CN110257361B

CN110257361B - 一种褐藻胶裂解酶及其基因和应用

Info

Publication number: CN110257361B
Application number: CN201910615825.7A
Authority: CN
Inventors: 李仁宽; 叶秀云; 王圆芳; 郭炳奇
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2019-07-09
Filing date: 2019-07-09
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2039-07-09
Also published as: CN110257361A

Abstract

本发明提供一种褐藻胶裂解酶及其基因和应用，以及将其在大肠杆菌和酵母细胞中克隆表达的方法，所述褐藻胶裂解酶基因核苷酸序列的如SEQ ID NO.1所示；褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；含所述基因的重组载体是褐藻胶裂解酶基因连接至大肠杆菌质粒或酵母质粒；含所述基因的细胞由所述重组载体转化而得；所述褐藻胶裂解酶基因的细胞是包含所述核苷酸分子或用所述重组载体转化的大肠杆菌或包含所述核酸分子或用所述重组载体转化的毕氏酵母。

Description

一种褐藻胶裂解酶及其基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种褐藻胶裂解酶及其基因和应用。

技术背景

褐藻胶裂解酶以来源于海洋生物为主，包括海洋微生物，无脊椎动物，藻类等。研究发现最多的褐藻胶裂解酶是多糖裂解酶第7家族(PL7），褐藻胶裂解酶可以将褐藻胶降解成具有多种活性的低聚糖或者寡糖，已经在细菌中已经得到了很好地研究。2018年，Jingjing Zhuang等人报道了一株来源于弧菌，属于多糖裂解酶第7家族的新褐藻胶裂解酶，它包含了两个连续的PL7结构域，可以降解褐藻胶生成二-、三-、四-褐藻胶低聚糖。2018年，ChunePeng等人发现一株属于多糖裂解酶第7家族的内型褐藻胶裂解酶，对重组酶使用不同的糖链作为测试底物发现其具有双功能，重组酶催化模块的改变可以产生不同水平的低聚糖。2018年，Peng Chen等人从海洋芽孢杆菌中纯化出一株高比活的褐藻胶裂解酶，主要降解褐藻胶产生二糖，三糖和四糖。

褐藻胶裂解酶的作用机制是在1- 4糖苷键位置通过β消去机制作用于古洛糖醛酸和甘露糖醛酸，同时在糖苷键断裂的非还原端碳骨架C4和C5间产生一个双键，形成一个特殊的结构，这个特殊结构的产物是裂解酶的特有产物，会在230-240 nm有特殊吸收峰。

褐藻胶裂解酶有多种分类的方式，可根据作用方式、底物专一性、分子量大小和初级结构等方面来分析褐藻胶裂解酶，了解它的结构和性质。褐藻胶裂解酶的分子大小是25kDa到110kDa不等，最适温度范围在25℃到50℃，最适PH在5-10之间。多数的褐藻胶裂解酶是诱导型表达，内切型降解酶；少数或者极少数是组成型，外切型降解酶。

大肠杆菌表达系统研究的比较清楚，而且易操作，生长周期短，然而，在大肠杆菌中异源表达的蛋白质易于形成包涵体。胞内酶的表达需要机械破坏以从细胞中释放，这可能导致酶失活或酶活性降低，限制了褐藻胶裂解酶的大规模生产和应用。而毕赤酵母操作复杂，其生长周期较长。但是具有高拷贝，高密度发酵，表达基因稳定在宿主基因组中等优点，因此选择合适的宿主也至关重要。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种褐藻胶裂解酶及其基因和应用。以及将褐藻胶裂解酶基因在大肠杆菌和酵母细胞中克隆表达的方法，提供具有潜在应用价值的新酶源。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种褐藻胶裂解酶，所述褐藻胶裂解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

含有褐藻胶裂解酶基因的重组载体是褐藻胶裂解酶基因连接至大肠杆菌质粒或酵母质粒的重组载体；优选的所述的重组载体为pET28a(+)-Alginate lyase或 pPIC9k - Alginate lyase。

含有褐藻胶裂解酶的基因的细胞选大肠杆菌细胞或酵母细胞为受体细胞；所述细胞由所述重组载体转化而得；所述细胞是包含所述核苷酸分子或用所述重组载体转化的大肠杆菌或包含所述核酸分子或用所述重组载体转化的毕氏酵母。

具体为：

本发明涉及从海洋环境筛选出能产褐藻胶裂解酶的菌株Microbulbifer sp.及克隆褐藻胶裂解酶基因。实施方式之一，本发明提取Microbulbifer sp.的基因组DNA，经测序获得褐藻胶裂解酶全长基因，称之为Alginate lyase。

本发明还涉及包含所述Alginate lyase编码序列的重组载体，例如由各种本领域常用的表达载体制备的重组载体，其中，所述编码序列不包含其来源微生物的内源性信号肽序列。实施方式之一中，将带内源性信号肽的编码序列即本发明Alginate lyase编码序列去除信号肽，再经Hind III和BamHI双酶切后与Hind III和BamHI双酶切pET28a(+)载体连接，得到大肠重组表达载体pET28a(+)-Alginate lyase。另一实施方式中，将带内源性信号肽编码序列的本发明Alginate lyase编码序列去除信号肽，再经AvrII和Not I双酶切后与AvrII和Not I双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体。

本发明还制备包含本发明Alginate lyase编码序列的细胞。实施方式之一中，所述细胞是用上述本发明重组载体转化来构建的。所述受体细胞优选各种利于基因产物表达的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。在本发明的实施方式之一中，选用大肠杆菌BL21(DE3)和毕氏酵母GS115构建表达Alginate lyase的重组细胞。

本发明还提供了表达Alginate lyase的方法，包括：培养前文所述包含本发明Alginate lyase编码序列的细胞或所述经转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物，还包括纯化表达产物的步骤。实施方式之一中，本发明通过包含本发明Alginate lyase编码序列的酵母(例如毕氏酵母GS115)发酵生产Alginate lyase褐藻胶裂解酶，并通过阴离子交换层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。

本发明利用基因工程手段制备了能够高效表达并分泌Alginate lyase的重组生产株，获得了优质的Alginate lyase产品。本发明通过酶活测定，酶学性质分析，降解底物的分析。证明本发明的Alginate lyase是一种具有广泛的温度范围和PH范围的褐藻胶裂解酶，且可以降解海藻酸钠产生不同的低聚糖产物。

本发明的优点在于：本发明的褐藻胶裂解酶温度适应性强，在最适温度的条件下仍具有较高活性和持久的稳定性。相对不受温度限制，在较低温条件下保持较高活性持久进行反应。

附图说明

图1 Microbulbifer sp.来源的Alginate lyase在质粒pMD18-T、pET-28a(+)和pPIC9k上的重组子结构图。

图2 Microbulbifer sp.来源的Alginate lyase的SDS-PAGE。M：蛋白质Marker；1：粗酶液；2:重组褐藻胶裂解酶Alginate lyase DEAE柱纯化产物。

图3 Microbulbifer sp.来源的Alginate lyase的最适pH和pH稳定性。a：pH对重组酶Alginate lyase的活性影响；b:重组酶Alginate lyase的pH稳定性。

图4 Microbulbifersp.来源的Alginate lyase的最适温度和温度稳定性。a：温度对重组酶Alginate lyase的活性影响；b:重组酶Alginate lyase的温度稳定性。

图5 Microbulbifer sp.来源的Alginate lyase降解产物分析。M：二糖标品，1：降解10min，2：降解15min，3：降解30min，4：降解1h，5：降解6h，6：降解24h。

具体实施方式

以下根据具体的实施例充分说明本发明。

实验材料和试剂

1.菌株和载体：

大肠杆菌BL21（DE3）、Top10及表达载体pET28a(+)购自Novagen公司，毕氏酵母GS115及表达载体pPIC9k均购自Invitrogen公司（Carlsbad，CA，USA）。

2.酶类及其他生化试剂：

限制性内切酶、DNA Maker、Protein Maker均购自Fermentas（MBI），genomewalking kit购自TaKaRa公司。

3.培养基：

（1）LB液体培养基：蛋白胨（Tryptone）10.0 g，NaCl 10.0 g，酵母提取物（YeastExtract）5.0 g，蒸馏水定容至1 L，121°C灭菌20 min。

（2）LB固体培养基是在LB液体培养基中添加2%(w/v)琼脂粉，121°C灭菌20 min。

（3）MD培养基：称取15.0 g琼脂粉于800 mL蒸馏水中，121°C灭菌20 min，待冷却至60°C左右，依次加入10×YNB 100 mL，500×生物素2 mL，20%(w/v)葡萄糖100 mL。

（4）YPD培养基：酵母粉1%(w/v)，蛋白胨2%(w/v)，121°C灭菌20 min，使用时加入2%(w/v)葡萄糖。固体培养基是在YPD液体培养基加入2%(w/v)的琼脂粉。

（5）YPM培养基：酵母粉1%(w/v)，蛋白胨2%(w/v)，121°C灭菌20 min，使用时加入2%(v/v)甲醇。

4.本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括：[美]J.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用（第二版）；朱检等，生物化学实验[M]。

5.本发明中所有相关的酶活、酶活力、酶活性均是指Alginate lyase酶活性，均采用DNS法并按照所述的方法进行测定及计算。

实施例1 Alginate lyase基因的获得

（1）来源于微泡菌Microbulbifer sp.基因组DNA的分离提取：

取1.5 mL菌体培养物Microbulbifer sp.（购自中国海洋微生物菌种保藏管理中心）于一灭菌Ep管中，12000 rpm离心1 min，弃上清液，收集菌体。

加入400 μL裂解液（40 mM Tris-醋酸，20 mM醋酸钠，1 mM EDTA，1% SDS，pH 7.8）混匀，置于37℃水浴1 h。

然后加入200 μL l5 mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000 rpm离心15 min。

取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3 M，pH 8.0)，-20℃保存1 h后，13000rpm离心15 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50 μL TE溶液中，置4℃保存备用。

（2）PCR获取目的基因

经Microbulbifer sp.基因组测序分析，得到一条褐藻胶裂解酶全长基因，根据基因序列分别设计上下游引物P1和P2、P3和P4。引物P1和P2分别含有Hind III和BamHI酶切位点，引物P3和P4分别含有AvrII和Not I酶切位点。引物由上海铂尚生物科技有限公司合成，引物序列如下：

P1：5'-CC aagctt GCCACGCACCCTAATCTTGTGATC-3'

P2：5'-CG ggatcc ATAACTCGGCTTTCCGCCTCAAGG-3'

P3：5'-CTC cctagg GCCACGCACCCTAATCTTGTGATC-3'

P4：5'-GTT gcggccgc ATAACTCGGCTTTCCGCCTCAAGG-3'

本实施例PCR反应体系为50ul （上下游引物各1uL，dNTP 1uL,基因组1uL,DNA聚合酶1uL，dd水45uL），反应程序为： 94℃预变性4 min；94℃变性30 s，57.1℃退火30 s，72℃延伸2.5min，循环扩增30次；最后72℃延伸10min。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测,并回收凝胶中的目的基因。

（3）cDNA亚克隆：

将实例1-（2）获得的带酶切位点的目的基因插入到载体pMD18-T上，得到重组质粒pMD18-T-Alginate lyase（如图1所示），用化学转化法转化到受体菌E.coliTop 10，在含有100 mg/mL Amp的LB平板上37℃培养过夜。挑取单克隆菌落接种到2 ml含有100 mg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃ 200 rpm培养6-10 h，10000 rpm离心10 min收集菌体，提取质粒，分别用Hind III/BamHI和 Avr II和Not I进行双酶切，回收目的基因备用（质粒提取和胶回收分别用OMEGA公司的E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I和E.Z.N.A. Gel Extraction Kit试剂盒）。将所得目的基因进行DNA序列测定（Invitrogen公司），并在NCBI数据库中进行比对分析，结果如SEQ ID NO.1所示。

由此得到的褐藻胶裂解酶的编码序列共有2046 bp（SEQ ID NO:1），其中第1-102位编码序列为信号肽编码含34个氨基酸信号肽，其信号肽氨基酸为 SEQ ID NO:2；第103-2046位编码序列编码不含信号肽的成熟蛋白，该成熟蛋白含有648个氨基酸（SEQ ID NO:3）。根据在NCBI数据库同源性比对的结果初步确定所得到的基因片段为褐藻胶裂解酶基因。

实施例2 Alginate lyase编码基因在大肠杆菌中的表达和扩增

将实施例1-(4)中所得到经Hind III和BamHI双酶切的目的基因，与经过到Hind III和BamHI双酶切的pET28a(+)质粒连接，得到重组质粒pET-28a-Alginate lyase（如图1所示）。

取10uL构建好的质粒DNA，加入到100uL制备好的大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞中，摇匀置于冰上，冰浴30min；置于42℃水浴中热击90s；将离心管快速移至冰水混合物中冰浴2min；每管加入800uL LB培养基，用移液器轻吸打散后于37℃摇床上复苏1h（80rpm～200rpm）；离心，4000rpm× 5min，除去700uL上清，剩余部分混匀；涂平板（LB平板，含100ug/mL Amp），37℃正置1h后，倒置培养过夜，在抗性平板上生长的为含有重组质粒的阳性克隆子。挑取重组子到LB液体培养基（含100ug/mL Amp），待菌液浑浊，用菌液PCR的方法验证阳性重组子，PCR产物经1.0%(w/v)琼脂糖凝胶电泳验证，目的条带大小为2046 bp左右，与实施例1中从Microbulbifer sp.中所得到的原始基因Alginate lyase的序列大小一致，将鉴定为阳性重组子的菌液送出测序，进一步验证目的基因序列和插入位点的正确性。

取测序正确的基因片段的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)，接种于200ml LB培养液中（1000ml三角瓶，100ug/mL Amp），37℃ 200rpm振荡培养1-1.5h，加入IPTG诱导（终浓度为1mmol/L），20℃ 200rpm再振荡培养10h。取培养液10000rpm离心10min，收集菌体，再加入等体积的无菌水重新悬浮菌体，12000rpm离心10min，取沉淀用1/20体积pH8、20mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液悬浮菌体，进行超声波破碎，破碎条件为：60%功率，间隔5s破碎10min，停止10min，再破碎10min。12000rpm离心，收集上清液分析Alginate lyase活力，并通过SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量，结果表明Alginate lyase的编码基因所编码的Alginate lyase可在大肠杆菌中表达，且有一定的Alginate lyase活性。

实施例3 酵母重组表达载体的构建

将实施例1-（4）中所得到经AvrII和Not I双酶切的目的基因，与经过AvrII和Not I双酶切的pPIC9k质粒连接，得到重组质粒pPIC9k-Alginate lyase（如图1所示）。

将重组质粒转入E.coliTop10感受态细胞，涂布在含有100 mg/mL Amp的LB筛选板上过夜培养，挑取重组子到液体LB（含100ug/mL Amp），用菌液PCR的方法鉴定，若为阳性重组子，送出测序，测序结果进一步证明目的基因序列和插入位点的正确性。选择插入基因正确的菌液，参照OMEGA Plasmid Mini Kit的提取步骤，提取重组质粒，于-20°C保存备用。

实施例4 毕氏酵母发酵生产重组酶Alginate lyase

将实施例3 制备的重组质粒pPIC9k-Alginate lyase经Sal I单酶切，得到线性化质粒pPIC9k- Alginate lyase。

取20 µL已线性化的重组质粒pPIC9K- Alginate lyase加入到80 µL的毕赤酵母GS115感受态细胞中，轻轻吹打混匀；把混合液加入2 mm预冷的电转杯中，将电转杯放入已预热30 min的电转仪，电击一次；电击完成后，快速加入1 mL预冷的山梨醇于电转杯中轻轻吹打悬浮菌液，吸出菌液至灭菌的1.5 mL EP管中，30°C静置复苏60 min；将菌液6000 ×g离心2 min，吸取80 µL上清重悬菌体后涂布于MD筛选板上；30°C倒置培养3天左右，直至转化子长出。在MD平板上生长的为含有重组质粒的阳性克隆子。

挑取重组质粒pPIC9K-Alginate lyase 转化的毕氏酵母GS115菌株阳性克隆子至10 mL YPD液体培养基，过夜培养。按10.0%(v/v)的添加量将菌液添加到10 mL YPM培养基中，30°C、200 rpm恒温摇床培养3天，每24 h添加终浓度为2.0%(v/v)的甲醇诱导表达。将菌液13000rpm离心5min，取上清液测定几丁质酶活力并进行SDS-PAGE分析，结果分别如图2所示。Alginate lyase 的表达水平(以发酵液上清的酶活力表示)可达到250 U/ml ，这说明Microbulbifer sp.来源的褐藻胶裂解酶基因Alginate lyase 在毕氏酵母中得到了表达和积累。

实施例5 重组酶 Alginate lyase的纯化

按实施例4制备大量发酵酶液，将所制备的发酵培养液12000rpm离心10min，将粗酶液用缓冲液 A（50 mM的pH 8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠）稀释5倍，以1mL/min的流速加载到DEAE纤维素柱中，用缓冲液A洗脱弱结合的蛋白至柱平衡，再用缓冲液B（含有1 mol·L^-1的NaCl的50 mM pH 8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠，）以 1 mL/min 的流速洗脱目的蛋白，收集洗脱液，SDS-PAGE 测定目的蛋白纯度。纯化完成后，获得的褐藻胶裂解酶Alginate lyase比活性从粗酶液的125U/mg 提高到纯酶的514.2U/mg，纯化倍数为4.11倍，得率为32%。重组酶大小约为89kDa，比理论值75.59 kDa大，可能与糖基化等因素有关。SDS-PAGE结果如图2。

实施例6重组酶 Alginate lyase 生化性质表征

1、重组酶的最适反应pH和pH稳定性的测定

重组酶最适反应pH测定：将纯化后的重组酶在40℃条件下，于不同pH（pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）的底物中测酶活，以确定其最适反应pH 。

重组酶pH稳定性测定：将纯化好的重组酶在不同 pH 值（pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）的缓冲液中于37℃下水浴保温60 min后，取酶液于最适pH和温度下分别测定其酶活力。结果显示重组Alginate lyase最适反应pH为pH8，在pH5-10范围内稳定，实验结果如图3所示。

2、重组酶最适反应温度和热稳定性的测定

重组酶最适反应温度的测定：将纯化后的重组酶在最适pH底物中，于不同温度（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）条件下反应测定酶活力，以确定其最适反应温度。

重组酶热稳定性测定：将纯化好的重组酶在不同温度（35℃、40℃、45℃）下水浴保温处理，并在不同时间点 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min 样后迅速置于冰上，在最适pH和温度条件下分别测定其酶活力。结果显示Alginate lyase最适反应温度为40℃，在35℃ 10min仍可以保持80%以上的酶活。实验结果如图4所示。

实施例7 重组酶Alginate lyase 降解海藻酸钠分析

反应混合物为900 µL 1%(w/v)海藻酸钠和 100 µL 0.5 U·mL-1 的纯化褐藻胶裂解酶，在40℃孵育不同时间（10 min、15 min、30 min、1 h、6 h、24 h），然后煮沸10 min终止反应。采用TLC对重组酶的水解产物进行分析。实验结果如图5所示，降解海藻酸钠产生三种低聚糖产物：二糖，三糖和四糖。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种褐藻胶裂解酶及其基因和应用

<130> 7

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2048

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.1

<400> 1

atgtttttgc accacaccca taaaaaagcc aaccttgttt cagcagcgat cgcactggcg 60

ctcggcgtat cctcgattgg atctgcaacg cctgtattcg cggccacgca ccctaatctt 120

gtgatcaatg cgggcgatgt ggacgcgatg cagggcgcag tgaacacgcc cggtcgcttc 180

cgcaacgcat ttctcgccag caagaaatcc gtcgatgaat ccttgcagat gcccctcgcc 240

gtaccggtac ctttggatgc aggcggcggg tacacccacg agcagcacaa aaacaactac 300

caattgatgt acagcgccgg tgtcttgtat cagatcaccg gagatgccaa gtacgcagag 360

cgcgtgcgcg acatgctgat cgcctacgcc gagctatacc ctacgctgcc gctgcatcca 420

aagcgccgtt ccggcgcaga caacccgggt aaactgttct ggcagagcct gaacgaggcg 480

gtatggctgg tgtataccat ccaggcatac gatctggtgc gcaccgcact gacggacagc 540

gaggctgaga agattgagca aggtttactg cgtccggtcg cgcgattcct gtctatcgaa 600

tcgccggaga cgttcaacaa ggtccacaat catggcacct ggctcactgc tggcgtcggc 660

atgaccggct atgtgctgga cgagcaggag ctggtggagc agtcactgct ggatctggaa 720

aaatccggta agggtggttt cctgcagcaa ttaaacacgc tgttttcacc agacggttat 780

tacaacgaag gcccctacta ccagcgctat gcgctgatgc cgttcgtaac ctttgccaag 840

gccatcgaca acaacgaacc ggagcgggag atattttcct accgcgacgg cgcgctgtta 900

aaggccatcg ataccagcat ccagctcagc tacaacgggc tgtttttccc catcaatgac 960

gccatcaaaa gtaaaggaat cgacacctca gagttggtgc agggtgttgc cattgcttat 1020

ggaaaaacgg gcaatccgca gcttctggat attgcacaga agcaacagca gatactgctg 1080

acgggcgatg gcctgaaagt ggcgcaggca ctcgatgccg gcgagaagcg agcctatgac 1140

ttcagatctg ccgttttccg cgacggtaaa gatggcgacg aaggcgcgtt agtggtcatg 1200

cgccagaaaa tcggcagcga tcaggcgctg gtgtttaagc ccgctgccca gggcatgggc 1260

cacggacact ttgacaagct ctcctggcag ttttacgacc atggctcgga aatcgtgacc 1320

gactatggct cggcccgttt tctcaatgtc gaggcaaagc acggcgggcg ctacttgccg 1380

gaaaatgaga cctatgccaa gcagaccgtc gcgcacaata ccgtggtgat tgacgaaacc 1440

tcccacttca acagtgacct caagatcggt aacagtaacc atcccgaact gctgtttttc 1500

catgcagacg accagatcaa aatcagctcg gcgagcatcg actccgccta ccccggcgta 1560

acgctaaccc gcaccatggc gctggttaac gacaccgact cgagctcaac gttcgtcatt 1620

gatctttttg acgtgcaggc gaataacaat cgtcgcctgg atctgccact gcactacaac 1680

ggccaactgg tagacaccaa cttcaaactg catagctaca ccgaccgtat ttccgcgctg 1740

gggaaaaaca acggttacca gcacttgtgg ttgaaagcca gaggtaaacc ggatgccggc 1800

ctcgcacaga taacctggct caacgacaac ggtcgtttct acacccactc caccattgcc 1860

gacgggagaa ccgaacttct gttcaccgag ctcggcgcca atgatccgga gttcaatctg 1920

cgctcggaaa aggcatttat tgcccgtcac gacaaaacca acgcgcatac gtttgtcagt 1980

gtcctcgaac cgcacggtga gtataaccca tcccgtgaat tcacccttga ggcggaaagc 2040

cgagttat 2048

<210> 2

<211> 34

<212> PRT

<213> SEQ ID NO.2

<400> 2

Met Phe Leu His His Thr His Lys Lys Ala Asn Leu Val Ser Ala Ala

1 5 10 15

Ile Ala Leu Ala Leu Gly Val Ser Ser Ile Gly Ser Ala Thr Pro Val

20 25 30

Phe Ala

<210> 3

<211> 648

<212> PRT

<213> SEQ ID NO.3

<400> 3

Ala Thr His Pro Asn Leu Val Ile Asn Ala Gly Asp Val Asp Ala Met

1 5 10 15

Gln Gly Ala Val Asn Thr Pro Gly Arg Phe Arg Asn Ala Phe Leu Ala

20 25 30

Ser Lys Lys Ser Val Asp Glu Ser Leu Gln Met Pro Leu Ala Val Pro

35 40 45

Val Pro Leu Asp Ala Gly Gly Gly Tyr Thr His Glu Gln His Lys Asn

50 55 60

Asn Tyr Gln Leu Met Tyr Ser Ala Gly Val Leu Tyr Gln Ile Thr Gly

65 70 75 80

Asp Ala Lys Tyr Ala Glu Arg Val Arg Asp Met Leu Ile Ala Tyr Ala

85 90 95

Glu Leu Tyr Pro Thr Leu Pro Leu His Pro Lys Arg Arg Ser Gly Ala

100 105 110

Asp Asn Pro Gly Lys Leu Phe Trp Gln Ser Leu Asn Glu Ala Val Trp

115 120 125

Leu Val Tyr Thr Ile Gln Ala Tyr Asp Leu Val Arg Thr Ala Leu Thr

130 135 140

Asp Ser Glu Ala Glu Lys Ile Glu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Val Ala

145 150 155 160

Arg Phe Leu Ser Ile Glu Ser Pro Glu Thr Phe Asn Lys Val His Asn

165 170 175

His Gly Thr Trp Leu Thr Ala Gly Val Gly Met Thr Gly Tyr Val Leu

180 185 190

Asp Glu Gln Glu Leu Val Glu Gln Ser Leu Leu Asp Leu Glu Lys Ser

195 200 205

Gly Lys Gly Gly Phe Leu Gln Gln Leu Asn Thr Leu Phe Ser Pro Asp

210 215 220

Gly Tyr Tyr Asn Glu Gly Pro Tyr Tyr Gln Arg Tyr Ala Leu Met Pro

225 230 235 240

Phe Val Thr Phe Ala Lys Ala Ile Asp Asn Asn Glu Pro Glu Arg Glu

245 250 255

Ile Phe Ser Tyr Arg Asp Gly Ala Leu Leu Lys Ala Ile Asp Thr Ser

260 265 270

Ile Gln Leu Ser Tyr Asn Gly Leu Phe Phe Pro Ile Asn Asp Ala Ile

275 280 285

Lys Ser Lys Gly Ile Asp Thr Ser Glu Leu Val Gln Gly Val Ala Ile

290 295 300

Ala Tyr Gly Lys Thr Gly Asn Pro Gln Leu Leu Asp Ile Ala Gln Lys

305 310 315 320

Gln Gln Gln Ile Leu Leu Thr Gly Asp Gly Leu Lys Val Ala Gln Ala

325 330 335

Leu Asp Ala Gly Glu Lys Arg Ala Tyr Asp Phe Arg Ser Ala Val Phe

340 345 350

Arg Asp Gly Lys Asp Gly Asp Glu Gly Ala Leu Val Val Met Arg Gln

355 360 365

Lys Ile Gly Ser Asp Gln Ala Leu Val Phe Lys Pro Ala Ala Gln Gly

370 375 380

Met Gly His Gly His Phe Asp Lys Leu Ser Trp Gln Phe Tyr Asp His

385 390 395 400

Gly Ser Glu Ile Val Thr Asp Tyr Gly Ser Ala Arg Phe Leu Asn Val

405 410 415

Glu Ala Lys His Gly Gly Arg Tyr Leu Pro Glu Asn Glu Thr Tyr Ala

420 425 430

Lys Gln Thr Val Ala His Asn Thr Val Val Ile Asp Glu Thr Ser His

435 440 445

Phe Asn Ser Asp Leu Lys Ile Gly Asn Ser Asn His Pro Glu Leu Leu

450 455 460

Phe Phe His Ala Asp Asp Gln Ile Lys Ile Ser Ser Ala Ser Ile Asp

465 470 475 480

Ser Ala Tyr Pro Gly Val Thr Leu Thr Arg Thr Met Ala Leu Val Asn

485 490 495

Asp Thr Asp Ser Ser Ser Thr Phe Val Ile Asp Leu Phe Asp Val Gln

500 505 510

Ala Asn Asn Asn Arg Arg Leu Asp Leu Pro Leu His Tyr Asn Gly Gln

515 520 525

Leu Val Asp Thr Asn Phe Lys Leu His Ser Tyr Thr Asp Arg Ile Ser

530 535 540

Ala Leu Gly Lys Asn Asn Gly Tyr Gln His Leu Trp Leu Lys Ala Arg

545 550 555 560

Gly Lys Pro Asp Ala Gly Leu Ala Gln Ile Thr Trp Leu Asn Asp Asn

565 570 575

Gly Arg Phe Tyr Thr His Ser Thr Ile Ala Asp Gly Arg Thr Glu Leu

580 585 590

Leu Phe Thr Glu Leu Gly Ala Asn Asp Pro Glu Phe Asn Leu Arg Ser

595 600 605

Glu Lys Ala Phe Ile Ala Arg His Asp Lys Thr Asn Ala His Thr Phe

610 615 620

Val Ser Val Leu Glu Pro His Gly Glu Tyr Asn Pro Ser Arg Glu Phe

625 630 635 640

Thr Leu Glu Ala Glu Ser Arg Val

645

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> P1

<400> 4

ccaagcttgc cacgcaccct aatcttgtga tc 32

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> P2

<400> 5

cgggatccat aactcggctt tccgcctcaa gg 32

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> P3

<400> 6

ctccctaggg ccacgcaccc taatcttgtg atc 33

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> P4

<400> 7

gttgcggccg cataactcgg ctttccgcct caagg 35

Claims

1.一种褐藻胶裂解酶，其特征在于：所述褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种褐藻胶裂解酶基因，其特征在于：所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种包含权利要求2所述的褐藻胶裂解酶基因的重组载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组大肠杆菌质粒pET28a(+)-Alginate lyase或重组酵母质粒pPIC9k-Alginate lyase。

5.一种包含权利要求2所述褐藻胶裂解酶基因的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于：所述细胞是包含褐藻胶裂解酶基因或用重组载体转化的大肠杆菌或包含褐藻胶裂解酶基因或用所述重组载体转化的毕赤酵母。

7.一种如权利要求3所述重组载体的制备方法，其特征在于：将权利要求2所述基因序列连接至pET28a(+)载体，得到大肠重组表达载体pET28a(+)-Alginate lyase，或将权利要求2所述基因序列连接至载体pPIC9k上，得到酵母重组表达载体pPIC9k-Alginate lyase。

8.一种褐藻胶裂解酶的制备方法，其特征在于：培养如权利要求5所述的宿主细胞，诱导褐藻胶裂解酶基因表达，收获表达产物，经纯化得到褐藻胶裂解酶纯酶形式的目的蛋白。

9.如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶用于降解海藻酸钠产生低聚糖。