JP2003210182A

JP2003210182A - 好熱性エンドグルカナーゼ

Info

Publication number: JP2003210182A
Application number: JP2002295578A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiko Ishikawa; 一彦石川; Hiroyasu Ishida; 紘靖石田; Yoshiji Kosugi; 佳次小杉; Susumu Ando; 進安藤; Akira Shimomura; 朗下村
Original assignee: Rakuto Kasei Industrial Co Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: Rakuto Kasei Industrial Co Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2001-11-14
Filing date: 2002-10-09
Publication date: 2003-07-29
Also published as: US20030129723A1

Abstract

(57)【要約】【課題】工業的に利用し易い好熱性エンドグルカナー
ゼを提供する。【解決手段】好熱性エンドグルカナーゼ活性を有する
ポリペプチド、それをコードするヌクレオチド配列を含
有する単離されたＤＮＡ、このＤＮＡを含む組換えＤＮ
Ａおよび発現ベクター、この発現ベクターにより形質転
換された形質転換体ならびにこの形質転換体を用いて前
記ポリペプチドを製造する方法を見出した。生成された
エンドグルカナーゼは、約９７℃の高温域において、最
大活性を示し、工業的利用に有利である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規好熱性エンド
グルカナーゼ、好熱性エンドグルカナーゼをコードする
ＤＮＡ、好熱性エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ
により形質転換された形質転換体、および形質転換体を
用いる好熱性エンドグルカナーゼの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】セルロースは、Ｄ−グルコースがβ-1，
4結合で直鎖状につながったホモ多糖であり、自然界に
最も多く存在する。天然には結晶状、あるいは非結晶状
で存在しており、リグニン、へミセルロース類、ペクチ
ン類などとともに複雑に結合して植物組織を構成してい
る。

【０００３】セルラーゼは、セルロースをセロオリゴ
糖、セロビオース、最終的にはグルコースにまで分解す
る酵素反応系を触媒する酵素群の総称であり、真菌、ア
クチノミセス類、粘液細菌、および真の細菌を包含する
多数の微生物により、または植物により、合成される。
特に、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカス（Acre
monium cellulolyticus）の生産するセルラーゼは糖化
力の強いことが特徴であり、飼料用途やサイレージ用途
での有用性が報告されている（特開平4-117244号公報、
特開平7-236431号公報）。広範な種類の特異性を有する
セルラーゼが同定されてきている。

【０００４】セルラーゼの非常に重要な工業的使用は、
例えば、洗剤組成物または布帛柔軟化組成物中の成分と
して、セルロースの繊維材料または布帛の処理、新しい
布帛のバイオポリッシング（酵素による仕上げ加工）、
およびセルロース含有布帛、特にデニムの「ストーンウ
ォッシド」外観のための使用である。

【０００５】さらにセルラーゼは、紙パルプの処理、例
えば、排水の改良またはリサイクル紙の脱インクのため
に使用され得る。

【０００６】セルラーゼは、その作用様式によって、エ
ンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、β―グルコシ
ダーゼに大別される。なかでも、エンドグルカナーゼ、
（エンドβ−１，４−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．
４）は、生理的条件下で、セルロースの構成成分であ
る、Ｄ−グルコース同士のβ-1,4-グルコシド結合を加
水分解する、セルロース処理に有効な酵素である。エン
ドグルカナーゼは、セルロース、セルロース誘導体（例
えば、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエ
チルセルロース）、リケニンにおける１，４−β−Ｄ−
グルコシド結合、混合β−１，３−グルカン、例えば、
穀物のβ−Ｄ−グルカンまたはキシログルカンおよびセ
ルロース部分を含有する他の植物材料におけるβ−１，
４結合のエンド加水分解を触媒する。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これま
で見出されているほとんどのエンドグルカナーゼは、至
適温度は、３５℃から６０℃付近であり、特に結晶状セ
ルロースおよび繊維の処理には、耐熱性が低いカビ由来
の酵素を使用して行われているのが現状である。反応効
率の観点から言えば、さらにより高温で反応を行う方が
望ましく、これまでに、至適温度が７５℃以上であるエ
ンドヌクレアーゼが開発されている（例えば、特許文献
１参照。）が、遺伝子工学的手法で本酵素を得る場合お
よび得られた酵素を使用してセルロース処理を行う場合
等に混入物を除去しあるいは混入物の反応への影響を除
く為に、１００℃近い高温でもなお、安定かつ触媒活性
を保持し得るエンドグルカナーゼ（以下、「好熱性エン
ドグルカナーゼ」という）が渇望されている。

【０００８】

【特許文献１】特開平１１−７５８４９号公報

【０００９】本発明の目的は、新規な好熱性エンドグル
カナーゼ、そのアミノ酸配列、それをコードするヌクレ
オチド配列を含むＤＮＡを提供することにある。さら
に、該ＤＮＡを含む発現ベクター、それを含む形質転換
体、およびこのような好熱性エンドグルカナーゼの製造
方法を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するため、鋭意検討した結果、９０-１００℃
で生育する超好熱性細菌に着目し、高温（100℃以上）
で生育する好熱菌であるパイロコッカス・ホリコシ（JC
M９９７４）から新規好熱性エンドグルカナーゼを見出
し、本発明を完成させるに至った。本発明によれば、以
下の特性を有する新規なエンドグルカナーゼが提供され
る： a．分子量約４３キロダルトン; b．至適温度９５℃以上１００℃以下； c. 至適ｐＨ５．４〜６．０； d．安定性約９７℃で３時間安定。

【００１１】１つの実施態様において、前記好熱性エン
ドグルカナ−ゼは、原核生物に由来する。

【００１２】また、１つの実施態様において、前記好熱
性エンドグルカナーゼは、パイロコッカス（Pyrocucou
s）属に由来する。

【００１３】さらに、１つの実施態様において、前記好
熱性エンドグルカナーゼは、パイロコッカスホリコシ
（Pyrocucous horikoshii）に由来する。

【００１４】本発明おいて、前記好熱性エンドグルカナ
ーゼは、配列表の配列番号２の１位〜４５８位のアミノ
酸配列を有する。

【００１５】また、１つの実施態様において、前記好熱
性エンドグルカナーゼは、配列表の配列番号２の１位〜
４５８位のアミノ酸配列において、１ないし１００個の
アミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸
配列を含み、かつ好熱性エンドグルカナ−ゼ活性を有す
る。

【００１６】また、１つの実施態様において、好熱性エ
ンドグルカナ−ゼは、配列表の配列番号２の２９位〜４
５８位のアミノ酸配列を有する。

【００１７】また、１つの実施態様において、好熱性エ
ンドグルカナ−ゼは、配列表の配列番号２の２９位〜４
５８位のアミノ酸配列において、１ないし１００個のア
ミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配
列を含み、かつ好熱性エンドグルカナ−ゼ活性を有す
る。

【００１８】また、別の実施態様において、好熱性エン
ドグルカナ−ゼは、原核生物に由来する。

【００１９】また、別の実施態様において、好熱性エン
ドグルカナ−ゼは、パイロコッカス（Pyrocucous）属に
由来する。

【００２０】また、別の実施態様において、好熱性エン
ドグルカナ−ゼは、パイロコッカスホリコシ（Pyrocuco
us horikoshii）に由来する。

【００２１】本発明においてはまた、前記好熱性エンド
グルカナ−ゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む
ＤＮＡが提供される。

【００２２】本発明においてはまた、配列表の配列番号
１の１位〜４５８位のアミノ酸配列をコードするポリヌ
クレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子が提供され
る。

【００２３】別の実施態様では、配列表の配列番号１の
１位〜４５８位のアミノ酸配列において、１ないし１０
０個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたア
ミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む単
離されたＤＮＡ分子が提供される。

【００２４】また別の実施態様では、配列表の配列番号
１の２９位〜４５８位のアミノ酸配列をコードするポリ
ヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子が提供さ
れる。

【００２５】また別の実施態様では、配列表の配列番号
１の２９位〜４５８位のアミノ酸配列において、１ない
し１００個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加さ
れたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を
含む単離されたＤＮＡ分子が提供される。

【００２６】さらに別の実施態様では、配列表の配列番
号１の第１残基〜第１３７４残基までに記載のポリヌク
レオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子が提供され
る。

【００２７】さらに別の実施態様では、配列表の配列番
号１の第８５残基〜第１３７４残基までに記載のポリヌ
クレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子が提供され
る。

【００２８】さらに別の実施態様では、配列表の配列番
号１の第８５残基〜第１３７７残基までに記載のポリヌ
クレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし得、かつ好熱性エンドグルカナーゼ活性を有す
るポリペプチドをコードする、単離されたＤＮＡ分子が
提供される。

【００２９】本発明においてはまた、好熱性エンドグル
カナーゼをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
分子を含む発現ベクター、このような発現ベクターによ
り形質転換された形質転換体、および形質転換体を用い
た好熱性エンドグルカナーゼの製造方法が提供される。

【００３０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。本明細書中で使用するセルロースには、アビセル、
カルボキシメチルセルロース、リケナン等が含まれる。

【００３１】本明細書の用語「エンドグルカナーゼ」
は、任意のエンドグルカナーゼ、即ちセルロースのＤ−
グルコース同士のβ-1,4-グルコシド結合の加水分解的
開裂を触媒する酵素を意図する。そのようなエンドグル
カナーゼのＥＣ番号は３．２．１．４である。

【００３２】本発明の「好熱性エンドグルカナーゼ」
は、９０℃から１００℃付近の高温下で安定でかつその
温度領域を至適温度とするエンドグルカナーゼである。
好ましくは、さらに以下の特性を有する： a．分子量約４３キロダルトン; b．至適温度９５℃以上１００℃以下； c. 至適ｐＨ５．４−６．０； d．安定性約９７℃で３時間安定。

【００３３】本発明の好熱性エンドグルカナーゼは、原
核生物、好ましくは、古細菌パイロコッカス（Pyrococc
us）属、より好ましくは、超好熱性細菌で最適成長温度
が９８℃である硫黄代謝好熱菌パイロコッカス・ホリ
コシ（Pyrococcus horikoshii,登録番号JCM９９７４JC
M微生物株カタログ第７版，１９９９年１月発行）から
得られ得る。

【００３４】本発明の好熱性エンドグルカナーゼは、例
えば配列表の配列番号２に記載の天然型のアミノ酸配列
を有する。あるいは、配列表の配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列において、１ないし１００個のアミノ酸残基が
欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含み、か
つ天然型の好熱性エンドグルカナーゼと実質的に同等の
活性を有するポリペプチドも、本発明の好熱性エンドグ
ルカナーゼに含まれる。

【００３５】人為的に作製される機能的に同等の活性を
有するポリペプチドには、多様な変異が導入され得る。
このようなポリペプチドは、当業者に周知の遺伝子組換
え技術を用いて、目的のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを改変し、改変したＤＮＡを発現させることにより得
られ得る。得られたポリペプチドが天然型のポリペプチ
ドと同等の活性を有するか否かは、その活性を測定する
ことにより容易に決定され得る。

【００３６】本発明の好熱性エンドグルカナーゼは、融
合タンパクとして調製することもできる。融合タンパク
は、ペプチド結合により融合した第一のペプチドと第二
のペプチドを含む。第一のペプチドは、本発明で定義さ
れる好熱性エンドグルカナーゼである。第二のペプチド
は、特定のタンパク質またはその断片であり得る。その
ような第二のペプチドになり得る特定のたんぱく質に
は、ベータガラクトシダーゼ、グルタチオンＳトランス
フェラーゼ、ルシフェラーゼ、ホースラディッシュペル
オキシダーゼ等がある。

【００３７】本発明の好熱性エンドグルカナーゼをコー
ドするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１に記載
のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得
る。あるいは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列において、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置
換、または付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレ
オチド配列を含み得る。好ましくは、このヌクレオチド
配列は、配列表の配列番号１の第１残基から第１３７４
残基に記載のポリヌクレオチド配列または配列表の配列
番号１の第８５残基から第１３７４残基までの配列であ
る。あるいは、配列表の配列番号１の第１残基から第１
３７７残基に記載のポリヌクレオチド配列または配列表
の配列番号１の第８５残基から第１３７７残基までの配
列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得、
かつ好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列であり得る。

【００３８】一般的に、ポリヌクレオチド配列の変異体
またはホモログの人為的調製法は、当業者に周知であ
り、そのような技術を用いて、例えば天然型の好熱性エ
ンドグルカナーゼ活性を保持する変異体またはホモログ
を調製することができる。このような変異体またはホモ
ログも本発明の好熱性エンドグルカナーゼに含まれる。

【００３９】ここで、ハイブリダイズの為の「ストリン
ジェントな条件」とは、例えば、６５℃における０．２
×ＳＳＣをいう。

【００４０】天然型の好熱性エンドグルカナーゼポリヌ
クレオチドは、例えば、パイロコッカス・ホリコシ培養
後、BLAST探索法を使用して、本好熱性細菌の遺伝子配
列からPyrococcus furiosusのエンドグルカナーゼ配列
に類似し、本酵素活性を示すと思われる遺伝子（例えば
配列番号１）を、PCR反応で増幅し抽出して得られる。
次に本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換えベ
クターを含む形質転換体を培地中で培養し、培養物から
好熱性エンドグルカナ−ゼを採取する。

【００４１】用いるベクターは、特に限定されるもので
はないが、宿主細胞内で自立複製可能なものでも、染色
体に１コピーもしくは複数のコピーが挿入されるもので
も良く、上記ＤＮＡすなわち好熱性エンドグルカナーゼ
遺伝子を組み込むことができる挿入部位を持ち、更にこ
の組み込んだＤＮＡを宿主細胞内で発現させ得る能力が
必要である。

【００４２】なお、ベクターに組み込む好熱性エンドグ
ルカナーゼ遺伝子としては、ｃＤＮＡだけでなく、ｃＤ
ＮＡから予想されるアミノ酸配列をコードするように設
計して合成されたＤＮＡでも良い。このようなアミノ酸
配列を基にした遺伝子の合成は、ＤＮＡ自動合成機を利
用して合成したオリゴヌクレオチドをアニール後に連結
することなどにより、容易に行うことができる。

【００４３】好熱性エンドグルカナーゼ遺伝子を発現さ
せるプロモーターとしては、通常異種タンパク質の発現
に用いられる強力なプロモーターを用いることができ
る。また、好熱性エンドグルカナーゼ遺伝子の下流には
ターミネーターを挿入することもできる。例えば、tr
p、tac、lac、trc、λPL、T7等のプロモーター、tpA、l
pp、T4等のターミネーターが挙げられる。

【００４４】また、翻訳の効率化のために、ＳＤ配列の
種類、数、ＳＤ配列と開始コドンの間の領域の塩基組
成、配列、長さを好熱性エンドグルカナーゼ遺伝子の発
現に最適になるようにすることも可能である。

【００４５】好熱性エンドグルカナーゼ発現に必要なプ
ロモーターから翻訳開始点までの領域は、従来公知のＰ
ＣＲ法や化学合成法などにより調製することができる。

【００４６】本発明の組換えＤＮＡは、所望の発現系に
応じた公知の発現ベクターに、前記好熱性エンドグルカ
ナーゼ遺伝子を含むＤＮＡを従来公知の方法によって挿
入することにより得ることが可能である。ここで用いる
発現ベクターは多コピーのものであることが望ましい。

【００４７】本発明の組換えＤＮＡの調製に用いること
のできる公知のベクターとしてはpUC18、pHSG299、pET-
11a等が挙げられる。

【００４８】次に、前記組換えＤＮＡ、発現ベクターが
挿入されて得られる種々の形質転換体について説明す
る。

【００４９】発現ベクターに上記組換えＤＮＡを挿入し
て得た組換え発現ベクターの宿主細胞内への導入方法
は、従来の慣用的に用いられている方法により行うこと
ができる。コンピテントセル法、プロトプラスト法、リ
ン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、マ
イクロインジェクション法、リポソーム融合法等、種々
のものが挙げられる。

【００５０】該形質転換体となりうる宿主細胞として
は、E.coli等の細菌が挙げられる。E.coliの一具体例と
しては、JM109株（recA、endA1、gyrA96、thi、hsdR1
7、supE44、relA1、Δ(lac-proAB)/F'[traD36、proAB
+、lacIq、lacZΔM15]）がある。

【００５１】この他の形質転換体となりうる宿主細胞に
は、枯草菌、酵母、麹菌等があり、これらのタンパク質
分泌能を利用して、本発明の好熱性エンドグルカナーゼ
を培地中に生産させる方法も考えられる。さらには、動
物細胞、植物細胞、および昆虫細胞も含まれる。

【００５２】このような形質転換体の内部で調製された
タンパク質または分泌されて得られるタンパク質を公知
の方法で単離し、精製することにより、目的とする酵素
が得られる。

【００５３】E.coliを宿主とした場合には、不活性な会
合体、すなわちタンパク質封入体として好熱性エンドグ
ルカナーゼ遺伝子産物を得た後、これを適当な方法で活
性化することも可能であり、活性再生後、活性型タンパ
ク質を公知の方法で分離精製することにより、目的の酵
素を得てもよい。

【００５４】形質転換体を培養する為の培地は公知であ
り、例えば、E.coliではLB培地などの栄養培地や、M9培
地などの最小培地に炭素源、窒素源、ビタミン源等を添
加して用いることができる。形質転換体の培養は、宿主
に応じて、通常16−42℃、好ましくは25−37℃で5−168
時間、好ましくは8−72時間行う。振盪培養と静置培養
のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌、通気を行
ってもよい。

【００５５】好熱性エンドグルカナーゼの単離、精製方
法としては、形質転換体の抽出物より、公知の塩析、等
電点沈殿法もしくは溶媒沈殿法等の沈殿法、透析、限外
濾過もしくはゲル濾過等の分子量差を利用する方法、イ
オン交換クロマトグラフィー等の特異的親和性を利用す
る方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフ
ィー等の疎水度の差を利用する方法やその他アフィニテ
ィークロマトグラフィー、ＳＤＳポリアクリルアミド電
気泳動法、等電点電気泳動法などが挙げられ、これらを
組み合わせることにより精製が可能である。

【００５６】あるいは、生産された酵素は、加熱処理に
て簡単に単離精製できる。熱遺伝子組換えによる製造方
法については、以下の実施例で詳細に説明するが、当業
者にとっては、当分野における通常の技術を使用して本
発明の記載に種々の変更等を加えることが可能であり、
かかる変更等も本発明に含まれる。

【００５７】

【実施例】以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、
本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。 (実施例１) パイロコッカス・ホリコシの培養パイロコッカス・ホリコシは公知の好熱菌であり、その
培養条件なども知られているが、ここではその一例を挙
げる。

【００５８】13.5ｇのNaCl、4gのNa₂SO₄、0.7gのKCl、
0.2gのNaHCO₃、0.1gのKBr、30 mgのH ₃BO₃、10gのMgCl₂
・6H₂O、1.5gのCaCl₂、25mgのSrCl₂、1.0mlのレザスリ
ン溶液（0.2g/L）、1.0gの酵母エキス、5gのバクトペプ
トンを蒸留水1Lに溶かし、pHを6.8に調整した後、加圧
殺菌した。ついで、乾熱滅菌した元素硫黄を0.2％とな
るように加え、この培地をアルゴンガスで飽和して嫌気
性とした後、パイロコッカス・ホリコシOT３を植菌し
た。培地が嫌気性となったか否かはNa₂S溶液を加えて、
培養液中でNa₂Sによるレザスリン溶液のピンク色が着色
しないことにより確認した。この培養液を95℃で２−4
日培養した。

【００５９】(実施例２) 染色体ＤＮＡの調製培養後、5000rpm、10分間の遠心分離により菌体を集菌
した。菌体を10mM Tris(pH 7.5)-1mM EDTA溶液で２回
洗浄後、InCert Agarose（FMC社製）ブロック中に封入
した。このブロックを１％N-ラウロイルサルコシン-1mg
/mlプロテアーゼK溶液中で処理することにより、染色体
DNAをAgaroseブロック中に分離調製した。

【００６０】（実施例3）染色体ＤＮＡを含むライブラ
リークローンの作製実施例2で得られた染色体ＤＮＡを制限酵素HindIIIによ
り部分分解後アガロースゲル電気泳動により約40kb長の
断片を調整した。このＤＮＡ断片を、制限酵素HindIII
によって完全分解したBacベクターpBAC108LまたはpFOS
１に、T4リガーゼを用いて結合させた。前者のベクター
を用いた場合には結合終了後のDNAをただちに大腸菌内
へ電気孔窄法により導入した。後者のベクターpFOS1を
用いた場合には、結合終了後のDNAをGIGA Pack Gold
（ストラタジーン社製）により試験管内でλファージ粒
子内に詰め込み、この粒子を大腸菌に感染させることに
よりDNAを大腸菌内に導入した。これらの方法により得
られた抗生物質クロラムフェニコール耐性の大腸菌集団
をBACライブラリーまたはFosmidライブラリーとした。
ライブラリーからJCM９９７４の染色体をカバーするの
に適したクローンを選択して、クローンの整列化を行っ
た。

【００６１】（実施例4）各BACクローンまたはFosmid
クローンの塩基配列決定整列化されたBAC或いはFosmid クローンについて順次以
下の方法で塩基配列を決定していった。大腸菌より回収
した各BAC或いはFosmidクローンのDNAを超音波処理する
ことにより断片化し、アガロースゲル電気泳動により1k
b及び2kb長のＤＮＡ断片を回収した。この断片をプラス
ミドベクターpＵＣ118のＨincII制限酵素部位に挿入し
たショットガンクローンを各BAC或いはFosmidクローン
当たり500クローン作製した。各ショットガンクローン
の塩基配列をパーキンエルマー、ABI社製自動塩基配列
読み取り装置373または377を用いて決定していった。各
ショットガンクローンから得られた塩基配列を塩基配列
自動連結ソフトSequencherを用いて連結編集し、各BAC
或いはFosmidクローンの全塩基配列を決定していった。

【００６２】（実施例5）エンドグルカナーゼ遺伝子の
同定上記で決定された各BAC或いはFosmidクローンの塩基配
列の大型計算機による解析を行い、エンドグルカナーゼ
をコードする遺伝子（配列表の配列番号１）を確認し
た。この遺伝子は、開始コドンから終止コドンまでで１
３７７塩基対からなり、そのコードするアミノ酸配列の
予想残基数は、４５８残基であった。

【００６３】（実施例6）発現プラスミドの構築構造遺伝子領域の前後に制限酵素（NdeIとXhoI）サイト
を構築する目的で、製品評価センター（独立行政法人製
品評価技術基盤機構）のゲノム解読データに基づき次の
２種のDNAプライマーを合成した。プライマー１：５'-T
TTTGAATTCTTTCATATGGAGGGGAATACTATTCTTAAAATC-３'（上
流用プライマー、配列表の配列番号３）プライマー２：
５'-TTTTTCTAGATTTGGATCCTTTGGGCTACCTGGGAGCCCTTCTTAA
-３')（下流用プライマー、配列表の配列番号４）。こ
のプライマー対を用いて、PCRでその遺伝子の前後に制
限酵素サイトを導入した。PCR反応後、制限酵素（NdeI
とXhoI）で完全分解（３７℃で２時間）した後、その構
造遺伝子を精製した。

【００６４】ｐET-11ａ（Novagen社製）を制限酵素NdeI
とXhoIで切断・精製した後、上記の構造遺伝子とT4リガ
ーゼで16℃、2時間反応させ連結した。連結したDNAをE.
coli-ＸＬ２−BlueＭＲＦ'（Stratagene社製）のコンピ
テントセルに導入し形質転換体のコロニーを得た。得ら
れたコロニーから発現プラスミドをアルカリ法で精製し
た。

【００６５】（実施例7）組換遺伝子の発現大腸菌（E.coli BL21(DE3)pLysS, Novagen社製）のコン
ピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1ｍL
移した。その中に発現プラスミド溶液を0.005ｍLを加え
氷中に30分間放置した後、42℃でヒートショックを30秒
間行い、ＳＯＣmedium0.9mLを加え、37℃で1時間振とう
培養する。その後この培養液を、アンピシリンを含む2
ＹＴ寒天プレートに適量まき、37℃で一晩培養し、形質
転換体を得た。その形質転換体をアンピシリンを含む2
ＹＴ培地1Lで600ｎｍの吸収が1に達するまで培養した
後、ＩＰＴＧ（Isopropyl-b-D-thiogaractopyranosid
e）100mＭ溶液を10ｍｌ加えさらに6時間培養した。培養
後遠心分離（6,000ｒｐｍ、20ｍｉｎ）で集菌した。

【００６６】（実施例8）好熱性酵素の精製集菌した菌体の2倍量のアルミナを加え、菌体を粉砕し
た後、5倍量の10mＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）を加
え懸濁液を得た。得られた懸濁液を85℃で30分加熱後遠
心分離（11,000ｒｐｍ，20分）し、上澄みをＨｉＴｒａ
ｐＱ（ファルマシア社製）カラムに吸着させ活性画分を
得た。

【００６７】（実施例9）酵素の諸性質（１）分子量およびアミノ酸配列 Phastシステム（ファルマシア社製）を用いて１０％か
ら１５％のゲル勾配上でSDS-PAGEを実施した。溶出した
画分はアミノ酸配列から計算される適当な分子量（４３
ｋＤ）に相当する単一のバンドを示し、これを酵素の性
状解析のために使用した。

【００６８】測定分子量は、SDS-PAGEと共に、ＴＳＫゲ
ルＧ３０００ＳＷ_XLカラム（ＴＯＳＯＨ，東京）上で高
速液体クロマトグラフィー（HPLC）を行って決定した。
溶出は０．３M NaClを含む５０ｍM リン酸ナトリウム
緩衝液（ｐH６．８）で、流速0.8ｍｌ／分、室温で行っ
た。溶出したタンパク質を280nmにおけるUV吸収で検出
した。精製した酵素はSDS-PAGEでも、ゲルろ過の溶出液
からも共に４３キロダルトンであることが解った。これ
は、遺伝子配列のオープンリーディングフレームから予
測される４５８残基から計算される約５２キロダルトン
より小さく、Ｎ末端側および／またはＣ末端側が欠如し
た結果得られるタンパク質であると予想された。この予
想に基づいて、精製したタンパク質のＮ末端側のアミノ
酸配列決定を行った所、配列表の配列番号２に記載され
るアミノ酸配列の第１残基から２８残基までが欠如して
いた。最初の２８残基は、シグナル配列であることが示
唆された。また、分子量から計算して、Ｃ末端側の欠如
も示唆される。触媒部位である第２９残基目からＣ末端
までの配列は、アシドサーマスセルロリティカス（Ac
idothermus cellulolyticus）のエンドグルカナーゼの
触媒部位と４３％の相同性を有していた(図１)。図１で
は、上の段が、本発明のエンドグルカナーゼ（ＥＧＰ
ｈ）のアミノ酸を表し、下の段が、アシドサーマスセ
ルロリティカス（Acidothermus cellulolyticus）のエ
ンドグルカナーゼ（ＥＧＡｃ）の触媒部位を表してい
る。（２）至適ｐＨ酵素活性の至適ｐＨの測定は、100ｍＭ酢酸ナトリウム
緩衝液、100ｍＭリン酸緩衝液及び100ｍＭホウ酸緩衝液
でｐＨ4〜9までの基質(カルボキシメチルセルロース)0.
5%溶液を調整し、８５℃で酵素の加水分解活性の初速度
を測定することにより求めた。活性は、ソモギーネルソ
ン法で、加水分解後生じる還元性末端を定量することか
ら検出した。図２に示すように、ｐＨ5.6付近で最大速
度が得られ、ｐＨ５．４−６．０の間で、最大速度に順
ずる速度が得られたため、最適ｐＨは５．４−６．０と
結論した。

【００６９】（３）至適温度基質として0.5%カルボキシメチルセルロースを使用し、
100ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．6）中に一定量
の酵素を加えて、各温度で１５分反応させ、相対活性を
（２）と同様に、ソモギー−ネルソン法で調べた。図３
に示す通り、97℃付近で最大活性が得られたため、最大
活性（至適温度）は97℃以上と結論した。

【００７０】（４）耐熱性（安定性）当該酵素溶液（0.1mg/mL）を100ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ5.6）中、97℃で３時間加熱後、温度を85℃
に低下させ残存活性を調べた。図４に活性の経時変化を
示す通り、残存活性は、８０％であった。

【００７１】（５）酵素作用の確認本発明のエンドグルカナーゼの加水分解作用を調べる
為、本発明のエンドグルカナーゼによって得られた加水
分解産物の粘度を測定し、エンドタイプのグルカナーゼ
として知られているセルロシンＡＣ−８（阪急共栄物
産）、マイセラーゼＳＰ−１００（明治製菓）等のエン
ドタイプ酵素を用いた場合に得られる分解産物の粘度と
比較した。0.5%カルボキシメチルセルロースを使用し、
100ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）中の濃度
が２０μｇ/mlの時点で一定量の本発明のエンドグルカ
ナーゼを加えて、９０℃で１５分反応させた。同様にセ
ルロシンまたはマイセラーゼを本発明のエンドグルカナ
ーゼの代わりに加えて、それぞれ４０℃で１５分反応さ
せた。エンド型酵素の場合、セルロースが内部から切断
されるため、大分子量のセルロースの減少（すなわち粘
度の減少）が初め急速で、次第に緩やかになる。従っ
て、分解産物であるグルコースの増加が初め緩やかで、
次第に急速になる。一方、エキソ型酵素の場合、セルロ
ースが末端から分解されるため、大分子量のセルロース
の減少（すなわち粘度の減少）は、終始緩やかでかつ一
定になる。図５に示すように、本発明のエンドグルカナ
−ゼは、その加水分解作用において、セルロシンＡＣ−
８やマイセラーゼＳＰ−１００と同様に粘度の減少が初
め急速で、次第に緩やかであった。従って、本発明のエ
ンドグルカナ−ゼはエンド型酵素であることが確認でき
た。（６）基質特異性基質特異性は、基質として、カルボキシメチルセルロー
ス（ＣＭＣ）、アビセルＳＦ（旭化成）、リケナン（ナ
カライテスク）、セロオリゴマー(セロビオースからセ
ロペンタオースまで)（生化学工業）を用いて測定し
た。さらに、カードラン、キシラン、キシログルカン
（ナカライテスク）も基質として使用した。酵素溶液
（0.01μｇ/mL）を各種の基質（セロオリゴマーは２m
M、他は0.5%）を含む１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．６）中、８５℃で１時間インキュベートした
後、触媒活性を調べた。

【００７２】活性は、加水分解後に生じる還元糖を、ソ
モギーネルソン法で検出して求めた。その結果、カルボ
キシメチルセルロース（ＣＭＣ）、アビセルＳＦ、リケ
ナン、セロオリゴマーは、加水分解された。基質を、カ
ードラン、キシラン、キシログルカンにした場合では、
加水分解はされなかった。これらをまとめた結果を表１
に示す。

【００７３】

【表１】

【００７４】従って、本発明の好熱性エンドグルカナー
ゼは、高温下において、セルロースまたはセルロース誘
導体のβ−1，4−Ｄグルコシド結合の選択的な加水分解
開裂を触媒することが確認された。

【００７５】

【発明の効果】本発明により、反応の至適温度が97℃以
上であり、セルロース、セルロース誘導体の選択的な加
水分解開裂を触媒する新規な好熱性エンドグルカナーゼ
が提供できる。さらに、酵素分子が安定であるという事
から耐有機溶媒性の向上も期待できる。本発明の酵素
は、高温下において、植物のバイオマスを燃料や化学物
質に変換するための界面活性剤として、セルロースおよ
びそれを含む繊維質処理剤として、廃液処理剤として、
またはジュース等の飲料の清澄化と抽出のための処理剤
として使用しうる。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RAKUTO KASEI INDUSTRIAL CO., LTD. <110> National Institute of Advanced Industrial Science and Technology <120> Thermophilic endoglucanase <130> P017123A <160> 4 <210> 1 <211> 1377 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii <400> 1 atg gag ggg aat act att ctt aaa atc gta cta att tgc act att tta 48 Met Glu Gly Asn Thr Ile Leu Lys Ile Val Leu Ile Cys Thr Ile Leu 1 5 10 15 gca ggc cta ttc ggg caa gtc gtg cca gta tat gca gaa aat aca aca 96 Ala Gly Leu Phe Gly Gln Val Val Pro Val Tyr Ala Glu Asn Thr Thr 20 25 30 tat caa aca ccg act gga att tac tac gaa gtg aga gga gat acg ata 144 Tyr Gln Thr Pro Thr Gly Ile Tyr Tyr Glu Val Arg Gly Asp Thr Ile 35 40 45 tac atg att aat gtc acc agt gga gag gaa act ccc att cat ctc ttt 192 Tyr Met Ile Asn Val Thr Ser Gly Glu Glu Thr Pro Ile His Leu Phe 50 55 60 ggt gta aac tgg ttt ggc ttt gaa aca cct aat cat gta gtg cac gga 240 Gly Val Asn Trp Phe Gly Phe Glu Thr Pro Asn His Val Val His Gly 65 70 75 80 ctt tgg aag aga aac tgg gaa gac atg ctt ctt cag atc aaa agc tta 288 Leu Trp Lys Arg Asn Trp Glu Asp Met Leu Leu Gln Ile Lys Ser Leu 85 90 95 ggc ttc aat gca ata aga ctt cct ttc tgt act gag tct gta aaa cca 336 Gly Phe Asn Ala Ile Arg Leu Pro Phe Cys Thr Glu Ser Val Lys Pro 100 105 110 gga aca caa cca att gga ata gat tac agt aaa aat cca gat ctt cgt 384 Gly Thr Gln Pro Ile Gly Ile Asp Tyr Ser Lys Asn Pro Asp Leu Arg 115 120 125 gga cta gat agc cta cag att atg gaa aag atc ata aag aag gcc gga 432 Gly Leu Asp Ser Leu Gln Ile Met Glu Lys Ile Ile Lys Lys Ala Gly 130 135 140 gat ctt ggt atc ttt gtc tta ctc gac tat cat agg ata gga tgc act 480 Asp Leu Gly Ile Phe Val Leu Leu Asp Tyr His Arg Ile Gly Cys Thr 145 150 155 160 cac ata gaa ccc ctc tgg tac acg gaa gac ttc tca gag gaa gac ttt 528 His Ile Glu Pro Leu Trp Tyr Thr Glu Asp Phe Ser Glu Glu Asp Phe 165 170 175 att aac aca tgg ata gag gtt gcc aaa agg ttc ggt aag tac tgg aac 576 Ile Asn Thr Trp Ile Glu Val Ala Lys Arg Phe Gly Lys Tyr Trp Asn 180 185 190 gta ata ggg gct gat cta aag aat gag cct cat agt gtt acc tca ccc 624 Val Ile Gly Ala Asp Leu Lys Asn Glu Pro His Ser Val Thr Ser Pro 195 200 205 cca gct gct tat aca gat ggt acc ggg gct aca tgg ggt atg gga aac 672 Pro Ala Ala Tyr Thr Asp Gly Thr Gly Ala Thr Trp Gly Met Gly Asn 210 215 220 cct gca acc gat tgg aac ttg gcg gct gag agg ata gga aaa gcg att 720 Pro Ala Thr Asp Trp Asn Leu Ala Ala Glu Arg Ile Gly Lys Ala Ile 225 230 235 240 ctg aag gtt gcc cct cat tgg ttg ata ttc gtg gag ggg aca caa ttt 768 Leu Lys Val Ala Pro His Trp Leu Ile Phe Val Glu Gly Thr Gln Phe 245 250 255 act aat ccg aag act gac agt agt tac aaa tgg ggc tac aac gct tgg 816 Thr Asn Pro Lys Thr Asp Ser Ser Tyr Lys Trp Gly Tyr Asn Ala Trp 260 265 270 tgg gga gga aat cta atg gcc gta aag gat tat cca gtt aac tta cct 864 Trp Gly Gly Asn Leu Met Ala Val Lys Asp Tyr Pro Val Asn Leu Pro 275 280 285 agg aat aag cta gta tac agc cct cac gta tat ggg cca gat gtc tat 912 Arg Asn Lys Leu Val Tyr Ser Pro His Val Tyr Gly Pro Asp Val Tyr 290 295 300 aat caa ccg tac ttt ggt ccc gct aag ggt ttt ccg gat aat ctt cca 960 Asn Gln Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Lys Gly Phe Pro Asp Asn Leu Pro 305 310 315 320 gat atc tgg tat cac cac ttt gga tac gta aaa tta gaa cta gga tat 1008 Asp Ile Trp Tyr His His Phe Gly Tyr Val Lys Leu Glu Leu Gly Tyr 325 330 335 tca gtt gta ata gga gag ttt gga gga aaa tat ggg cat gga ggc gat 1056 Ser Val Val Ile Gly Glu Phe Gly Gly Lys Tyr Gly His Gly Gly Asp 340 345 350 cca agg gat gtt ata tgg caa aat aag cta gtt gat tgg atg ata gag 1104 Pro Arg Asp Val Ile Trp Gln Asn Lys Leu Val Asp Trp Met Ile Glu 355 360 365 aat aaa ttt tgt gat ttc ttt tac tgg agc tgg aat cca gat agt gga 1152 Asn Lys Phe Cys Asp Phe Phe Tyr Trp Ser Trp Asn Pro Asp Ser Gly 370 375 380 gat acc gga ggg att cta cag gat gat tgg aca aca ata tgg gaa gat 1200 Asp Thr Gly Gly Ile Leu Gln Asp Asp Trp Thr Thr Ile Trp Glu Asp 385 390 395 400 aag tat aat aac ctg aag aga ttg atg gat agt tgt tcc aaa agt tct 1248 Lys Tyr Asn Asn Leu Lys Arg Leu Met Asp Ser Cys Ser Lys Ser Ser 405 410 415 tca agt act caa tcc gtt att cgg agt acc acc cct aca aag tca aat 1296 Ser Ser Thr Gln Ser Val Ile Arg Ser Thr Thr Pro Thr Lys Ser Asn 420 425 430 aca agt aag aag att tgt gga cca gca att ctt atc atc cta gca gta 1344 Thr Ser Lys Lys Ile Cys Gly Pro Ala Ile Leu Ile Ile Leu Ala Val 435 440 445 ttc tct ctt ctc tta aga agg gct ccc agg tag 1377 Phe Ser Leu Leu Leu Arg Arg Ala Pro Arg * 450 455 458 <210> 2 <211> 430 <212> PRT <213> Pyrococcus horikoshii <400> 2 Met Glu Gly Asn Thr Ile Leu Lys Ile Val Leu Ile Cys Thr Ile Leu 5 10 15 Ala Gly Leu Phe Gly Gln Val Val Pro Val Tyr Ala Glu Asn Thr Thr 20 25 30 Tyr Gln Thr Pro Thr Gly Ile Tyr Tyr Glu Val Arg Gly Asp Thr Ile 35 40 45 Tyr Met Ile Asn Val Thr Ser Gly Glu Glu Thr Pro Ile His Leu Phe 50 55 60 Gly Val Asn Trp Phe Gly Phe Glu Thr Pro Asn His Val Val His Gly 65 70 75 80 Leu Trp Lys Arg Asn Trp Glu Asp Met Leu Leu Gln Ile Lys Ser Leu 85 90 95 Gly Phe Asn Ala Ile Arg Leu Pro Phe Cys Thr Glu Ser Val Lys Pro 100 105 110 Gly Thr Gln Pro Ile Gly Ile Asp Tyr Ser Lys Asn Pro Asp Leu Arg 115 120 125 Gly Leu Asp Ser Leu Gln Ile Met Glu Lys Ile Ile Lys Lys Ala Gly 130 135 140 Asp Leu Gly Ile Phe Val Leu Leu Asp Tyr His Arg Ile Gly Cys Thr 145 150 155 160 His Ile Glu Pro Leu Trp Tyr Thr Glu Asp Phe Ser Glu Glu Asp Phe 165 170 175 Ile Asn Thr Trp Ile Glu Val Ala Lys Arg Phe Gly Lys Tyr Trp Asn 180 185 190 Val Ile Gly Ala Asp Leu Lys Asn Glu Pro His Ser Val Thr Ser Pro 195 200 205 Pro Ala Ala Tyr Thr Asp Gly Thr Gly Ala Thr Trp Gly Met Gly Asn 210 215 220 Pro Ala Thr Asp Trp Asn Leu Ala Ala Glu Arg Ile Gly Lys Ala Ile 225 230 235 240 Leu Lys Val Ala Pro His Trp Leu Ile Phe Val Glu Gly Thr Gln Phe 245 250 255 Thr Asn Pro Lys Thr Asp Ser Ser Tyr Lys Trp Gly Tyr Asn Ala Trp 260 265 270 Trp Gly Gly Asn Leu Met Ala Val Lys Asp Tyr Pro Val Asn Leu Pro 275 280 285 Arg Asn Lys Leu Val Tyr Ser Pro His Val Tyr Gly Pro Asp Val Tyr 290 295 300 Asn Gln Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Lys Gly Phe Pro Asp Asn Leu Pro 305 310 315 320 Asp Ile Trp Tyr His His Phe Gly Tyr Val Lys Leu Glu Leu Gly Tyr 325 330 335 Ser Val Val Ile Gly Glu Phe Gly Gly Lys Tyr Gly His Gly Gly Asp 340 345 350 Pro Arg Asp Val Ile Trp Gln Asn Lys Leu Val Asp Trp Met Ile Glu 355 360 365 Asn Lys Phe Cys Asp Phe Phe Tyr Trp Ser Trp Asn Pro Asp Ser Gly 370 375 380 Asp Thr Gly Gly Ile Leu Gln Asp Asp Trp Thr Thr Ile Trp Glu Asp 385 390 395 400 Lys Tyr Asn Asn Leu Lys Arg Leu Met Asp Ser Cys Ser Lys Ser Ser 405 410 415 Ser Ser Thr Gln Ser Val Ile Arg Ser Thr Thr Pro Thr Lys Ser Asn 420 425 430 Thr Ser Lys Lys Ile Cys Gly Pro Ala Ile Leu Ile Ile Leu Ala Val 435 440 445 Phe Ser Leu Leu Leu Arg Arg Ala Pro Arg 450 455 <210> 3 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer <400> 3 TTTTGAATTC TTTCATATGG AGGGGAATAC TATTCTTAAA ATC 43 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer <400> 4 TTTTTCTAGA TTTGGATCCT TTGGGCTACC TGGGAGCCCT TCTTAA 46

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の酵素のアミノ酸配列とアシドサーマス
セルロリティカス（Acidothermus cellulolyticus）
のエンドグルカナーゼの触媒部位のアミノ酸配列を比較
した図である。

【図２】本発明の酵素の比活性のｐＨによる変化を示し
た図である。

【図３】本発明の酵素を、各温度でインキュベーション
した場合の比活性の変化を示した図である。

【図４】本発明の酵素を97℃で熱処理した後の残存活性
を示す図である。

【図５】本発明の酵素および公知のエンドグルカナーゼ
の相対粘度と還元糖の濃度の関係を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ // Ａ２３Ｌ 2/70 Ａ２３Ｌ 2/00 Ｋ (72)発明者石田紘靖茨城県つくば市東１丁目１番地１独立行政法人産業技術総合研究所つくば中央第６事業所内 (72)発明者小杉佳次茨城県つくば市東１丁目１番地１独立行政法人産業技術総合研究所つくば中央第６事業所内 (72)発明者安藤進大阪府池田市緑丘２丁目６番５号緑丘北摂ハイツ202号 (72)発明者下村朗滋賀県大津市関津四丁目５番１号洛東化成工業株式会社内Ｆターム(参考） 4B017 LC07 LG04 LK23 4B024 AA03 AA05 BA12 CA02 HA03 4B050 CC01 CC03 DD02 LL02 LL04 LL05 4B065 AB01 BA02 CA31 CA41 CA55 CA57

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の特性を有する好熱性エンドグルカ
ナーゼ： a．分子量約４３キロダルトン; b．至適温度９５℃以上； c. 至適ｐＨ５．４−６．０； d．安定性約９７℃で３時間安定。
【請求項２】原核生物に由来する、請求項１に記載の
好熱性エンドグルカナーゼ。
【請求項３】パイロコッカス（Pyrococcus）属に由来
する、請求項１に記載の好熱性エンドグルカナーゼ。
【請求項４】パイロコッカスホリコシ（Pyrococcus
horikoshii）に由来する、請求項１に記載の好熱性エ
ンドグルカナーゼ。
【請求項５】配列表の配列番号２の１位〜４５８位の
アミノ酸配列を有する、好熱性エンドグルカナーゼ。
【請求項６】配列表の配列番号２の１位〜４５８位の
アミノ酸配列において、１ないし１００個のアミノ酸残
基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含
み、かつ好熱性エンドグルカナ−ゼ活性を有する好熱性
エンドグルカナーゼ。
【請求項７】配列表の配列番号２の２９位〜４５８位
のアミノ酸配列を有する、好熱性エンドグルカナーゼ。
【請求項８】配列表の配列番号２の２９位〜４５８位
のアミノ酸配列において、１ないし１００個のアミノ酸
残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含
み、かつ好熱性エンドグルカナ−ゼ活性を有する好熱性
エンドグルカナーゼ。
【請求項９】原核生物に由来する、請求項５から８の
いずれかに記載の好熱性エンドグルカナーゼ。
【請求項１０】パイロコッカス（Pyrococcus）属に由
来する、請求項５から８のいずれかに記載の好熱性エン
ドグルカナーゼ。
【請求項１１】パイロコッカスホリコシ（Pyrocuco
us horikoshii）に由来する、請求項５から８のいずれ
かに記載の好熱性エンドグルカナーゼ。
【請求項１２】請求項５から１１のいずれかに記載の
好熱性エンドグルカナーゼをコードするポリヌクレオチ
ド配列を含むＤＮＡ。
【請求項１３】配列表の配列番号１の１位〜４５８位
のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含
む、請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１４】配列表の配列番号１の１位〜４５８位
のアミノ酸配列において、１ないし１００個のアミノ酸
残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列をコ
ードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記
載のＤＮＡ。
【請求項１５】配列表の配列番号１の２９位〜４５８
位のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を
含む、請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１６】配列表の配列番号１の２９位〜４５８
位のアミノ酸配列において、１ないし１００個のアミノ
酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を
コードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１２に
記載のＤＮＡ。
【請求項１７】配列表の配列番号１の第１残基〜第１
３７４残基までに記載のポリヌクレオチド配列を含む、
請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１８】配列表の配列番号１の第８５残基〜第
１３７４残基までに記載のポリヌクレオチド配列を含
む、請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１９】配列表の配列番号１の第８５残基〜第
１３７７残基までに記載のポリヌクレオチド配列とスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし得、かつ好熱
性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコー
ドする、ＤＮＡ。
【請求項２０】請求項１２から１９までのいずれかに
記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項２１】好熱性エンドグルカナーゼの発現用の
プロモーターの調節下に請求項１２から１９までのいず
れかに記載のＤＮＡを含んで成り、宿主細胞において、
好熱性エンドグルカナーゼの活性を有するポリペプチド
を発現する能力を有する、発現ベクター。
【請求項２２】請求項２０または２１に記載のベクタ
ーにより形質転換された形質転換体。
【請求項２３】微生物細胞、動物細胞、植物細胞また
は昆虫細胞を宿主とする、請求項２２に記載の形質転換
体。
【請求項２４】請求項２２または２３に記載の形質転
換体を培養する工程、および得られる培養物より好熱性
エンドグルカナーゼを回収する工程を含む、好熱性エン
ドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。