실시예 3을 통하여 정제된 YlMpo1에 10 mM EDTA를 4 ℃에서 16시간 이상 처리한 후, 다시 정제수로 투석하여 얻은 YlMpo1 용액을 이용하여 하기의 실험을 수행하였다.

실시예 5-3과 동일하게 전체 반응액 100 ㎕에 50 mM 인산나트륨 (sodium phosphate, pH 6.5) 완충액, 2 mM GDP-mannose, M8-APTS, YlMpo1 (1 ㎎/㎖)에 각기 다른 10 mM 이온 (CaCl₂, FeCl₃, CuSo₄, MgCl₂, MnCl₂ 또는 ZnSO₄) 또는 EDTA를 넣어 30 ℃에서 2시간 반응시킨 다음, 100 ℃에서 5분간 끓여주어 반응을 멈추고 DNA sequencer를 통해 분석하였다.

그 결과, 이온을 포함하지 않았을 때보다 10 mM 칼슘이온(CaCl₂)을 넣고 반응할 때 가장 높은 활성을 보였으며, 망간이온 (MnCl₂)를 넣었을 때 다음으로 높은 활성을 보였다 (도 10A). 반면에 다른 이온들 또는 EDTA를 넣고 반응 할 때는 활성이 크게 감소하였다.

가장 크게 활성을 증가시키는 칼슘이온 (CaCl₂)을 농도 별로 처리하여 반응 시 활성에 차이를 보이는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 0.4 mM, 2 mM, 10 mM과 20 mM 칼슘이온을 첨가하여 상기의 실험과 동일하게 수행하였다.

그 결과 도 4B에 나타난 바와 같이 2 mM의 칼슘이온에서 가장 높은 활성을 보이는 것을 확인하였다.

5-5 : 계면활성제( surfactant )에 따른 YlMpo1 의 만노스 인산화 활성

계면활성제(surfactant)가 YlMpo1의 만노스 인산화 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해, NP-40, Triton-X100, Tween-20, Brij-35, CHAPS를 사용하여 실험을 수행하였다.

전체 반응액 100 ㎕에 50 mM 완충액 인산나트륨 (sodium phosphate, pH 6.5), 0.5 % 계면활성제 (NP-40, Triton-X100, Tween-20, Brij-35 또는 CHAPS), 2 mM CaCl₂, 2 mM GDP-mannose, M8-APTS, YlMpo1 (1 ㎎/㎖) 를 넣어 30 ℃에서 2시간 반응시킨 다음, DNA sequencer를 통해 분석하였다.

그 결과, 계면활성제(surfactant)를 넣어 주었을 때, 전반적으로 활성이 조금 증가하는 것을 관찰하였으며, 특히 Tween-20과 CHAPS가 있을 때 활성이 가장 높은 것을 확인하였다 (도 11A).

또한, Tween-20과 CHAPS의 농도에 따른 활성변화를 알아보기 위해서 두 종류의 계면활성제를 0.05%, 0.1%, 0.5%, 2% 농도별 처리하여 YlMpo1의 만노스 인산화 활성이 어떻게 변화하는 지를 확인하였다.

그 결과, Tween-20의 경우 도 11B에서 보여주는 바와 같이 0.5% 일 때 가장 높은 활성을 보였으며, 2%일 때 활성이 크게 감소하였으며, CHAPS의 경우에는 2% CHAPS을 처리하였을 때 활성이 높게 나타났다 (도 5C).

His - tagged YlMpo1 가용화 정제 및 활성 확인

6-1 : His - tagged YlMpo1 가용화 정제

실시예 2에서 불용성으로 발현된 His-tagged YlMpo1_dTM2를 가용화시켜서 정제하고, 이를 이용하여 만노스 인산화 반응을 수행할 수 있는지를 확인하였다.

우선 실시예 2에서 기술한 방법과 동일하게 YlMpo1을 발현시킨 다음, 수확된 세포 침전물을 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF)에 재현탁 시킨 후, 초음파분해로 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 6,000 X g, 4℃ 조건으로 20분 동안 원심분리 하였으며, 원심분리 후 수득된 침전물에 완충액(100 mM NaH₂PO₄, pH 8.0, 20 % glycerol, 0.4 M NaCl, 1 % CHAPS)을 첨가하여 4℃에서 3시간 동안 가용화 시킨 후에 100,000 X g, 4℃ 조건으로 1시간 동안 원심분리 하였다.

그 후 계면활성제(surfactant)인 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)를 첨가하여 가용화된 용액으로부터 Ni-NTA 컬럼(Qiagen, USA)을 사용하여 YlMpo1을 정제하였다. His-tagged YlMpo1을 Ni-NTA 컬럼에 부착시킨 후 완충액 (50 mM NaH₂PO₄, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole) 으로 세척한 다음, 250 mM imidazole이 포함된 완충액을 처리하여 흡착되어 있던 His-tagged YlMpo1을 용출하였다.

6-2 : His - tagged YlMpo1 에 의한 만노스 인산화 반응 확인

실시예 4의 방법을 통해서 준비된 M8-APTS를 기질로 하여, 가용화 시켜서 정제한 His-tagged YlMpo1이 in vitro에서 Man₈GlcNAc₂ (M8) 당사슬을 기질로하여 만노스 인산화 반응을 수행하는지 확인하였다.

실시예 5에서 기술된 바와 같이 전체 반응액 100 ㎕에 50 mM 완충액 인산나트륨 (sodium phosphate, pH 6.5), 0.5 % Tween-20, 2 mM CaCl2, 2 mM GDP-mannose, M8-APTS, His-tagged YlMpo1 (1 ㎎/㎖)을 넣어 30 ℃에서 2시간 반응시킨 다음, 100 ℃에서 5분간 끓여주어 반응을 멈추고 실시예 4의 방법으로 DNA sequencer를 이용하여 분석하였다.

덱스트란 래더(Dextran ladder)를 이용한 글루코오스 유닛(glucose unit; GU)을 통해서 APTS로 표지된 당사슬들을 비교 분석한 결과, 가용화 시킨 His-tagged YlMpo1에 의해서 M8 당사슬에 만노스 인산을 부가하여 만노스-6-인산-1-만노스 구조가 생성되는 것을 확인하였다 (도 12).

캠핑된 만노스 제거를 통한 만노스 -6-인산이 부가된 당사슬 제조

7-1: Uncapping 효소의 발현 및 정제

최근 공지된 셀룰로시마이크로비움 셀루란스(Cellulosimicrobium cellulans)유래 uncapping 효소인 CcGH92_5의 효소 활성 도메인(1-774)을 발현하는 벡터를 제작하였다 (Tiels et al , Nature Biotech , 30:1225, 2012). 해당 아미노산 서열을 코딩하는 DNA는 DNA 2.0 (Menro Park, CA, USA)에 의뢰하여 합성하였고, 이를 EZ-cloning 키트(Enzynomics, 대전, 한국)를 이용하여 pFN18A 벡터(Promega)에 클로닝하여 pFN18A-uncapping 벡터를 제작하였다 (도 13A). 이렇게 제작된 pFN18A-uncapping 벡터는 N-말단에 Halo-tag이 융합된 CcGH92_5의 uncapping 효소 활성 도메인(1-774)을 발현한다.

상기의 pFN18A-uncapping 벡터를 대장균 KRX 균주(Promega)에 형질전환하여 Halo-tagged uncapping 단백질을 발현하였다. 형질전환체는 암피실린(100 ㎎/㎖)이 포함된 LB 배지로 37℃에서 하룻밤 배양하고, 다음날 이를 종균(seed)으로 하여 Terrific Broth (TB)배지에 접종하여 37℃에서 본 배양을 수행하였다. 600 nm에서 흡광도가 0.8에 도달했을 때, 람노오스(rhamnose)를 최종 농도가 0.1%가 되도록 첨가하여 uncapping 효소 유전자의 발현을 유도하였다. 발현 유도 후 15℃에서 24시간을 더 배양하고, 6,000 X g, 4℃ 조건으로 20분 동안 원심분리하여 세포를 수확하였다.

Halo-tagged uncapping 단백질의 정제는 HaloTag Protein Purification System 제조사(Promega)에서 제공하는 정제 방법을 따라서 정제하였다. 상기 과정을 간략히 기술하면, 세포 침전물을 정제 완충액 (50 mM HEPES, pH7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.5 M EDTA, 0.005% IGEPAL)에 재현탁 시키고 초음파 분해로 세포를 용해시킨 다음, 세포 용해물을 6,000 X g, 4℃ 조건으로 20분 동안 원심분리한 후, 세포 용해물을 정제 완충액으로 미리 평형화 해 둔 HaloLink resin과 섞어서 4 ℃에서 24시간 동안 반응시켰다. Halo-tag의 경우에는 HaloLink resion에 공유결합으로 연결되며, Halo-tagged uncapping 단백질이 결합한 resin을 컬럼에 채운 다음, resin 부피의 20배에 해당하는 양의 정제 완충액으로 세척하였다. 절단 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.5 mM EDTA)을 컬럼 볼륨과 동일하게 넣어주고 TEV protease (Promega)를 처리하여 1시간 동안 반응시킨 다음, 컬럼 부피의 2배의 정제 완충액을 흘려주어, TEV protease에 의해서 Halo-tag으로부터 잘려져 나온 uncapping 단백질을 용출하였다. 그 후, 용출된 용액에 섞여있는 His-tag이 부가되어 있는 TEV protease를 제거하기 위해서 His-link resin 을 넣고 상온에서 20분 반응하였다. 1000 x g에서 1분간 원심분리 하여 resin을 침전시키고 상층액만 회수한 다음, 상기 각 단계에서 용출된 분획을 SDS-PAGE로 분석하였다. 그 결과 도 13B에 나타난 바와 같이, uncapping 단백질이 분리, 정제되었음을 확인하였다. 용출된 분획을 최종적으로 20 mM 인산나트륨 완충액(sodium phosphate buffer, pH 7.4)에서 투석한 후 30 kDa 원심분리 필터장치 (Amicon Ultra centrifugal filter device, Millipore)를 이용해 6000 g에서 원심분리하여 농축한 후 -80℃에서 보관하였다.

7-2: Uncapping 효소에 의한 만노스 -6-인산이 부가된 당사슬의 제조

상기 실시예 7-1 방법을 통하여 분리 정제된 uncapping 효소를 이용하여 만노스-6-인산-1-만노스가 부가된 당사슬에서 바깥쪽 만노스의 캡핑이 제거되어 만노스-6-인산이 부가된 당사슬이 형성되는 지를 확인하였다. 이를 위해서 먼저 M8 당사슬에 실시예 5에서 확립한 최적의 조건에서 YlMpo1을 처리하여 만노스-6-인산-1만노스 당사슬 구조를 형성하였다 (도 14B). 그리고 전체 반응액 50 ㎕에 실시예 7-1에서 분리 정제된 uncapping 효소 20 ㎍를 100 mM HEPES (pH 7.0), 2 mM CaCl₂에 첨가하여 30 ℃에서 16시간 동안 반응시킨 다음, DNA sequencer를 이용하여 분석하였다 (도 14C).

그 결과 바깥쪽 만노스가 제거되어 형성된 만노스-6-인산이 부가된 당사슬 피크(peak)가 검출되는 것을 확인하였다.

7-3: 약산 가수분해를 이용한 만노스 캠핑 제거

만노스-6-인산-1-만노스가 부가된 당사슬에서 바깥쪽 만노스 캡핑을 제거하기 위해서 다양한 조건에서 약산 가수 분해를 진행하였다.

이를 위해서 먼저 M8 당사슬에 실시예 5에서 확립한 최적의 조건에서 YlMpo1을 처리하여 만노스-6-인산-1만노스 당사슬 구조를 형성하였다 (도 15B). 그리고 전체반응액에 0.5 M 포름산(formic acid)을 처리하여 80 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, DNA sequencer를 이용하여 분석하였다 (도 15C).

그 결과, 약산 가수분해에 의해 바깥쪽 만노스가 제거되어 형성된 만노스-6-인산이 부가된 당사슬 피크(peak)가 검출되는 것을 확인하였다.

또한, 상기 당사슬에 칼프 인텐스티날 알칼라인 포스파테이즈(calf intestinal alkaline phosphatase; CIP)처리하면, 인산이 완전히 제거되어 M8 당사슬로 변환되는 것을 확인하였다 (도 15D).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원 KCTC12493BP 20130925

<110> korea research institute of bioscience and biotechnology <120> Mannosylphosphorylation Reaction Using YlMpo1 Protein <130> P13-B197 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1935 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica YlMPO1 gene <400> 1 atggtgctgc acccgtttcg cctgctgcgc acatctcttg tgagcaagct cgtcgtcatt 60 ctcataacct gtctgatttt cggcagctta ctcaacttga ccgacaagct gcccgacgga 120 gtcaagtcac gggtcgccta catgaccgac gtgggcttag tcagcggcgg tgcccgctcg 180 aaagccatgg ccggcaactc gtctgtgcgc atcagtcacg tgccactgac gaaaatcaag 240 tttgccgaaa acgaaaagga attcaacccc aagtgggccc agaagaaggc tctggactcg 300 tcgtcggatt actcattcga gtggaaagac tgggtcgact tgaccgaggt cacgggtcta 360 ttcagagcca tcgaggtcgg ctcgtgtggc aaaaacaaac aatgccttag taagctccag 420 gtcaccggac ccccgactca ggtggagccc caggcgtttt tcaaccgggt cggaaaggtg 480 tttttggacc agaccatgcc caagccgaaa cagttgattt atctgaccga gaaagagtca 540 cgtggcaagc gggaggagcc cgtcgagata gagtcacatg ttccggtggt tcgggagcct 600 gagttgggcg actttagccg atcgcgtgac gccaagtcaa tccaaaatgc taagcgggag 660 gcgactgagg aggcgactgg tgagtcagcc aacgagggcc agtcacgtga ctccgcacga 720 gcctccgcgc gtgacattgc cttttccgag gctgaccccg tgcacgaaga ctcgtatgac 780 gacgacgaaa acggaaccat tctcgtgccg acggctgagt cagaggagga gctccaggaa 840 tacgcagaca aggacgcggc cgccaagtcg tacctgcgaa gcggctggtc acgtggccag 900 aaatatgtcg agctgccgcg cgagctgttc acttgggaca ttcacgaaga gattgacaag 960 ggactgacta agaagagcgt tgactcagac gacccgtcac gtgagcaggt tgcgcactcg 1020 cagtttctta gtcagcattg gaaacacatc aaaaagtccg gcaagcattt ctccgaagcg 1080 tgggttgtgg gcgacaccaa agcagccgga gtccattacg actggcgatt tttcagcgag 1140 ttaaacacca ttgacgagaa acgagtcatc ttgcgtaaat tggtgcgtgc gtggctcgac 1200 ttcacgtcac gtgagggcat tatcacgtgg ctggcgcatg gcacgttgct gggctggtac 1260 tggaacggcc agtctctgcc gtgggatttc gacggtgatg tccagatgcc gatccgcgaa 1320 ttcgaccggt ttgcccgcct ctataatcag tcgttggtaa ttgatgagtc agccggcggc 1380 cggtattatg tcgatgtggg tccctcctac gtcgagcgcc tccgaggcaa cggcaagaat 1440 gtcattgatg ctcggtttat cgacgttgat agtggcatgt acattgacat taccgccttg 1500 gcgtatgccg agcagcagga aaagttccac tgcaaaaact ggcatcggta tgagttggag 1560 agcgtttctc cgctgcgtcg gacgctgttt gagggcaagg aggcttacat tccaaacaat 1620 ttcgagtcca ttttgaacca ggagtacaag aaggcgccgc tggtgaacac ccggttcgag 1680 ggccacttct ggaacaagtt tatcaaaatg tgggttcagc aggaccagtg tgaaatgtta 1740 cagattgagg agaatgtgga ccagcgggca gtgagggaaa acggtgaacc cacaactttt 1800 ggcgcttgtt atcgaccgga gtatctcaag aggtatcacg agacccacaa gatgagtaag 1860 gctcatgagg gggagatgga ggcaatcagg caaaaggccg atgtttggga atggattcgc 1920 gaggagtttg agtag 1935 <210> 2 <211> 644 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica YlMpo1 <400> 2 Met Val Leu His Pro Phe Arg Leu Leu Arg Thr Ser Leu Val Ser Lys 1 5 10 15 Leu Val Val Ile Leu Ile Thr Cys Leu Ile Phe Gly Ser Leu Leu Asn 20 25 30 Leu Thr Asp Lys Leu Pro Asp Gly Val Lys Ser Arg Val Ala Tyr Met 35 40 45 Thr Asp Val Gly Leu Val Ser Gly Gly Ala Arg Ser Lys Ala Met Ala 50 55 60 Gly Asn Ser Ser Val Arg Ile Ser His Val Pro Leu Thr Lys Ile Lys 65 70 75 80 Phe Ala Glu Asn Glu Lys Glu Phe Asn Pro Lys Trp Ala Gln Lys Lys 85 90 95 Ala Leu Asp Ser Ser Ser Asp Tyr Ser Phe Glu Trp Lys Asp Trp Val 100 105 110 Asp Leu Thr Glu Val Thr Gly Leu Phe Arg Ala Ile Glu Val Gly Ser 115 120 125 Cys Gly Lys Asn Lys Gln Cys Leu Ser Lys Leu Gln Val Thr Gly Pro 130 135 140 Pro Thr Gln Val Glu Pro Gln Ala Phe Phe Asn Arg Val Gly Lys Val 145 150 155 160 Phe Leu Asp Gln Thr Met Pro Lys Pro Lys Gln Leu Ile Tyr Leu Thr 165 170 175 Glu Lys Glu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Glu Pro Val Glu Ile Glu Ser 180 185 190 His Val Pro Val Val Arg Glu Pro Glu Leu Gly Asp Phe Ser Arg Ser 195 200 205 Arg Asp Ala Lys Ser Ile Gln Asn Ala Lys Arg Glu Ala Thr Glu Glu 210 215 220 Ala Thr Gly Glu Ser Ala Asn Glu Gly Gln Ser Arg Asp Ser Ala Arg 225 230 235 240 Ala Ser Ala Arg Asp Ile Ala Phe Ser Glu Ala Asp Pro Val His Glu 245 250 255 Asp Ser Tyr Asp Asp Asp Glu Asn Gly Thr Ile Leu Val Pro Thr Ala 260 265 270 Glu Ser Glu Glu Glu Leu Gln Glu Tyr Ala Asp Lys Asp Ala Ala Ala 275 280 285 Lys Ser Tyr Leu Arg Ser Gly Trp Ser Arg Gly 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acgacgaaaa cggaaccatt 660 ctcgtgccga cggctgagtc agaggaggag ctccaggaat acgcagacaa ggacgcggcc 720 gccaagtcgt acctgcgaag cggctggtca cgtggccaga aatatgtcga gctgccgcgc 780 gagctgttca cttgggacat tcacgaagag attgacaagg gactgactaa gaagagcgtt 840 gactcagacg acccgtcacg tgagcaggtt gcgcactcgc agtttcttag tcagcattgg 900 aaacacatca aaaagtccgg caagcatttc tccgaagcgt gggttgtggg cgacaccaaa 960 gcagccggag tccattacga ctggcgattt ttcagcgagt taaacaccat tgacgagaaa 1020 cgagtcatct tgcgtaaatt ggtgcgtgcg tggctcgact tcacgtcacg tgagggcatt 1080 atcacgtggc tggcgcatgg cacgttgctg ggctggtact ggaacggcca gtctctgccg 1140 tgggatttcg acggtgatgt ccagatgccg atccgcgaat tcgaccggtt tgcccgcctc 1200 tataatcagt cgttggtaat tgatgagtca gccggcggcc ggtattatgt cgatgtgggt 1260 ccctcctacg tcgagcgcct ccgaggcaac ggcaagaatg tcattgatgc tcggtttatc 1320 gacgttgata gtggcatgta cattgacatt accgccttgg cgtatgccga gcagcaggaa 1380 aagttccact gcaaaaactg gcatcggtat gagttggaga gcgtttctcc gctgcgtcgg 1440 acgctgtttg agggcaagga ggcttacatt ccaaacaatt tcgagtccat 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Leu Ile Tyr Leu 115 120 125 Thr Glu Lys Glu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Glu Pro Val Glu Ile Glu 130 135 140 Ser His Val Pro Val Val Arg Glu Pro Glu Leu Gly Asp Phe Ser Arg 145 150 155 160 Ser Arg Asp Ala Lys Ser Ile Gln His Ala Lys Arg Glu Ala Thr Glu 165 170 175 Glu Ala Thr Gly Glu Ser Ala Asn Glu Gly Gln Ser Arg Asp Ser Ala 180 185 190 Arg Ala Ser Ala Arg Asp Ile Ala Phe Ser Glu Ala Asp Pro Val His 195 200 205 Glu Asp Ser Tyr Asp Asp Asp Glu Asn Gly Thr Ile Leu Val Pro Thr 210 215 220 Ala Glu Ser Glu Glu Glu Leu Gln Glu Tyr Ala Asp Lys Asp Ala Ala 225 230 235 240 Ala Lys Ser Tyr Leu Arg Ser Gly Trp Ser Arg Gly Gln Lys Tyr Val 245 250 255 Glu Leu Pro Arg Glu Leu Phe Thr Trp Asp Ile His Glu Glu Ile Asp 260 265 270 Lys Gly Leu Thr Lys Lys Ser Val Asp Ser Asp Asp Pro Ser Arg Glu 275 280 285 Gln Val Ala His Ser Gln Phe Leu Ser Gln His Trp Lys His Ile Lys 290 295 300 Lys Ser Gly Lys His Phe Ser Glu Ala Trp Val Val Gly Asp Thr Lys 305 310 315 320 Ala Ala Gly Val His Tyr Asp Trp Arg Phe Phe Ser Glu Leu Asn Thr 325 330 335 Ile Asp Glu Lys Arg Val Ile Leu Arg Lys Leu Val Arg Ala Trp Leu 340 345 350 Asp Phe Thr Ser Arg Glu Gly Ile Ile Thr Trp Leu Ala His Gly Thr 355 360 365 Leu Leu Gly Trp Tyr Trp Asn Gly Gln Ser Leu Pro Trp Asp Phe Asp 370 375 380 Gly Asp Val Gln Met Pro Ile Arg Glu Phe Asp Arg Phe Ala Arg Leu 385 390 395 400 Tyr Asn Gln Ser Leu Val Ile Asp Glu Ser Ala Gly Gly Arg Tyr Tyr 405 410 415 Val Asp Val Gly Pro Ser Tyr Val Glu Arg Leu Arg Gly Asn Gly Lys 420 425 430 Asn Val Ile Asp Ala Arg Phe Ile Asp Val Asp Ser Gly Met Tyr Ile 435 440 445 Asp Ile Thr Ala Leu Ala Tyr Ala Glu Gln Gln Glu Lys Phe His Cys 450 455 460 Lys Asn Trp His Arg Tyr Glu Leu Glu Ser Val Ser Pro Leu Arg Arg 465 470 475 480 Thr Leu Phe Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Ile Pro Asn Asn Phe Glu Ser 485 490 495 Ile Leu Asn Gln Glu Tyr Lys Lys Ala Pro Leu Val Asn Thr Arg Phe 500 505 510 Glu Gly His Phe Trp Asn Lys Phe Ile Lys Met Trp Val Gln Gln Asp 515 520 525 Gln Cys Glu Met Leu Gln Ile Glu Glu Asn Val Asp Gln Arg Ala Val 530 535 540 Arg Glu Asn Gly Glu Pro Thr Thr Phe Gly Ala Cys Tyr Arg Pro Glu 545 550 555 560 Tyr Leu Lys Arg Tyr His Glu Thr His Lys Met Ser Lys Ala His Glu 565 570 575 Gly Glu Met Glu Ala Ile Arg Gln Lys Ala Asp Val Trp Glu Trp Ile 580 585 590 Arg Glu Glu Phe Glu 595 <210> 7 <211> 1755 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica YlMPO1 gene <400> 7 aaagccatgg ccggcaactc gtctgtgcgc atcagtcacg tgccactgac gaaaatcaag 60 tttgccgaaa acgaaaagga attcaacccc aagtgggccc agaagaaggc tctggactcg 120 tcgtcggatt actcattcga gtggaaagac tgggtcgact tgaccgaggt cacgggtcta 180 ttcagagcca tcgaggtcgg ctcgtgtggc aaaaacaaac aatgccttag taagctccag 240 gtcaccggac ccccgactca ggtggagccc caggcgtttt tcaaccgggt cggaaaggtg 300 tttttggacc agaccatgcc caagccgaaa cagttgattt atctgaccga gaaagagtca 360 cgtggcaagc gggaggagcc cgtcgagata gagtcacatg ttccggtggt tcgggagcct 420 gagttgggcg actttagccg atcgcgtgac gccaagtcaa tccaacatgc taagagggag 480 gcgactgagg aggcgactgg tgagtcagcc aacgagggcc agtcacgtga ctccgcacga 540 gcctccgcgc gtgacattgc cttttccgag gctgaccccg tgcacgaaga ctcgtatgac 600 gacgacgaaa acggaaccat tctcgtgccg acggctgagt cagaggagga gctccaggaa 660 tacgcagaca aggacgcggc cgccaagtcg tacctgcgaa gcggctggtc acgtggccag 720 aaatatgtcg agctgccgcg cgagctgttc acttgggaca ttcacgaaga gattgacaag 780 ggactgacta agaagagcgt tgactcagac gacccgtcac gtgagcaggt tgcgcactcg 840 cagtttctta gtcagcattg gaaacacatc aaaaagtccg gcaagcattt ctccgaagcg 900 tgggttgtgg gcgacaccaa agcagccgga gtccattacg actggcgatt tttcagcgag 960 ttaaacacca ttgacgagaa acgagtcatc ttgcgtaaat tggtgcgtgc gtggctcgac 1020 ttcacgtcac gtgagggcat tatcacgtgg ctggcgcatg gcacgttgct gggctggtac 1080 tggaacggcc agtctctgcc gtgggatttc gacggtgatg tccagatgcc gatccgcgaa 1140 ttcgaccggt ttgcccgcct ctataatcag tcgttggtaa ttgatgagtc agccggcggc 1200 cggtattatg tcgatgtggg tccctcctac gtcgagcgcc tccgaggcaa cggcaagaat 1260 gtcattgatg ctcggtttat cgacgttgat agtggcatgt acattgacat taccgccttg 1320 gcgtatgccg agcagcagga aaagttccac tgcaaaaact ggcatcggta tgagttggag 1380 agcgtttctc cgctgcgtcg gacgctgttt gagggcaagg aggcttacat tccaaacaat 1440 ttcgagtcca ttttgaacca ggagtacaag aaggcgccgc tggtgaacac ccggttcgag 1500 ggccacttct ggaacaagtt tatcaaaatg tgggttcagc aggaccagtg tgaaatgtta 1560 cagattgagg agaatgtgga ccagcgggca gtgagggaaa acggtgaacc cacaactttt 1620 ggcgcttgtt atcgaccgga gtatctcaag aggtatcacg agacccacaa gatgagtaag 1680 gctcatgagg gggagatgga ggcaatcagg caaaaggccg atgtttggga atggattcgc 1740 gaggagtttg agtag 1755 <210> 8 <211> 584 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica YlMpo1 <400> 8 Lys Ala Met Ala Gly Asn Ser Ser Val Arg Ile Ser His Val Pro Leu 1 5 10 15 Thr Lys Ile Lys Phe Ala Glu Asn Glu Lys Glu Phe Asn Pro Lys Trp 20 25 30 Ala Gln Lys Lys Ala Leu Asp Ser Ser Ser Asp Tyr Ser Phe Glu Trp 35 40 45 Lys Asp Trp Val Asp Leu Thr Glu Val Thr Gly Leu Phe Arg Ala Ile 50 55 60 Glu Val Gly Ser Cys Gly Lys Asn Lys Gln Cys Leu Ser Lys Leu Gln 65 70 75 80 Val Thr Gly Pro Pro Thr Gln Val Glu Pro Gln Ala Phe Phe Asn Arg 85 90 95 Val Gly Lys Val Phe Leu Asp Gln Thr Met Pro Lys Pro Lys Gln Leu 100 105 110 Ile Tyr Leu Thr Glu Lys Glu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Glu Pro Val 115 120 125 Glu Ile Glu Ser His Val Pro Val Val Arg Glu Pro Glu Leu Gly Asp 130 135 140 Phe Ser Arg Ser Arg Asp Ala Lys Ser Ile Gln His Ala Lys Arg Glu 145 150 155 160 Ala Thr Glu Glu Ala Thr Gly Glu Ser Ala Asn Glu Gly Gln Ser Arg 165 170 175 Asp Ser Ala Arg Ala Ser Ala Arg Asp Ile Ala Phe Ser Glu Ala Asp 180 185 190 Pro Val His Glu Asp Ser Tyr Asp Asp Asp Glu Asn Gly Thr Ile Leu 195 200 205 Val Pro Thr Ala Glu Ser Glu Glu Glu Leu Gln Glu Tyr Ala Asp Lys 210 215 220 Asp Ala Ala Ala Lys Ser Tyr Leu Arg Ser Gly Trp Ser Arg Gly Gln 225 230 235 240 Lys Tyr Val Glu Leu Pro Arg Glu Leu Phe Thr Trp Asp Ile His Glu 245 250 255 Glu Ile Asp Lys Gly Leu Thr Lys Lys Ser Val Asp Ser Asp Asp Pro 260 265 270 Ser Arg Glu Gln Val Ala His Ser Gln Phe Leu Ser Gln His Trp Lys 275 280 285 His Ile Lys Lys Ser Gly Lys His Phe Ser Glu Ala Trp Val Val Gly 290 295 300 Asp Thr Lys Ala Ala Gly Val His Tyr Asp Trp Arg Phe Phe Ser Glu 305 310 315 320 Leu Asn Thr Ile Asp Glu Lys Arg Val Ile Leu Arg Lys Leu Val Arg 325 330 335 Ala Trp Leu Asp Phe Thr Ser Arg Glu Gly Ile Ile Thr Trp Leu Ala 340 345 350 His Gly Thr Leu Leu Gly Trp Tyr Trp Asn Gly Gln Ser Leu Pro Trp 355 360 365 Asp Phe Asp Gly Asp Val Gln Met Pro Ile Arg Glu Phe Asp Arg Phe 370 375 380 Ala Arg Leu Tyr Asn Gln Ser Leu Val Ile Asp Glu Ser Ala Gly Gly 385 390 395 400 Arg Tyr Tyr Val Asp Val Gly Pro Ser Tyr Val Glu Arg Leu Arg Gly 405 410 415 Asn Gly Lys Asn Val Ile Asp Ala Arg Phe Ile Asp Val Asp Ser Gly 420 425 430 Met Tyr Ile Asp Ile Thr Ala Leu Ala Tyr Ala Glu Gln Gln Glu Lys 435 440 445 Phe His Cys Lys Asn Trp His Arg Tyr Glu Leu Glu Ser Val Ser Pro 450 455 460 Leu Arg Arg Thr Leu Phe Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Ile Pro Asn Asn 465 470 475 480 Phe Glu Ser Ile Leu Asn Gln Glu Tyr Lys Lys Ala Pro Leu Val Asn 485 490 495 Thr Arg Phe Glu Gly His Phe Trp Asn Lys Phe Ile Lys Met Trp Val 500 505 510 Gln Gln Asp Gln Cys Glu Met Leu Gln Ile Glu Glu Asn Val Asp Gln 515 520 525 Arg Ala Val Arg Glu Asn Gly Glu Pro Thr Thr Phe Gly Ala Cys Tyr 530 535 540 Arg Pro Glu Tyr Leu Lys Arg Tyr His Glu Thr His Lys Met Ser Lys 545 550 555 560 Ala His Glu Gly Glu Met Glu Ala Ile Arg Gln Lys Ala Asp Val Trp 565 570 575 Glu Trp Ile Arg Glu Glu Phe Glu 580 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YlMPO1 HindIII 1F <400> 9 cccaagcttc gatgaccgac gtgggcttag t 31 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YlMPO1 HindIII 2F <400> 10 cccaagcttc gaaagccatg gccggcaact c 31 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YlMPO1 XhoI R <400> 11 ccgctcgagc tcaaactcct cgcgaatcca 30 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YlMPO1 SgfI F <400> 12 acggcgatcg ccatgaccga cgt 23 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YlMPO1 BamHI R <400> 13 agcggatccc tactcaaact cctcg 25

Claims (22)

1. 다음의 단계를 포함하는 YlMpo1(Yarrowia lipolytica MNN4 homologue MPO1) 효소를 이용하여 당사슬에 만노스-6-인산을 부가시키는 방법:
   (a) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 YlMpo1 효소를 이용한 만노스인산화 효소반응을 통해 당사슬에 만노스-6-인산-1-만노스를 부가시키는 단계; 및
   (b) 상기 만노스-6-인산-1-만노스가 부가된 당사슬의 바깥쪽 만노스를 제거하여 만노스-6-인산이 부가된 당사슬을 생성시키는 단계.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 YlMpo1(Yarrowia lipolytica MNN4 homologue MPO1)은 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 유래인 것을 특징으로 하는 당사슬에 만노스-6-인산을 부가시키는 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 당사슬은 Man_3-9GlcNAc₂ (M3-9)인 것을 특징으로 하는 당사슬에 만노스-6-인산을 부가시키는 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 당사슬에 만노스-6-인산-1-만노스를 부가시키는 과정은 완충용액, 금속이온 및 GDP-만노스(mannose)가 추가로 첨가되는 것을 특징으로 하는 당사슬에 만노스-6-인산을 부가시키는 방법.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 완충용액은 pH 5.0 내지 8.0의 인산나트륨 (sodium phosphate)인 것을 특징으로 하는 당사슬에 만노스-6-인산을 부가시키는 방법.
   
6. 제4항에 있어서, 상기 금속이온은 칼슘이온 또는 망간이온인 것을 특징으로 하는 당사슬에 만노스-6-인산을 부가시키는 방법.
   
7. 제4항에 있어서, 상기 (a) 단계의 당사슬에 만노스-6-인산-1-만노스를 부가시키는 과정은 계면활성제(surfactant)가 추가로 첨가되는 것을 특징으로 하는 당사슬에 만노스-6-인산을 부가시키는 방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 계면활성제(surfactant)는 노닐 페녹시폴리에톡시에탄올(nonyl phenoxypolyethoxylethanol; NP-40), 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르(polyoxyethylene octyl phenyl ether; Triton X-100), 폴리옥시에칠렌소르비톨모노라우레이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate; Tween-20), 폴리옥시에틸렌 (23) 라우릴 에테르(Polyoxyethylene (23) lauryl ether; Brij-35) 및 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로페인셀퍼네이트(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate; CHAPS)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 당사슬에 만노스-6-인산을 부가시키는 방법.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 만노스-6-인산-1-만노스가 부가된 당사슬의 바깥쪽 만노스를 제거하는 과정은 약산 가수분해 또는 캡핑 제거(uncapping) 효소를 이용하는 것을 특징으로 하는 당사슬에 만노스-6-인산을 부가시키는 방법.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 약산은 0.1 내지 5 M의 포름산(formic acid)인 것을 특징으로 하며, 캡핑 제거(uncapping) 효소는 α-만노시다제(α-mannosidase)인 것을 특징으로 하는 당사슬에 만노스-6-인산을 부가시키는 방법.
    
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 만노스-6-인산을 부가하는 것을 특징으로 하는 당단백질의 제조방법.
    
12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 만노스-6-인산이 부가된 당사슬과 단백질을 화학적 또는 물리적으로 결합시키는 것을 특징으로 하는 당단백질의 제조방법.
    
13. 제11항에 있어서, 상기 단백질은 병원체 단백질(pathogen protein), 라이소좀 단백질(lysosomal protein), 성장 인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 항체 또는 이의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment), 또는 융합 단백질(fusion protein)인 것을 특징으로 하는 만노스-6-인산이 부가된 당단백질의 제조방법.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 라이소좀 단백질(lysosomal protein)은 라이소좀 저장질환(lysosomal storage disease) 관련된 분해효소인 것을 특징으로 하는 만노스-6-인산이 부가된 당단백질의 제조방법.
    
15. 제12항에 있어서, 상기 단백질은 병원체 단백질(pathogen protein), 라이소좀 단백질(lysosomal protein), 성장 인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 항체 또는 이의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment), 또는 융합 단백질(fusion protein)인 것을 특징으로 하는 만노스-6-인산이 부가된 당단백질의 제조방법.
    
16. 제15항에 있어서, 상기 라이소좀 단백질(lysosomal protein)은 라이소좀 저장질환(lysosomal storage disease) 관련된 분해효소인 것을 특징으로 하는 만노스-6-인산이 부가된 당단백질의 제조방법.
    
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