JP6927467B2 - タガトース生産用組成物及びこれを用いたタガトースの製造方法 - Google Patents
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Description
D−タガトース1,6−ビスリン酸 <=> グリセロンホスフェート+D−グリセルアルデヒド3−リン酸
グルコキナーゼ(glucokinase)、これを発現する微生物または前記微生物の培養物;
タガトース−6−リン酸脱リン酸化酵素、これを発現する微生物または前記微生物の培養物;及び/または
α−アミラーゼ(α−amylase)、プルラナーゼ(pullulanase)、グルコアミラーゼ(glucoamylase)、スクラーゼ(sucrase)またはイソアミラーゼ(isoamylase);前記アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼまたはイソアミラーゼを発現する微生物;または前記アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼまたはイソアミラーゼを発現する微生物の培養物を含まないことを特徴としてもよい。
新規耐熱性の果糖−4−エピマー化酵素を提供するために、Thermanaerothrix daxensis、Kosmotoga oleariaに由来したタガトース−ビスリン酸アルドラーゼの遺伝子情報を確保して、大腸菌発現可能ベクター及び形質転換微生物(形質転換体)を製造した。
組換え酵素を製造するために、前記実施例1−1で製造した形質転換体であるE.coli BL21(DE3)/CJ_TD_F4E、E.coli BL21(DE3)/CJ_KO_F4Eをアンピシリン(ampicillin)が含まれたLB液体培地5mlを含む培養チューブに接種し、600nmで吸光度が2.0になるまで37℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をLBとタンパク質発現調節因子であるラクトースが含有された液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記培養過程中の撹拌速度は180rpmであり、培養温度は37℃が維持されるようした。培養液は8,000rpmで、4℃で20分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体は、50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で2回洗浄し、10mM イミダゾール(imidazole)及び300mM NaClが含まれた50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液に再懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機(sonicator)を用いて破砕し、細胞破砕物は13,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液はHis−taq親和クロマトグラフィーを用いて精製し、20mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を充填剤の10倍の液量で流して非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。最終250mM イミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝液を流して溶出精製し、50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で透析した後、酵素特性解析のための酵素を確保した。
前記実施例1−2から得られた酵素の活性を測定するために、30重量%果糖を用い、ここに50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM CoSO4、前記実施例1−2で分離された20mg/mlの精製酵素を添加して、温度60℃で2時間反応した。果糖−4−エピマー化酵素3種、CJ_TD_F4E、及びCJ_KO_F4Eによって転換されたタガトースの濃度及び果糖からタガトースに転換された転換率を確認した結果、CJ_TD_F4Eの場合、4.6%であり、CJ_KO_F4Eの場合、16.0%であった。前記換算率は次の式で計算された:転換率=タガトース重量/初期果糖重量×100
本出願の酵素のエピマー化活性に対する温度の影響性を調査するために、果糖を含む50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液に、前記実施例1−2で製造した1mg/mlの精製酵素をそれぞれ添加して、50℃〜80℃で3時間反応し、反応終了液はHPLCを用いてタガトースを定量分析した。その結果、本出願の酵素2種はすべて70℃で最大活性を示した(図2)。
本出願に係る新規な耐熱性の果糖−4−エピマー化酵素を発掘するために、Rhodothermus profundi DSM 22212、Rhodothermus marinus ATCC 43812由来のタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子情報を確保して、大腸菌発現可能ベクター及び形質転換微生物を製造した。
前記実施例2−1で製造した形質転換菌株 E. coli BL21(DE3)/CJ_RP_F4E及びE. coli BL21(DE3)/CJ_RM_F4Eから組換え酵素を製造するために、それぞれの形質転換微生物をアンピシリン(ampicillin)抗生剤が含まれたLB液体培地5mLを含む培養チューブに接種し、600nmで吸光度が2.0になるまで37℃振とう培養器で種菌培養を行った。前記種菌培養の結果、得られた培養液をLBとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は、攪拌速度180rpmと37℃の条件で行った。次に、前記培養液を8,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、菌体を回収した。前記回収された菌体を50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で2回洗浄し、10mMイミダゾール(imidazole)と300mM NaClが含まれた50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液に再懸濁した。前記再懸濁された菌体を細胞破砕機(sonicator)を用いて破砕し、13,000 rpmで4℃で20分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をHis−taq親和クロマトグラフィーを用いて精製し、20mMイミダゾール、及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を充填剤の10倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。続いて、250mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を追加で流して溶出精製した後、50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で透析し、酵素特性解析のために精製酵素CJ_RP_F4E及びCJ_RM_F4Eをそれぞれ確保した。
前記実施例2−2で確保した本出願組換え酵素CJ_RP_F4E及びCJ_RM_F4Eの果糖−4−エピマー化活性を測定するために、30重量%果糖に50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM NiSO4及び各20mg/ml CJ_RP_F4E及びCJ_RM_F4Eを添加して、60℃で10時間反応させた。
前記実施例2−2で製造した酵素CJ_RP_F4E及びCJ_RM_F4Eの果糖−4−エピマー化活性に対する温度の影響力を調査するために、10重量%果糖を含む50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液に、各1mg/mlのCJ_RP_F4E及びCJ_RM_F4Eを添加して、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃及び70℃の様々な温度で3時間反応させた。前記反応の完了後、反応物内のタガトースはHPLCを用いて定量分析した。
前記実施例2−2で製造した酵素CJ_RP_F4E及びCJ_RM_F4Eの果糖−4−エピマー化活性の金属イオン別の影響力を確認するために、10重量%果糖を含む50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液に、各1mg/mlのCJ_RP_F4E及びCJ_RM_F4Eと各1mMの様々な金属イオン(ZnSO4、MgCl2、MnCl2、NH4Cl、CaCl2、Na2SO4、CuSO4、MgSO4、MnSO4、(NH4)2SO4、またはNiSO4)を添加して、60℃で5時間反応させた。反応完了後、反応物のタガトースをHPLCを用いて定量分析した。
本発明者らはLimnochorda pilosa DSM 28787由来のタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子情報を確保して、大腸菌発現可能な組換えベクター及び形質転換微生物を製造した。
前記実施例3−1に従って製造した形質転換菌株E.coli BL21(DE3)/CJ_LP_F4E由来のCJ_LP_F4Eから本出願組換え酵素を収得するために、前記それぞれの形質転換微生物をアンピシリン(ampicillin)抗生剤が含まれたLB液体培地5mLを含む培養チューブに接種し、600nmで吸光度が2.0になるまで37℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をLBとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は、攪拌速度180rpm及び37℃の条件で行った。続いて、前記培養液を8,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で2回洗浄し、10mMイミダゾール(imidazole)と300mM NaClが含まれた50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液に再懸濁した。前記再懸濁された菌体を細胞破砕機(sonicator)を用いて破砕し、細胞破砕物を13,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をHis−taq親和クロマトグラフィーを用いて精製した後、20mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を充填剤の10倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、250mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で透析して、酵素特性解析のための精製酵素CJ_LP_F4Eを確保した。
前記実施例3−2で確保した本出願組換え酵素CJ_LP_F4Eの活性を測定するために、30重量%果糖の50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM NiSO4、及び各20mg/mlのCJ_LP_F4Eを添加して、60℃で10時間反応させた。
前記実施例3−2で得られた本出願組換え酵素CJ_LP_F4Eの果糖−4−エピマー化活性に対する温度の影響力を調査するために10重量%果糖を含む50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液に1mg/ml CJ_LP_F4Eを添加して45℃、50℃、55℃、60℃及び70℃の様々な温度で3時間反応させた。反応が完了した後、反応液内のタガトースはHPLCを用いて定量分析した。
従来公知の異性化酵素、例えば、グルコース異性化酵素及びアラビノース異性化酵素及びエピマー酵素、例えば、プシコース3−エピマー化酵素は、金属イオンを必要とすることが知られている。したがって、前記実施例3−2で得られた本出願の組換え酵素CJ_LP_F4Eの場合も金属イオンが果糖−4−エピマー化活性に影響を与えるかどうかを確認した。
新規耐熱性の果糖−4−エピマー化酵素を発掘するために、Caldithrix abyssi DSM 13497及びCaldicellulosiruptor kronotskyensis DSM 18902由来のタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子情報を確保し、大腸菌発現可能ベクター及び形質転換微生物を製造した。
前記実施例4−1で製造した各遺伝子組換え微生物E. coli BL21(DE3)/CJ_Cab_F4E及びE. coli BL21(DE3)/CJ_Ckr_F4Eから組換え酵素CJ_Cab_F4E及びCJ_Ckr_F4Eを製造するために、それぞれの組換え微生物をアンピシリン(ampicillin)抗生剤が含まれたLB液体培地5mLを含む培養チューブに接種し、600nmで吸光度が2.0になるまで37℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をLBとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は攪拌速度180rpm及び37℃の条件で行った。その後、前記培養液は8,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で2回洗浄し、10mMイミダゾール(imidazole)と300mM NaClが含まれた50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液に懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機(sonicator)を用いて破砕し、細胞破砕物を13,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をHis−taq親和クロマトグラフィーを用いて精製し、20mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を充填剤の10倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、250mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で透析して酵素特性解析のための精製酵素CJ_Cab_F4E及びCJ_Ckr_F4Eを確保した。
前記実施例4−2で確保した組換え酵素CJ_Cab_F4E及びCJ_Ckr_F4Eの果糖−4−エピマー化活性を測定するために、10重量%果糖の50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM MnSO4及び各5mg/mlのCJ_Cab_F4E及びCJ_Ckr_F4Eを添加して、60℃で24時間反応させた。
前記実施例4−2で得られた組換え酵素CJ_Cab_F4E及びCJ_Ckr_F4Eの果糖−4−エピマー化活性に対する温度の影響力を調査するために、5重量%果糖を含む50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液に各5mg/mlのCJ_Cab_F4E及びCJ_Ckr_F4Eを添加し、各37℃、40℃、50℃、55℃、60℃及び70℃で5時間反応させた。反応完了液内のタガトースはHPLCを用いて定量分析した。その結果、CJ_Cab_F4Eは55℃で、CJ_Ckr_F4Eは60℃で最大活性を示し、両方の酵素すべて50℃〜70℃で最大活性の75%以上の活性を示すことを確認した(表1、図9a及び9b) 。
前記実施例4−2で得られた組換え酵素CJ_Cab_F4E及びCJ_Ckr_F4Eの金属が果糖−4−エピマー化活性に影響を与えるかどうかを確認した。
新規耐熱性の果糖−4−エピマー化酵素を発掘するためにCaldilinea aerophila由来のタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子情報を確保し、大腸菌発現可能ベクター及び形質転換微生物を製造した。
ATATACATATGTCAACACTTCGCCACATCATTTTGCGAとプライマー2:
TGGTGCTCGAGTCCAAGCAATGTAGCGGCGTCGTAを用い、PCR条件は、94℃で2分間変性後、94℃30秒の変性、65℃ 30秒のアニーリング、72℃で2分の伸長を35回繰り返した後、72℃で5分間伸長反応を行った。
前記実施例5−1で製造した各遺伝子組換え微生物E. coli BL21(DE3)/CJ_CAE_F4Eから組換え酵素CJ_CAE_F4Eを製造するために、遺伝子組換え微生物をアンピシリン(ampicillin)抗生剤が含まれたLB液体培地5mLを含む培養チューブに接種し、600nmで吸光度が2.0になるまで37℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をLBとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は、攪拌速度180rpm及び37℃の条件で行った。その後、前記培養液は8,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で2回洗浄し、10mMイミダゾール(imidazole)と300mM NaClが含まれた50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液に懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機(sonicator)を用いて破砕し、細胞破砕物を13,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をHis−taq親和クロマトグラフィーを用いて精製し、20mMイミダゾール、及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を充填剤の10倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、250mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で透析して酵素の特性解析のための精製酵素CJ_CAE_F4Eを確保した。
前記実施例5−2で確保した組換え酵素CJ_CAE_F4Eの果糖−4−エピマー化活性を測定するために、10重量%果糖の50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM MnSO4及び各20mg/mlのCJ_CAE_F4Eを添加して、60℃で24時間反応させた。
新規耐熱性の果糖−4−エピマー化酵素を発掘するために、Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus由来のタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子情報を取得して、大腸菌発現可能ベクター及び形質転換微生物を製造した。
前記実施例6−1で製造した組換え微生物E. coli BL21(DE3)/CJ_TATH_F4Eから組換え酵素CJ_TATH_F4Eを製造するために、遺伝子組換え微生物をアンピシリン(ampicillin)抗生剤が含まれたLB液体培地5mLを含む培養チューブに接種し、600nmで吸光度が2.0になるまで37℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をLBとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は攪拌速度180rpm及び37℃の条件で行った。その後、前記培養液は8,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で2回洗浄し、10mMイミダゾール(imidazole)と300mM NaClが含まれている50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液に懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機(sonicator)を用いて破砕し、細胞破砕物を13,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をHis−taq親和クロマトグラフィーを用いて精製し、20mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を充填剤の10倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、250mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で透析して酵素特性解析のための精製酵素CJ_TATH_F4Eを確保した。
前記実施例6−2で確保した組換え酵素CJ_TATH_F4Eの果糖−4−エピマー化活性を測定するために、30重量%果糖の50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM MnSO4及び各5mg/mlのCJ_TATH_F4Eを添加して、60℃で24時間反応させた。
新規耐熱性の果糖−4−エピマー化酵素を発掘するために、Acidobacteriales bacterium由来のタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子情報を確保し、大腸菌発現可能ベクター及び形質転換微生物を製造した。
前記実施例7−1で製造した組換え微生物E. coli BL21(DE3)/CJ_AB_F4Eから組換え酵素CJ_AB_F4Eを製造するために、遺伝子組換え微生物をアンピシリン(ampicillin)抗生剤が含まれたLB液体培地5mLを含む培養チューブに接種し、600nmで吸光度が2.0になるまで37℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をLBとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は攪拌速度180rpm及び37℃の条件で行った。その後、前記培養液は8,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で2回洗浄し、10mMイミダゾール(imidazole)と300mM NaClが含まれた50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液に懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機(sonicator)を用いて破砕し、細胞破砕物を13,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をHis−taq親和クロマトグラフィーを用いて精製し、20mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を充填剤の10倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、250mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で透析して酵素の特性解析のための精製酵素CJ_AB_F4Eを確保した。
前記実施例7−2で確保した組換え酵素CJ_AB_F4Eの果糖−4−エピマー化活性を測定するために、1重量%果糖の50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM MnSO4と各10mg/mlのCJ_AB_F4Eを添加して55℃で24時間反応させた。
Claims (6)
- タガトース−ビスリン酸アルドラーゼ、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を含む、タガトース生産用組成物。
- 前記組成物が、果糖をさらに含む、請求項1に記載のタガトース生産用組成物。
- 前記組成物が、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17または19のアミノ酸配列からなるタガトース−ビスリン酸アルドラーゼを1つ以上含むものである、請求項1に記載のタガトース生産用組成物。
- 前記タガトース−ビスリン酸アルドラーゼが、Thermanaerothrix sp.由来の酵素またはその変異体、Anaerolinea sp.由来の酵素またはその変異体、Kosmotoga sp.由来の酵素またはその変異体、Rhodothermus sp.由来の酵素またはその変異体、Limnochorda sp.由来の酵素またはその変異体、Caldithrix sp.またはCaldicellulosiruptor sp.由来の酵素またはその変異体である、請求項1に記載のタガトース生産用組成物。
- 果糖を、タガトース−ビスリン酸アルドラーゼ、これを発現する微生物または前記微生物の培養物と接触させて、前記果糖をタガトースに転換させる段階を含む、タガトースの製造方法。
- 前記接触が、pH5.0〜pH9.0の条件で、30℃〜80℃の温度条件で、または0.5時間〜48時間行われる、請求項5に記載のタガトースの製造方法。
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