KR102078272B1 - 과당-4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 출원은 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 단백질을 포함하는 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법에 관한 것이다.

Description

과당-4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법{A Fructose C4 epimerases and Preparation Method for producing Tagatose using the same}

본 출원은 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 단백질을 포함하는 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조 방법에 관한 것이다.

타가토스는 우유, 치즈 및 카카오 등의 식품, 그리고 사과와 귤과 같은 단맛이 나는 천연과일에 소량 존재하는 천연 감미료이다. 타가토스의 칼로리는 1.5 kcal/g으로 설탕의 1/3 수준이며, GI(Glycemic index, 혈당지수)는 3으로 설탕의 5% 수준인데 반해, 설탕과 물리적 성질이 유사하고, 유사한 단맛을 내면서 다양한 건강 기능성을 가지고 있기 때문에 건강과 맛을 동시에 만족시킬 수 있는 설탕 대체 감미료로 여러 제품에 이용될 수 있다.

종래 공지되거나 공용된 타가토스의 제조방법은 갈락토스를 주원료로 한 화학적 방법(촉매 반응)과 생물학적 방법(이성화 효소반응)이 있다(PCT WO2006/058092, 대한민국 등록특허 제10-0964091호 및 제10-1368731호 참조). 그러나 상기 종래의 제조방법에서 주원료로 사용되는 갈락토스의 기초 원료가 되는 유당은 국제 시장에서의 원유(原乳) 및 유당의 생산량, 수요 및 공급량 등에 따라 가격이 불안정하여 안정적 수급에 한계가 있으므로, 보편화된 당(설탕, 포도당, 과당 등)을 원료로 타가토스를 제조할 수 있는 새로운 방법이 요구되었다.

이러한 배경 하에, 본 출원자들은 과당을 타가토스로 전환시키는 활성을 가지는 효소를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 칼디리니아 속 유래의 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase)가 과당을 타가토스로 전환시키는 기능이 있음을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 목적은 칼디리니아(Caldilinea) sp. 유래의 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase); 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 하나 이상 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 칼디니리아(Caldilinea) sp. 유래의 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase); 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 하나 이상과 과당을 접촉시켜, 상기 과당을 타가토스로 전환하는 단계를 포함하는 타가토스의 제조방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 출원을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 출원에 개시한 일 실시 양태의 설명 및 실시예는 공통된 사항에 대하여 다른 실시 양태의 설명 및 실시예에서도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원의 상세한 설명에 개시된 다양한 요소들의 모든 조합은 본 출원의 권리범위에 속하는 것은 물론이다. 그뿐만 아니라, 하기 기술된 구체적인 설명에 의하여 본 발명출원의 권리범위가 제한되는 것이 아니다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.

본 출원은 타가토스-이인산 알돌레이즈가 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 것을 새롭게 규명한 것에 특징이 있다.

과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이체는 D-프럭토스(과당)의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 D-타가토스로 전환시키는 특징이 있다. 상기 과당-4-에피머화 효소는 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase) 활성을 가지며, D-타가토스 1,6-이인산(D-tagatose 1,6-bisphosphate)를 기질로 하여 글리세론 포스페이트(glycerone phosphate)와 D-글리세랄데하이드 3-디포스페이트(D-glyceraldehyde 3-phosphate)를 생산한다.

한편, 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase: EC4.1.2.40)는 하기 [반응식 1]과 같이 D-타가토스 1,6-이인산(D-tagatose 1,6-bisphosphate)를 기질로 하여 글리세론 포스페이트(glycerone phosphate)와 D-글리세랄데하이드 3-포스페이트(D-glyceraldehyde 3-phosphate)를 생산하고, 갈락토스 대사에 관여함이 공지된 바 있으나, 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈가 타가토스를 생산하는 활성을 가지는지에 대한 연구는 전무하다.

[반응식 1]

D-타가토스 1,6-이인산 ⇔ 글리세론 포스페이트 + D-글리세랄데하이드 3-포스페이트

본 출원에 이르러 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase)가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가진다는 사실을 새롭게 밝혀냈다. 따라서, 본 출원의 일 구현예는 과당으로부터 타가토스를 제조함에 있어서 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase)를 과당-4-에피머화 효소로 사용하는 것을 포함하는 타가토스-이인산 알돌레이즈의 신규한 용도를 제공한다. 또한, 본 출원의 다른 구현예는 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase)를 과당-4-에피머화 효소로 사용하여 과당으로부터 타가토스를 제조하는 방법을 제공한다.

본 출원의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태는 칼디리니아(Caldilinea) sp. 유래의 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase); 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 하나 이상 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 과당을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 과당은 구체적으로 D-프럭토스(fructose)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈는 내열성 미생물 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있으며, 예를 들어, 칼디리니아(Caldilinea) sp. 유래의 효소 또는 그 변이체일 수 있다. 구체적으로, 칼디리니아 에어로필라(Caldilinea aerophila) DSM 14535 유래의 효소 또는 그 변이체일 수 있다.

일 구현예로, 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈는 내열성이 높은 효소일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈는 50℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100% 또는 75% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈는 55℃ 내지 60℃, 또는 60℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 80% 내지 100% 또는 85% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다.

본 출원에서 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈는 서열번호 1 또는 이와 85% 이상의 동일성을 갖는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈는 서열번호 1 또는 이와 85% 이상의 동일성을 갖는 것일 수 있으며, 일 예로 과당을 기질로 하여 타가토스를 생산할 수 있다면 한정 없이 포함될 수 있다. 구체적으로 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈는 기질인 과당으로부터 타가토스로의 전환율(전환율=타가토스 중량/초기 과당 중량 *100)이 0.01% 이상, 구체적으로 0.1% 이상, 더욱 구체적으로 0.3% 이상인 것일 수 있다. 보다 구체적으로 전환율은 0.01% 내지 40%의 범위, 0.1% 내지 30%의 범위, 0.3% 내지 25%의 범위, 또는 0.3% 내지 20%의 범위일 수 있다.

본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈 또는 이의 변이체는 본 출원의 상기 효소 또는 이의 변이체를 발현하는 DNA, 예컨대, 서열번호 2로 이들을 E. coli 등의 균주에 형질전환시킨 다음, 이를 배양하여 배양물을 수득하고, 상기 배양물을 파쇄하여, 컬럼 등을 통해 정제하여 수득한 것일 수 있다. 상기 형질전환용 균주는 대장균(Escherichia coli) 외에도 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterum glutamicum), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 등이 있다.

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈는 서열번호 1의 아미노산 서열과 85% 이상의 유전적 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 구현예에 따르면. 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 기능성 단편(functional fragment)도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

또한, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 구체적으로는 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이루어진 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열을 포함하거나 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 변이형 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 상기 아미노산 서열 앞뒤에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.

상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 알지닌, 라이신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함한다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

상동성(homology) 또는 동일성(identity)은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 추가적으로, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 출원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"는 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 폴리뉴클레오티드에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990) 참조).

상기 폴리뉴클레오티드는 본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 1과 85% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지면서 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 예를 들어, 상기 서열번호 1 또는 이와 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 타가토스-이인산 알돌레이즈를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 더불어, 전술한 바와 같이 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 서열번호 2의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 역시 포함할 수 있음은 자명하다.

본 출원에서 사용될 수 있는 타가토스-이인산 알돌레이즈를 발현하는 미생물은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 미생물일 수 있다. 상기 벡터는 본 출원의 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 형태일 수 있다. 본 출원에서 용어, "작동 가능하게 연결된"이란 일반적으로 기능을 수행하도록 염기 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 염기 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 벡터와의 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다.

본 출원에서 용어 "벡터" 는 유기체, 예컨대 숙주세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. 여기서, "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 본 출원의 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 유기체, 예컨대, 숙주세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함할 수 있고, 미니구형 DNA, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)와 같은 트랜스포존(Izsvak et al. J.MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 재조합 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 상기 벡터는 다양한 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있다. 본 출원에서 용어, "항생제 저항성 유전자"란 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지고 있는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에 선별 마커로서 유용하게 사용된다. 본 출원에서 항생제 저항성 유전자는 본 출원의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, 암피실린(ampicilin), 테트라사이클린(tetracyclin), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloroamphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 또는 네오마이신(neomycin)에 대한 저항 유전자 등을 사용할 수 있다.

본 출원에서 이용될 수 있는 타가토스-이인산 알돌레이즈를 발현하는 미생물은, 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내로 도입하는 방법을 이용할 수 있으며, 상기 벡터를 형질전환시키는 방법은 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함될 수 있으며, 당해 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAEdextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 및 열 충격법 등이 포함될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

형질전환된 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입된 형태 및 염색체 외에 위치하고 있는 형태 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 재조합 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 출원의 미생물은 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 재조합 벡터를 포함하여 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈를 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로, 대장균(E. coli) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 미생물은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터 도입 이외에도 다양한 공지의 방법에 의해 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈를 발현할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다.

본 출원의 미생물의 배양물은 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈를 발현하는 미생물을 배지에서 배양하여 제조된 것일 수 있다.

본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 7 내지 9)를 조절할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있고, 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양온도는 25 내지 40 ℃, 구체적으로는 30 내지 37 ℃를 유지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 약 0.5 시간 내지 60 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 과당을 직접 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 활성을 갖는 타가토스-이인산 알돌레이즈, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 것으로서, 기질인 과당 이외에 다른 효소를 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 당해 타가토스 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 금속을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 출원의 금속은 2가 양이온을 포함하는 금속일 수 있다. 구체적으로 본 출원의 금속은 2가 양이온을 포함하는 금속일 수 있다. 구체적으로 본 출원의 금속은 니켈(Ni), 마그네슘(Mg) 또는 망간(Mn)일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 금속은 금속이온 또는 금속염일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 본 출원의 금속은 망간, 니켈로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 보다 더 구체적으로 상기 금속염은 MgSO₄, NiSO₄, NiCl₂, MgCl₂, MnCl₂ 또는 MnSO₄일 수 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 칼디니리아(Caldilinea) sp. 유래의 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase); 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 하나 이상과 과당을 접촉시켜, 상기 과당을 타가토스로 전환하는 단계를 포함하는 타가토스의 제조방법을 제공한다. 상기 용어 타가토스-이인산 알돌레이즈, 미생물은 전술한 바와 같다.

일 구현예로, 본 출원의 접촉은 pH 5.0 내지 pH 9.0 조건에서, 30℃ 내지 80℃ 온도 조건에서, 및/또는 0.5시간 내지 48시간 동안 수행할 수 있다.

구체적으로, 본 출원의 접촉은 pH 6.0 내지 pH 9.0 조건 또는 pH 7.0 내지 pH 9.0 조건에서 수행할 수 있다. 또한, 본 출원의 접촉은 35℃ 내지 80℃, 40℃ 내지 80℃, 45℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 80℃, 55℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 80℃, 30 ℃ 내지 70℃, 35℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 70℃, 45℃ 내지 70℃, 50℃ 내지 70℃, 55℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 65℃, 35℃ 내지 65℃, 40℃ 내지65℃, 45℃ 내지 65℃, 50℃ 내지 65℃, 55℃ 내지 65℃, 30℃ 내지 60℃, 35℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 60℃, 45℃ 내지 60℃, 50℃ 내지 60℃ 또는 55℃ 내지 60℃ 온도 조건에서 수행할 수 있다. 더불어, 본 출원의 접촉은 0.5시간 내지 36시간 동안, 0.5시간 내지 24시간 동안, 0.5시간 내지 12시간 동안, 0.5시간 내지 6시간 동안, 1시간 내지 48시간 동안, 1시간 내지 36시간 동안, 1시간 내지 24시간 동안, 1시간 내지 12시간 동안, 1시간 내지 6시간 동안, 3시간 내지 48시간 동안, 3시간 내지 36시간 동안, 3시간 내지 24시간 동안, 3시간 내지 12시간 동안, 3시간 내지 6시간 동안, 6시간 내지 48시간 동안, 6시간 내지 36시간 동안, 6시간 내지 24시간 동안, 6시간 내지 12시간 동안, 12시간 내지 48시간 동안, 12시간 내지 36시간 동안, 12시간 내지 24시간 동안, 18시간 내지 48시간 동안, 18시간 내지 36시간 동안 또는 18시간 내지 30시간 동안 수행할 수 있다.

일 구현예로, 본 출원의 접촉은 금속 존재하에서 수행할 수 있다. 사용될 수 있는 금속은 전술한 양태에서와 같다.

다른 구현예로, 본 출원의 타가토스 제조방법은 과당에 금속이온 또는 금속염을 추가로 더 접촉시켜 과당을 타가토스로 전환시키는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 금속은 망간, 니켈로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 금속일 수 있다.

본 출원의 제조방법은 제조된 타가토스를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 및/또는 정제는 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있으며. 비제한적인 예로, 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 이온교환 크로마토그래피 및 분별 결정 등을 사용할 수 있다. 상기 정제는 하나의 방법만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다.

또한, 본 출원의 제조방법은 상기 분리 및/또는 정제하는 단계 이전 또는 이후에 탈색 및/또는 탈염을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 실시함으로써, 보다 품질이 우수한 타가토스를 얻을 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 타가토스로 전환하는 단계, 분리 및/또는 정제하는 단계, 또는 탈색 및/또는 탈염하는 단계 이후 타가토스를 결정화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 결정화는 통상적으로 사용하는 결정화 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 냉각결정화 방법을 사용하여 결 정화를 수행할 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조 방법은 상기 결정화하는 단계 이전에 타가토스를 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 농축은 결정화 효율을 높일 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 분리 및/또는 정제하는 단계 이후 미반응된 과당을 본 출원의 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시키는 단계, 본 출원의 결정화하는 단계 이후 결정이 분리된 모액을 상기 분리 및/또는 정제 단계에 재사용하는 단계, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다.

본 출원의 과당-4-에피머화 효소인 타가토스-이인산 알돌레이즈는 내열성이 우수하여 산업적으로 타가토스 생산이 가능하고, 보편화된 당인 과당을 타가토스로 전환하는 바 경제성이 높은 효과가 있다.

도 1는 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_CA_F4E가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 나타내는 HPLC 크로마토그래피 그래프이다.
도 2는 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_CA_F4E의 온도 변화에 따른 과당-4-에피머화 효소 활성을 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 출원의 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소 CJ_CA_F4E의 금속 첨가에 따른 과당-4-에피머화 활성을 보여주는 그래프이다.

이하 본 출원을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 신규한 타가토스-이인산 알돌레이즈를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환체의 제조

신규한 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 제공하기 위해, 대표적으로 칼디리니아 속인 칼디리니아 에어로필라(Caldilinea aerophila) DSM 14535 유래 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.

구체적으로, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 에 등록된 칼디리니아 에어로필라 DSM 14535 유전자 서열에서 타가토스-이인산 알돌레이즈 유전자 서열을 선발하고, 상기 미생물의 아미노산 서열(서열번호 1)과 염기 서열(서열번호 2) 정보를 바탕으로 상기 효소의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 벡터 pBT7-C-His-CJ_CA_F4E를 제조하였다(㈜바이오니아, 대한민국).

상기 재조합 벡터는 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 형질전환 균주를 E. coli BL21(DE3)/CJ_CA_F4E로 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국 미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2017년 08월 11일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM12094P를 부여받았다.

실시예 2: 재조합 효소의 제조 및 정제

상기 실시예 1에서 제조한 형질전환 균주 E. coli BL21(DE3)/CJ_CA_F4E 로부터 재조합 효소를 제조하기 위하여, 형질전환 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 상기 종균 배양결과 얻은 배양액을 LB와 단백질 발현조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본 배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 다음, 상기 배양액을 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 상기 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액에 재현탁하였다. 상기 재현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이어서, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제한 다음, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위하여 정제효소 CJ_CA_F4E를 확보하였다.

실시예 3: 과당으로부터 타가토스로의 전환 및 활성 확인

상기 실시예 2에서 확보한 본 출원 재조합 효소 CJ_CA_F4E의 과당-4-에피머화 활성을 측정하기 위하여, 30 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM NiSO₄ 및 20 mg/mL CJ_CA_F4E를 첨가하여 60℃에서 10시간 동안 반응시켰다.

반응 후 잔존하는 과당 및 생성물인 타가토스의 정량은 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석은 Shodex Sugar SP0810 컬럼을 사용하였고, 컬럼 온도는 80℃로 하였으며, 이동상인 물의 유속은 1 mL/min으로 흘려주었다(도 1).

실험 결과, 본 출원 CJ_CA_F4E의 효소반응에 의한 과당으로부터 타가토스로의 전환율은 1.6%으로 확인되었다.

실시예 4: 온도에 따른 재조합 효소의 활성 확인

상기 실시예 2에서 제조한 효소 CJ_CA_F4E의 과당-4-에피머화 활성에 대한 온도의 영향력을 조사하기 위하여, 10 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl(pH8.0) 완충용액에, 1 mg/mL의 CJ_CA_F4E 를 첨가하여 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃ 및 70℃의 다양한 온도에서 3시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 완료 후 반응물 내의 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.

실험 결과, CJ_CA_F4E는 60℃에서 최대 활성을 나타내었으며, 55℃ 내지 65℃에서 최대 활성의 80% 이상, 모든 온도 범위에서 최대 활성의 40% 이상을 유지하였다(도 2).

실시예 5: 금속이온 첨가에 따른 본 출원 재조합 효소의 활성 확인

상기 실시예 2에서 제조한 효소 CJ_CA_F4E의 과당-4-에피머화 활성에 대한 금속이온별 영향력을 확인하기 위하여, 10 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl (pH8.0) 완충용액에, 1 mg/mL의 CJ_CA_F4E와 각 1 mM의 다양한 금속이온(ZnSO₄, MgCl₂, MnCl₂, NH₄Cl, CaCl₂, Na₂SO₄, CuSO₄, MgSO₄, MnSO₄, (NH₄)₂SO₄ 또는 NiSO₄)을 첨가하여 60℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후 반응물의 타가토스를 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.

실험 결과, CJ_CA_F4E는 MnCl₂, MnSO₄ 및 NiSO₄ 각각의 첨가에 의하여 활성이 증가하는 것으로 나타나 망간 또는 니켈 이온이 활성을 증가시킨다는 사실을 확인하였다(도 3).

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM12094P 20170811

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A Fructose C4 epimerases and Preparation Method for producing Tagatose using the same <130> KPA180905-KR <150> KR 10-2017-0111489 <151> 2017-08-31 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 408 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of CA-F4E <400> 1 Met Ser Thr Leu Arg His Ile Ile Leu Arg Leu Ile Glu Leu Arg Glu 1 5 10 15 Arg Glu Gln Ile His Leu Thr Leu Leu Ala Val Cys Pro Asn Ser Ala 20 25 30 Ala Val Leu Glu Ala Ala Val Lys Val Ala Ala Arg Cys His Thr Pro 35 40 45 Met Leu Phe Ala Ala Thr Leu Asn Gln Val Asp Arg Asp Gly Gly Tyr 50 55 60 Thr Gly Trp Thr Pro Ala Gln Phe Val Ala Glu Met Arg Arg Tyr Ala 65 70 75 80 Val Arg Tyr Gly Cys Thr Thr Pro Leu Tyr Pro Cys Leu Asp His Gly 85 90 95 Gly Pro Trp Leu Lys Asp Arg His Ala Gln Glu Lys Leu Pro Leu Asp 100 105 110 Gln Ala Met His Glu Val Lys Leu Ser Leu Thr Ala Cys Leu Glu Ala 115 120 125 Gly Tyr Ala Leu Leu His Ile Asp Pro Thr Val Asp Arg Thr Leu Pro 130 135 140 Pro Gly Glu Ala Pro Leu Val Pro Ile Val Val Glu Arg Thr Val Glu 145 150 155 160 Leu Ile Glu His Ala Glu Gln Glu Arg Gln Arg Leu Asn Leu Pro Ala 165 170 175 Val Ala Tyr Glu Val Gly Thr Glu Glu Val His Gly Gly Leu Val Asn 180 185 190 Phe Asp Asn Phe Val Ala Phe Leu Asp Leu Leu Lys Ala Arg Leu Glu 195 200 205 Gln Arg Ala Leu Met His Ala Trp Pro Ala Phe Val Val Ala Gln Val 210 215 220 Gly Thr Asp Leu His Thr Thr Tyr Phe Asp Pro Ser Ala Ala Gln Arg 225 230 235 240 Leu Thr Glu Ile Val Arg Pro Thr Gly Ala Leu Leu Lys Gly His Tyr 245 250 255 Thr Asp Trp Val Glu Asn Pro Ala Asp Tyr Pro Arg Val Gly Met Gly 260 265 270 Gly Ala Asn Val Gly Pro Glu Phe Thr Ala Ala Glu Phe Glu Ala Leu 275 280 285 Glu Ala Leu Glu Arg Arg Glu Gln Arg Leu Cys Ala Asn Arg Lys Leu 290 295 300 Gln Pro Ala Cys Phe Leu Ala Ala Leu Glu Glu Ala Val Val Ala Ser 305 310 315 320 Asp Arg Trp Arg Lys Trp Leu Gln Pro Asp Glu Ile Gly Lys Pro Phe 325 330 335 Ala Glu Leu Thr Pro Ala Arg Arg Arg Trp Leu Val Gln Thr Gly Ala 340 345 350 Arg Tyr Val Trp Thr Ala Pro Lys Val Ile Ala Ala Arg Glu Gln Leu 355 360 365 Tyr Ala His Leu Ser Leu Val Gln Ala Asp Pro His Ala Tyr Val Val 370 375 380 Glu Ser Val Ala Arg Ser Ile Glu Arg Tyr Ile Asp Ala Phe Asn Leu 385 390 395 400 Tyr Asp Ala Ala Thr Leu Leu Gly 405 <210> 2 <211> 1227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequences of CA-F4E <400> 2 atgtcaacac ttcgccacat cattttgcga ctgatcgagc tgcgtgaacg agaacagatc 60 catctcacgc tgctggccgt ctgtcccaac tcggcggcgg tgctggaggc agcggtgaag 120 gtcgccgcgc gctgccacac gccgatgctc ttcgctgcca cgctcaatca agtcgatcgc 180 gacggcggct acaccggttg gacgcctgcg caattcgtcg ccgagatgcg tcgctatgcc 240 gtccgctatg gctgcaccac cccgctctat ccttgcctgg atcacggcgg gccgtggctc 300 aaagatcgcc atgcacagga aaagctaccg ctcgaccagg cgatgcatga ggtcaagctg 360 agcctcaccg cctgtctgga ggccggctac gcgctgctgc acatcgaccc cacggtcgat 420 cgcacgctcc cgcccggaga agcgccgctc gtgccgatcg tcgtcgagcg cacggtcgag 480 ctgatcgaac atgccgaaca ggagcgacag cggctgaacc tgccggcggt cgcctatgaa 540 gtcggcaccg aagaagtaca tggcgggctg gtgaatttcg acaattttgt cgccttcttg 600 gatttgctca aggcaaggct tgaacaacgt gccctgatgc acgcctggcc cgccttcgtg 660 gtggcgcagg tcggcactga cctgcataca acgtattttg accccagtgc ggcgcaacgg 720 ctgactgaga tcgtgcgccc taccggtgca ctgttgaagg ggcactacac cgactgggtc 780 gaaaatcccg ccgactatcc gagggtaggc atgggaggcg ccaacgttgg tccagagttt 840 acggcggccg agttcgaggc gctggaagcg ctggaacggc gggaacaacg gctgtgcgcc 900 aaccggaaat tgcagcccgc ctgttttttg gctgcactgg aagaggcagt agtcgcttca 960 gatcgttggc ggaagtggct ccagcccgat gagatcggca agccctttgc agaattaacg 1020 cccgcacgcc ggcgctggct cgtgcagacc ggggcacgct acgtctggac tgcgccgaaa 1080 gttatcgccg cacgcgaaca gctctatgcg cacctctccc ttgtgcaggc ggatccacat 1140 gcctacgtgg tagagtcagt cgcccggtca atcgagcgct atatcgatgc cttcaactta 1200 tacgacgccg ctacattgct tggatga 1227

Claims (11)

1. 서열번호 1을 포함하는 단백질; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 하나 이상 포함하는 타가토스 생산용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 과당을 추가로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 과당은 D-프럭토스(fructose)인 것인, 타가토스 생산용 조성물.
   
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 금속 이온 또는 금속염을 추가로 포함하고, 상기 금속은 망간, 니켈로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 금속인, 타가토스 생산용 조성물.
   
6. 삭제
7. 서열번호 1을 포함하는 단백질; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 하나 이상과 과당을 접촉시켜, 상기 과당을 타가토스로 전환하는 단계를 포함하는 타가토스의 제조방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 접촉은 pH 7.0 내지 9.0, 및 45℃ 내지 80℃ 온도에서 0.5시간 내지 24시간 동안 수행하는 방법.
   
9. 제7항에 있어서, 상기 전환은 상기 과당에 금속이온 또는 금속염 존재하에서 수행되고, 상기 금속은 망간, 니켈로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 금속인, 방법.
   
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