CN108546303A

CN108546303A - 一种高表达高稳定性的多糖氢键破除酶融合蛋白及其应用

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Publication number: CN108546303A
Application number: CN201810430285.0A
Authority: CN
Inventors: 赵庆新; 叶凯霞; 刘忠权; 康贻军; 沈敏
Original assignee: Yancheng Teachers University
Current assignee: Yancheng Teachers University
Priority date: 2018-05-08
Filing date: 2018-05-08
Publication date: 2018-09-18

Abstract

本发明公开了一种高表达高稳定性的多糖氢键破除酶融合蛋白及其应用，属于微生物工程和生物质能源工程领域。本发明在大肠杆菌中表达了该多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH，该多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH与纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶之间存在协同效应，能有效提高多糖的糖化效率，能够将纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶的降解效率分别提高330％、300％和300％；‑80℃和0℃条件下保存的样品，活性可分别保持在90％和85％以上，在25‑50℃范围内，保存2小时的样品活性可以保持在70‑95％。多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH在生物质材料、生物质能源、食药用糖、食用酒、传统棉麻纺织品等生产领域具有应用价值。

Description

一种高表达高稳定性的多糖氢键破除酶融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种高表达高稳定性的多糖氢键破除酶融合蛋白及其应用，属于微生物工程和生物质能源工程领域。

背景技术

多糖降解是多糖生物质原料和材料利用过程中的基本过程，生物质能源生产和酒类等产品生产过程中，首先需要完成糖化过程，即需要将多糖降解成单糖，再将单糖转化为乙醇。多糖在溶液体系中容易形成氢键，形成多糖链的聚集体，不利于多糖降解酶与底物的结合。

多糖氢键破除酶能够有效地破除多糖链之间氢键，提高多糖降解酶与多糖的结合，提高多糖降解酶的降解效率。多糖氢键破除酶首次发现是在黄瓜幼苗下胚轴细胞壁中发现的，1992年，Cosgrove实验室从黄瓜幼苗下胚轴细胞壁中分离到分子量分别为29、30kDa的两个活性蛋白，均有诱导热钝化的离体细胞壁恢复伸展的功能，当时命名为Expansin。后续研究发现Expansin蛋白分为四个家族，α-Expansin、β-Expansin、α-likeExpansin(EXLA)和β-lik Expansin(EXLB)，Expansin的来源生物包含植物、真菌、线虫和细菌。Expansin的功能原理研究显示Expansin能够诱导植物未成熟细胞壁扩张的机理是Expansin能够破除植物细胞壁中纤维素与半纤维素之间的氢键，后续的研究发现Expansin和果胶酶联合作用能够诱导成熟细胞壁的扩张，并能与多种多糖降解酶之间有协同作用，能够提高多糖降解糖化的效率。该特性为Expansin的应用带来了广阔的应用空间，特别是生物质原料类的行业。

枯草芽孢杆菌Expansin的发现为Expansin的工业化运用提供了较好的原核Expansin资源，为Expansin的工业化运用提供了基础。

然而，目前枯草芽孢杆菌Expansin表达遇到的主要问题有，枯草芽孢杆菌自身Expansin的表达受到时空限制，主要在芽孢阶段表达，不能在正常细胞阶段进行有效表达，另外，草芽孢杆菌Expansin在大肠杆菌系统中的异源表达效率也不高，主要受到Expansin对宿主的毒性、易形成包涵体、表达量低、稳定性差、活性低等因素的影响。

发明内容

本发明针对枯草芽孢杆菌Expansin的大肠杆菌异源表达受到Expansin对宿主的毒性、易形成包涵体、表达量低、稳定性差、活性低等问题，提供了一种多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH及其表达质粒与应用。

本发明的第一个目的是提供一种高表达高活性高稳定性的多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH，含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；该多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH具有对大肠杆菌宿主无毒性、高可溶性表达且无包涵体、高稳定性和高活性等优势。

本发明的第二个目的是提供编码所述多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH的基因(peheh)，可在大肠杆菌中高效表达多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH。

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有枯草芽孢杆菌来源的编码扩张蛋白Expansin成熟蛋白的核苷酸序列、编码曲霉果胶酸裂解酶PelA成熟蛋白的核苷酸序列、大肠杆菌肠激酶识别位点核苷酸序列、1个10×组氨基酸核苷酸序列和1个6×组氨酸核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供一种表达所述多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH或含有所述peheh融合基因的表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体以pET系列载体为出发载体。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pET-28a(+)。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为peheh/pET-28a(+)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH的基因工程菌或转基因细胞系。

在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET-28a(+)为载体，表达核苷酸序列为SEQ ID NO.2的多糖氢键破除酶融合基因peheh。

本发明的第五个目的是提供一种提高多糖氢键破除酶可溶性表达的方法，是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET-28a(+)为载体，表达核苷酸序列为SEQ ID NO.1的多糖氢键破除酶融合蛋白。

本发明的第六个目的是提供一种产多糖氢键破除酶的方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，18～22℃培养16～48h。

本发明还要求保护所述多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH在多糖氢键破除酶蛋白生产、生物质原料利用、单糖生产等领域的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括在纤维素酶降解纤维素材料的过程中，弱化纤维素微丝和半纤维素之间的氢键，促进纤维素酶降解纤维素。(具体方法可参考以下文献：

1.Kumar M,Singh P,Sukla L B.Addition of Expansin to CellulaseEnhanced Bioethanol Production[J].Process Biochemistry,2016.

2.Bunterngsook B,Mhuantong W,Champreda V,et al.Identification ofnovel bacterial expansins and their synergistic actions on cellulosedegradation.[J].Bioresource Technology,2014,159(5):64.

3.Kim E S,Lee H J,Bang W G,et al.Functional characterization of abacterial expansin from Bacillus subtilis for enhanced enzymatic hydrolysisof cellulose.[J].Biotechnology&Bioengineering,2010,102(5):1342-1353.)

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备以多糖为原料的产品。

本发明的有益效果：

(1)本发明设计并合成了多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH融合基因peheh，构建了含该peheh融合基因的表达质粒(peheh/pET-28a(+))和含该表达质粒的工程菌(peheh/pET-28a(+)/BL21(DE3))，该工程菌可以表达多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH。摇瓶发酵表达结果表明，多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH对宿主细胞毒性低，20℃条件下表达48h后，工程菌(peheh/pET-28a(+)/BL21(DE3))工程菌OD₆₀₀可以达到2.8，高于多糖氢键破除酶Expansin独立表达的工程菌OD₆₀₀(1.60)，说明融合表达可以降低多糖氢键破除酶蛋白对宿主具有毒性。

(2)本发明的工程菌表达的可溶性多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH产率为1.5mg/mL培养液，占到细胞总蛋白的30％,无包涵体产生，相比多糖氢键破除酶Expansin胞内独立表达效率0.025mg/mL(在可溶性蛋白中占0.5％，有包涵体产生)，可溶性目标蛋白产量上升60倍，说明该融合表达可以提高多糖氢键破除酶的表达量。

(3)多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH与纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶之间存在协同效应，能有效提高多糖的糖化效率，在PEHEH与多糖酶的复配比为2:8的条件下，纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶的降解效率分别可以提高330％、300％和300％，-80℃和0℃条件下保存的样品，活性可分别保持在90％和85％以上，在25-50℃范围内，保存2小时的样品活性可以保持在70-95％。

附图说明

图1：设计的peheh/pET-28a(+)质粒结构图。

图2：peheh/pET-28a(+)酶切鉴定图；1.DNA Marker；2.peheh/pET-28a(+)；3.peheh/pET-28a(+)双酶切。

图3：重组表达与纯化的PEHEH SDS-PAGE图谱；1.蛋白Marker；2.peheh/pET-28a(+)/BL21(DE3)的胞内上清；3.上样流出液；4.清洗流出液；5.前期洗脱液；6.纯化的PEHEH。

具体实施方式

实施例1融合基因peheh设计

从5'端开始，融合基因peheh依次包含了含有曲霉果胶酸裂解酶Pela成熟蛋白核苷酸序列、大肠杆菌肠激酶Ek识别位点核苷酸序列、1个编码10×组氨酸核苷酸序列、枯草芽孢杆菌扩张蛋白Expansin序列(NC_000964)和1个6×his的核苷酸序列。在果胶酸裂解酶Pela成熟蛋白核苷酸序列的上游序列添加Nco Ⅰ酶切位点，下游加Ek识别位点核苷酸序列、1个编码10his核苷酸序列和NdeⅠ位点序列；NdeⅠ序列后连接expansin基因序列，并在expansin序列下游添加EcoR Ⅰ酶切位点，将来再利用pET28-a(+)载体上的EcoR I位点到终止密码子之间的序列(包含一个6his的核苷酸序列)，得到完整的peheh序列。

实施例2pela-ek-10his(peh)序列的合成与克隆

本发明中使用的活性果胶酸裂解酶基因来自曲霉，因pela基因内部有Nco Ⅰ位点，因此采用Over-Lap PCR方法设计多对引物，在不改变氨基酸序列的情况下对其进行定点突变，引物合成及测序工作由上海生工完成。使用的引物具体如下：

pl1：5’-CCATGGGCTCACCTGCGCCGGACCTCAAC-3’(5’加Nco I)

pl2：5’-CATATGGTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGCTTGTCGTCGTCGTCCAATTTCTGTCCGGCTGTAC-3’(3’加Nde I)

pl3：5’-CATATGGTGATGATGATGATGATGATG-3’

pl4：5’-GATATCAGCCACGGCGCGGAATG-3’

pl5：5’-CATTCCGCGCCGTGGCTGATATC-3’

现以，本实验室保存的pela基因为模板(公开于公开号为CN102191212A的专利申请中)，使用引物pl1，pl2合成pela-ek-10his(peh)序列，作为突变前的模板。50μLPCR反应体系为：5μL 10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺plus)、4μL dNTP(2.5mM each)、1μL引物pl1(20μM)、1μL引物pl2(20μM)、1μL pela/pET28a(+)(模板)、0.5μL Ex Taq(2.5U/μL)和37.5μL ddH₂O构成。PCR反应程序为：第一个循环，95℃保温5min；30个循环，每个在95℃持续1min、60℃持续1min、72℃持续1min；最后一个循环，72℃持续10min，保存于4℃。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的基因。

使用引物pl1，pl5和pl3，pl4，以纯化后的peh片段为模板，合成peh内部Nco Ⅰ酶切位点前后段基因。PCR反应体系和反应程序与上述类似，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物并进行切胶回收。

使用引物pl1，pl3，以上述合成的二个片段为模板，用over-lap PCR方法合成新的peh序列片段，测序鉴定显示新合成的peh序列消除了内部Nco Ⅰ位点，添加的Enterokinase-10Histag-NdeⅠ序列均正确。

实施例3 expansin基因的合成与克隆

本发明中使用的枯草芽孢杆菌expansin基因由两个结构域和N端信号肽组成，信号肽核苷酸长度为75bp，设计引物合成成熟expansin核苷酸序列片段。二端分别需加Nde I和EcoR I两个酶切位点，其内部第77—82位碱基为Nde I位点需要突变消除，由于Nde I靠近需要合成的片段的正向末端，可以直接在设计P1引物时，满足不改变编码氨基酸的情况下，将第81位碱基T突变为碱基C。

P1：5’-CATATGGCATACGACGACCTGCATGAAGG-3’(NdeI)

P2：5’-GAATTCTTCAGGAAACTGAACATGG-3’(EcoR I)

PCR扩增无信号肽的expansin基因，该体系(50μL)是由5μL 10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺plus)、4μL dNTP(2.5mM each)、1μL引物P1(20μM)、1μL引物P2(20μM)、1μL枯草芽孢杆菌168基因组、0.5μL Ex Taq(2.5U/μL)和37.5μL ddH₂O构成。该PCR反应程序为：一个循环，95℃保温5min；30个循环，每个在95℃持续1min、60℃持续1min、72℃持续1min；最后一个循环，72℃持续10min，保存于4℃。纯化合成的expansin片段。

实施例4 pela-ek-10his-expansin(pehe)序列的合成与克隆

使用引物pl1和P2引物，以前面合成的peh核苷酸片段和expansin片段为模板，用Over-Lap PCR方法，合成pela-ek-10his-expansin(pehe)序列。PCR扩增反应体系由5μL 10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺plus)、4μL dNTP(2.5mM each)、1μL引物pl1(20μM)、1μL引物P2(20μM)、1μL pla-ek-10his片段、1μL expansin片段、0.5μL Ex Taq(2.5U/μL)和36.5μL ddH₂O构成。程序为：一个循环，95℃保温5min；30个循环，每个在95℃持续1min、55℃持续1min、72℃持续1min；最后一个循环，72℃持续10min，保存于4℃。使用1×TAE Buffer和1％琼脂糖凝胶电泳鉴定5μL PCR产物，在1620bp左右观察到目的条带。纯化后，得到pehe片段。

将已纯化的pehe片段与pMD18-T载体(载体购自TaKaRa公司)连接，热转化DH5α感受态细胞，经过鉴定得到转化子pehe/pMD18-T/DH5α。该菌落PCR鉴定反应的反应体系(20μL)是由2μL 10×Taq Buffer(Mg²⁺plus)、1.6μL dNTP(2.5mM each)、10μL稀释菌液(模板)、0.4μL引物BSE1(20μM)、0.4μL引物BSE4(20μM)、0.1μL rTaq(5U/μL)和5.5μL ddH₂O构成。菌落PCR鉴定反应程序为：一个循环，95℃持续5min；30个循环，每个在95℃持续1min、55℃持续1min、72℃持续1min；最后一个循环，72℃持续10min，保存于4℃。结束后，使用1×TAEBuffer和1％琼脂糖凝胶电泳鉴定5μL PCR产物，在705bp观察到目的条带。提取pehe/pMD18-T的质粒，进一步进行双酶切鉴定。酶切鉴定使用Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制性核酸内切酶进行双酶切质粒pehe/pMD18-T，酶切体系(30μL)由3μL 10×H Buffer、5μL质粒pehe/pMD18-T、1μL Nde Ⅰ、1μL EcoR Ⅰ、20μL ddH₂O构成，37℃酶切3h。使用1×TAE Buffer和1％琼脂糖凝胶电泳鉴定30μL双酶切产物，在705bp观察到目的条带，进一步测序鉴定，碱基序列正确，pehe序列克隆完成，提取pehe/pMD18-T质粒备用。

实施例5 peheh/pET-28a(+)表达载体构建

使用限制性核酸内切酶Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切质粒pehe/pMD18-T，该体系(50μL)由5μL 10×K Buffer、10μL质粒pehe/pMD18-T、2μL Nco Ⅰ、2μL EcoR Ⅰ、31μL ddH₂O构成。37℃酶切3h。使用1×TAE Buffer和1％琼脂糖凝胶电泳分析50μL双酶切产物，观察到1620bp左右pehe条带和线性pMD18-T载体条带，使用TaKaRa公司凝胶回收试剂盒，对pehe条带进行纯化备用。

将pET-28a(+)质粒进行Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，后与pehe基因片段连接，连接体系(10μL)由1μL 10×T4 Buffer、4μL pehe片段、4μL pET-28a(+)载体片段、1μL T4 DNALigase构成，16℃连接4h。连接完成后热转化DH5α感受态细胞，感受态细胞制备方法同实施例4中方法。将转化完成后的菌液涂布于含100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养10h。挑取单克隆进行菌落PCR，该体系(20μL)由2μL 10×Taq Buffer(Mg²⁺plus)、1.6μLdNTP(2.5mM each)、10μL稀释菌液(模板)、0.4μL引物BSE1(20μM)、0.4μL引物BSE4(20μM)、0.1μL rTaq(5U/μL)和5.5μL ddH₂O构成。其程序为：一个循环，95℃持续5min；30个循环，每个循环在95℃持续1min、55℃持续1min、72℃持续1min；最后一个循环，72℃持续10min，保存于4℃。结束后，使用1×TAE Buffer和1％琼脂糖凝胶电泳鉴定5μL PCR产物，在1620bp处观察到目的条带，证明pehe片段与pET-28a(+)载体连接成功。

pehe在pET-28a(+)上的EcoR I与终止子之间片段连接在一起，又成功地在pehe后面加上6his片段，从而得到了完整的多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH的融合基因peheh，也得到了质粒peheh/pET-28a(+)。

实施例6表达多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH工程菌peheh/pET-28a(+)/BL21(DE3)的构建

将构建好的质粒peheh/pET-28a(+)热转化感受态细胞BL21(DE3)以实现工程菌peheh/pET-28a(+)/BL21(DE3)的构建。感受态细胞BL21(DE3)制备与转化方法同感受态细胞DH5α。转化后，使用含100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基筛选转化子，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。挑取单克隆进行菌落PCR，该体系(20μL)由2μL 10×Taq Buffer(Mg²⁺plus)、1.6μL dNTP(2.5mM each)、10μL稀释菌液(模板)、0.4μL引物BSE1(20μM)、0.4μL引物BSE4(20μM)、0.1μL rTaq(5U/μL)和5.5μL ddH₂O构成。其程序为：一个循环，95℃持续5min；30个循环，每个循环在95℃持续1min、55℃持续1min、72℃持续1min；最后一个循环，72℃持续10min，保存于4℃。结束后，使用1×TAE Buffer和1％琼脂糖凝胶电泳鉴定5μL PCR产物，在1620bp处观察到目的条带，证明peheh/pET-28a(+)质粒转化入BL21(DE3)成功，得到表达多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH工程菌peheh/pET-28a(+)/BL21(DE3)，使用12％的甘油保存菌种。

实施例7多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH的表达

用工程菌peheh/pET-28a(+)/BL21(DE3)表达多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH，表达条件为1mM IPTG、20℃、120rpm、24h。表达结束后，使用离心机对菌液进行离心收集，6000rpm离心1min，去上清后，使用pH7.5、10mM Tris-HCL 10mL洗涤菌体两次，再于-80℃冻存6h以上。使用超声细胞粉碎仪粉碎细胞，将冻存的细胞于室温融化5min，用10mL pH7.510mM Tris-HCL重悬细胞，加入100μL 10mg/mL Lysozyme，涡旋混匀后30℃降解20min，冰上冷却10min后开始超声破菌。

细胞粉碎仪设置为400W，工作20s，间隔20s，工作时间1h，保持冰浴。破菌结束后，对破碎后的菌液进行离心，8000rpm离心10min，上清为糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH粗提液。使用BIO-RAD公司蛋白电泳仪进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，判断蛋白表达情况，在66kD出现目的蛋白条带。多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH产率为1.5mg/mL培养液，无包涵体出现，融合蛋白对大肠杆菌宿主无毒性，20℃条件下表达48h后，peheh/pET-28a(+)/BL21(DE3)工程菌OD₆₀₀可以达到2.8，以未融合的多糖氢键破除酶Expansin独立表达的expansin工程菌(expansin/pET-28a(+)/BL21(DE3))为对照(构建策略同实施例1～7，区别在于，仅表达枯草芽孢杆菌扩张蛋白Expansin序列)，具体步骤如下：

对照菌expansin/pET-28a(+)/BL21(DE3)的构建：使用枯草芽孢杆菌168基因组为模板，设计引物合成成熟Expansin核苷酸序列片段,二端分别需加Nde I和EcoR I两个酶切位点，其内部第77—82位碱基为Nde I位点需要突变消除，由于Nde I靠近需要合成的片段的正向末端，可以直接在设计P1引物时，满足不改变编码氨基酸的情况下，将第81位碱基T突变为碱基C。

P1：5’-CATATGGCATACGACGACCTGCATGAAGG-3’(NdeI)

P2：5’-GAATTCTTCAGGAAACTGAACATGG-3’(EcoR I)

PCR扩增无信号肽的expansin基因，该体系(50μL)是由5μL 10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺plus)、4μL dNTP(2.5mM each)、1μL引物P1(20μM)、1μL引物P2(20μM)、1μL枯草芽孢杆菌基因组、0.5μL Ex Taq(2.5U/μL)和37.5μL ddH₂O构成。该PCR反应程序为：一个循环，95℃保温5min；30个循环，每个在95℃持续1min、60℃持续1min、72℃持续1min；最后一个循环，72℃持续10min，保存于4℃。纯化合成的expansin片段。

将已纯化的expansin片段片段与pMD18-T载体(载体购自TaKaRa公司)连接，热转化DH5α感受态细胞，经过鉴定得到转化子expansin/pMD18-T/DH5α，进一步测序鉴定，碱基序列正确，expansin序列克隆完成，提取expansin/pMD18-T质粒备用。使用限制性核酸内切酶Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切质粒expansin/pMD18-T，使用TaKaRa公司凝胶回收试剂盒，对expansin条带进行纯化备用,将pET-28a(+)质粒进行Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，后与expansin基因片段连接，连接完成后热转化DH5α感受态细胞,得到expansin/pET-28a(+)/DH5工程菌成功。从expansin/pET-28a(+)/DH5工程菌中，提取得到expansin/pET-28a(+)质粒，转化BL21(DE3),得到对照菌expansin/pET-28a(+)/BL21(DE3)。将对照菌在与工程菌peheh/pET-28a(+)/BL21(DE3)相同条件下进行培养，结果显示，OD₆₀₀在相同条件下只达到1.5。

实施例8多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH的活性测定

根据Expansin蛋白与多糖降解酶，如纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶等的协同作用，测定expansin蛋白活性。采用Expansin蛋白协同纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶的酶促反应来测定其活性。实验组酶活测定体系(0.5mL反应液)由50mM pH5.0HAC-NaAC、10μL 1％的底物、4μL Expansin样品、16μL实施例7制备的酶液(10mg/mL)。对照组不加Expansin样品。一个多糖降解酶活单位定义为每分钟释放1μmol还原糖(reducing sugar)所需的酶量，Expansin的活性以多糖降解酶活性增加的％比计算。

在复配比为2:8的条件下，即Expansin蛋白：纤维素酶，或Expansin蛋白：木聚糖酶，或Expansin蛋白：果胶酶的比例为2:8，且底物与纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶都饱和使用的条件下，纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶的降解效率分别可以提高330％、300％和300％。

实施例9多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH的分离纯化

使用Ni离子亲和层析分离纯化融合蛋白Expansin，超声破菌后的细胞液离心取上清(经0.45μm膜过滤)作为融合蛋白纯化的上样液，并与1：1的比例和2×Binging buffer(10mM咪唑，1M NaCl，40mM Tris-HCL)混匀备用；His-tag亲和层析柱用5倍柱体积的1×charging buffer(50mM NiSO4)处理后，再用5倍柱体积1×Binding buffer(5mM咪唑，0.5MNaCl，20mM Tris-HCL)平衡；将蛋白样品上样后用10倍柱体积1X Binging buffer洗柱，再用5倍柱体积1×Washing buffer(10mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCL)洗柱；用6倍柱体积1×Elution buffer(40mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCL)洗脱。纯化结果如图3所示，纯化后的蛋白纯度高、杂质少。

实施例10多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH的稳定性检测

将多糖氢键破除酶融合蛋白PEHEH在-80℃和0℃条件下分别保存2个月和1周持久保存，在25-50℃范围内，分别保存2h,对不同保存条件下的样品进行活性检测。-80℃和0℃条件下保存的样品，活性保持在90％和85％，在25-50℃范围内，保存2小时的样品活性可以保持在70-95％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 盐城师范学院

<120> 一种高表达高稳定性的多糖氢键破除酶融合蛋白及其应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 555

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ser Pro Ala Pro Asp Leu Asn Ala Arg His Glu Leu Thr Arg Arg Gln

1 5 10 15

Ala Ser Glu Ser Cys Pro Ile Gly Tyr Cys Thr Gln Asn Gly Gly Thr

20 25 30

Thr Gly Gly Ala Ala Gly Asp Thr Val Thr Val Thr Asn Leu Ala Asp

35 40 45

Leu Thr Glu Ala Ala Glu Ser Asp Gly Pro Leu Thr Ile Ile Val Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Ser Gly Ser Ala Lys Ile Arg Val Ala Ser Asp Lys Thr

65 70 75 80

Ile Phe Gly Glu Ser Gly Ser Ser Ile Thr Gly Ile Gly Phe Tyr Ile

85 90 95

Arg Arg Val Ser Asn Val Ile Met Arg Asn Leu Lys Ile Ser Lys Val

100 105 110

Asp Ala Asp Asn Gly Asp Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ser Ser Asn Val

115 120 125

Trp Val Asp His Cys Asp Leu Ser Gly Asp Leu Ser Gly Gly Lys Asp

130 135 140

Asp Leu Asp Gly Leu Val Asp Ile Ser His Gly Ala Glu Trp Ile Thr

145 150 155 160

Val Ser Asn Thr Tyr Phe His Asp His Trp Lys Gly Ser Leu Ile Gly

165 170 175

His Ser Asp Asn Asn Glu Asp Glu Asp Leu Gly His Leu His Val Thr

180 185 190

Tyr Ala Asn Asn Tyr Trp Tyr Asn Val Tyr Ser Arg Thr Pro Leu Ile

195 200 205

Arg Phe Ala Thr Val His Ile Ile Asn Asn Tyr Trp Asp Ser Leu Ile

210 215 220

Asp Thr Gly Val Asn Cys Arg Met Asp Ala Gln Val Leu Ile Gln Ser

225 230 235 240

Ser Ala Phe His Asn Cys Pro Asp Arg Ala Ile Phe Phe Ala Asp Ser

245 250 255

Asp Tyr Thr Gly Tyr Ala Val Val Asp Asp Val Asp Leu Gly Gly Ser

260 265 270

Ser Asn Ser Val Pro Glu Gly Thr Leu Thr Pro Ser Ser Leu Pro Tyr

275 280 285

Ala Ala Ile Thr Ala Leu Gly Ser Gly Gln Val Ala Ser Val Ile Pro

290 295 300

Gly Thr Ala Gly Gln Lys Leu Asp Asp Asp Asp Lys His His His His

305 310 315 320

His His His His His His His Met Ala Tyr Asp Asp Leu His Glu Gly

325 330 335

Tyr Ala Thr Tyr Thr Gly Ser Gly Tyr Ser Gly Gly Ala Phe Leu Leu

340 345 350

Asp Pro Ile Pro Ser Asp Met Glu Ile Thr Ala Ile Asn Pro Ala Asp

355 360 365

Leu Asn Tyr Gly Gly Val Lys Ala Ala Leu Ala Gly Ser Tyr Leu Glu

370 375 380

Val Glu Gly Pro Lys Gly Lys Thr Thr Val Tyr Val Thr Asp Leu Tyr

385 390 395 400

Pro Glu Gly Ala Arg Gly Ala Leu Asp Leu Ser Pro Asn Ala Phe Arg

405 410 415

Lys Ile Gly Asn Met Lys Asp Gly Lys Ile Asn Ile Lys Trp Arg Val

420 425 430

Val Lys Ala Pro Ile Thr Gly Asn Phe Thr Tyr Arg Ile Lys Glu Gly

435 440 445

Ser Ser Arg Trp Trp Ala Ala Ile Gln Val Arg Asn His Lys Tyr Pro

450 455 460

Val Met Lys Met Glu Tyr Glu Lys Asp Gly Lys Trp Ile Asn Met Glu

465 470 475 480

Lys Met Asp Tyr Asn His Phe Val Ser Thr Asn Leu Gly Thr Gly Ser

485 490 495

Leu Lys Val Arg Met Thr Asp Ile Arg Gly Lys Val Val Lys Asp Thr

500 505 510

Ile Pro Lys Leu Pro Glu Ser Gly Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Val Pro

515 520 525

Gly His Val Gln Phe Pro Glu Asp Pro Asn Ser Ser Ser Val Asp Lys

530 535 540

Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His

545 550 555

<210> 2

<211> 1667

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcccctgcgc cggacctcaa cgcccgtcat gaattgaccc gccgccaggc ctcagaaagc 60

tgcccgatcg ggtactgcac acagaacggt ggcactaccg gtggtgcggc cggtgacacc 120

gtgaccgtga ccaatctggc cgacctgact gaagccgccg agagcgatgg gccgctgacg 180

atcatcgtgt ctgggtccat ctcgggcagt gccaagatcc gcgtggcctc agataagacg 240

atctttggag agtcgggtag ttctatcacc ggtatcggat tctacattcg ccgcgtcagc 300

aatgtcatca tgcggaactt gaagatcagc aaggtcgacg cagacaacgg cgatgccatt 360

ggcattgatg cctcctccaa tgtctgggtc gatcattgcg acctctctgg agacctcagc 420

ggtgggaagg atgacttgga cggactggtc gatatcagcc acggcgcgga atggatcacc 480

gtctcgaaca cttacttcca cgaccattgg aaaggttccc ttatcggcca ctccgacaac 540

aatgaagacg aggacctagg ccatctgcac gtcacctacg ctaacaacta ctggtacaac 600

gtgtacagcc gtacacccct gatccggttc gccacagtgc acatcatcaa caactattgg 660

gacagcctga tcgacacggg cgtgaactgc cgtatggatg cacaggtgct gatccagtcc 720

tccgcgttcc acaactgccc cgacagagcg atcttcttcg ccgactcaga ctacaccggg 780

tatgctgtcg tagacgatgt tgacctgggc ggctcgagta actcggtgcc cgagggaacc 840

ctgacgccta gctccttgcc ttatgcggcc attactgcgc tgggatctgg ccaggttgca 900

agcgtgattc cgggtacagc cggacagaaa ttggacgacg acgacaagca tcatcatcat 960

catcatcatc atcatcacca tatggcatac gacgacctgc atgaaggtta tgcaacgtat 1020

acagggtcag gctattcagg aggagctttc ctgctggatc ccattccttc cgatatggag 1080

attactgcaa taaatccggc ggatctcaat tacggaggag taaaagcggc acttgccggc 1140

tcttatttgg aagttgaagg gccaaaaggg aaaacaaccg tatatgttac tgatctttat 1200

cccgaaggcg ctcggggagc tcttgatctg tcacctaatg ccttccgtaa aatcggcaat 1260

atgaaagacg gaaaaatcaa tattaaatgg cgtgttgtca aagccccaat caccggcaat 1320

ttcacgtacc ggatcaaaga aggcagcagc aggtggtggg cagcaatcca agtcagaaat 1380

cacaagtatc ctgttatgaa aatggaatat gaaaaggatg gtaagtggat caacatggag 1440

aaaatggact ataaccattt tgtgagtacg aatttaggta ctggctctct caaagtcaga 1500

atgactgaca tccgcggaaa agttgtgaaa gacaccattc caaagctgcc tgaaagcgga 1560

acgtccaaag cctatacagt accgggccat gttcagtttc ctgaagatcc gaattcgagc 1620

tccgtcgaca agcttgcggc cgcactcgag caccaccacc accacca 1667

<210> 3

<211> 6897

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taggcctata tcaaggagga aagtcgtttt ttggggagtt ctgggcaaat ctccggggtt 60

ccccaatacg atcaataacg agtcgccacc gtcgtcggtt gagtcgaagg aaagcccgaa 120

acaatcgtcg gcctagagtc accaccacca ccaccacgag ctcacgccgg cgttcgaaca 180

gctgcctcga gcttaagcct agaccaccac caccaccacg agctcacgcc ggcgttcgaa 240

cagctgcctc gagcttaagc ctagaagtcc tttgacttgt accgggccat gacatatccg 300

aaacctgcaa ggcgaaagtc cgtcgaaacc ttaccacaga aagtgttgaa aaggcgccta 360

cagtcagtaa gactgaaact ctctcggtca tggatttaag catgagtgtt ttaccaatat 420

caggtaaaag aggtacaact aggtgaatgg taggaaaagt ataaggtaaa agtattgtcc 480

tatgaacact aaagactgaa cctaacgacg ggtggtggac gacgacggaa gaaactaggc 540

catgcacttt aacggccact aaccccgaaa ctgttgtgcg gtaaattata actaaaaagg 600

cagaaagtat aacggctaaa atgccttccg taatccactg tctagttctc gaggggctcg 660

cggaagccct atttctagtc attgtatatg ccaacaaaag ggaaaaccgg gaagttgaag 720

gtttattctc ggccgttcac ggcgaaaatg aggaggcatt aactctaggc ggcctaaata 780

acgtcattag aggtatagcc ttccttaccc taggtcgtcc tttcgaggag gacttatcgg 840

actgggacat atgcaacgta ttggaagtac gtccagcagc atacggtata ccactactac 900

tactactact actactacta cgaacagcag cagcaggtta aagacaggcc gacatgggcc 960

ttagtgcgaa cgttggaccg gtctagggtc gcgtcattac cggcgtattc cgttcctcga 1020

tccgcagtcc caagggagcc cgtggctcaa tgagctcggc gggtccagtt gtagcagatg 1080

ctgtcgtatg ggccacatca gactcagccg cttcttctag cgagacagcc ccgtcaacac 1140

cttgcgcctc ctgacctagt cgtggacacg taggtatgcc gtcaagtgcg ggcacagcta 1200

gtccgacagg gttatcaaca actactacac gtgacaccgc ttggcctagt ccccacatgc 1260

cgacatgtgc aacatggtca tcaacaatcg catccactgc acgtctaccg gatccaggag 1320

cagaagtaac aacagcctca ccggctattc ccttggaaag gttaccagca ccttcattca 1380

caagctctgc cactaggtaa ggcgcggcac cgactatagc tggtcaggca ggttcagtag 1440

gaagggtggc gactccagag gtctctccag cgttactagc tgggtctgta acctcctccg 1500

tagttacggt taccgtagcg gcaacagacg cagctggaac gactagaagt tcaaggcgta 1560

ctactgtaac gactgcgccg cttacatctt aggctatggc cactatcttg atgggctgag 1620

aggtttctag cagaatagac tccggtgcgc ctagaaccgt gacgggctct acctgggtct 1680

gtgctactag cagtcgccgg gtagcgagag ccgccgaagt cagtccagcc ggtctaacca 1740

gtgccagtgc cacagtggcc ggcgtggtgg ccatcacggt ggcaagacac acgtcatggg 1800

ctagcccgtc gaaagactcc ggaccgccgc ccagttaagt actgcccgca actccaggcc 1860

gcgtcccctc ccttaacaat aggcgagtgt taaggggata tcactcagca taattaaagc 1920

gccctagctc tagagctagg agatgcggcc tgcgtagcac cggccgtagt ggccgcggtg 1980

tccacgccaa cgaccgcgga tatagcggct gtagtggcta ccccttctag cccgagcggt 2040

gaagcccgag tactcgcgaa caaagccgca cccataccac cgtccggggc accggccccc 2100

tgacaacccg cggtagagga acgtacgtgg taaggaacgc cgccgccacg agttgccgga 2160

gttggatgat gacccgacga aggattacgt cctcagcgta ttccctctcg cagctctagg 2220

gcctgtggta gcttaccgcg ttttggaaag cgccataccg tactatcgcg ggccttctct 2280

cagttaagtc ccaccactta cactttggtc attgcaatat gctacagcgt ctcatacggc 2340

cacagagaat agtctggcaa agggcgcacc acttggtccg gtcggtgcaa agacgctttt 2400

gcgccctttt tcaccttcgc cgctaccgcc tcgacttaat gtaagggttg gcgcaccgtg 2460

ttgttgaccg cccgtttgtc agcaacgact aaccgcaacg gtggaggtca gaccgggacg 2520

tgcgcggcag cgtttaacag cgccgctaat ttagagcgcg gctagttgac ccacggtcgc 2580

accaccacag ctaccatctt gcttcgccgc agcttcggac atttcgccgc cacgtgttag 2640

aagagcgcgt tgcgcagtca cccgactagt aattgatagg cgacctactg gtcctacggt 2700

aacgacacct tcgacggacg tgattacaag gccgcaataa agaactacag agactggtct 2760

gtgggtagtt gtcataataa aagagggtac ttctgccatg cgctgacccg cacctcgtag 2820

accagcgtaa cccagtggtc gtttagcgcg acaatcgccc gggtaattca agacagagcc 2880

gcgcagacgc agaccgaccg accgtattta tagagtgagc gttagtttaa gtcggctatc 2940

gccttgccct tccgctgacc tcacggtaca ggccaaaagt tgtttggtac gtttacgact 3000

tactcccgta gcaagggtga cgctacgacc aacggttgct agtctaccgc gacccgcgtt 3060

acgcgcggta atggctcagg cccgacgcgc aaccacgcct atagagccat caccctatgc 3120

tgctatggct tctgtcgagt acaatatagg gcggcaattg gtggtagttt gtcctaaaag 3180

cggacgaccc cgtttggtcg cacctggcga acgacgttga gagagtcccg gtccgccact 3240

tcccgttagt cgacaacggg cagagtgacc acttttcttt ttggtgggac cgcgggttat 3300

gcgtttggcg gagaggggcg cgcaaccggc taagtaatta cgtcgaccgt gctgtccaaa 3360

gggctgacct ttcgcccgtc actcgcgttg cgttaattac attcaatcga gtgagtaatc 3420

cgtggcccta gagctggcta cgggaactct cggaagttgg gtcagtcgag gaaggccacc 3480

cgcgccccgt actgatagca gcggcgtgaa tactgacaga agaaatagta cgttgagcat 3540

cctgtccacg gccgtcgcga gacccagtaa aagccgctcc tggcgaaagc gacctcgcgc 3600

tgctactagc cggacagcga acgccataag ccttagaacg tgcgggagcg agttcggaag 3660

cagtgaccag ggcggtggtt tgcaaagccg ctcttcgtcc ggtaatagcg gccgtaccgc 3720

cggggtgccc acgcgtacta gcacgaggac agcaactcct gggccgatcc gaccgcccca 3780

acggaatgac caatcgtctt acttagtggc tatgcgctcg cttgcacttc gctgacgacg 3840

acgttttgca gacgctggac tcgttgttgt acttaccaga agccaaaggc acaaagcatt 3900

tcagaccttt gcgccttcag tcgcgggacg tggtaataca aggcctagac gtagcgtcct 3960

acgacgaccg atgggacacc ttgtggatgt agacataatt gcttcgcgac cgtaactggg 4020

actcactaaa aagagaccag ggcggcgtag gtatggcggt caacaaatgg gagtgttgca 4080

aggtcattgg cccgtacaag tagtagtcat tgggcatagc actcgtagga gagagcaaag 4140

tagccatagt aatgggggta cttgtcttta gggggaatgt gcctccgtag tcactggttt 4200

gtcctttttt ggcgggaatt gtaccgggcg aaatagtctt cggtctgtaa ttgcgaagac 4260

ctctttgagt tgctcgacct gcgcctactt gtccgtctgt agacacttag cgaagtgctg 4320

gtgcgactac tcgaaatggc gtcgacggag cgcgcaaagc cactactgcc acttttggag 4380

actgtgtacg tcgagggcct ctgccagtgt cgaacagaca ttcgcctacg gccctcgtct 4440

gttcgggcag tcccgcgcag tcgcccacaa ccgcccacag ccccgcgtcg gtactgggtc 4500

agtgcatcgc tatcgcctca catatgaccg aattgatacg ccgtagtctc gtctaacatg 4560

actctcacgt ggtatatacg ccacacttta tggcgtgtct acgcattcct cttttatggc 4620

gtagtccgcg agaaggcgaa ggagcgagtg actgagcgac gcgagccagc aagccgacgc 4680

cgctcgccat agtcgagtga gtttccgcca ttatgccaat aggtgtctta gtcccctatt 4740

gcgtcctttc ttgtacactc gttttccggt cgttttccgg tccttggcat ttttccggcg 4800

caacgaccgc aaaaaggtat ccgaggcggg gggactgctc gtagtgtttt tagctgcgag 4860

ttcagtctcc accgctttgg gctgtcctga tatttctatg gtccgcaaag ggggaccttc 4920

gagggagcac gcgagaggac aaggctggga cggcgaatgg cctatggaca ggcggaaaga 4980

gggaagccct tcgcaccgcg aaagagtatc gagtgcgaca tccatagagt caagccacat 5040

ccagcaagcg aggttcgacc cgacacacgt gcttgggggg caagtcgggc tggcgacgcg 5100

gaataggcca ttgatagcag aactcaggtt gggccattct gtgctgaata gcggtgaccg 5160

tcgtcggtga ccattgtcct aatcgtctcg ctccatacat ccgccacgat gtctcaagaa 5220

cttcaccacc ggattgatgc cgatgtgatc ttcctgtcat aaaccataga cgcgagacga 5280

cttcggtcaa tggaagcctt tttctcaacc atcgagaact aggccgtttg tttggtggcg 5340

accatcgcca ccaaaaaaac aaacgttcgt cgtctaatgc gcgtcttttt ttcctagagt 5400

tcttctagga aactagaaaa gatgccccag actgcgagtc accttgcttt tgagtgcaat 5460

tccctaaaac cagtacttgt tattttgaca gacgaatgta tttgtcatta tgttccccac 5520

aatactcggt ataagttgcc ctttgcagaa cgagatccgg cgctaattta aggttgtacc 5580

tacgactaaa tatacccata tttacccgag cgctattaca gcccgttagt ccacgctgtt 5640

agatagctaa catacccttc gggctacgcg gtctcaacaa agactttgta ccgtttccat 5700

cgcaacggtt actacaatgt ctactctacc agtctgattt gaccgactgc cttaaatacg 5760

gagaaggctg gtagttcgta aaataggcat gaggactact acgtaccaat gagtggtgac 5820

gctaggggcc cttttgtcgt aaggtccata atcttcttat aggactaagt ccacttttat 5880

aacaactacg cgaccgtcac aaggacgcgg ccaacgtaag ctaaggacaa acattaacag 5940

gaaaattgtc gctagcgcat aaagcagagc gagtccgcgt tagtgcttac ttattgccaa 6000

accaactacg ctcactaaaa ctactgctcg cattaccgac cggacaactt gttcagacct 6060

ttctttacgt atttgaaaac ggtaagagtg gcctaagtca gcagtgagta ccactaaaga 6120

gtgaactatt ggaataaaaa ctgctcccct ttaattatcc aacataacta caacctgctc 6180

agccttagcg tctggctatg gtcctagaac ggtaggatac cttgacggag ccactcaaaa 6240

gaggaagtaa tgtctttgcc gaaaaagttt ttataccata actattagga ctatacttat 6300

ttaacgtcaa agtaaactac gagctactca aaaagattct taattaagta ctcgcctatg 6360

tataaactta cataaatctt tttatttgtt tatccccaag gcgcgtgtaa aggggctttt 6420

cacggtggac tttaacattt gcaattataa aacaatttta agcgcaattt aaaaacaatt 6480

tagtcgagta aaaaattggt tatccggctt tagccgtttt agggaatatt tagttttctt 6540

atctggctct atcccaactc acaacaaggt caaaccttgt tctcaggtga taatttcttg 6600

cacctgaggt tgcagtttcc cgctttttgg cagatagtcc cgctaccggg tgatgcactt 6660

ggtagtggga ttagttcaaa aaaccccagc tccacggcat ttcgtgattt agccttggga 6720

tttccctcgg gggctaaatc tcgaactgcc cctttcggcc gcttgcaccg ctctttcctt 6780

cccttctttc gctttcctcg cccgcgatcc cgcgaccgtt cacatcgcca gtgcgacgcg 6840

cattggtggt gtgggcggcg cgaattacgc ggcgatgtcc cgcgcagggt aagcggt 6897

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccatgggctc acctgcgccg gacctcaac 29

<210> 5

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

catatggtga tgatgatgat gatgatgatg atgatgcttg tcgtcgtcgt ccaatttctg 60

tccggctgta c 71

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

catatggtga tgatgatgat gatgatg 27

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gatatcagcc acggcgcgga atg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cattccgcgc cgtggctgat atc 23

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

catatggcat acgacgacct gcatgaagg 29

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaattcttca ggaaactgaa catgg 25

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

catatggcat acgacgacct gcatgaagg 29

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gaattcttca ggaaactgaa catgg 25

Claims

1.一种多糖氢键破除酶融合蛋白，其特征在于，含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述的多糖氢键破除酶融合蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，含有枯草芽孢杆菌来源的编码扩张蛋白Expansin成熟蛋白的核苷酸序列、编码曲霉果胶酸裂解酶PelA成熟蛋白的核苷酸序列、大肠杆菌肠激酶识别位点核苷酸序列、1个10×组氨基酸核苷酸序列和1个6×组氨酸核苷酸序列。

4.含有权利要求2所述基因载体。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，以pET系列载体为出发载体。

6.表达权利要求1所述多糖氢键破除酶融合蛋白的基因工程菌或细胞系。

7.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET-28a(+)为载体，表达权利要求1所述的多糖氢键破除酶融合蛋白。

8.一种提高多糖氢键破除酶可溶性表达的方法，其特征在于，在大肠杆菌BL21(DE3)中，以pET-28a(+)为载体，表达核苷酸序列为SEQ ID NO.1的多糖氢键破除酶融合蛋白。

9.一种产多糖氢键破除酶的方法，其特征在于，应用权利要求7所述的基因工程菌进行发酵生产。

10.权利要求1所述的多糖氢键破除酶融合蛋白在多糖氢键破除酶蛋白生产、生物质原料利用、或单糖生产领域的应用。