CN111344405A - 用于制备塔格糖的组合物和利用其制备塔格糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种包含果糖‑4‑差向异构酶的用于制备塔格糖的组合物，以及利用其制备塔格糖的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种包含果糖-4-差向异构酶的用于制备塔格糖的组合物，以及利用其制备塔格糖的方法。
背景技术
塔格糖是一种天然甜味剂，少量存在于诸如牛奶、奶酪、可可等食物中，以及诸如苹果和橘子的甜水果中。塔格糖的热量值为1.5kcal/g(蔗糖的三分之一)，血糖指数(Glycemic index，GI)为3，是蔗糖的5％。塔格糖有类似于蔗糖的物理性质和甜味并具有多种健康益处。就此而言，塔格糖可作为能够同时满足口感和健康的替代甜味剂应用于多种产品。
常规已知或广泛应用的塔格糖制备方法包括使用半乳糖作为主要原料的化学方法(催化反应)或生物方法(异构化酶反应)(参见PCT WO2006/058092，韩国专利号10-0964091和10-1368731)。然而，在已知的制备方法中，用作主要原料的半乳糖的基础原料为乳糖，而乳糖的价格不稳定，其取决于全球市场上生乳和乳糖的产量、供应量和需求量等。因此，其稳定供应受到限制。因此，需要并研究一种能够以常用糖(蔗糖、葡萄糖、果糖等)作为原料制备塔格糖的新方法。文献分别公开了由葡萄糖、半乳糖和果糖制备半乳糖、阿洛酮糖和塔格糖的方法(韩国专利号10-744479、10-1057873和10-1550796)。
同时，已知塔格糖-二磷酸醛缩酶(tagatose-bisphosphate aldolase：EC4.1.2.40)可以D-塔格糖1,6-二磷酸(D-tagatose 1,6-bisphosphate)为底物产生磷酸甘油酮(glycerone phosphate)和D-甘油醛3-磷酸(D-glyceraldehyde3-phosphate)，并参与半乳糖代谢，如下所示[反应式1]。然而，并无针对塔格糖-二磷酸醛缩酶是否具有制备塔格糖的活性的研究。
[反应式1]D-塔格糖1,6-二磷酸<＝>磷酸甘油酮+D-甘油醛3-磷酸
在此背景下，本发明的发明人进行了广泛的研究以开发具有将果糖转化为塔格糖的活性的酶，结果，他们发现塔格糖-二磷酸醛缩酶具有将果糖转化为塔格糖的功能，从而完成本发明。
发明内容
本发明的一目的在于提供一种用于制备塔格糖的组合物，其包含塔格糖-二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖-二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物。
本发明的另一目的在于提供一种制备塔格糖的方法，其包括使果糖与本发明的果糖-4-差向异构酶(fructose-4-epimerase)、表达所述果糖-4-差向异构酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将果糖转化成塔格糖。
本发明的其他目的和优势将借由以下详细说明和随附的权利要求与附图进行详细阐明。本说明书中未描述的内容可由本领域或相似领域的技术人员充分认知、推导，因而省略其说明。
具体实施方式
以下具体地对本发明的内容进行说明。同时，本发明中公开的各说明和实施方案均可应用到其他说明和实施方案。此外，对本发明中公开的各种元素的组合落入本发明的范围。此外，本发明的范围不为以下的具体描述所限制。
为达到本发明的目的，本发明在一方面提供一种用于制备塔格糖的组合物，其包含塔格糖-二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖-二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物。
塔格糖-二磷酸醛缩酶为塔格糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.40)。例如，塔格糖-二磷酸醛缩酶没有任何限制，只要其能够以果糖为底物而产生塔格糖。具体而言，塔格糖-二磷酸醛缩酶将作为底物的果糖转化为塔格糖的转化率(转化率＝塔格糖重量/初始果糖重量*100)可为0.01％或以上，具体而言，为0.1％或以上，更具体而言，为0.3％或以上。更具体而言，转化率可为0.01％至40％、0.1％至30％、0.3％至25％或0.3％至20％。
具体而言，塔格糖-二磷酸醛缩酶可包含由SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17或19的氨基酸序列组成的多肽，或者与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17或19的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、97％或99％的同源性的多肽。显然，具有所述同源性且表现出与SEQID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17或19的氨基酸序列组成的蛋白相应的功效(即，将果糖的第4碳位置差向异构化而转化为塔格糖的果糖-4-差向异构化活性)的氨基酸序列的多肽，即便具有一部分序列缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列，都包含在本发明的范围内。此外，根据已知核苷酸序列制备的探针，例如，可在严格条件下与编码所述多肽的核苷酸序列的全部或部分的互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽，亦可无限制地包括在内，只要其具有果糖-4-差向异构化活性即可。另外，所述组合物可包含一或多种由SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17或19的氨基酸序列组成的塔格糖-二磷酸醛缩酶。
本发明揭示了“塔格糖-二磷酸醛缩酶”表现出果糖-4-差向异构化活性，通过将果糖的第4碳位置差向异构化而将果糖转化成塔格糖。因此，在本发明中，“塔格糖-二磷酸醛缩酶”可与“果糖-4-差向异构酶”互换使用。
如本文所用，术语“严格条件”是指可实现多核苷酸之间特异性杂交的条件。这些条件取决于多核苷酸的长度和互补程度，这些参数是本领域众所周知的，并且在文献中有具体描述(例如，下文的J.Sambrooket et al.)。严格条件可以包括，例如，具有高同源性的基因彼此杂交、具有80％或以上、90％或以上、95％或以上、97％或以上、99％或以上的同源性的基因彼此杂交，同源性低于所述的基因彼此不杂交的条件；或于Southern杂交的常规清洗条件，即在60℃、1×SSC、0.1％SDS，具体而言60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，并且更具体而言68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度和温度下，清洗一次，具体而言，清洗两次或三次的条件。杂交中使用的探针可以是核苷酸序列的互补序列的一部分。此种探针可以通过PCR来制备，以基于已知序列的寡核苷酸为引物和包含这些核苷酸序列的DNA片段为模板。此外，本领域技术人员可视需要而根据诸如探针的长度的因素来调节温度和清洗溶液的盐浓度。
如本文所用，术语“同源性”是指两个多核苷酸或多肽部分(moiety)之间的相同性的百分比。可以通过本领域中的已知技术来确定自一部分至另一部分的序列同源性。例如，可以使用下列方式确定同源性：使用现成的并且能够比对序列信息的计算机程序(例如，BLAST2.0)直接地比对两个多核苷酸分子或两个多肽分子的序列信息，例如得分(score)、相同性(identity)、相似性(similarity)等参数。另外，多核苷酸的同源性可以通过如下方式确定：在同源区域间形成稳定的双链的条件下杂交多核苷酸，然后用单链特异性核酸酶消化杂交的链来确定消化的片段的大小。
在一具体实施方案中，本发明的果糖-4-差向异构酶可为源自耐热微生物的酶，例如，源自Thermanaerothrix sp.的酶或其变体、源自Kosmotoga sp.的酶或其变体、源自红嗜热盐菌(Rhodothermus sp.)的酶或其变体、源自Limnochorda sp.的酶或其变体、源自暖发菌(Caldithrix sp.)、暖绳菌(Caldilinea sp.)、热厌氧杆菌(Thermoanaerobactersp.)、酸杆菌(Acidobacteriales sp.)或热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor sp.)的酶或其变体。具体而言，本发明的果糖-4-差向异构酶可为源自Thermanaerothrix daxensis、Kosmotoga olearia、Rhodothermus profundi、海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)、Limnochorda pilosa、Caldithrix abyssi、Caldilinea aerophila、热产硫化氢热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)、酸杆菌细菌(Acidobacterialesbacterium)或Caldicellulosiruptor kronotskyensis的酶或其变体。更具体而言，本发明的果糖-4-差向异构酶可为源自Rhodothermus profundi DSM 22212或海洋红嗜热盐菌ATCC 43812的酶或其变体。
本发明的果糖-4-差向异构酶或其变体的特征在于，通过将D-果糖的第4碳位置差向异构化，将D-果糖转化成D-塔格糖。已知果糖-4-差向异构酶具有塔格糖-二磷酸醛缩酶活性，以D-塔格糖1,6-二磷酸为底物产生磷酸甘油酮和D-甘油醛3-磷酸，并参与半乳糖代谢。本发明首次揭示了塔格糖-二磷酸醛缩酶具有果糖-4-差向异构酶活性。因此，本发明的一实施方案涉及塔格糖-二磷酸醛缩酶的新用途，包括在自果糖制备塔格糖时将塔格糖-二磷酸醛缩酶用作果糖-4-差向异构酶。此外，本发明的另一实施方案涉及一种将塔格糖-二磷酸醛缩酶用作果糖-4-差向异构酶自果糖制备塔格糖的方法。
在一实施方案中，本发明的果糖-4-差向异构酶可为具有高耐热性的酶。具体而言，本发明的果糖-4-差向异构酶可在50℃至70℃下表现出其最大活性的50％至100％、60％至100％、70％至100％或75％至100％。更具体而言，本发明的果糖-4-差向异构酶可于55℃至60℃、60℃至70℃、55℃、60℃或70℃下表现出其最大活性的80％至100％或85％至100％。
此外，由SEQ ID NO：1组成的果糖-4-差向异构酶可由SEQ ID NO：2的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO：3组成的果糖-4-差向异构酶可由SEQ ID NO：4的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO：5组成的果糖-4-差向异构酶可由SEQ ID NO：6的核苷酸序列编码；由SEQ IDNO：7组成的果糖-4-差向异构酶可由SEQ ID NO：8的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO：9组成的果糖-4-差向异构酶可由SEQ ID NO：10的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO：11组成的果糖-4-差向异构酶可由SEQ ID NO：12的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO：13组成的果糖-4-差向异构酶可由SEQ ID NO：14的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO：15组成的果糖-4-差向异构酶可由SEQ ID NO：16的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO：17组成的果糖-4-差向异构酶可由SEQID NO：18的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO：19组成的果糖-4-差向异构酶可由SEQ ID NO：20的核苷酸序列编码，但不限制于此。
本发明的果糖-4-差向异构酶或其变体可通过以下方式获得：用表达本发明的酶或其变体的DNA(例如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18或20)转化微生物(例如大肠杆菌(E.coli))，培养所述微生物以获得培养物，破碎培养物，然后使用柱等进行纯化。除大肠杆菌(Escherichia coli)外，用于转化的微生物还可包括谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
在一具体实施方案中，转化的微生物可为大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_TD_F4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_KO_F4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RP_F4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RM_F4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_LP_F4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_Cab_F4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_Ckr_、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_CAE_F4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_TATH_F4E或大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_AB_F4E。将这些微生物根据《布达佩斯条约》的规定，保藏于国际保藏单位韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms)，保藏号分别为KCCM11995P(保藏日：2017年3月20日)、KCCM11999P(保藏日：2017年3月24日)、KCCM12097P(保藏日：2017年8月11日)、KCCM12096P(保藏日：2017年8月11日)、KCCM12095P(保藏日：2017年8月11日)、KCCM12107P(保藏日：2017年9月13日)、KCCM12108P(保藏日：2017年9月13日)、KCCM12233P(保藏日：2018年3月23日)、KCCM12234P(保藏日：2018年3月23日)和KCCM12237P(保藏日：2018年3月23日)。
本发明中使用的果糖-4-差向异构酶可由编码所述果糖-4-差向异构酶的核酸来提供。
如本文所用，术语“核酸”具有涵盖DNA或RNA分子的含义，其中作为核酸的基本组成单元的核苷酸不仅可包括天然核苷酸，还可包括具有糖或碱基修饰的类似物(参见：Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980)；Uhlman及Peyman,ChemicalReviews,90:543-584(1990))。
本发明的核酸可为这样的核酸，其编码本发明的由SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17或19的氨基酸序列组成的多肽，或编码与本发明的果糖4-差向异构酶具有至少80％、90％、95％、97％或99％的同源性且具有果糖-4-差向异构酶活性的多肽。例如，编码由SEQID NO：1的氨基酸序列组成的果糖-4-差异构酶的核酸可为这样的核酸，其与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少80％、90％、95％、97％、99％或100％的同源性。另外，例如，编码由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的果糖-4-差向异构酶的核酸可为这样的核酸，其与SEQ IDNO：4的核苷酸序列具有至少80％、90％、95％、97％、99％或100％的同源性。这也适用于编码本文所述其他氨基酸序列的酶的核酸。同样显然地，本发明的核酸可包括由于密码子简并性(codon degeneracy)而翻译成本发明的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶的核酸，或这样的核酸，其在严格条件下与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18或20的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的核酸杂交，且编码具有本发明的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶活性的多肽。可在本发明中使用的表达果糖-4-差向异构酶的微生物可为包含重组载体的微生物，其中所述重组载体包含所述核酸。载体可以可操作地连接至本发明的核酸。如本文所用，术语“可操作地连接”是指为了执行一般功能而将核苷酸表达调节序列与编码目标蛋白的核苷酸序列可操作地彼此连接，从而影响编码核苷酸序列的表达。可以利用本领域已知的基因重组技术实现与载体的可操作连接，并且可以利用本领域已知的限制性酶和连接酶实现位点特异性的DNA切割和连接。如本文所用，术语“载体”是指用于将碱基克隆和/或转移至生物体(例如宿主细胞)中的任何介质。载体可为复制子(replicon)，其能够使组合有不同DNA片段的组合片段进行复制。在此，术语“复制子”是指任意遗传单位(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)，其作为体内DNA复制的自复制单元起作用，即能够通过自调节来实现复制。如本文所用，术语“载体”可以包括用于在体外、离体或体内将碱基引入生物体(例如宿主细胞)中的病毒和非病毒介质，并且还可包括微环DNA、如睡美人(Sleeping Beauty)的转座子(Izsvak et al.,J.MoI.Biol.302:93-102(2000))或人工染色体。常用的载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A等作为噬菌体载体或粘粒载体；可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL和pET等的载体作为质粒载体。可以在本发明中使用的载体没有特别限制，可以使用任何已知的表达载体。此外，载体可为重组载体，其特征在于还包含各种抗生素抗性基因。如本文所用，术语“抗生素抗性基因”是指对抗生素具有抗性的基因，并且具有该基因的细胞可在经相应抗生素处理的环境中存活。因此，在大肠杆菌中产生大量质粒的过程中，将抗生素抗性基因用作选择标记。本发明中的抗生素抗性基因并非对本发明的核心技术(由载体的最佳组合实现的表达效率)产生较大影响的因素，因此可以无限制地使用通常用作选择标记的抗生素抗性基因。具体实例可包括针对氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素、链霉素或新霉素等的抗性基因。
可使用将包含编码所述酶的核酸的载体导入宿主细胞的方法获得用于本发明的表达果糖-4-差向异构酶的微生物，转化所述载体的方法可为任何能将核酸导入细胞的方法。可以选择并执行本领域已知的适当标准技术。可以包括电穿孔、磷酸钙共沉淀、逆转录病毒感染、显微注射、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法和热激法，但不限于此。
只要转化的基因能在宿主细胞中表达即可，其可以整合并置于宿主细胞的染色体中，或存在于染色体外。此外，所述基因包括DNA和RNA作为编码多肽的多核苷酸，并且可无限制地使用任何形式，只要能将其导入宿主细胞并在其中表达即可。例如，可以以表达盒的形式将基因导入宿主细胞，所述表达盒为包含自主表达所需的所有元件的多核苷酸构建体。通常，表达盒包括与基因可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可为能够自我复制的表达载体的形式。另外，可以将基因本身或多核苷酸构建体形式的基因引入宿主细胞中，并与在宿主细胞中表达所需的序列可操作地连接。
本发明的微生物可包括原核微生物或真核微生物，只要是通过导入本发明的核酸或重组载体而可产生本发明的果糖-4-差向异构酶的微生物即可。例如，所述微生物可包括属于埃希氏菌(Escherichia)属、欧文氏菌(Erwinia)属、沙雷氏菌(Serratia)属、普罗威登斯菌(Providencia)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属和短杆菌(Brevibacterium)属的微生物菌株，具体而言，可为但不限于大肠杆菌(E.coli)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。所述微生物的具体实例可包括大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_TD_F4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_KO_F4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RP_F4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RM_F4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_LP_F4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_Cab_F4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_Ckr_F4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_CAE_F4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_TATH_F4E以及大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_AB_F4E。
除导入所述核酸或载体以外，本发明的微生物可包括经由各种已知方法而能够表达本发明的果糖-4-差向异构酶的任何微生物。
本发明的微生物的培养物可通过在培养基中培养能够表达本发明的塔格糖-二磷酸醛缩酶的微生物来制备。
如本文所用，术语“培养”指使微生物在控制得当的环境条件下生长。本发明的培养过程可根据本领域已知的适当的培养基和培养条件进行。本领域技术人员可根据选择的菌株容易地地调整培养过程。培养微生物的步骤可以但不特别限定于通过已知的分批培养、连续培养或补料分批培养进行。至于培养条件，可使用碱性化合物(例如，氢氧化钠，氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)来调节恰当的pH(例如，pH5至9，具体而言，pH7至9)，但不特别限定于此。另外，可以在培养过程中加入如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂来抑制泡沫的产生。此外，可向培养物中注入氧气或含氧气体以保持培养物的有氧状态；也可不注入气体或注入氮气、氢气或二氧化碳气体，以维持培养物的厌氧或微氧状态。培养温度可维持在25℃至40℃，具体地，30℃至37℃，但不限于此。可持续培养直至获得所需量的有用材料为止，具体地，可持续约0.5小时至约60小时，但不限于此。此外，使用的培养基可包括作为糖源的糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油脂(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)和有机酸(例如，乙酸)。这些物质可单独或混合使用，但不限于此。氮源可包括含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、豆粕和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)。这些氮源也可单独或混合使用，但不限于此。磷源可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或其相应的钠盐。这些磷源也可单独或混合使用，但不限于此。培养基可包含必需的生长刺激剂，例如金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素。
本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含果糖。
本发明的用于制备塔格糖的组合物可包括塔格糖-二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖-二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物，所述塔格糖-二磷酸醛缩酶具有直接将果糖转化成塔格糖的果糖-4-差向异构化活性。所述组合物的特征在于不包含以果糖为底物的酶以外的其他酶。
例如，本发明的用于制备塔格糖的组合物的特征可在于，不包含
例如α-葡聚糖磷酸化酶(α-glucan phosphorylase)、淀粉磷酸化酶(starchphosphorylase)、麦芽糊精磷酸化酶(maltodextrin phosphorylase)或蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase)，表达所述α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶的微生物或所述微生物的培养物；
葡萄糖激酶(glucokinase)、表达所述葡萄糖激酶的微生物或所述微生物的培养物；
塔格糖-6-磷酸磷酸酶(tagatose-6-phosphate phosphatase)、表达所述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培养物；和/或
α-淀粉酶(α-amylase)、支链淀粉酶(pullulanase)、葡萄糖淀粉酶(glucoamylase)、蔗糖酶(sucrase)或异淀粉酶(isoamylase)，表达所述α-淀粉酶、支链淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶的微生物，或表达所述α-淀粉酶、支链淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶的微生物的培养物。
本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含通常用于相应的用于制备塔格糖的组合物的任何合适的赋形剂。赋形剂可包括，例如，防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂等，但不限于此。
本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含金属。在一实施方案中，本发明的金属可为包含二价阳离子的金属。具体而言，本发明的金属可为镍、镁(Mg)或锰(Mn)。更具体而言，本发明的金属可为金属离子或金属盐，更具体而言，所述金属盐可为MgSO4、NiSO4、NiCl2、MgCl2、MnCl2或MnSO4。
本发明的又一方面提供一种制备塔格糖的方法，其包括使D-果糖与本发明的果糖-4-差向异构酶、表达所述果糖-4-差向异构酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将D-果糖转化为塔格糖。
在一实施方案中，本发明的接触可在pH 5.0至pH 9.0和30℃至80℃的条件下进行和/或进行0.5小时至48小时。
具体而言，本发明的接触可在pH 6.0至pH 9.0或pH 7.0至pH 9.0的条件下进行。此外，本发明的接触可在35℃至80℃、40℃至80℃、45℃至80℃、50℃至80℃、55℃至80℃、60℃至80℃、30℃至70℃、35℃至70℃、40℃至70℃、45℃至70℃、50℃至70℃、55℃至70℃、60℃至70℃、30℃至65℃、35℃至65℃、40℃至65℃、45℃至65℃、50℃至65℃、55℃至65℃、30℃至60℃、35℃至60℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或55℃至60℃进行。此外，本发明的接触可进行0.5小时至36小时、0.5小时至24小时、0.5小时至12小时、0.5小时至6小时、1小时至48小时、1小时至36小时、1小时至24小时、1小时至12小时、1小时至6小时、3小时至48小时、3小时至36小时、3小时至24小时、3小时至12小时、3小时至6小时、6小时至48小时、6小时至36小时、6小时至24小时、6小时至12小时、12小时至48小时、12小时至36小时、12小时至24小时、18小时至48小时、18小时至36小时或18小时至30小时。
在一实施方案中，本发明的接触可在金属的存在下进行。可使用的金属与上述实施方案相同。
本发明的制备方法可进一步包括对制备的塔格糖进行分离和/或纯化。分离和/或纯化可使用本领域通常使用的方法。非限制性实例可包括透析、沉淀、吸附、电泳、离子交换层析法、分级结晶等。可仅使用一种方法，也可使用两种或更多种方法进行纯化。
另外，本发明的制备方法可进一步包括在分离和/或纯化步骤之前或之后进行脱色和/或脱盐的步骤。通过进行脱色和/或脱盐，可获得质量更高的塔格糖。
在另一实施方案中，本发明的制备方法可在本发明的转化为塔格糖的步骤、进行分离和/或纯化的步骤、或进行脱色和/或脱盐后，进一步包括对塔格糖进行结晶的步骤。可利用通常使用的结晶方法进行所述结晶步骤。例如，可使用冷却结晶来进行结晶。
在又一实施方案中，本发明的制备方法可进一步包括在结晶之前对塔格糖进行浓缩的步骤。浓缩可提高结晶效率。
在又一实施方案中，本发明的制备方法可在本发明的分离和/或纯化后，进一步包括使未反应的果糖与本发明的酶、表达所述酶的微生物或所述微生物的培养物接触的步骤，在本发明的结晶之后，还包括将结晶分离的母液再使用于分离和/或纯化步骤，或其组合。利用附加步骤，能够以更高的产率获得塔格糖，并且可减少废弃的果糖量，因此具有经济性优点。
有益效果
本发明的塔格糖-二磷酸醛缩酶为果糖-4-差向异构酶，其具有优异的耐热性，可工业化制备塔格糖，并且将普通糖果糖转化为塔格糖，因此在经济上是可行的。
附图说明
图1为HPLC层析结果，显示本发明一实施方案中制备的塔格糖-二磷酸醛缩酶(CJ_TD_F4E和CJ_KO_F4E)具有果糖-4-差向异构酶活性。
图2为显示本发明一实施方案中制备的塔格糖-二磷酸醛缩酶(CJ_TD_F4E和CJ_KO_F4E)与温度的变化对应的果糖-4-差向异构酶活性的图表。
图3为HPLC图谱，显示本发明一实施方案中制备的塔格糖-二磷酸醛缩酶(CJ_RP_F4E和CJ_RM_F4E)具有果糖-4-差向异构酶活性。
图4a为显示本发明一实施方案中制备的塔格糖-二磷酸醛缩酶(CJ_RP_F4E)与温度的变化对应的果糖-4-差向异构酶活性的图表。
图4b为显示本发明一实施方案中制备的塔格糖-二磷酸醛缩酶(CJ_RM_F4E)与温度的变化对应的果糖-4-差向异构酶活性的图表。
图5a为显示本发明一实施方案中制备的塔格糖-二磷酸醛缩酶(CJ_RP_F4E)与金属的添加对应的果糖-4-差向异构化活性的图表。
图5b为显示本发明一实施方案中制备的塔格糖-二磷酸醛缩酶(CJ_RM_F4E)与金属的添加对应的果糖-4-差向异构化活性的图表。
图6为HPLC图谱，显示在本发明一实施方案中制备的塔格糖-二磷酸醛缩酶(CJ_LP_F4E)具有果糖-4-差向异构酶活性。
图7a为显示本发明一实施方案中制备的塔格糖-二磷酸醛缩酶(CJ_LP_F4E)的与温度的变化对应的果糖-4-差向异构酶活性的图表。
图7b为显示本发明一实施方案中制备的塔格糖-二磷酸醛缩酶(CJ_LP_F4E)与金属的添加对应的果糖-4-差向异构化活性的图表。
图8a为HPLC图谱，显示本发明一实施方案中制备的塔格糖-二磷酸醛缩酶(CJ_Cab_F4E)具有果糖-4-差向异构酶活性。
图8b为HPLC图谱，显示本发明一实施方案中制备的CJ_Ckr_F4E具有果糖-4-差向异构酶活性。
图9a为显示本发明一实施方案中制备的CJ_Cab_F4E与温度对应的果糖-4-差向异构化活性的图表。
图9b为显示本发明一实施方案中制备的CJ_Ckr_F4E与温度对应的果糖-4-差向异构化活性的图表。
图10a为显示本发明一实施方案中制备的CJ_Cab_F4E与金属的添加对应的果糖-4-差向异构化活性的图表。
图10b为显示本发明一实施方案中制备的CJ_Ckr_F4E与金属的添加对应的果糖-4-差向异构化活性的图表。
图11为HPLC图谱，显示本发明一实施方案中制备的CJ_CAE_F4E具有果糖-4-差向异构酶活性。
图12为HPLC图谱，显示本发明一实施方案中制备的CJ_TATH_F4E具有果糖-4-差向异构酶活性。
图13为HPLC图谱，显示本发明一实施方案中制备的CJ_AB_F4具有果糖-4-差向异构酶活性。
实施例
在下文中，参照下列实施例更详细地对本发明进行说明。然而，本发明的以下实施例仅为本发明的示例。对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施例旨在更详细地描述本发明，并且随附权利要求书所提出的本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1：塔格糖-二磷酸醛缩酶的制备及其活性的评估
实施例1-1：包含塔格糖-二磷酸醛缩酶基因的重组表达载体和转化子的制备
为了提供新型耐热性果糖-4-差向异构酶，获得了源自Thermanaerothrixdaxensis和Kosmotoga olearia的塔格糖-二磷酸醛缩酶基因的信息，以制备可在大肠杆菌中表达的载体和转化微生物(转化子)。
具体而言，从登记在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因组百科全书)中的3种微生物(Thermanaerothrix daxensis、嗜热厌氧绳菌(Anaerolinea thermophila)和Kosmotoga olearia)的核苷酸序列中选取塔格糖-二磷酸醛缩酶的核苷酸序列，基于Thermanaerothrix daxensis的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和核苷酸序列(SEQ ID NO：2)，和Kosmotoga olearia的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)和核苷酸序列(SEQ ID NO：6)，在Bioneer Corp.合成通过插入可在大肠杆菌中表达的载体pBT7-C-His来制备重组表达载体。
为了诱导蛋白的表达，将各载体转化至用于大肠杆菌表达的菌株BL21(DE3)中，并分别命名为大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_TD_F4E和大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_KO_F4E。依照《布达佩斯条约》的规定，将大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_TD_F4E和大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_KO_F4E分别以保藏号KCCM11995P(保藏日：2017年3月20日)和KCCM11999P(保藏日：2017年3月24日)保藏于韩国微生物保藏中心。
实施例1-2：重组酶的制备和纯化
为了制备重组酶，将实施例1-1中制备的转化子大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_TD_F4E和大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_KO_F4E分别接种到装有5mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基的培养管中，然后在37℃的振荡培养箱中进行种菌培养，直至在600nm的吸光度达到2.0。将通过种菌培养获得的每种培养物接种在含有液体培养基的培养瓶中，所述液体培养基含有LB和作为蛋白表达调节因子的乳糖，然后进行主培养。培养期间，震荡速度保持在180rpm，培养温度保持在37℃。将各培养物在8,000rpm和4℃下离心20分钟以回收细胞。用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液将回收的细胞清洗两次，然后重悬于含有10mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液中。用超声仪破碎重悬的细胞。将细胞裂解液在13,000rpm和4℃下离心20分钟，仅取上清液。通过多聚组氨酸标签亲和层析法纯化各上清液，并应用10倍柱体积的含有20mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液以除去非特异性结合的蛋白。接下来，进一步用含有250mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液进行洗脱。使用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液进行透析来获得用以进行酶表征的酶。
实施例1-3：将果糖转化为塔格糖的活性的评估
为了测定实施例1-2中获得的酶的活性，使用30重量％的果糖，并向其中添加50mMTris-HCl(pH 8.0)、1mM CoSO4以及实施例2中分离的20mg/mL纯化的酶，并使其在60℃下反应2小时。检测经由3种果糖-4-差向异构酶(CJ_TD_F4E和CJ_KO_F4E)转化的塔格糖的浓度以及从果糖到塔格糖的转化率，结果显示CJ_TD_F4E的转化率为4.6％，CJ_KO_F4E的转化率为16.0％。转化率通过下式计算：转化率＝塔格糖重量/初始果糖重量×100。
另外，利用HPLC对反应后残余的果糖和产物塔格糖进行定量。使用Shodex SugarSP0810柱进行HPLC分析，柱温为80℃，流动相的水流速为1mL/min。图1中的峰值代表通过HPLC检测与定量的以果糖为底物的酶反应。
实施例1-4：温度对果糖-4-差向异构化活性的影响
为了研究温度对本发明酶的差向异构化活性的影响，将实施例1-2中制备的纯化的各种酶以1mg/mL加入到含有果糖的50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，并使其在50℃至80℃下反应3小时。利用HPLC对各反应后的溶液中的塔格糖进行定量。结果，本发明的两种酶均在70℃下显示出其最大活性(图2)。
实施例2：塔格糖-二磷酸醛缩酶的制备及其活性的评估
实施例2-1：包含塔格糖-二磷酸醛缩酶基因的重组表达载体和转化子的制备
为了鉴定本发明的新型耐热性的果糖-4-差向异构酶，获得了源自Rhodothermusprofundi DSM 22212和海洋红嗜热盐菌ATCC 43812的塔格糖-二磷酸醛缩酶基因的信息，以制备可在大肠杆菌中表达的载体和转化微生物。
具体而言，从登记在KEGG(京都基因和基因组百科全书)和NCBI(美国国家生物技术信息中心)中Rhodothermus profundi和海洋红嗜热盐菌ATCC 43812的核苷酸序列中，选取塔格糖-二磷酸醛缩酶的核苷酸序列，并且基于两种微生物的氨基酸序列(SEQ ID NO：7和9)和核苷酸序列(SEQ ID NO：8和10)，制备了包含所述酶的核苷酸序列且可在大肠杆菌中表达的重组载体pBT7-C-His-CJ_RP_F4E和pBT7-C-His-CJ_RM_F4E(Bioneer Corp.，韩国)。
通过热激转化法(Sambrook and Russell:Molecular cloning,2001)将各重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并冷冻保存在50％甘油中。将转化子分别命名为大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RP_F4E和大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RM_F4E，并于2017年8月11日分别以保藏号KCCM12097P和KCCM12096P，根据《布达佩斯条约》的规定，保藏于国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KCCM)。
实施例2-2：重组酶的制备和纯化
为了从实施例2-1中制备的转化子大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RP_F4E和大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RM_F4E制备重组酶，将各转化子接种至装有5mL含有氨苄青霉素抗生素的LB液体培养基的培养管中，然后在37℃的振荡培养箱中进行种菌培养，直至在600nm的吸光度达到2.0。将进行种菌培养所获得的各培养物接种至含有液体培养基的培养瓶中，所述液体培养基含有LB和作为蛋白表达调节因子的乳糖，然后进行主培养。在180rpm和37℃的条件下进行种菌培养和主培养。然后，将各培养物在8,000rpm和4℃下离心20分钟以回收细胞。用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液将回收的细胞清洗两次，然后重悬于含有10mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液中。用超声仪破碎重悬的细胞。将细胞裂解液在13,000rpm和4℃下离心20分钟，仅提取上清液。使用多聚组氨酸标签亲和层析法纯化各上清液，并应用10倍柱体积的含有20mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液以除去非特异性结合的蛋白。接下来，进一步用含有250mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液进行洗脱。使用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液进行透析，以获得纯化的酶CJ_RP_F4E和CJ_RM_F4E用以进行酶表征。
实施例2-3：自果糖向塔格糖的转化及活性的评估
为了测定实施例2-2中获得的本发明的重组酶CJ_RP_F4E和CJ_RM_F4E的果糖-4-差向异构化活性，于30重量％的果糖中添加50mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM NiSO4和各20mg/mL的CJ_RP_F4E和CJ_RM_F4E，并使其在60℃反应10小时。
随后，利用HPLC对反应后残余的果糖和产物塔格糖进行定量。使用Shodex SugarSP0810柱进行HPLC分析，柱温为80℃，流动相的水流速为1mL/min(图3)。
结果，证实了通过本发明的CJ_RP_F4E和CJ_RM_F4E将果糖转化为塔格糖的转化率分别为5.7％和11.1％。
实施例2-4：与温度对应的重组酶的活性的检测
为了检测温度对实施例2-2中制备的CJ_RP_F4E和CJ_RM_F4E的果糖-4-差向异构化活性的影响，于包含10重量％的果糖的50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中添加各1mg/mL的CJ_RP_F4E和CJ_RM_F4E，并使其在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃的各温度下反应3小时。利用HPLC对各反应后的溶液中的塔格糖进行定量。
结果，CJ_RP_F4E在65℃下表现出其最大活性，在60℃至70℃下保持其最大活性的70％或以上，且在所有温度范围内保持其最大活性的50％或以上(图4a)。CJ_RM_F4E在70℃下表现出其最大活性，在55℃至70℃下保持其最大活性的70％或以上，且在所有温度范围内保持其最大活性的40％或以上(图4b)。
实施例2-5：与金属离子的添加对应的本发明的重组酶活性的检测
为了检测金属离子对实施例2-2中制备的CJ_RP_F4E和CJ_RM_F4E的果糖-4-差向异构化活性的影响，于包含10重量％的果糖的50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中添加各1mg/mL的CJ_RP_F4E和CJ_RM_F4E，以及各1mM的各种金属离子(ZnSO4、MgCl2、MnCl2、NH4Cl、CaCl2、Na2SO4、CuSO4、MgSO4、MnSO4、(NH4)2SO4或NiSO4)，并使其在60℃下反应5小时。利用HPLC对各反应后的溶液中的塔格糖进行定量。
结果，CJ_RP_F4E因添加NiSO4而活性增加，表明镍离子可增加活性(图5a)，CJ_RM_F4E因分别添加MnSO4或NiSO4而活性增加，表明锰离子或镍离子可增加本发明的重组酶的活性(图5b)。
实施例3：塔格糖-二磷酸醛缩酶的制备及其活性评估
实施例3-1：包含塔格糖-二磷酸醛缩酶基因的重组表达载体及转化子的制备
本发明的发明人获得了源自Limnochorda pilosa DSM 28787的塔格糖-二磷酸醛缩酶基因的信息，并制备了可在大肠杆菌中表达的重组载体和转化微生物。
更具体而言，从登记在KEGG(京都基因和基因组百科全书)和ENA(EuropeanNucleotide Archive，欧洲核苷酸数据库)中的Limnochorda pilosa的核苷酸序列中，选取塔格糖-二磷酸醛缩酶的核苷酸序列，并基于源自Limnochorda pilosa的塔格糖-二磷酸醛缩酶CJ_LP_F4E的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)和核苷酸序列(SEQ ID NO：12)，制备包含所述酶的核苷酸序列并可在大肠杆菌中表达的重组表达载体pBT7-C-His-CJ_LP_F4E(Bioneer Corp.，韩国)。
通过热激转化法(Sambrook and Russell:Molecular cloning,2001)将所述重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，然后冷冻保存在50％甘油中。将所述转化子命名为大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_LP_F4E，并于2017年8月11日以保藏号KCCM12095P，根据《布达佩斯条约》的规定，保藏于国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KCCM)。
实施例3-2：重组酶的制备和纯化
为了从实施例3-1中制备的转化子大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_LP_F4E制备本发明的重组酶，将转化子接种到装有5mL含有氨苄青霉素抗生素的LB液体培养基的培养管中，然后在37℃的震荡培养箱中进行种菌培养，直至在600nm的吸光度达到2.0。将通过种菌培养获得的培养物接种到培养瓶中，然后进行主培养，所述培养瓶装有含LB和作为蛋白表达调节因子的乳糖的液体培养基。在180rpm和37℃的条件下进行种菌培养和主培养。然后，将培养物在8,000rpm和4℃下离心20分钟以回收细胞。用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液清洗回收的细胞两次，并重悬在含有10mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液中。用超声仪破碎重悬的细胞。将细胞裂解液在13,000rpm和4℃下离心20分钟，仅取上清液。使用多聚组氨酸标签亲和层析法纯化上清液，并应用10倍柱体积的含有20mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液以除去非特异性结合的蛋白。接下来，进一步用含有250mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液进行洗脱。使用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液进行透析，以获得纯化的酶CJ_LP_F4E用以进行酶表征。
实施例3-3：评估重组酶将果糖转化为塔格糖的活性
为了测定实施例3-2中获得的重组酶CJ_LP_F4E的活性，于30重量％的果糖中添加50mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM NiSO4和20mg/mL的CJ_LP_F4E，并使其在60℃反应10小时。
进一步，利用HPLC对反应后残余的果糖和产物塔格糖进行定量。使用ShodexSugar SP0810柱进行HPLC分析，柱温为80℃，流动相的水流速为1mL/min(图6)。
结果，证实经本发明的CJ_LP_F4E将果糖转化为塔格糖的转化率为9.5％。
实施例3-4：与温度对应的重组酶活性的检测
为了检测温度对实施例3-2中制备的本发明的重组酶CJ_LP_F4E的果糖-4-差向异构化活性的影响，于含有10重量％果糖的50mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中添加1mg/mL的CJ_LP_F4E，并使其在45℃、50℃、55℃、60℃和70℃各温度下反应3小时。利用HPLC对每种反应后的溶液中的塔格糖进行定量。
结果，本发明的CJ_LP_F4E在60℃下表现出其最大活性，并且在45℃至70℃下保持其最大活性的50％或以上(图7a)。
实施例3-5：与金属离子的添加对应的重组酶活性的检测
已知公知的异构酶(例如，葡萄糖异构酶和阿拉伯糖异构酶)和差向异构酶(例如，阿洛酮糖3-差向异构酶)需要金属离子。因此，检测了金属离子是否会影响实施例3-2中制备的重组酶CJ_LP_F4E的果糖-4-差向异构化活性。
更具体而言，于含有10重量％的果糖的50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中添加2mg/mL的CJ_LP_F4E和各1mM的各种金属离子(NiSO4、CaCl2、ZnSO4、MgSO4、MnSO4、FeSO4、CuSO4或(NH4)2SO4)，然后测定酶活性。将未经金属离子处理的组作为对照组。利用HPLC对每种反应后的溶液中的塔格糖进行定量。
结果，本发明的CJ_LP_F4E因添加MnSO4或NiSO4而活性增加，表明CJ_LP_F4E需要如锰离子或镍离子的金属离子。尤其是，在添加NiSO4时CJ_LP_F4E表现出其最大活性(图7b)。
实施例4：塔格糖-二磷酸醛缩酶的制备及其活性的评估
实施例4-1：包含塔格糖-二磷酸醛缩酶基因的重组载体和重组微生物的制备
为了鉴定新型的耐热性果糖-4-差向异构酶，获得了源自Caldithrix abyssi DSM13497和Caldicellulosiruptor kronotskyensis DSM 18902的塔格糖-二磷酸激醛缩酶基因的信息，以制备可在大肠杆菌中表达的载体和转化微生物。
具体而言，从登记在KEGG(京都基因和基因组百科全书)及NCBI(美国国家生物技术信息中心)中的Caldithrix abyssi DSM 13497和Caldicellulosiruptorkronotskyensis的核苷酸序列中，选取塔格糖-二磷酸醛缩酶的核苷酸序列，并基于所述微生物的氨基酸序列(SEQ ID NO：13和15)和核苷酸序列(SEQ ID NO：14和16)，合成包含所述酶的核苷酸序列并可在大肠杆菌中表达的重组载体pBT7-C-His-CJ_Cab_F4E和pBT7-C-His-CJ_Ckr_F4E(Bioneer Corp.，韩国)。
通过热激转化法(Sambrook and Russell:Molecular cloning,2001)将制备的各重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中以制备重组微生物，并分别冷冻保存在50％甘油中。将重组微生物分别命名为大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_Cab_F4E和大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_Ckr_F4E，并于2017年9月13日分别以保藏号KCCM12107P和KCCM12108P，根据《布达佩斯条约》的规定，保藏于国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KCCM)。
实施例4-2：重组酶的制备和纯化
为了从实施例4-1中制备的重组微生物大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_Cab_F4E和大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_Ckr_F4E制备重组酶CJ_Cab_F4E和CJ_Ckr_F4E，将各重组微生物接种到装有5mL含有氨苄青霉素抗生素的LB液体培养基的培养管中，然后在37℃的震荡培养箱中进行种菌培养，直至在600nm的吸光度达到2.0。将通过种菌培养获得的各培养物接种到培养瓶中，然后进行主培养，所述培养瓶装有含LB和作为蛋白表达调节因子的乳糖的液体培养基。在180rpm和37℃的条件下进行种菌培养和主培养。然后，将各培养物在8,000rpm和4℃下离心20分钟以回收细胞。用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液清洗回收的细胞两次，并重悬在含有10mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液中。用超声仪破碎重悬的细胞。将细胞裂解液在13,000rpm和4℃下离心20分钟，仅取上清液。使用多聚组氨酸标签亲和层析法纯化各上清液，并应用10倍柱体积的含有20mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH8.0)缓冲液以除去非特异性结合的蛋白。接下来，进一步用含有250mM咪唑和300mMNaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液进行洗脱。使用50mMTris-HCl(pH 8.0)缓冲液进行透析，以获得纯化的酶CJ_Cab_F4E和CJ_Ckr_F4E用以进行酶表征。
实施例4-3：评估重组酶将果糖转化为塔格糖的活性
为了测定实施例4-2中获得的重组酶CJ_Cab_F4E和CJ_Ckr_F4E的果糖-4-差向异构化活性，于10重量％的果糖中添加50mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM MnSO4和各5mg/mL的CJ_Cab_F4E和CJ_Ckr_F4E，并使其在60℃反应24小时。
进一步，利用HPLC对反应后残余的果糖和产物塔格糖进行定量。使用ShodexSugar SP0810层析柱进行HPLC分析，柱温为80℃，流动相的水流速为1mL/min。
结果，证实经重组酶CJ_Cab_F4E和CJ_Ckr_F4E将果糖转化为塔格糖的转化率分别为3.8％和4.0％(图8a和8b)。
实施例4-4：与温度对应的重组酶的活性的检测
为了检测温度对实施例4-2中获得的重组酶CJ_Cab_F4E和CJ_Ckr_F4E的果糖-4-差向异构化活性的影响，于含有5重量％的果糖的50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中添加各5mg/mL的CJ_Cab_F4E和CJ_Ckr_F4E，并使其在37℃、40℃、50℃、55℃、60℃和70℃的各温度下反应5小时。利用HPLC对各反应后的溶液中的塔格糖进行定量。结果，CJ_Cab_F4E在55℃下表现出其最大活性，CJ_Ckr_F4E在60℃下表现出其最大活性，且两种酶均在50℃至70℃下保持其最大活性的75％或以上(表1，图9a和9b)。
表1.各温度下的相对活性(％)
| 分类 | CJ_Cab_F4E | CJ_CKr_F4E |
| 37℃ | - | 33.0 |
| 40℃ | 49.8 | - |
| 50℃ | 80.8 | 76.7 |
| 55℃ | 100.0 | 89.2 |
| 60℃ | 98.1 | 100.0 |
| 70℃ | 76.1 | 78.8 |
实施例4-5：与金属的添加对应的本发明的重组酶活性的检测
检测了金属是否会影响实施例4-2中制备的重组酶CJ_Cab_F4E和CJ_Ckr_F4E的果糖-4-差向异构化活性。
具体而言，于含有5重量％的果糖的50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中添加各5mg/mL的CJ_Cab_F4E和CJ_Ckr_F4E，以及各1mM的金属离子(MgSO4或MnSO4)，并使其在60℃下反应5小时。将未经金属离子处理的组作为对照组(w/o)。利用HPLC对各反应后的溶液中的塔格糖进行定量。
结果，CJ_Cab_F4E因添加MnSO4活性增加了约2倍，因添加MgSO4活性增加10倍或以上，表明锰离子或镁离子(或其盐)可增加CJ_Cab_F4E的果糖-4-差向异构化活性(图10a)。另外，CJ_Ckr_F4E在添加MgSO4时表现出与对照组相似的活性，但因添加MnSO4而活性增加约2倍，表明锰离子(或其盐)可增加CJ_Ckr_F4E的果糖-4-差向异构化活性(图10b)。
实施例5：塔格糖-二磷酸醛缩酶的制备及其活性的评估
实施例5-1：包含塔格糖-二磷酸醛缩酶基因的重组载体和重组微生物的制备
为了发现新型耐热性的果糖-4-差向异构酶，获得了源自Caldilinea aerophila的塔格糖-二磷酸醛缩酶基因的信息，以制备可在大肠杆菌中表达的载体和转化微生物。
具体而言，从登记在KEGG(京都基因和基因组百科全书)和NCBI(美国国家生物技术信息中心)中的Caldilinea aerophila的核苷酸序列中，选取塔格糖-二磷酸醛缩酶的核苷酸序列，基于所述微生物的氨基酸序列(SEQID NO：17)和核苷酸序列(SEQ ID NO：18)，克隆了包含所述酶的核苷酸序列并且可在大肠杆菌中表达的重组载体pET21a-CJ_CAE_F4E。
为了使用所述重组表达载体，利用Caldilinea aerophila的基因组DNA和引物1：ATATACATATGTCAACACTTCGCCACATCATTTTGCGA和引物2：TGGTGCTCGAGTCCAAGCAATGTAGCGGCGTCGTA，在以下条件下进行PCR反应：94℃变性2分钟，然后是94℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸2分钟，35个循环，然后在72℃延伸5分钟。
通过热激转化法(Sambrook and Russell:Molecular cloning,2001)将所述重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中以制备重组微生物，并冷冻保存在50％甘油中。将所述重组微生物命名为大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_CAE_F4E，并于2018年3月23日以保藏号KCCM12233P，根据《布达佩斯条约》的规定，保藏于国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KCCM)。
实施例5-2：重组酶的制备和纯化
为了从实施例5-1中制备的重组微生物大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_CAE_F4E制备重组酶CJ_CAE_F4E，将所述重组微生物接种到装有5mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基的培养管中。然后在37℃的振荡培养箱中进行种菌培养，直至在600nm的吸光度达到2.0。将通过种菌培养获得的培养物接种在含有液体培养基的培养瓶中，所述液体培养基含有LB和作为蛋白表达调节因子的乳糖，然后进行主培养。在180rpm和37℃的条件下进行种菌培养和主培养。然后，将培养物在8,000rpm和4℃下离心20分钟以回收细胞。用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液清洗回收的细胞两次，然后重悬于含有10mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH8.0)缓冲液中。用超声仪破碎重悬的细胞。将细胞裂解液在13,000rpm和4℃下离心20分钟，仅取上清液。通过多聚组氨酸标签亲和层析法纯化上清液，并应用10倍柱体积的含有20mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液以除去非特异性结合的蛋白。接下来，进一步用含有250mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液进行洗脱。使用50mMTris-HCl(pH 8.0)缓冲液进行透析，以获得纯化的酶CJ_CAE_F4E用以进行酶表征。
实施例5-3：评估重组酶将果糖转化为塔格糖的活性
为了测定实施例5-2中获得的重组酶CJ_CAE_F4E的果糖-4-差向异构化活性，于10重量％的果糖中添加50mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM MnSO4和20mg/mL的CJ_Cab_F4E和CJ_Ckr_F4E，并使其于60℃反应24小时。
利用HPLC对反应后残余的果糖和产物塔格糖进行定量。使用Shodex SugarSP0810柱进行HPLC分析，柱温为80℃，流动相的水流速为1mL/min。
结果，证实通过重组酶CJ_CAE_F4E将果糖转化为塔格糖的转化率为1.8％(图11)。
实施例6：塔格糖-二磷酸醛缩酶的制备及其活性的评估
实施例6-1：包含塔格糖-二磷酸醛缩酶基因的重组载体和重组微生物的制备
为了鉴定新型的耐热性果糖-4-差向异构酶，获得了源自热产硫化氢热厌氧杆菌的塔格糖-二磷酸醛缩酶基因的信息，以制备可在大肠杆菌中表达的载体和转化微生物。
具体而言，从登记在KEGG(京都基因和基因组百科全书)和NCBI(美国国家生物技术信息中心)中的热产硫化氢热厌氧杆菌的核苷酸序列中，选取塔格糖-二磷酸醛缩酶的核苷酸序列，基于所述微生物的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)和核苷酸序列(SEQ ID NO：20)，合成包含所述酶的核苷酸序列并且可在大肠杆菌中表达的重组载体pBT7-C-His-CJ_TATH_F4E(Bioneer Corp.，韩国)。
通过热激转化法(Sambrook and Russell:Molecular cloning,2001)将所述重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中以制备重组微生物，并冷冻保存在50％甘油中。将所述重组微生物命名为大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_TATH_F4E，并于2018年3月23日，以保藏号KCCM12234P，根据《布达佩斯条约》的规定，保藏于国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KCCM)。
实施例6-2：重组酶的制备和纯化
为了从实施例6-1中制备的重组微生物大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_TATH_F4E制备重组酶CJ_TATH_F4E，将所述重组微生物接种到装有5mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基的培养管中，然后在37℃的振荡培养箱中进行种菌培养，直至在600nm的吸光度达到2.0。将通过种菌培养获得的培养物接种在含有液体培养基的培养瓶中，所述液体培养基含有LB和作为蛋白表达调节因子的乳糖，然后进行主培养。在180rpm和37℃的条件下进行种菌培养和主培养。然后将培养物在8,000rpm和4℃下离心20分钟以回收细胞。用50mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液清洗回收的细胞两次，然后悬浮于含有10mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液中。用超声仪破碎悬浮的细胞。将细胞裂解液在13,000rpm和4℃下离心20分钟，仅取上清液。通过多聚组氨酸标签亲和层析法纯化上清液，并应用10倍柱体积的含有20mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液以除去非特异性结合的蛋白。接下来，进一步用含有250mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液进行洗脱。使用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液进行透析，以获得纯化的酶CJ_TATH_F4E用以进行酶表征。
实施例6-3：评估重组酶将果糖转化为塔格糖的活性
为了测定实施例6-2中获得的重组酶CJ_TATH_F4E的果糖-4-差向异构化活性，于30重量％的果糖中添加50mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM MnSO4和5mg/mL的CJ_TATH_F4E，并使其于60℃反应24小时。
利用HPLC对反应后残余的果糖和产物塔格糖进行定量。使用Shodex SugarSP0810柱进行HPLC分析，柱温为80℃，流动相的水流速为1mL/min。
结果，证实通过重组酶CJ_TATH_F4E将果糖转化为塔格糖的转化率为2.9％(图12)。
实施例7：塔格糖-二磷酸醛缩酶的制备及其活性的评估
实施例7-1：包含塔格糖-二磷酸醛缩酶基因的重组载体和重组微生物的制备
为了发现新型的耐热性果糖-4-差向异构酶，获得了源自酸杆菌细菌的塔格糖-二磷酸醛缩酶基因的信息，以制备可在大肠杆菌中表达的载体和转化微生物。
具体而言，从登记在KEGG(京都基因和基因组百科全书)和NCBI(美国国家生物技术信息中心)中的酸杆菌细菌的核苷酸序列中，选取塔格糖-二磷酸醛缩酶的核苷酸序列，基于所述微生物的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)和核苷酸序列(SEQ ID NO：4)，合成包含所述酶的核苷酸序列并且可在大肠杆菌中表达的重组载体pBT7-C-His-CJ_AB_F4E(BioneerCorp.，韩国)。
通过热激转化法(Sambrook and Russell:Molecular cloning,2001)将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中以制备重组微生物，并冷冻保存在50％甘油中。将所述重组微生物命名为大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_AB_F4E，并于2018年3月23日以保藏号KCCM12237P，根据《布达佩斯条约》的规定，保藏于国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KCCM)。
实施例7-2：重组酶的制备和纯化
为了从实施例7-1中制备的重组微生物大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_AB_F4E制备重组酶CJ_AB_F4E，将所述重组微生物接种到装有5mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基的培养管中，然后在37℃的振荡培养箱中进行种菌培养，直至在600nm的吸光度达到2.0。将通过种菌培养获得的培养物接种在含有液体培养基的培养瓶中，所述液体培养基含有LB和作为蛋白表达调节因子的乳糖，然后进行主培养。在180rpm和37℃的条件下进行种菌培养和主培养。然后将培养物在8,000rpm和4℃下离心20分钟以回收细胞。用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液清洗回收的细胞两次，然后悬浮于含有10mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液中。用超声仪破碎悬浮的细胞。将细胞裂解液在13,000rpm和4℃下离心20分钟，仅取上清液。通过多聚组氨酸标签亲和层析法纯化上清液，并应用10倍柱体积的含有20mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液以除去非特异性结合的蛋白。接下来，进一步用含有250mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液进行洗脱。使用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液进行透析，以获得纯化的酶CJ_AB_F4E用以进行酶表征。
实施例7-3：评估重组酶将果糖转化为塔格糖的活性
为了测定实施例7-2中获得的重组酶CJ_AB_F4E的果糖-4-差向异构化活性，于1重量％的果糖中添加50mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM MnSO4和10mg/mL的CJ_AB_F4E，并使其于55℃反应24小时。
利用HPLC对反应后残余的果糖和产物塔格糖进行定量。使用Shodex SugarSP0810柱进行HPLC分析，柱温为80℃，流动相的水流速为1mL/min。
结果，证实经重组酶CJ_AB_F4E将果糖转化为塔格糖的转化率为8％(图13)。
基于以上描述，本领域技术人员将理解，可以以不同的特定形式来实现本发明，而不改变其技术精神或必要特征。因此，应当理解，所述实施方式在所有方面均为示例，并无限定性含义。本发明的范围由随附权利要求限定，因此落入权利要求的范围之内的所有改变和修改，或此范围内的等同概念均为权利要求所涵盖。
Claims (6)
1.一种用于制备塔格糖的组合物，其包含塔格糖-二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖-二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物。
2.权利要求1所述的用于制备塔格糖的组合物，其还包含果糖。
3.权利要求1所述的用于制备塔格糖的组合物，其中所述组合物包含一种或多种由SEQID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17或19的氨基酸序列组成的塔格糖-二磷酸醛缩酶。
4.权利要求1所述的用于制备塔格糖的组合物，其中
所述塔格糖-二磷酸醛缩酶为源自Thermanaerothrix sp.的酶或其变体、源自厌氧绳菌(Anaerolinea sp.)的酶或其变体、源自Kosmotoga sp.的酶或其变体、源自红嗜热盐菌(Rhodothermus sp.)的酶或其变体、源自Limnochorda sp.的酶或其变体、源自暖发菌(Caldithrix sp.)或热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor sp.)的酶或其变体。
5.一种制备塔格糖的方法，其包括
使果糖与塔格糖-二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖-二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将果糖转化为塔格糖。
6.权利要求5的制备塔格糖的方法，其中所述接触在pH 5.0至pH 9.0和30℃至80℃的条件下进行0.5小时至48小时。
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Cited By (1)
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101480422B1 (ko) * | 2013-07-29 | 2015-01-13 | 건국대학교 산학협력단 | 효소조합 반응에 의한 과당으로부터 타가토스 생산 방법 및 그 조성물 |
Family Cites Families (13)
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|---|---|---|---|---|
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| KR101610911B1 (ko) * | 2013-05-09 | 2016-04-08 | 주식회사 삼양사 | L-리불로스 5-인산 4-에피머화 효소를 이용한 과당에서 타가토스 생산 |
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| KR101620904B1 (ko) * | 2013-10-11 | 2016-05-23 | (주)케비젠 | 기질 및 효소 컴비네이션 반응을 이용한 프럭토스로부터 타가토스 생산용 조성물 및 이의 용도 |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101480422B1 (ko) * | 2013-07-29 | 2015-01-13 | 건국대학교 산학협력단 | 효소조합 반응에 의한 과당으로부터 타가토스 생산 방법 및 그 조성물 |
Non-Patent Citations (11)
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111212907A (zh) * | 2017-08-31 | 2020-05-29 | Cj第一制糖株式会社 | 一种果糖-4-差向异构酶以及使用其制备塔格糖的方法 |
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