KR102328650B1 - 신규 과당-4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 출원은 신규 과당-4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

신규 과당-4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법{A Novel Fructose C4 epimerases and Preparation Method for producing Tagatose using the same}

본 출원은 신규 과당-4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법에 관한 것이다.

타가토스는 우유, 치즈 및 카카오 등의 식품, 그리고 사과와 귤과 같은 단맛이 나는 천연과일에 소량 존재하는 천연 감미료이다. 타가토스의 칼로리는 1.5 kcal/g으로 설탕의 1/3 수준이며, GI(Glycemic index, 혈당지수)는 3으로 설탕의 5% 수준인데 반해, 설탕과 물리적 성질이 유사하고, 유사한 단맛을 내면서 다양한 건강 기능성을 가지고 있기 때문에 건강과 맛을 동시에 만족시킬 수 있는 설탕 대체 감미료로 여러 제품에 이용될 수 있다.

종래 공지되거나 공용된 타가토스의 제조방법은 갈락토스를 주원료로 한 화학적 방법(촉매 반응)과 생물학적 방법(이성화 효소반응)이 있다(PCT WO2006/058092, 대한민국 등록특허 제10-0964091호 및 제10-1368731호 참조). 그러나 상기 종래의 제조방법에서 주원료로 사용되는 갈락토스의 기초 원료가 되는 유당은 국제 시장에서의 원유(原乳) 및 유당의 생산량, 수요 및 공급량 등에 따라 가격이 불안정하여 안정적 수급에 한계가 있으므로, 보편화된 당(설탕, 포도당, 과당 등)을 원료로 타가토스를 제조할 수 있는 새로운 방법이 요구되었다.

이러한 배경 하에, 본 출원자들은 과당을 타가토스로 전환시키는 활성을 가지는 효소를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase)가 과당을 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 효소활성이 있음을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 하나의 목적은 타가토스-이인산 알돌레이즈; 이를 발현하는 미생물; 및 상기 미생물의 배양물 중 하나 이상을 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 중 하나 이상을 포함하는 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물과 과당을 접촉시켜, 상기 과당을 타가토스로 전환하는 단계를 포함하는 타가토스의 제조방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase); 이를 발현하는 미생물; 및 상기 미생물의 배양물 중 하나 이상을 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공한다.

본 출원은 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈가 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 것을 새롭게 규명한 것에 특징이 있다.

과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이체는 D-프럭토스(과당)의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 D-타가토스로 전환시키는 특징이 있다. 상기 과당-4-에피머화 효소는 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase) 활성을 가지며, D-타가토스 1,6-이인산(D-tagatose 1,6-bisphosphate)를 기질로 하여 글리세론 포스페이트(glycerone phosphate)와 D-글리세랄데하이드 3-디포스페이트(D-glyceraldehyde 3-phosphate)를 생산한다.

한편, 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase: EC4.1.2.40)는 하기 [반응식 1]과 같이 D-타가토스 1,6-이인산(D-tagatose 1,6-bisphosphate)를 기질로 하여 글리세론 포스페이트(glycerone phosphate)와 D-글리세랄데하이드 3-포스페이트(D-glyceraldehyde 3-phosphate)를 생산하고, 갈락토스 대사에 관여함이 공지된 바 있으나, 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈가 타가토스를 생산하는 활성을 가지는지에 대한 연구는 전무하다.

[반응식 1]

D-타가토스 1,6-이인산 ⇔ 글리세론 포스페이트 + D-글리세랄데하이드 3-포스페이트

본 출원에 이르러 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase)가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가진다는 사실을 새롭게 밝혀냈다. 따라서, 본 출원의 일 구현예는 과당으로부터 타가토스를 제조함에 있어서 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase)를 과당-4-에피머화 효소로 사용하는 것을 포함하는 타가토스-이인산 알돌레이즈의 신규한 용도를 제공한다. 또한, 본 출원의 다른 구현예는 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase)를 과당-4-에피머화 효소로 사용하여 과당으로부터 타가토스를 제조하는 방법을 제공한다.

본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈는 예를 들어 과당을 기질로 하여 타가토스를 생산할 수 있다면 한정 없이 포함될 수 있다. 구체적으로 타가토스-이인산 알돌레이즈는 기질인 과당으로부터 타가토스로의 전환율(전환율=타가토스 중량/초기 과당 중량 *100)이 0.01% 이상, 구체적으로 0.1% 이상, 더욱 구체적으로 0.3%이상인 것일 수 있다. 보다 구체적으로 전환율은 0.01% 내지 40%의 범위, 0.1% 내지 30%의 범위, 0.3% 내지 25%의 범위, 또는 0.3% 내지 20%의 범위일 수 있다.

일 구현예로, 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈는 서열번호 1 또는 3 과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈는 서열번호 1또는 3의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드이거나, 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 상동성 또는 동일성을 가지며, 상기 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능(즉, 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 활성)을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 더불어, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드로서, 과당-4-에피머화 활성을 가지는 폴리펩티드도 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 서열번호 1 또는 3과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 타가토스-이인산 알돌레이즈 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈는 내열성 미생물 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있으며, 예를 들어, 써모언에어박테리움(Thermoanaerobacterium) sp. 유래의 효소 또는 그 변이체, 또는 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas) sp. 유래의 효소 또는 그 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 써모언에어로박테리움 써모사카롤리티쿰(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum) 또는 슈도알테로모나스 sp. H103 유래의 효소 또는 그 변이체일 수 있다.

일 구현예로, 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈는 내열성이 높은 효소일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈는 30℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100% 또는 75% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈는 40℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 65℃, 45℃ 내지 65℃, 45℃ 내지 60℃, 또는 45℃ 내지 55℃에서 최대 활성의 80% 내지 100% 또는 85% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다. 나아가, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 서열번호 1로 이루어진 타가토스-이인산 알돌레이즈는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해; 서열번호 3로 이루어진 타가토스-이인산 알돌레이즈는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

구체적으로, 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈는 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈는 서열번호 1, 3의 아미노산 서열 또는 이와 50% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈는 서열번호 1, 3 및 상기 서열번호 1, 3과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

또한, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 1, 3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1, 3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 구체적으로는 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 변이형 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 상기 아미노산 서열 앞뒤에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.

상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 알지닌, 라이신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함한다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

상동성(homology) 또는 동일성(identity)은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 추가적으로, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.

본 출원의 다른 양태는 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 중 하나 이상을 포함하는 미생물을 제공한다.

본 출원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"는 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 폴리뉴클레오티드에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990) 참조).

상기 폴리뉴클레오티드는 본 출원의 서열번호 1 또는 3과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 가지면서 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 예를 들어, 상기 서열번호 1 또는 3과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 타가토스-이인산 알돌레이즈를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 4의 염기서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 더불어, 전술한 바와 같이 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 서열번호 2 또는 4의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 역시 포함할 수 있음은 자명하다.

본 출원에서 사용될 수 있는 타가토스-이인산 알돌레이즈를 발현하는 미생물은 상기 폴리펩타이드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 중 하나 이상을 포함하는 미생물일 수 있다. 상기 벡터는 본 출원의 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 형태일 수 있다. 본 출원에서 용어, "작동 가능하게 연결된"이란 일반적으로 기능을 수행하도록 염기 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 염기 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 벡터와의 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다.

본 출원에서 용어 "벡터" 는 유기체, 예컨대 숙주세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. 여기서, "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 본 출원의 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 유기체, 예컨대, 숙주세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함할 수 있고, 미니구형 DNA, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)와 같은 트랜스포존(Izsvak et al. J.MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 재조합 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 상기 벡터는 다양한 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있다. 본 출원에서 용어, "항생제 저항성 유전자"란 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지고 있는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에 선별 마커로서 유용하게 사용된다. 본 출원에서 항생제 저항성 유전자는 본 출원의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, 암피실린(ampicilin), 테트라사이클린(tetracyclin), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloroamphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 또는 네오마이신(neomycin)에 대한 저항 유전자 등을 사용할 수 있다.

본 출원에서 이용될 수 있는 타가토스-이인산 알돌레이즈를 발현하는 미생물은, 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내로 도입하는 방법을 이용하여 제작할 수 있다. 상기 벡터를 형질전환시키는 방법은 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함될 수 있으며, 당해 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAEdextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 및 열 충격법 등이 포함될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 일 구현예로, 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈를 발현하는 미생물은 서열번호 1 또는 3과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 타가토스-이인산 알돌레이즈, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 타가토스 생산용 미생물일 수 있다.

형질전환된 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입된 형태 및 염색체 외에 위치하고 있는 형태 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 재조합 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 출원의 미생물은 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 재조합 벡터를 포함하여 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈를 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로, 대장균(E. coli) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 미생물의 배양물은 본 출원의 미생물을 배지에서 배양하여 제조된 것일 수 있다.

본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 미생물을 배양하는 단계는, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있으나 특별히 이에 제한되지 않는다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 7 내지 9)를 조절할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있고, 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양온도는 25 내지 40 ℃, 구체적으로는 30 내지 37 ℃를 유지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 약 0.5 시간 내지 60 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 추가로 과당을 포함할 수 있다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 과당을 직접 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 활성을 갖는 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 것으로서, 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈 또는 그의 변이체에 의해 과당을 기질로 하여 타가토스가 생성될 수 있다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 당해 타가토스 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 금속을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 출원의 금속은 2가 양이온을 포함하는 금속일 수 있다. 구체적으로 본 출원의 금속은 니켈(Ni), 마그네슘(Mg) 또는 망간(Mn)일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 금속은 금속이온 또는 금속염일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 금속염은 MgSO₄, NiSO₄, NiCl₂, MgCl₂, MnCl₂ 또는 MnSO₄일 수 있다.

본 출원은 다른 양태로서, 과당을 상기 조성물과 접촉시켜 상기 과당을 타가토스로 전환하는 단계를 포함하는 타가토스 제조방법을 제공한다.

일 구현예로, 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈는 서열번호 1 또는 3과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 구현예로, 본 출원의 접촉은 pH 5.0 내지 pH 9.0 조건에서, 30℃ 내지 80℃ 온도 조건에서, 및/또는 0.5시간 내지 48시간 동안 수행할 수 있다.

구체적으로, 본 출원의 접촉은 pH 6.0 내지 pH 9.0 조건 또는 pH 7.0 내지 pH 9.0 조건에서 수행할 수 있다. 또한, 본 출원의 접촉은 30℃ 내지 80℃, 35℃ 내지 80℃, 40℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 80℃, 55℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 80℃, 30 ℃ 내지 70℃, 35℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 70℃, 45℃ 내지 70℃, 50℃ 내지 70℃, 55℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 65℃, 35℃ 내지 65℃, 40℃ 내지 65℃, 45℃ 내지 65℃, 50℃ 내지 65℃, 55℃ 내지 65℃, 30℃ 내지 60℃, 35℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 60℃, 45℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 55℃ 또는 45℃ 내지 55℃ 온도 조건에서 수행할 수 있다. 더불어, 본 출원의 접촉은 0.5시간 내지 36시간 동안, 0.5시간 내지 24시간 동안, 0.5시간 내지 12시간 동안, 0.5시간 내지 6시간 동안, 1시간 내지 48시간 동안, 1시간 내지 36시간 동안, 1시간 내지 24시간 동안, 1시간 내지 12시간 동안, 1시간 내지 6시간 동안, 3시간 내지 48시간 동안, 3시간 내지 36시간 동안, 3시간 내지 24시간 동안, 3시간 내지 12시간 동안, 3시간 내지 6시간 동안, 6시간 내지 48시간 동안, 6시간 내지 36시간 동안, 6시간 내지 24시간 동안, 6시간 내지 12시간 동안, 12시간 내지 48시간 동안, 12시간 내지 36시간 동안, 12시간 내지 24시간 동안, 18시간 내지 48시간 동안, 18시간 내지 36시간 동안 또는 18시간 내지 30시간 동안 수행할 수 있다.

일 구현예로, 본 출원의 접촉은 금속 존재하에서 수행할 수 있다. 사용될 수 있는 금속은 전술한 양태에서와 같다.

본 출원의 제조방법은 제조된 타가토스를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 및/또는 정제는 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있으며. 비제한적인 예로, 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 이온교환 크로마토그래피 및 분별 결정 등을 사용할 수 있다. 상기 정제는 하나의 방법만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다.

또한, 본 출원의 제조방법은 상기 분리 및/또는 정제하는 단계 이전 또는 이후에 탈색 및/또는 탈염을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 실시함으로써, 보다 품질이 우수한 타가토스를 얻을 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 타가토스로 전환하는 단계, 분리 및/또는 정제하는 단계, 또는 탈색 및/또는 탈염하는 단계 이후 타가토스를 결정화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 결정화는 통상적으로 사용하는 결정화 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 냉각결정화 방법을 사용하여 결 정화를 수행할 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조 방법은 상기 결정화하는 단계 이전에 타가토스를 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 농축은 결정화 효율을 높일 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 분리 및/또는 정제하는 단계 이후 미반응된 과당을 본 출원의 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시키는 단계, 본 출원의 결정화하는 단계 이후 결정이 분리된 모액을 상기 분리 및/또는 정제 단계에 재사용하는 단계, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다.

본 출원의 과당-4-에피머화 효소인 타가토스-이인산 알돌레이즈는 내열성이 우수하여 산업적으로 타가토스 생산이 가능하고, 보편화된 당인 과당을 타가토스로 전환하는 바 경제성이 높은 효과가 있다.

도 1은 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_TATSA_F4E, CJ_Pal_F4E 의 과당-4-에피머화 효소 활성을 확인한 HPLC 크로마토그래피 그래프이다.
도 2a는 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_TATSA_F4E 의 온도 변화에 따른 과당-4-에피머화 효소 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_Pal_F4E 의 온도 변화에 따른 과당-4-에피머화 효소 활성을 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환체의 제조

신규한 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 발굴하기 위하여, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum 또는 Pseudoalteromonas sp. H103 유래 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 유사 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.

구체적으로, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 에 등록된 Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum 또는 Pseudoalteromonas sp. H103 유전자 서열에서 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 유사 서열을 선발하고, 상기 2종 미생물의 아미노산 서열(서열번호 1 및 3)과 염기 서열(서열번호 2 및 4) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 pBT7-C-His 벡터(㈜바이오니아, 대한민국)를 이용하여 대장균 발현 가능한 재조합 벡터 pBT7-C-His-CJ_TATSA_F4E, pBT7-C-His- CJ_Pal_F4E를 제조하였다(㈜바이오니아, 대한민국).

제조한 각각의 재조합 벡터를 이용하여 공지된 열 충격 방법(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)으로 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였다. 상세하게는 상기 제조된 제조합 벡터 플라스미드 DNA를 각각 1ul를 취하여 1.5ml 튜브에 넣은 후 50ul 대장균 BL21(DE3)(Novagen®, Germany) competent cell를 첨가하여 30분간 ice 에 방치한 후 42도 water bath 내 30초간 열처리를 하여 LB 배지를 500ul를 첨가한 후 37도 진탕배양기에서 1시간 배양을 한 후 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고 37도 진탕 배양기에 배양한, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 형질전환 균주를 각각 E. coli BL21(DE3)/CJ_TATSA_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_Pal_F4E 로 명명하였다.

실시예 2: 재조합 효소의 제조 및 정제

재조합 효소를 제조하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조한 형질전환 균주 E. coli BL21(DE3)/CJ_TATSA_F4E, E. coli BL21(DE3)/CJ_Pal_F4E를 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 상기 종균 배양 결과 얻은 배양액을 LB와 단백질 발현조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본 배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 다음, 상기 배양액을 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 상기 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액에 재현탁하였다. 상기 재현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이어서, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제한 다음, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_TATSA_F4E, CJ_Pal_F4E를 각각 확보하였다.

실시예 3: 과당으로부터 타가토스로의 전환 및 활성 확인

상기 실시예 2에서 제조한 본 발명 재조합 효소 CJ_TATSA_F4E, CJ_Pal_F4E 의 과당-4-에피머화 활성을 측정하기 위하여, 30 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM NiSO₄ 및 각 20 mg/mL CJ_TATSA_F4E, 및 CJ_Pal_F4E를 첨가하여 55℃에서 10시간 동안 반응시켰다.

반응 후 잔존하는 과당 및 생성물인 타가토스의 정량은 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석은 Shodex Sugar SP0810 컬럼을 사용하였고, 컬럼 온도는 80℃로 하였으며, 이동상인 물의 유속은 1 mL/min으로 흘려주었다(도 1).

실험 결과, 본 발명 CJ_TATSA_F4E 및 CJ_Pal_F4E 효소반응에 의한 과당으로부터 타가토스로의 전환율은 각각 9.51% 및 2.39%으로 확인되었다.

	과당→타가토스 전환율
CJ_TATSA_F4E	9.51%
CJ_Pal_F4E	2.39%

실시예 4: 재조합 효소의 온도에 따른 활성 확인

상기 실시예 2에서 제조한 효소 CJ_TATSA_F4E 및 CJ_Pal_F4E 의 과당-4-에피머화 활성에 대한 온도의 영향력을 조사하기 위하여 10 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl(pH8.0) 완충용액에, 각 10 mg/mL의 CJ_TATSA_F4E및 CJ_Pal_F4E 를 첨가하여 45℃, 50℃, 55℃, 60℃ 및 65℃의 다양한 온도에서 10시간 동안 반응시켰다. HPLC를 이용하여 상기 반응 완료 후 반응물 내의 타가토스를 정량 분석하였다.

실험 결과, CJ_TATSA_F4E 는 50℃에서 최대 활성을 나타내었으며, 45℃ 내지 60℃에서 최대 활성의 80% 이상, 모든 온도 범위에서 최대 활성의 50% 이상을 유지하였다(도 2a). 그리고, CJ_Pal_F4E 는 45℃에서 최대 활성을 나타내었다 (도 2b).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A Novel Fructose C4 epimerases and Preparation Method for producing Tagatose using the same <130> KPA180906-KR <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 434 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ_TATSA_F4E <400> 1 Met Ala Lys Glu His Pro Leu Lys Glu Leu Val Asn Lys Gln Lys Ser 1 5 10 15 Gly Ile Ser Glu Gly Ile Val Ser Ile Cys Ser Ser Asn Glu Phe Val 20 25 30 Ile Glu Ala Ser Met Glu Arg Ala Leu Thr Asn Gly Asp Tyr Val Leu 35 40 45 Ile Glu Ser Thr Ala Asn Gln Val Asn Gln Tyr Gly Gly Tyr Ile Gly 50 55 60 Met Thr Pro Ile Glu Phe Lys Lys Phe Val Phe Ser Ile Ala Lys Lys 65 70 75 80 Val Asp Phe Pro Leu Asp Lys Leu Ile Leu Gly Gly Asp His Leu Gly 85 90 95 Pro Leu Ile Trp Lys Asn Glu Ser Ser Asn Leu Ala Leu Ala Lys Ala 100 105 110 Ser Glu Leu Ile Lys Glu Tyr Val Leu Ala Gly Tyr Thr Lys Ile His 115 120 125 Ile Asp Thr Ser Met Arg Leu Lys Asp Asp Thr Asp Phe Asn Thr Glu 130 135 140 Ile Ile Ala Gln Arg Ser Ala Val Leu Leu Lys Ala Ala Glu Asn Ala 145 150 155 160 Tyr Met Glu Leu Asn Lys Asn Asn Lys Asn Val Leu His Pro Val Tyr 165 170 175 Val Ile Gly Ser Glu Val Pro Ile Pro Gly Gly Ser Gln Gly Ser Asp 180 185 190 Glu Ser Leu Gln Ile Thr Asp Ala Lys Asp Phe Glu Asn Thr Val Glu 195 200 205 Ile Phe Lys Asp Val Phe Ser Lys Tyr Gly Leu Ile Asn Glu Trp Glu 210 215 220 Asn Ile Val Ala Phe Val Val Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Asn Asp 225 230 235 240 Phe Val His Glu Tyr Lys Arg Asp Glu Ala Lys Glu Leu Thr Asp Ala 245 250 255 Leu Lys Asn Tyr Lys Thr Phe Val Phe Glu Gly His Ser Thr Asp Tyr 260 265 270 Gln Thr Arg Glu Ser Leu Lys Gln Met Val Glu Asp Gly Ile Ala Ile 275 280 285 Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ala Leu Arg Glu Ala Leu Ile 290 295 300 Ala Leu Asn Asn Ile Glu Asn Glu Leu Leu Asn Asn Val Asp Ser Ile 305 310 315 320 Lys Leu Ser Asn Phe Thr Asn Val Leu Val Ser Glu Met Ile Asn Asn 325 330 335 Pro Glu His Trp Lys Asn His Tyr Phe Gly Asp Asp Ala Arg Lys Lys 340 345 350 Phe Leu Cys Lys Tyr Ser Tyr Ser Asp Arg Cys Arg Tyr Tyr Leu Pro 355 360 365 Thr Arg Asn Val Lys Asn Ser Leu Asn Leu Leu Ile Arg Asn Leu Glu 370 375 380 Asn Val Lys Ile Pro Met Thr Leu Ile Ser Gln Phe Met Pro Leu Gln 385 390 395 400 Tyr Asp Asn Ile Arg Arg Gly Leu Ile Lys Asn Glu Pro Ile Ser Leu 405 410 415 Ile Lys Asn Ala Ile Met Asn Arg Leu Asn Asp Tyr Tyr Tyr Ala Ile 420 425 430 Lys Pro <210> 2 <211> 1305 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ_TATSA_F4E <400> 2 atggctaaag aacatccatt aaaggaatta gtaaataaac aaaaaagtgg tatatccgag 60 ggtatagttt ctatttgtag ttcaaatgaa tttgttattg aagcatctat ggagcgtgca 120 ttaacaaatg gtgattatgt tttaattgaa tcaacagcaa atcaggtgaa tcaatatggt 180 ggatatattg gtatgacacc tattgagttt aaaaaatttg tattttcaat agctaaaaaa 240 gtagattttc cattagataa attgattctt ggtggggatc atttaggccc attaatatgg 300 aaaaatgaat ctagtaattt ggcgttagca aaagcatccg agcttattaa agaatatgta 360 ttagccggat atactaaaat tcatatagac actagtatgc ggctaaaaga tgatactgat 420 tttaatacag aaattattgc tcaaagaagt gcagtattgt taaaggcagc ggaaaatgca 480 tatatggaat tgaataaaaa taataaaaat gttttacatc ctgtctatgt tataggaagt 540 gaagtcccaa tacctggggg cagccaaggc agtgatgaat cgctccaaat tactgatgct 600 aaggattttg aaaatacagt tgaaatattt aaagatgttt tttcaaaata tggattaatt 660 aatgagtggg aaaacatagt agcatttgtt gttcaaccag gagttgagtt tggaaatgat 720 tttgtacatg aatataaacg tgatgaagca aaagaattaa cagatgcact taaaaattat 780 aaaacatttg tttttgaagg acattctact gattatcaaa cacgtgaatc attaaaacaa 840 atggtggaag atggcattgc aattttaaaa gttggacctg cattaacatt tgcactacgt 900 gaagccttaa tagcactaaa taatatagaa aatgagttgc ttaataatgt agatagtata 960 aaattatcaa attttactaa tgtactcgta agtgaaatga tcaataaccc cgaacattgg 1020 aaaaatcatt attttggtga tgatgcaagg aaaaagtttc tatgtaaata tagttattcg 1080 gatagatgta ggtactattt accaactaga aatgtaaaaa actcattaaa tcttcttatt 1140 agaaatctag aaaatgtgaa aataccaatg acattaataa gtcaatttat gcctttgcaa 1200 tatgataata ttagaagagg actcataaaa aatgaaccaa tttctttaat taaaaatgca 1260 ataatgaacc gacttaatga ctattattat gctataaagc cgtaa 1305 <210> 3 <211> 434 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ_Pal_F4E <400> 3 Met Arg Gly Asp Lys Arg Val Thr Thr Asp Phe Leu Lys Glu Ile Val 1 5 10 15 Gln Gln Asn Arg Ala Gly Gly Ser Arg Gly Ile Tyr Ser Val Cys Ser 20 25 30 Ala His Arg Leu Val Ile Glu Ala Ser Met Gln Gln Ala Lys Ser Asp 35 40 45 Gly Ser Pro Leu Leu Val Glu Ala Thr Cys Asn Gln Val Asn His Glu 50 55 60 Gly Gly Tyr Thr Gly Met Thr Pro Ser Asp Phe Cys Lys Tyr Val Leu 65 70 75 80 Asp Ile Ala Lys Glu Val Gly Phe Ser Gln Glu Gln Leu Ile Leu Gly 85 90 95 Gly Asp His Leu Gly Pro Asn Pro Trp Thr Asp Leu Pro Ala Ala Gln 100 105 110 Ala Met Glu Ala Ala Lys Lys Met Val Ala Asp Tyr Val Ser Ala Gly 115 120 125 Phe Ser Lys Ile His Leu Asp Ala Ser Met Ala Cys Ala Asp Asp Val 130 135 140 Glu Pro Leu Ala Asp Glu Val Ile Ala Gln Arg Ala Thr Ile Leu Cys 145 150 155 160 Ala Ala Gly Glu Ala Ala Val Ser Asp Lys Asn Ala Ala Pro Met Tyr 165 170 175 Ile Ile Gly Thr Glu Val Pro Val Pro Gly Gly Ala Gln Glu Asp Leu 180 185 190 His Glu Leu Ala Thr Thr Asn Ile Asp Asp Leu Lys Gln Thr Ile Lys 195 200 205 Thr His Lys Ala Lys Phe Ser Glu Asn Gly Leu Gln Asp Ala Trp Asp 210 215 220 Arg Val Ile Gly Val Val Val Gln Pro Gly Val Glu Phe Asp His Ala 225 230 235 240 Met Val Ile Gly Tyr Gln Ser Glu Lys Ala Gln Thr Leu Ser Lys Thr 245 250 255 Ile Leu Asp Phe Asp Asn Leu Val Tyr Glu Ala His Ser Thr Asp Tyr 260 265 270 Gln Thr Glu Thr Ala Leu Thr Asn Leu Val Asn Asp His Phe Ala Ile 275 280 285 Leu Lys Val Gly Pro Gly Leu Thr Tyr Ala Ala Arg Glu Ala Leu Phe 290 295 300 Ala Leu Ser Tyr Ile Glu Gln Glu Trp Ile Thr Asn Lys Pro Leu Ser 305 310 315 320 Asn Leu Arg Gln Val Leu Glu Glu Arg Met Leu Glu Asn Pro Lys Asn 325 330 335 Trp Ala Lys Tyr Tyr Thr Gly Thr Glu Gln Glu Gln Ala Phe Ala Arg 340 345 350 Lys Tyr Ser Phe Ser Asp Arg Ser Arg Tyr Tyr Trp Ala Asp Pro Ile 355 360 365 Val Asp Gln Ser Val Gln Thr Leu Ile Asn Asn Leu Thr Glu Gln Pro 370 375 380 Ala Pro Met Thr Leu Leu Ser Gln Phe Met Pro Leu Gln Tyr Ala Ala 385 390 395 400 Phe Arg Ala Gly Gln Leu Asn Asn Asp Pro Leu Ser Leu Ile Arg His 405 410 415 Trp Ile Gln Glu Val Val Ser Thr Tyr Ala Arg Ala Ser Gly Leu Ala 420 425 430 Val Lys <210> 4 <211> 1305 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ_Pal_F4E <400> 4 atcagaggag ataaaagggt gactacagat tttctgaaag aaattgttca acaaaacaga 60 gccggtggta gcagaggtat ttactctgtt tgttctgcgc atcgccttgt tattgaagcg 120 tctatgcagc aagccaaaag cgatggctca ccactgttag tagaggcaac atgtaatcag 180 gttaatcacg aaggtggtta taccggtatg accccaagcg acttttgcaa atacgtgtta 240 gatattgcaa aagaagtggg cttttcccaa gagcaactta ttttaggggg cgaccactta 300 gggcctaacc cgtggactga cctaccagct gcacaggcaa tggaagcggc caaaaaaatg 360 gttgctgatt acgtaagtgc gggcttttca aaaatacatt tagatgcaag catggcatgt 420 gcagatgatg tagagccgct tgctgatgag gttatagcgc agcgcgccac tattttatgt 480 gctgccggcg aagctgctgt tagcgataaa aatgcagccc caatgtatat tattggtacc 540 gaagtgccgg taccaggtgg cgcacaagaa gatttacacg aacttgctac aaccaatatt 600 gatgatttaa aacaaaccat taaaacccat aaagcaaaat ttagcgaaaa cggtttgcaa 660 gacgcatggg atagagtaat tggtgtagta gtgcagcctg gtgttgagtt tgaccacgcg 720 atggtaattg gctatcaaag cgaaaaagca caaacactaa gtaaaactat tttagatttt 780 gataatttgg tttatgaagc gcattcaacc gattatcaaa ccgaaacagc gttaactaac 840 ttggttaacg accactttgc tattttaaaa gtgggcccag ggcttactta tgcagcgcgc 900 gaagcgttgt ttgcacttag ttatattgag caagagtgga taaccaataa gcctctttct 960 aatttgcgcc aagtgcttga agagcgcatg ctcgaaaacc ctaaaaactg ggctaagtat 1020 tacacaggta cagagcaaga gcaggccttt gcacgaaaat atagctttag cgatagatcg 1080 cgttactatt gggccgatcc tattgttgat caaagtgttc aaacactcat taataactta 1140 actgagcagc cagcgccaat gaccttgctg agtcaattta tgccacttca atatgcggca 1200 tttcgtgcag gacaattaaa taacgatccg ctttctttga tcagacactg gatccaagaa 1260 gttgtatcaa cctacgcccg cgctagcgga cttgcagtaa aatag 1305

Claims (11)

1. 삭제
2. 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-이인산 알돌레이즈; 이를 발현하는 미생물; 및 상기 미생물의 배양물 중 하나 이상을 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 과당을 추가로 포함하는 것인, 타가토스 생산용 조성물.
   
4. 삭제
5. 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-이인산 알돌레이즈, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 타가토스 생산용 미생물.
   
6. 삭제
7. 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-이인산 알돌레이즈; 이를 발현하는 미생물; 및 상기 미생물의 배양물 중 하나 이상을 과당과 접촉시켜, 상기 과당을 타가토스로 전환하는 단계를 포함하는 타가토스 제조방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 접촉은 45℃ 내지 65℃ 온도 조건에서 수행되는 것인, 타가토스 제조방법.
   
9. 제7항에 있어서, 상기 접촉은 pH 5 내지 9에서 수행되는 것인, 타가토스 제조방법.
   
10. 제7항에 있어서, 상기 접촉은 금속, 금속이온 및 금속염 중 어느 하나 이상의 존재하에 수행되는 것인, 타가토스 제조방법.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 금속, 금속이온 및 금속염은 니켈(Ni), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 및 이의 각각의 이온 및 이의 각각의 금속염 중에서 선택되는 1 이상인 것인, 타가토스 제조방법.
    
    
    

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