KR100986050B1 - 네오칼리마스틱스 프론탈리스 유래의 아세틸 자일란에스터라제 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 네오칼리마스틱스 프론탈리스(Neocallimastix frontalis) 유래의 아세틸 자일란 에스터라제 NfAXE1(Neocallimastix frontalis Acetyl Xylan Esterase 1)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 NfAXE1 단백질; 상기 NfAXE1 단백질을 코딩하는 유전자; 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포; 상기 유전자를 미생물에서 과발현시킴으로써 NfAXE1 단백질을 대량 생산하는 방법; 및 상기 단백질에 대한 항체에 관한 것이다.

네오칼리마스틱스 프론탈리스, NfAXE1, 아세틸 자일란 에스터라제

Description

네오칼리마스틱스 프론탈리스 유래의 아세틸 자일란 에스터라제 단백질{Acetyl xylan esterase protein from Neocallimastix frontalis}

본 발명은 네오칼리마스틱스 프론탈리스 유래의 아세틸 자일란 에스터라제 NfAXE1에 관한 것이다.

섬유질의 탄수화물은 비 반추위 초식동물 및 반추위 동물을 포함하는 초식동물의 식량 공급원으로 사용될 수 있다. 반추위에서 소화가 될 음식물의 다양한 형태는 미생물의 발효에 의해 작은 분자로 분해되고 박테리아, 프로토조아 및 진균류와 같은 세가지 형태의 미생물은 이와 같은 반추위의 발효 미생물과 연관이 있다. 혐기성 진균류의 존재는 1975년 반추위에 존재하는 미생물들 사이에서 보고되었다(Orpin CG (1975)J Gen Microbiol 91(2):249-62). Orpin의 보고서 전에, 반추위 혐기성 진균류는 Callimastix, Oikomonas, Monas 및 Spaeromonas 와 같이 편모가 있는 프로토조아로 분류되었다. 현재 NCBI 데이터베이스에는 Anaeromyces, Caecomyces, Cyllamyces, Neocallimastix, Orpinomyces 및 Piromyces를 포함하는 6개의 혐기성 진균류가 초식동물의 장내에서 분리되어 제공되고 있다(http://ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=taxonomy). 반추위에 존재하는 박테 리아 또는 프로토조아와 달리 혐기성 진균류는 편모와 같은 뿌리를 침투시켜 사료의 물리적 분해를 다양한 효소 시스템을 분비함으로써 음식물의 화학적 분해를 야기한다(Ho YW, N. Abdullah, et al (1988) Animal Feed Science and Technology 22: 161-171). 또한, 혐기성 진균류는 엔도글루카나제, β-글루코시다제, 자일라나제 및 다른 탄수화물 분해 효소를 포함하는 다양한 효소를 분비한다. 탄수화물 분해 효소는 동물 사료 첨가제, 종이 제조 및 바이오-에너지 생산을 위한 잠재적인 효소원이다.

나무 식물 세포 벽의 건중량의 20~30%에 해당하는 두 번째로 가장 많은 세포벽 탄수화물인 헤미셀룰로우스는 주로 구조적 백본(backbone)으로서 자일란으로 구성된다. 자일란은 예를 들어, 아라비노스, O-아세틸 및 페루릭(4-히드록시-3-메트옥시신나믹), p-쿠마릭, L-아르비노퓨라노실 및 4-O-메틸글루쿠로닐 잔기와 같은 다양한 치환기 그룹을 갖는 β-1,4-연결된 자일로피라노실 잔기(β-1,4-linked xylopyranosyl residues)로 구성되었다. 몇 개의 경재 수종에서(hardwood species), 자일로스 잔기의 약 60~70%는 아세트산으로 에스테르화되었다. 또한, 건조된 목초의 2.7%는 자일로피라노스 잔기의 C-2 또는 C-3에 연결된 O-아세틸기로 구성되었다((Thomson JA (1993) FEMS Microbiol Rev 1065-82). 자일란 백본에서 아세틸기는 헤미셀룰로스의 완전한 분해를 방해하기 때문에, 아세틸기의 제거는 몇몇의 산업 적용에서 매우 중요하다. 아세틸 자일란 에스터라제(AXE)는 천연의 아세틸화 자일란의 자일로스 절반인 2 및/또는 3의 위치에서 아세틸기의 에스터 결합을 가수분해시키는 효소이다.

AXE의 존재는 실모양의 진균류 스키조필럼 코뮨(Schizophyllum commune)의 배양으로 처음 보고되었다. 그 후, AXE은 페니실리움 퍼퍼로제눔(Gordillo et al.(2006) Mycol Res 110(Pt 10):1129-1139 ), 아스퍼질러스(Tenkanen M., Thornton J., Viikari L (1995) J Biotechnol 42(3):197-206), 트리코데르마 레세이(Sundergburg and Poutanen (1991) Biotechnol Appl Biochem 13:1-11)를 포함하는 자일란 분해 진균류 뿐만 아니라 반추위 박테리아인 피브로박터 숙시노제네시스 S85(McDermid KP, Mackenzie CR, Forsberg CW (1990) Appl Environ Microbiol 56(1):127-132)로부터 정제되어, 특성이 밝혀졌다. 최근, 탄수화물 에스터라제는 Coutinho and Henrissat(Coutinho PM, Henrissat B. (1999). Bioengineering p1-12)에 의해 14개의 그룹으로 분류되었다. 아세틸 자일란 에스터라제는 1-7과로 분류되었고, 다양한 기질 특이성(Caufrier F, Martinou A, Dupont C, Bouriotis V (2003) Carbohydr Res 338:687-692)과 독특한 위치선택성 작용 방식을 포함하는 기능적 다양성을 함축하는 효소의 주요한 서열 다양성(Koseki T, Miwa Y, Akao T, Akita O, Hashizume K. (2006) J Biotechnol 10;121(3):381-9)을 보여주었다.

현재, 자일라나제와 같은 헤미셀룰라제는 동물 생산성을 향상시키고, 사료의 소화율 향상으로 인한 환경 오염을 방지하고자 사료 첨가제에 사용되었다(Fang ZF, Peng J, Liu ZL, Liu YG (2007) J Anim Physiol Anim Nutr 91:361-368). 게다가, 자일라나제는 자일리톨 생산(Nigam, P. and Singh, D (1995) A review: Process Biochem 30:117-124), 제빵산업 및 바이오에탄올 생산에 사용된다. 그러나, 현재 네오칼리마스틱스 프론탈리스 균주로부터 아세틸 자일란 에스터라제 활성을 갖는 단백질에 대한 보고는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 반추위의 혐기성 진균류인 네오칼리마스틱스 프론탈리스 PMA 02 균주로부터 AXE를 분리 및 정제하여 세포벽 탄수화물인 헤미셀룰로우스의 주요한 구조적 백본(backbone)인 자일란에 존재하는 아세틸기가 헤미셀룰로스의 완전한 분해를 방해하는 문제점을 해결하는데 이용하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 네오칼리마스틱스 프론탈리스(Neocallimastix frontalis) 유래의 아세틸 자일란 에스터라제 NfAXE1(Neocallimastix frontalis Acetyl Xylan Esterase 1) 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 NfAXE1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자를 미생물에서 과발현시킴으로써 NfAXE1 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 단백질에 대한 항체를 제공한다.

본 발명은 네오칼리마스틱스 프론탈리스 유래의 천연의 아세틸화 자일란의 아세틸기의 에스터 결합을 가수분해시키는 효소인 NfAXE1를 제공함으로써, 동물 사료 첨가제, 종이 제조 및 바이오-에너지 생산을 위한 몇몇의 산업에서 이용가치가 클 것으로 기대된다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 네오칼리마스틱스 프론탈리스(Neocallimastix frontalis) 유래의 아세틸 자일란 에스터라제 NfAXE1(Neocallimastix frontalis Acetyl Xylan Esterase 1) 단백질을 제공한다. 아세틸 자일란 에스터라제는 아세틸화 자일란의 아세틸기의 에스터 결합을 가수분해시키는 효소이다. 본 발명에 따른 NfAXE1 단백질의 범위는 네오칼리마스틱스 프론탈리스로부터 분리된 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 아세틸 자일란 에스터라제 활성을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 상기 단백질은 35~45℃, pH 7.5~9인 약알칼리성 조건에서 활성이 크고, 40℃, pH8 인 조건에서 최적 활성을 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에 따른 상기 단백질은 p-니트로페닐 아세테이트, α-나 프틸 아세테이트, 아세틸화 벌크우드 자일란 또는 아세틸화 비치우드 자일란에 기질 특이성을 가지며, p-니트로페닐 아세테이트는 495.2 U mg^-1, α-나프틸 아세테이트는 327.9 U mg^-1, 아세틸화 벌크우드 자일란은 150.8mg^-1, 아세틸화 비치우드 자일란은 216.6mg^-1으로 각각 기질 활성을 나타내었다.

본 발명은 상기 NfAXE1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 NfAXE1 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유 전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 상기 재조합 벡터는 pET28a-NfAXE1이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장 내균과 균주 등이 있다. 본 발명에서는 상기 미생물로 대장균을 이용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 상기 유전자를 미생물에서 과발현시킴으로써 NfAXE1 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다. 대량 생산하는 방법은 형질전환체를 공지된 기술을 이용하여 재조합 단백질의 생산에 적합한 배지에서 배양한다. 예를 들어, 세포들은 적합한 배지와 단백질이 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효, 쉐이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지기술을 사용하여 탄소, 질소원 및 무기염을 포함하는 적합한 배지에서 일어난다. 적합한 배지는 상업적으로 입수하거나 예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있다.

상기 제조방법에서는 목적 유전자에 의해 발현된 단백질을 당업계에 공지된 단백질 분리방법을 이용하여 회수할 수 있다. 예를 들어 단백질은 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 영양배지로부터 분리될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 단백질은 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

본 발명은 상기 단백질에 대한 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 본 발명의 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

1. 곰팡이 균주 및 배양조건

본 발명에 사용된 네오칼리마스틱스 프론탈리스 PMA02(Neocallimastix frontalis PMA02) 균주는 혐기적 조건에서 롤 튜브 방법에 의해 홀스타인 거세우(holstein steer)의 반추위에서 분리하였고(Hungate RE, Smith W, Clarke RT (1966) J Bacteriol 91:908-909), 탄수화물원으로 2% 글루코스, 셀로비오스(cellobiose) 및 전분 혼합물(2:1:1)을 포함하는 변형된 로웨스 배지(Lowe’s medium)에 보존하였다. RNA 추출을 위해, 네오칼리마스틱스 프론탈리스 PMA02은 500㎖의 변형된 로웨스 배지에서 39℃에서 72시간동안 배양하였다.

2. NfAXE1 클로닝

cDNA 라이브러리는 pBK-CMV 벡터를 이용하여 제작하였고, 이를 이용하여 네오칼리마스틱스 프론탈리스 PMA02에서 아세틸 자일란 에스터라제를 코딩하는 유전 자를 스크리닝하는데 사용하였다. 우선, pBK-CMV 벡터에 1 kb 이상의 삽입물을 포함하는 대장균 클론은 T3 및 T7 프라이머로 콜로니 PCR 방법으로 스크리닝하였다(도 1A). 선별된 클론을 시퀀싱하고, 분석하였다. 클론 중 하나는 곰팡이 아세틸 자일란 에스터라제와 매우 유사성인 높은 삽입물을 포함하고 있는 것으로 확인되었고, 5′및 3′UTR을 갖는 총길이의 ORF를 포함하는 것으로 분석되었다.

3. 재조합 단백질의 발현 및 정제

981bp ORF(open reading frame)는 NdeI 및 BamHI인 제한효소자리를 각각 갖는 정방향 프라이머, 5′-GCCATATGAGAGCCAGTATTATT-3′(서열번호 3) 및 역방향 프라이머, 5′- CCGGATCCTTAATTTTCTTCAGCAGAA-3′(서열번호 4)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. PCR 산물은 발현벡터 pET28a (노바젠, 머크, USA)의 NdeI 및 BamHI 자리로 삽입시켜, pET28a-NfAXE1를 제작하였다. pET28a-NfAXE1 플라스미드로 대장균 BL21(DE3) 세포를 형질전환 시켰고, 50 ㎍ 카나마이신을 포함하는 LB 액체 배지 50 ㎖에서, 37℃에서 250pm으로 OD(optical density) 600nm에서 0.5가 될 때까지 현탁 배양하였다. 이소프로필-B-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)는 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가하여 25℃에서 12시간동안 배양하였다. 세포는 2500 x g에서 5분 동안 원심분리하여 수득하였고, 이미다졸이 포함된 8 ㎖의 네이티브 바인딩 버퍼(native binding buffer)에 현탁시켰다(인비트로젠, CA). 그런 다음, 8㎎ 리소자임을 첨가하였고, 얼음에서 30분 동안 반응시켰다. 얼음 속에서 10초 동안 초음파 처리하여 세포 파열시키고, 10초 동안 냉각시키는 실험을 여러번 반복하였다. 세포 용균물은 3000 x g에서 15분 동안 원심 분리하였고, 상층액은 새 튜브로 옮겼다. 8 ㎖ 용균 물은 네이티브 조건(native conditions)에서 Ni-NTA 아가로스 컬럼으로 정제하였다(인비트로젠, CA). 단백질들은 제조사의 지시대로 75mM 이미다졸이 첨가된 8 ㎖ 네이티브 세정 버퍼(native washing buffer, pH 6.0)로 4회 세정하였고, 재조합 단백질은 250mM 이미다졸이 포함된 10㎖ 용출 버퍼(elution buffer, pH 8.0)에 녹여 500㎕씩 분주하였다. 벡터 대조구로 pET28a를 갖는 대장균의 단백질 추출은 pET28a-NfAXE1와 같은 과정으로 수행하였다.

4. SDS-PAGE와 젤 전기영동

단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)를 기준으로 사용한 브래드포드 방법으로 정량하였다. 총 109 ㎍의 단백질 추출물과 3 ㎍의 정제된 재조합 단백질은 SDS-PAGE(dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, 10% 젤)를 이용하여 Sambrook et al (1982) 지시대로 분석하였다. SDS-PAGE 후에, 단백질 젤은 10% (v/v) 인산, 10% (w/v) 황산암모늄, 0.12% (w/v) 브릴리언트 블루 G250, 및 20% (v/v) 메탄올이 포함된 쿠마시 브릴리언트 블루 용액으로 염색하였다(Reiner 2006). 젤 전기영동을 위해, 3 ㎍ 단백질 샘플은 마이크로플루이딕 칩(microfluidic chip)에 로딩하였고, Experion Pro260 젤 전기영동 시스템(Experion Pro260 automated gel electrophoresis system)을 이용하여 제조사(Bio-Rad)의 지시대로 분석하였다

5. 효소 분석

NfAXE1은 대장균의 정제 전후 세포 분해물을 이용하여 분석하였고, 대조구로서 pET28a를 갖는 대장균의 용균물을 분석하였다. 효소의 활성을 나타내는 1유 닛(unit)은 그것의 기질(p-니트로페닐 아세테이트, α-나프틸 아세테이트, 및 아세틸화 자일란)로부터 1 mmole p-니트로페닐, α-나프톨 및 아세트산을 각각 방출하는데 40℃에서 분당 필요한 효소의 양으로 정의하였다. 기질로 p-니트로페닐을 사용한 효소 분석을 위해, 20㎕의 0.5M 포타슘 포스페이트 버퍼(pH6.0)는 0.2㎕의 정제된 효소 용액과 혼합하고, 최종 부피가 180㎕가 되도록 증류수를 첨가하였다. 다음 반응은 DMSO로 녹인 20㎕의 10 mM p-니트로페닐 아세테이트를 첨가하였다. p-니트로페닐의 방출은 마이크로플레이트 리더 플루스타 옵티마(microplate reader floustar optima, BMG labtech, Germany)를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다(Johnson et al. 1988). 알파-나프틸 아세테이트가 기질로 사용되었을 경우, 1.34 ㎖의 100 mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.0), 0.5㎕의 정제된 효소 용액 및 0.15 ㎖의 메탄올에 녹인 5 mM α-나프틸 아세테이트를 첨가하여 39℃에서 15분 동안 반응시켰다.

그런 다음, 0.01%(w/v) Fast Garnet GBC (sigma)을 포함하는 1.5 ㎖의 10% (w/v) SDS를 첨가하고 분광광도계 UV-Vis 8453 (Agilent, USA)을 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다(Koseki T, Furuse S, Iwano K, Sakai H, Matsuzawa H(1997) Biochem J. 326:485-490). 아세틸화 자일란, 벌크우드 자일란(birchwood xylan, 시그마) 및 비치우드 자일란(시그마)에 대한 재조합 NfAXE1의 기질 특이성을 결정하기 위해, 아세트산 무수물/디메틸 설폭시드(acetic anhydride/dimethyl sulfoxide) 방법을 사용하여 아세틸화시켰고, 가용성 분획은 효소 분석을 위해 준비하였다. NfAXE1 활성은 아세틸화된 벌크우드 및 비치우드 자일란으로부터 방출된 아세트산을 측정하여 분석하였다. 아세트산은 25℃에서 HPX-87H 컬럼 (Bio-rad, CA)을 이용하여 HPLC (Agilent, USA)로 정량하였다. 30㎕ 샘플은 유속 0.6ml/분으로 0.01N H₂SO₄로 주입하였다. NfAXE1 및 자일라나제의 시너지 효과를 측정하기 위해, 250 Uml^-1 유닛의 상업용 자일라나제(시그마, USA)를 정제된 NfAXE1(124 Uml^-1)에 첨가하였다. 자일라나제 활성은 기질로 2% 아세틸화된 벌크우드 자일란으로 40℃에서 30분 동안 측정하였다.

<실시예 1. NfAXE1의 클로닝 및 유전자 분석>

앞서 제작한 EST 라이브러리(Kwon et al. manuscript in preparation)는 네오칼리마스틱스 프론탈리스(N. frontalis)의 아세틸 자일란 에스터라제를 포함하는 후보 클론을 선별하는데 이용되었다. 추정의 셀룰라제를 위해 선별된 38 콘티그에 기초하여 조사한 결과, 1494 bp를 갖는 하나의 콘티그가 곰팡이 아세틸 자일란 에스터라제와 상당한 유사성을 나타내었다(도 1A). 선별된 콘티그의 서열은 108 bp 5′UTR 및 362 bp 3′UTR 을 갖는 981 bp ORF을 위한 서열을 포함하는 것으로 분석되었다. 그러므로, 총 1494 bp의 NfAXE1 서열은 네오칼리마스틱스 프론탈리스의 총길이에 가까운 것으로 분석되었고, NfAXE1으로 정하였다. NfAXE1을 코딩하는 게놈 DNA를 시퀀싱하였고, cDNA와 비교하였을 때, NfAXE1 게놈 DNA는 인트론이 없었고, DUF 도메인과 높은 유사성을 나타내는 하나의 엑손으로 구성되어 있는 것을 확인하였다(도 1B). BLAST 알고리즘을 사용하여 GenBank 데이터 베이스를 검색한 결과 오 르피노마이세스 종(Orpinomyces sp) 균주 PC-2 아세틸 자일란 에스터라제 A(AXEA) 및 네오칼리마스틱스 페트리시아룸(Neocallimastix patriciarum) 아세틸 자일란 에스터라제(BnaI) 유전자와 높은 유사성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. AXEA 및 bnaI을 제외하고, NfAXE은 NCBI 데이터베이스에 있는 다른 AXE와 매우 낮은 동일성을 나타내었다(20% 이하). cDNA 및 게놈 DNA 서열의 비교 결과 게놈 DNA는 인트론이 없는 하나의 엑손으로 구성되어 있는 것을 확인하였다(도 1). NfAXE cDNA의 유도된 아미노산 서열은 두 개의 가장 유사한 아미노산 서열과 비교한 결과, 오르피노마이세스 종(Orpinomyces sp) 균주 PC-2 아세틸 자일란 에스터라제 A (AXEA) 및 네오칼리마스틱스 페트리시아룸(Neocallimastix patriciarum) 아세틸 자일란 에스터라제(BnaI)은 73%, 55.6% 유사성을 각각 나타내었다(도 2). NfAXE1은 N-말단 영역에 많은 소수성 서열을 갖는 326 아미노산 잔기로 구성되었고, 이는 엑스파시 분석 도구(Expassy analysis tool)을 이용하여 분석한 결과, 22 및 23 사이의 잔기에 절단 자리를 갖는 추정의 신호 펩티드의 존재 가능성 0.559을 제시하였다.

BLASTP 분석으로 GenBank 데이터 베이스를 검색한 결과 NfAXE1의 326개 아미노산은 오르피노마이세스 종 AXEA (AAC14690.1), 네오칼리마스틱스 페트리시아룸 bnaI (AAB69090.1)과 74% 및 64%의 서열 동일성을 나타내었고, 피브로박터 숙시노젠 아종 숙시노제네시스 S85(AAG36766.1, Fibrobacter succinogenes sub sp. succinogenesis S85)과는 44%의 서열 동일성을 나타내었다. 셀룰로오스 결합 도메인이 많은 헤미셀룰라제 및 아세틸 자일란 에스터라제에서 관찰되었다고 하더라도, NfAXE1은 셀룰로오스 결합 도메인을 포함하지 않았다. 그러나, BLASTP 분석한 결과 아직 명확하진 않지만 NfAXE1이 원핵생물 및 바이러스에 제한적인 것으로 보이는 기능을 갖는 보존된 DUF303 도메인을 포함하는 것으로 나타났다. NfAXE1은 오르피노마이세스 AXEA와 같이 링커 서열이 존재하지 않거나 네오칼리마스틱스 페트리시아룸 BnaI의 C-말단에 존재하는 다커린 도메인(dockerin domain, NCRPD)을 포함하지 않았다(도 2). 비록 AXEA 및 BnaI이 게놈 서열에서 인트론을 갖는다 하더라도, NfAXE1 의 게놈 DNA는 어떤 인트론도 포함하지 않았다. 피브로박터 숙시노제네시스 아종 S85 Axe6A 뿐만 아니라 혐기적 반추위 곰팡이 오르피노마이세스 종 AXEA 및 네오칼리마스틱스 페트리시아룸 BnaI(도 4)은 계통 발생 분석 결과 같은 분기군에 있는 것으로 확인되었다. 다른 AXEs은 NfAXE1과 단지 20%~30% 동일성을 나타내었다. 동일성을 조사한 결과, NfAXE1은 또 다른 혐기성 곰팡이 오르피토마이세스의 AXEA와 가장 밀접한 연관이 있으나 몇몇의 박테리아 특성을 포함하는 것으로 확인되었다.

<실시예 2. NfAXE1의 발현 및 정제와 활성 평가>

예상되는 ORF가 기능적 효소를 코딩하는지 조사하기 위해, NfAXE1을 코딩하는 총 길이 cDNA를 박테리아 발현벡터 pET28로 클로닝하였고, 대장균 BL21 (DE3) 세포에서 발현시켰다. pET28a-NfAXE1을 갖고 있는 대장균 BL21 (DE3)의 세포 50ml을 LB 배지가 담긴 20 리터 플라스크에서 배양하였고, 폴리히스티딘이 표지된 재조합 NfAXE1의 발현은 IPTG의 첨가에 의해 유도하였다. 대장균 세포의 초음파 분해 후에, N-말단 His-tags를 갖는 재조합 단백질의 가용성 분획은 친화성 Ni-NTA 아가로스 컬럼을 이용하여 정제하였다. pET28a-NfAXE1을 갖는 대장균 세포 50ml은 IPTG 유도 후에 543mg의 총 단백질을 만들어내었다. IPTG 유도 후 12시간이 지나서, 대략 43kDa 분자량인 하나의 중요한 단백질을 세포 추출물로부터 검출하였다(도 4). 그러나, 비어 있는 pET28 벡터를 포함하는 대장균은 43 kDa 분자량을 갖는 단백질을 만들어내지 못했다(도 4의 레인 1). 용출 단백질 분획물의 쿠마시 블루 염색한 SDS-PAGE는 재조합 NfAXE1이 몇 개의 마이너 밴드가 아직 젤에서 나타나기 때문에 부분적으로 정제되었다는 것을 보여주었다(도 4A). 정제된 재조합 단백질의 순도를 결정하기 위해, 부분적으로 정제된 4㎕의 단백질을 마이크로플루이딕 칩에 로딩하였고, 젤 전기영동을 수행하였다. 로딩된 단백질 샘플 중에서 43kDa 단백질 밴드의 농도가 대략 90%이므로 순도를 대락 90%로 예상하였다(도 4B). 재조합 NfAXE1 모노머의 분자량은 대략 43.5kDa으로 계산되었다(도 4A). 그러나, NfAXE1의 유도된 아미노산 서열에 기초한 이론적인 분자량은 Expasy (http:://Expasy.org)의 Compute pI/Mw tool을 이용한 결과 36505.92Da로 계산되었다. N-말단의 His₆ 분자량의 증가는 대략 1800.92 kDa이나, 단백질 젤에서 분자량의 불일치 이유는 아세틸 자일란 에스터라제의 번역 후 변형에 의한 것으로 예측되어진다(Harrison MJ, Wathugala IM, Tenkanen M, Packer NH, Nevalainen KM (2002) Glycobiology 12:291- 298).

유도된 아미노산 서열을 Expasy (http://Expasy.org)의 Compute pI/Mw tool를 이용하여 분석한 결과 NfAXE1의 등전점은 4.54로 계산되었다. 재조합 NfAXE1의 효소 분석은 기질로 p-니트로페닐 아세테이트(pNA)를 이용하여 최적 온도 및 pH를 결정하기 위해 수행되었다. pET21-NfAXE1를 포함하는 대장균의 단백질 추출물은 빈 벡터 pET21를 갖는 대장균과 마찬가지로 IPTG 유도 전에는 어떤 활성도 나타내지 않았다. 그러나 IPTG 유도 후 NfAXE1의 활성은 적정 온도와 pH에서 기질로써 pNA를 사용한 경우 상당히 증가하였다(도 5). 도 5A에서 보여주듯이, 재조합 NfAXE1은 40℃에서 가장 큰 활성을 나타내었고, 온도가 증가함에 따라 감소하였다. 이것은 오르피노마이세스 AXEA 및 네오칼리마스틱스 페트리시아룸 BnaI에서도 유사한 패턴을 나타내었다. 게다가, NfAXE1은 약한 알칼리 조건(pH 8)에서 가장 큰 활성을 나타내었다(도 6B). 오르피노마이세스의 경우, AXEA는 pH 9에서 가장 큰 활성을 나타내는 반면에(Blum et al 1999) 네오칼리마스틱스 페트리시아룸 BnaI는 pH 5.5에서 가장 큰 활성을 나타내었다(Cybinski et al. 1999). Ni-NTA 컬럼을 이용하여 몇 번의 세정 및 정제 단계를 거침으로써, NfAXE1 단백질은 28.1%의 수율인 121.3배로 정제되었고 기질로 p-NA을 이용하여 분석한 경우 495.2 U mg^-1 인 특이적 활성을 나타내었다(표 1). 많은 아세틸 자일란 에스터라제가 넓은 기질 특이성을 갖는다고 보고됨에 따라, 표 2와 같이 다양한 기질을 이용하여 재조합 NfAXE1 활성을 최적의 온도 및 pH 조건에서 분석하였다(표 2).

표 1. 대장균 BL21(DE3)로부터 NfAXE1의 정제

표 2. NfAXE1의 기질 특이성과 특이적 활성

α-나프틸 아세테이트가 기질로써 사용되었을 때, 재조합 NfAXE1의 활성은 327.9 U mg^-1을 나타내었고, 이것은 최적 조건에서 pNA에 대한 기질 활성보다 약간 낮았다. 기질로써 비치우드와 벌크우드 자일란의 경우, 활성은 각각 216.6 U mg^-1 및 150.8 U mg^-1이다. 그러므로, NfAXE1은 넓은 기질 특이성을 갖는 것으로 보이지만 pNA가 가장 높았다. AXE가 자일라나제 활성에서 시너지 효과를 갖는다는 보고 때문에(Cybinski DH, Layton I, Lowry JB, Dalrymple BP (1999) Appl Microbiol Biotechnol 52:221-225), 당의 양을 감소시킨 조건에서 상업용 자일라나제 및 기질로서 아세틸화된 벌크우드 자일란을 이용하여 분석하였다. 자일라나제가 아세틸화 벌크우드 자일란의 분해를 위해 단독으로 사용되었을 때, 방출된 자일로스의 양은 약 0.45 μmole/분이다(도 6). 재조합 NfAXE1을 첨가하였을 때 방출된 자일로스의 양은 0.65 μmole/분 속도로 현저히 증가하였다(도 6). 따라서, 아세틸화 헤미셀룰 로스 분해 양은 헤미셀룰로스의 아세틸화에 의해 제한되어지는 것으로 보이고, NfAXE1의 첨가는 자일라나제 매개에 의해 자일란 분해의 효율성을 증가시킬 수도 있다.

도 1은 T3 및 T7 프라이머를 이용하여 진균류 아세틸 자일란 에스터라제(a)에 서열 상동성을 나타내는 삽입물을 갖는 cDNA 클론을 증폭한 PCR 산물을 DNA 전기영동을 수행한 결과 및 NfAXE1을 코딩하는 게놈 DNA의 구조를 나타낸다. 분리된 1451 NfAXE1 cDNA는 5′UTR의 108bp 및 3′UTR의 362 bp를 갖는 981 ORF를 포함한다.

도 2는 오르피노마이세스 종 균주 PC-2 (등록번호 AF001178)의 아세틸 자일란 에스터라제 A(AxeA), 네오칼리마스틱스 페트리시아룸 (등록번호 U66251)의 아세틸 자일란 에스터라제 (bnaI) 및 본 발명의 네오칼리마스틱스 프론탈리스의 아세틸 자일란 에스터라제 (NfAXE1)의 추론된 아미노산 서열들의 비교를 나타낸다. 총 단백질의 N-말단으로부터 잔기의 번호는 오른쪽에 보여준다. *은 보존된 아미노산을 나타낸다. :은 보존된 치환을 나타낸다. .은 반-보존된 치환을 나타낸다. -->은 보존된 DUF 303 도메인 영역을 나타낸다.

도 3은 NfAXE1을 가지고 AXEs의 계통 발생 분석을 수행한 결과이다. 추론된 AXE 아미노산 서열은 GenBank 데이터 베이스에 있고, NfAXE1의 아미노산 서열과 40% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 계통 발생 분석을 위해 선별하였다. 계통 발생 트리는 벡터 NTI 프로그램을 이용하여 Neighbor-joining 방법으로 만들었다. 등록번호 옆의 괄호 안의 숫자는 서열간의 분기(divergence)의 정도를 나타낸다.

도 4는 대장균에서 발현된 NfAXE1 단백질 정제를 보여주는 그림이다. (A)는 정제의 다양한 단계에서 단백질의 쿠마시 염색을 수행한 SDS-PAGE 이다. M, 분자마커 (kDa); 레인 1, 대조구인 pET28a을 갖고 있는 세포; 레인 2, IPTG 유도 후 pET28a-NfAXE1을 갖고 있는 정제전 세포; 레인 3, 정제된 재조합 NfAXE1. (B) SP는 내부 신호 피크를 나타낸다; *은 자동화된 전기영동 시스템에 의해 분석된 정제된 목적 단백질 피크를 나타낸다(Experion, Bio-RAD).

도 5는 기질로서 p-니트로페닐 아세테이트를 이용한 재조합 NfAXE1의 활성을 온도(A) 및 pH(B) 조건에 따라 조사한 결과이다. 빈 벡터인 pET28a을 갖고 있는 대장균 세포에서는 효소 활성이 관찰되지 않았다.

도 6은 아세틸화 벌크우드 자일란으로부터 감소된 당의 방출을 나타내는 그림이다. 기질은 250 U ml^-1 자일라나제 단독 또는 250 U ml^-1 자일라나제와 124 U ml^-1 NfAXE1을 함께 넣고 40℃에서 30분 동안 반응시켰다.

<110> Korea National Open University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Acetyl xylan esterase protein from Neocallimastix frontalis <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1494 <212> DNA <213> Neocallimastix frontalis <220> <221> CDS <222> (152)..(1129) <400> 1 agctcgcgcg ctgcaggtcg acactagtgg atccaaagaa ttcggcacga ggaaaaaaaa 60 aaaaatacat atataaataa taaataaaaa aaattaaaaa ataaaataaa taataattta 120 attttataaa ttaataaata atatatcaaa g atg aga gcc agt att 166 Met Arg Ala Ser Ile 1 5 att tta tct ttc tta gct gct act tta act gtt atg tca aag gct gtt 214 Ile Leu Ser Phe Leu Ala Ala Thr Leu Thr Val Met Ser Lys Ala Val 10 15 20 agc aag cca gat cca aac ttc cac att tac tta gct ttc ggt caa tct 262 Ser Lys Pro Asp Pro Asn Phe His Ile Tyr Leu Ala Phe Gly Gln Ser 25 30 35 aac atg gaa ggt caa gct aac ctt gaa gtt caa gat aga gtt gaa gac 310 Asn Met Glu Gly Gln Ala Asn Leu Glu Val Gln Asp Arg Val Glu Asp 40 45 50 aag cgt ttc aag tta att tca act gct gat gaa tgt atg ggt cgt gaa 358 Lys Arg Phe Lys Leu Ile Ser Thr Ala Asp Glu Cys Met Gly Arg Glu 55 60 65 gtt ggt caa tgg tac tca gct ctt cca cca att gtt aac tgt tac ggt 406 Val Gly Gln Trp Tyr Ser Ala Leu Pro Pro Ile Val Asn Cys Tyr Gly 70 75 80 85 tac tta ggt cca ctt gat tac ttc ggt cgt act tta act aag aag tta 454 Tyr Leu Gly Pro Leu Asp Tyr Phe Gly Arg Thr Leu Thr Lys Lys Leu 90 95 100 cca gaa gaa att acc att ggt gtt gtt cca gtt gct att gct ggt tgt 502 Pro Glu Glu Ile Thr Ile Gly Val Val Pro Val Ala Ile Ala Gly Cys 105 110 115 gat att caa ctt ttc gaa gaa gaa aac tat caa tcc tac gaa att cca 550 Asp Ile Gln Leu Phe Glu Glu Glu Asn Tyr Gln Ser Tyr Glu Ile Pro 120 125 130 gat tgg atg caa ggt aga gtt gac cgt tac ggt ggt aac cca ttc cgt 598 Asp Trp Met Gln Gly Arg Val Asp Arg Tyr Gly Gly Asn Pro Phe Arg 135 140 145 cgt tta att gat gtt gcc aag aag gct caa gaa gct ggt gtt att aag 646 Arg Leu Ile Asp Val Ala Lys Lys Ala Gln Glu Ala Gly Val Ile Lys 150 155 160 165 ggt att ctt ctt cac caa ggt gaa acc aac aac gga caa gaa aac tgg 694 Gly Ile Leu Leu His Gln Gly Glu Thr Asn Asn Gly Gln Glu Asn Trp 170 175 180 cca caa cgt att aag gtt ctt tac gaa aga ata ctt aag gaa tta gac 742 Pro Gln Arg Ile Lys Val Leu Tyr Glu Arg Ile Leu Lys Glu Leu Asp 185 190 195 tta aag gct gaa gaa gtt cca ctt att gct ggt gaa gtt gtt cgt act 790 Leu Lys Ala Glu Glu Val Pro Leu Ile Ala Gly Glu Val Val Arg Thr 200 205 210 gaa att gac ggt ctt tgt ggt gct cac aat gaa gtc att aag aag ctt 838 Glu Ile Asp Gly Leu Cys Gly Ala His Asn Glu Val Ile Lys Lys Leu 215 220 225 cca gaa gtt att cca act gct cac gtt att tct tct gaa ggt tta gaa 886 Pro Glu Val Ile Pro Thr Ala His Val Ile Ser Ser Glu Gly Leu Glu 230 235 240 245 caa caa ggt gat ggt ctt cac ttc aac agt gct tct tac cgt atc ttc 934 Gln Gln Gly Asp Gly Leu His Phe Asn Ser Ala Ser Tyr Arg Ile Phe 250 255 260 ggt gaa cgt tac gct gac aag atg tta gaa ctt ctt aac ggt aac aag 982 Gly Glu Arg Tyr Ala Asp Lys Met Leu Glu Leu Leu Asn Gly Asn Lys 265 270 275 act gaa gaa aag gaa act gaa act gtt gaa aag gaa act gaa acc gtt 1030 Thr Glu Glu Lys Glu Thr Glu Thr Val Glu Lys Glu Thr Glu Thr Val 280 285 290 gaa aag gaa act gaa gct gct gaa gaa gtt agt gac gaa gat gaa gct 1078 Glu Lys Glu Thr Glu Ala Ala Glu Glu Val Ser Asp Glu Asp Glu Ala 295 300 305 gtt gaa gct gga act agt gaa gtt gaa gaa gaa gat tct gct gaa gaa 1126 Val Glu Ala Gly Thr Ser Glu Val Glu Glu Glu Asp Ser Ala Glu Glu 310 315 320 325 aat t aaataaatat aaaattaaat tattatttaa gaaaaaaaaa taagaacata 1180 Asn aatataaaaa aaaaaagaag cataattatt gcttaatttt ttaatcattt tataaataaa 1240 aaatataaat gaatatctac aaccaatggt gtaaatttta ttaaataaaa aagaactaat 1300 taatttgata ttatttagta tacaattgta taataaaaat aatacattaa tagcttataa 1360 gcaaatttcc aaatttttta ttaaaaataa gagtgggatt tttataaata tttaaattta 1420 atataagaat attatataag cttatatgct aaaaaaaaat agaatttnat tttttaatna 1480 aaattataat ttat 1494 <210> 2 <211> 326 <212> PRT <213> Neocallimastix frontalis <400> 2 Met Arg Ala Ser Ile Ile Leu Ser Phe Leu Ala Ala Thr Leu Thr Val 1 5 10 15 Met Ser Lys Ala Val Ser Lys Pro Asp Pro Asn Phe His Ile Tyr Leu 20 25 30 Ala Phe Gly Gln Ser Asn Met Glu Gly Gln Ala Asn Leu Glu Val Gln 35 40 45 Asp Arg Val Glu Asp Lys Arg Phe Lys Leu Ile Ser Thr Ala Asp Glu 50 55 60 Cys Met Gly Arg Glu Val Gly Gln Trp Tyr Ser Ala Leu Pro Pro Ile 65 70 75 80 Val Asn Cys Tyr Gly Tyr Leu Gly Pro Leu Asp Tyr Phe Gly Arg Thr 85 90 95 Leu Thr Lys Lys Leu Pro Glu Glu Ile Thr Ile Gly Val Val Pro Val 100 105 110 Ala Ile Ala Gly Cys Asp Ile Gln Leu Phe Glu Glu Glu Asn Tyr Gln 115 120 125 Ser Tyr Glu Ile Pro Asp Trp Met Gln Gly Arg Val Asp Arg Tyr Gly 130 135 140 Gly Asn Pro Phe Arg Arg Leu Ile Asp Val Ala Lys Lys Ala Gln Glu 145 150 155 160 Ala Gly Val Ile Lys Gly Ile Leu Leu His Gln Gly Glu Thr Asn Asn 165 170 175 Gly Gln Glu Asn Trp Pro Gln Arg Ile Lys Val Leu Tyr Glu Arg Ile 180 185 190 Leu Lys Glu Leu Asp Leu Lys Ala Glu Glu Val Pro Leu Ile Ala Gly 195 200 205 Glu Val Val Arg Thr Glu Ile Asp Gly Leu Cys Gly Ala His Asn Glu 210 215 220 Val Ile Lys Lys Leu Pro Glu Val Ile Pro Thr Ala His Val Ile Ser 225 230 235 240 Ser Glu Gly Leu Glu Gln Gln Gly Asp Gly Leu His Phe Asn Ser Ala 245 250 255 Ser Tyr Arg Ile Phe Gly Glu Arg Tyr Ala Asp Lys Met Leu Glu Leu 260 265 270 Leu Asn Gly Asn Lys Thr Glu Glu Lys Glu Thr Glu Thr Val Glu Lys 275 280 285 Glu Thr Glu Thr Val Glu Lys Glu Thr Glu Ala Ala Glu Glu Val Ser 290 295 300 Asp Glu Asp Glu Ala Val Glu Ala Gly Thr Ser Glu Val Glu Glu Glu 305 310 315 320 Asp Ser Ala Glu Glu Asn 325 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gccatatgag agccagtatt att 23 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccggatcctt aattttcttc agcagaa 27

Claims (11)

1. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 네오칼리마스틱스 프론탈리스(Neocallimastix frontalis) 유래의 아세틸 자일란 에스터라제 NfAXE1(Neocallimastix frontalis Acetyl Xylan Esterase 1) 단백질.
2. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 40℃, pH 8에서 최적 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 단백질.
3. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 p-니트로페닐 아세테이트, α-나프틸 아세테이트, 아세틸화 벌크우드 자일란 또는 아세틸화 비치우드 자일란에 기질 특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
4. 제1항의 NfAXE1 단백질을 코딩하는 유전자.
5. 제4항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
6. 제4항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
7. 제6항에 있어서, 상기 벡터는 pET28a-NfAXE1인 것을 특징으로 하는 벡터.
8. 제6항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
9. 제8항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
10. 제4항의 유전자를 미생물에서 과발현시킴으로써 NfAXE1 단백질을 대량 생산하는 방법.
11. 제1항의 단백질에 대한 항체.

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