KR101435141B1 - 야로위아 리폴리티카 유래 펩티드-ｎ-글리코시다제 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 유래 신규한 펩티드-N-글리코시다제(peptide-N-glycosidase, PNGase Y) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하여 상기 단백질을 제조하는 방법, 상기 단백질 또는 이를 포함하는 상기 형질전환체의 배양액을 이용하여 N-결합형 당사슬이 절단된 당단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 펩티드-N-글리코시다제는 복합형 당사슬, 하이브리드형 당사슬, 고만노스형 당사슬, 만노스-6-인산이 부가된 당사슬, 첫 번째 N-아세틸글루코사민에 α(1,3)-퓨코스가 부가된 당사슬 등을 효과적으로 절단할 수 있어 동물, 식물 및 곤충 유래 당사슬에 대해 광범위하고 우수한 기질 특이성을 나타내며, 당단백질의 펩티드 상태뿐만 아니라 단순 변성된 단백질 상태에서도 N-결합형 당사슬을 절단할 수 있어 보다 간편하고 신속하게 N-결합형 당사슬을 절단하여 그 구조를 분석할 수 있다.

Description

야로위아 리폴리티카 유래 펩티드-Ｎ-글리코시다제 및 이의 용도{Peptide-N-Glycosidase Derived From Yarrowia Lipolytica And Use Thereof}

본 발명은 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 유래 신규한 펩티드-N-글리코시다제(peptide-N-glycosidase, PNGase Y) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하여 상기 단백질을 제조하는 방법, 상기 단백질 또는 이를 포함하는 상기 형질전환체의 배양액을 이용하여 당단백질의 N-결합형 당사슬의 구조를 분석하는 방법에 관한 것이다.

최근 EPO(erythropoietin) 등을 비롯한 사이토카인, 치료용 항체, 효소 치료제 등의 당단백질 의약품들이 주목을 받으며 재조합 단백질 의약품 시장의 주력으로 떠오르고 있다. 이러한 재조합 단백질의 발현용 숙주로는 균주 조작이 용이하고 경제적인 생산이 가능한 대장균이나 효모와 같은 미생물이 1차적으로 고려되지만, 이를 이용한 방법은 인체 유래의 복잡한 당단백질을 활성형으로 발현하기 어렵다는 문제점이 있다. 그로 인해 현재 대부분의 고부가가치 의약용 당단백질은 부착되는 당사슬이 인간과 유사하게 수식될 수 있는 동물세포 배양기술을 이용하여 생산되고 있다. 그러나, 상기 방법 역시 고가의 생산비용 유발과 인간에게 해로울 수 있는 바이러스와 프라이온(prion)의 오염 가능성 등이 문제점으로 제기되고 있다.

이의 대안으로, 식물 또는 곤충세포 등이 바이러스와 프라이온 등의 오염 가능성이 낮고 경제적인 생산이 가능한 유용한 시스템으로 부각되고 있다(Ko and Koprowski, Virus Res., 111: 93-100, 2005). 그러나, 이들의 소포체에서 이루어지는 N-당질화(Glycosylation) 과정은 동물세포와 동일하지만, 골지체에서 식물이나 곤충 특이적인 당사슬 가지가 부가되기 때문에 인체 주입 시 면역반응을 야기할 우려가 있다(Gomord, Chamberlain et al., Trends Biotechnol., 23: 559-65, 2005). 이에 식물이나 곤충의 당사슬 생합성 경로를 인간화하기 위한 연구가 활발하게 이루어지고 있으며, 이러한 연구를 위해서는 당사슬 구조 분석이 중요하다.

보통 동물세포에서 발현된 당단백질의 N-결합형 당사슬은 주로 플라비박테리움 메닝고셉티쿰(Flavibacterium meningocepticum) 유래 펩티드-N-글리코시다제 F(PNGase F)에 의해 절단된다. 그러나, 식물 또는 곤충에서 발현된 당단백질에 부착된 N-결합형 당사슬의 경우에는 종종 첫 번째 N-아세틸글루코사민에 α(1,3)-퓨코스가 부가되는 경우가 있으며, PNGase F는 이러한 당사슬을 절단할 수 없다(Altmann, Paschinger et al., Eur. J. Biochem., 252: 118-23, 1998). 이로 인해 현재 식물과 곤충 유래 당단백질의 당사슬 분석에는 아몬드(Almond) 유래 펩티드-N-글리코시다제 A(PNGase A)가 이용된다. 또한, PNGase F는 만노스-6-인산이 부가된 당사슬 구조를 갖는 당단백질을 절단하는데 한계를 갖는다. 특히 인산이 2개 부가된 당사슬의 경우에는 PNGase F의 절단 활성이 현저히 저하되는 것으로 보고되어서, 당사슬의 절단에 PNGase A 효소의 사용이 선호된다(Zhao, Faull et al., J. Biol. Chem., 272: 22758-65, 1997). 그러나 아몬드로부터 전통적인 단백질 정제방법을 통해 정제되는 PNGase A는 고가로 판매되고 있어 경제적이지 못하다. 또한, PNGase F는 당단백질을 변성시킨 후에 바로 단백질 상태에서 당사슬을 절단할 수 있지만, PNGase A는 변성된 당단백질에 단백질 분해효소를 처리하여 펩티드 상태로 전환시켜야만 당사슬을 절단할 수 있다. 따라서, PNGase A를 이용한 당사슬 절단은 PNGase F를 이용한 경우보다 복잡하고 번거롭다는 단점을 갖는다.

이에, 본 발명자들은 동물 유래뿐만 아니라 식물 및 곤충 유래 당단백질에 대해서도 절단 활성을 나타내면서 당단백질의 펩티드로의 전환을 요구하지 않는 N-결합형 당사슬 절단효소를 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로부터 N-결합형 당사슬을 절단할 수 있는 펩티드-N-글리코시다제를 새로이 발굴하고, 상기 효소가 광범위한 기질 특이적인 당사슬 절단 활성을 가지며 펩티드로의 전환 없이 당단백질 상태에서 N-결합형 당사슬을 절단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 유래의 펩티드-N-글리코시다제(peptide-N-glycosidase, PNGase Y) 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y) 단백질을 코딩하는 핵산을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y) 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y) 단백질 또는 이를 포함하는 상기 형질전환체의 배양액을 이용하여 당단백질의 N-결합형 당사슬을 절단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y) 단백질 또는 이를 포함하는 상기 형질전환체의 배양액을 이용하여 당단백질의 N-결합형 당사슬의 구조를 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 유래의 N-결합형 당사슬 절단 활성을 갖는 펩티드-N-글리코시다제(peptide-N-glycosidase, PNGase Y) 단백질을 제공한다.

본 발명에서 용어, "펩티드-N-글리코시다제", "펩티드-N-글리코시다제 단백질" 또는 "PNGase Y"는 당단백질에 부가된 N-결합형 당사슬을 특이적으로 인식하여 절단할 수 있는 효소로서, N-결합형 당사슬을 아스파라긴산 잔기로부터 분리하는 가수분해 효소이다.

본 발명에서 용어, "당사슬"은 당이 사슬처럼 연결된 형태를 지칭한다.

본 발명에서 용어, "N-결합형 당사슬"은 당사슬이 단백질에 결합된 형태 중의 하나로서, 당사슬이 아스파라긴산의 NH₂기와 연결된 형태이다. N-결합형 당사슬은 본 발명의 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)에 의해 가수분해를 통해 절단될 수 있다.

본 발명의 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)는 야로위아 리폴리티카로부터 유래된 효소로서, 당단백질의 N-결합형 당사슬을 절단하는 활성을 갖는다. 구체적으로, 본 발명의 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)는 서열번호: 4로 기재되는 아미노산 서열 전체 또는 일부를 포함하는데, 상기 서열은 야로위아 리폴리티카 유래 펩티드-N-글리코시다제를 코딩하는 1,938 bp의 뉴클레오티드 ORF(open reading frame)의 아미노산 서열을 나타내며, 총 645개의 아미노산을 포함한다. 이중 N-말단 부분의 30개의 아미노산 서열은 단백질을 세포 외로 분비시키는 신호서열(signal sequence)로 추정된다. 따라서, 본 발명에 따른 야로위아 리폴리티카 유래 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)는 당단백질의 N-결합형 당사슬 절단 활성에 필수적인 효소활성 부분으로 서열번호: 4의 아미노산 서열에서 N-말단의 신호서열 부분을 제외한 나머지 부분, 즉 서열번호: 6으로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 야로위아 리폴리티카 유래 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)의 아미노산 서열을 종래의 펩티드-N-글리코시다제의 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, 식물인 아몬드(Almond) 및 토마토(Lycopersicum esruletum) 유래 펩티드-N-글리코시다제와는 각각 22% 및 19%의 동일성(각각 34% 및 30%의 상동성)을, 곰팡이류인 아스페르질러스 니거(Aspergillus niger) 및 아스페르질러스 오리제(Aspergillus oryzae) 유래 펩티드-N-글리코시다제와는 각각 23%의 동일성(각각 36% 및 35%의 상동성)을 나타내어, 본 발명에 따른 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)가 종래 펩티드-N-글리코시다제와는 매우 낮은 서열 상동성을 나타내는 신규한 효소 단백질임을 확인하였다(도 1 참조).

본 발명에 따른 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)의 범주에는 서열번호: 4 및 6으로 기재되는 아미노산을 갖는 단백질뿐만 아니라, 이의 보존적 아미노산 치환 변이체 및 기능적 유도체를 포함한다.

본 발명에서 용어, "보존적 아미노산 치환(conservative amino acid)"은 주어진 아미노산 잔기 중 어떤 아미노산이 치환된 것을 나타내는 것으로, 상기에서 치환 잔기가 원래 주어진 잔기와 생화학적 특성이 상당히 유사하여 폴리펩티드의 기능, 예를 들면 효소 활성을 실질적으로 감소시키지 않는 치환을 의미한다. 보존적 아미노산 치환은 본 기술 분야에서 보편적으로 알려져 있으며, 예를 들면 미국 특허 제6,790,639호, 제6,774,107호, 제6,194,167호 또는 제5,350,576호에 설명되어 있다.

본 발명에서 바람직한 보존적 아미노산 치환은 다음의 어느 하나에서 발생할 수 있다: ⅰ) 실질적으로 비극성인 작은 지방족 측쇄를 갖는 잔기: 알라닌(alanine), 글리신(glycine), 프롤린(proline), 세린(serine) 또는 쓰레오닌(threonine); ⅱ) 비극성이며 큰 지방족 측쇄를 갖는 잔기: 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 발린(valine) 또는 메티오닌(methionine); ⅲ) 음전하의 극성인 측쇄를 갖는 잔기: 아스파르트산(aspartic acid) 또는 글루탐산(glutamic acid); ⅳ) 아미드기의 측쇄를 갖는 잔기: 아스파라긴(asparagine) 또는 글루타민(glutamine); v) 양전하의 극성인 측쇄를 갖는 잔기: 아르기닌(arginine), 라이신(lysin) 또는 히스티딘(histidine); 및 ⅵ) 방향족 측쇄를 갖는 잔기: 트립토판(tryptophan), 타이로신(tyrosine) 또는 페닐알라닌(phenylalanine).

본 발명에 따른 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)의 보존적 치환 변이체는 서열번호: 4 또는 6의 아미노산 서열에서 아미노산 치환 변이가 발생하였음에도 불구하고 상기 효소의 N-결합형 당사슬 절단 활성을 유지하거나 이보다 향상된 절단 활성을 갖는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어, "기능적 유도체"는 통상적으로 천연 폴리펩티드와 실질적으로 대등한 생물학적 활성을 나타내는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 기능적 유도체는 천연 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)와 동등한 생물학적 활성, 즉 N-결합형 당사슬 절단 활성을 갖는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)의 기능적 유도체는 서열번호: 4 또는 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 기능적 유도체이다. 상기 기능적 유도체는 상기 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성, 바람직하게는 80% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서, 펩타이드-N-글라이코시데이즈의 N-결합형 당사슬 절단 활성을 갖는 단백질을 포함한다.

본 발명의 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)는 단백질 분해효소 처리에 의한 펩티드로의 전환 없이 단순 변성 과정만 거친 당단백질의 당사슬을 절단할 수 있으며, 다양한 형태의 당사슬, 예컨대 복합형 당사슬, 하이브리드형 당사슬, 고만노스형 당사슬, 만노스-6-인산이 부가된 당사슬, 및 첫 번째 N-아세틸글루코사민에 α(1,3)-퓨코스가 부가된 당사슬에 대해 우수한 절단 활성을 나타낸다. 이는 포유동물 유래 당사슬뿐만 아니라 식물 및 곤충 유래 당사슬에 대해서도 절단 활성을 나타내는 것으로, 본 발명의 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)는 종래 PNGase A 및 PNGase F에 비해 광범위한 기질 특이적 절단 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 단백질 분해효소 처리에 의한 당단백질의 펩티드로의 전환을 요구하지 않아 보다 간편하고 신속하게 N-결합형 당사슬을 절단할 수 있다.

본 발명에서 용어, "복합형(complex type) 당사슬"은 트리-만노스 핵심 당사슬(tri-mannosyl core glycan)의 말단에 있는 2개의 만노스에 각각 N-아세틸글루코사민, 갈락토스, 시알산 등이 순차적으로 부가되는 2개 이상의 안테나 구조를 갖는 당사슬을 지칭한다(도 2 참조).

본 발명에서 용어, "하이브리드형(hybrid type) 당사슬"이란 트리-만노스 핵심 당사슬에서 뻗어 나간 안테나들 중 하나 이상이 만노스 잔기들로만 신장되거나 종결되고, 나머지 안테나는 N-아세틸글루코사민, 갈락토스, 시알산 등이 순차적으로 부가되어 혼합되는 구조를 갖는 당사슬을 지칭한다(도 2 참조).

본 발명에서 용어, "고-만노스형(high-mannose type) 당사슬"이란 트리-만노스 핵심 당사슬에 주로 만노스가 연결되어 뻗어 나간 구조를 갖는 당사슬을 지칭한다(도 2 참조).

본 발명에서 용어, "첫 번째 N-아세틸글루코사민에 α(1,3)-퓨코스가 부가된 당사슬"이란 트리-만노스 핵심 당사슬의 첫 번째 N-아세틸글루코사민에 α(1,3)-퓨코스가 부가된 구조를 갖는 당사슬을 지칭한다. 식물 및 곤충에서 유래하는 많은 당단백질은 이러한 구조의 당사슬을 갖는다.

본 발명에서 용어, "만노스-6-인산이 부가된 당사슬"이란 고-만노스형 당사슬에 만노스-6-인산이 부가된 구조를 갖는 당사슬을 지칭한다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y) 단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명에서 용어, "핵산"은 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)로, 게놈 DNA, cDNA 및 이로부터 전사되는 RNA를 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584, 1990). 본 발명의 핵산은 표준 분자생물학 기술을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 예를 들어, 적절한 프라이머 서열을 이용하여 야로위아 리폴리티카 게놈 DNA로부터 PCR(중합효소 연쇄반응)을 통해 증폭할 수 있고, 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 표준 합성기술을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 핵산은 바람직하게는 서열번호: 3 및 5로 기재되는 염기서열을 포함한다. 본 발명은 서열번호: 3 및 5로 기재되는 염기 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상의 상동성, 바람직하게는 80% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서 실질적으로 핵산이 코딩한 단백질이 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)의 N-결합형 당사슬 절단 활성을 갖는 핵산을 모두 포함한다.

본 발명에서 용어, "상동성(homology)"은 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성은 두 서열을 육안으로 비교하여 결정할 수도 있으나, 비교대상이 되는 서열을 나란히 배열하여 상동성 정도를 분석해 주는 생물정보 알고리즘(bioinformatic algorithm)을 사용하여 결정할 수 있다. 상기 두 개의 아미노산 서열 사이의 상동성은 백분율로 표시할 수 있다. 유용한 자동화된 알고리즘은 Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, W, USA)의 GAP, BESTFIT, FASTA와 TFASTA 컴퓨터 소프트웨어 모듈에서 이용가능하다. 상기 모듈에서 자동화된 배열 알고리즘은 Needleman & Wunsch와 Pearson & Lipman과 Smith & Waterman 서열 배열 알고리즘을 포함한다. 다른 유용한 배열에 대한 알고리즘과 상동성 결정은 FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST와 CLUSTAL W를 포함하는 소프트웨어에서 자동화되어 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있고, 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 하여 구축될 수 있다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 핵산 구조물(construct)을 의미한다. 본 발명은 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있는데, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 본 발명의 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y) 단백질을 수득할 수 있다.

본 발명에서 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)를 코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 라이보좀 결합부위, 전사 종결서열 등)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명에서 용어, "프로모터"는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열, 즉, 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 말하며, mRNA 전사 개시부위의 5' 부위에 위치한다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 재조합 벡터이고 원핵세포를 숙주로 하는 경우에, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예: tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합부위 및 전사/해독 종결서열을 포함하는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pPICZα 시리즈, pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 재조합 벡터이고 진핵세포를 숙주로 하는 경우에, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 우두바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열(예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열)을 일반적으로 갖는다.

바람직하게 본 발명의 프로모터는, 본 발명의 핵산을 효모와 같은 숙주에서 발현하도록 하는 효모 유래 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들어, "효모 유래 프로모터"는 천연적으로 효모 내에 존재하는 임의의 프로모터를 의미하는 것으로, 효모 알파-메이팅 시스템(α-mating system)의 프로모터, 효모 트리오스 포스파타아제 이소머라제(triose phosphatase isomerase; TPI)의 프로모터, 효모의 해당과정에 관여하는 유전자들(glycolytic genes) 또는 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase) 유전자의 프로모터, 효모의 갈락토오스 대사에 관여하는 효소들, 예컨대 GAL1(galactose kinase) 및 GAL10(uridine diphosphoglucose 4-epimerase)을 코딩하는 유전자의 프로모터, GADPH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), MOX(methanol oxidase), AOX(alcohol oxidase)의 프로모터 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 재조합 벡터는 선택 마커로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 사용될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 회수되는 목적 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여 필요에 따라 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가로 포함될 수 있는 서열은 단백질 정제용 태그 서열일 수 있으며, 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6개 히스티딘(hexahistidine) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6개 히스티딘 태그일 수 있으나, 상기 예들에 의하여 목적 단백질의 정제를 위하여 필요한 서열의 종류가 제한되는 것은 아니다.

상기와 같은 태그 서열을 포함하는 재조합 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6개 히스티딘 태그가 이용된 경우에는 Ni-NTA 칼럼을 이용하여 원하는 목적 단백질을 용이하게 회수할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 본 발명에 따른 야로위야 리폴리티카 유래의 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)에서 N-말단의 분비 신호서열을 제외하고 효소활성을 갖는 부분, 즉, 서열번호: 6의 아미노산 서열에 해당하는 부분만을 PCR(중합효소 연쇄반응)로 증폭한 후 그로부터 증폭된 유전자 절편을 AOX 프로모터, 알파-인자 신호서열(α-factor signal peptide) 및 6개 히스티딘 태그(hexahistidine tag)를 포함하는 pPICZα-A 벡터(Invitrogen)에 클로닝하였다. 상기 클로닝에 의해 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y) 유전자 절편의 N-말단에는 알파-인자 신호서열이 연결되고 그의 C-말단에는 6개 히스티딘 태그가 연결된다. 이로부터 제조된 재조합 벡터를 pPICZα-PNGase Y로 명명하였다(도 3 참조). 상기 재조합 벡터 pPICZα-PNGase Y는 서열번호: 7로 기재되는 염기 서열로 이루어진 핵산 구조물을 포함하며, 이로부터 서열번호: 8로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)가 코딩된다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 야로위야 리폴리티가 유래 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 용어, "형질전환(transformation)"이란 DNA를 숙주세포 내로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로, 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.

본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환법 등이 있다.

본 발명의 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.

목적 핵산인 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내로 도입함으로써 본 발명의 형질전환체(transformant)를 획득할 수 있다.

본 발명에 적합한 숙주는 본 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충세포; 및 CHO, COS, BSC 등과 같은 동물세포가 있다. 바람직하게는, 숙주세포로 피키아 파스토리스를 사용한다.

피키아 파스토리스는 메탄올자화 효모 중 하나로, 메탄올 대사 및 퍼옥시좀 생성 연구에 매우 유용한 모델 생물체인 한편, 전통 효모인 사카로마이세스 세레비지애를 능가하는 단백질의 대량 생산에 유용한 숙주 시스템이다. 특히, 피키아 파스토리스를 이용한 발현 시스템은 메탄올 유도성 알코올 옥시다제 프로모터(alcohol oxidase promoter, AOX)를 이용해 재조합 단백질의 대량 생산에 매우 유리하다. 또한, 피키아 파스토리스는 독특한 대사 및 생리활성으로 인해 환경친화적 생물공정에 활용할 수 있는 유용한 산업자원 중 하나로 인식되고 있다. 따라서, 본 발명에 따른 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y) 생산용 피키아 파스토리스 발현 시스템의 구축은 생산단가는 저렴하면서 고효율로 재조합 단백질을 생산할 수 있어 경제, 산업적 측면에서 매우 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서는 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터 pPICZα-PNGase Y를 피키아 파스토리스에 형질전환시켜 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)를 발현하는 형질전환체를 수득하였다(도 4a 및 4b 참조). 이로부터 수득된 형질전환체를 피키아 파스토리스 GS115-PNGaseY로 명명하고 이를 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라, 2011년 11월 11일자로 한국생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KRIBB) 내 유전자은행(Korea Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁번호 제KCTC12067BP호로서 기탁하였다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용하여 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)를 제조하는 방법을 제공한다.

바람직하게, 본 발명에 따른 방법은

(a) 펩티드-N-글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계;

(b) 상기 배양된 형질전환체로부터 펩티드-N-글리코시다제를 생산하는 단계; 및

(c) 상기 생산된 펩티드-N-글리코시다제를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 형질전환체의 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 숙주세포 배양의 요건을 충족해야 한다. 숙주세포의 생장을 위하여 배지 중에 포함될 수 있는 탄소원은 제조된 형질전환체의 종류에 따라 당업자의 판단에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 배양 시기 및 양을 조절하기 위해 적당한 배양 조건을 채택할 수 있다.

사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 사카로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다.

마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양 도중에 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예: 공기)를 주입한다.

본 발명에 따른 형질전환체의 배양은 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 또한 배양은 원하는 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 지속되는데, 이러한 목적으로 배양은 보통 10 내지 160시간 동안 지속될 수 있다.

전술한 바와 같이 숙주세포에 따라 적절한 배양 조건을 조성해주면 본 발명에 따른 형질전환체는 펩티드-N-글리코시다제를 생산하게 되며, 벡터의 구성 및 숙주세포의 특징에 따라 생산된 펩티드-N-글리코시다제는 숙주세포의 세포질 내, 원형질막 공간(periplasmic space) 또는 세포 외로 분비될 수 있다. 본 발명의 형질전환체는 그에 도입된 재조합 벡터 pPICZα-PNGase Y에 포함된 알파-인자 신호서열로 인해 발현된 펩티드-N-글리코시다제를 세포 외로, 즉 배양액 내로 분비한다.

숙주세포 내 또는 외에서 발현된 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 정제 방법의 예로는 염석(예: 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(예: 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 적용할 수 있다.

상기 방법으로 형질전환체로부터 분리, 정제된 본 발명의 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)는 광범위한 기질 특이성으로 보다 용이하게 다양한 당단백질의 N-결합형 당사슬을 절단할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)를 발현하는 피키아 파스토리스 형질전환체 GS115-PNGaseY(KCTC12067BP)를 통상적인 효모 배양 배지에 접종하여 30℃에서 2~3일간 배양하였다. 상기 배양액을 감자 유래 당단백질에 처리한 후 DNA 시퀀서(sequencer)를 이용하여 분석한 결과, 감자 유래 당단백질의 당쇄가 절단됨을 확인하였다(도 5 참조). 이로부터 상기 형질전환체로부터 발현된 단백질이 N-결합형 당사슬 절단 활성을 가짐을 알 수 있다.

상기 배양액으로부터 단백질을 분리, 정제하기 위해 배양액을 Ni-NTA 칼럼 크로마토그래피에 로딩하여 발현된 단백질을 Ni-NTA 칼럼에 흡착시켰다. 이어서 Ni-NTA 칼럼에 흡착된 단백질을 용출하여 얻은 분획을 SDS-PAGE로 분석하여 약 72 kDa 크기의 단백질이 발현되었음을 확인하였다(도 6 참조). 상기 배양액으로부터 분리, 정제된 단백질의 당사슬 구조를 분석한 결과, 효모에서 발현된 당단백질로서 고-만노스형 N-결합형 당사슬을 가지고 있음을 확인하였다(도 7 참조). 상기 결과로부터 피키아 파스토리스 형질전환체 GS115-PNGaseY(KCTC12067BP)로부터 N-결합형 당사슬 절단 활성을 갖는 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)가 발현됨을 알 수 있다.

이에 본 발명은, 또 다른 하나의 양태로서, 하기 단계를 포함하는 당단백질의 N-결합형 당사슬 구조를 분석하는 방법을 제공한다:

(a) N-결합형 당사슬을 포함하는 당단백질을 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y), 이를 포함하는 형질전환체, 또는 이의 배양액으로 처리하는 단계; 및

(b) 상기 처리에 의해 당단백질로부터 절단된 N-결합형 당사슬의 구조를 분석하는 단계.

본 발명에서 용어, "배양액"은 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하여 수득한 조성물로서, 형질전환체에서 발현된 N-결합형 당사슬 절단 활성을 갖는 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)를 포함하는 조성물을 지칭한다.

본 발명에서 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y), 이를 포함하는 형질전환체 또는 이의 배양액을 "처리"하는 것은 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)의 N-결합형 당사슬 절단 활성이 유지되는 상태에서 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 온도 및 pH 조건에서 적절한 시간 동안 수행할 수 있다. 바람직하게는 20℃ 내지 45℃ 및 pH 5 내지 6, 더욱 바람직하게는 30℃ 내지 40℃ 및 pH 5.5에서 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)가 충분히 당단백질의 N-결합형 당사슬을 절단할 수 있을 때까지, 바람직하게는 1 내지 160시간 동안 처리할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서는, N-결합형 당사슬을 갖는 당단백질 기질에 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y), 이를 포함하는 형질전환체 또는 이의 배양액을 37℃에서 12시간 이상 처리할 수 있다. 또한, 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y), 이를 포함하는 형질전환체 또는 이의 배양액과 N-결합형 당단백질의 반응 몰비는 1:1 내지 1:100인 것이 바람직하고, 1:50인 것이 더욱 바람직하지만, N-결합형 당사슬의 절단이 가능한 범위라면 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 방법에 따라 N-결합형 당사슬이 절단될 수 있는 당단백질에는 동물 유래 당단백질뿐만 아니라 식물 및 곤충 유래 당단백질이 모두 포함된다. 구체적으로, 본 발명에 따른 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)의 기질이 될 수 있는 당단백질에는 복합형 당사슬, 하이브리드형 당사슬, 고만노스형 당사슬, 만노스-6-인산이 부가된 당사슬, 및 첫 번째 N-아세틸글루코사민에 α(1,3)-퓨코스가 부가된 당사슬을 갖는 당단백질이 포함된다.

또한, 본 발명의 방법에 따르면, N-결합형 당사슬을 포함하는 당단백질은 단백질 및 펩티드 상태 모두에서 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)의 기질로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)는 단순 변성시키는 조건 하에서 단백질 상태로 유지된 당단백질의 N-결합형 당사슬을 절단할 수도 있고, 변성된 단백질에 단백질 분해효소를 처리하여 펩티드 상태로 전환된 당단백질의 N-결합형 당사슬을 절단할 수도 있다.

본 발명에서 용어, "단순 변성시키는 조건"은 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)에 의한 당단백질에 부가된 당사슬의 절단이 용이하도록 처리하는 조건을 말하는데, 단백질 1차 구조의 변화를 수반하지 않으면서 2차, 3차, 4차 구조 등 입체구조에 변화를 일으키는 조건을 의미한다. 이러한 변화는 단백질 상태를 유지하면서 이루어지고, 펩티드로 분해된 상태는 이에 포함되지 않는다. 변성을 위해 가열, 동결건조, 고압, 흡착, 교반, 초음파, 자외선, X선 등 물리적인 처리, 산, 염기, 요소, 구아니딘, 유기용매, 계면활성제, 중금속염 등 화학적인 처리 등이 가능하다. 바람직하게는, PNGase F(F. meningosepticum 유래 PNGase) 사용 시 당업계에 공지된 조건(Plummer and Tarentino, Glycobiology, 1: 257-63, 1991)과 유사한 조건을 사용할 수 있다. 예를 들어, 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS) 및 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)이 첨가된 완충액으로 당단백질을 처리하여 변성시킬 수 있다.

본 발명에서 용어, "단백질 상태"는 단백질 분해효소에 의해 펩티드로 분해되지 않고 단백질 1차 구조를 유지하는 상태를 의미하고, 단백질이 가역적 또는 비가역적으로 변성된 상태도 이에 포함된다.

일반적으로 동물 유래 당단백질은 세균 유래의 PNGase F에 의해 손쉽게 절단될 수 있으나, 첫 번째 N-아세틸글루코사민에 α(1,3)-퓨코스가 부가되어 있는 식물 및 곤충 유래 당단백질은 PNGase F가 절단하지 못한다. 따라서, 식물 및 곤충 유래 당단백질의 당사슬 분석을 위해서는 PNGase F 보다 광범위한 활성을 갖는 아몬드 유래의 PNGase A 효소가 사용된다. 또한, 효소 치료제 등에서 발견되는 만노스-6-인산이 2개 부가된 당사슬의 경우에도 PNGase F는 잘 절단하지 못하나 광범위한 기질 활성을 갖는 PNGase A는 절단할 수 있다. 반면 PNGase A는 광범위한 기질 특이성을 나타내지만 당사슬 절단을 위해서는 당단백질을 펩티드 상태로 분해하는 단백질 분해효소에 의한 전처리 과정을 요구한다. 이러한 단백질 분해효소 전처리 과정은 당사슬 분석과정을 복잡하고 번거롭게 하는 단점이 있다.

이처럼 광범위한 기질 특이성을 나타내는 대신 기질 단백질의 펩티드 상태로의 전환을 요구하는 PNGase A와, 절단 가능한 당단백질의 종류가 매우 제한적인 PNGase F에 비해, 본 발명의 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)는 펩티드 상태로의 전환 없이 단백질 상태에서 당단백질을 절단할 수 있고, 다양한 형태의 당사슬을 갖는 동물 유래뿐만 아니라 식물 및 곤충 유래 당단백질에 대해 광범위한 기질 특이적 절단 활성을 나타낸다.

바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)는 동물 유래의 복합형 당사슬을 갖는 페투인(Fetuin) 단백질과 고-만노스형 당사슬을 갖는 RNase B 단백질의 당사슬을 효과적으로 절단하였다(도 8a 및 8b 참조). 또한, 본 발명의 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)는 PNGase A와 같이 첫 번째 N-아세틸글루코사민에 α(1,3)-퓨코스가 부가된 당사슬을 갖는 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)뿐만 아니라 만노스-6-인산이 2개 부가된 당사슬을 갖는 α-갈락토시다제(α-galactosidase)에 대해서도 보다 우수한 절단 활성을 나타내어 PNGase F보다 광범위한 기질 특이성을 가짐을 확인하였다(도 9a 및 9b 참조). 더욱이, 본 발명의 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)는 PNGase F와 같이 당단백질을 단순 변성시키는 조건만으로도 당사슬을 절단할 수 있어서 단백질 분해효소 처리에 의한 펩티드 상태로의 전환을 요구하는 PNGase A보다 신속하고 간편하게 당사슬을 분석할 수 있는 장점을 갖는다(도 10a 및 10b 참조).

상기한 바와 같은 본 발명의 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)의 당사슬 형태에 따른 기질 특이성 및 당단백질 상태에 따른 절단 활성을 정리하면 하기 표 1 및 2와 같다.

당사슬 형태	PNGase F	PNGase A	PNGase Y
고-만노스형	+++	+++	+++
복합형	+++	+++	+++
1st N-아세틸글루코사민에 α(1,3)-퓨코스가 부가된 형태	-	+++	+++
만노스-6-인산이 2개 부가된 형태	+	+++	+++

당단백질 상태	PNGase F	PNGase A	PNGase Y
변성된 당단백질	+++	-	++
당펩티드	+++	+++	+++

따라서, 본 발명의 야로위아 리폴리티카 유래 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)는 동물, 식물 및 곤충 유래의 다양한 당사슬을 갖는 단백질에 대해 광범위한 기질 특이적 절단 활성을 나타내고, 단백질 분해효소 처리에 의해 펩티드 상태로 전환되지 않고 당단백질을 단순 변성시키는 조건만으로도 효과적으로 당사슬을 절단할 수 있어 당사슬이 절단된 당단백질을 제조하고 당단백질의 당사슬을 분석하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)는 복합형 당사슬, 하이브리드형 당사슬, 고만노스형 당사슬, 만노스-6-인산이 부가된 당사슬, 식물 또는 곤충 유래의 첫 번째 N-아세틸글루코사민에 α(1,3)-퓨코스가 부가된 당사슬 등을 비롯한 다양한 당단백질의 N-결합형 당사슬을 절단할 수 있는 광범위한 기질 특이성을 가지며, 전처리 단계로 당단백질을 펩티드로 분해하는 과정을 거치지 않고 당단백질의 변성만으로 당사슬을 절단할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)는 N-결합형 당사슬을 당단백질로부터 절단하여 이의 구조를 분석하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 야로위아 리폴리티카 유래의 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y) 유전자의 염기서열에 대해 계통수 분석(phylogenetic tree analysis)을 수행한 결과이다.
도 2는 N-결합형 당사슬의 대표적인 구조인 복합형 당사슬, 하이브리드형 당사스, 및 고-만노스형 당사슬의 구조를 나타낸 것이다. 상기 도면에서 박스 부분은 트리-만노스 핵심 당사슬(tri-mannosyl core grlycan)을 나타낸다.
도 3은 야로위아 리폴리티카 유래의 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y) 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pPICZα-PNGase Y의 구조를 나타낸 것이다.
도 4a 및 4b는 각각 본 발명에 따른 재조합 PNGase Y를 발현하는 피키아 파스토리스 형질전환체의 콜로니 (colony)를 스크리닝하기 위한 이스턴 분석(Yeastern analysis)과 웨스턴 분석(Western analysis) 결과를 나타낸 것이다. 상기 도면에서 M: 표준 단백질 마커, N: 공벡터 배양액, 1-40: 재조합 벡터 pPICZα-PNGase Y로 형질전환된 피키아 파스토리스의 콜로니 1 내지 40의 배양액을 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 피키아 파스토리스 형질전환체에서 발현된 재조합 PNGase Y의 효소활성을 확인하기 위해 감자에서 분리, 정제된 당단백질로부터 얻어진 당펩타이드를 기질로 하여 당사슬 절단 분석을 수행한 결과이다. 상기 도면에서 Positive: PNGase A 처리, Negative: 공벡터 배양액 처리, 4, 10, 34 및 37: 도 2b에서 재조합 PNGase Y의 발현이 확인된 피키아 파스토리스 형질전환체의 번호를 나타낸다. 이때 각 당사슬의 당은 미국 Consortium for Functional Glycomics(http://www.functionalglycomics.org/)에서 규정한 규정에 따라, 파란색 네모(■): N-아세틸글루코사민, 녹색 원(●): 만노스, 적색 세모(◀): 푸코스, 주황색 별(★): 자일로스로 나타내었다.
도 6은 본 발명에 따른 피키아 파스토리스 형질전환체에서 발현된 재조합 PNGase Y의 정제 도중에 수득된 분획을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. 상기 도면에서 M: 표준 단백질 마커, C: 배양 상층액, F: Ni-NTA 칼럼에 배양 상층액을 흘려 용출된 용액(flow through), W1: 상기 칼럼에 세척 완충액을 흘려 얻은 첫 번째 용출액, W2: 상기 칼럼에 세척 완충액을 흘려 얻은 마지막 용출액, E₁-E₅: 상기 칼럼에 용출 완충액을 흘려 얻은 용출액을 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따른 피키아 파스토리스 형질전환체로부터 분리, 정제된 재조합 PNGase Y의 당사슬 구조를 분석한 결과이다. 상기 도면에서 HEX: 헥소스, HEXNAC: N-아세틸헥소사민을 나타낸다.
도 8a 및 8b는 각각 본 발명에 따른 PNGase Y의 당사슬 절단 활성을 PNGase F 및 PNGase A와 비교하기 위하여 복합형 당사슬을 갖는 페투인(fetuin)과 고-만노스형(high-mannose type) 당사슬을 갖는 RNase B에 PNGase F, PNGase A 및 PNGase Y를 처리한 후 MALID-TOF를 이용하여 분석한 당사슬 프로파일을 나타낸 것이다. 상기 도면에서 파란색 네모(■): N-아세틸글루코사민, 녹색 원(●): 만노스, 적색 세모(◀): 푸코스, 노란색 원(○): 갈락토스, 다이아몬드(◆): 시알산을 나타낸다.
도 9a 및 9b는 각각 본 발명에 따른 PNGase Y의 기질 특이성을 PNGase F 및 PNGase A와 비교하기 위하여 만노스-6-인산이 부가된 당사슬을 갖는 알파-갈락토시다제(α-galactosidase)와 첫 번째 N-아세틸글루코사민에 α(1,3)-퓨코스가 부가된 당사슬을 갖는 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 PNGase F, PNGase A 및 PNGase Y를 처리한 후 MALID-TOF를 이용하여 분석한 당사슬 프로파일을 나타낸 것이다. 상기 도면에서 파란색 네모(■): N-아세틸글루코사민, 녹색 원(●): 만노스, 적색 세모(◀): 푸코스, 노란색 원(○): 갈락토스, 다이아몬드(◆): 시알산, 주황색 별(★): 자일로스를 나타낸다.
도 10a 및 10b는 각각 당단백질의 변성 조건 하에서 본 발명에 따른 PNGase Y의 당사슬 절단 활성을 분석하기 위해서 글루코스 옥시다제(GOD) 및 HRP를 변성시킨 후 PNGase F, PNGase A 및 PNGase Y를 처리하고 SDS-PAGE를 수행한 결과이다. 상기 도면에서 M: 표준 단백질 마커, N: 효소 무처리, F: PNGase F 처리, A: PNGase A 처리, Y: PNGase Y 처리를 나타낸다.
도 11a 및 11b는 각각 본 발명에 따른 PNGase Y의 당사슬 절단 활성에 있어 최적 온도 및 pH 조건을 조사한 결과이다. 도 10a는 동일 양의 PNGase Y를 처리하고 온도를 달리하여 반응시킨 후 분석한 결과이고, 도 10b는 각 pH 별로 PNGase Y의 활성을 분석한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정이 되는 것은 아니다.

실시예 1: 야로위아 리폴리티카( Yarrowia lipolytica ) 유래 펩티드-N-글리코시다제의 동정

본 발명의 야로위아 리폴리티카 유래 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y) 유전자는 N-결합형 당사슬 절단 활성을 갖는 아스페르질러스 니거(Aspergillus niger)의 펩티드-N-글리코시다제 아미노산 서열을 이용하여 야로위아 리폴리티카의 유전체 데이터베이스에 대해 NCBI/BLAST 조사를 수행하여 동정하였다.

본 발명에 따라 야로위아 리폴리티카로부터 새로이 동정된 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)는 당단백질의 N-결합형 당사슬을 절단하는 활성을 갖는 효소로, 서열번호: 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 서열은 야로위아 리폴리티카 유래 펩티드-N-글리코시다제를 코딩하는 1,938 bp의 뉴클레오티드 ORF(open reading frame)의 아미노산 서열을 나타내며, 총 645개의 아미노산을 포함하는 것이다. 이중 N-말단 부분의 30개의 아미노산 서열은 단백질을 세포 외로 분비시키는 신호서열(signal sequence)로 추정된다.

본 발명에 따른 야로위아 리폴리티카 유래 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)의 아미노산 서열을 종래의 펩티드-N-글리코시다제의 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, 식물인 아몬드(Almond) 및 토마토(Lycopersicum esruletum) 유래 펩티드-N-글리코시다제와는 각각 22% 및 19%의 동일성(각각 34% 및 30%의 상동성)을, 곰팡이류인 아스페르질러스 니거(Aspergillus niger) 및 아스페르질러스 오리제(Aspergillus oryzae) 유래 펩티드-N-글리코시다제와는 각각 23%의 동일성(각각 36% 및 35%의 상동성)을 나타내어, 본 발명에 따른 펩티드-N-글리코시다제(PNGase Y)가 종래 펩티드-N-글리코시다제와는 매우 낮은 서열 상동성을 나타내는 신규한 효소 단백질임을 확인하였다(도 1).

실시예 2: 야로위아 리폴리티카 유래 펩티드-N-글리코시다제의 클로닝 및 발현 확인

야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 균체의 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출 키트(Genomic DNA Extraction kit, 바이오니아)를 사용하여 추출하였다. 펩티드-N-글리코시다제의 분비 신호서열 부위를 제외한 효소활성 부위를 클로닝하기 위해 하기 서열번호: 1 및 2의 정방향 및 역방향 프라이머를 제작하였다.

PNGase Y-F: 5'-CGGAATTCATCATCAACACCTTCCAGGTC-3'(서열번호: 1)

PNGase Y-R: 5'-GCTCTAGACCGTGCTGATGAAGGCCGTTG-3'(서열번호: 2)

각각의 프라이머는 유전자 재조합을 위해 EcoR1과 Xba1 제한효소 인식부위를 포함하고 있다. 상기에서 분리한 야로위아 리폴리티카 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하였다. PCR은 주형 게놈 DNA 100 ng, 10 pM 프라이머 각각 2 ㎕씩, 10 mM dNTP 5 ㎕, Taq 중합효소 0.5 ㎕(Takara, Japan) 및 10× 완충액을 혼합하여 반응용액을 제조하고, 95℃에서 3분간의 초기 변성 후 95℃에서 30초, 62℃에서 40초 및 72℃에서 120초간의 증폭을 25회 수행하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시켰다.

이로부터 수득된 PCR 증폭산물을 정제 키트(QIAquick PCR purification Kit, Qiagen)를 이용하여 추출한 후 제한효소 EcoR1과 Xba1으로 처리하여 삽입 절편을 제조하였다. 이어서, pPICZα-A 벡터(Invitrogen)를 동일한 제한효소로 절단하고 동일한 정제 키트를 이용하여 추출하였다. 이와 같이 준비된 벡터에 상기 삽입 절편을 T4 리가아제를 이용하여 연결시켜 재조합 벡터 pPICZα-PNGase Y를 제조하였다(도 3).

도 3에 나타난 바와 같이, 재조합 벡터 pPICZα-PNGase Y는 그의 N-말단에는 알파-인자 신호서열이 연결되고 C-말단에는 6개 히스티딘 태그가 연결된, PCR로 증폭된 야로위아 리폴리티카 유래 PNGase Y 유전자 절편을 포함하고 있다. 상기 재조합 벡터 내 PNGase Y 유전자 절편은 AOX 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다.

상기 재조합 벡터 pPICZα-PNGase Y를 전기천공법(electrophoration)에 의해 형질전환용 대장균(Nova blue competent cell)에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균으로부터 추출 키트(QIAquick PCR purification Kit, Qiagen)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리한 후 제한효소 Xba1 및 HindIII를 처리하여 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다. 이로부터 1845 bp 크기의 삽입 DNA가 존재함을 확인하였고, 이어서 DNA 서열분석을 통하여 야로위야 리폴리티카 유래 펩티드-N-글리코시다제 유전자가 벡터에 올바르게 삽입되었음을 확인하였다.

서열분석 결과, 상기 재조합 벡터 pPICZα-PNGase Y에 클로닝된 PNGase Y 유전자 절편은 서열번호: 7로 기재되는 염기 서열을 가지며, 이로부터 코딩되는 재조합 PNGase Y는 서열번호: 8로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다.

상기 재조합 벡터 pPICZα-PNGase Y를 제한효소 Nsi1로 처리하여 선형(linear)으로 만든 후 전기천공법에 의해 피키아 파스토리스 GS115(Invitrogen)에 형질전환시켰다. 형질전환된 균주를 YPDS 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% D-글루코스, 1 M 솔비톨, 2% 한천, 100 ㎍/㎖ 지오신)에 도말하여 30℃에서 2-3일간 배양하여 콜로니(colony) 생성 여부를 확인하였다.

생성된 콜로니 중에서 재조합 PNGase Y의 발현량이 높은 콜로니를 스크리닝하기 위해서 His-tag 항체(Santa cruz)를 이용한 이스턴 블랏(Yeastern blot)을 수행하였다(James M, Cregg et al., Methods in exzymology, 463: 169-189, 2009)(도 4a). 간략히 설명하면, 형질전환을 통해 얻어진 여러 콜로니들을 지오신(100 ㎍/㎕)이 첨가된 YPDS 한천 배지에 일정한 간격으로 도말한 후 배양하였다. 해당 콜로니들이 자라면, 이를 멸균된 필터 페이퍼에 복제(replica)를 찍어내고 이를 다시 BMMY 한천 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 100 mM 인산칼륨 완충용액(pH 6.0), 1.34% YNB, 4×10-5% 마이오틴, 1% 메탄올)에 옮겨 30℃에서 72시간 동안 배양하였다. 배양된 콜로니가 있는 필터 페이퍼에 부착되어 있는 단백질들을 전기적 방법(전류 14 mA/㎠, ~50 V)을 이용하여 PVDF 막에 옮겼다. 상기 PVDF 막을 TBS 완충액(20 mM tris, 150 mM 염화나트륨)으로 1회 세척하고 3% BSA 함유 TBST 차단(blocking) 완충액으로 2시간 동안 처리하였다. 이어서 상기 PVDF 막에 일차 항체(항-HIS 항체, Santa cuze)를 1:1000의 비율로 2시간 동안 처리한 후 TBST 완충액(20 mM Tris, 150 mM 염화나트륨, 0.5% Tween 20)을 이용해 10분 간격으로 3회 세척하였다. 상기 PVDF 막에 이차 항체(항-마우스-HRP 항체, Santa cuze)를 1:5000의 비율로 1시간 동안 처리한 후, 다시 TBST를 이용해 5분 간격으로 6회 세척하였다. 이후 ECL 용액(GE Healthcare)을 이용해 상기 PVDF 막으로부터 표적 단백질을 검출하였다.

상기 이스턴 블랏을 통해서 1차 스크리닝된 콜로니들을 대상으로 웨스턴 블랏(Western blot)을 수행하여 단백질의 발현 정도 및 양상을 조사하여 재조합 PNGase Y의 발현량이 높은 콜로니 4, 10, 34 및 37을 최종 선발하였다. 간략히 설명하면, 10% SDS-PAGE를 통해 각 콜로니로부터 단백질을 분리하고, 전기적인 방법(80 V에서 45분)을 이용하여 PVDF 막에 옮겼다. 상기 PVDF 막에 5% 탈지유(skim milk) 함유 TBST 차단 완충액을 1시간 동안 처리한 후 일차 항체(항-HIS 항체, Santa cuze)를 1/1000의 비율로 1시간 동안 처리하였다. 이후 상기에서 기술한 이스턴 블랏과 동일한 세척 및 이차 항체 처리 과정을 거치고 ECL 방법을 이용해서 단백질의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, 최종 선발된 콜로니 4, 10, 34 및 37은 약 72 kDa의 재조합 단백질을 발현하여 배양액 내로 분비하고 있음을 알 수 있다.

실시예 3: 효모 배양액에 존재하는 PNGase Y의 당사슬 절단 활성 분석

상기 실시예 1에서 선발된 피키아 파스토리스 형질전환체의 배양액에 존재하는 재조합 PNGase Y가 당사슬 절단 활성을 나타내는지 여부를 확인하기 위해, 콜로니 4, 10, 34 및 37의 배양액을 기질인 감자 유래의 당단백질에서 얻은 당펩타이드에 처리하여 당사슬을 절단한 후 절단된 당사슬에 형광을 표지하여 DNA 시퀀서(sequencer)를 이용한 당사슬 분석을 수행하였다(Lee, Jung et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 380: 223-9, 2009).

감자의 괴경으로부터 획득한 당단백질 30 ㎍을 염산(HCl, pH 2.2) 완충액에 녹인 후 2 ㎕의 펩신(0.6 ㎍/㎕, Sigma)을 처리하고 37℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액을 100℃에서 5분간 끓여 반응을 종결시킨 후 원심건조기를 이용해 건조시켰다. 건조된 당펩타이드 시료를 100 mM 아세트산나트륨(sodium acetate, pH 5.0) 완충액에 녹인 후 0.5 mU의 PNGase A(Roche) 또는 1 ㎍의 총 단백질을 포함하는 콜로니 4, 10, 34 및 37의 배양액 각각을 첨가하고 37℃에서 12시간 동안 반응시켰다.

PNGase 반응에 의해 절단된 당사슬은 흑연화 탄소 칼럼(graphitized carbon resin from carbograph, Alltech)을 이용해 반응액으로부터 분리하였다. 분리된 당사슬에 형광을 표지하기 위해 20 mM APTS(8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid, Invitrogen)가 용해된 1.2 M의 구연산(citric acid, Sigma) 용액과 1 M 시아노브롬하이드리드(cyanoborohydride, Sigma)가 용해된 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO, Sigma)를 1:1 비율로 혼합하여 ATPS 용액을 준비하였다. 분리된 당사슬에 1 ㎕의 APTS 용액을 넣고 37℃에서 8시간 이상 반응시켰다. 반응액에 정제수 4 ㎕를 첨가하여 반응을 종결시킨 후 APTS가 표지된 당사슬을 세파덱스 G10 칼럼(sephadex G10, GE Healthcare)을 이용하여 정제하였다. 정제된 당사슬을 원심건조기를 통해 건조시킨 후 -20℃에서 보관하거나 바로 다음 실험에 사용하였다. APTS가 표지된 당사슬은 5 ㎕ 정제수에 녹여 사용하되 분석 시 1/20의 비율로 정제수로 희석한 후 96-웰 플레이트(96-well plate)에 분주하였다. 상기 웰 플레이트를 ABI3130 시퀀서(ABI 3130 sequencer, Applied biosystems)를 이용해 분석하고 진맵퍼 소프트웨어(Gnen Mapper software, Applied Biosystems)를 사용하여 결과를 해석하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 피키아 파스토리스 형질전환체로부터 발현되어 배양액 내로 분비된 재조합 PNGase Y가 종래 아몬드 유래 PNGase A와 같이 식물 유래 당단백질의 당사슬을 절단할 수 있음을 확인하였다. 이들 중 가장 우수한 당단백질 절단 활성을 나타낸 콜로니 34를 피키아 파스토리스 GS115-PNGaseY로 명명하고 2011년 11월 11일자로 한국생명공학연구원(KRIBB) 내 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 제KCTC12067BP호로서 기탁하였다.

실시예 4: 야로위아 리폴리티카 유래 PNGase Y의 분리 및 정제

상기 실시예 2에서 선발된 형질전환체 효모로부터 재조합 PNGase Y를 분리 및 정제하기 위해, 피키아 파스토리스 GS115-PNGaseY를 YPD 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% D-글루코스)에 접종하고 30℃에서 10시간 이상 전 배양을 수행하였다. 전 배양액을 1/100의 부피 비로 BMMY 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 100 mM 인산칼륨, 2% 바이오틴, 1% 메탄올)에 접종하고 30℃에서 72시간 동안 본 배양을 수행하였다. 본 배양 후 원심분리를 통해 균체를 제거하고 분비된 재조합 단백질을 포함하는 배양액만을 회수하였다.

한편, 오픈 칼럼에 Ni-NTA 수지(1.5×1 ㎝, Qaigen)를 패킹하고 10배 이상 칼럼 부피의 정제수로 패킹된 Ni-NTA 칼럼을 세척한 후 0.5 M 염화나트륨(NaCl) 함유 50 mM의 인산이수소나트륨(NaH₂PO₄) 완충액(pH 7.5)으로 평형화시켰다. 이렇게 준비된 Ni-NTA 칼럼에 원심분리를 통해서 회수한 배양액을 주입하고, 흘러나온 배양액을 2회 이상 반복 주입하여 재조합 단백질이 칼럼에 흡착하는 효율을 높였다. 10배 이상 칼럼 부피의 20 mM 이미다졸(imidazole) 및 0.5 M 염화나트륨 함유 50 mM의 인산이수소나트륨 완충액(pH 7.5)으로 Ni-NTA 칼럼을 세척한 후 500 mM 이미다졸 및 0.5 M 염화나트륨 함유 50 mM의 인산이수소나트륨 완충액(pH 7.5)을 흘려 Ni-NTA 칼럼에 흡착되어 있던 재조합 PNGase Y를 용출시켰다.

상기 각 단계에서 용출된 분획을 SDS-PAGE로 분석하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 재조합 PNGase Y가 Ni-NTA 칼럼에 의해 효과적으로 분리, 정제되었음을 확인하였다.

이렇게 분리, 정제된 재조합 단백질로부터 투석을 통해 염을 제거하고 원심분리 필터 장치(Amicon Ultra centrifugal filter device, Qaigen)를 이용해 농축한 후 통상적인 방법에 따라 당사슬 분석을 수행하였다(Plummer and Tarentino, Glycobiology, 1: 257-63, 1991). 그 결과, 본 발명에 따른 야로위아 리폴리티카 유래 PNGase Y는 효모에서 발현된 당단백질로서 고-만노스형의 N-결합형 당사슬을 가지고 있음을 확인하였다 (도 7).

실시예 5: 야로위아 리폴리티카 유래 PNGase Y의 N-결합형 당사슬 절단 활성 분석

본 발명에 따른 야로위야 리폴리티가 유래 PNGase Y의 N-결합형 당사슬 절단 활성을 분석하기 위해 다양한 당단백질을 기질로 하여 하기 실험을 수행하였다.

본 실험에는 고-만노스형 당사슬을 갖는 RNase B(Ribonuclease B from bovine pancreas, Sigma) 및 GOD(glucose oxidase, Sigma); 복합형 당사슬을 갖는 페투인(fetuin, Sigma); 첫 번째 N-아세틸글루코사민에 α(1,3)-퓨코스가 부가된 당사슬을 갖는 HRP(horseradish peroxidase from Armoracia rusticana, type V, Sigma); 및 만노스-6-인산이 부가된 당사슬을 갖는 α-갈락토시다제(α-galactosidase)를 당단백질 기질로 사용하였다.

준비된 당단백질에 0.1% 라피게스트(RapiGest, Waters) 20 ㎕를 첨가하여 혼합한 후 10 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol) 함유 50 mM 중탄산암모늄(ammonium bicarbonate, pH 8.0) 완충액을 첨가하고 60℃에서 30분간 반응시켰다. 반응이 종결된 후 반응액을 상온에서 식히고 15 mM 요오드아세트아미드 함유 50 mM 중탄산암모늄 완충액(pH 8.0)을 첨가하여 암 조건, 상온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 종결된 당단백질 시료를 100℃에서 5분간 끓여준 후 건조시켰다. 건조된 당단백질 시료를 50 mM 중탄산암모늄 완충액(pH 8.0)에 녹인 후 1:50의 농도비로 트립신(trypsin, Promega)을 처리하고 37℃에서 16시간 이상 반응시켰다. 반응액을 100℃에서 5분간 끓여 반응을 종결시킨 후 원심건조기(speed vac drier)를 이용하여 건조시켰다. 이렇게 준비된 각각의 시료 20 ㎍에 PNGase Y, PNGase A 및 PNGase F를 각각 처리하고 37℃에서 12시간 이상 반응시켰다.

각 PNGase 효소별 처리 조건은 다음과 같다. PNGase A(Rhoch)는 100 mM 아세트산나트륨(sodium acetate, pH 5.0) 완충액에 0.5 mU으로 녹여 처리하였다. PNGase Y는 피키아 파스토리스 GS115-PNGaseY로부터 분리, 정제된 재조합 단백질 0.5 ㎍을 동일 완충액에 녹여 처리하였다. PNGase F(NEB) 처리 시에는, 당단백질을 5% SDS 및 0.4 M DTT 함유 완충액에 녹이고 100℃에서 5분간 끓여 단백질을 변성시킨 후 0.5 M 인산나트륨(sodium phosphate, pH 7.5) 완충액과 함께 65 단위(unit)의 PNGase F를 처리하였다.

PNGase 반응에 의해서 당단백질로부터 절단된 당사슬을 흑연화 탄소 칼럼(Alltech)을 이용해 반응액으로부터 정제하였다. 상기 칼럼에 10배 칼럼 부피의 0.1% TFA(trifluoroacetic acid) 함유 80% 아세토니트릴(acetonitrile) 완충액을 흘린 후, 다시 10배 칼럼 부피의 정제수로 평형화시켰다. 이어서 준비된 효소 반응액을 상기 칼럼에 흘려주고 5배 칼럼 부피의 정제수를 흘려 시료를 세척한 후 0.075% TFA 함유 25% 아세토니트릴 용출 완충액을 흘려 당사슬을 용출하였다(Morelle and Michalski, Nat. Protoc., 2: 1585-602, 2007). 정제된 당사슬은 건조시켜 -20℃에서 보관하거나 바로 다음 실험에 사용하였다.

수산화나트륨(NaOH) 비드(bead)를 이용해 정제된 당사슬의 고체상 퍼메틸화(solid phase permethylation)를 수행하였다(Goetz, Novotny et al., Anal. Chem., 81: 9546-52, 2009). 건조된 당사슬을 2.7 ㎕의 정제수, 35 ㎕의 아이오도메탄올(iodomethane), 90 ㎕의 DMSO를 이용해 용해시켰다. 한편, 수산화나트륨 비드를 스핀 칼럼에 3 ㎝ 정도 패킹하여 준비하였다. 상기 스핀 칼럼에 DMSO를 150 ㎕씩 2회 반복하여 흘려주고 앞서 준비한 당사슬 시료 용액을 흘려주었다. 이때 시료는 원심분리기를 이용하여 400 ×g에서 2분간 8회 반복하여 흘려주었다. 여기에 150 ㎕의 아세토니트릴을 흘려 칼럼을 세척하고 용출액을 회수하였다. 회수한 용출액에 400 ㎕의 클로로포름(chloroform)과 1 ㎖의 염화나트륨(500 mM)을 첨가하여 섞은 후 400 ×g에서 2분간 원심분리를 통해 층을 분리시켰다. 층 분리를 통해 상층액을 제거한 후 다시 1 ㎖의 염화나트륨(500 mM)을 첨가하여 섞은 후 원심분리를 통해 상층액을 제거하고 클로로포름 층을 건조시켜 시료를 준비하였다.

이렇게 준비된 당사슬 시료에 대해 MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight) 질량분광계(Bruker Daltonik GmbH)를 이용하여 당사슬 구조 분석을 수행하였다(Goetz, Novotny et al., Anal. Chem., 81: 9546-52, 2009). 먼저 당사슬 시료를 4 ㎕의 50% 메탄올에 녹이고 10 ㎎/㎖의 DHB(2,5-dihydroxybenzoic acid)가 1 mM 아세트산나트륨 용액에 녹아 있는 매트릭스 용액과 1:1의 비율로 혼합하였다. 준비된 당사슬-매트릭스 혼합 용액을 MSP 96 연마 스틸 칩(polished steel chip) 위에 올려 건조시킨 후 상기 칩을 MALDI-TOF 질량분광계에 장착하여 제조사에서 권장하는 분석 조건에 따라 분석을 수행하였다.

한편, 만노스-6-인산이 부가된 당사슬의 구조 분석을 위해서는 상기와 동일한 당사슬 절단 및 정제과정을 수행한 후 고체상 퍼메틸화 대신에 2-아미노벤조산(2-aminobenzoic acid) 형광 염료를 표지한 후 수행하였다. 형광의 표지, 표지된 당사슬의 정제 및 분석은 문헌에 발표된 방법에 따라 수행하였다(Anumula and Dhume, Glycobiology, 8: 685-94, 1998).

그 결과, 본 발명의 야로위아 리폴리티카 유래 PNGase Y는 PNGase F 및 PNGase A와 같이 복합형 당사슬을 갖는 페투인(도 8a) 및 고-만노스형 당사슬을 갖는 RNase B(도 8b)에 대해 N-결합형 당사슬 절단 활성을 나타내었다. 뿐만 아니라, 본 발명의 PNGase Y는 만노스-6-인산이 2개 부가된 당사슬이 포함된 알파-갈락토시다제(도 9a)와 첫 번째 N-아세틸글루코사민에 α(1,3)-퓨코스가 부가된 당사슬을 갖는 HRP(도 9b)의 N-결합형 당사슬을 절단하는 활성을 나타내었다. 결과적으로, 본 발명의 PNGase Y는 PNGase A와 같이 동물 유래 복합형 및 고-만노스형 당사슬뿐만 아니라 만노스-6-인산이 2개 부가된 당사슬과 첫 번째 N-아세틸글루코사민에 α(1,3)-퓨코스가 부가된 식물 및 곤충 유래 N-결합형 당사슬에 대해서도 우수한 절단 활성을 나타내어 매우 광범위한 기질 특이성을 가짐을 알 수 있다.

실시예 6: 당단백질 변성 조건에서 N-결합형 당사슬 절단 활성 분석

PNGase F는 당단백질을 단순히 변성시키는 조건에서 당사슬의 절단이 가능하지만, PNGase A는 당단백질을 변성시킨 후에도 펩티드로 분해하는 전처리 단계를 필요로 한다. 이에 본 발명의 야로위아 리폴리티카 유래 PNGase Y가 PNGase A와 같이 당단백질을 펩티드로 분해하는 전처리 단계를 요구하는지, 아니면 단순 변성 조건에서 당사슬의 절단이 가능한지를 확인하기 위해 하기 실험을 수행하였다.

실시예 4에 개시된 N-결합형 당사슬 절단 활성 분석에서 당단백질에 트립신을 처리하여 펩티드로 전환하는 과정을 생략하였다. 구체적으로, 고-만노스형 당사슬을 갖는 GOD에 10 mM DTT 함유 중탄산암모늄 완충액(pH 8.0)을 첨가하고 60℃에서 30분간 반응시킨 후 상온에서 식히고 15 mM 요오드아세트아미드 함유 중탄산암모늄 완충액(pH 8.0)을 첨가하여 암 조건, 상온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 종결된 당단백질에 5% SDS 및 0.4 M DTT 함유 완충액을 첨가하고 100℃에서 5분간 끓여 단백질을 변성시켰다. 변성된 당단백질 시료에 본 발명의 PNGase Y와 PNGase A는 실시예 4와 동일한 양으로 100 mM 아세트산나트륨(pH 5.0) 완충액에서 처리하고 37℃에서 12시간 이상 반응시켰다.

한편, 첫 번째 N-아세틸글루코사민에 α(1,3)-퓨코스가 부가된 HRP는 전처리 단계 없이 5% SDS 및 0.4 M DTT 함유 완충액을 첨가하고 100℃에서 5분간 끓여 변성시킨 후 GOD와 동일하게 본 발명의 PNGase Y와 PNGase A를 처리하였다.

또한, 변성된 당단백질 시료 GOD 및 HRP 각각에 0.5 M 인산나트륨(pH 7.5) 완충액과 함께 65 단위의 PNGase F를 동일 온도와 시간으로 처리하였다.

반응을 종결시키고 당단백질 시료를 SDS-PAGE용 시료 로딩 완충액(sample loading buffer)과 섞은 후 100℃에서 5분간 끓여주었다. 상기 당단백질 시료를 상온에서 식힌 후 8% SDS-PAGE를 이용해 단백질을 분리하였다.

그 결과, 도 10a 및 10b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 PNGase Y는 PNGase F와 같이 당단백질을 단순 변성시키는 조건 하에서도 당사슬을 효과적으로 절단할 수 있어서, PNGase A와 같이 당단백질을 펩티드로 분해하는 전처리 단계를 거칠 필요가 없음을 확인하였다.

실시예 7: 야로위아 리폴리티카 유래 PNGase Y의 최적 반응조건 분석

본 발명에 따른 야로위아 리폴리티카 유래 PNGase Y의 최적 반응조건을 분석하기 위해 하기 실험을 수행하였다.

50 mM 중탄산암모늄 완충액(pH 8.0) 중에서 당단백질 RNase B(Sigma)에 2 ㎍/㎕의 프로네이즈(Pronase, Sigma)를 첨가하고 40℃에서 48시간 동안 처리하여 당펩티드 상태로 유도하였다. 반응이 종결된 후 프로네이즈 등을 제거하고 흑연화 탄소 칼럼(Alltech)을 이용해 반응액으로부터 당펩티드를 회수하였다. 상기 칼럼에 10배 칼럼 부피의 0.1% TFA 함유 80% 아세토니트릴 완충액을 흘린 후, 10배 칼럼 부피의 정제수로 평형화시켰다. 이어서 상기에서 준비한 RNase B로부터 유도된 당펩티드 용액을 칼럼에 흘려주었다. 상기 칼럼에 5배 칼럼 부피의 정제수를 흘려 시료를 세척하고 0.075% TFA 함유 25% 아세토니트릴 용출 완충액을 당펩티드를 용출하였다(Morelle and Michalski, Nat. Protoc., 2: 1585-602, 2007).

용출된 당펩티드의 농도는 펩타이드에 부착되어 있는 당사슬의 성분당의 함량 분석을 통해 확인할 수 있다. 이를 위해서 건조된 당펩티드를 20% TFA에 녹이고 99℃에서 7시간 동안 성분당을 가수분해하였다. 반응이 종결된 후 반응액을 건조시켜 시료를 준비하였다. 분리된 단당류와 실험에 사용되는 표준품(monosaccharides standard mix, DIONEX)을 동량의 정제수에 녹이고 HPLC 분석을 위해 AA(anthranilic acid, Sigma) 용액으로 형광을 표지하였다. AA 용액(30 mg/mL in 4% sodium acetate·3H2O and 2% boric acid in methanol)을 표준품과 분리된 단당류 시료에 2:1(v/v)의 비율로 섞은 후 80℃에서 45분간 반응시켰다. 반응이 종결된 시료를 실온에서 식힌 후, 용액 A[0.2% (v/v) 1-butylamine, 0.5% (v/v) phosphoric acid, 1.0% (v/v) tetrahydrofuran(THF) in HPLC water]를 시료의 약 5배 부피(v/v)로 혼합하고 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 150 ㎕의 상층액을 분석용 바이알로 옮기고 시메트리 C18(Symmetry C18, 4.6×150 mm, 5 ㎛, Waters) 칼럼을 사용하여 중성단당류 분석을 진행하였다(Anumula et al., Anal. Biochem., 220: 275-83, 1994).

HPLC 분석 시 이동상으로 용액 A와 용액 B[solvent A:acetonitrile (ACN)=1:1]를 1 ㎖/분의 유속으로 95:5에서 25분간 흘려준 후, 85:15까지 25분간 구배 조건으로 흘려주었다. 워터스(Waters) HPLC와 2475 형광 검출기를 사용하여 여기 파장 360 nm, 방출 파장 425 nm에서 분석을 수행하였다. HPLC 분석 후 단당류(monosaccharides) 표준품 피크에서 얻은 면적 값으로 정량곡선을 그린 후 이로부터 각 중성단당류의 농도를 구하였다. 고-만노스형 당사슬의 경우 1몰의 당펩티드 당 N-아세틸글루코사민이 2몰의 비율로 포함되어 있다는 사실을 근거로 RNaseB의 당펩티드 농도를 계산하였다.

이렇게 얻어진 당펩티드를 기질로 이용하여 본 발명의 PNGase Y가 최적의 활성을 보이는 온도와 pH를 조사하였다. 우선, 최적의 온도를 찾기 위해서 25℃부터 50℃까지 온도 조건을 달리한 상태에서 0.12 μM 당펩티드에 0.05 ㎍/㎕의 PNGase Y를 20 mM 암모늄아세테이트(Sigma) 완충액 중에서 처리한 후 30분간 반응시켰다. 반응액을 100℃에서 5분간 끓여 반응을 종결시킨 후 MALDI-TOF 질량분광계(Bruker Daltonik GmbH)를 이용하여 질량 분석을 수행하였다.

질량 분석을 위해 최종적으로 건조된 시료에 5 ㎕의 정제수를 첨가하여 녹이고 5 ㎎/㎖의 DHB(2,5-dihydroxybenzoic acid)가 TA30(0.1% TFA, 30% 아세토니트릴) 용액에 용해되어 있는 매트릭스 용액과 1:1 비율로 혼합하였다(Goetz, Novotny et al., Anal. Chem., 81: 9546-52, 2009). 준비된 당사슬-매트릭스 혼합 용액을 MSP 96 연마 스틸 칩(polished steel chip) 위에 올려 건조시킨 후 상기 칩을 MALDI-TOF 질량분광계에 장착하여 제조사에서 권장하는 분석 조건에 따라 분석을 수행하였다. PNGase Y의 당사슬 절단 활성은 각 반응 조건에서 당펩티드에서 당사슬이 분리된 비율로부터 계산하였으며, 그 결과 본 발명의 PNGase Y는 30℃ 내지 40℃의 온도 범위에서 가장 높은 절단 활성을 보였다(도 11a).

최적의 pH 조건을 확인하기 위해서, 해당 pH별 완충액을 사용하여 반응을 수행 하였다. 사용한 완충액 조건은 다음과 같다. pH 2: 10 mM 염산(HCl); pH 3-4: 10 mM 사이트레이트(citrate); pH 5-6: 10 mM 염화아세테이트(sodium acetate); 및 pH 7: 10 mM HEPES 완충액. 상기 완충액을 이용한 다양한 pH 조건에서 PNGase Y의 당사슬 절단 활성을 분석하였으며, 이때 온도는 37℃로 고정하고 이외의 조건은 상기의 온도 실험과 동일하게 수행하였다. 반응이 종결된 시료는 상기와 동일하게 100℃에서 5분간 두어 효소의 활성을 정지시키고 흑연화 탄소 칼럼(Alltech)을 이용해 분리하였다. 그 결과, 본 발명의 PNGase Y는 pH 5에서 가장 최적의 절단 활성을 나타내었다(도 11b).

한국생명공학연구원 KCTC12067BP 20111111

<110> Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology Wonkwang University Center For Industry-Academy Cooperation <120> Peptide-N-Glycosidase Derived From Yarrowia Lipolytica And Use Therof <130> PA110822/KR <150> KR10-2010-0115098 <151> 2010-11-18 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNGase Y-forward primer <400> 1 cggaattcat catcaacacc ttccaggtc 29 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNGase Y-reverse primer <400> 2 gctctagacc gtgctgatga aggccgttg 29 <210> 3 <211> 1938 <212> DNA <213> peptide-N-glycosidase derived from Yarrowia lipolytica (PNGase Y) <220> <221> CDS <222> (1)..(1935) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(90) <400> 3 atg aag ctc ttt cac tct ctt tcc gca tgc ttg ctt gcc tca gta gcg 48 Met Lys Leu Phe His Ser Leu Ser Ala Cys Leu Leu Ala Ser Val Ala 1 5 10 15 ctg gcc gct cct gtg gtg gac cta gct tct cga gac cag cag atc atc 96 Leu Ala Ala Pro Val Val Asp Leu Ala Ser Arg Asp Gln Gln Ile 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Ala Phe Pro Tyr Pro Val Val Tyr Thr Gly 275 280 285 Gly Ile Ser Pro Tyr Phe Trp Thr Pro Ile Val Ser Pro Gln Ala Phe 290 295 300 Asp Gly Pro Ser Tyr Arg Val Asp Val Thr Pro Phe Leu Pro Trp Leu 305 310 315 320 Trp Gln Gly Ile Glu Ile Glu Leu Lys Leu Thr Ala Gln Tyr Thr Asp 325 330 335 Lys Pro Gln Asn Ala Gln Gln Asn Trp Phe Val Thr Gly Ala Leu Leu 340 345 350 Ala Trp Thr Glu Leu Gly Leu Gln Gly Ser Gly Asn Val Tyr Val Ala 355 360 365 Asp Asn Thr Pro Thr Tyr Thr Pro Ala Trp Asn Lys Leu Ser Asn Ser 370 375 380 Asp Met Val Gln Val Ser His Val Asn Arg Val Val Lys Val Met Ser 385 390 395 400 Gln Leu Gln Phe Ser Ser Pro Arg Gly Asn Leu Asn Ala Gln Val Thr 405 410 415 Trp Asn Gln Asn Gly Ile Ser Ser Asn Ile Gln Tyr Tyr Thr Ser Ser 420 425 430 Ser Gln Ala Val Leu Gln Ser Thr Lys Gly Ser Asp Ser Leu Glu Val 435 440 445 Val Leu Asn Gly Asn Thr Gln Thr Val Trp Asn Ala Ser Tyr Phe Tyr 450 455 460 Pro Val Val Leu Asn Thr Ile Gln Gln Gly Lys Val Ala Asn Ser Asp 465 470 475 480 Ile Val Thr Gly Tyr Asp 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Gly Leu Gln Gly Gln Phe Asp Thr 115 120 125 aac ttc ttc att gag ttc ctc aag agc gga gac gga ccc cac cct ggt 432 Asn Phe Phe Ile Glu Phe Leu Lys Ser Gly Asp Gly Pro His Pro Gly 130 135 140 acc cag atc gga gga gct ctt act tgg aat tac gga acc gga ggc gac 480 Thr Gln Ile Gly Gly Ala Leu Thr Trp Asn Tyr Gly Thr Gly Gly Asp 145 150 155 160 tac ttc cga cct gcc gac gtg gtc cat ggc ctg tcc aag ggc aac gga 528 Tyr Phe Arg Pro Ala Asp Val Val His Gly Leu Ser Lys Gly Asn Gly 165 170 175 gac tcg tac tct ttc ccc gac gat act gcc aag act tcc atc cag ctg 576 Asp Ser Tyr Ser Phe Pro Asp Asp Thr Ala Lys Thr Ser Ile Gln Leu 180 185 190 cct cga aac acc act cga gca gtt gtg gag atc cat gcg tcc gga aac 624 Pro Arg Asn Thr Thr Arg Ala Val Val Glu Ile His Ala Ser Gly Asn 195 200 205 tcc aac gaa gag ttc tgg tac acc aac atg ttc aac gag ctg tct ggc 672 Ser Asn Glu Glu Phe Trp Tyr Thr Asn Met Phe Asn Glu Leu Ser Gly 210 215 220 cag gat gga gac gga aac gga ggt ccc agt cga att gtg gag gtc tgg 720 Gln Asp Gly Asp Gly Asn Gly Gly Pro Ser Arg Ile Val Glu Val Trp 225 230 235 240 atc gga ggg aga ctc gct ggc gtg gcc ttc cct tac ccc gtt gta tac 768 Ile Gly Gly Arg Leu Ala Gly Val Ala Phe Pro Tyr Pro Val Val Tyr 245 250 255 act gga ggc atc tcg cct tac ttc tgg acc ccc att gtg tct ccc caa 816 Thr Gly Gly Ile Ser Pro Tyr Phe Trp Thr Pro Ile Val Ser Pro Gln 260 265 270 gcg ttc gac ggc ccc tcc tac cga gtg gac gtg acg ccc ttc ctg ccc 864 Ala Phe Asp Gly Pro Ser Tyr Arg Val Asp Val Thr Pro Phe Leu Pro 275 280 285 tgg ttg tgg cag gga att gag att gag ctc aag ctc acc gct cag tac 912 Trp Leu Trp Gln Gly Ile Glu Ile Glu Leu Lys Leu Thr Ala Gln Tyr 290 295 300 acc gac aag ccc cag aac gcg caa cag aac tgg ttt gtg acc ggc gct 960 Thr Asp Lys Pro Gln Asn Ala Gln Gln Asn Trp Phe Val Thr Gly Ala 305 310 315 320 ctg ctg gcc tgg acc gag ttg ggt ctg cag ggc tcc ggc aat gtg tat 1008 Leu Leu Ala Trp Thr Glu Leu Gly Leu Gln Gly Ser Gly Asn Val Tyr 325 330 335 gtg gca gat aac acc ccc acc tac act ccg gcc tgg aac aag ctg tcc 1056 Val Ala Asp Asn Thr Pro Thr Tyr Thr Pro Ala Trp Asn Lys Leu Ser 340 345 350 aac tcg gac atg gtg cag gtg tcg cac gtg aac cgg gtc gtc aag gtc 1104 Asn Ser Asp Met Val Gln Val Ser His Val Asn Arg Val Val Lys Val 355 360 365 atg tct cag ctg cag ttt tct tct ccc cgt ggc aac ctc aac gcc cag 1152 Met Ser Gln Leu Gln Phe Ser Ser Pro Arg Gly Asn Leu Asn Ala Gln 370 375 380 gtc acc tgg aac cag aac gga atc tcc agc aac atc cag tac tac act 1200 Val Thr Trp Asn Gln Asn Gly Ile Ser Ser Asn Ile Gln Tyr Tyr Thr 385 390 395 400 tcg tct tct cag gct gtt ctg cag agc acc aag ggt tcg gat tcg ctg 1248 Ser Ser Ser Gln Ala Val Leu Gln Ser Thr Lys Gly Ser Asp Ser Leu 405 410 415 gag gtt gtg ctc aat ggc aac acc cag act gtg tgg aac gcc tcg tac 1296 Glu Val Val Leu Asn Gly Asn Thr Gln Thr Val Trp Asn Ala Ser Tyr 420 425 430 ttt tac ccc gtt gtc ctc aac acc att cag cag ggt aag gtg gcc aac 1344 Phe Tyr Pro Val Val Leu Asn Thr Ile Gln Gln Gly Lys Val Ala Asn 435 440 445 tcc gac att gtc acc ggt tac gac cga gtc aag act gga gtt gcc tac 1392 Ser Asp Ile Val Thr Gly Tyr Asp Arg Val Lys Thr Gly Val Ala Tyr 450 455 460 gag cga acc gta ctc aac gct acc tcg cag atg ggt ggc gac tcg tct 1440 Glu Arg Thr Val Leu Asn Ala Thr Ser Gln Met Gly Gly Asp Ser Ser 465 470 475 480 tgg ggc aca acc tac cag tcg tac tgg cga tct cta gct gga gcc tac 1488 Trp Gly Thr Thr Tyr Gln Ser Tyr Trp Arg Ser Leu Ala Gly Ala Tyr 485 490 495 gac gtg cct tcc aac tac gat gcc acc tac tac tcc gag gag gcc cag 1536 Asp Val Pro Ser Asn Tyr Asp Ala Thr Tyr Tyr Ser Glu Glu Ala Gln 500 505 510 gcc gac cac ggc aac ctg cag tac cga aac ccc agt tcg tcg gga tct 1584 Ala Asp His Gly Asn Leu Gln Tyr Arg Asn Pro Ser Ser Ser Gly Ser 515 520 525 gca acc tcc ttt aag gat ggc agc gtg ctg gac acc atc aat cac tac 1632 Ala Thr Ser Phe Lys Asp Gly Ser Val Leu Asp Thr Ile Asn His Tyr 530 535 540 acg gat ctc gtg ttc gcc agt ggc aac aac cag gac ccc tgg gcg ttt 1680 Thr Asp Leu Val Phe Ala Ser Gly Asn Asn Gln Asp Pro Trp Ala Phe 545 550 555 560 gct aca gca ctg tcc aac gtg atc aag gct ctg gga tac tct ccc gcc 1728 Ala Thr Ala Leu Ser Asn Val Ile Lys Ala Leu Gly Tyr Ser Pro Ala 565 570 575 gag atc ccg tcc tcc tcc aac gac aag tcg ttt gcc atc cag tcg ggt 1776 Glu Ile Pro Ser Ser Ser Asn Asp Lys Ser Phe Ala Ile Gln Ser Gly 580 585 590 gga gat tcg gac tcc aac gcc ggc cct tac cga atc gtc ttc tcc ggc 1824 Gly Asp Ser Asp Ser Asn Ala Gly Pro Tyr Arg Ile Val Phe Ser Gly 595 600 605 ggc aac ggc ctt cat cag cac tag 1848 Gly Asn Gly Leu His Gln His 610 615 <210> 6 <211> 615 <212> PRT <213> peptide-N-glycosidase derived from Yarrwia lipolitica (PNGase Y) <400> 6 Ile Ile Asn Thr Phe Gln Val Thr Gly Pro Asn Ile Gln Leu Glu Ser 1 5 10 15 Val Asp Lys Ile His Leu Trp Gln His Thr Phe Ala Asn Ser Tyr Gly 20 25 30 Ala Pro Lys Val Ala Gln Tyr Thr Pro Pro Asn Gln Asp Phe Asp Arg 35 40 45 Val Arg Leu Ser Tyr Asn Ser Ser Val Thr Thr Thr Gln Tyr Asp Arg 50 55 60 Leu Ile Gln Val Phe Val Gly Asp Thr Glu Val Trp Arg Ser Ser Thr 65 70 75 80 Ala Glu Pro Val Gly Ser Pro Leu Val Gln Phe Gly Phe Glu Lys Asp 85 90 95 Val Ser Glu Tyr Leu Ala Leu Phe Lys Glu Pro Gln Thr Ile Thr Phe 100 105 110 Val Leu Gly Asn Val Val Gln Asp Gly Leu Gln Gly Gln Phe Asp Thr 115 120 125 Asn Phe Phe Ile Glu Phe Leu Lys Ser Gly Asp Gly Pro His Pro Gly 130 135 140 Thr Gln Ile Gly Gly Ala Leu Thr Trp Asn Tyr Gly Thr Gly Gly Asp 145 150 155 160 Tyr Phe Arg Pro Ala Asp Val Val His Gly Leu Ser Lys Gly Asn Gly 165 170 175 Asp Ser Tyr Ser Phe Pro Asp Asp Thr Ala Lys Thr Ser Ile Gln Leu 180 185 190 Pro Arg Asn Thr Thr Arg Ala Val Val Glu Ile His Ala Ser Gly Asn 195 200 205 Ser Asn Glu Glu Phe Trp Tyr Thr Asn Met Phe Asn Glu Leu Ser Gly 210 215 220 Gln Asp Gly Asp Gly Asn Gly Gly Pro Ser Arg Ile Val Glu Val Trp 225 230 235 240 Ile Gly Gly Arg Leu Ala Gly Val Ala Phe Pro Tyr Pro Val Val Tyr 245 250 255 Thr Gly Gly Ile Ser Pro Tyr Phe Trp Thr Pro Ile Val Ser Pro Gln 260 265 270 Ala Phe Asp Gly Pro Ser Tyr Arg Val Asp Val Thr Pro Phe Leu Pro 275 280 285 Trp Leu Trp Gln Gly Ile Glu Ile Glu Leu Lys Leu Thr Ala Gln Tyr 290 295 300 Thr Asp Lys Pro Gln Asn Ala Gln Gln Asn Trp Phe Val Thr Gly Ala 305 310 315 320 Leu Leu Ala Trp Thr Glu Leu Gly Leu Gln Gly Ser Gly Asn Val Tyr 325 330 335 Val Ala Asp Asn Thr Pro Thr Tyr Thr Pro Ala Trp Asn Lys Leu Ser 340 345 350 Asn Ser Asp Met Val Gln Val Ser His Val Asn Arg Val Val Lys Val 355 360 365 Met Ser Gln Leu Gln Phe Ser Ser Pro Arg Gly Asn Leu Asn Ala Gln 370 375 380 Val Thr Trp Asn Gln Asn Gly Ile Ser Ser Asn Ile Gln Tyr Tyr Thr 385 390 395 400 Ser Ser Ser Gln Ala Val Leu Gln Ser Thr Lys Gly Ser Asp Ser Leu 405 410 415 Glu Val Val Leu Asn Gly Asn Thr Gln Thr Val Trp Asn Ala Ser Tyr 420 425 430 Phe Tyr Pro Val Val Leu Asn Thr Ile Gln Gln Gly Lys Val Ala Asn 435 440 445 Ser Asp Ile Val Thr Gly Tyr Asp Arg Val Lys Thr Gly Val Ala Tyr 450 455 460 Glu Arg Thr Val Leu Asn Ala Thr Ser Gln Met Gly Gly Asp Ser Ser 465 470 475 480 Trp Gly Thr Thr Tyr Gln Ser Tyr Trp Arg Ser Leu Ala Gly Ala Tyr 485 490 495 Asp Val Pro Ser Asn Tyr Asp Ala Thr Tyr Tyr Ser Glu Glu Ala Gln 500 505 510 Ala Asp His Gly Asn Leu Gln Tyr Arg Asn Pro Ser Ser Ser Gly Ser 515 520 525 Ala Thr Ser Phe Lys Asp Gly Ser Val Leu Asp Thr Ile Asn His Tyr 530 535 540 Thr Asp Leu Val Phe Ala Ser Gly Asn Asn Gln Asp Pro Trp Ala Phe 545 550 555 560 Ala Thr Ala Leu Ser Asn Val Ile Lys Ala Leu Gly Tyr Ser Pro Ala 565 570 575 Glu Ile Pro Ser Ser Ser Asn Asp Lys Ser Phe Ala Ile Gln Ser Gly 580 585 590 Gly Asp Ser Asp Ser Asn Ala Gly Pro Tyr Arg Ile Val Phe Ser Gly 595 600 605 Gly Asn Gly Leu His Gln His 610 615 <210> 7 <211> 1845 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide-N-glycosidase (rPNGase Y) <400> 7 atcatcaaca ccttccaggt cactggtcct aacatccaac tagagtcggt tgacaaaatc 60 cacctgtggc agcacacctt tgctaacagt tatggagccc ccaaggttgc ccagtacact 120 ccccccaacc aggactttga ccgtgtccga ctgtcctaca actcctccgt caccaccacc 180 cagtacgaca gactcatcca ggtgtttgtt ggagataccg aggtgtggcg ttcttccact 240 gccgagcccg tcggttcccc cctggtccag tttggttttg agaaggacgt ttccgagtac 300 ctggctctgt tcaaggagcc tcagaccatc acttttgtgc ttggcaacgt ggttcaagac 360 ggtctgcagg gccagtttga caccaacttc ttcattgagt tcctcaagag cggagacgga 420 ccccaccctg gtacccagat cggaggagct cttacttgga attacggaac cggaggcgac 480 tacttccgac ctgccgacgt ggtccatggc ctgtccaagg gcaacggaga ctcgtactct 540 ttccccgacg atactgccaa gacttccatc cagctgcctc gaaacaccac tcgagcagtt 600 gtggagatcc atgcgtccgg aaactccaac gaagagttct ggtacaccaa catgttcaac 660 gagctgtctg gccaggatgg agacggaaac ggaggtccca gtcgaattgt ggaggtctgg 720 atcggaggga gactcgctgg cgtggccttc ccttaccccg ttgtatacac tggaggcatc 780 tcgccttact tctggacccc cattgtgtct ccccaagcgt tcgacggccc ctcctaccga 840 gtggacgtga cgcccttcct gccctggttg tggcagggaa ttgagattga gctcaagctc 900 accgctcagt acaccgacaa gccccagaac gcgcaacaga actggtttgt gaccggcgct 960 ctgctggcct ggaccgagtt gggtctgcag ggctccggca atgtgtatgt ggcagataac 1020 acccccacct acactccggc ctggaacaag ctgtccaact cggacatggt gcaggtgtcg 1080 cacgtgaacc gggtcgtcaa ggtcatgtct cagctgcagt tttcttctcc ccgtggcaac 1140 ctcaacgccc aggtcacctg gaaccagaac ggaatctcca gcaacatcca gtactacact 1200 tcgtcttctc aggctgttct gcagagcacc aagggttcgg attcgctgga ggttgtgctc 1260 aatggcaaca cccagactgt gtggaacgcc tcgtactttt accccgttgt cctcaacacc 1320 attcagcagg gtaaggtggc caactccgac attgtcaccg gttacgaccg agtcaagact 1380 ggagttgcct acgagcgaac cgtactcaac gctacctcgc agatgggtgg cgactcgtct 1440 tggggcacaa cctaccagtc gtactggcga tctctagctg gagcctacga cgtgccttcc 1500 aactacgatg ccacctacta ctccgaggag gcccaggccg accacggcaa cctgcagtac 1560 cgaaacccca gttcgtcggg atctgcaacc tcctttaagg atggcagcgt gctggacacc 1620 atcaatcact acacggatct cgtgttcgcc agtggcaaca accaggaccc ctgggcgttt 1680 gctacagcac tgtccaacgt gatcaaggct ctgggatact ctcccgccga gatcccgtcc 1740 tcctccaacg acaagtcgtt tgccatccag tcgggtggag attcggactc caacgccggc 1800 ccttaccgaa tcgtcttctc cggcggcaac ggccttcatc agcac 1845 <210> 8 <211> 640 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide-N-glycosidase (rPNGase Y) <400> 8 Glu Phe Ile Ile Asn Thr Phe Gln Val Thr Gly Pro Asn Ile Gln Leu 1 5 10 15 Glu Ser Val Asp Lys Ile His Leu Trp Gln His Thr Phe Ala Asn Ser 20 25 30 Tyr Gly Ala Pro Lys Val Ala Gln Tyr Thr Pro Pro Asn Gln Asp Phe 35 40 45 Asp Arg Val Arg Leu Ser Tyr Asn Ser Ser Val Thr Thr Thr Gln Tyr 50 55 60 Asp Arg Leu Ile Gln Val Phe Val Gly Asp Thr Glu Val Trp Arg Ser 65 70 75 80 Ser Thr Ala Glu Pro Val Gly Ser Pro Leu Val Gln Phe Gly Phe Glu 85 90 95 Lys Asp Val Ser Glu Tyr Leu Ala Leu Phe Lys Glu Pro Gln Thr Ile 100 105 110 Thr Phe Val Leu Gly Asn Val Val Gln Asp Gly Leu Gln Gly Gln Phe 115 120 125 Asp Thr Asn Phe Phe Ile Glu Phe Leu Lys Ser Gly Asp Gly Pro His 130 135 140 Pro Gly Thr Gln Ile Gly Gly Ala Leu Thr Trp Asn Tyr Gly Thr Gly 145 150 155 160 Gly Asp Tyr Phe Arg Pro Ala Asp Val Val His Gly Leu Ser Lys Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Ser Tyr Ser Phe Pro Asp Asp Thr Ala Lys Thr Ser Ile 180 185 190 Gln Leu Pro Arg Asn Thr Thr Arg Ala Val Val Glu Ile His Ala Ser 195 200 205 Gly Asn Ser Asn Glu Glu Phe Trp Tyr Thr Asn Met Phe Asn Glu Leu 210 215 220 Ser Gly Gln Asp Gly Asp Gly Asn Gly Gly Pro Ser Arg Ile Val Glu 225 230 235 240 Val Trp Ile Gly Gly Arg Leu Ala Gly Val Ala Phe Pro Tyr Pro Val 245 250 255 Val Tyr Thr Gly Gly Ile Ser Pro Tyr Phe Trp Thr Pro Ile Val Ser 260 265 270 Pro Gln Ala Phe Asp Gly Pro Ser Tyr Arg Val Asp Val Thr Pro Phe 275 280 285 Leu Pro Trp Leu Trp Gln Gly Ile Glu Ile Glu Leu Lys Leu Thr Ala 290 295 300 Gln Tyr Thr Asp Lys Pro Gln Asn Ala Gln Gln Asn Trp Phe Val Thr 305 310 315 320 Gly Ala Leu Leu Ala Trp Thr Glu Leu Gly Leu Gln Gly Ser Gly Asn 325 330 335 Val Tyr Val Ala Asp Asn Thr Pro Thr Tyr Thr Pro Ala Trp Asn Lys 340 345 350 Leu Ser Asn Ser Asp Met Val Gln Val Ser His Val Asn Arg Val Val 355 360 365 Lys Val Met Ser Gln Leu Gln Phe Ser Ser Pro Arg Gly Asn Leu Asn 370 375 380 Ala Gln Val Thr Trp Asn Gln Asn Gly Ile Ser Ser Asn Ile Gln Tyr 385 390 395 400 Tyr Thr Ser Ser Ser Gln Ala Val Leu Gln Ser Thr Lys Gly Ser Asp 405 410 415 Ser Leu Glu Val Val Leu Asn Gly Asn Thr Gln Thr Val Trp Asn Ala 420 425 430 Ser Tyr Phe Tyr Pro Val Val Leu Asn Thr Ile Gln Gln Gly Lys Val 435 440 445 Ala Asn Ser Asp Ile Val Thr Gly Tyr Asp Arg Val Lys Thr Gly Val 450 455 460 Ala Tyr Glu Arg Thr Val Leu Asn Ala Thr Ser Gln Met Gly Gly Asp 465 470 475 480 Ser Ser Trp Gly Thr Thr Tyr Gln Ser Tyr Trp Arg Ser Leu Ala Gly 485 490 495 Ala Tyr Asp Val Pro Ser Asn Tyr Asp Ala Thr Tyr Tyr Ser Glu Glu 500 505 510 Ala Gln Ala Asp His Gly Asn Leu Gln Tyr Arg Asn Pro Ser Ser Ser 515 520 525 Gly Ser Ala Thr Ser Phe Lys Asp Gly Ser Val Leu Asp Thr Ile Asn 530 535 540 His Tyr Thr Asp Leu Val Phe Ala Ser Gly Asn Asn Gln Asp Pro Trp 545 550 555 560 Ala Phe Ala Thr Ala Leu Ser Asn Val Ile Lys Ala Leu Gly Tyr Ser 565 570 575 Pro Ala Glu Ile Pro Ser Ser Ser Asn Asp Lys Ser Phe Ala Ile Gln 580 585 590 Ser Gly Gly Asp Ser Asp Ser Asn Ala Gly Pro Tyr Arg Ile Val Phe 595 600 605 Ser Gly Gly Asn Gly Leu His Gln His Gly Leu Glu Gln Lys Leu Ile 610 615 620 Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His 625 630 635 640

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13. 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 유래의 서열번호: 6으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질(PNGase Y), 이를 생산하는 형질전환체 또는 상기 형질전환체의 배양액을, 별도의 단백질 분해효소를 전처리하지 않은 당단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 당단백질의 N-결합형 당사슬을 절단하는 방법.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 당단백질은 복합형 당사슬, 하이브리드형 당사슬, 고만노스형 당사슬, 만노스-6-인산이 부가된 당사슬 및 첫번째 N-아세틸글루코사민에 α(1,3)-퓨코스가 부가된 당사슬로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상의 당사슬을 포함하는 것인, 방법.
    
15. 제13항에 있어서, 상기 PNGase Y, 이를 생산하는 형질전환체 또는 상기 형질전환체의 배양액의 처리 단계는 30 내지 40℃의 온도 및 pH 5 내지 6의 산도 조건하에서 수행되는 것인, 방법.
    
16. 제13항에 있어서, 상기 PNGase Y, 이를 생산하는 형질전환체 또는 상기 형질전환체의 배양액과 당단백질의 반응 몰비가 1:1 내지 1:100인 것인, 방법.
    
17. 제13항에 있어서, 상기 당단백질의 단백질 상태가 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS) 및 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)이 첨가된 완충액으로 처리되어 변성된 상태인 것인, 방법.
    
18. 제13항에 있어서, 상기 형질전환체는 기탁번호 제KCTC12067BP로 기탁된 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115-PNGaseY인 것인, 방법.
    
19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따라 절단된 N-결합형 당사슬의 구조를 분석하는 단계를 포함하는, 당단백질의 N-결합형 당사슬 구조를 분석하는 방법.
    
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