TWI700370B - 用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本申請案是有關於一種包括果糖-4-差向異構酶的用於生 產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法。

Description

用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖 的方法
本申請案是有關於一種包括果糖-4-差向異構酶的用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法。
塔格糖是少量存在於牛奶、乳酪及可可等食品、以及如蘋果與柑橘般具有甜味的天然水果的天然甜味料。塔格糖的卡路里為1.5kcal/g(即砂糖的卡路里的1/3)，血糖指數(Glycemic index，GI)為3(即砂糖的血糖指數的5%)，然而，其物理性質與砂糖相似，具有相似的甜味，並且具有各種健康功能性，故而可作為可同時滿足健康與口感的砂糖替代甜味料而利用於多種製品。
先前公知或公用的塔格糖的製備方法有以半乳糖為主原料的化學方法(觸媒反應)及生物學方法(異構酶反應)(參照PCT WO 2006/058092、韓國註冊專利第10-0964091號及韓國註冊專利第10-1368731號)。然而，上述先前製備方法中用作主原料 的半乳糖的基礎原料為乳糖，而乳糖因國際市場中的生乳(raw milk)及乳糖的生產量、供需量等因素而價格不穩定，從而穩定供需存在極限，因此需要一種能夠以普遍的糖(砂糖、葡萄糖、果糖等)為原料來製備塔格糖的新的方法，故對此進行了研究，上述文獻中揭示有分別自葡萄糖、半乳糖及果糖生產半乳糖、阿洛酮糖及塔格糖的方法(韓國註冊專利第10-744479號、韓國註冊專利第10-1057873號及韓國註冊專利第10-1550796號)。
另一方面，已知塔格糖-二磷酸醛縮酶(tagatose-bisphosphate aldolase，酶學委員會(Enzyme Commission，EC)4.1.2.40)如下述[反應式1]般以D-塔格糖1,6-二磷酸(D-tagatose 1,6-bisphosphate)為基質而生產磷酸甘油酮(glycerone phosphate)與D-甘油醛3-磷酸(D-glyceraldehyde 3-phosphate)，且參與半乳糖代謝，但並無針對上述塔格糖-二磷酸醛縮酶是否具有生產塔格糖的活性的研究。
[反應式1]D-塔格糖1,6-二磷酸<=>磷酸甘油酮+D-甘油醛3-磷酸
於此種背景下，本發明者等人為了開發一種具有將果糖轉化成塔格糖的活性的酶而進行銳意研究，結果確認到塔格糖-二磷酸醛縮酶(tagatose-bisphosphate aldolase，EC 4.1.2.40)具有將果糖轉化成塔格糖的功能，藉此完成本申請案。
本申請案的目的在於提供一種有效製備塔格糖的組成物，上述組成物包括塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現上述酶的微生物或上述微生物的培養物。
本申請案的另一目的在於提供一種塔格糖的製備方法，其包括使本申請案的果糖-4-差向異構酶、表現上述酶的微生物或上述微生物的培養物與果糖接觸而將果糖轉化成塔格糖的步驟。
本申請案的其他目的及優點藉由隨附的發明申請專利範圍、圖式及下述詳細說明而變得更加明確。本說明書中未記載的內容可由在本申請案的技術領域或相似領域中具有常識者充分地認知、推導，因此省略其說明。
以下，具體地對本申請案的內容進行說明。另一方面，本申請案中揭示的一實施方式的說明及實施形態中的共通事項亦可應用於其他實施方式的說明及實施形態。另外，本申請案中所揭示的各種要素的所有組合均屬於本申請案的範疇。而且，本申請案的範疇並不限制於以下具體的記述。
為了達成本申請案的目的，本申請案的一實施方式提供一種包括塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現上述塔格糖-二磷酸醛縮酶的微生物或上述微生物的培養物的用於生產塔格糖的組成物。
上述塔格糖-二磷酸醛縮酶例如為塔格糖-二磷酸醛縮酶(tagatose-bisphosphate aldolase，EC 4.1.2.40)，然而，例如可無 限制地包括其他能夠以果糖為基質而生產塔格糖的物質。具體而言，以將作為基質的果糖轉化為塔格糖來定義轉化率，上述塔格糖-二磷酸醛縮酶的轉化率(轉化率=塔格糖重量/初始果糖重量*100)可為0.01%以上、具體而言為0.1%以上、更具體而言為0.3%以上者。更具體而言，轉化率可為0.01%至40%的範圍、0.1%至30%的範圍、0.3%至25%的範圍或0.3%至20%的範圍。
具體而言，上述塔格糖-二磷酸醛縮酶可包括由序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9、序列號11、序列號13、序列號15、序列號17或序列號19的胺基酸序列構成的多肽、或與序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9、序列號11、序列號13、序列號15、序列號17或序列號19的胺基酸序列具有至少80%、90%、95%、97%或99%的同源性的多肽。另外，只要為具有上述同源性且具有表現出與由上述序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9、序列號11、序列號13、序列號15、序列號17或序列號19的胺基酸序列構成的蛋白質相應的功效(即，將果糖的第4碳位置差向異構化而轉化成塔格糖的果糖-4-差向異構化活性)的胺基酸序列的多肽，則即便具有一部分序列缺失、經修飾、經取代或經添加的胺基酸序列，亦當然包括於本申請案的範圍內。此外，作為由可根據公知的基因序列製備的探針、例如於嚴格的條件下與編碼上述多肽的鹼基序列的全部或一部分的互補序列雜交(hybridization)的聚核苷酸編碼的多肽，亦可無限制地包括具有果糖-4-差向異構化活性的多肽。另外，上 述組成物可包括至少一種由1、3、5、7、9、11、13、15、17或19的胺基酸序列構成的塔格糖-二磷酸醛縮酶。
於本申請案中，揭示了“塔格糖-二磷酸醛縮酶”表現出將果糖的第4碳位置差向異構化而將果糖轉化成塔格糖的果糖-4-差向異構化活性，因此於本申請案中可與“果糖-4-差向異構酶”互換使用。
於本申請案中，用語“嚴格的條件”是指可實現聚核苷酸間的特異性雜交的條件。此種條件依存於聚核苷酸的長度及互補性程度，這些參數為本技術領域所熟知，諸如具體記載在文獻(例如，J.Sambrook等人，同源)中。例如，可列舉如下條件：同源性較高的基因彼此雜交、具有80%以上、90%以上、95%以上、97%以上或99%以上的同源性的基因彼此雜交、同源性低於上述的基因彼此不雜交的條件；或於通常的南方雜交的清洗條件，即於60℃、1×鹽水檸檬酸鈉(Saline Sodium Citrate，SSC)、0.1%十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate，SDS)、具體而言60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、更具體而言68℃、0.1×SSC、0.1% SDS對應的鹽濃度及溫度下清洗1次、具體而言2次至3次的條件。上述雜交中所使用的探針可為鹼基序列的互補序列的一部分。此種探針能夠以根據公知序列製成的寡核苷酸為引子，而藉由以包括此種鹼基序列的基因片段為模板的聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)製作。另外，業者可視需要而根據如探針長度的要素調節溫度及清洗溶液的鹽濃度。
於本申請案中，用語“同源性”是指兩個聚核苷酸或多肽部分之間的一致性的百分比。自一個部分至另一部分為止的序列間同源性可藉由公知的相應技術而確定。例如，可藉由如下方式確定同源性：對序列資訊進行整列，利用可容易地獲得的電腦程式直接對兩個聚核苷酸分子或兩個多肽分子間的序列資訊(例如分值(score)、一致性(identity)及相似度(similarity)等參數(parameter))進行整列(例如，基礎局部比對檢索工具(Basic Local Alig nment Search Tool，BLAST)2.0)。另外，聚核苷酸間同源性可藉由如下方式確定：於在構成同源區域間的穩定雙鏈的條件下將聚核苷酸雜交後，分解成單鏈特異性核酸酶而確定所分解的片段的尺寸。
作為一實施例，本申請案的果糖-4-差向異構酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自Thermanaerothrix屬的酶或其變異體、來自Kosmotoga屬的酶或其變異體、來自紅嗜熱鹽菌屬的酶或其變異體、來自Limnochorda屬的酶或其變異體、來自暖發菌屬、暖繩菌屬、熱厭氧桿菌屬、酸桿菌屬或熱解纖維素菌屬的酶或其變異體。具體而言，可為來自Thermanaerothrix daxensis、Kosmotoga olearia、Rhodothermus profundi、海洋紅嗜熱鹽菌(Rhodothermus marinus)、Limnochorda pilosa、Caldithrix abyssi、Caldilinea aerophila、熱產硫化氫熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)、酸桿菌細菌(Acidobacteriales bacterium)或Caldicellulosiruptor kronotskyensis的酶或其變異體。更具體而 言，可為來自Rhodothermus profundi DSM 22212或海洋紅嗜熱鹽菌ATCC 43812的酶或其變異體。
本申請案的果糖-4-差向異構酶或其變異體具有將D-果糖(fructose)的第4碳位置差向異構化而轉化成D-塔格糖的特徵。已知上述果糖-4-差向異構酶具有塔格糖-二磷酸醛縮酶(tagatose-bisphosphate aldolase)活性，以D-塔格糖1,6-二磷酸(D-tagatose 1,6-bisphosphate)為基質而生產磷酸甘油酮(glycerone phosphate)與D-甘油醛3-磷酸(D-glyceraldehyde 3-phosphate)，且參與半乳糖代謝。於本申請案中，首次揭示上述塔格糖-二磷酸醛縮酶具有果糖-4-差向異構酶活性。因此，本申請案的一實施例是有關於一種包括於自果糖製備塔格糖時將塔格糖-二磷酸醛縮酶用作果糖-4-差向異構酶的塔格糖-二磷酸醛縮酶的新的用途。另外，本申請案的一實施例是有關於一種將塔格糖-二磷酸醛縮酶用作果糖-4-差向異構酶而自果糖製備塔格糖的方法。
作為一實施例，本申請案的果糖-4-差向異構酶可為耐熱性較高的酶。具體而言，本申請案的果糖-4-差向異構酶可於50℃至70℃下表現出最大活性的50%至100%、60%至100%、70%至100%或75%至100%的活性。更具體而言，本申請案的果糖-4-差向異構酶可於55℃至60℃、60℃至70℃、55℃、60℃或70℃下表現出最大活性的80%至100%或85%至100%的活性。
進而，可分別為由序列號1構成的上述果糖-4-差向異構酶為由序列號2的核苷酸序列編碼者；由序列號3構成的果糖-4- 差向異構酶為由序列號4的核苷酸序列編碼者；由序列號5構成的果糖-4-差向異構酶為由序列號6的核苷酸序列編碼者；由序列號7構成的果糖-4-差向異構酶為由序列號8的核苷酸序列編碼者；由序列號9構成的果糖-4-差向異構酶為由序列號10的核苷酸序列編碼者；由序列號11構成的果糖-4-差向異構酶為由序列號12的核苷酸序列編碼者；由序列號13構成的果糖-4-差向異構酶為由序列號14的核苷酸序列編碼者；由序列號15構成的果糖-4-差向異構酶為由序列號16的核苷酸序列編碼者；由序列號17構成的果糖-4-差向異構酶為由序列號18的核苷酸序列編碼者；由序列號19構成的果糖-4-差向異構酶為由序列號20的核苷酸序列編碼者。
本申請案的果糖-4-差向異構酶或其變異體可為藉由如下方式獲得者：於藉由表現本申請案的上述酶或其變異體的脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)(例如序列號2、序列號4、序列號6、序列號8、序列號10、序列號12、序列號14、序列號16、序列號18或序列號20)轉形至大腸桿菌(E.coli)等菌株後，對其進行培養而獲得培養物，對上述培養物進行粉碎而藉由管柱等進行精製。除大腸桿菌(Escherichia coli)以外，上述轉形用菌株還可為麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、米麴菌(Aspergillus oryzae)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)等。
於具體例中，此種轉形的菌株為大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_TD_F4E、大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_KO_F4E、大腸桿菌BL21 (DE3)/CJ_RP_F4E、大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_RM_F4E、大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_LP_F4E、大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_Cab_F4E、大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_Ckr_F4E或大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_CAE_F4E、大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_TATH_F4E、大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_AB_F4E，其等分別依次以寄存編號KCCM11995P(寄存日期：2017年3月20日)、寄存編號KCCM11999P(寄存日期：2017年3月24日)、KCCM12097P(寄存日期：2017年8月11日)、KCCM12096P(寄存日期：2017年8月11日)、KCCM12095P(寄存日期：2017年8月11日)、KCCM12107P(寄存日期：2017年9月13日)、KCCM12108P(寄存日期：2017年9月13日)、KCCM12233P(寄存日期：2018年3月23日)、KCCM12234P(寄存日期：2018年3月23日)及KCCM12237P(寄存日期：2018年3月23日)寄存於作為布達佩斯條約下的國際寄存機關的韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms)。
本申請案中使用的果糖-4-差向異構酶可利用編碼上述果糖-4-差向異構酶的核酸提供。
於本申請案中，用語“核酸”具有總括DNA分子或核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)分子的含義，作為核酸的基本構成單元的核苷酸不僅包括天然核苷酸，而且亦可包括糖或鹼基位點經修飾的類似物(參照Scheit，核苷酸類似物(Nucleotide Analogs)，John Wiley，New York(1980)；Uhlman及Peyman，化 學綜述(Chemical Reviews)，90：543-584(1990))。
上述核酸可為編碼本申請案的由序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9、序列號11、序列號13、序列號15、序列號17或序列號19的胺基酸序列構成的多肽的核酸、或編碼與本申請案的果糖-4-差向異構酶具有至少80%、90%、95%、97%或99%的同源性且具有果糖-4-差向異構酶活性的多肽的核酸。具體而言，例如編碼由序列號1的胺基酸序列構成的上述果糖-4-差向異構酶的核酸可為與序列號2的鹼基序列具有至少80%、90%、95%、97%、99%或100%的同源性的核酸。另外，例如編碼由序列號3的胺基酸序列構成的上述果糖-4-差向異構酶的核酸可為與序列號4的鹼基序列具有至少80%、90%、95%、97%、99%或100%的同源性的核酸，其亦可應用於編碼本申請案中所記述的其他胺基酸序列的酶的核酸。而且，本申請案的核酸可包括可藉由密碼簡並性(codon degeneracy)而轉譯成本申請案的果糖-4-差向異構酶的核酸，當然亦可包括如下核酸：於嚴格的條件下與由相對於序列號2、序列號4、序列號6、序列號8、序列號10、序列號12、序列號14、序列號16、序列號18或序列號20的上述鹼基序列為互補性的鹼基序列構成的核酸雜交，且編碼具有本申請案的果糖-4-差向異構酶活性的多肽。
可使用於本申請案的表現果糖-4-差向異構酶的微生物可為包括包含上述核酸的重組載體的微生物。上述載體可為以可使本申請案的核酸發揮作用的方式連接的形態。於本申請案中， 用語“以可發揮作用的方式連接”通常是為了執行功能而鹼基表現調節序列與編碼靶蛋白的鹼基序列以可發揮作用的方式連接，從而可對編碼的鹼基序列的表現產生影響。可利用業界公知的基因重組技術以可發揮作用的方式與載體連接，可使用業界的剪切及連接酶等實現位點特異性DNA剪切及連接。於本申請案中，用語“載體”是指用以將鹼基選殖及/或轉移至有機體(例如宿主細胞)的任意的介質。載體可為不同的DNA片段結合而可導入所結合的片段的複製的複製單元(replicon)。此處，“複製單元”是指於生物體內作為DNA自複製單元發揮功能、即可藉由自調節而實現複製的任意的遺傳單元(例如，質體、噬菌體、黏質體、染色體、病毒)。本申請案的用語“載體”可包括用以於試管內、生物體外或生物體內將鹼基導入至有機體(例如宿主細胞)的病毒介質及非病毒介質，可包括微環DNA、如睡美人(Sleeping Beauty)的轉位子(Izsvak等人，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)302：93-102(2000))、或人工染色體。作為通常使用的載體的示例，可列舉天然狀態或重組狀態的質體、黏質體、病毒及細菌噬菌體。例如，可使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A及Charon21A等作為噬菌體載體或黏質體載體，可使用pBR類、pUC類、pBluescriptII類、pGEM類、pTZ類、pCL類及pET類等作為質體載體。可使用於本申請案的載體並無特別限制，可使用公知的重組載體。另外，上述載體可為以更包括各種抗生素抗性基因為特徵的重組載體。於本申請案中，用語“抗 生素抗性基因”是對抗生素具有抗性的基因，具有該基因的細胞可存活於以相應的抗生素進行處理過的環境中，因此於在大腸桿菌中獲得大量質體的過程中有效地用作篩選標誌。於本申請案中，抗生素抗性基因並非為對本申請案的核心技術(即由載體的最佳組合實現的表現效率)產生較大影響的要素，因此可無限制地使用通常使用的抗生素抗性基因作為篩選標誌。作為具體的示例，可使用針對胺苄青黴素(ampicilin)、四環素(tetracyclin)、康黴素(kanamycin)、氯黴素(chloroamphenicol)、鏈黴素(streptomycin)或新黴素(neomycin)的抗性基因等。
可利用於本申請案的表現果糖-4-差向異構酶的微生物可利用將包括編碼上述酶的核酸的載體導入至宿主細胞內的方法，使上述載體轉形的方法可包括將核酸導入至細胞內的任一方法可選擇如於本技術領域內公知的適當的標準技術而執行。可包括電致孔(electroporation)、磷酸鈣共沉澱(calcium phosphate co-precipitation)、反轉錄病毒感染(retroviral infection)、顯微注射法(microinjection)、二乙胺乙基(Dicthylaminoethyl，DEAE)-葡聚糖(DEAE-dextran)、陽離子脂質體(cationic liposome)法及熱衝擊法等，但並不限制於此。
轉形的基因只要可於宿主細胞內表現，則可包括所有插入於宿主細胞的染色體內的形態及位於染色體外的形態。另外，上述基因只要為包括DNA及RNA作為可編碼多肽的聚核苷酸且可導入至宿主細胞內而表現者即可，因此可無限制地使用具有上 述特徵者。例如，上述基因能夠以作為包括自表現所需的所有要素的聚核苷酸結構體的表現盒(expression cassette)形態導入至宿主細胞。上述表現盒通常可包括以可發揮作用的方式連接於上述基因的啟動子(promoter)、轉錄終止訊號、核糖體結合位點及轉譯終止訊號。上述表現盒可呈可實現自複製的重組載體形態。另外，上述基因亦可為如下者：以其本身的形態或聚核苷酸結構體的形態導入至宿主細胞而於宿主細胞內以可發揮作用的方式與表現所需的序列連接。
本申請案的微生物只要為包括本申請案的核酸或本申請案的重組載體而可生產本申請案的果糖-4-差向異構酶的微生物即可，因此可包括原核微生物及真核微生物中的任一種。例如，可包括屬於埃希氏菌(Escherichia)屬、歐文氏菌(Erwinia)屬、沙雷氏菌(Serratia)屬、普羅威登菌(Providencia)屬、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬及短桿菌(Brevibacterium)屬的微生物菌株，具體而言，可為大腸桿菌(E.coli)或麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)，但並不限制於此。作為此種微生物的示例，有大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_TD_F4E、大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_KO_F4E、大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_RP_F4E、大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_RM_F4E、大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_LP_F4E、大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_Cab_F4E、大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_Ckr_F4E、大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_CAE_F4E、大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_TATH_F4E或大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_AB_F4E。
本申請案的微生物可包括除上述核酸導入或載體導入以外可藉由各種公知方法表現本申請案的果糖-4-差向異構酶的所有微生物。
本申請案的微生物的培養物可為於培養基中培養表現本申請案的塔格糖-二磷酸醛縮酶的微生物而製備者。
於本申請案中，用語“培養”是指使上述微生物於適當地調節的環境條件下生長。本申請案的培養過程可利用業界熟知的適當的培養基與培養條件實現。此種培養過程可根據選擇的菌株而由業者容易地調整來使用。培養微生物的上述步驟並無特別限制，可藉由公知的批式培養方法、連續式培養方法、流加式培養方法等而執行。此時，培養條件並無特別限制，可使用鹼性化合物(例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)調節最適pH值(例如，pH5至pH9，具體而言為pH7至pH9)。另外，可於培養中使用如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡劑來抑制氣泡的產生，另外，為了保持培養物的好氧狀態而可向培養物中注入氧氣或含氧氣體，或為了保持厭氧狀態及微好氧狀態而可不注入氣體或注入氮氣、氫氣或二氧化碳氣體。培養溫度可保持為25℃至40℃、具體而言為30℃至37℃，但並不限制於此。培養時間可持續至獲得所期望的有用物質的生產量為止，具體而言，可培養約0.5小時至60小時，但並不限制於此。而且，使用的培養用培養基作為碳供給源可單獨或混合糖及碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉及纖維素)、 油脂及脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油及椰子油)、脂肪酸(例如，棕櫚酸、硬脂酸及亞麻油酸)、醇(例如，甘油及乙醇)與有機酸(例如，乙酸)等而使用，但並不限制於此。作為氮供給源，可單獨或混合含氮的有機化合物(例如，蛋白腖、酵母萃取物、肉汁、麥芽萃取物、玉米漿、大豆粕粉及尿素)或無機化合物(例如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨)等而使用，但並不限制於此。作為磷供給源，可單獨或混合磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、與其對應的含鈉的鹽等而使用，但並不限制於此。另外，於培養基中可包括如金屬鹽(例如，硫酸鎂或硫酸鐵)、胺基酸及維生素的其他必需生長促進物質。
本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括果糖。
本申請案的用於生產塔格糖的組成物包括具有將果糖直接轉化成塔格糖的果糖-4-差向異構化活性的塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現上述塔格糖-二磷酸醛縮酶的微生物或上述微生物的培養物，能夠以不含有以果糖以外為底物的任何酶為特徵。
例如，能夠以如下情形為特徵：不包括α-葡聚糖磷酸化酶(α-glucan phosphorylase)、澱粉磷酸化酶(starch phosphorylase)、麥芽糊精磷酸化酶(maltodextrin phosphorylase)或蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase)、表現上述酶的微生物或上述微生物的培養物；不包括葡萄糖激酶(glucokinase)、表現上述葡萄糖激酶的微生物或上述微生物的培養物； 不包括塔格糖-6-磷酸磷酸酶(tagatose-6-phosphate phosphatase)、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物；及/或不包括α-澱粉酶(α-amylase)、支鏈澱粉酶(pullulanase)、葡萄糖澱粉酶(glucoamylase)、蔗糖酶(sucrase)或異澱粉酶(isoamylase)、表現上述澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物、或表現上述澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物的培養物。
本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括通常使用於所述用於生產塔格糖的組成物的任意適當的賦形劑。作為此種賦形劑，例如可為保存劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑或等張劑等，但並不限定於此。
本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括金屬。於一實施例中，本申請案的金屬可為包括2價陽離子的金屬。具體而言，本申請案的金屬可為鎳、鎂(Mg)或錳(Mn)。更具體而言，本申請案的金屬可為金屬離子或金屬鹽，更進一步具體而言，上述金屬鹽可為MgSO4、NiSO4、NiCl2、MgCl2、MnCl2或MnSO4。
本申請案的另一實施方式提供一種塔格糖製備方法，其包括使果糖(D-fructose)與本申請案的果糖-4-差向異構酶、表現上述酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而將上述果糖轉化成塔格糖的步驟。
作為一實施例，能夠以pH5.0至pH9.0的條件、30℃至 80℃的溫度條件及/或0.5小時至48小時的條件執行本申請案的接觸。
具體而言，可於pH6.0至pH9.0的條件或pH7.0至pH9.0的條件下執行本申請案的接觸。另外，可於35℃至80℃、40℃至80℃、45℃至80℃、50℃至80℃、55℃至80℃、60℃至80℃、30℃至70℃、35℃至70℃、40℃至70℃、45℃至70℃、50℃至70℃、55℃至70℃、60℃至70℃、30℃至65℃、35℃至65℃、40℃至65℃、45℃至65℃、50℃至65℃、55℃至65℃、30℃至60℃、35℃至60℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或55℃至60℃的溫度條件下執行本申請案的接觸。而且，本申請案的接觸可執行0.5小時至36小時、0.5小時至24小時、0.5小時至12小時、0.5小時至6小時、1小時至48小時、1小時至36小時、1小時至24小時、1小時至12小時、1小時至6小時、3小時至48小時、3小時至36小時、3小時至24小時、3小時至12小時、3小時至6小時、6小時至48小時、6小時至36小時、6小時至24小時、6小時至12小時、12小時至48小時、12小時至36小時、12小時至24小時、18小時至48小時、18小時至36小時或18小時至30小時。
作為一實施例，可於存在金屬的條件下執行本申請案的接觸。可使用的金屬與上述實施方式相同。
本申請案的製備方法可更包括對所製備的塔格糖進行分離及/或精製的步驟。上述分離及/或精製可使用本申請案的技術 領域內通常使用的方法，可使用透析、沉澱、吸附、電泳、離子交換層析法及分步結晶等作為非限制性的示例。上述精製可僅實施一種方法，亦可一併實施兩種以上的方法。
另外，本申請案的製備方法可更包括於上述分離及/或精製步驟前或上述分離及/或精製步驟後執行脫色及/或脫鹽的步驟。藉由實施上述脫色及/或脫鹽，可獲得品質更優異的塔格糖。
作為另一實施例，本申請案的製備方法於轉化成本申請案的塔格糖的步驟、進行分離及/或精製的步驟、或進行脫色及/或脫鹽的步驟後，可更包括對塔格糖進行結晶化的步驟。上述結晶化可使用通常使用的結晶化方法執行。例如，可使用冷卻結晶化方法執行結晶化。
作為另一實施例，本申請案的製備方法於上述結晶化步驟前，可更包括對塔格糖進行濃縮的步驟。上述濃縮可提高結晶化效率。
作為另一實施例，本申請案的製備方法可於本申請案的分離及/或精製步驟後，更包括使未反應的果糖與本申請案的酶、表現上述酶的微生物或上述微生物的培養物接觸的步驟，於本申請案的結晶化步驟後，更包括將結晶分離的母液再使用於上述分離及/或精製步驟的步驟或其組合。藉由上述追加步驟而能夠以更高的產率獲得塔格糖，可減少廢棄的果糖量而具有經濟性優點。
本申請案的作為果糖-4-差向異構酶的塔格糖-二磷酸醛 縮酶的耐熱性優異，因此可於產業上生產塔格糖，將普遍的糖(即果糖)轉化成塔格糖而具有經濟性較高的效果。
圖1是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-二磷酸醛縮酶(CJ_TD_F4E、CJ_KO_F4E)具有果糖-4-差向異構酶活性的高效液相層析法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)的層析結果。
圖2是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-二磷酸醛縮酶(CJ_TD_F4E、CJ_KO_F4E)的果糖-4-差向異構化活性的與溫度變化對應的活性程度的圖表。
圖3是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-二磷酸醛縮酶CJ_RP_F4E及CJ_RM_F4E具有果糖-4-差向異構酶活性的HPLC的層析圖表。
圖4a是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-二磷酸醛縮酶CJ_RP_F4E的與溫度變化對應的果糖-4-差向異構酶活性的圖表。
圖4b是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-二磷酸醛縮酶CJ_RM_F4E的與溫度變化對應的果糖-4-差向異構酶活性的圖表。
圖5a是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-二磷酸 醛縮酶CJ_RP_F4E的藉由添加金屬實現的果糖-4-差向異構化活性的圖表。
圖5b是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-二磷酸醛縮酶CJ_RM_F4E的藉由添加金屬實現的果糖-4-差向異構化活性的圖表。
圖6表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-二磷酸醛縮酶CJ_LP_F4E具有果糖-4-差向異構酶活性的HPLC的層析圖表。
圖7a是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-二磷酸醛縮酶CJ_LP_F4E的與溫度變化對應的果糖-4-差向異構化活性的圖表。
圖7b是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-二磷酸醛縮酶CJ_LP_F4E的藉由添加金屬實現的果糖-4-差向異構化活性的圖表。
圖8a是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-二磷酸醛縮酶CJ_Cab_F4E具有果糖-4-差向異構酶活性的HPLC的層析結果的圖表。
圖8b是表示於本申請案的一實施例中製備的CJ_Ckr_F4E具有果糖-4-差向異構酶活性的HPLC的層析結果的圖表。
圖9a是表示於本申請案的一實施例中製備的CJ_Cab_F4E的與溫度對應的果糖-4-差向異構酶活性的圖表。
圖9b是表示於本申請案的一實施例中製備的CJ_Ckr_F4E的 與溫度對應的果糖-4-差向異構酶活性的圖表。
圖10a是表示於本申請案的一實施例中製備的CJ_Cab_F4E的藉由添加金屬實現的果糖-4-差向異構化活性的圖表。
圖10b是表示於本申請案的一實施例中製備的CJ_Ckr_F4E的藉由添加金屬實現的果糖-4-差向異構化活性的圖表。
圖11是表示於本申請案的一實施例中製備的CJ_CAE_F4E具有果糖-4-差向異構酶活性的HPLC的層析結果的圖表。
圖12是表示於本申請案的一實施例中製備的CJ_TATH_F4E具有果糖-4-差向異構酶活性的HPLC的層析結果的圖表。
圖13是表示於本申請案的一實施例中製備的CJ_AB_F4具有果糖-4-差向異構酶活性的HPLC的層析結果的圖表。
以下，藉由本申請案的實施例而更詳細地對本發明進行說明。然而，本申請案的下述實施例僅為本申請案的一示例。該等實施例用以更具體地對本發明進行說明，於本發明所屬的技術領域內具有常識者應明白，隨附的發明申請專利範圍中所提出的本發明的範圍並不限制於該等實施例。
實施例1：塔格糖-二磷酸醛縮酶的製備及其活性評估
實施例1-1：包括塔格糖-二磷酸醛縮酶基因的重組表現載體及轉形體的製備
為了提供新的耐熱性的果糖-4-差向異構酶，獲得來自 Thermanaerothrix daxensis、Kosmotoga olearia的塔格糖-二磷酸醛縮酶基因資訊而製備可表現於大腸桿菌中的載體及轉形微生物(轉形體)。
具體而言，以註冊於京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)的3種基因序列(即Thermanaerothrix daxensis、嗜熱厭氧繩菌(Anaerolinea thermophila)、Kosmotoga olearia的基因序列)為對象而選擇塔格糖-二磷酸醛縮酶基因序列，向Bioneer委託合成基於Thermanaerothrix daxensis的胺基酸序列(序列號1)及鹼基序列(序列號2)、Kosmotoga olearia的胺基酸序列(序列號5)及鹼基序列(序列號6)而插入至作為可表現於大腸桿菌中的載體的pBT7-C-His來製備重組表現載體。
為了誘發蛋白質表現，將大腸桿菌轉形為表現用菌株BL21(DE3)，分別命名為大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_TD_F4E、大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_KO_F4E。於布達佩斯條約下，上述大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_TD_F4E於2017年3月20日以寄存編號KCCM11995P寄存至韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms)，上述大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_KO_F4E於2017年3月24日以寄存編號KCCM11999P寄存。
實施例1-2：重組酶的製備及精製
為了製備重組酶，將於上述實施例1-1中製備的作為轉形體的大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_TD_F4E、大腸桿菌BL21(DE3) /CJ_KO_F4E接種至包括包含胺芐青黴素(ampicillin)的5ml的溶菌酶肉湯(Lysozyme Broth，LB)液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600nm的吸光度成為2.0為止。將種菌培養物的該培養液接種至包括LB與含有作為蛋白質表現調節因子的乳糖的液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。上述培養過程中的攪拌速度為180rpm，且培養溫度保持為37℃。於在4℃下以8,000rpm對培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，再懸浮至包括10mM的咪唑(imidazole)與300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液。利用細胞粉碎機(sonicator)對再懸浮的上述菌體進行粉碎，於4℃下以13,000rpm對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離，之後僅取出上清液。使用多聚組胺酸標籤(His-tag)親和層析法對上述上清液進行精製，以填充劑的10倍的液量流加含有20mM的咪唑及300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液以而去除可實現非特異性結合的蛋白質。最終流加含有250mM的咪唑及300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液進行溶出精製，利用50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液進行透析，之後獲得用以進行酶特性分析的酶。
實施例1-3：自果糖向塔格糖的轉化活性的評估
為了測定於上述實施例1-2中獲得的酶的活性，使用30重量%的果糖，向其添加50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)、1mM 的CoSO4、於上述實施例1-2中分離的20mg/ml的精製酶並於60℃的溫度下反應2小時。對藉由2種果糖-4-差向異構酶(包括CJ_TD_F4E及CJ_KO_F4E)轉化的塔格糖的濃度、與自果糖轉化成塔格糖的轉化率進行確認，CJ_TD_F4E的結果為4.6%，CJ_KO_F4E的結果為16.0%。藉由下式計算上述轉化率：轉化率=塔格糖重量/初始果糖重量×100。
另外，利用HPLC對在反應後殘留的果糖與作為產物的塔格糖進行定量。使用的管柱為Shodex Sugar SP0810，將管柱溫度設為80℃，以1ml/分的流速流加作為流動相的水。於圖1中，利用HPLC層析法檢測及定量以果糖為基質的上述酶的反應峰值。
實施例1-4：溫度對果糖-4-差向異構化活性的影響
為了調查溫度對本申請案的酶的差向異構化活性的影響，分別將於上述實施例1-2中製備的1mg/ml的精製酶添加至包括果糖的50mM的Tris HCl(pH值為8.0)而於50℃至80℃下反應3小時，利用HPLC對反應結束液的塔格糖進行定量分析。結果顯示本申請案的兩種酶均於70℃下表現出最大活性(圖2)。
實施例2：塔格糖-二磷酸醛縮酶的製備及其活性評估
實施例2-1：包括塔格糖-二磷酸醛縮酶基因的重組表現載體及轉形體的製備
為了發掘本申請案的新的耐熱性的果糖-4-差向異構酶，獲得來自Rhodothermus profundi DSM 22212、海洋紅嗜熱鹽菌 (Rhodothermus marinus)ATCC 43812的塔格糖-二磷酸醛縮酶基因資訊而製備可表現於大腸桿菌中的載體及轉形微生物。
具體而言，於註冊於KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)及美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的Rhodothermus profundi、海洋紅嗜熱鹽菌ATCC 43812基因序列中選擇塔格糖-二磷酸醛縮酶基因序列，基於上述兩種微生物的胺基酸序列(序列號7及序列號9)與鹼基序列(序列號8及序列號10)資訊而製備包括上述酶的鹼基序列的可表現於大腸桿菌中的重組載體pBT7-C-His-CJ_RP_F4E、pBT7-C-His-CJ_RM_F4E(Bioneer(股份有限公司)，韓國)。
藉由熱衝擊(heat shock transformation，Sambrook與Russell：分子選殖(Molecular cloning)，2001)將上述各重組載體轉形至大腸桿菌BL21(DE3)後，冷凍儲存於50%甘油中待使用。將上述轉形菌株分別命名為大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_RP_F4E及大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_RM_F4E，於2017年8月11日寄存至作為布達佩斯條約下的國際寄存機關的韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms,KCCM)而分別被賦予KCCM12097P、KCCM12096P。
實施例2-2：重組酶的製備及精製
為了自於上述實施例2-1中製備的轉形菌株大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_RP_F4E及大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_RM_F4E 製備重組酶，將各轉形微生物接種至包括包含胺芐青黴素(ampicillin)抗生素的5mL的LB液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600nm的吸光度成為2.0為止。將進行上述種菌培養所獲得的培養液接種至包括LB與含有作為蛋白質表現調節因子的乳糖的液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於180rpm的攪拌速度及37℃的條件下實施上述種菌培養及正式培養。其次，於在4℃下以8,000rpm對上述培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液將所回收的上述菌體清洗2次，再懸浮至包括10mM的咪唑(imidazole)與300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液。利用細胞粉碎機(sonicator)對再懸浮的上述菌體進行粉碎，於4℃下以13,000rpm進行20分鐘的離心分離，之後僅取出上清液。使用多聚組胺酸標籤親和層析法對上述上清液進行精製，以填充劑的10倍的液量流加含有20mM的咪唑及300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液而去除可實現非特異性結合的蛋白質。接著，進一步流加含有250mM的咪唑及300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液進行溶出精製，之後利用50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液進行透析而分別獲得用以進行酶特性分析的精製酶CJ_RP_F4E及CJ_RM_F4E。
實施例2-3：自果糖向塔格糖的轉化及活性的確認
為了測定於上述實施例2-2中獲得的本申請案的重組酶 CJ_RP_F4E及CJ_RM_F4E的果糖-4-差向異構化活性，於30重量%的果糖中添加50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)、1mM的NiSO4及各20mg/mL的CJ_RP_F4E及CJ_RM_F4E而於60℃下反應10小時。
利用HPLC對反應後殘留的果糖及作為產物的塔格糖進行定量分析。HPLC分析使用Shodex Sugar SP0810管柱，管柱溫度設為80℃，以1mL/min的流速流加作為流動相的水(圖3)。
根據實驗結果，確認到藉由本申請案的酶CJ_RP_F4E及CJ_RM_F4E實現的將果糖轉化成塔格糖的轉化率分別為5.7%及11.1%。
實施例2-4：與溫度對應的重組酶的活性的確認
為了調查溫度對在上述實施例2-2中製備的酶CJ_RP_F4E及CJ_RM_F4E的果糖-4-差向異構化活性的影響力，於包括10重量%的果糖的50mM的Tris HCl(pH值為8.0)緩衝溶液中添加各1mg/mL的CJ_RP_F4E及CJ_RM_F4E而於45℃、50℃、55℃、60℃、65℃及70℃的各溫度下反應3小時。於上述反應結束後，利用HPLC對反應物中的塔格糖進行定量分析。
根據實驗結果，CJ_RP_F4E於65℃下表現出最大活性，於60℃至70℃下保持最大活性的70%以上，且於所有溫度範圍內保持最大活性的50%以上(圖4a)。並且，CJ_RM_F4E於70℃下表現出最大活性，於55℃至70℃下保持最大活性的70%以上，於所有溫度範圍內保持最大活性的40%以上(圖4b)。
實施例2-5：藉由添加金屬離子實現的本發明的重組酶的活性的確認
為了確認各金屬離子對在上述實施例2-2中製備的酶CJ_RP_F4E及CJ_RM_F4E的果糖-4-差向異構化活性的影響力，於包括10重量%的果糖的50mM的Tris HCl(pH值為8.0)緩衝溶液中添加各1mg/mL的CJ_RP_F4E及CJ_RM_F4E、與各1mM的各種金屬離子(ZnSO4、MgCl2、MnCl2、NH4Cl、CaCl2、Na2SO4、CuSO4、MgSO4、MnSO4、(NH4)2SO4或NiSO4)而於60℃下反應5小時。於反應結束後，利用HPLC對反應物的塔格糖進行定量分析。
根據實驗結果，CJ_RP_F4E因添加NiSO4而活性增加，從而確認到鎳離子可增加活性(圖5a)，CJ_RM_F4E因分別添加MnSO4及NiSO4而活性增加，從而確認到錳離子或鎳離子可增加本申請案的重組酶的活性(圖5b)。
實施例3：塔格糖-二磷酸醛縮酶的製備及其活性評估
實施例3-1：包括塔格糖-二磷酸醛縮酶基因的重組表現載體及轉形體的製備
本發明者等人獲得來自Limnochorda pilosa DSM 28787的塔格糖-二磷酸醛縮酶基因資訊而製備可表現於大腸桿菌中的重組載體及轉形微生物。
更具體而言，以註冊於KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)及歐洲核酸檔案庫(European Nucleotide Archive，ENA)的Limnochorda pilosa基因序列為對象而選擇塔格糖-二磷酸醛縮酶基因序列，並基於來自Limnochorda pilosa的塔格糖-二磷酸醛縮酶CJ_LP_F4E的胺基酸序列(序列號11)及鹼基序列(序列號12)製備包括上述酶的鹼基序列的可表現於大腸桿菌中的重組表現載體pBT7-C-His-CJ_LP_F4E(Bioneer(股份有限公司)，韓國)。
藉由熱衝擊(heat shock transformation，Sambrook與Russell：分子選殖，2001)將上述重組載體轉形至大腸桿菌BL21(DE3)後，冷凍保管於50%甘油中待使用。將上述轉形菌株命名為大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_LP_F4E，於2017年8月11日寄存至作為布達佩斯條約下的國際寄存機關的韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms,KCCM)而被賦予寄存編號KCCM12095P。
實施例3-2：重組酶的製備及精製
為了自來自根據上述實施例3-1而製備的轉形菌株大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_LP_F4E的CJ_LP_F4E獲得本申請案的重組酶，將上述各轉形微生物接種至包括包含胺芐青黴素(ampicillin)抗生素的5mL的LB液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600nm的吸光度成為2.0為止。將種菌培養的該培養液接種至包括LB與含有作為蛋白質表現調節因子的乳糖的液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於180rpm的攪拌速度及37℃的條件下實施上述種菌培養及正式培養。接著，於在 4℃下以8,000rpm對上述培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，再懸浮至包括10mM的咪唑(imidazole)與300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液。利用細胞粉碎機(sonicator)對再懸浮的上述菌體進行粉碎，於4℃下以13,000rpm對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離，之後僅取出上清液。於使用多聚組胺酸標籤親和層析法對上述上清液進行精製後，以填充劑的10倍的液量流加含有20mM的咪唑及300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液而去除可實現非特異性結合的蛋白質。其次，進一步流加含有250mM的咪唑及300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液進行溶出精製，利用50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液進行透析而獲得用以進行酶特性分析的精製酶CJ_LP_F4E。
實施例3-3：重組酶的自果糖向塔格糖的轉化活性的評估
為了測定於上述實施例3-2中獲得的本申請案的重組酶CJ_LP_F4E的活性，於30重量%的果糖中添加50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)、1mM的NiSO4及20mg/mL的CJ_LP_F4E而於60℃下反應10小時。
利用HPLC對在反應後殘留的果糖及作為產物的塔格糖進行定量。HPLC分析利用Shodex Sugar SP0810管柱，管柱溫度為80℃，以1mL/min的流速流加作為流動相的水(圖6)。
根據實驗結果，確認到於利用CJ_LP_F4E的情形時，藉由本申請案的各酶而自果糖轉化成塔格糖的轉化率為9.5%。
實施例3-4：與溫度對應的重組酶的活性的確認
為了調查溫度對在上述實施例3-2中獲得的本申請案的重組酶CJ_LP_F4E的果糖-4-差向異構化活性的影響力，於包括10重量%的果糖的50mM的Tris HCl(pH值為8.0)緩衝溶液中添加1mg/mL的CJ_LP_F4E而於45℃、50℃、55℃、60℃及70℃的各溫度下反應3小時。於反應結束後，利用HPLC對反應液中的塔格糖進行定量分析。
根據實驗結果，可確認到本申請案的CJ_LP_F4E酶於60℃下表現出最大活性，CJ_LP_F4E於45℃至70℃下保持最大活性的50%以上(圖7a)。
實施例3-5：藉由添加金屬離子實現的重組酶的活性的確認
已知先前公知的如葡萄糖異構酶及阿拉伯糖異構酶的異構酶、及如阿洛酮糖3-差向異構酶的差向異構酶需要金屬離子。因此，亦對在上述實施例3-2中獲得的本申請案的重組酶CJ_LP_F4E確認金屬離子是否對果糖-4-差向異構化活性產生影響。
更具體而言，於包括10重量%的果糖的50mM的Tris HCl(pH值為8.0)緩衝溶液中添加2mg/mL的CJ_LP_F4E，且分別添加各1mM的各種金屬離子NiSO4、CaCl2、ZnSO4、MgSO4、 MnSO4、FeSO4、CuSO4或(NH4)2SO4而測定酶活性。將不進行金屬離子處理的情形設定為對照組。於上述反應結束後，利用HPLC對反應液中的塔格糖進行定量分析。
根據實驗結果可知，本申請案的CJ_LP_F4E酶藉由添加各MnSO4、NiSO4而活性增加，從而需要錳離子或鎳離子等金屬離子。特別是，確認到於添加NiSO4的情形時表現出最大活性(圖7b)。
實施例4：塔格糖-二磷酸醛縮酶的製備及其活性評估
實施例4-1：包括塔格糖-二磷酸醛縮酶基因的重組載體及重組微生物的製備
為了發掘新的耐熱性的果糖-4-差向異構酶，獲得來自Caldithrix abyssi DSM 13497及Caldicellulosiruptor kronotskyensis DSM 18902的塔格糖-二磷酸醛縮酶基因資訊而製備可表現於大腸桿菌中的載體及轉形微生物。
具體而言，於註冊於KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)及NCBI(National Center for Biotechnology Information)中的Caldithrix abyssi及Caldicellulosiruptor kronotskyensis基因序列中選擇塔格糖-二磷酸醛縮酶基因序列，並基於上述微生物的各胺基酸序列(序列號13及序列號15)與鹼基序列(序列號14及序列號16)資訊而合成包括上述酶的鹼基序列的可表現大腸桿菌的重組載體pBT7-C-His-CJ_Cab_F4E及pBT7-C-His-CJ_Ckr_F4E(Bioneer(股份有限公司)，韓國)。
藉由熱衝擊(heat shock transformation，Sambrook與Russell：分子選殖，2001)將各重組載體轉形至大腸桿菌BL21(DE3)而製備重組微生物後，冷凍保存於50%甘油中而待使用。將上述重組微生物分別命名為大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_Cab_F4E及大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_Ckr_F4E，於2017年9月13日寄存至作為布達佩斯條約下的國際寄存機關的韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms,KCCM)而分別被賦予寄存編號KCCM12107P及KCCM12108P。
實施例4-2：重組酶的製備及精製
為了自於上述實施例4-1中製備的各重組微生物大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_Cab_F4E及大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_Ckr_F4E製備重組酶CJ_Cab_F4E及CJ_Ckr_F4E，將各重組微生物接種至包括包含胺芐青黴素(ampicillin)抗生素的5mL的LB液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600nm的吸光度成為2.0為止。將種菌培養的該培養液接種至包括LB與含有作為蛋白質表現調節因子的乳糖的液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於180rpm的攪拌速度及37℃的條件下實施上述種菌培養及正式培養。此後，於在4℃下以8,000rpm對上述培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，懸浮至包括10mM的咪唑(imidazole)與300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液。利用細胞粉碎機(sonicator)對懸浮的上述 菌體進行粉碎，於4℃下以13,000rpm對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離，之後僅取出上清液。使用多聚組胺酸標籤親和層析法對上述上清液進行精製，以填充劑的10倍的液量流加含有20mM的咪唑及300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液而去除可實現非特異性結合的蛋白質。此後，進一步流加含有250mM的咪唑及300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液進行溶出精製，利用50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液進行透析而獲得用以進行酶特性分析的精製酶CJ_Cab_F4E及CJ_Ckr_F4E。
實施例4-3：重組酶的自果糖向塔格糖的轉化活性的評估
為了測定於上述實施例4-2中獲得的重組酶CJ_Cab_F4E及CJ_Ckr_F4E的果糖-4-差向異構化活性，於10重量%的果糖中添加50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)、1mM的MnSO4及各5mg/ml的CJ_Cab_F4E及CJ_Ckr_F4E而於60℃下反應24小時。
利用HPLC對在反應後殘留的果糖及作為產物的塔格糖進行定量分析。HPLC分析利用Shodex Sugar SP0810管柱，管柱溫度設為80℃，以1mL/min的流速流加作為流動相的水。
根據結果，確認到藉由重組酶CJ_Cab_F4E及CJ_Ckr_F4E實現的自果糖向塔格糖的轉化率分別為3.8%及4.0%(圖8a及圖8b)。
實施例4-4：與溫度對應的重組酶的活性的確認
為了調查溫度對在上述實施例4-2中獲得的重組酶CJ_Cab_F4E及CJ_Ckr_F4E的果糖-4-差向異構化活性的影響力，於包括5重量%的果糖的50mM的Tris HCl(pH值為8.0)緩衝溶液中添加各5mg/ml的CJ_Cab_F4E及CJ_Ckr_F4E而分別於37℃、40℃、50℃、55℃、60℃及70℃下反應5小時。利用HPLC對反應結束液中的塔格糖進行定量分析。根據結果，確認到CJ_Cab_F4E於55℃下表現出最大活性，CJ_Ckr_F4E於60℃下表現出最大活性，兩種酶均於50℃至70℃下表現出最大活性的75%以上的活性(表1、圖9a及9b)。
Figure 107111525-A0305-02-0038-1
實施例4-5：藉由添加金屬實現的本申請案的重組酶的活性的確認
確認於上述實施例4-2中獲得的重組酶CJ_Cab_F4E及CJ_Ckr_F4E的金屬是否對果糖-4-差向異構化活性產生影響。
具體而言，於包括5重量%的果糖的50mM的Tris HCl(pH值為8.0)緩衝溶液中添加各5mg/mL的CJ_Cab_F4E及CJ_Ckr_F4E與1mM的金屬離子(MgSO4或MnSO4)而於60℃下反應5小時。將不進行金屬離子處理的情形設定為對照組(w/o)。於上述反應結束後，利用HPLC對反應結束液的塔格糖進行定量分析。
結果顯示CJ_Cab_F4E藉由添加MnSO4而活性增加約2倍、藉由添加MgSO4而活性增加10倍以上，從而確認到錳離子或鎂離子(或其鹽)可增加CJ_Cab_F4E的果糖-4-差向異構化活性(圖10a)。另外，CJ_Ckr_F4E於添加MgSO4時表現出與對照組相似的活性，但藉由添加MnSO4而活性增加約2倍，從而確認到錳離子(或其鹽)可增加CJ_Ckr_F4E的果糖-4-差向異構化活 性(圖10b)。
實施例5：塔格糖-二磷酸醛縮酶的製備及其活性評估
實施例5-1：包括塔格糖-二磷酸醛縮酶基因的重組載體及重組微生物的製備
為了發掘新的耐熱性的果糖-4-差向異構酶，獲得來自Caldilinea aerophila的塔格糖-二磷酸醛縮酶基因資訊而製備可表現於大腸桿菌中的載體及轉形微生物。
具體而言，於註冊於KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)及NCBI(National Center for Biotechnology Information)的Caldilinea aerophila基因序列中選擇塔格糖-二磷酸醛縮酶基因序列，基於上述各微生物的胺基酸序列(序列號17)與鹼基序列(序列號18)資訊而選殖包括上述酶的鹼基序列的可表現於大腸桿菌中的重組載體pET21a-CJ_CAE_F4E。
為了使用重組表現載體，使用Caldilinea aerophila基因組(Genomic)DNA，並利用引子1：ATATACATATGTCAACACTTCGCCACATCATTTTGCGA與引子2：TGGTGCTCGAGTCCAAGCAATGTAGCGGCGTCGTA，其中PCR條件如下：進行於94℃下變性2分鐘、於94℃下變性30秒、於65℃下黏合30秒及於72℃下延長2分鐘的循環35次之後，最後於72℃下執行5分鐘的延長反應。
藉由熱衝擊(heat shock transformation，Sambrook與Russell：分子選殖，2001)將上述重組載體轉形至大腸桿菌BL21 (DE3)而製備重組微生物後，冷凍保存於50%甘油中而待使用。將上述重組微生物命名為大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_CAE_F4E，於2018年3月23日寄存至作為布達佩斯條約下的國際寄存機關的韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)而被賦予寄存編號KCCM12233P。
實施例5-2：重組酶的製備及精製
為了自於上述實施例5-1中製備的各重組微生物大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_CAE_F4E製備重組酶CJ_CAE_F4E，將重組微生物接種至包括包含胺芐青黴素(ampicillin)抗生素的5mL的LB液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600nm的吸光度成為2.0為止。將種菌培養的該培養液接種至包括LB與含有作為蛋白質表現調節因子的乳糖的液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於180rpm的攪拌速度及37℃的條件下實施上述種菌培養及正式培養。此後，於在4℃下以8,000rpm對上述培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，懸浮至包括10mM的咪唑(imidazole)與300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液。利用細胞粉碎機(sonicator)對懸浮的上述菌體進行粉碎，於4℃下以13,000rpm對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離，之後僅取出上清液。使用多聚組胺酸標籤親和層析法對上述上清液進行精製，以填充劑的10倍的液量流加含有20mM的咪唑及300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4 (pH值為8.0)緩衝溶液而去除可實現非特異性結合的蛋白質。此後，進一步流加含有250mM的咪唑及300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液進行溶出精製，利用50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液進行透析而獲得用以進行酶特性分析的精製酶CJ_CAE_F4E。
實施例5-3：重組酶的自果糖向塔格糖的轉化活性的評估
為了測定於上述實施例5-2中獲得的重組酶CJ_CAE_F4E的果糖-4-差向異構化活性，於10重量%的果糖中添加50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)、1mM的MnSO4及20mg/ml的CJ_CAE_F4E而於60℃下反應24小時。
利用HPLC對在反應後殘留的果糖及作為產物的塔格糖進行定量分析。HPLC分析利用Shodex Sugar SP0810管柱，管柱溫度設為80℃，以1mL/min的流速流加作為流動相的水。
根據結果，確認到藉由重組酶CJ_CAE_F4E實現的自果糖向塔格糖的轉化率為1.8%(圖11)。
實施例6：塔格糖-二磷酸醛縮酶的製備及其活性評估
實施例6-1：包括塔格糖-二磷酸醛縮酶基因的重組載體及重組微生物的製備
為了發掘新的耐熱性的果糖-4-差向異構酶，獲得來自熱產硫化氫熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)的塔格糖-二磷酸醛縮酶基因資訊而製備可表現於大腸桿菌中的 載體及轉形微生物。
具體而言，於註冊於KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)及NCBI(National Center for Biotechnology Information)的熱產硫化氫熱厭氧桿菌基因序列中選擇塔格糖-二磷酸醛縮酶基因序列，基於上述微生物的胺基酸序列(序列號19)與鹼基序列(序列號20)資訊而合成包括上述酶的鹼基序列的可表現於大腸桿菌中的重組載體pBT7-C-His-CJ_TATH_F4E(Bioneer(股份有限公司)，韓國)。
藉由熱衝擊(heat shock transformation，Sambrook與Russell：分子選殖，2001)將上述重組載體轉形至大腸桿菌BL21(DE3)而製備重組微生物後，冷凍保存於50%甘油中而待使用。將上述重組微生物命名為大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_TATH_F4E，於2018年3月23日寄存至作為布達佩斯條約下的國際寄存機關的韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)而被賦予寄存編號KCCM12234P。
實施例6-2：重組酶的製備及精製
為了自於上述實施例6-1中製備的重組微生物大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_TATH_F4E製備重組酶CJ_TATH_F4E，將重組微生物接種至包括包含胺芐青黴素(ampicillin)抗生素的5mL的LB液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600nm的吸光度成為2.0為止。將種菌培養的該培養液接種至包括LB與含有作為蛋白質表現調節因子的乳糖的液體培養 基的培養燒瓶而進行正式培養。於180rpm的攪拌速度及37℃的條件下實施上述種菌培養及正式培養。此後，於在4℃下以8,000rpm對上述培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，懸浮至包括10mM的咪唑(imidazole)與300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液。利用細胞粉碎機(sonicator)對懸浮的上述菌體進行粉碎，於4℃下以13,000rpm對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離，之後僅取出上清液。利用多聚組胺酸標籤親和層析法對上述上清液進行精製，以填充劑的10倍的液量流加含有20mM的咪唑及300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液而去除可實現非特異性結合的蛋白質。此後，進一步流加含有250mM的咪唑及300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液進行溶出精製，利用50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液進行透析而獲得用以進行酶特性分析的精製酶CJ_TATH_F4E。
實施例6-3：重組酶的自果糖向塔格糖的轉化活性的評估
為了測定於上述實施例6-2中獲得的重組酶CJ_TATH_F4E的果糖-4-差向異構化活性，於30重量%的果糖中添加50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)、1mM的MnSO4及5mg/ml的CJ_TATH_F4E而於60℃下反應24小時。
利用HPLC對在反應後殘留的果糖及作為產物的塔格糖 進行定量分析。HPLC分析利用Shodex Sugar SP0810管柱，管柱溫度設為80℃，以1mL/min的流速流加作為流動相的水。
根據結果，確認到藉由重組酶CJ_TATH_F4E實現的自果糖向塔格糖的轉化率為2.9%(圖12)。
實施例7：塔格糖-二磷酸醛縮酶的製備及其活性評估
實施例7-1：包括塔格糖-二磷酸醛縮酶基因的重組載體及重組微生物的製備
為了發掘新的耐熱性的果糖-4-差向異構酶，獲得來自酸桿菌細菌(Acidobacteriales bacterium)的塔格糖-二磷酸醛縮酶基因資訊而製備可表現大腸桿菌的載體及轉形微生物。
具體而言，於註冊於KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)及NCBI(National Center for Biotechnology Information)的酸桿菌細菌基因序列中選擇塔格糖-二磷酸醛縮酶基因序列，基於上述微生物的胺基酸序列(序列號3)與鹼基序列(序列號4)資訊而合成包括上述酶的鹼基序列的可表現於大腸桿菌中的重組載體pBT7-C-His-CJ_AB_F4E(Bioneer(股份有限公司)，韓國)。
藉由熱衝擊(heat shock transformation，Sambrook與Russell：分子選殖，2001)將上述重組載體轉形至大腸桿菌BL21(DE3)而製備重組微生物後，冷凍保存於50%甘油中而待使用。將上述重組微生物命名為大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_AB_F4E，於2018年3月23日寄存至作為布達佩斯條約下的國際寄存機關的韓 國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)而被賦予寄存編號KCCM12237P。
實施例7-2：重組酶的製備及精製
為了自於上述實施例7-1中製備的重組微生物大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_AB_F4E製備重組酶CJ_AB_F4E，將重組微生物接種至包括包含胺芐青黴素(ampicillin)抗生素的5mL的LB液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600nm的吸光度成為2.0為止。將種菌培養的該培養液接種至包括LB與含有作為蛋白質表現調節因子的乳糖的液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於180rpm的攪拌速度及37℃的條件下實施上述種菌培養及正式培養。此後，於在4℃下以8,000rpm對上述培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，懸浮至包括10mM的咪唑(imidazole)與300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液。利用細胞粉碎機(sonicator)對懸浮的上述菌體進行粉碎，於4℃下以13,000rpm對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離，之後僅取出上清液。使用多聚組胺酸標籤親和層析法對上述上清液進行精製，以填充劑的10倍的液量流加含有20mM的咪唑及300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液而去除可實現非特異性結合的蛋白質。此後，進一步流加含有250mM的咪唑及300mM的NaCl的50mM的NaH2PO4(pH值為8.0)緩衝溶液進行溶出精製，利用50mM 的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液進行透析而獲得用以進行酶特性分析的精製酶CJ_AB_F4E。
實施例7-3：重組酶的自果糖向塔格糖的轉化活性的評估
為了測定於上述實施例7-2中獲得的重組酶CJ_AB_F4E的果糖-4-差向異構化活性，於1重量%的果糖中添加50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)、1mM的MnSO4及10mg/ml的CJ_AB_F4E而於55℃下反應24小時。
利用HPLC對在反應後殘留的果糖及作為產物的塔格糖進行定量分析。HPLC分析利用Shodex Sugar SP0810管柱，管柱溫度設為80℃，以1mL/min的流速流加作為流動相的水。
根據結果，確認到藉由重組酶CJ_AB_F4E實現的自果糖向塔格糖的轉化率為8%(圖13)。
根據上述說明，本申請案所屬的技術領域內的業者應可理解可不變更本申請案的技術思想或必要特徵而以其他具體的形態實施本申請案。與此相關，僅應理解為以上所記述的實施例於所有方面均為示例，並無限定性含義。本申請案的範圍應解釋為相較上述詳細說明而根據下文敍述的發明申請專利範圍的含義、範圍及其等效概念導出的所有經修飾或經修飾的形態均包括於本申請案的範圍內。
【生物材料寄存】
[國外寄存資訊/國內寄存資訊]
寄存機關名稱：韓國微生物保存中心/財團法人食品工業發展研究所
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寄存日期：2017年9月13日/2018年6月29日
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寄存編號：KCCM12233P/BCRC940680
寄存日期：2018年3月23日/2018年6月29日
寄存機關名稱：韓國微生物保存中心/財團法人食品工業發展研究所
寄存編號：KCCM12234P/BCRC940681
寄存日期：2018年3月23日/2018年6月29日
寄存機關名稱：韓國微生物保存中心/財團法人食品工業發展研究所
寄存編號：KCCM12237P/BCRC940682
寄存日期：2018年3月23日/2018年6月29日
<110> CJ第一製糖
<120> 用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法
<150> KR 17/0042166
<151> 2017-03-31
<150> KR 17/0111489
<151> 2017-08-31
<150> KR 17/0111494
<151> 2017-08-31
<150> KR 17/0158765
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<160> 20
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<213> 人工序列
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<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的胺基酸序列，CJ_TD_F4E，來自Thermanaerothrix daxensis
<400> 1
Figure 107111525-A0305-02-0050-2
Figure 107111525-A0305-02-0051-3
Figure 107111525-A0305-02-0052-4
<210> 2
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的DNA序列，CJ_TD_F4E，來自Thermanaerothrix daxensis
<400> 2
Figure 107111525-A0305-02-0052-5
Figure 107111525-A0305-02-0053-6
<210> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的胺基酸序列，CJ_AB_F4E，來自Acidobacteriales bacterium
<400> 3
Figure 107111525-A0305-02-0054-7
Figure 107111525-A0305-02-0055-8
<210> 4
<211> 1296
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的DNA序列，CJ_AB_F4E，來自Acidobacteriales bacterium
<400> 4
Figure 107111525-A0305-02-0056-9
Figure 107111525-A0305-02-0057-10
<210> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的胺基酸序列，CJ_KO_F4E，來自Kosmotoga olearia
<400> 5
Figure 107111525-A0305-02-0057-11
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Figure 107111525-A0305-02-0059-13
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的DNA序列，CJ_KO_F4E，來自Kosmotoga olearia
<400> 6
Figure 107111525-A0305-02-0059-14
Figure 107111525-A0305-02-0060-15
<210> 7
<211> 420
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的胺基酸序列，CJ_RP_F4E，來自Rhodothermus profundi
<400> 7
Figure 107111525-A0305-02-0060-16
Figure 107111525-A0305-02-0061-17
Figure 107111525-A0305-02-0062-18
<210> 8
<211> 1263
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的DNA序列，CJ_RP_F4E，來自Rhodothermus profundi
<400> 8
Figure 107111525-A0305-02-0062-19
Figure 107111525-A0305-02-0063-20
<210> 9
<211> 420
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的胺基酸序列，CJ_RM_F4E，來自Rhodothermus marinus
<400> 9
Figure 107111525-A0305-02-0064-21
Figure 107111525-A0305-02-0065-22
Figure 107111525-A0305-02-0066-23
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的DNA序列，CJ_RM_F4E，來自Rhodothermus marinus
<400> 10
Figure 107111525-A0305-02-0066-24
Figure 107111525-A0305-02-0067-25
<210> 11
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的胺基酸序列，CJ_LP_F4E，來自Limnochorda pilosa
<400> 11
Figure 107111525-A0305-02-0067-26
Figure 107111525-A0305-02-0068-27
Figure 107111525-A0305-02-0069-28
<210> 12
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的DNA序列，CJ_LP_F4E，來自Limnochorda pilosa
<400> 12
Figure 107111525-A0305-02-0069-29
Figure 107111525-A0305-02-0070-30
<210> 13
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的胺基酸序列，CJ_Cab_F4E，來自Caldithrix abyssi
<400> 13
Figure 107111525-A0305-02-0071-31
Figure 107111525-A0305-02-0072-32
<210> 14
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的DNA序列，CJ_Cab_F4E，來自Caldithrix abyssi
<400> 14
Figure 107111525-A0305-02-0073-33
Figure 107111525-A0305-02-0074-34
<210> 15
<211> 429
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的胺基酸序列，CJ_Ckr_F4E，來自Caldicellulosiruptor
kronotskyensis
<400> 15
Figure 107111525-A0305-02-0074-35
Figure 107111525-A0305-02-0075-36
Figure 107111525-A0305-02-0076-37
<210> 16
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的DNA序列，CJ_Ckr_F4E，來自Caldicellulosiruptor
kronotskyensis
<400> 16
Figure 107111525-A0305-02-0076-38
Figure 107111525-A0305-02-0077-39
<210> 17
<211> 408
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的胺基酸序列，CJ_CAE_F4E，來自Caldilinea aerophila
<400> 17
Figure 107111525-A0305-02-0077-40
Figure 107111525-A0305-02-0078-41
Figure 107111525-A0305-02-0079-42
<210> 18
<211> 1227
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的DNA序列，CJ_CAE_F4E，來自Caldilinea aerophila
<400> 18
Figure 107111525-A0305-02-0079-43
Figure 107111525-A0305-02-0080-44
<210> 19
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的胺基酸序列，CJ_TATH_F4E，來自Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus
<400> 19
Figure 107111525-A0305-02-0081-45
Figure 107111525-A0305-02-0082-46
Figure 107111525-A0305-02-0083-47
<210> 20
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔格糖-二磷酸醛縮酶的DNA序列，CJ_TATH_F4E，來自Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus
<400> 20
Figure 107111525-A0305-02-0083-48
Figure 107111525-A0305-02-0084-49

Claims (7)

  1. 一種用於生產塔格糖的組成物的用途，所述組合物包括塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現所述塔格糖-二磷酸醛縮酶的微生物或所述微生物的培養物，其中所述塔格糖-二磷酸醛縮酶具有果糖-4-差向異構酶活性。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中所述組成物更包括果糖。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其包括一種以上的由序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9、序列號11、序列號13、序列號15、序列號17或序列號19的胺基酸序列構成的塔格糖-二磷酸醛縮酶。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中所述塔格糖-二磷酸醛縮酶來自下者：來自嗜熱菌屬(Thermanaerothrix)的酶或其變異體、來自厭氧繩菌屬(Anaerolinea)的酶或其變異體、來自科莫託加菌屬(Kosmotoga)的酶或其變異體、來自紅嗜熱鹽菌屬(Rhodothermus)的酶或其變異體、來自林諾喬達菌屬(Limnochorda)的酶或其變異體、來自暖發菌屬(Caldithrix)或熱解纖維素菌屬(Caldicellulosiruptor)的酶或其變異體。
  5. 一種塔格糖的製備方法，其包括使果糖與塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現所述塔格糖-二磷酸醛縮酶的微生物或所述微生物的培養物接觸而將所述果糖轉化成塔格糖的步驟，其中所述塔格糖-二磷酸醛縮酶具有果糖-4-差向異構酶活性。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的塔格糖的製備方法，其中所述接觸是於pH5.0至pH9.0的條件下、30℃至80℃的溫度條件下或0.5小時至48小時的條件下執行。
  7. 一種用於生產塔格糖的組成物，其包括塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現所述塔格糖-二磷酸醛縮酶的微生物或所述微生物的培養物，其中包括一種以上的由序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9、序列號11、序列號13、序列號15、序列號17或序列號19的胺基酸序列構成的塔格糖-二磷酸醛縮酶，其中所述塔格糖-二磷酸醛縮酶具有果糖-4-差向異構酶活性。
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