KR101987586B1

KR101987586B1 - 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법

Info

Publication number: KR101987586B1
Application number: KR1020180037144A
Authority: KR
Inventors: 양성재; 이영미; 박일향; 조현국; 김성보; 이찬형; 최은정
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2019-06-10
Also published as: BR112019020520B1; EP3604514A1; TWI700370B; US20200024627A1; KR20180111678A; JP2020511986A; CN111344405B; US11180785B2; EP3604514A4; CA3058415A1; BR112019020520A2; CN111344405A; MX2019011758A; JP6927467B2; TW201842188A; WO2018182354A1

Abstract

본 출원은 과당-4-에피머화 효소를 포함하는 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법에 관한 것이다.

Description

타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법 {A composition for preparing tagatose and Methods for producing tagatose using The Same}

타가토스는 우유, 치즈 및 카카오 등의 식품, 그리고 사과와 귤과 같은 단맛이 나는 천연과일에 소량 존재하는 천연감미료이다. 타가토스의 칼로리는 1.5 kcal/g으로 설탕의 1/3 수준이며, GI(Glycemic index, 혈당지수)는 3으로 설탕의 5% 수준인데 반해, 설탕과 물리적 성질이 유사하고, 유사한 단맛을 내면서 다양한 건강 기능성을 가지고 있기 때문에 건강과 맛을 동시에 만족시킬 수 있는 설탕 대체 감미료로 여러 제품에 이용될 수 있다.

종래 공지되거나 공용된 타가토스의 제조방법은 갈락토스를 주원료로 한 화학적 방법(촉매 반응)과 생물학적 방법(이성화 효소반응)이 있다(PCT WO 2006/058092, 대한민국 등록특허 제10-0964091호 및 제10-1368731호 참조). 그러나 상기 종래의 제조방법에서 주원료로 사용되는 갈락토스의 기초 원료가 되는 유당은 국제 시장에서의 원유(原乳) 및 유당의 생산량, 수요 및 공급량 등에 따라 가격이 불안정하여 안정적 수급에 한계가 있으므로, 보편화된 당(설탕, 포도당, 과당 등)을 원료로 타가토스를 제조할 수 있는 새로운 방법이 요구되어 연구된 바 상기 문헌들은 포도당과 갈락토스 및 과당으로부터 각각 갈락토스, 사이코스 및 타가토스를 생산하는 방법을 개시하고 있다(대한민국 등록특허 제10-744479호, 제10-1057873호 및 제10-1550796호).

한편, 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase: EC 4.1.2.40)는 하기 [반응식 1]과 같이 D-타가토스 1,6-이인산(D-tagatose 1,6-bisphosphate)를 기질로 하여 글리세론 포스페이트(glycerone phosphate)와 D-글리세랄데하이드 3-포스페이트(D-glyceraldehyde 3-phosphate)를 생산하고, 갈락토스 대사에 관여함이 공지된 바 있으나, 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈가 타가토스를 생산하는 활성을 가지는지에 대한 연구는 전무하다.

[반응식 1]

D-타가토스 1,6-이인산 <=> 글리세론 포스페이트 + D-글리세랄데하이드 3-포스페이트

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 과당을 타가토스로 전환시키는 활성을 가지는 효소를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase: EC 4.1.2.40)가 과당을 타가토스로 전환시키는 기능이 있음을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.

PCT WO 2006/058092 A2 대한민국 등록특허 제10-0964091호 (2010.06.08. 등록) 대한민국 등록특허 제10-1368731 (2014.2.24. 등록) 대한민국 등록특허 제10-744479 (2007.7.25. 등록) 대한민국 등록특허 제10-1057873 (2011.8.11. 등록) 대한민국 등록특허 제10-1550796호 (2015.09.01. 등록)

Kim et al., Novel Activity of UDP-Galactose-4-Epimerase for Free Monosaccharide and Activity Improvement by Active Site-Saturation Mutagenesis, 2011, Appl Biochem Biotechnol, 163:444-451

본 출원의 목적은 타가토스 제조에 유용한 조성물을 제공하기 위한 것으로, 상기 조성물은 타가토스-이인산 알돌레이즈, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함한다.

본 출원의 다른 목적은 본 출원의 과당-4-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 과당과 접촉시켜 과당을 타가토스로 전환시키는 단계를 포함하는 타가토스의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.

이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 실시 양태의 설명 및 실시 형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 출원의 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 일 양태로서 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공한다.

상기 타가토스-이인산 알돌레이즈는 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase: EC 4.1.2.40)로서 예를 들어 과당을 기질로 하여 타가토스를 생산할 수 있다면 한정 없이 포함될 수 있다. 구체적으로 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈는 기질인 과당으로부터 타가토스로의 전환율(전환율=타가토스 중량/초기 과당 중량 *100)이 0.01% 이상, 구체적으로 0.1% 이상, 더욱 구체적으로 0.3% 이상인 것일 수 있다. 보다 구체적으로 전환율은 0.01% 내지 40%의 범위, 0.1% 내지 30%의 범위, 0.3% 내지 25%의 범위, 또는 0.3% 내지 20%의 범위일 수 있다.

구체적으로 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 또는 19의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드이거나, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 또는 19 의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 상동성을 가지며, 상기 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 또는 19 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능(즉, 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 활성)을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 더불어, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드로서, 과당-4-에피머화 활성을 가지는 폴리펩티드도 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 또는 19의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-이인산 알돌레이즈 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

본원에 이르러 '타가토스-이인산 알돌레이즈'가 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 과당을 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 활성을 나타냄을 밝혀내었으며 따라서 본원에서는'과당-4-에피머화 효소'와 호환적으로 사용될 수 있다.

본 출원에서 용어, "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있고, 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 상기 하이브리드화에 사용된 프로브는, 염기서열의 상보 서열의 일부일 수 있다. 이러한 프로브는, 공지 서열에 근거하여 만들어진 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여, 이러한 염기 서열을 포함하는 유전자 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 작제될 수 있다. 또한, 당업자는 온도 및 세척 용액 염 농도를 프로브의 길이와 같은 요소에 따라 필요할 경우 조절할 수 있다.

본 출원에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다(예: BLAST 2.0). 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

일 구현예로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소는 내열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, 썸언에어로드릭스 sp. 유래 효소 또는 그 변이체, 코스모토가 sp. 유래 효소 또는 그 변이체, 로도써무스 sp. 유래의 효소 또는 그 변이체, 림노초르다 sp. 유래의 효소 또는 그 변이체, 칼디스리스 sp, 칼디리네 sp, 써모언에로박터 sp, 에시도박테리알레스 sp또는 칼디셀룰로시럽터 sp. 유래의 효소 또는 그 변이체일 수 있다. 구체적으로는, 썸언에어로드릭스 데센시스(Thermanaerothrix daxensis), 코스모토가 올레아리아(Kosmotoga olearia), 로도써무스 프로펀디(Rhodothermus profundi), 로도써무스 마리너스(Rhodothermus marinus), 림노초르다 필오사(Limnochorda pilosa), 칼디스리스 아비시 (Caldithrix abyssi), 칼디리네 에로필라 (Caldilinea aerophila) 써모언에로박터 써모하이드로썰퓨리쿠스 (Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus), 에시도박테리알레스 박테리움 (Acidobacteriales bacterium) 또는 칼디셀룰로시럽터 크로노스키엔시스 (Caldicellulosiruptor kronotskyensis) 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있다. 보다 구체적으로는, Rhodothermus profundi DSM 22212, 또는 Rhodothermus marinus ATCC 43812 유래의 효소 또는 그 변이체일 수 있다.

본원의 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이체는 D-프럭토스(과당)의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 D-타가토스로 전환시키는 특징이 있다. 상기 과당-4-에피머화 효소는 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase) 활성을 가지며, D-타가토스 1,6-이인산(D-tagatose 1,6-bisphosphate)를 기질로 하여 글리세론 포스페이트(glycerone phosphate)와 D-글리세랄데하이드 3-포스페이트(D-glyceraldehyde 3-phosphate)를 생산하고, 갈락토스 대사에 관여하는 것으로 알려져 있었다. 본 출원에 이르러, 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 새로이 밝혀 내었다. 이에, 본 출원의 일 구현예는 과당으로부터 타가토스를 제조함에 있어서 타가토스-이인산 알돌레이즈를 과당-4-에피머화 효소로 사용하는 것을 포함하는 타가토스-이인산 알돌레이즈의 신규 용도에 관한 것이다. 또한, 본 출원의 일 구현예는 타가토스-이인산 알돌레이즈를 과당-4-에피머화 효소로 사용하여 과당으로부터 타가토스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소는 내열성이 높은 효소일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소는 50℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100% 또는 75% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소는 55℃ 내지 60℃, 60℃ 내지 70℃, 55℃, 60℃, 또는 70℃에서 최대 활성의 80% 내지 100% 또는 85% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다.

나아가, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 서열번호 1로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 3로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 5로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 7로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 9로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 11로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 13로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 15로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열에 의해 ; 서열번호 17로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 19로 이루어진 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열에 의해 각각 암호화되는 것일 수 있다.

본 출원의 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이체는 본 출원의 상기 효소 또는 이의 변이체를 발현하는 DNA, 예컨대, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20 으로 E. coli 등의 균주에 형질전환시킨 다음, 이를 배양하여 배양물을 수득하고, 상기 배양물을 파쇄하여, 컬럼 등을 통해 정제하여 수득한 것일 수 있다. 상기 형질전환용 균주는 대장균(Escherichia coli) 외에도 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterum glutamicum), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 등이 있다.

구체예에서, 이러한 형질전환된 균주로 E. coli BL21(DE3)/CJ_TD_F4E, E.coli BL21(DE3)/CJ_KO_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_RP_F4E, E. coli BL21(DE3)/ CJ_RM_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_LP_F4E, E. coli BL21(DE3)/ CJ_Cab_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_Ckr_또는 E. coli BL21(DE3)/CJ_CAE_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_TATH_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_AB_F4E이며, 이들은 각각 순서대로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM11995P(기탁일: 2017년 3월 20일), 기탁번호 KCCM11999P(기탁일: 2017년 3월 24일), KCCM12097P(기탁일: 2017년 8월 11일), KCCM12096P(기탁일: 2017년 8월 11일), KCCM12095P(기탁일: 2017년 8월 11일), KCCM12107P(기탁일: 2017년 9월 13일) 및 KCCM12108P(기탁일: 2017년 9월 13일), KCCM12233P(기탁일: 2018년 3월 23일), KCCM12234P(기탁일: 2018년 3월 23 일) 및 KCCM12237P(기탁일: 2018년 3월 23 일)로 기탁하였다.

본 출원에서 사용되는 과당-4-에피머화 효소는 이를 암호화하는 핵산을 이용하여 제공될 수 있다.

본 출원에서 용어 "핵산"은 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990) 참조).

상기 핵산은 본 출원의 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 또는 19의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 본 출원의 과당-4-에피머화 효소와 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지면서 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산일 수 있다. 구체적으로, 예컨데 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-4-에피머화 효소를 암호화하는 핵산은 서열번호 2의 염기서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 상동성을 가지는 핵산일 수 있다. 또한, 예컨데, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 과당-4-에피머화 효소를 암호화하는 핵산은 서열번호 4의 염기서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 상동성을 가지는 핵산일 수 있으며, 이는 본원에 기술된 다른 아미노산 서열의 효소를 암호화하는 핵산에도 적용될 수 있다. 더불어, 본 출원의 핵산은 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 본 출원의 과당-4-에피머화 효소로 번역될 수 있는 핵산을 포함할 수 있고, 상기 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 역시 포함할 수 있음은 자명하다.

본 출원에서 사용될 수 있는 과당-4-에피머화 효소를 발현하는 미생물은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 미생물일 수 있다. 상기 벡터는 본 출원의 핵산이 작동 가능하게 연결된 형태일 수 있다. 본 출원에서 용어, "작동 가능하게 연결된"이란 일반적으로 기능을 수행하도록 염기 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 염기 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 벡터와의 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다. 본 출원에서 용어 "벡터"는 유기체, 예컨대 숙주세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. 여기서, "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 본 출원의 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 유기체, 예컨대, 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함할 수 있고, 미니구형 DNA, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)와 같은 트랜스포존(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 재조합 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 상기 벡터는 다양한 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있다. 본 출원에서 용어, "항생제 저항성 유전자"란 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지고 있는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에 선별 마커로서 유용하게 사용된다. 본 출원에서 항생제 저항성 유전자는 본 출원의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, 암피실린(ampicilin), 테트라사이클린(tetracyclin), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloroamphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 또는 네오마이신(neomycin)에 대한 저항 유전자 등을 사용할 수 있다.

본 출원에서 이용될 수 있는 과당-4-에피머화 효소를 발현하는 미생물은, 상기 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 숙주세포 내로 도입하는 방법을 이용할 수 있으며, 상기 벡터를 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함될 수 있으며, 당해 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 및 열 충격법 등이 포함될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

형질전환된 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입된 형태 및 염색체 외에 위치하고 있는 형태 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 재조합 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 출원의 미생물은 본 출원의 핵산 또는 본 출원의 재조합 벡터를 포함하여 본 출원의 과당-4-에피머화 효소를 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로, 대장균(E. coli) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 미생물의 예로는 E. coli BL21(DE3)/CJ_TD_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_KO_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_RP_F4E, E. coli BL21(DE3)/ CJ_RM_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_LP_F4E, E. coli BL21(DE3)/ CJ_Cab_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_Ckr_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_CAE_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_TATH_F4E, 또는 E. coli BL21(DE3)/CJ_AB_F4E 이 있다.

본 출원의 미생물은 상기 핵산 또는 벡터 도입 이외에도 다양한 공지의 방법에 의해 본 출원의 과당-4-에피머화 효소를 발현할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다.

본 출원의 미생물의 배양물은 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈를 발현하는 미생물을 배지에서 배양하여 제조된 것일 수 있다.

본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 7 내지 9)를 조절할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있고, 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양온도는 25 내지 40 ℃, 구체적으로는 30 내지 37 ℃를 유지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 약 0.5 시간 내지 60 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 추가로 과당을 포함할 수 있다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 과당을 직접 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 활성을 갖는 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 것으로서, 기질인 과당 이외에 다른 효소를 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

예를 들어 α-글루칸 포스포릴라아제(α-glucan phosphorylase), 전분 포스포릴라아제(starch phosphorylase), 말토덱스트린 포스포릴라아제(maltodextrin phosphorylase) 또는 수크로오스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물;

포도당 인산화 효소(glucokinase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물;

타가토스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물; 및/또는

α-아밀라아제(α-amylase), 풀루란아제(pullulanase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 수크라아제(sucrase) 또는 이소아밀라아제(isoamylase); 상기 아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 당해 타가토스 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 금속을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 출원의 금속은 2가 양이온을 포함하는 금속일 수 있다. 구체적으로 본 출원의 금속은 니켈, 마그네슘(Mg) 또는 망간(Mn)일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 금속은 금속이온 또는 금속염일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 금속염은MgSO₄, NiSO₄, NiCl₂, MgCl₂,MnCl₂ 또는 MnSO₄일 수 있다.

본 출원은 다른 양태로서, 과당(D-fructose)을 본 출원의 과당-4-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜 상기 과당을 타가토스로 전환하는 단계를 포함하는 타가토스 제조방법을 제공한다.

일 구현예로, 본 출원의 접촉은 pH 5.0 내지 pH 9.0 조건에서, 30℃ 내지 80℃ 온도 조건에서, 및/또는 0.5시간 내지 48시간 동안 수행할 수 있다.

구체적으로, 본 출원의 접촉은 pH 6.0 내지 pH 9.0 조건 또는 pH 7.0 내지 pH 9.0 조건에서 수행할 수 있다. 또한, 본 출원의 접촉은 35℃ 내지 80℃, 40℃ 내지 80℃, 45℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 80℃, 55℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 80℃, 30℃ 내지 70℃, 35℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 70℃, 45℃ 내지 70℃, 50℃ 내지 70℃, 55℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 65℃, 35℃ 내지 65℃, 40℃ 내지 65℃, 45℃ 내지 65℃, 50℃ 내지 65℃, 55℃ 내지 65℃, 30℃ 내지 60℃, 35℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 60℃, 45℃ 내지 60℃, 50℃ 내지 60℃ 또는 55℃ 내지 60℃ 온도 조건에서 수행할 수 있다. 더불어, 본 출원의 접촉은 0.5시간 내지 36시간 동안, 0.5시간 내지 24시간 동안, 0.5시간 내지 12시간 동안, 0.5시간 내지 6시간 동안, 1시간 내지 48시간 동안, 1시간 내지 36시간 동안, 1시간 내지 24시간 동안, 1시간 내지 12시간 동안, 1시간 내지 6시간 동안, 3시간 내지 48시간 동안, 3시간 내지 36시간 동안, 3시간 내지 24시간 동안, 3시간 내지 12시간 동안, 3시간 내지 6시간 동안, 6시간 내지 48시간 동안, 6시간 내지 36시간 동안, 6시간 내지 24시간 동안, 6시간 내지 12시간 동안, 12시간 내지 48시간 동안, 12시간 내지 36시간 동안, 12시간 내지 24시간 동안, 18시간 내지 48시간 동안, 18시간 내지 36시간 동안 또는 18시간 내지 30시간 동안 수행할 수 있다.

일 구현예로, 본 출원의 접촉은 금속 존재하에서 수행할 수 있다. 사용될 수 있는 금속은 전술한 양태에서와 같다.

본 출원의 제조방법은 제조된 타가토스를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 및/또는 정제는 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있으며. 비제한적인 예로, 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 이온교환 크로마토그래피 및 분별 결정 등을 사용할 수 있다. 상기 정제는 하나의 방법만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다.

또한, 본 출원의 제조방법은 상기 분리 및/또는 정제하는 단계 이전 또는 이후에 탈색 및/또는 탈염을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 실시함으로써, 보다 품질이 우수한 타가토스를 얻을 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 타가토스로 전환하는 단계, 분리 및/또는 정제하는 단계, 또는 탈색 및/또는 탈염하는 단계 이후 타가토스를 결정화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 결정화는 통상적으로 사용하는 결정화 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 냉각결정화 방법을 사용하여 결정화를 수행할 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조 방법은 상기 결정화하는 단계 이전에 타가토스를 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 농축은 결정화 효율을 높일 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 분리 및/또는 정제하는 단계 이후 미반응된 과당을 본 출원의 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시키는 단계, 본 출원의 결정화하는 단계 이후 결정이 분리된 모액을 상기 분리 및/또는 정제 단계에 재사용하는 단계, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가 단계를 통해 타가토스를 더욱 고수율로 수득할 수 있으며 버려지는 과당의 양을 절감할 수 있어 경제적 이점이 있다.

본 출원의 과당-4-에피머화 효소인 타가토스-이인산 알돌레이즈는 내열성이 우수하여 산업적으로 타가토스 생산이 가능하고, 보편화된 당인 과당을 타가토스로 전환하는 바 경제성이 높은 효과가 있다.

도 1은 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소들 (CJ_TD_F4E, CJ_KO_F4E)이 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
도 2는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소들 (CJ_TD_F4E, CJ_KO_F4E)의 과당-4-에피머화 활성에 있어서 온도 변화에 따른 활성 정도를 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 나타내는 HPLC 크로마토그래피 그래프이다.
도 4a는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_RP_F4E의 온도 변화에 따른 과당-4-에피머화 효소 활성을 보여주는 그래프이다.
도 4b는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_RM_F4E의 온도 변화에 따른 과당-4-에피머화 효소 활성을 보여주는 그래프이다.
도 5a는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_RP_F4E의 금속 첨가에 따른 과당-4-에피머화 활성을 보여주는 그래프이다.
도 5b는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_RM_F4E의 금속 첨가에 따른 과당-4-에피머화 활성을 보여주는 그래프이다.
도 6는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_LP_F4E 가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 나타내는 HPLC 크로마토그래피 그래프이다.
도 7a는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_LP_F4E의 온도 변화에 따른 과당-4-에피머화 활성을 보여주는 그래프이다.
도 7b은 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_LP_F4E의 금속 첨가에 따른 과당-4-에피머화 활성을 보여주는 그래프이다.
도 8a는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 CJ_Cab_F4E가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과를 보인 그래프이다.
도 8b는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 CJ_Ckr_F4E가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과를 보인 그래프이다.
도 9a는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 CJ_Cab_F4E의 온도에 따른 과당-4-에피머화 효소 활성을 보여주는 그래프이다.
도 9b는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 CJ_Ckr_F4E의 온도에 따른 과당-4-에피머화 효소 활성을 보여주는 그래프이다.
도 10a는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 CJ_Cab_F4E의 금속 첨가에 따른 과당-4-에피머화 활성을 보여주는 그래프이다.
도 10b는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 CJ_Ckr_F4E의 금속첨가에 따른 과당-4-에피머화 활성을 보여주는 그래프이다.
도 11은 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 CJ_CAE_F4E 가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과를 보인 그래프이다.
도 12는 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 CJ_TATH_F4E 가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과를 보인 그래프이다.
도 13은 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 CJ_AB_F4 가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과를 보인 그래프이다.

이하, 본 출원에 따른 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만 본 출원의 하기 실시예는 본 출원의 일 예시에 불과하다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구항에 제시된 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.

실시예 1: 타가토스- 이인산 알돌레이즈의 제조 및 그 활성 평가

실시예 1-1: 타가토스- 이인산 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터들 및 형질전환체들의 제조

신규 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 제공하기 위해 써마네로트릭스 다센시스 (Thermanaerothrix daxensis), 코스모토가 오엘리아 (Kosmotoga olearia)에서 유래한 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 벡터 및 형질전환 미생물(형질전환체)을 제조하였다.

구체적으로, 상기 유전자 3종 중 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에 등록된 써마네로트릭스 다센시스, 아네로리네아 써모필리아, 코스모토가 오엘리아 유전자 서열들을 대상으로 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 서열을 선발하였고, 써마네로트릭스 다센시스의 아미노산 서열 (서열번호 1)과 염기 서열 (서열번호 2), 코스모토가 오엘리아의 아미노산 서열 (서열번호 5)과 염기 서열 (서열번호 6)를 바탕으로 대장균 발현 가능 벡터인 pBT7-C-His에 삽입하여 제작된 재조합 발현벡터를 바이오니아에 합성 의뢰하였다.

단백질 발현을 유도하고자 대장균 발현용 균주인 BL21(DE3)에 형질 전환하였고, 각각 E. coli BL21(DE3)/CJ_TD_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_KO_F4E로 명명하였다. 부다페스트 조약 하에 상기 E. coli BL21(DE3)/CJ_TD_F4E는 2017년 3월 20일에 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM11995P로 기탁되었고, 상기 E. coli BL21(DE3)/CJ_KO_F4E는 2017년 3월 24일에 기탁번호 KCCM11999P로 기탁되었다.

실시예 1-2 : 재조합 효소의 제조 및 정제

재조합 효소를 제조하기 위해, 상기 실시예 1-1에서 제조된 형질전환체인 E.coli BL21(DE3)/CJ_TD_F4E, E . coli BL21(DE3)/CJ_KO_F4E 를 앰피실린 (ampicillin)이 포함된 LB 액체배지 5ml를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB와 단백질발현조절인자인 락토스가 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 배양 과정 중의 교반속도는 180rpm이며, 배양 온도는 37℃가 유지되도록 하였다. 배양액은 8,000rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하였고, 10mM 이미다졸(imidazole)과 300mM NaCl이 포함되어 있는 50mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액에 재현탁하였다. 상기 현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하였으며, 세포 파쇄물은 13,000rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액은 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제되었고, 20mM 이미다졸 및 300mM NaCl을 함유하는 50mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 최종 250mM 이미다졸 및 300mM NaCl을 함유하는 50mM NaH2PO4(pH8.0) 완충용액을 흘려주어 용출 정제하였으며, 50mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석 후 효소 특성 분석을 위한 효소를 확보하였다.

실시예 1-3 : 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성 평가

상기 실시예 1-2에서 얻어진 효소들의 활성을 측정하기 위하여, 30 중량% 과당을 사용하였고, 여기에 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM CoSO₄, 상기 실시예 2에서 분리된 20mg/ml 정제효소를 첨가하여 온도 60℃에서 2시간 반응하였다. 과당-4-에피머화 효소 3종, CJ_TD_F4E, 및 CJ_KO_F4E 에 의해 전환된 타가토스의 농도 및 과당으로부터 타가토스로 전환된 전환율을 확인한 결과, CJ_TD_F4E의 경우, 4.6 %였고, CJ_KO_F4E의 경우, 16.0 %였다. 상기 전환율은 다음 식으로 산출되었다: 전환율=타가토스 중량/초기과당 중량 X 100

또한, 반응 후 잔존하는 과당과 생성물인 타가토스의 경우 HPLC를 이용하여 정량하였다. 사용한 컬럼은 Shodex Sugar SP0810이고, 컬럼 온도를 80℃로 하였으며, 이동상인 물의 유속은 1ml/분으로 흘려주었다. 도 1에 HPLC 크로마토그래피를 이용하여 과당을 기질로 하는 상기 효소의 반응을 나타내는 피크를 검출 정량하였다.

실시예 1-4 : 과당-4- 에피머화 활성에 대한 온도의 영향

본 출원의 효소의 에피머화 활성에 대한 온도 영향성을 조사하기 위하여 과당을 포함하는 50mM Tris HCl (pH8.0) 완충용액에, 상기 실시예 1-2에서 제조된 1mg/ml 정제효소를 각각 첨가하여 50℃ 내지 80℃에서 3시간 반응하였고, 반응 완료액은 HPLC를 이용하여 타가토스를 정량 분석하였다. 그 결과, 본 출원의 효소 2종은 모두 70℃에서 최대활성을 나타내었다(도 2).

실시예 2 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈의 제조 및 그 활성 평가

실시예 2-1: 타가토스- 이인산 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환체의 제조

본 출원에 따른 신규한 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 발굴하기 위해 로도써머스 프로펀디(Rhodothermus profundi) DSM 22212, 로도써머스 마리너스(Rhodothermus marinus) ATCC 43812 유래 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.

구체적으로, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 에 등록된 로도써머스 프로펀디, 로도써머스 마리너스 ATCC 43812 유전자 서열에서 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 서열을 선발하고, 상기 2종 미생물의 아미노산 서열(서열번호 7 및 9)과 염기 서열(서열번호 8 및 10) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 벡터 pBT7-C-His-CJ_RP_F4E, pBT7-C-His-CJ_RM_F4E를 제조하였다(㈜바이오니아, 대한민국).

상기 각각의 재조합 벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 형질전환 균주를 각각 E. coli BL21(DE3)/CJ_RP_F4E 및 E. coli BL21(DE3)/ CJ_RM_F4E로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국 미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2017년 08월 11일자로 기탁하여 각각 KCCM12097P, KCCM12096P를 부여받았다.

실시예 2-2: 재조합 효소의 제조 및 정제

상기 실시예 2-1에서 제조한 형질전환 균주 E. coli BL21(DE3)/CJ_RP_F4E 및 E. coli BL21(DE3)/CJ_RM_F4E로부터 재조합 효소를 제조하기 위하여, 각각의 형질전환 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 상기 종균 배양결과 얻은 배양액을 LB와 단백질 발현조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본 배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 다음, 상기 배양액을 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 상기 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액에 재현탁하였다. 상기 재현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이어서, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제한 다음, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위하여 정제효소 CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E를 각각 확보하였다.

실시예 2-3: 과당으로부터 타가토스로의 전환 및 활성 확인

상기 실시예 2-2에서 확보한 본 출원 재조합 효소 CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E의 과당-4-에피머화 활성을 측정하기 위하여, 30 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM NiSO₄ 및 각 20 mg/mL CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E를 첨가하여 60℃에서 10시간 동안 반응시켰다.

반응 후 잔존하는 과당 및 생성물인 타가토스의 정량은 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석은 Shodex Sugar SP0810 컬럼을 사용하였고, 컬럼 온도는 80℃로 하였으며, 이동상인 물의 유속은 1 mL/min으로 흘려주었다(도 3).

실험 결과, 본 출원 CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E 효소반응에 의한 과당으로부터 타가토스로의 전환율은 각각 5.7% 및 11.1%으로 확인되었다.

실시예 2-4: 온도에 따른 재조합 효소의 활성 확인

상기 실시예 2-2에서 제조한 효소 CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E의 과당-4-에피머화 활성에 대한 온도의 영향력을 조사하기 위하여 10 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl(pH8.0) 완충용액에, 각 1 mg/mL의 CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E를 첨가하여 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃ 및 70℃의 다양한 온도에서 3시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 완료 후 반응물 내의 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.

실험 결과, CJ_RP_F4E는 65℃에서 최대 활성을 나타내었으며, 60℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 70% 이상, 모든 온도 범위에서 최대 활성의 50% 이상을 유지하였다(도 4a). 그리고, CJ_RM_F4E는 70℃에서 최대 활성을 나타내었으며, 55℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 70% 이상, 모든 온도 범위에서 최대 활성의 40% 이상을 유지하였다(도 4b).

실시예 2-5: 금속이온 첨가에 따른 본 발명 재조합 효소의 활성 확인

상기 실시예 2-2에서 제조한 효소 CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E의 과당-4-에피머화 활성에 대한 금속이온별 영향력을 확인하기 위하여 10 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl (pH8.0) 완충용액에, 각 1 mg/mL의 CJ_RP_F4E 및 CJ_RM_F4E와 각 1 mM의 다양한 금속이온(ZnSO₄, MgCl₂, MnCl₂, NH₄Cl, CaCl₂, Na₂SO₄, CuSO₄, MgSO₄, MnSO₄, (NH₄)₂SO₄ 또는 NiSO₄)을 첨가하여 60℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응 완료후 반응물의 타가토스를 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.

실험 결과, CJ_RP_F4E는 NiSO₄ 각각의 첨가에 의하여 활성이 증가하는 것으로 나타나 니켈 이온이 활성을 증가시킬 수 있고(도 5a), CJ_RM_F4E는 MnSO₄ 및 NiSO₄각각의 첨가에 의하여 활성이 증가하는 것으로 나타나 망간 또는 니켈 이온이 본 출원 재조합 효소의 활성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 5b).

실시예 3 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈의 제조 및 그 활성 평가

실시예 3-1 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환체의 제조

본 발명자들은 림노코르다 필로사(Limnochorda pilosa) DSM 28787 유래 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 재조합 벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.

더욱 구체적으로는, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 ENA(European Nucleotide Archive)에 등록된 림노코르다 필로사 유전자 서열을 대상으로 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 서열을 선발하여, 림노코르다 필로사 유래 타가토스-이인산 알돌레이즈 CJ_LP_F4E의 아미노산 서열(서열번호 11) 및 염기서열(서열번호 12)을 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 발현벡터 pBT7-C-His-CJ_LP_F4E를 제조하였다(㈜바이오니아, 대한민국).

상기 재조합 벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 형질전환 균주를 E. coli BL21(DE3)/CJ_LP_F4E로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국 미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2017년 08월 11일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM12095P를 부여받았다.

실시예 3-2 : 재조합 효소의 제조 및 정제

상기 실시예 3-1에 따라 제조한 형질전환 균주 E. coli BL21(DE3)/CJ_LP_F4E, 유래의 CJ_LP_F4E 로부터 본 출원 재조합 효소를 수득하기 위하여, 상기 각각의 형질전환 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB와 단백질 발현조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 이어서, 상기 배양액을 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액에 재현탁하였다. 상기 재현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 세포 파쇄물을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제한 후, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 다음, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제하였고 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_LP_F4E 를 확보하였다.

실시예 3-3 : 재조합 효소의 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성 평가

상기 실시예 3-2에서 확보한 본 출원 재조합 효소 CJ_LP_F4E의 활성을 측정하기 위하여, 30 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM NiSO₄ _,및 각 20 mg/mL의 CJ_LP_F4E 를 첨가하여 60℃에서 10시간 동안 반응시켰다.

반응 후 잔존하는 과당 및 생성물인 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량하였다. HPLC 분석은 Shodex Sugar SP0810 컬럼을 이용하였고, 컬럼 온도는 80℃, 이동상인 물의 유속은 1 mL/min으로 흘려주었다(도 6).

실험 결과, 본 출원 각 효소에 의하여 과당으로부터 타가토스로 전환된 전환율은 CJ_LP_F4E를 이용한 경우 9.5 %임을 확인하였다.

실시예 3-4 : 온도에 따른 재조합 효소의 활성 확인

상기 실시예 3-2에서 수득한 본 출원 재조합 효소 CJ_LP_F4E 의 과당-4-에피머화 활성에 대한 온도의 영향력을 조사하기 위하여 10 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl(pH 8.0) 완충용액에 1mg/mL CJ_LP_F4E 를 첨가하여 45℃, 50℃, 55℃, 60℃ 및 70℃의 다양한 온도에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 반응액 내의 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.

실험 결과, 본 출원 CJ_LP_F4E 효소는 60℃에서 최대활성을 나타내었으며, CJ_LP_F4E는 45℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 50% 이상을 유지함을 확인할 수 있었다(도 7a).

실시예 3-5 : 금속이온 첨가에 따른 재조합 효소의 활성 확인

종래 공지된 이성화 효소, 예컨대 포도당 이성화 효소 및 아라비노스 이성화 효소 및 에피머효소, 예컨대 사이코스 3-에피머화 효소는 금속이온을 요구하는 것으로 알려져 있다. 따라서 상기 실시예 3-2에서 수득한 본 출원 재조합 효소 CJ_LP_F4E도 금속이온이 과당-4-에피머화 활성에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다.

더욱 구체적으로, 10 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl(pH 8.0) 완충용액에, 2 mg/mL의 CJ_LP_F4E 를 첨가하고, 다양한 금속이온 NiSO₄, CaCl₂, ZnSO₄, MgSO₄, MnSO₄, FeSO₄, CuSO₄, 또는 (NH₄)₂SO₄ 을 각 1 mM씩 첨가하여 효소활성을 측정하였다. 금속이온을 처리하지 않은 경우를 대조군으로 설정하였다. 상기 반응이 완료된 후 반응액 내의 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.

실험 결과, 본 출원 CJ_LP_F4E 효소는 각 MnSO₄, NiSO₄ 의 첨가에 의하여 활성이 증가하는 것으로 나타나 망간이온이나 니켈이온 등 금속이온의 요구성이 있음을 알 수 있었다. 특히, NiSO₄를 첨가한 경우 최대 활성을 보임을 확인하였다(도 7b).

실시예 4 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈의 제조 및 그 활성 평가

실시예 4-1 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물의 제조

신규 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 발굴하기 위해 칼디스리스 아비시 (Caldithrix abyssi) DSM 13497 및 칼디셀룰로시럽터 크로노스키엔시스 (Caldicellulosiruptor kronotskyensis ) DSM 18902 유래 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.

구체적으로, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록된 칼디스리스 아비시 DSM 13497 및 칼디셀룰로시럽터 크로노스키엔시스 유전자 서열에서 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 서열을 선발하고, 상기 미생물 각각의 아미노산 서열(서열번호 13 및 15)과 염기 서열(서열번호 14 및 16) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 벡터 pBT7-C-His-CJ_Cab_F4E 및 pBT7-C-His-CJ_Ckr_F4E를 합성하였다(㈜바이오니아, 대한민국).

상기 각 재조합 벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 재조합 미생물을 제조한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 재조합 미생물을 각각 E. coli BL21(DE3)/CJ_Cab_F4E 및 E. coli BL21(DE3)/CJ_Ckr_F4E 로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2017년 9월 13일자로 기탁하여 각각 기탁번호 KCCM12107P 및 KCCM12108P를 부여받았다.

실시예 4-2: 재조합 효소의 제조 및 정제

상기 실시예 4-1에서 제조한 각 재조합 미생물 E. coli BL21(DE3)/CJ_Cab_F4E 및 E. coli BL21(DE3)/CJ_Ckr_F4E로부터 재조합 효소 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E를 제조하기 위하여, 각각의 재조합 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB와 단백질 발현 조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 이후, 상기 배양액은 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액에 현탁하였다. 상기 현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 세포 파쇄물을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이후, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제하였으며, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E를 확보하였다.

실시예 4-3: 재조합 효소의 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성 평가

상기 실시예 4-2에서 확보한 재조합 효소 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E의 과당-4-에피머화 활성을 측정하기 위하여, 10 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM MnSO₄ 및 각 5 mg/ml의 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E를 첨가하여 60℃에서 24시간 반응시켰다.

반응 후 잔존하는 과당 및 생성물인 타가토스의 정량은 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석은 Shodex Sugar SP0810 컬럼을 이용하였고, 컬럼 온도는 80℃로 하였으며, 이동상인 물의 유속은 1 mL/min으로 흘려주었다.

그 결과, 재조합 효소 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E에 의한 과당으로부터 타가토스로의 전환율은 각각 3.8% 및 4.0% 임을 확인하였다(도 8a 및 도 8b).

실시예 4-4: 온도에 따른 재조합 효소의 활성 확인

상기 실시예 4-2에서 수득한 재조합 효소 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E 의 과당-4-에피머화 활성에 대한 온도 영향력을 조사하기 위하여 5 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl(pH8.0) 완충용액에, 각 5 mg/ml의 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E 를 첨가하여 각 37℃, 40℃, 50℃, 55℃, 60℃ 및 70℃에서 5시간 반응시켰다. 반응 완료액 내의 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다. 그 결과, CJ_Cab_F4E는 55℃에서, CJ_Ckr_F4E는 60℃에서 최대 활성을 나타내었으며, 두 효소 모두 50℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 75% 이상의 활성을 나타냄을 확인하였다(표 1, 도 9a 및 9b).

온도별 상대활성(%)

구분	CJ_Cab_F4E	CJ_CKr_F4E
37℃	-	33.0
40℃	49.8	-
50℃	80.8	76.7
55℃	100.0	89.2
60℃	98.1	100.0
70℃	76.1	78.8

실시예 4-5: 금속 첨가에 따른 본 출원 재조합 효소의 활성 확인

상기 실시예 4-2에서 수득한 재조합 효소 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E의 금속이 과당-4-에피머화 활성에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다.

구체적으로, 5 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl (pH8.0) 완충용액에, 각 5 mg/mL의 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E과 1 mM 금속이온(MgSO₄ 또는 MnSO₄)을 첨가하여 60℃에서 5시간 반응시켰다. 금속이온을 처리하지 않은 경우를 대조군(w/o)으로 설정하였다. 상기 반응이 완료된 후 반응 완료액의 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.

그 결과, CJ_Cab_F4E은 MnSO₄의 첨가에 의하여 약 2배, MgSO₄의 첨가에 의하여 10배 이상 활성이 증가하여 망간 또는 마그네슘 이온(또는, 이의 염)이 CJ_Cab_F4E의 과당-4-에피머화 활성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 10a). 또한, CJ_Ckr_F4E는 MgSO₄ 첨가시 대조군과 유사한 활성을 보였으나, MnSO₄의 첨가에 의하여 활성이 약 2배 증가하여 망간 이온(또는, 이의 염)이 CJ_Ckr_F4E의 과당-4-에피머화 활성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 10b).

실시예 5 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈의 제조 및 그 활성 평가

실시예 5-1 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물의 제조

신규 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 발굴하기 위해 칼디리네 에로필라 (Caldilinea aerophila) 유래 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.

구체적으로, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록된 칼디리네 에로필라 유전자 서열에서 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 서열을 선발하고, 상기 미생물 각각의 아미노산 서열(서열번호 17)과 염기 서열(서열번호 18) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 벡터 pET21a-CJ_CAE_F4E를 클로닝하였다

재조합 발현벡터를 사용하기 위해, 칼디리네 에로필라 Genomic DNA를 이용하여, 프라이머 1: ATATACATATGTCAACACTTCGCCACATCATTTTGCGA 과 프라이머 2: TGGTGCTCGAGTCCAAGCAATGTAGCGGCGTCGTA를 이용하여, PCR 조건은 94 ℃에서 2분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 65℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 신장을 35회 반복한 후, 72℃에서 5분간 신장반응을 수행하였다.

상기 재조합 벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 재조합 미생물을 제조한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 재조합 미생물을 각각 E. coli BL21(DE3)/CJ_CAE_F4E 로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2018년 3월 23일자로 기탁하여 각각 기탁번호 KCCM 12233P 를 부여받았다.

실시예 5-2: 재조합 효소의 제조 및 정제

상기 실시예 5-1에서 제조한 각 재조합 미생물 E. coli BL21(DE3)/ CJ_CAE_F4E 로부터 재조합 효소 CJ_CAE_F4E 를 제조하기 위하여,재조합 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB와 단백질 발현 조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 이후, 상기 배양액은 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액에 현탁하였다. 상기 현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 세포 파쇄물을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이후, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제하였으며, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_CAE_F4E 를 확보하였다.

실시예 5-3: 재조합 효소의 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성 평가

상기 실시예 5-2에서 확보한 재조합 효소 CJ_CAE_F4E 의 과당-4-에피머화 활성을 측정하기 위하여, 10 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM MnSO₄ 및 각 20mg/ml의 CJ_Cab_F4E 및 CJ_Ckr_F4E를 첨가하여 60℃에서 24시간 반응시켰다.

그 결과, 재조합 효소 CJ_CAE_F4E 에 의한 과당으로부터 타가토스로의 전환율은 1.8% 임을 확인하였다(도 11).

실시예 6 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈의 제조 및 그 활성 평가

실시예 6-1 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물의 제조

신규 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 발굴하기 위해 써모언에로박터 써모하이드로썰퓨리쿠스 (Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus) 유래 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.

구체적으로, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록된 써모언에로박터 써모하이드로썰퓨리쿠스 유전자 서열에서 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 서열을 선발하고, 상기 미생물 아미노산 서열(서열번호 19)와 염기 서열(서열번호 20) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 벡터 pBT7-C-His-CJ_TATH_F4E를 합성하였다(㈜바이오니아, 대한민국).

상기 재조합 벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 재조합 미생물을 제조한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 재조합 미생물을 각각 E. coli BL21(DE3)/CJ_TATH_F4E 로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2018년 3월 23일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM12234P를 부여받았다.

실시예 6-2: 재조합 효소의 제조 및 정제

상기 실시예 6-1에서 제조한 재조합 미생물 E. coli BL21(DE3)/ CJ_TATH_F4E 로부터 재조합 효소 CJ_TATH_F4E 를 제조하기 위하여,재조합 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB와 단백질 발현 조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 이후, 상기 배양액은 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액에 현탁하였다. 상기 현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 세포 파쇄물을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이후, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제하였으며, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_TATH_F4E 를 확보하였다.

실시예 6-3: 재조합 효소의 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성 평가

상기 실시예 6-2에서 확보한 재조합 효소 CJ_TATH_F4E 의 과당-4-에피머화 활성을 측정하기 위하여, 30 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM MnSO₄ 및 각 5mg/ml의 CJ_TATH_F4E 를 첨가하여 60℃에서 24시간 반응시켰다.

그 결과, 재조합 효소 CJ_TATH_F4E 에 의한 과당으로부터 타가토스로의 전환율은 2.9% 임을 확인하였다(도 12).

실시예 7 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈의 제조 및 그 활성 평가

실시예 7-1 : 타가토스- 이인산 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물의 제조

신규 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 발굴하기 위해 에시도박테리알레스 박테리움 (Acidobacteriales bacterium) 유래 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.

구체적으로, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록된 에시도박테리알레스 박테리움 유전자 서열에서 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 서열을 선발하고, 상기 미생물 아미노산 서열(서열번호 3)와 염기 서열(서열번호 4) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 벡터 pBT7-C-His-CJ_AB_F4E 합성하였다(㈜바이오니아, 대한민국).

상기 재조합 벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 재조합 미생물을 제조한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 재조합 미생물을 각각 E. coli BL21(DE3)/CJ_AB_F4E 로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2018년 3월 23일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM12237P를 부여받았다.

실시예 7-2: 재조합 효소의 제조 및 정제

상기 실시예 7-1에서 제조한 재조합 미생물 E. coli BL21(DE3)/ CJ_AB_F4E 로부터 재조합 효소 CJ_AB_F4E 를 제조하기 위하여,재조합 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB와 단백질 발현 조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 이후, 상기 배양액은 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액에 현탁하였다. 상기 현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 세포 파쇄물을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이후, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제하였으며, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_AB_F4E 를 확보하였다.

실시예 7-3: 재조합 효소의 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성 평가

상기 실시예 7-2에서 확보한 재조합 효소 CJ_AB_F4E 의 과당-4-에피머화 활성을 측정하기 위하여, 1 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM MnSO₄ 및 각 10 mg/ml의 CJ_AB_F4E 를 첨가하여 55℃에서 24시간 반응시켰다.

그 결과, 재조합 효소 CJ_AB_F4E 에 의한 과당으로부터 타가토스로의 전환율은 각각 8% 임을 확인하였다(도 13).

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM11995P

수탁일자 : 20170320

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM11999P

수탁일자 : 20170324

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12097P

수탁일자 : 20170811

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12096P

수탁일자 : 20170811

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12095P

수탁일자 : 20170811

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12107P

수탁일자 : 20170913

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12108P

수탁일자 : 20170913

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12233P

수탁일자 : 20180323

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12234P

수탁일자 : 20180323

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12237P

수탁일자 : 20180323

<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> A composition for preparing tagatose and Methods for producing tagatose using The Same <130> P18-0070 <150> KR 17/0042166 <151> 2017-03-31 <150> KR 17/0111489 <151> 2017-08-31 <150> KR 17/0111494 <151> 2017-08-31 <150> KR 17/0158765 <151> 2017-11-24 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 426 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_TD_F4E derived from Thermanaerothrix daxensis <400> 1 Met Val Thr Tyr Leu Asp Phe Val Val Leu Ser His Arg Phe Arg Arg 1 5 10 15 Pro Leu Gly Ile Thr Ser Val Cys Ser Ala His Pro Tyr Val Ile Glu 20 25 30 Ala Ala Leu Arg Asn Gly Met Met Thr His Thr Pro Val Leu Ile Glu 35 40 45 Ala Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln Tyr Gly Gly Tyr Thr Gly Met Thr 50 55 60 Pro Ala Asp Phe Val Arg Tyr Val Glu Asn Ile Ala Ala Arg Val Gly 65 70 75 80 Ser Pro Arg Glu Asn Leu Leu Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Leu 85 90 95 Val Trp Ala His Glu Pro Ala Glu Ser Ala Met Glu Lys Ala Arg Ala 100 105 110 Leu Val Lys Ala Tyr Val Glu Ala Gly Phe Arg Lys Ile His Leu Asp 115 120 125 Cys Ser Met Pro Cys Ala Asp Asp Arg Asp Phe Ser Pro Lys Val Ile 130 135 140 Ala Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Gln Val Ala Glu Ser Thr Cys Asp 145 150 155 160 Val Met Gly Leu Pro Leu Pro Asn Tyr Val Ile Gly Thr Glu Val Pro 165 170 175 Pro Ala Gly Gly Ala Lys Ala Glu Ala Glu Thr Leu Arg Val Thr Arg 180 185 190 Pro Glu Asp Ala Ala Glu Thr Ile Ala Leu Thr Arg Ala Ala Phe Phe 195 200 205 Lys Arg Gly Leu Glu Ser Ala Trp Glu Arg Val Val Ala Leu Val Val 210 215 220 Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Asp His Gln Ile His Val Tyr Arg Arg 225 230 235 240 Glu Glu Ala Gln Ala Leu Ser Arg Phe Ile Glu Ser Gln Pro Gly Leu 245 250 255 Val Tyr Glu Ala His Ser Thr Asp Tyr Gln Pro Arg Asp Ala Leu Arg 260 265 270 Ala Leu Val Glu Asp His Phe Ala Ile Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu 275 280 285 Thr Phe Ala Phe Arg Glu Ala Val Phe Ala Leu Ala Ser Ile Glu Asp 290 295 300 Trp Val Cys Asp Ser Pro Ser Arg Ile Leu Glu Val Leu Glu Thr Thr 305 310 315 320 Met Leu Ala Asn Pro Val Tyr Trp Gln Lys Tyr Tyr Leu Gly Asp Glu 325 330 335 Arg Ala Arg Arg Ile Ala Arg Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Arg Ile Arg 340 345 350 Tyr Tyr Trp Ser Ala Pro Ala Val Glu Gln Ala Phe Glu Arg Leu Arg 355 360 365 Ala Asn Leu Asn Arg Val Ser Ile Pro Leu Val Leu Leu Ser Gln Tyr 370 375 380 Leu Pro Asp Gln Tyr Arg Lys Val Arg Asp Gly Arg Leu Pro Asn Gln 385 390 395 400 Phe Asp Ala Leu Ile Leu Asp Lys Ile Gln Ala Val Leu Glu Asp Tyr 405 410 415 Asn Val Ala Cys Gly Val Arg Ile Gly Glu 420 425 <210> 2 <211> 1281 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_TD_F4E derived from Thermanaerothrix daxensis <400> 2 atggttacct atttggattt tgtggtgctt tctcatcgtt ttaggcgccc cctgggcatt 60 acctcagtgt gttcggcgca tccgtatgtc attgaggcgg cgctgcgtaa tgggatgatg 120 acccatacac cggtcctaat cgaggccact tgcaatcaag tcaatcagta tgggggatat 180 acggggatga ccccggcaga tttcgtgcgg tatgtggaga atattgctgc acgggtaggc 240 tctccacgtg aaaacctcct tttgggtggc gatcatttgg gacccctggt ctgggctcat 300 gaacctgctg agagtgccat ggaaaaagct cgagctctgg tcaaagccta tgtagaggct 360 ggttttcgca aaattcatct ggattgctca atgccctgtg cggatgatcg cgatttttct 420 ccaaaggtca ttgctgagcg ggcagccgaa ttggctcagg tggcagagtc aacttgtgat 480 gttatgggct tgcccttgcc caactacgtc attggaaccg aggtgccccc agcaggtggc 540 gccaaggctg aagccgaaac tttgagggta acccgtccgg aggatgcagc ggagaccatt 600 gcactgacca gagcggcttt tttcaagcga ggtttagagt ctgcctggga acgtgtagtg 660 gcgttagtag tgcaacccgg tgttgaattc ggagatcatc agattcatgt ttaccgccgt 720 gaggaagcgc aggctctttc ccgcttcatt gaaagccagc ccggcttagt ctatgaggct 780 cactccaccg actatcagcc ccgtgatgcg ctgcgggctt tggttgagga tcatttcgca 840 atcctgaagg tgggtccggc gctaaccttt gcttttcgtg aggcagtttt tgccctggcc 900 agtatcgagg attgggtatg cgattcaccc agtcgcatcc tggaagtttt ggaaacaacc 960 atgctggcca acccggtcta ctggcaaaag tattacttgg gcgatgagcg agcgcgtcgg 1020 attgccagag ggtatagttt cagcgatcgc attcgttatt attggagtgc accagcggtt 1080 gaacaggcct ttgaacgctt gcgggcaaat ctgaatcgtg tttcgatccc ccttgtcctt 1140 ctcagtcagt atttgccgga tcaatatcgc aaagtgcggg atggacggct gcctaaccag 1200 tttgatgctt tgattctgga taaaatccaa gccgtactgg aagactacaa tgtggcgtgt 1260 ggtgtgagga taggggagtg a 1281 <210> 3 <211> 431 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_AB_F4E derived from Acidobacteriales bacterium <400> 3 Met Ser Asp Asn Leu Gln Val Phe Leu Arg Glu Ser Arg Gly Arg Arg 1 5 10 15 Gly Ile Tyr Ser Val Cys Ser Ala His Pro Arg Val Ile Glu Ala Ala 20 25 30 Met Arg Gln Ala Gly Ala Asp Gly Thr His Leu Leu Leu Glu Ala Thr 35 40 45 Ser Asn Gln Val Asn Gln Ala Gly Gly Tyr Thr Gly Met Thr Pro Ala 50 55 60 Met Phe Arg Asp Tyr Val Tyr Asp Ile Ala Gln Glu Ile Gly Phe Asp 65 70 75 80 Arg Ser Arg Leu Ile Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Asn Pro Trp 85 90 95 Gln Gln Leu Asp Ala Ser Thr Ala Met Gln Tyr Ala Glu Glu Met Val 100 105 110 Arg Leu Tyr Ile Glu Ala Gly Phe Thr Lys Ile His Leu Asp Ala Ser 115 120 125 Met Arg Cys Ala Asp Asp Ala Ala Ile Val Pro Asp Glu Val Met Ala 130 135 140 Gly Arg Ala Ala Ala Leu Cys Ser Ala Ala Glu Ser Ala Arg Ala Arg 145 150 155 160 Leu Gly Leu Ala Pro Val Val Tyr Val Ile Gly Thr Glu Val Pro Thr 165 170 175 Pro Gly Gly Ala Ser His Ala Leu Asn Thr Leu Glu Val Thr Thr Arg 180 185 190 Glu Ala Val Glu His Thr Leu Ser Val His Arg Lys Ala Phe His Asp 195 200 205 Ala Gly Leu Asp Ala Ala Trp Gln Arg Val Ile Ala Val Val Val Gln 210 215 220 Pro Gly Val Glu Phe Asp His Asp Ser Val Val Asp Tyr Asp Ala Ala 225 230 235 240 Lys Ala Gly His Leu Gln Glu Phe Leu Gln Ala His Pro Glu Leu Val 245 250 255 Met Glu Ala His Ser Ser Asp Tyr Gln Lys Pro Gln Ala Tyr Lys Glu 260 265 270 Leu Val Arg Asp Gly Phe Ala Ile Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu Thr 275 280 285 Phe Ala Leu Arg Glu Met Leu Tyr Ala Leu Ala Ala Ile Glu Arg Glu 290 295 300 Leu Val Pro Glu Ala Glu Gln Ser His Leu Val Glu Thr Met Glu Glu 305 310 315 320 Ile Met Leu Ala His Pro Glu Asn Trp Gln Lys Tyr Tyr Arg Gly Ser 325 330 335 Ala Glu Gln Gln Arg Leu Leu Arg Val Tyr Ser Tyr Ser Asp Arg Ile 340 345 350 Arg Tyr Tyr Trp Gly Arg Pro Glu Ala Glu Ala Ala Val Thr Arg Leu 355 360 365 Met Arg Asn Leu His Gln Thr Thr Ile Pro Glu Thr Leu Leu Ser Gln 370 375 380 Tyr Cys Pro Arg Glu Tyr Glu Ala Met Arg Glu Gly Arg Leu Arg Asn 385 390 395 400 Asp Pro Ala Glu Leu Thr Ile Ala Ser Ile Arg Thr Val Leu Glu Ser 405 410 415 Tyr Ser Ser Ala Cys Arg Gly Asp Gly Ser Asn Ser Gly Lys Gln 420 425 430 <210> 4 <211> 1296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_AB_F4E derived from Acidobacteriales bacterium <400> 4 atgtccgaca atttgcaggt gtttcttcgt gagtcccgag gccggcgcgg catctattcg 60 gtatgctccg cgcatccccg ggtgatcgag gccgccatgc ggcaagctgg cgcagacggc 120 acgcatctgc tgctggaagc gacgtcgaat caggtgaacc aagccggagg ctacaccggc 180 atgactcccg cgatgtttcg cgattacgtt tatgacattg cacaggagat cggcttcgac 240 cgcagccgtt tgattcttgg cggagatcat ttgggcccca atccctggca gcagctcgac 300 gccagcacag cgatgcagta tgcagaggag atggttcgac tgtacatcga ggcaggattc 360 accaagattc atctcgacgc cagcatgcgt tgtgccgacg atgcggcaat cgttcccgat 420 gaagtgatgg caggacgcgc cgccgcattg tgcagcgcgg ctgagtcggc gcgagcacgg 480 ctgggactgg cgccggtggt ctacgtgatc ggaaccgagg ttccaacgcc gggtggagca 540 agccatgctc tcaacacgct ggaggtaaca acgcgggagg cagtcgagca tacgctgtcg 600 gttcatcgca aagccttcca cgatgcggga ttggacgctg catggcagcg cgtgatcgcg 660 gtggtcgtgc agccgggcgt ggagttcgat cacgatagcg ttgtcgacta tgacgccgca 720 aaagcgggcc atttgcaaga atttctacaa gcccacccgg aactggtgat ggaggcacac 780 tccagcgatt accagaagcc gcaagcctac aaggaactgg tccgtgatgg cttcgcgatc 840 ctgaaggtcg ggcctgcgtt gacgtttgcg ctgcgggaga tgctctacgc gctggccgcc 900 atcgagcggg aactggtgcc ggaggcggag cagtcccatc tggtagagac gatggaagag 960 atcatgctgg ctcatcccga gaactggcag aagtactatc gcggaagcgc agagcagcag 1020 cgattgctgc gcgtctatag ctacagcgac cgcattcgct attactgggg acgtccggag 1080 gccgaagctg ccgtcacgcg cctgatgcga aatctgcatc agacgacgat tcccgagact 1140 ctcctaagcc agtattgtcc gcgcgaatat gaggcaatgc gcgaaggaag actgcgaaac 1200 gatccggctg agttgacgat cgcgagcatt cgaactgtgc tggagtccta cagcagcgct 1260 tgtcgcggtg acggctcgaa ctccggtaaa cagtaa 1296 <210> 5 <211> 435 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_KO_F4E derived from Kosmotoga olearia <400> 5 Met Lys Lys His Pro Leu Gln Asp Ile Val Ser Leu Gln Lys Gln Gly 1 5 10 15 Ile Pro Lys Gly Val Phe Ser Val Cys Ser Ala Asn Arg Phe Val Ile 20 25 30 Glu Thr Thr Leu Glu Tyr Ala Lys Met Lys Gly Thr Thr Val Leu Ile 35 40 45 Glu Ala Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln Phe Gly Gly Tyr Thr Gly Met 50 55 60 Thr Pro Ala Asp Phe Arg Glu Met Val Phe Ser Ile Ala Glu Asp Ile 65 70 75 80 Gly Leu Pro Lys Asn Lys Ile Ile Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro 85 90 95 Asn Pro Trp Lys Gly Gln Pro Ser Asp Gln Ala Met Arg Asn Ala Ile 100 105 110 Glu Met Ile Arg Glu Tyr Ala Lys Ala Gly Phe Thr Lys Leu His Leu 115 120 125 Asp Ala Ser Met Arg Leu Ala Asp Asp Pro Gly Asn Glu Asn Glu Pro 130 135 140 Leu Asn Pro Glu Val Ile Ala Glu Arg Thr Ala Leu Leu Cys Leu Glu 145 150 155 160 Ala Glu Arg Ala Phe Lys Glu Ser Ala Gly Ser Leu Arg Pro Val Tyr 165 170 175 Val Ile Gly Thr Asp Val Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gln Asn Glu Gly 180 185 190 Lys Ser Ile His Val Thr Ser Val Gln Asp Phe Glu Arg Thr Val Glu 195 200 205 Leu Thr Lys Lys Ala Phe Phe Asp His Gly Leu Tyr Glu Ala Trp Gly 210 215 220 Arg Val Ile Ala Val Val Val Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Asn Glu 225 230 235 240 His Ile Phe Glu Tyr Asp Arg Asn Arg Ala Arg Glu Leu Thr Glu Ala 245 250 255 Ile Lys Lys His Pro Asn Ile Val Phe Glu Gly His Ser Thr Asp Tyr 260 265 270 Gln Thr Ala Lys Ala Leu Lys Glu Met Val Glu Asp Gly Val Ala Ile 275 280 285 Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ala Leu Arg Glu Ala Phe Phe 290 295 300 Ala Leu Ser Ser Ile Glu Lys Glu Leu Phe Tyr Asp Thr Pro Gly Leu 305 310 315 320 Cys Ser Asn Phe Val Glu Val Val Glu Arg Ala Met Leu Asp Asn Pro 325 330 335 Lys His Trp Glu Lys Tyr Tyr Gln Gly Glu Glu Arg Glu Asn Arg Leu 340 345 350 Ala Arg Lys Tyr Ser Phe Leu Asp Arg Leu Arg Tyr Tyr Trp Asn Leu 355 360 365 Pro Glu Val Arg Thr Ala Val Asn Lys Leu Ile Thr Asn Leu Glu Thr 370 375 380 Lys Glu Ile Pro Leu Thr Leu Ile Ser Gln Phe Met Pro Met Gln Tyr 385 390 395 400 Gln Lys Ile Arg Asn Gly Leu Leu Arg Lys Asp Pro Ile Ser Leu Ile 405 410 415 Lys Asp Arg Ile Thr Leu Val Leu Asp Asp Tyr Tyr Phe Ala Thr His 420 425 430 Pro Glu Cys 435 <210> 6 <211> 1308 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_KO_F4E derived from Kosmotoga olearia <400> 6 atgaaaaaac atcctcttca ggacattgtt tcattgcaaa aacagggaat acccaaaggg 60 gttttctctg tatgtagtgc caatagattt gttattgaaa ccactctgga atatgcgaag 120 atgaaaggga caacggttct tatagaggcc acctgcaatc aggtaaacca gttcggtggc 180 tacaccggta tgactcctgc tgatttcaga gaaatggttt tttctatcgc tgaggatatt 240 ggacttccca aaaataaaat catccttggt ggcgaccatc ttggcccaaa tccctggaag 300 ggtcagccgt cagatcaggc tatgcgtaac gccattgaaa tgattcgaga atacgctaaa 360 gctgggttta ccaagcttca tctggatgcc agcatgcgtc ttgcagacga tccggggaac 420 gaaaacgagc cgctgaaccc ggaagttata gcggaaagaa cagctcttct ctgtcttgaa 480 gccgagaggg cttttaaaga atccgccggt tctctccggc ctgtttacgt tattggtacg 540 gatgttccgc caccgggtgg agcgcaaaac gaaggtaaat cgattcatgt aaccagtgtt 600 caggattttg agcgtaccgt tgagttgacc aaaaaggcat ttttcgacca tggtttgtat 660 gaagcctggg gaagggtgat tgcggttgtt gtgcaaccgg gagtagaatt cgggaatgaa 720 catatattcg aatatgatag aaatcgagcg agagaactta ctgaggcgat aaaaaagcat 780 ccaaatatag tttttgaagg tcactcgaca gattatcaaa cggcaaaagc attgaaagaa 840 atggtagaag acggtgtagc catactcaag gttgggccag ctctaacatt tgcgctcaga 900 gaggcttttt ttgcgttgag cagcattgaa aaagagttat tttatgatac acccgggctt 960 tgttcaaact ttgttgaagt tgtcgagaga gcgatgcttg acaatccaaa acattgggaa 1020 aaatattacc agggagaaga gagagaaaat agattagccc gtaaatacag ctttctcgat 1080 cgcttgaggt attactggaa tcttcctgag gttagaacag cggtgaataa gctgataacc 1140 aaccttgaaa caaaagaaat cccgttaacg cttataagcc agttcatgcc gatgcagtac 1200 caaaaaatca gaaacggttt gctaagaaag gatccaataa gccttataaa agatcgaatt 1260 acccttgttc ttgatgacta ctatttcgca actcaccctg aatgttga 1308 <210> 7 <211> 420 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_RP_F4E derived from Rhodothermus profundi <400> 7 Met Gln Ala His Val Leu Leu Ala Pro Ser Phe Glu Gln Leu Ala Asp 1 5 10 15 His Arg His Gly Phe Val Gly Trp Leu Val Asp Leu Leu Arg Gly Pro 20 25 30 Leu Ala Tyr Arg His Thr Leu Leu Ala Val Cys Pro Asn Ser Glu Ala 35 40 45 Val Thr Arg Ala Ala Leu Glu Ala Ala Arg Glu Ala Asn Ala Pro Leu 50 55 60 Phe Phe Ala Ala Thr Leu Asn Gln Val Asp Leu Asp Gly Gly Tyr Thr 65 70 75 80 Gly Trp Thr Pro Ala Thr Leu Ala Arg Phe Val Ala Asp Glu Arg Ile 85 90 95 Arg Leu Gly Leu Arg Ala Pro Val Val Leu Gly Leu Asp His Gly Gly 100 105 110 Pro Trp Lys Lys Asp Trp His Val Arg Asn Arg Leu Pro Tyr Glu Ala 115 120 125 Thr Leu Gln Ala Val Leu Arg Ala Ile Glu Ala Cys Leu Asp Ala Gly 130 135 140 Tyr Gly Leu Leu His Leu Asp Pro Thr Val Asp Leu Glu Leu Pro Pro 145 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tccccatccc acgtattgtc gaacgaacgg tagcgctttt acaacatgct 540 gaaacgtatc gccaacagcg tcgcctgccc ccggtcgcct acgaggtagg cacggaggag 600 gttggcggcg gcctgcaggc tgaggcgcga atggcagaat ttctggatcg actctggacc 660 gtcctggatc gggaagggct accccgtccg gtgtttgtgg tgggtgacat tggcacccgg 720 cttgacacgc acaccttcga ctttgaacgc gcccgtcgcc tggatgccct ggtgcgccgc 780 tacggtgccc tgatcaaggg gcactacacc gatggagtag accgcctgga tctatatcca 840 caggcgggta tcggtggagc aaacgtgggg cctggcctgg ctgctatcga gtttgaagcg 900 ctggaggccc tggtggccga agcgcaccgc cgcaagctgc ccgttacctt tgaccggacc 960 atccgccagg ctgtcattga aagtggacgc tggcaaaaat ggctgcgccc tgaagagaaa 1020 ggacgtccct ttgaagcatt acctccagaa cgccagcggt ggctggtcgc tacaggcagc 1080 cgctacgtgt ggacgcaccc ggctgtccgg caggcgcgcc atcaattgta tcaggtgctc 1140 gctccctggc tcgatgccga tgcttttgtg cgcgcgcgca tcaaggcccg cctgatggac 1200 tacttccgcg ctttcaacct gataggcttc aatgaacggc tgcaggcctt tttacctaat 1260 tga 1263 <210> 9 <211> 420 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_RM_F4E derived from Rhodothermus marinus <400> 9 Met Gln Ala Gln Ala Leu Leu Thr Val Pro Phe Asp Arg Val Ala Thr 1 5 10 15 His Ala Arg Gly Phe Val Gly Trp Val Ala Glu Leu Leu Gln Gly Pro 20 25 30 Leu Ala Tyr Gln His Thr Leu Leu Ala Val Cys Pro Asn Ser Glu Ala 35 40 45 Val Thr Arg Ala Ala Leu Glu Ala Ala Ala Glu Ala Asn Ala Pro Leu 50 55 60 Leu Phe Ala Ala Thr Leu Asn Gln Val Asp Leu Asp Gly Gly Tyr Thr 65 70 75 80 Gly Trp Thr Pro Ala Thr Leu Ala Arg Phe Val Ala Asp Glu Leu Ala 85 90 95 Arg Leu Asp Leu His Ile Pro Val Val Leu Gly Leu Asp His Gly Gly 100 105 110 Pro Trp Lys Lys Asp Leu His Ala Arg Asn Arg Leu Ser Phe Glu Glu 115 120 125 Thr Phe Gln Ala Val Leu Arg Ala Ile Glu Ala Cys Leu Asp Ala Gly 130 135 140 Tyr Gly Leu Leu His Leu Asp Pro Thr Val Asp Leu Glu Leu Ser Pro 145 150 155 160 Gly Thr Pro Val Pro Ile Pro Arg Ile Val Glu Arg Ser Val Ala Leu 165 170 175 Leu Arg His Ala Glu Thr Tyr Arg Leu Arg Arg Asn Leu Pro Pro Val 180 185 190 Ala Tyr Glu Val Gly Thr Glu Glu Val Gly Gly Gly Leu Gln Ala Glu 195 200 205 Ala Arg Met Ala Glu Phe Leu Asp Arg Leu Trp Thr Ala Leu Asp Arg 210 215 220 Glu Gly Leu Pro His Pro Val Phe Val Val Gly Asp Ile Gly Thr Arg 225 230 235 240 Leu Asp Thr Arg Thr Phe Asp Phe Glu Arg Ala Arg Arg Leu Asp Ala 245 250 255 Leu Val Arg Arg Tyr Gly Ala Leu Ile Lys Gly His Tyr Thr Asp Asp 260 265 270 Val Asp Arg Leu Asp Leu Tyr Pro Lys Ala Gly Ile Gly Gly Ala Asn 275 280 285 Val Gly Pro Gly Leu Ala Ala Ile Glu Phe Glu Ala Leu Glu Ala Leu 290 295 300 Val Glu Glu Ala Arg Arg Arg Gly Leu Ser Val Thr Phe Asp Gln Ala 305 310 315 320 Ile Arg Arg Ala Val Val Glu Ser Gly Arg Trp Thr Lys Trp Leu Gln 325 330 335 Pro Glu Glu Lys Gly Gln Pro Phe Asp Ala Leu Asp Pro Glu Arg Gln 340 345 350 Arg Trp Leu Val Ala Thr Gly Ser Arg Tyr Val Trp Thr His Pro Ala 355 360 365 Val Leu Gln Ala Arg Arg Glu Leu Tyr Glu Ala Leu Ala Pro Trp Leu 370 375 380 Asp Ala Asp Ala Phe Val Arg Thr Arg Ile Lys Ala Arg Leu Met Asp 385 390 395 400 Tyr Phe Arg Ala Phe Asn Leu Ile His Phe Asn Glu Arg Leu Gln Ala 405 410 415 Phe Leu Pro Glu 420 <210> 10 <211> 1263 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_RM_F4E derived from Rhodothermus marinus <400> 10 atgcaggcgc aggccctgct gaccgttcca tttgatcggg tggcgaccca cgcacgcggg 60 tttgtgggct gggtggccga actgctgcag gggcccctgg cctatcagca tacgctgctg 120 gctgtctgtc ccaattcgga agcggtaaca cgggccgcgc tggaggccgc cgccgaggcc 180 aacgccccgc tgctttttgc cgccacgctg aaccaggtgg acctcgacgg cggctacacc 240 ggctggacgc ccgccacgct ggcccggttc gtggcggacg aactggcccg cctggacctg 300 cacatccccg tcgtgctcgg cctggaccac ggcggcccct ggaaaaagga tctgcacgcc 360 cgcaaccgat tgtcctttga ggaaaccttc caggccgtgc tgcgggccat cgaggcctgt 420 ctggatgccg gctacggcct gctgcacctg gatccgacgg tcgatctgga gctatcgccc 480 ggcacgccgg tgcccatccc gcgcattgtc gaacgctcgg tagcgctttt gcgtcatgcc 540 gaaacctatc gacttcgacg taacctgccg ccggtcgcct acgaggtggg caccgaagaa 600 gtcggcggcg gcctgcaggc cgaagcgcgc atggcggagt ttctggatcg cctctggacc 660 gcactggacc gggaaggcct gccccatcca gtcttcgtgg tgggcgacat cggcacccgg 720 ctcgacacgc gcacgttcga cttcgagcgg gcccgacggc tggacgcgct ggtgcgccgc 780 tacggtgccc tcatcaaagg gcactacacc gacgacgtgg atcgcctcga tctgtacccg 840 aaggcgggca tcggcggggc caacgtgggc ccgggcctgg ccgccatcga gtttgaagcg 900 ctggaggcgc tggtggagga agcccgtcgc cgcggtcttt cggtgacgtt cgatcaggcc 960 atccgccggg ccgtcgtcga aagcggacgc tggacgaagt ggctccaacc ggaagagaaa 1020 ggccagccgt tcgatgcgct ggatcccgag cggcaacgct ggctggtggc caccggcagc 1080 cgctacgtgt ggacgcatcc ggccgtcctg caggcccgcc gcgaactcta cgaggcgctc 1140 gccccctggc tcgatgccga cgctttcgtg cgcacgcgca tcaaagcacg cctgatggac 1200 tactttcgtg ccttcaacct gatccatttc aacgagcggc tgcaggcctt tctccccgaa 1260 tga 1263 <210> 11 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_LP_F4E derived from Limnochorda pilosa <400> 11 Met Gln Thr Ser Thr Ala Tyr Val Arg Gln Val Ile Trp Gly Gln Gly 1 5 10 15 Thr Arg Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Ser Val Cys Thr Ala Asp Pro Leu 20 25 30 Val Leu Arg Ala Ala Leu Lys Gln Ala Val Glu Asp Gly Ser Pro Ala 35 40 45 Leu Ile Glu Ala Thr Ser Asn Gln Val Asn Gln Phe Gly Gly Tyr Thr 50 55 60 Gly Met Glu Pro Pro Ala Phe Val Glu Phe Val Leu Gly Leu Ala Arg 65 70 75 80 Glu Met Gly Leu Pro Pro Glu Arg Leu Ile Leu Gly Gly Asp His Leu 85 90 95 Gly Pro Asn Pro Trp Gln Arg Leu Ala Ala Glu Glu Ala Met Arg His 100 105 110 Ala Cys Asp Leu Val Glu Ala Phe Val Ala Cys Gly Phe Thr Lys Ile 115 120 125 His Leu Asp Ala Ser Met Pro Leu Gly Glu Glu Arg Ala Gly Gly Ala 130 135 140 Leu Ser Lys Arg Val Val Ala Glu Arg Thr Ala Gln Leu Cys Glu Ala 145 150 155 160 Ala Glu Ala Ala Phe Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Gly Ala Ser Ala 165 170 175 Pro Pro Leu Tyr Val Ile Gly Ser Asp Val Pro Pro Pro Gly Gly Glu 180 185 190 Thr Ser Gly Ser Gln Gly Pro Lys Val Thr Thr Pro Glu Glu Phe Glu 195 200 205 Glu Thr Val Ala Leu Thr Arg Ala Thr Phe His Asp Arg Gly Leu Asp 210 215 220 Asp Ala Trp Gly Arg Val Ile Ala Val Val Val Gln Pro Gly Val Asp 225 230 235 240 Phe Gly Glu Trp Gln Val His Pro Tyr Asp Arg Ala Ala Ala Ala Ser 245 250 255 Leu Thr Arg Ala Leu Thr Gln His Pro Gly Leu Ala Phe Glu Gly His 260 265 270 Ser Thr Asp Tyr Gln Thr Pro Gly Arg Leu Arg Gln Met Ala Glu Asp 275 280 285 Gly Ile Ala Ile Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ala Lys Arg 290 295 300 Glu Ala Leu Phe Ala Leu Asn Ala Leu Glu Ser Glu Val Leu Gly Thr 305 310 315 320 Asp Gly Arg Ala Arg Arg Ser Asn Val Glu Ala Ala Leu Glu Glu Ala 325 330 335 Met Leu Ala Asp Pro Arg His Trp Ser Ala Tyr Tyr Ser Gly Asp Glu 340 345 350 His Glu Leu Arg Leu Lys Arg Lys Tyr Gly Leu Ser Asp Arg Cys Arg 355 360 365 Tyr Tyr Trp Pro Val Pro Ser Val Gln Glu Ala Val Gln Arg Leu Leu 370 375 380 Gly Asn Leu Arg Glu Ala Gly Ile Pro Leu Pro Leu Leu Ser Gln Phe 385 390 395 400 Leu Pro Arg Gln Tyr Glu Arg Val Arg Glu Gly Val Leu Arg Asn Asp 405 410 415 Pro Glu Glu Leu Val Leu Asp Arg Ile Arg Asp Val Leu Arg Gly Tyr 420 425 430 Ala Ala Ala Val Gly Thr Gly Ala Arg Arg Ala Glu Pro Ser Pro Ala 435 440 445 <210> 12 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_LP_F4E derived from Limnochorda pilosa <400> 12 atgcaaacct cgacggcgta cgtgaggcag gtcatttggg gtcaagggac gagggacccc 60 cgcggcatct actcggtctg taccgcagac cccctcgtcc ttcgggccgc cctcaagcag 120 gcggtggagg atggctcccc cgcgctgatc gaggcgacgt ccaaccaggt gaaccagttc 180 ggcgggtata cggggatgga gcccccggcg ttcgtggagt tcgtgctggg acttgcccgc 240 gagatgggac tcccgcccga gcggctgatc ctcgggggcg atcacctcgg ccccaaccca 300 tggcagcggc tggcggccga agaggccatg cggcatgcct gcgacctcgt cgaggccttc 360 gtggcctgcg gcttcaccaa gattcacctg gacgccagca tgcccctggg ggaggaacgg 420 gcaggcggtg cgctttcgaa acgggtggtg gccgaacgga ccgcccagct ctgcgaggcg 480 gccgaggcgg ccttcaggaa gcggtcccag gcggaggggg cgtcggcgcc tccgctctac 540 gtcatcggct ccgacgtgcc tccgcccggc ggcgagacct ccgggagcca ggggcccaag 600 gtgaccacgc cggaggagtt cgaggagacg gtcgcgctga cgcgggcgac ctttcacgat 660 cggggcctgg acgacgcctg gggacgggtg atcgccgtgg tggtccagcc gggggtggac 720 ttcggcgagt ggcaggttca cccctacgat cgggccgccg cggcgagcct tacccgagcc 780 ttgacgcagc atccggggct ggccttcgaa gggcactcca ccgactacca gacgccgggg 840 cggcttcgcc agatggcgga agacggcatc gccatcctga aggtggggcc ggccctcacc 900 ttcgccaagc gggaagcgct cttcgccctg aacgccctgg agtccgaagt gctggggacg 960 gacggccgag cacggcgctc caacgtcgaa gccgccctcg aagaggcgat gctcgccgat 1020 ccccgtcact ggagcgccta ctacagcggg gacgagcacg agctccgtct caagcggaag 1080 tacggcctct ccgaccggtg tcgctactac tggcccgtcc cttcggtgca ggaggccgtc 1140 cagcgcctcc ttggcaacct gcgcgaggcg gggatcccct tgcccctgct gagccagttc 1200 ctgccgcgcc agtacgagcg ggtgcgggag ggcgtcctgc gcaacgaccc ggaggagctg 1260 gtcctggacc ggattcgtga cgtgttgcgg ggatatgcgg cggccgtggg gacgggcgct 1320 aggcgggcgg agccatcacc cgcgtga 1347 <210> 13 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_Cab_F4E derived from Caldithrix abyssi <400> 13 Met Ser Leu His Pro Leu Asn Lys Leu Ile Glu Arg His Lys Lys Gly 1 5 10 15 Thr Pro Val Gly Ile Tyr Ser Val Cys Ser Ala Asn Pro Phe Val Leu 20 25 30 Lys Ala Ala Met Leu Gln Ala Gln Lys Asp Gln Ser Leu Leu Leu Ile 35 40 45 Glu Ala Thr Ser Asn Gln Val Asp Gln Phe Gly Gly Tyr Thr Gly Met 50 55 60 Arg Pro Glu Asp Phe Lys Thr Met Thr Leu Glu Leu Ala Ala Glu Asn 65 70 75 80 Asn Tyr Asp Pro Gln Gly Leu Ile Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro 85 90 95 Asn Arg Trp Thr Lys Leu Ser Ala Ser Arg Ala Met Asp Tyr Ala Arg 100 105 110 Glu Gln Ile Ala Ala Tyr Val Lys Ala Gly Phe Ser Lys Ile His Leu 115 120 125 Asp Ala Thr Met Pro Leu Gln Asn Asp Ala Thr Asp Ser Ala Gly Arg 130 135 140 Leu Pro Val Glu Thr Ile Ala Gln Arg Thr Ala Glu Leu Cys Ala Val 145 150 155 160 Ala Glu Gln Thr Tyr Arg Gln Ser Asp Gln Leu Phe Pro Pro Pro Val 165 170 175 Tyr Ile Val Gly Ser Asp Val Pro Ile Pro Gly Gly Ala Gln Glu Ala 180 185 190 Leu Asn Gln Ile His Ile Thr Glu Val Lys Glu Val Gln Gln Thr Ile 195 200 205 Asp His Val Arg Arg Ala Phe Glu Lys Asn Gly Leu Glu Ala Ala Tyr 210 215 220 Glu Arg Val Cys Ala Val Val Val Gln Pro Gly Val Glu Phe Ala Asp 225 230 235 240 Gln Ile Val Phe Glu Tyr Ala Pro Asp Arg Ala Ala Ala Leu Lys Asp 245 250 255 Phe Ile Glu Ser His Ser Gln Leu Val Tyr Glu Ala His Ser Thr Asp 260 265 270 Tyr Gln Thr Ala Pro Leu Leu Arg Gln Met Val Lys Asp His Phe Ala 275 280 285 Ile Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ala Leu Arg Glu Ala Ile 290 295 300 Phe Ala Leu Ala Phe Met Glu Lys Glu Leu Leu Pro Leu His Arg Ala 305 310 315 320 Leu Lys Pro Ser Ala Ile Leu Glu Thr Leu Asp Gln Thr Met Asp Lys 325 330 335 Asn Pro Ala Tyr Trp Gln Lys His Tyr Gly Gly Thr Lys Glu Glu Val 340 345 350 Arg Phe Ala Gln Arg Phe Ser Leu Ser Asp Arg Ile Arg Tyr Tyr Trp 355 360 365 Pro Phe Pro Lys Val Gln Lys Ala Leu Arg Gln Leu Leu Lys Asn Leu 370 375 380 Gln Gln Ile Ser Ile Pro Leu Thr Leu Val Ser Gln Phe Met Pro Glu 385 390 395 400 Glu Tyr Gln Arg Ile Arg Gln Gly Thr Leu Thr Asn Asp Pro Gln Ala 405 410 415 Leu Ile Leu Asn Lys Ile Gln Ser Val Leu Lys Gln Tyr Ala Glu Ala 420 425 430 Thr Gln Ile Gln Asn Ser Leu Thr Phe Thr Gln Asn Gln Asn Ser Leu 435 440 445 Ala Met Glu Arg Leu 450 <210> 14 <211> 1362 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_Cab_F4E derived from Caldithrix abyssi <400> 14 atgagtctgc atcctttaaa taaattaatc gagcgacaca aaaaaggaac gccggtcggt 60 atttattccg tctgttcggc caatcccttt gttttgaaag cggccatgct acaggcgcaa 120 aaggatcagt ctttgctact tattgaggcc acttccaacc aggtagatca attcggcggt 180 tacaccggca tgcggcccga agattttaaa acaatgacgc ttgaactggc agccgaaaac 240 aattacgatc cacagggatt aatcctgggc ggcgaccatc tggggcccaa ccgctggaca 300 aaactgagcg cctcccgggc catggactac gccagagagc agattgccgc ttatgttaaa 360 gccggctttt ccaaaatcca cttagacgcc accatgccct tgcaaaacga tgccacagat 420 tccgccggcc gccttccagt cgaaacaatc gctcaacgta ccgcagaatt atgcgccgtg 480 gccgaacaaa cttaccggca gagcgaccaa ctctttccgc cgcctgttta cattgtcggc 540 agcgacgtgc ccatcccggg cggcgcgcaa gaagcgctga accagatcca tattacggag 600 gtaaaagagg ttcaacagac cattgatcac gtgcggcggg cctttgaaaa aaacggcctg 660 gaagcggctt acgaaagagt ttgcgccgtt gtcgtgcagc caggcgttga attcgccgat 720 caaatcgttt ttgaatacgc tcccgacaga gcggcggcct taaaagattt tattgaaagc 780 cattcgcagc tggtttatga agcgcactct actgattacc agaccgcacc tcttttgcgc 840 cagatggtaa aagatcactt tgccatttta aaggtcgggc ctgcgctcac ctttgccctg 900 cgcgaagcca tttttgctct ggcctttatg gaaaaagagc ttttgccatt gcacagagcg 960 ctcaaacctt ctgccattct ggaaacgctg gaccaaacga tggacaaaaa ccctgcttac 1020 tggcaaaagc attacggcgg aacaaaggaa gaagtacgct ttgcgcagcg gtttagcctg 1080 agcgaccgca ttcgttacta ctggccgttt ccaaaggttc aaaaggccct gcgccaattg 1140 ctaaaaaact tgcaacaaat ttccattcct ctaactttgg taagccagtt catgccagag 1200 gaataccaac gtattcgcca aggaacgtta accaacgatc cgcaggcgct gattttgaac 1260 aaaattcaaa gcgtattaaa gcaatacgcg gaggcgacgc aaattcaaaa ctctttgaca 1320 ttcacgcaaa atcaaaattc attagcaatg gagcgactat ga 1362 <210> 15 <211> 429 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_Ckr_F4E derived from Caldicellulosiruptor kronotskyensis <400> 15 Met Ser Pro Gln Asn Pro Leu Ile Gly Leu Phe Lys Asn Arg Glu Lys 1 5 10 15 Glu Phe Lys Gly Ile Ile Ser Val Cys Ser Ser Asn Glu Ile Val Leu 20 25 30 Glu Ala Val Leu Lys Arg Met Lys Asp Thr Asn Leu Pro Ile Ile Ile 35 40 45 Glu Ala Thr Ala Asn Gln Val Asn Gln Phe Gly Gly Tyr Ser Gly Leu 50 55 60 Thr Pro Ser Gln Phe Lys Glu Arg Val Ile Lys Ile Ala Gln Lys Val 65 70 75 80 Asp Phe Pro Leu Glu Arg Ile Ile Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro 85 90 95 Phe Val Trp Arg Asp Gln Glu Pro Glu Ile Ala Met Glu Tyr Ala Lys 100 105 110 Gln Met Ile Lys Glu Tyr Ile Lys Ala Gly Phe Thr Lys Ile His Ile 115 120 125 Asp Thr Ser Met Pro Leu Lys Gly Glu Asn Ser Ile Asp Asp Glu Ile 130 135 140 Ile Ala Lys Arg Thr Ala Val Leu Cys Arg Ile Ala Glu Glu Cys Phe 145 150 155 160 Glu Lys Ile Ser Ile Asn Asn Pro Tyr Ile Thr Arg Pro Val Tyr Val 165 170 175 Ile Gly Ala Asp Val Pro Pro Pro Gly Gly Glu Ser Ser Ile Cys Gln 180 185 190 Thr Ile Thr Thr Lys Asp Glu Leu Glu Arg Ser Leu Glu Tyr Phe Lys 195 200 205 Glu Ala Phe Lys Lys Glu Gly Ile Glu His Val Phe Asp Tyr Val Val 210 215 220 Ala Val Val Ala Asn Phe Gly Val Glu Phe Gly Ser Asp Glu Ile Val 225 230 235 240 Asp Phe Asp Met Glu Lys Val Lys Pro Leu Lys Glu Leu Leu Ala Lys 245 250 255 Tyr Asn Ile Val Phe Glu Gly His Ser Thr Asp Tyr Gln Thr Lys Glu 260 265 270 Asn Leu Lys Arg Met Val Glu Cys Gly Ile Ala Ile Leu Lys Val Gly 275 280 285 Pro Ala Leu Thr Phe Thr Leu Arg Glu Ala Leu Val Ala Leu Ser His 290 295 300 Ile Glu Glu Glu Ile Tyr Ser Asn Glu Lys Glu Lys Leu Ser Arg Phe 305 310 315 320 Arg Glu Val Leu Leu Asn Thr Met Leu Thr Cys Lys Asp His Trp Ser 325 330 335 Lys Tyr Phe Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Lys Ser Lys Leu Leu Tyr 340 345 350 Ser Tyr Leu Asp Arg Trp Arg Tyr Tyr Phe Glu Asn Glu Ser Val Lys 355 360 365 Ser Ala Val Tyr Ser Leu Ile Gly Asn Leu Glu Asn Val Lys Ile Pro 370 375 380 Pro Trp Leu Val Ser Gln Tyr Phe Pro Ser Gln Tyr Gln Lys Met Arg 385 390 395 400 Lys Lys Asp Leu Lys Asn Gly Ala Ala Asp Leu Ile Leu Asp Lys Ile 405 410 415 Gly Glu Val Ile Asp His Tyr Val Tyr Ala Val Lys Glu 420 425 <210> 16 <211> 1290 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_Ckr_F4E derived from Caldicellulosiruptor kronotskyensis <400> 16 atgagtcctc aaaatccatt gattggttta tttaagaata gagaaaaaga gtttaagggt 60 attatttcag tttgttcttc aaatgaaata gtcttagaag cagttttaaa aagaatgaaa 120 gatacaaacc taccaattat tattgaagcc acagcgaacc aggtaaatca atttggcggg 180 tattctgggt tgacaccgtc tcagttcaaa gaacgagtta taaaaattgc tcaaaaagtt 240 gattttccac ttgagagaat aattcttggt ggggaccatc ttggaccatt tgtgtggcgt 300 gaccaggaac cagaaattgc tatggagtat gctaagcaaa tgataaaaga atacataaaa 360 gcaggtttta ccaaaattca catcgacacg agtatgcctt taaaagggga gaacagcata 420 gatgatgaaa taattgctaa aagaactgct gtgctctgca ggattgcgga ggagtgtttt 480 gagaagattt ctataaacaa tccctatatt acaaggccag tttatgtgat aggagctgat 540 gtgccacctc ccggcggaga gtcttctatt tgtcaaacaa ttactactaa agatgaatta 600 gaaagaagtt tagaatattt caaagaagca tttaaaaagg aaggaattga gcatgtattc 660 gattatgtag ttgctgttgt tgcaaatttt ggagttgaat ttgggagcga tgaaattgtt 720 gattttgata tggaaaaagt aaagccgcta aaagaacttt tggcaaagta caatatagta 780 tttgaaggcc attctacaga ttatcaaaca aaagaaaact taaaaagaat ggtcgaatgt 840 ggtattgcaa ttttaaaggt tggtcctgct ctaacattta cattgcgcga agcgttagta 900 gcacttagtc atattgaaga agaaatttat agcaatgaaa aggagaaact gtcaagattt 960 agagaagttt tattgaatac tatgctaaca tgcaaagatc actggagtaa atattttgat 1020 gagaatgata agttaattaa gtcaaagctc ctatatagct atcttgacag atggagatac 1080 tattttgaaa acgagagtgt gaaaagtgct gtttattctc ttattggaaa tttagagaat 1140 gttaaaattc caccttggct tgtaagtcag tattttcctt ctcagtacca aaagatgaga 1200 aaaaaagatt taaaaaacgg tgctgccgac ctaatattgg ataaaatagg ggaagtcatt 1260 gaccattatg tttatgcggt aaaagaataa 1290 <210> 17 <211> 408 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_CAE_F4E derived from Caldilinea aerophila <400> 17 Met Ser Thr Leu Arg His Ile Ile Leu Arg Leu Ile Glu Leu Arg Glu 1 5 10 15 Arg Glu Gln Ile His Leu Thr Leu Leu Ala Val Cys Pro Asn Ser Ala 20 25 30 Ala Val Leu Glu Ala Ala Val Lys Val Ala Ala Arg Cys His Thr Pro 35 40 45 Met Leu Phe Ala Ala Thr Leu Asn Gln Val Asp Arg Asp Gly Gly Tyr 50 55 60 Thr Gly Trp Thr Pro Ala Gln Phe Val Ala Glu Met Arg Arg Tyr Ala 65 70 75 80 Val Arg Tyr Gly Cys Thr Thr Pro Leu Tyr Pro Cys Leu Asp His Gly 85 90 95 Gly Pro Trp Leu Lys Asp Arg His Ala Gln Glu Lys Leu Pro Leu Asp 100 105 110 Gln Ala Met His Glu Val Lys Leu Ser Leu Thr Ala Cys Leu Glu Ala 115 120 125 Gly Tyr Ala Leu Leu His Ile Asp Pro Thr Val Asp Arg Thr Leu Pro 130 135 140 Pro Gly Glu Ala Pro Leu Val Pro Ile Val Val Glu Arg Thr Val Glu 145 150 155 160 Leu Ile Glu His Ala Glu Gln Glu Arg Gln Arg Leu Asn Leu Pro Ala 165 170 175 Val Ala Tyr Glu Val Gly Thr Glu Glu Val His Gly Gly Leu Val Asn 180 185 190 Phe Asp Asn Phe Val Ala Phe Leu Asp Leu Leu Lys Ala Arg Leu Glu 195 200 205 Gln Arg Ala Leu Met His Ala Trp Pro Ala Phe Val Val Ala Gln Val 210 215 220 Gly Thr Asp Leu His Thr Thr Tyr Phe Asp Pro Ser Ala Ala Gln Arg 225 230 235 240 Leu Thr Glu Ile Val Arg Pro Thr Gly Ala Leu Leu Lys Gly His Tyr 245 250 255 Thr Asp Trp Val Glu Asn Pro Ala Asp Tyr Pro Arg Val Gly Met Gly 260 265 270 Gly Ala Asn Val Gly Pro Glu Phe Thr Ala Ala Glu Phe Glu Ala Leu 275 280 285 Glu Ala Leu Glu Arg Arg Glu Gln Arg Leu Cys Ala Asn Arg Lys Leu 290 295 300 Gln Pro Ala Cys Phe Leu Ala Ala Leu Glu Glu Ala Val Val Ala Ser 305 310 315 320 Asp Arg Trp Arg Lys Trp Leu Gln Pro Asp Glu Ile Gly Lys Pro Phe 325 330 335 Ala Glu Leu Thr Pro Ala Arg Arg Arg Trp Leu Val Gln Thr Gly Ala 340 345 350 Arg Tyr Val Trp Thr Ala Pro Lys Val Ile Ala Ala Arg Glu Gln Leu 355 360 365 Tyr Ala His Leu Ser Leu Val Gln Ala Asp Pro His Ala Tyr Val Val 370 375 380 Glu Ser Val Ala Arg Ser Ile Glu Arg Tyr Ile Asp Ala Phe Asn Leu 385 390 395 400 Tyr Asp Ala Ala Thr Leu Leu Gly 405 <210> 18 <211> 1227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_CAE_F4E derived from Caldilinea aerophila <400> 18 atgtcaacac ttcgccacat cattttgcga ctgatcgagc tgcgtgaacg agaacagatc 60 catctcacgc tgctggccgt ctgtcccaac tcggcggcgg tgctggaggc agcggtgaag 120 gtcgccgcgc gctgccacac gccgatgctc ttcgctgcca cgctcaatca agtcgatcgc 180 gacggcggct acaccggttg gacgcctgcg caattcgtcg ccgagatgcg tcgctatgcc 240 gtccgctatg gctgcaccac cccgctctat ccttgcctgg atcacggcgg gccgtggctc 300 aaagatcgcc atgcacagga aaagctaccg ctcgaccagg cgatgcatga ggtcaagctg 360 agcctcaccg cctgtctgga ggccggctac gcgctgctgc acatcgaccc cacggtcgat 420 cgcacgctcc cgcccggaga agcgccgctc gtgccgatcg tcgtcgagcg cacggtcgag 480 ctgatcgaac atgccgaaca ggagcgacag cggctgaacc tgccggcggt cgcctatgaa 540 gtcggcaccg aagaagtaca tggcgggctg gtgaatttcg acaattttgt cgccttcttg 600 gatttgctca aggcaaggct tgaacaacgt gccctgatgc acgcctggcc cgccttcgtg 660 gtggcgcagg tcggcactga cctgcataca acgtattttg accccagtgc ggcgcaacgg 720 ctgactgaga tcgtgcgccc taccggtgca ctgttgaagg ggcactacac cgactgggtc 780 gaaaatcccg ccgactatcc gagggtaggc atgggaggcg ccaacgttgg tccagagttt 840 acggcggccg agttcgaggc gctggaagcg ctggaacggc gggaacaacg gctgtgcgcc 900 aaccggaaat tgcagcccgc ctgttttttg gctgcactgg aagaggcagt agtcgcttca 960 gatcgttggc ggaagtggct ccagcccgat gagatcggca agccctttgc agaattaacg 1020 cccgcacgcc ggcgctggct cgtgcagacc ggggcacgct acgtctggac tgcgccgaaa 1080 gttatcgccg cacgcgaaca gctctatgcg cacctctccc ttgtgcaggc ggatccacat 1140 gcctacgtgg tagagtcagt cgcccggtca atcgagcgct atatcgatgc cttcaactta 1200 tacgacgccg ctacattgct tggatga 1227 <210> 19 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_TATH_F4E derived from Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus <400> 19 Met Asn Thr Glu His Pro Leu Lys Asn Val Val Lys Leu Gln Lys Lys 1 5 10 15 Gly Ile Pro Ile Gly Ile Tyr Ser Val Cys Ser Ala Asn Glu Ile Val 20 25 30 Ile Gln Val Ala Met Glu Lys Ala Leu Ser Met Asp Ser Tyr Val Leu 35 40 45 Ile Glu Ala Thr Ala Asn Gln Val Asn Gln Tyr Gly Gly Tyr Thr Asn 50 55 60 Met Lys Pro Ile Asp Phe Arg Asp Phe Val Tyr Ser Ile Ala Lys Arg 65 70 75 80 Ile Asn Phe Pro Glu Asn Arg Ile Ile Leu Gly Gly Asp His Leu Gly 85 90 95 Pro Leu Pro Trp Lys Asn Gln Gln Ala Lys Lys Ala Met Glu Glu Ala 100 105 110 Lys Glu Leu Val Lys Gln Phe Val Met Ala Gly Phe Thr Lys Ile His 115 120 125 Val Asp Thr Ser Met Leu Leu Gly Asp Asp Asn Ile Asn Ile Lys Leu 130 135 140 Asp Thr Glu Thr Ile Ala Glu Arg Gly Ala Ile Leu Val Ser Val Ala 145 150 155 160 Glu Arg Ala Phe Glu Glu Leu Lys Lys Phe Asn Pro Tyr Ala Leu His 165 170 175 Pro Val Tyr Val Ile Gly Ser Glu Val Pro Val Pro Gly Gly Ser Gln 180 185 190 Lys Glu Asn Asn Asn Glu Ile Gln Val Thr Lys Pro Thr Asp Phe Glu 195 200 205 Glu Thr Val Glu Val Tyr Lys Ser Thr Phe Tyr Lys Tyr Gly Leu Gly 210 215 220 Asn Ala Trp Glu Asp Val Val Ala Val Val Val Gln Ala Gly Val Glu 225 230 235 240 Phe Gly Val Glu Asp Ile His Glu Tyr Asp His Gln Gln Ala Glu Asn 245 250 255 Leu Val Ser Ala Leu Lys Lys Tyr Pro Asn Leu Val Phe Glu Ala His 260 265 270 Ser Thr Asp Tyr Gln Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Met Val Arg Asp 275 280 285 Gly Phe Ala Ile Leu Lys Val Gly Pro Glu Leu Thr Phe Ala Leu Arg 290 295 300 Glu Gly Leu Phe Ala Leu Asn Ile Ile Glu Lys Glu Leu Phe Lys Asp 305 310 315 320 Asn His Asp Ile Glu Met Ser Asn Phe Ile Asp Ile Leu Asp Thr Ala 325 330 335 Met Leu Asn Asn Pro Lys Tyr Trp Glu Gln Tyr Tyr Tyr Gly Asp Asp 340 345 350 Asn Lys Ile Arg Ile Ala Arg Lys Tyr Ser Tyr Ser Asp Arg Cys Arg 355 360 365 Tyr Tyr Leu Ile Glu Asn Glu Val Arg Ala Ser Met Ser Arg Leu Phe 370 375 380 Lys Asn Leu Thr Asn Val Glu Ile Pro Leu Thr Leu Ile Ser Gln Tyr 385 390 395 400 Met Pro Ile Gln Tyr Glu Lys Ile Arg Met Gly Leu Leu Lys Asn Asp 405 410 415 Pro Glu Asn Leu Val Lys Asp Lys Ile Gly Asn Cys Ile Asp Lys Tyr 420 425 430 Leu Tyr Ala Thr Asn Pro Thr Ser Gly Glu Phe Lys Leu Ile 435 440 445 <210> 20 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of Tagatose-biphosphate aldolase, CJ_TATH_F4E derived from Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus <400> 20 atgaatacag aacatccttt gaaaaacgtt gttaaactac aaaaaaaggg aattccaata 60 ggtatttatt cagtttgtag tgcaaatgaa atagttattc aagttgcaat ggagaaggca 120 ttgagtatgg atagttatgt tttaattgaa gcaacggcta atcaagtaaa tcaatatggt 180 ggctatacga atatgaaacc tattgatttt agagattttg tgtattctat agccaaaagg 240 ataaacttcc cagaaaatag aataatcctt ggcggggacc acttaggacc tttgccatgg 300 aaaaatcaac aagcgaaaaa agcaatggaa gaagcaaaag aacttgttaa acaatttgtg 360 atggctggct ttacgaaaat tcatgtagat acaagtatgc ttcttggaga tgataacata 420 aatatcaaac tagatactga aactattgcg gagagaggag cgatacttgt atcagtagca 480 gaaagagctt ttgaggagtt aaaaaagttt aatccttatg ctcttcatcc agtttatgta 540 ataggtagtg aagttcctgt tccaggaggt tctcaaaaag aaaataataa tgaaatacaa 600 gtaacaaagc cgacggattt tgaagaaact gtggaagtgt ataaaagcac tttctataaa 660 tatggtttag gaaacgcatg ggaagatgtt gtagcagtgg ttgtgcaggc tggggtggaa 720 tttggagttg aagatattca tgaatatgat caccaacagg ctgaaaattt agtaagtgct 780 ttaaaaaagt atcctaattt agtatttgaa gcccactcta cggattatca acctgcaaaa 840 ctactaaaag aaatggtgag agatggattt gctatactta aagttggacc tgaattgact 900 tttgcattaa gggaaggatt gtttgctctg aatattatag aaaaagaatt atttaaagat 960 aatcatgata ttgagatgtc aaattttatt gatatccttg atacagcaat gttaaataat 1020 ccgaagtatt gggaacagta ttattacggt gatgataata aaattagaat tgctagaaaa 1080 tacagctatt ctgatagatg taggtattat ctaatcgaaa atgaagttag agcatctatg 1140 tctaggttgt ttaaaaattt aacaaatgtt gagataccat taaccttgat aagtcagtat 1200 atgcctattc aatatgaaaa aattagaatg ggactattaa aaaatgatcc tgagaattta 1260 gtaaaagata aaattggaaa ttgcattgat aagtatttgt atgctactaa tccgacaagt 1320 ggagaattta aactaatata a 1341

Claims

타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 타가토스 생산용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 과당을 추가로 포함하는, 타가토스 생산용조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 또는 19의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-이인산 알돌레이즈를 하나 이상 포함하는 것인, 타가토스 생산용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈는 썸언에어로드릭스 sp. 유래 효소 또는 그 변이체, 언에어로리네 sp. 유래 효소 또는 그 변이체, 코스모토가 sp. 유래 효소 또는 그 변이체, 로도써무스 sp. 유래의 효소 또는 그 변이체, 림노초르다 sp. 유래의 효소 또는 그 변이체, 칼디스리스 sp 또는 칼디셀룰로시럽터 sp. 유래의 효소 또는 그 변이체로부터 유래된 것인, 타가토스 생산용 조성물.
과당을, 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시켜, 상기 과당을 타가토스로 전환시키는 단계를 포함하는 타가토스의 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 접촉은 pH 5.0 내지 pH 9.0 조건에서, 30℃ 내지 80℃ 온도 조건에서, 또는 0.5시간 내지 48시간 동안 수행하는, 타가토스 제조방법.