KR101183114B1 - 백색부후균 유래 베타-글루코시다아제 유전자, 상기 유전자를 함유한 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백색부후균(Phanerochate chrysosporium) 유래의 베타-글루코시다아제 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 재조합 베타-글루코시다아제는 사료 내의 셀룰로오스를 분해하는 사료 첨가제로서 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 세제로서도 이용되어 산업적으로 섬유소의 분해 등에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

백색부후균 유래 베타-글루코시다아제 유전자, 상기 유전자를 함유한 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체의 제조방법{β-Glucosidase gene from Phanerochate chrysosporium, expression vector containing gene, transformant transformed by the vector, and method for preparation of transformant}

본 발명은 백색부후균 유래 베타-글루코시다아제 유전자를 함유한 발현벡터 및 이를 함유하는 형질전환체에 관한 것이다.

지구상 자연계에서 석탄에 이어 가장 풍부하게 존재하는 유기화합물인 섬유소(cellulose)는 미래자원으로 그 이용가치가 크게 주목받고 있다. 섬유소는 고등식물의 세포벽의 주성분으로 목질부의 대부분을 차지하는 다당류이다. 또한 베타-글루코오스(β-glucose)는 β-1,4 결합으로 다수 중합되어 이루어진 중합체로, 섬유소의 곧은 사슬이 나란히 배열하여 결정상을 이루고 있다. 자연계에 존재하는 섬유소는 녹말, 팩틴, 목질류 등과 결합된 안정한 형태로 존재하므로 자연상태에서의 분해속도는 대단히 느리다. 섬유소는 주로 균류, 세균, 연체동물 등의 셀룰라아제(cellulase)에 의해 분해된 후 최종적으로 글루코오스가 된다. 이러한 섬유소를 분해시켜 저분자 물질로 만드는 방법으로 효소나 산을 이용하거나 열분해 시키는 방법 등이 알려져 있는데(Okada amp; Nisizawa, J. Biochem ., vol 78, p297-306, 1975 Lee amp; Fan, Biotechnol. Bioeng., vol 24, p2183-2406, 1982), 그 중에서도 효소반응을 이용한 섬유소의 가수분해 방법이 가장 활발하게 연구되고 있다.

셀룰라아제는 복합효소로서 기질에 따른 가수분해 특성에 따라 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose, CMcellulose)에 대한 가수 분해능이 우수한 엔도글루카나아제(endoglucanase, EG), 아비셀(Avicel)에 대한 분해능이 우수한 엑소글루카나아제(exoglucanase, CBH) 및 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 등의 3종으로 분류되는데, 섬유소의 분해에는 이들 세 종류의 효소가 관여한다고 알려져 있다.

엔도글루카나아제는 셀룰로오스를 무작위로 공격하여 비환원성 말단기를 만드는데, 저분자량의 수용성 섬유소, 인산 가수분해된 섬유소 등은 쉽게 분해하나, 결정성 섬유소를 단독으로 분해하지는 못한다. 엑소글루카나아제는 섬유소 사슬의 비환원성 말단기를 공격하여 셀로비오스(cellobiose)를 생성시키며, 특히 기질이 결정상으로 존재할 때 이 효소의 존재는 커다란 의미를 갖는다. 즉, 여러 유기화학, 물리화학적인 연구 결과, 셀룰로오스의 분자는 많은 글루코오스가 탈수축합하여 셀로비오스 모양으로 결합하여 생긴 고분자로 추정되는데 이와 같은 결합을 β-1,4-글루코시드 결합이라 한다. 마지막으로 베타-글루코시다아제는 저 분자량의 수용성 섬유소를 분해하여 글루코오스(glucose)를 생성한다(Beldman et al., Eur. J. Biochem., vol 146, p301-308, 1985; Kim et al., Korean J. Biotechnol. Bioeng., vol 13, p162-167, 1998).

셀룰라아제의 이러한 특성 때문에, 이를 이용하고자 다양한 생물체로부터 분리된 셀룰라아제 및 그 유전자가 보고되고 있다. 지금까지 셀룰라아제 및 그 유전자는 주로 세균과 곰팡이 등의 미생물로부터 분리된 것들이 많이 알려져 왔다 (Eber hardt et al., Microbiology, vol 146, p1999-2008, 2000; Guiseppi et al., Mol. Microbiol., vol 2, p159-164, 1988; Hagen et al., Gen, vol 150, p163-167, 1994; Nakatani et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., vol 64, p1238-1246, 2000; Takashima et al. , J. Biotechnol., vol 67, p85-97, 1999).

한국특허공개 제2004-0079249호에는 뽕나무하늘소로부터 분리한 셀룰라아제 코딩 유전자 및 이를 이용하여 제조한 재조합 셀룰라아제가 개시되어 있으나, 이는 곤충으로부터 유래된 것이므로 본 발명의 백색부후균 유래의 것과는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 백색부후균 20741의 cDNA 유전자 라이브러리로부터 베타-글루코시다아제 유전자를 분리하고, 이를 대장균 및 효모에서 발현시킨 후, 효모에서 발현된 재조합 단백질의 효소 활성을 검정함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 백색부후균(Phanerochate chrysosporium) 유래의 베타-글루코시다아제 단백질을 제공한다.

또한, 서열번호 1로 표시되는 백색부후균(Phanerochate chrysosporium) 유래의 베타-글루코시다아제의 유전자를 제공한다.

또한, 서열번호 1로 표시되는 백색부후균(Phanerochate chrysosporium) 유래의 베타-글루코시다아제의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

상기 벡터는 대장균 발현 벡터 또는 효모 발현 벡터일 수 있다.

또한, 서열번호 1의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

상기 형질전환체는 대장균 또는 효모일 수 있다.

또한, 다음 단계를 포함하는 서열번호 1로 표시된 백색부후균(Phanerochate chrysosporium) 유래의 베타-글루코시다아제의 유전자로 형질전환된 형질전환체의 제조방법을 제공한다:

1) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1로 표시된 백색부후균(Phanerochate chrysosporium) 유래의 베타-글루코시다아제의 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및

3) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계.

상기 숙주세포는 대장균 또는 효모일 수 있다.

본 발명에 따른 베타-글루코시다아제는 사료 내의 셀룰로오스를 분해하는 사료 첨가제로서 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 세제로서도 이용되어 산업적으로 섬유소의 분해 등에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 백색부후균(Phanerochate chrysosporium) 유래의 베타-글루코시다아제 단백질을 제공한다. 상기 백색부후균은 구체적으로는 백색부후균 20741 균주이다. 상기 베타-글루코시다아제 단백질은 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 베타-글루코시다아제 단백질의 범위는 백색부후균으로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.

"기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 생물체 내에서 카르복시메틸셀룰로오스에 대한 가수 분해능이 우수한 베타-글루코시다아제의 활성을 의미한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 베타-글루코시다아제 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 베타-글루코시다아제 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 베타-글루코시다아제 코딩 유전자는 총 876bp의 뉴클레오티드로 구성되어 있으며, 총 291개의 아미노산을 암호화하고 있다. 또한, 본 발명에 따른 베타-글루코시다아제 코딩 유전자의 연역 아미노산 서열을 기존의 유전자 데이터베이스와 비교검색한 결과, 본 발명의 분리된 유전자는 베타-글루코시다아제를 코딩하는 신규 유전자로 밝혀졌다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 베타-글루코시다아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 대장균 발현 벡터 또는 효모 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 대장균 발현 벡터로는 pET28a 벡터를 예로 들수 있으며, 효모 발현 벡터로는 pKBN-IFN 벡터를 예로 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우 에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들면, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4?λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들면, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들면, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예를 들면, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Samonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 대장균이다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모, 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO(Chinese hamster ovary) 세포주, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주), 식물세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 효모이며, 더욱 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyce cerevisiae)이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입 법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 서열번호 1로 표시된 백색부후균(Phanerochate chrysosporium) 유래의 베타-글루코시다아제 유전자로 형질전환된 형질전환체의 제조방법을 제공한다:

1) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1로 표시된 백색부후균(Phanerochate chrysosporium) 유래의 베타-글루코시다아제의 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및

3) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계.

상기 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 방법은 전술한 바와 같다. 상기 숙주세포는 원핵생물인 경우는 대장균(E. coli)일 수 있으며, 진핵생물인 경우는 효모일 수 있다. 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyce cerevisiae)이다.

상기 형질전환체를 이용하여 재조합 베타-글루코시다아제를 생산할 수 있으며, 그 방법은 형질전환체를 공지된 기술을 이용하여 재조합 단백질의 생산에 적합한 배지에서 배양한다. 예를 들어, 세포들은 적합한 배지와 단백질이 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효, 쉐이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지기술을 사용하여 탄소, 질소원 및 무기염을 포함하는 적합한 배지에서 일어난다. 적합한 배지는 상업적으로 입수하거나 예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있다.

상기 베타-글루코시다아제는 목적 유전자에 의해 발현된 단백질을 당업계에 공지된 단백질 분리방법을 이용하여 회수할 수 있다. 예를 들어 단백질은 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 영양배지로부터 분리될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 단백질은 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

상기 형질전환체를 이용하여 재조합 베타-글루코시다아제를 생산할 수 있다. 상기 생산된 재조합 베타-글루코시다아제는 사료 내의 셀룰로오스를 분해하는 사료 첨가제로서 이용될 수 있다. 또한, 베타-글루코시다아제를 효소 세제 첨가제로서 사용할 수 있다.

본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된 다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

1. 곰팡이 균주 및 배양조건

본 발명에 사용된 백색부후균(Phanerochate chrysosporium) 20741 균주는 산림과학원으로부터 제공받았다. 상기 백색부후균을 배양하기 위하여, 상기 백색부후균 곰팡이 세포를 PDA(Potato dextrose agar) 배지에 30℃에서 7일 동안 배양을 하였다. 이렇게 배양된 하나의 콜로니를 50㎖의 멸균된 탄수화물과 포도당이 포함된 배지에 넣고 배양을 한 뒤 원심분리하여 분리한 후, 건조시켜 4℃에 보관하였다. 탄수화물원으로 2% 글루코오스, 셀로비오스(cellobiose) 및 전분 혼합물(2:1:1)을 포함하는 변형된 로웨스 배지(Lowe’s medium)에 보존하였다. RNA 추출을 위해, 백색부후균 20741은 500㎖의 변형된 로웨스 배지에서 39℃에서 72시간동안 배양하였다.

2. 글루카나아제 유전자 클로닝

cDNA 라이브러리는 pBK-CMV 벡터를 이용하여 제작하였고, 이를 이용하여 백색부후균 20741에서 베타-글루코시다아제를 코딩하는 유전자를 스크리닝하는데 사 용하였다. 우선, pBK-CMV 벡터에 1kb 이상의 삽입물을 포함하는 대장균 클론은 T3 및 T7 프라이머로 콜로니 PCR 방법으로 스크리닝하였다. 선별된 클론을 시퀀싱하고, 분석하였다. 클론 중 하나는 곰팡이 베타-글루코시다아제와 매우 유사성인 높은 삽입물을 포함하고 있는 것으로 확인되었고, 5′및 3′UTR을 갖는 총길이의 ORF를 포함하는 것으로 분석되었다.

3. 재조합 단백질의 발현 및 정제

876bp ORF(open reading frame)는 NdeI 및 BamHI인 제한효소 자리를 각각 갖는 정방향 프라이머, 5'-CATATGCGCGGAGCGACACGA-3'(서열번호 3) 및 역방향 프라이머, 5'-GGATCCTTAGGCGTGGGAGGGAGC-3'(서열번호 4)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. PCR 산물은 발현벡터 pET28a (노바젠, 머크, USA)의 NdeI 및 BamHI 자리로 삽입시켜, pET28a-PCC1을 제작하였다. pET28a-PCC1 플라스미드로 대장균 BL21(DE3) 세포를 형질전환시켰고, 50㎍ 카나마이신을 포함하는 LB 액체 배지 50 ㎖에서, 37℃에서 250pm으로 OD(optical density) 600㎚에서 0.5가 될 때까지 현탁 배양하였다. 이소프로필-B-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)는 최종 농도 1mM이 되도록 첨가하여 25℃에서 12시간 동안 배양하였다. 세포는 2500xg에서 5분 동안 원심분리하여 수득하였고, 이미다졸이 포함된 8㎖의 네이티브 바인딩 버퍼(native binding buffer)에 현탁시켰다(인비트로젠, CA). 그런 다음, 8㎎ 리소자임을 첨가하였고, 얼음에서 30분 동안 반응시켰다. 얼음 속에서 10초 동안 초음파 처리하여 세포 파열시키고, 10초 동안 냉각시키는 실험을 여러 번 반복하였다. 세포 용균물은 3000xg에서 15분 동안 원심 분리하였고, 상층액은 새 튜브로 옮겼다. 8㎖ 용균물은 네이티브 조건(native conditions)에서 Ni-NTA 아가로스 컬럼으로 정제하였다(인비트로젠, CA). 단백질들은 제조사의 지시대로 75mM 이미다졸이 첨가된 8㎖ 네이티브 세정 버퍼(native washing buffer, pH 6.0)로 4회 세정하였고, 재조합 단백질은 250mM 이미다졸이 포함된 10㎖ 용출 버퍼(elution buffer, pH 8.0)에 녹여 500㎕씩 분주하였다. 벡터 대조구로 pET28a를 갖는 대장균의 단백질 추출은 pET28a-PCC1과 같은 과정으로 수행하였다.

4. SDS-PAGE와 젤 전기영동

단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)를 기준으로 사용한 브래드포드 방법으로 정량하였다. 총 109㎍의 단백질 추출물과 3㎍의 정제된 재조합 단백질은 SDS-PAGE(dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, 10% 젤)를 이용하여 Sambrook et al.(1982) 지시대로 분석하였다. 총 단백질(total protein)은 배양액 20㎕를 세포 침전시킨 후, 10㎕를 Tris-HCl(pH6.8)에 재현탁하여 사용하였으며, 불용성 분획은 배양액 총 600㎕를 세포 침전시킨 후, 300㎕ Tris-HCl(pH6.8)에 재현탁하고, sonication하여 상층액(soluble form)은 버리고, 펠렛을 250㎕에 재현탁하여 사용하였다. SDS-PAGE 후에, 단백질 젤은 10%(v/v) 인산, 10%(w/v) 황산암모늄, 0.12%(w/v) 브릴리언트 블루 G250, 및 20%(v/v) 메탄올이 포함된 쿠마시 브릴리언트 블루 용액으로 염색하였다.

5. 효모 형질전환

효모의 분비 시스템을 이용한 유전자 발현을 위해 Gal 프로모터와 Mating factor alpha signal sequence가 도입된 pKBN-IFN 벡터를 이용하였다. 효모 발현 벡터 내로 클로닝하기 위하여 XbaI, BamHI의 제한효소 인식부위를 포함한 프라이머를 제작하여 PCR을 수행하여 얻어진 산물을 TA 클로닝 벡터에 클로닝하였다. 그 후 제한효소 XbaI, BamHI으로 DNA 크기를 확인하고 T3, T7 프라이머를 이용하여 염기 서열을 확인한 후 정확한 플라스미드를 선택하였다. 유전자가 삽입된 발현벡터 클론을 Saccharomyces cerevisiae S2805 균주에 통상적인 전기천공법(electroporation)에 의해 형질전환하였다. 유전자 발현을 위해 5㎖ YPD 배지에 콜로니를 접종하여 밤새 배양 후 효모 세포를 침전하여 50㎖ SD 배지(1% 효모 추출액, 2% 펩톤, 2% 갈락토스)에서 배양하였다. 최종적으로 원심분리 후 상층액을 이용하여 활성도 측정을 진행하였다.

6. 효소 활성 분석

베타-글루코시다아제 활성은 형질전환된 효모 콜로니를 SD 배지(1% 효모 추출액, 2% 펩톤, 2% 갈락토스)에 접종하고, 30℃에서 16-20시간 동안 배양하였다. 효모 배양액을 원심분리하고, 상층액을 버리고, 25㎖ YEPGAL 배지(1% 효모 추출액, 2% 펩톤, 2% 글루코오스)를 첨가하고, 30℃에서 밤새 배양하였다. 밤새 배양물을 4℃, 13000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 CMC 검정을 수행하였다.

CMC 검정은 0.1g의 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)와 1g의 아가(Agar)를 비이커에 넣고 0.9% 염수 용액을 최종부피 100㎖가 되게 하여 끓인 후 페트리디쉬에 높이 약 0.3㎜ 정도가 되도록 부은 후 공기 중에서 식혀 0.1%의 카르복시메틸셀룰로오스를 함유하는 1% 아가 배지를 제조하였다. 마이크로피펫 팁을 이용해서 정제된 his-taqqed 단백질을 스팟팅한 CMC 아가 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하였다. 그 후 플레이트를 콩고 레드(congo red)로 20분간 염색한 후 1M 염수 용액으로 탈색하였다.

실시예 2: 베타-글루코시다아제 유전자(PCC1)의 클로닝 및 유전자 분석

백색부후균 20741로부터 베타-글루코시다아제 유전자(PCC1)를 클로닝하였다. 도 1은 클로닝 어댑터 프라이머를 이용한 PCC1 유전자의 PCR 산물(a) 및 벡터 내에 들어 있는 ORF DNA의 구조(b)를 나타낸다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, PCC1 유전자는 876bp의 ORF를 가지며, 291개의 아미노산을 코딩하는 유전자임을 알 수 있었다.

PCC1 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 여러 라이브러리에서 입수가능한 서열 데이터와 비교하여 분석하였다. 공개된 또는 알려진 셀룰라아제 유전자 서열과 본 발명 PCC1 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자에 대한 데이터베이스 연구는 이들 유전자간의 상동성과 계통발생학적으로 가깝게 인접하는 것들을 조사하기 위하여 행하였다. 도 2는 ORF 아미노산 서열의 검색 결과로서, 본 발명에서 클로닝된 유전자는 glycoside hydrolase와 1e-104 이상(75%)의 고도의 상 동성을 나타내었으며, (a), (b)는 그 서열 비교를 나타낸 것이다.

실시예 3: 대장균에서 PCC1의 발현

예상되는 ORF가 제대로 발현되는지 조사하기 위해, PCC1을 코딩하는 총 길이 cDNA를 박테리아 발현벡터 pET28a로 클로닝하였고, 대장균 BL21 (DE3) 세포에서 발현시켰다. pET28a-PCC1을 갖고 있는 대장균 BL21 (DE3)의 세포 50㎖을 LB 배지가 담긴 20 리터 플라스크에서 배양하였고, 폴리히스티딘이 표지된 재조합 PCC1의 발현은 IPTG의 첨가에 의해 유도하였다. 대장균 세포의 초음파 분해 후에, N-말단 His-tags를 갖는 재조합 단백질의 불용성 분획은 친화성 Ni-NTA 아가로스 컬럼을 이용하여 정제하였다. IPTG 유도 후 12시간이 지나서, 30.85kDa 분자량인 하나의 중요한 단백질을 세포 추출물로부터 검출하였다(도 3 참조). 그러나, 비어 있는 pET28a 벡터를 포함하는 대장균은 30.85kDa 분자량을 갖는 단백질을 만들어내지 못했다(도 3의 레인 Con). 또한, 불용성 단백질 분획에서는 PCC1 재조합 단백질이 검출되고, 반면 가용성 단백질 분획에는 PCC1 재조합 단백질이 검출되지 않은 점으로 보아, 대장균에서는 PCC1 재조합 단백질이 봉입체(inclusion body)로 생산된다는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에서 분리한 PCC1 유전자는 대장균에서 30.85 kDa의 단백질을 생산함을 알 수 있었다.

실시예 4: 효모에서 PCC1의 발현 및 CMC 검정

분리된 PCC1 유전자는 곰팡이 유래이므로, 당화(glycosylation)가 되어 있을 가능성이 높다. 따라서, PCC1 단백질의 기능을 조사하기 위해, 동일한 진핵 생물인 효모에서 PCC1 단백질 발현을 유도하였다. 효모에서 PCC1 단백질을 발현한 후에, CMC 검정을 수행하였다. 도 4는 효모에서 발현된 PCC1 재조합 단백질의 CMC 검정 결과이다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 발현된 PCC1 재조합 단백질은 기질인 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)를 분해하여 투명환이 형성함을 알 수 있다 (PCC1-1 및 PCC1-2).

도 5는 재조합 발현된 효모에서 환원당분해력 대한 가수분해 나노몰 수준에서 검정한 결과이다. C8은 베타-글루코시다제가 클론된 것을 나타낸 것이며, Mock는 대조군을 나타낸다. 도 5로부터, 효모에서 발현된 PCC1 재조합 단백질은 카르복시메틸셀룰로오스에 대한 가수분해능이 우수한 베타-글루코시다아제임을 알 수 있다.

도 1은 클로닝 어댑터 프라이머를 이용한 PCC1 유전자의 PCR 산물(a) 및 벡터 내에 들어 있는 ORF DNA의 구조(b)를 나타낸다.

도 2는 ORF 아미노산 서열의 검색 결과로서, 고도의 상동성을 나타내는 유전자(a) 및 서열 비교(b)를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 PCC1 재조합 단백질을 대장균에서 발현시켜 SDS-PAGE를 수행한 사진이다.

도 4는 효모에서 발현된 PCC1 재조합 단백질의 CMC 검정 결과이다. PCC1-1 및 PCC1-2는 반복을 나타낸 것이며, C2730은 양성 대조군을 나타낸다.

도 5는 재조합 발현된 효모에서 환원당분해력 대한 가수분해 나노몰 수준에서 검정한 결과이다. C8은 베타-글루코시다아제가 클론된 것을 나타낸 것이며, Mock는 대조군을 나타낸다.

<110> Republic of Korea <120> beta-Glucosidase gene from Phanerochate chrysosporium, expression vector containing gene, transformant transformed by the vector, and method for preparation of transformant <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 876 <212> DNA <213> Phanerochate chrysosporium <400> 1 atgcgcggag cgacacgact tgtagccctg ctctctgcag tggttgcgct ttccgttggc 60 gttgctgccc ttccaaaggt tacgaggact ggcagatacc tatacagcga cgatggtagc 120 aggttctaca tccgaggtgt cgcttaccag ccccaaggca ccgtaaccca gagttccgac 180 aatcccttcg gtgaaccgga ctcgttcatt gatgcccttg cggacagcgc gggctgttct 240 cgggatctac cctacctcca gcagctcggt gtcaatgtta tccgtgctta cagcgtcaat 300 gcctcgctca accacgattc ctgcatgagc gcactgagtg gtgctgggat ctacactatc 360 atcgacctgt cgctccctct caacggttcc atcgaccgtg cttcgcctgc gtggtcgacg 420 aacctgcttg actcatacat tgcgacgatc gacacatttt ccaagtacga caacgtcctg 480 gcgtacaacg tcggtaacga agtcatcacg gcagcaaatg cgacggacgc tgcagccttt 540 atcaaagcag ctgcgcgtga cacgaaagcc tacctcgcgt cgaagaactc accggtcctt 600 gtcggatacg ctgctatcga tgcagatgac gactggctcg tccctctggc aaactatctt 660 agctgtgatc ccaacggcag caactccggc tccactgcta tcgacctgtt tggtctgaac 720 aactacgaat ggtgcggcga ttcccagcca agtgtctaca atgacaagaa tggcgctttt 780 gctggttata atgtggccgc ttacttcagc gaatacggct tgcccgacac agaactccac 840 atggctggcc agcacgaagc tccctcccac gcctaa 876 <210> 2 <211> 291 <212> PRT <213> Phanerochate chrysosporium <400> 2 Met Arg Gly Ala Thr Arg Leu Val Ala Leu Leu Ser Ala Val Val Ala 1 5 10 15 Leu Ser Val Gly Val Ala Ala Leu Pro Lys Val Thr Arg Thr Gly Arg 20 25 30 Tyr Leu Tyr Ser Asp Asp Gly Ser Arg Phe Tyr Ile Arg Gly Val Ala 35 40 45 Tyr Gln Pro Gln Gly Thr Val Thr Gln Ser Ser Asp Asn Pro Phe Gly 50 55 60 Glu Pro Asp Ser Phe Ile Asp Ala Leu Ala Asp Ser Ala Gly Cys Ser 65 70 75 80 Arg Asp Leu Pro Tyr Leu Gln Gln Leu Gly Val Asn Val Ile Arg Ala 85 90 95 Tyr Ser Val Asn Ala Ser Leu Asn His Asp Ser Cys Met Ser Ala Leu 100 105 110 Ser Gly Ala Gly Ile Tyr Thr Ile Ile Asp Leu Ser Leu Pro Leu Asn 115 120 125 Gly Ser Ile Asp Arg Ala Ser Pro Ala Trp Ser Thr Asn Leu Leu Asp 130 135 140 Ser Tyr Ile Ala Thr Ile Asp Thr Phe Ser Lys Tyr Asp Asn Val Leu 145 150 155 160 Ala Tyr Asn Val Gly Asn Glu Val Ile Thr Ala Ala Asn Ala Thr Asp 165 170 175 Ala Ala Ala Phe Ile Lys Ala Ala Ala Arg Asp Thr Lys Ala Tyr Leu 180 185 190 Ala Ser Lys Asn Ser Pro Val Leu Val Gly Tyr Ala Ala Ile Asp Ala 195 200 205 Asp Asp Asp Trp Leu Val Pro Leu Ala Asn Tyr Leu Ser Cys Asp Pro 210 215 220 Asn Gly Ser Asn Ser Gly Ser Thr Ala Ile Asp Leu Phe Gly Leu Asn 225 230 235 240 Asn Tyr Glu Trp Cys Gly Asp Ser Gln Pro Ser Val Tyr Asn Asp Lys 245 250 255 Asn Gly Ala Phe Ala Gly Tyr Asn Val Ala Ala Tyr Phe Ser Glu Tyr 260 265 270 Gly Leu Pro Asp Thr Glu Leu His Met Ala Gly Gln His Glu Ala Pro 275 280 285 Ser His Ala 290 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 catatgcgcg gagcgacacg a 21 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggatccttag gcgtgggagg gagc 24

Claims (8)

1. 서열번호 2로 표시되는 백색부후균(Phanerochate chrysosporium) 유래의 베타-글루코시다아제 단백질.
2. 서열번호 1로 표시되는 백색부후균(Phanerochate chrysosporium) 유래의 베타-글루코시다아제의 유전자.
3. 서열번호 1의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
4. 제3항에 있어서,

   상기 벡터는 대장균 발현 벡터 또는 효모 발현 벡터인 재조합 벡터.
5. 서열번호 1의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
6. 제5항에 있어서,

   상기 형질전환체는 대장균 또는 효모인 형질전환체.
7. 다음 단계를 포함하는 서열번호 1로 표시된 백색부후균(Phanerochate chrysosporium) 유래의 베타-글루코시다아제의 유전자로 형질전환된 형질전환체의 제조방법:

   1) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1로 표시된 백색부후균(Phanerochate chrysosporium) 유래의 베타-글루코시다아제의 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

   2) 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및

   3) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계.
8. 제7항에 있어서,

   상기 숙주세포는 대장균 또는 효모인 형질전환체의 제조방법.

Images