CN113817763B

CN113817763B - β-半乳糖苷酶家族基因定向进化方法、突变体及其应用

Info

Publication number: CN113817763B
Application number: CN202111249832.3A
Authority: CN
Inventors: 孙晶晶; 郝建华; 王伟
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2021-10-26
Filing date: 2021-10-26
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2041-10-26
Also published as: CN113817763A

Abstract

本发明涉及一种β‑半乳糖苷酶家族基因定向进化方法、突变体及其及应用，属于生物技术领域。所述家族基因定向进化方法是对GH2家族的四种β‑半乳糖苷酶进行基因片段重排，获得β‑半乳糖苷酶突变体，筛选得到具有优良的酶学特性β‑半乳糖苷酶突变体，所述突变体具有较强的专一性，只水解β‑D‑半乳糖苷键，能够以乳糖为底物，生成低聚半乳糖产物。

Description

β-半乳糖苷酶家族基因定向进化方法、突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，本发明涉及一种β-半乳糖苷酶家族基因定向进化方法、突变体及其应用。

背景技术

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)又称乳糖酶，能水解β-半乳糖苷中的非还原末端β-半乳糖苷残基，也具有转糖基活性，能以乳糖或其水解产物半乳糖和葡萄糖为糖基受体，合成半乳糖苷键，生成功能性低聚糖，是一种在食品工业中广泛应用的酶。β-半乳糖苷酶主要用于牛奶及其副产品中乳糖的水解，生产无乳糖牛奶，为乳糖不耐人群提供合适的奶源。而具有转糖基活性也使其应用于低聚半乳糖的生产中，低聚半乳糖是一种功能性食品，能被人体肠道中八大有益菌所利用，利于肠道健康，同时也是母乳的重要成分，因此成为婴儿奶粉中重要的添加剂。

尽管发现了多种天然来源的β-半乳糖苷酶，但在实际应用中，往往因为各种限制，仅有几种商业化的酶得到开发，例如诺维信公司的Lactozym和DSM公司的因此，寻找新型性能优良的β-半乳糖苷酶，在食品工业有着重要的意义。天然来源的酶往往不能满足生产需要，酶的体外定向进化技术的出现拓展了酶的应用范围。基因家族改组最早由Crameri等人提出的一种定向进化方法，是将四种同源性在58％到82％之间的头孢菌素酶基因进行了DNA改组，对四种基因进行家族基因改组后，突变体抗性提高270-540倍。简并寡核苷酸基因改组法(degenerate oligonucleotide gene shuffling，DOGS)是一种基于家族基因改组的定向进化方法，其原理是通过简并寡核苷酸引物将多个同源的家族基因片段化，再重组成全长的基因，完成基因家族改组过程，是有控制的基因改组方法，避免了核酸内切酶的随机片段化，并允许对选定的基因片段进行随机突变。

本发明通过基于简并寡核苷酸基因改组的家族基因定向进化方法，实现了GH2家族β-半乳糖苷酶基因的定向进化，通过筛选获得了β-半乳糖苷酶突变体。β-半乳糖苷酶突变体具有转糖基活性，在低聚半乳糖的生产中具有较高的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种β-半乳糖苷酶家族基因定向进化方法、突变体及其应用，所述的定向进化方法应用于β-半乳糖苷酶基因的突变体筛选，获得的一种β-半乳糖苷酶突变体，其基因序列为四种GH2家族β-半乳糖苷酶基因的嵌合体，具有优良的酶学特性，可应用于低聚半乳糖的生产中。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

本发明提供了一种β-半乳糖苷酶家族基因定向进化方法，步骤如下：

(1)将四种GH2家族β-半乳糖苷酶基因构建到表达载体pet-24a上，作为步骤(2)PCR扩增的模板，所述四种GH2家族β-半乳糖苷酶核苷酸序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、Genbank No.MH925305、Genbank No.MH925304所示；

(2)根据四种β-半乳糖苷酶基因的共同保守区设计简并寡核苷酸引物，共分成14个基因片段，将步骤(1)构建的质粒等比例混合作为模板，对14个基因片段分别进行了PCR扩增，PCR产物经电泳后回收；

进一步，所述14个基因片段的每个基因片段长度在200-300bp之间，相邻基因片段之间有26-31bp的重叠区域。

(3)构建β-半乳糖苷酶突变体基因文库；将回收后的14个基因片段等比例混合，加入高保真酶PrimerSTAR进行无引物PCR(基因片段组装)，共45个循环，取2μL产物加入到50μL有引物PCR体系中，再进行25个循环反应，PCR产物经电泳后回收；

(4)构建β-半乳糖苷酶突变体基因表达文库；将β-半乳糖苷酶突变体基因文库通过无缝克隆技术(In-Fusion)法连接到pMD19载体上，构建β-半乳糖苷酶突变体基因表达文库；将带有β-半乳糖苷酶突变体基因表达文库的载体转化到大肠杆菌DH5α中，在含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和氨苄霉素的LB平板上，挑选蓝色克隆进行下一步筛选；

(5)筛选β-半乳糖苷酶突变体，获得β-半乳糖苷酶活性菌株；将具有β-半乳糖苷酶活性的菌株进行DNA测序，获得β-半乳糖苷酶突变体基因序列。

本发明提供了一种编码β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，所述核苷酸序列来源于上述定向进化方法获得的突变体序列。

一种上述核苷酸序列编码的β-半乳糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。

一种重组表达载体，它包含了SEQ ID No:3所示核苷酸序列；重组表达载体为pET-galm。

一种重组菌，它包含了SEQ ID No:3所示核苷酸序列，所述的菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

利用上述β-半乳糖苷酶的核苷酸序列制备重组β-半乳糖苷酶的方法，步骤如下：

(1)将来自β-半乳糖苷酶核苷酸序列SEQ ID No:3克隆到大肠杆菌表达载体pET-24a中，构建重组表达载体pET-galm，将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，用卡那霉素抗性筛选出含β-半乳糖苷酶基因的重组菌株；

(2)将步骤(1)筛选出的菌株接种于LB液体培养基中，37℃培养10-12小时，获得种子液；将种子液以体积比1％-2％的量接种于LB液体培养基中，待生长到OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度0.1-1mmol/L的IPTG诱导，诱导温度为16-37℃，诱导时间为3-16小时；

(3)收集步骤(2)诱导后获得的菌体，超声破碎后，使用亲和层析柱对重组β-半乳糖苷酶进行纯化，获得电泳纯的重组β-半乳糖苷酶。

本发明还提供上述重组β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖生产中的应用。

上述重组β-半乳糖苷酶具有如下酶学性质:

(1)重组β-半乳糖苷酶的最适作用温度为35℃；

(2)重组β-半乳糖苷酶的K_m值分别为0.9mM，V_max为12U/mg。重组β-半乳糖苷酶的催化水解反应活性较野生型降低，但是底物亲和力更高。

(3)重组β-半乳糖苷酶具有较强的底物专一性，只水解β-D-半乳糖苷键，对测试的其他糖苷类底物和α糖苷键底物无活性。

本发明所述重组β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖生产中的应用是指：

重组β-半乳糖苷酶对乳糖底物有转糖基活性，生成低聚半乳糖产物，半乳糖等单糖的加入能提高转糖基活性，在低聚半乳糖的生产中具有较高的应用前景。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明提供一种β-半乳糖苷酶家族基因定向进化方法，是有控制的基因改组方法，与传统定向进化方法相比，能更好的积累有益突变，为优良特性的β-半乳糖苷酶的筛选提供了可行的方案。本发明提供的编码β-半乳糖苷酶的基因，是利用该方法获得的有益突变体，在低聚半乳糖的生产具有广阔的应用前景。

附图说明

图1、β-半乳糖苷酶基因片段PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；M，DNA分子量标准；1-14，β-半乳糖苷酶基因片段PCR产物；

图2、β-半乳糖苷酶家族基因改组的琼脂糖凝胶电泳图；M，DNA分子量标准；1，无引物PCR重组产物；2，有引物PCR产物；

图3、β-半乳糖苷酶突变体的SDS-PAGE电泳图；1，蛋白分子量标准；2，亲和层析纯化后的β-半乳糖苷酶突变体；

图4、反应温度对β-半乳糖苷酶突变体的影响；

图5、β-半乳糖苷酶突变体的转糖基活性的薄层色谱分析结果。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1四种β-半乳糖苷酶基因重组载体的构建

以SEQ ID No:1(1)、SEQ ID No:2(2)、Genbank No.MH925305(3)、GenbankNo.MH925304(4)所示核苷酸序列作为模板设计引物进行基因调取，引物序列如表1所示。PCR扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定后，连接到pMD19T载体，进行克隆测序。测序结果表明，与预期序列相同，随后将PCR产物与pET-24a分别用相应的限制性内切酶进行切割。酶切产物切胶回收后，通过T4 DNA Ligase进行连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，挑取单克隆进行测序。测序结果表明，成功构建四种β-半乳糖苷酶基因的重组载体。

表1重组载体构建所需引物列表

实施例2简并寡核苷酸引物扩增β-半乳糖苷酶基因

根据四种β-半乳糖苷酶基因的共同保守区设计简并寡核苷酸引物，全长基因共分成14个基因片段，相邻基因片段之间有26-31bp的重叠区域，每个片段长度在200-300bp之间，引物序列如表2所示。由于普通Taq酶的PCR产物在末端有一个多余的A尾，在下一步无引物PCR组装过程中容易导致基因序列移码突变，因此选择了高保真酶PrimerSTAR(Takara)进行扩增。实施例1中构建的四种β-半乳糖苷酶基因的重组载体等比例混合作为模板，对14个基因片段分别进行了PCR扩增，实验结果如图1所示，PCR产物大小与预期相符，将基因片段分别回收，用于基因改组实验。

表2简并寡核苷酸引物序列

实施例3β-半乳糖苷酶的家族基因重组

将实施例2中获得的14个基因片段等比例混合，加入高保真酶PrimerSTAR进行无引物PCR(基因片段互为引物组装)，共45个循环，取2μL产物加入到50μL有引物PCR体系中，引物为LF(ATTTCACACAGGAAACAGCTATGSHWAMTGTKGCKSARGT)和LR(CCCGGGGATCCTCTAGAGATTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT)，再进行25个循环，实验结果如图2所示。将PCR产物连接到T载体，挑取10个克隆进行测序，测序结果表明，成功的形成了β-半乳糖苷酶基因嵌合体，可以用于表达文库的构建。

实施例4构建β-半乳糖苷酶基因表达文库

以pMD19做为表达载体，构建β-半乳糖苷酶表达文库。pMD19载体转化效率高，而且带有乳糖操纵子，能在IPTG诱导下表达目的蛋白。pMD19能表达大肠杆菌β-半乳糖苷酶的α肽，转化到表达α肽缺失型β-半乳糖苷酶的大肠杆菌中，两种β-半乳糖苷酶片段产生α-互补，表现出β-半乳糖苷酶活性。因此，为了防止大肠杆菌自身β-半乳糖苷酶的干扰，在引物设计时，去除了pMD19的α肽序列，选择了α肽缺失型β-半乳糖苷酶的大肠杆菌DH5α作为表达菌株。将pMD19通过PCR的方式线性化，正向序列为ACCACCACCACCACCACTGAATCTCTAGAGGATCCCCGGG，反向引物为ACYTSMGCMACAKTWDSCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAAT，划线部分为与基因文库同源的基因序列。随后将线性化载体和实施例3中的基因重组产物通过In-Fusion酶作用，反应条件为50℃作用15min，将产物转化到大肠杆菌DH5α中，转化产物涂布到含有氨苄霉素，IPTG和X-gal的LB平板上，在37℃培养箱内培养至克隆可见，转入25℃室温培养，构建β-半乳糖苷酶基因表达文库。

实施例5β-半乳糖苷酶基因表达文库的筛选

挑取平板上的蓝色克隆在氨苄霉素，IPTG和X-gal的LB平板划线，纯化菌株。共获得320株β-半乳糖苷酶活性菌株。将筛选出的菌株，挑取到LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，取2％接种到新的LB培养基中，培养到OD值1左右，加入终浓度为1mM IPTG诱导，16℃、200rpm培养20h。离心收集菌体，加入细胞裂解液将菌体裂解，离心收集上清液。以邻硝基酚-β半乳糖苷(oNPG)为底物，测定上清液40℃条件下的酶活。结果表明，87％的菌株具有β-半乳糖苷酶活性。挑取单克隆进行测序，分析测序结果，获得β-半乳糖苷酶突变体序列。

实施例6β-半乳糖苷酶突变体的表达和纯化

β-半乳糖苷酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，编码的氨基酸序列如SEQID No:4所示。将β-半乳糖苷酶突变体基因构建到表达载体pet-24a上，限制性内切酶酶切位点分别为EcoR I和Xho I，质粒命名为pet-galm。

将述pet-galm重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得β-半乳糖苷酶的基因工程菌株。将菌株接种到LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃、200rpm过夜培养，获得种子液。将种子液以体积比1％-2％的量接种于LB液体培养基中，待生长到OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度0.1-1mmol/L的IPTG诱导，诱导温度为16-37℃，诱导时间为3-16小时。在4℃，8500rpm条件下离心10min收集菌体，菌体用50mM磷酸盐缓冲液(pH 7)重悬。超声破碎细胞，细胞破碎液在4℃，10000rpm条件下离心10min，获得的上清液即为粗酶液。粗酶液经过0.22μm滤膜过滤后，通过亲和层析柱Ni-NTA Agarose进行纯化，用含20-250mM咪唑的磷酸盐缓冲液(pH 7)梯度洗脱，获得纯的重组β-半乳糖苷酶。蛋白纯度通过12％SDS-PAGE进行检测，电泳胶用考马斯亮蓝进行染色，实验结果如图3所示。通过BCA法测定蛋白浓度，以BSA为标准蛋白。

实施例7β-半乳糖苷酶突变体的酶学性质

将底物oNPG溶解在pH 7的磷酸盐缓冲液中，与适量的酶在温度范围4-50℃作用5分钟，其中oNPG的终浓度为4mM，反应结束后，加入等体积的1M碳酸钠溶液终止反应，测定反应液在420nm的吸光度，根据邻硝基酚的标准曲线，计算β-半乳糖苷酶的活性。β-半乳糖苷酶突变体酶活与温度的关系如图4所示，β-半乳糖苷酶突变体的最适反应温度为35℃。

测定了β-半乳糖苷酶突变体对八种化学底物的催化活性，其相对活性如表3所示。β-半乳糖苷酶突变体具有较强的专一性，只水解β-D-半乳糖苷键，对测试的其他糖苷类底物和α糖苷键底物无活性。

表3β-半乳糖苷酶突变体的底物特异性

β-半乳糖苷酶突变体的动力学参数如表4所示。测定缓冲液为50mM的磷酸盐缓冲液(pH 7)，其中底物浓度范围为0.1-50mM，测定温度为35℃，通过Lineweaver-Burk方法计算了K_m，V_max，k_cat和k_cat/K_m等动力学参数。β-半乳糖苷酶突变体催化反应活性与野生型相比有所降低，但底物亲和力提高。

表4β-半乳糖苷酶突变体的动力学参数

实施例8β-半乳糖苷酶突变体的转糖基活性

反应体系为5％乳糖、0.2mg/mLβ-半乳糖苷酶突变体、50mM磷酸盐缓冲液(pH 7)；在反应体系中分别加入终浓度为20％半乳糖、20％葡萄糖或20％果糖。在30℃，转速200rpm的恒温摇床中反应8小时，分别在4小时、8小时取出反应液，加热灭活后，通过薄层色谱法检测反应产物，实验结果如图5所示。β-半乳糖苷酶突变体与乳糖作用8小时后，产物为葡萄糖、半乳糖、低聚半乳糖；在额外加入单糖的反应体系中，反应产物中低聚糖增加，其中加入半乳糖的反应体系中转糖基产物最多。β-半乳糖苷酶突变体对乳糖底物具有转糖基活性，生成低聚半乳糖产物，具有较高的应用前景。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> β-半乳糖苷酶家族基因定向进化方法、突变体及其应用

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3120

<212> DNA

<213> β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)

<400> 1

atgcttaatg ttgcgcaagt agtggctcag aatgattggc aaaaccccgt ggtgtttcag 60

cgaaatcgaa tcaatgctca cagtcctcat catggtttta cttcgttaga gaatgcgctg 120

cacaatatca aaacacgcac gtgcagcctt aatggtcaat gggattttcg gttatttgat 180

gcgcctgaga gcgtccccga aagtttactt tctacaacat tgagcgctga agaaggtagc 240

ctttggcagc ccatcgttgt tccttcaaat tggcagctgc aagggtatga caagcctatt 300

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<210> 2

<211> 3120

<212> DNA

<213> β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)

<400> 2

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tgtataaacg gtctgttatt tccagacaga acgccacatc cgcacttatt agaagctaaa 1860

tattgtcagc agcacttaag cttttcgttg gttgagaaag acaacaagtt tgagcttaca 1920

gtaagcagcg attacttatt tagacgcaca gacaacgagt tattacgttg gcaagtgtta 1980

gaaaatggac aaccgattgc tgaggcgaag ggcgaatgcg aaatcgacat agcgccacaa 2040

caagcacaaa cgctcagtct tagcccagat attacgttta aagcaggcgc tgagtaccac 2100

ttaaatattg atgtggtact agcgaatgac tgctcgtggg ctaaagcagg gcatgttatg 2160

gacaccgccc agttagcgct agtcaacaag cgtggaatag tatcgttttc tcttaatgat 2220

aacgaaacaa caagcggcac tagtgagcta tcaattgaag ctcaggatgg gatgttgctg 2280

gtacatgcgc aaaataacgt atttagcttt aatagtgaga gcgggctatt aacctcgtgg 2340

cttcaaggcg cggaggaaac acttagcgcg ccgctagaag ataacttttt cagagcgccg 2400

ctagataacg acattggggt aagcgaagtt gataatccag acccaaatgc gtgggagtct 2460

cgctggcgtc gtgctggaat tggcaagtgg acacgcactt gcacgggcgt aaacgtagag 2520

cagggcgcgc aagacgtgcg tataacatcg ttgtttgatt atcaccattc agaaaagctg 2580

gtagcggcaa caaagtgggt ttacaccata aatgcacagg ctaagctatc ggtagacgtt 2640

gaagtgctct tggatgacgg tttaccacct atgccgcgaa ttggtataca aacggcagtg 2700

cctgtagccg ataagccaac gtcgattacc tgggaaggac tagggccatt tgagaactat 2760

cctgacagaa aagcggcagc gcgttatggt cgctacacct tacctataaa agagatgcaa 2820

acgtgctaca tattcccaac ggacaacggc ttgcgctgtg gctgtacaca acttgaagtt 2880

agcggcctga aagcaaaagg acagttctat tttaacgtga gcgaatatgg gcaagcacag 2940

ctagacgagg caaaacacac ctgtgattta acacctcaag attgtgtgtt tgtgtacatt 3000

gatcatgctc acatgggcgt aggcggcgat gattcatgga gcccaagtac acataaagca 3060

ttcttgttgg aagagaagca ataccgctac tcagtttgct ttagcgccgc tgacagctaa 3120

<210> 3

<211> 3201

<212> DNA

<213> β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)

<400> 3

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcat ggtttggctg 60

agggtggttg ctcaacaaga ttggcaaaac cccgtggtat atcagcgtaa tcgagtaaat 120

ggtcatgcgc cgctcaatgg ctatacatgc cttgacgatg cattgaacaa aagcggcgct 180

cagaaacgca agctcaatgg tgattggcag tttaggttat tcaactcacc tttcgacgtg 240

ccagataatg ccattgctgc acacttaccc gccaaagaag aagctcgttg gcaacctatc 300

tccgtacctt caaattggca actgcagggg ttcgataagc ccatttattg caacgtaaag 360

tatccttttg aggttaaccc accgcaggtg ccacaagaca atcccacagg ggtttaccgc 420

actgaatttg aaatgactaa agccatgctt ttgcaacgca atcatattgt ctttgacggc 480

gtaaatagcg cgtttcactt gtggtgtaac caatcatacg tgggatattc ccaagatagc 540

cgtctgcccg ctgagtttga cttatgcccc ttcttaaaag aggggaaaaa ccagattaca 600

gccatggtta tccgttggtc tgatggtagc taccttgaag atcaggacat gtggtggtta 660

agcggtattt tccgtgatgt ttatttggca agtaagccgc agcattacat tcaagacgta 720

tttgctaccc cttcattaga tgcttgttac cgcgatggtc gcctcgatat tagaacctcc 780

attgtcgccc ctaaggattt caaagtggcc gtgcagcttt ttgatggcac gactgccgtt 840

actcagccgc aggtggcaaa caccaataat cgccgtattg atgaaaaagg cggatgggat 900

gatgtggttt tccaatcact acacctaaat agccccaaaa aatggacagc agaaacgccg 960

aatttgtaca ggctggtggt aagcctatta gacagaagcg acagccttgt ggatatggaa 1020

gcctatgatg ttggctttag acacattgag atgattaaag gccagctttg cgttaacggt 1080

gagcccgtat taattcgcgg ggtgaaccgt catgaacacc atgaaagtcg agggcatgca 1140

gtcaatgaag ctgacatgct agaagacatc aagctgctta aacagaataa cttcaacgca 1200

gtgcgcaccg cccattaccc taatcatcct cggtggtatg aactgtgtga tgaatacggc 1260

ttatatgtgg ttgatgaggc gaatatagag acccacggca tgtttcctat gggaaggctt 1320

tctcgcgacc cgctctgggc cggcgcttac atggcgcgct ttacgcaaat ggtcgagcga 1380

gacaaaaacc accccagcat cattatttgg tcgttaggga atgagtctgg tcacggtcct 1440

acccacgatg caatgtatgg ctgggcaaag tcatttgacc catcgcgccc tgtacagtac 1500

gaaggcggcg gcgctgatgc ttcggccact gatatcatcg cgccaatgta tgctcgggta 1560

gataccgatg tgctcgatga cgccgtgcct aaatgggcaa ttaaaaagtg gttatcgtta 1620

cctggtgaaa cccgccctgt tattttgtgt gagtacgccc atgccatggg gaatagttta 1680

gggagctttg cggactactg gcaggcattt aaagactatc cccgtttaca aggtggcttt 1740

atttgggact gggttgatca agggctagcg aaatacacag acagtggcga aaagtattgg 1800

gcttacggcg gtgattttgg tgataccgac aatgatagac agttttgtat caatgggttg 1860

ctattcccgg atagaagcgc tcacccagcc ctctatgaag cgaaacactg ccaacagcac 1920

cttcagtttt cgttaacgga agataacggt acattcgaac tgacagtggc cagcgattac 1980

ctgtttagaa ccacggataa tgaaacgtta gtgtggcaac ttttggaaga cggctgttgc 2040

gttgcacagg ggagcttcgt tattgaggtt aagccacagc agacagcgaa ctataccatt 2100

acacccgcct acacgtataa agcgggcgca cagtatcacc ttaatgttga tacgcaaacg 2160

actaaagcct gcgcgtgggc taacgctggt cacgttatcg atacggccca gtttaggctt 2220

aaaaatactg cggggttagg ggcagcaccc cggccactct gtacccctac taaagcgaac 2280

gacaagggga cgtctgctgt cgtaccatta gcggcaaaaa ttgatgaaca aacgctcacc 2340

gttaatgcac acactagtgt gtttagtctt catcttgaat cgggtcagtt gatttcatgg 2400

ttagttgccg atgaagagca actgagcgca ccgattgaag ataacttttt tagggctccg 2460

ttagacaatg atattggtgt aagtgaagtg gataaccccg accctaatgc gtgggagtca 2520

cgttggcgcc gagctggaat agggcaatgg caacgcaact gtgcaggtgt cgatgtagtt 2580

gtaagcacac aagacgtgcg ggtgacggca ctgtttaact atcattacga taatgcctta 2640

gtggcatcaa caagctggtg ttaccgcgtg aatgctacag gcacattaga cttagatgtt 2700

caggttaagt tagacgatag tttacctccg atgccgcgta ttggtttgca gtgggccgtg 2760

cctcgttcaa gtcaggctga agcaaagatt cagtggaagg ggttaggccc atttgagaac 2820

taccccgacc ggttagcagc ggctagattt gggagttaca gtgaaagtat tgcctgcatg 2880

catacgcctt acatctttcc taccgacaac gggcttcgta gtaattgccg agaacttagc 2940

attaacgcta taaaagtagc gggtgatttt cactttgctg taagcccgta cgggcaaaag 3000

cagcttgacg aagcgaaaca cacctgtgat ttatccccgc aagattgcat ctttgtttat 3060

atcgaccatg cacatatggg agttggagga gatgactcat ggagcccaag tacgcacaaa 3120

gctttcctgt tagaggaaaa aatgtaccgg tattcattcc tttttgaagc aatactcgag 3180

caccaccacc accaccactg a 3201

<210> 4

<211> 1066

<212> PRT

<213> β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)

<400> 4

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Phe

1 5 10 15

Met Val Trp Leu Arg Val Val Ala Gln Gln Asp Trp Gln Asn Pro Val

20 25 30

Val Tyr Gln Arg Asn Arg Val Asn Gly His Ala Pro Leu Asn Gly Tyr

35 40 45

Thr Cys Leu Asp Asp Ala Leu Asn Lys Ser Gly Ala Gln Lys Arg Lys

50 55 60

Leu Asn Gly Asp Trp Gln Phe Arg Leu Phe Asn Ser Pro Phe Asp Val

65 70 75 80

Pro Asp Asn Ala Ile Ala Ala His Leu Pro Ala Lys Glu Glu Ala Arg

85 90 95

Trp Gln Pro Ile Ser Val Pro Ser Asn Trp Gln Leu Gln Gly Phe Asp

100 105 110

Lys Pro Ile Tyr Cys Asn Val Lys Tyr Pro Phe Glu Val Asn Pro Pro

115 120 125

Gln Val Pro Gln Asp Asn Pro Thr Gly Val Tyr Arg Thr Glu Phe Glu

130 135 140

Met Thr Lys Ala Met Leu Leu Gln Arg Asn His Ile Val Phe Asp Gly

145 150 155 160

Val Asn Ser Ala Phe His Leu Trp Cys Asn Gln Ser Tyr Val Gly Tyr

165 170 175

Ser Gln Asp Ser Arg Leu Pro Ala Glu Phe Asp Leu Cys Pro Phe Leu

180 185 190

Lys Glu Gly Lys Asn Gln Ile Thr Ala Met Val Ile Arg Trp Ser Asp

195 200 205

Gly Ser Tyr Leu Glu Asp Gln Asp Met Trp Trp Leu Ser Gly Ile Phe

210 215 220

Arg Asp Val Tyr Leu Ala Ser Lys Pro Gln His Tyr Ile Gln Asp Val

225 230 235 240

Phe Ala Thr Pro Ser Leu Asp Ala Cys Tyr Arg Asp Gly Arg Leu Asp

245 250 255

Ile Arg Thr Ser Ile Val Ala Pro Lys Asp Phe Lys Val Ala Val Gln

260 265 270

Leu Phe Asp Gly Thr Thr Ala Val Thr Gln Pro Gln Val Ala Asn Thr

275 280 285

Asn Asn Arg Arg Ile Asp Glu Lys Gly Gly Trp Asp Asp Val Val Phe

290 295 300

Gln Ser Leu His Leu Asn Ser Pro Lys Lys Trp Thr Ala Glu Thr Pro

305 310 315 320

Asn Leu Tyr Arg Leu Val Val Ser Leu Leu Asp Arg Ser Asp Ser Leu

325 330 335

Val Asp Met Glu Ala Tyr Asp Val Gly Phe Arg His Ile Glu Met Ile

340 345 350

Lys Gly Gln Leu Cys Val Asn Gly Glu Pro Val Leu Ile Arg Gly Val

355 360 365

Asn Arg His Glu His His Glu Ser Arg Gly His Ala Val Asn Glu Ala

370 375 380

Asp Met Leu Glu Asp Ile Lys Leu Leu Lys Gln Asn Asn Phe Asn Ala

385 390 395 400

Val Arg Thr Ala His Tyr Pro Asn His Pro Arg Trp Tyr Glu Leu Cys

405 410 415

Asp Glu Tyr Gly Leu Tyr Val Val Asp Glu Ala Asn Ile Glu Thr His

420 425 430

Gly Met Phe Pro Met Gly Arg Leu Ser Arg Asp Pro Leu Trp Ala Gly

435 440 445

Ala Tyr Met Ala Arg Phe Thr Gln Met Val Glu Arg Asp Lys Asn His

450 455 460

Pro Ser Ile Ile Ile Trp Ser Leu Gly Asn Glu Ser Gly His Gly Pro

465 470 475 480

Thr His Asp Ala Met Tyr Gly Trp Ala Lys Ser Phe Asp Pro Ser Arg

485 490 495

Pro Val Gln Tyr Glu Gly Gly Gly Ala Asp Ala Ser Ala Thr Asp Ile

500 505 510

Ile Ala Pro Met Tyr Ala Arg Val Asp Thr Asp Val Leu Asp Asp Ala

515 520 525

Val Pro Lys Trp Ala Ile Lys Lys Trp Leu Ser Leu Pro Gly Glu Thr

530 535 540

Arg Pro Val Ile Leu Cys Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser Leu

545 550 555 560

Gly Ser Phe Ala Asp Tyr Trp Gln Ala Phe Lys Asp Tyr Pro Arg Leu

565 570 575

Gln Gly Gly Phe Ile Trp Asp Trp Val Asp Gln Gly Leu Ala Lys Tyr

580 585 590

Thr Asp Ser Gly Glu Lys Tyr Trp Ala Tyr Gly Gly Asp Phe Gly Asp

595 600 605

Thr Asp Asn Asp Arg Gln Phe Cys Ile Asn Gly Leu Leu Phe Pro Asp

610 615 620

Arg Ser Ala His Pro Ala Leu Tyr Glu Ala Lys His Cys Gln Gln His

625 630 635 640

Leu Gln Phe Ser Leu Thr Glu Asp Asn Gly Thr Phe Glu Leu Thr Val

645 650 655

Ala Ser Asp Tyr Leu Phe Arg Thr Thr Asp Asn Glu Thr Leu Val Trp

660 665 670

Gln Leu Leu Glu Asp Gly Cys Cys Val Ala Gln Gly Ser Phe Val Ile

675 680 685

Glu Val Lys Pro Gln Gln Thr Ala Asn Tyr Thr Ile Thr Pro Ala Tyr

690 695 700

Thr Tyr Lys Ala Gly Ala Gln Tyr His Leu Asn Val Asp Thr Gln Thr

705 710 715 720

Thr Lys Ala Cys Ala Trp Ala Asn Ala Gly His Val Ile Asp Thr Ala

725 730 735

Gln Phe Arg Leu Lys Asn Thr Ala Gly Leu Gly Ala Ala Pro Arg Pro

740 745 750

Leu Cys Thr Pro Thr Lys Ala Asn Asp Lys Gly Thr Ser Ala Val Val

755 760 765

Pro Leu Ala Ala Lys Ile Asp Glu Gln Thr Leu Thr Val Asn Ala His

770 775 780

Thr Ser Val Phe Ser Leu His Leu Glu Ser Gly Gln Leu Ile Ser Trp

785 790 795 800

Leu Val Ala Asp Glu Glu Gln Leu Ser Ala Pro Ile Glu Asp Asn Phe

805 810 815

Phe Arg Ala Pro Leu Asp Asn Asp Ile Gly Val Ser Glu Val Asp Asn

820 825 830

Pro Asp Pro Asn Ala Trp Glu Ser Arg Trp Arg Arg Ala Gly Ile Gly

835 840 845

Gln Trp Gln Arg Asn Cys Ala Gly Val Asp Val Val Val Ser Thr Gln

850 855 860

Asp Val Arg Val Thr Ala Leu Phe Asn Tyr His Tyr Asp Asn Ala Leu

865 870 875 880

Val Ala Ser Thr Ser Trp Cys Tyr Arg Val Asn Ala Thr Gly Thr Leu

885 890 895

Asp Leu Asp Val Gln Val Lys Leu Asp Asp Ser Leu Pro Pro Met Pro

900 905 910

Arg Ile Gly Leu Gln Trp Ala Val Pro Arg Ser Ser Gln Ala Glu Ala

915 920 925

Lys Ile Gln Trp Lys Gly Leu Gly Pro Phe Glu Asn Tyr Pro Asp Arg

930 935 940

Leu Ala Ala Ala Arg Phe Gly Ser Tyr Ser Glu Ser Ile Ala Cys Met

945 950 955 960

His Thr Pro Tyr Ile Phe Pro Thr Asp Asn Gly Leu Arg Ser Asn Cys

965 970 975

Arg Glu Leu Ser Ile Asn Ala Ile Lys Val Ala Gly Asp Phe His Phe

980 985 990

Ala Val Ser Pro Tyr Gly Gln Lys Gln Leu Asp Glu Ala Lys His Thr

995 1000 1005

Cys Asp Leu Ser Pro Gln Asp Cys Ile Phe Val Tyr Ile Asp His Ala

1010 1015 1020

His Met Gly Val Gly Gly Asp Asp Ser Trp Ser Pro Ser Thr His Lys

1025 1030 1035 1040

Ala Phe Leu Leu Glu Glu Lys Met Tyr Arg Tyr Ser Phe Leu Phe Glu

1045 1050 1055

Ala Ile Leu Glu His His His His His His

1060 1065

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgggatccat gcttaatgtt gcg 23

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgctcgagt attgcttcaa aaagga 26

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgggatccat gcttaatgtt gcgc 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgctcgagg ctgtcagcgg cgct 24

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgggatccat ggcaaatgtt gctcaa 26

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccgctcgagg caattttcag cact 24

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cggaattcat gcatactgtg gctga 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccgctcgagg gctacagggc aaa 23

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgshwamtg tkgcksargt dgtkgcyca 29

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccytgcakyt gccarttwga wgghac 26

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtdccwtcwa aytggcarmt gcargg 26

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tcagcvggya rwcgrctrtc ttgvgaata 29

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tattcbcaag ayagycgwyt rccbgctga 29

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggbgtrrcaa ayacrtcttg aatrtrrtg 29

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cayyayattc aagaygtrtt tgyyacvcc 29

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttgraawayy acatcrtccc ahccgcc 27

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggcggdtggg aygatgtrrt wttycaa 27

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgrtgytcrt ghckrtthac vccrcgaat 29

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

attcgyggbg tdaaymgdca ygarcayca 29

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ccatdggrwa catrccgtgg gtytcdat 28

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

athgaraccc acggyatgtw ycchatgg 28

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gcrtacatwg gsgcratrat rtcdgtdgc 29

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gchachgaya tyatygcscc watgtaygc 29

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tcracccart cccadatraa rccrccttg 29

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

caaggyggyt tyathtggga ytgggtyga 29

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ttrtcbgtks dbckraayav rtartcrct 29

<210> 31

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

agygaytayb trttymgvhs macvgayaa 29

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

acrtgmcchg cdkyhgccca mkmrcag 27

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ctgykmktgg gcdrmhgcdg gkcaygt 27

<210> 34

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tcyarygghg cyctraaraa gttrtcttc 29

<210> 35

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gaagayaact tyttyagrgc dccrytrga 29

<210> 36

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ggcatmggvg gtaadsyrtc rkcyaa 26

<210> 37

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ttrgmygayr shttaccbcc katgcc 26

<210> 38

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

tcrcwrgtrt gttthgchty rtcwagytg 29

<210> 39

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

carctwgayr adgcdaaaca yacywgyga 29

<210> 40

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

tcagtggtgg tggtggtggt gctcgag 27

Claims

1.一种β-半乳糖苷酶家族基因定向进化方法，其特征在于，所述方法步骤如下：

(1)将四种GH2家族β-半乳糖苷酶基因构建到表达载体pet-24a上，作为步骤(2)PCR扩增的模板，所述四种GH2家族β-半乳糖苷酶核苷酸序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、GenbankNo.MH925305、GenbankNo.MH925304所示；

(2)根据四种β-半乳糖苷酶基因的共同保守区设计简并寡核苷酸引物，所述简并寡核苷酸引物如表1所示，共分成14个基因片段，将步骤(1)构建的质粒等比例混合作为模板，对14个基因片段分别进行了PCR扩增，PCR产物经电泳后回收；

(3)构建β-半乳糖苷酶突变体基因文库；将回收后的14个基因片段等比例混合，加入高保真酶PrimerSTAR进行无引物PCR，共45个循环，取2μL产物加入到50μL有引物PCR体系中，所述有引物PCR体系中的引物为LF：ATTTCACACAGGAAACAGCTATGSHWAMTGTKGCKSARG和LR：CCCGGGGATCCTCTAGAGATTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT，再进行25个循环反应，PCR产物经电泳后回收；

(4)构建β-半乳糖苷酶突变体基因表达文库；将β-半乳糖苷酶突变体基因文库通过无缝克隆技术法连接到pMD19载体上，构建β-半乳糖苷酶突变体基因表达文库；将带有β-半乳糖苷酶突变体基因表达文库的载体转化到大肠杆菌DH5α中，在含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷和氨苄霉素的LB平板上，挑选蓝色克隆进行下一步筛选；

(5)筛选β-半乳糖苷酶突变体，获得β-半乳糖苷酶活性菌株；将具有β-半乳糖苷酶活性的菌株进行DNA测序，获得β-半乳糖苷酶突变体基因序列；

表1简并寡核苷酸引物序列

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述14个基因片段的每个基因片段长度在200-300bp之间，相邻基因片段之间有26-31bp的重叠区域。