KR102194285B1

KR102194285B1 - 신규 과당-4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법

Info

Publication number: KR102194285B1
Application number: KR1020180125279A
Authority: KR
Inventors: 이영미; 박일향; 김성보; 박승원; 최은정
Original assignee: 씨제이제일제당 주식회사
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2020-12-23
Also published as: US20220372534A1; EP3845643A4; CN112867793B; WO2020080658A1; EP3845643A1; AR116589A1; KR20200045059A; CN112867793A; EP3845643B1

Abstract

본 출원은 신규 과당-4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

신규 과당-4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법{A Novel Fructose C4 epimerases and Preparation Method for producing Tagatose using the same}

타가토스는 우유, 치즈 및 카카오 등의 식품, 그리고 사과와 귤과 같은 단맛이 나는 천연과일에 소량 존재하는 천연 감미료이다. 타가토스의 칼로리는 1.5 kcal/g으로 설탕의 1/3 수준이며, GI(Glycemic index, 혈당지수)는 3으로 설탕의 5% 수준인데 반해, 설탕과 물리적 성질이 유사하고, 유사한 단맛을 내면서 다양한 건강 기능성을 가지고 있기 때문에 건강과 맛을 동시에 만족시킬 수 있는 설탕 대체 감미료로 여러 제품에 이용될 수 있다.

종래 공지되거나 공용된 타가토스의 제조방법은 갈락토스를 주원료로 한 화학적 방법(촉매 반응)과 생물학적 방법(이성화 효소반응)이 있다(PCT WO2006/058092, 대한민국 등록특허 제10-0964091호 및 제10-1368731호 참조). 그러나 상기 종래의 제조방법에서 주원료로 사용되는 갈락토스의 기초 원료가 되는 유당은 국제 시장에서의 원유(原乳) 및 유당의 생산량, 수요 및 공급량 등에 따라 가격이 불안정하여 안정적 수급에 한계가 있으므로, 보편화된 당(설탕, 포도당, 과당 등)을 원료로 타가토스를 제조할 수 있는 새로운 방법이 요구되었다.

이러한 배경 하에, 본 출원자들은 과당을 타가토스로 전환시키는 활성을 가지는 효소를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 종래에 기능이 밝혀지지 않은 폴리펩타이드 서열이 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 것을 새롭게 밝혔으며, 상기 폴리펩타이드가 과당을 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 효소활성이 있음을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 과당-4-에피머화 효소(fructose-C4-epimerase) 활성을 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 폴리펩타이드; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 하나 이상 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터를 포함하는 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물과 과당을 접촉시켜, 상기 과당을 타가토스로 전환하는 단계를 포함하는 타가토스의 제조방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다,

본 출원의 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 하나 이상 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공한다.

본 출원은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(단백질)가 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 것을 새롭게 규명한 것에 특징이 있다.

과당-4-에피머화 효소는 D-프럭토스(과당)의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 D-타가토스로 전환시키는 특징이 있다.

본 출원에 이르러 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 과당-4-에피머화 효소 활성을 가진다는 사실을 새롭게 밝혀냈다. 따라서, 본 출원의 일 구현예는 과당으로부터 타가토스를 제조함에 있어서 상기 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는, 가설 단백질(hypothetical protein)로 알려진 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 신규한 효소 용도를 제공한다. 또한, 본 출원의 다른 구현예는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 과당-4-에피머화 활성을 갖는 폴리펩타이드를 사용하여 과당으로부터 타가토스를 제조하는 방법을 제공한다.

본 출원의 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는, 예를 들어 과당을 기질로 하여 타가토스를 생산할 수 있는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상의 동일성 또는 상동성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드 역시 한정 없이 포함될 수 있다. 구체적으로 과당-4-에피머화 효소는 기질인 과당으로부터 타가토스로의 전환율(전환율=타가토스 중량/초기 과당 중량 *100)이 0.01% 이상, 구체적으로 0.1% 이상, 더욱 구체적으로 0.3%이상인 것일 수 있다. 보다 구체적으로 전환율은 0.01% 내지 40%의 범위, 0.1% 내지 30%의 범위, 0.3% 내지 25%의 범위, 또는 0.3% 내지 20%의 범위일 수 있다.

본 출원의 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 내열성 미생물 유래 과당-4-에피머화 활성을 갖는 효소 또는 그 변이체일 수 있으며, 예를 들어, 리토릴리네아(Litorilinea) sp. 유래의 효소 또는 그 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 리토릴리네아 에어로필라(Litorilinea aerophila) 또는 그 변이체일 수 있다.

일 구현예로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 내열성이 높은 효소일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 30℃ 내지 70℃에서 최대 활성의 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100% 또는 75% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 40℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 65℃, 45℃, 50℃, 55℃, 또는 60℃에서 최대 활성의 80% 내지 100% 또는 85% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다. 나아가, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 서열번호 1로 이루어진 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

구체적으로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 서열번호 1과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또 하나의 구체예로, 상기 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드거나, 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 상동성 또는 동일성을 가지며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능(즉, 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 활성)을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 더불어, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩타이드로서, 과당-4-에피머화 활성을 가지는 폴리펩타이드도 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 서열번호 1과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 하나 이상을 포함할 수 있다.

즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 폴리펩타이드' 또는 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드'라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.

상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 알지닌, 라이신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함한다.

본 출원의 다른 양태는 상기 과당 4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 미생물을 제공한다.

본 출원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"는 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 폴리뉴클레오티드에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990) 참조).

상기 폴리뉴클레오티드는 본 출원의 서열번호 1과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 가지면서 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 예를 들어, 상기 서열번호 1과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 70% 이상, 80% 이상, 구체적으로는 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다.

본 출원에서 용어 "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) 이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.

본 출원에서 사용될 수 있는 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 발현하는 미생물은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 미생물일 수 있다. 상기 벡터는 본 출원의 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 형태일 수 있다. 본 출원에서 용어, "작동 가능하게 연결된"이란 일반적으로 기능을 수행하도록 염기 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 염기 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 벡터와의 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다.

본 출원에서 용어 "벡터" 는 유기체, 예컨대 숙주세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. 여기서, "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 본 출원의 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 유기체, 예컨대, 숙주세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함할 수 있고, 미니구형 DNA, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)와 같은 트랜스포존(Izsvak et al. J.MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 재조합 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 상기 벡터는 다양한 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있다. 본 출원에서 용어, "항생제 저항성 유전자"란 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지고 있는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에 선별 마커로서 유용하게 사용된다. 본 출원에서 항생제 저항성 유전자는 본 출원의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, 암피실린(ampicilin), 테트라사이클린(tetracyclin), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloroamphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 또는 네오마이신(neomycin)에 대한 저항 유전자 등을 사용할 수 있다.

본 출원에서 이용될 수 있는 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 발현하는 미생물은, 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내로 도입하는 방법을 이용할 수 있으며, 상기 벡터를 형질전환시키는 방법은 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함될 수 있으며, 당해 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAEdextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 및 열 충격법 등이 포함될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 일 구현예로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 발현하는 미생물은 서열번호 1과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 과당-4-에피머화 효소, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 타가토스 생산용 미생물일 수 있다.

형질전환된 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입된 형태 및 염색체 외에 위치하고 있는 형태 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 재조합 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 출원의 미생물은 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 재조합 벡터를 포함하여 본 출원의 과당-4-에피머화 효소를 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로, 대장균(E. coli) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 미생물의 배양물은 본 출원의 미생물을 배지에서 배양하여 제조된 것일 수 있다. 상기 미생물의 배양물은 본 출원의 미생물에 의해 발현된 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드가 외부 기질과 접촉할 수 있는 상태로 존재하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 미생물을 배양하는 단계는, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있으나 특별히 이에 제한되지 않는다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 7 내지 9)를 조절할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있고, 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양온도는 25 내지 40 ℃, 구체적으로는 30 내지 37 ℃를 유지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 약 0.5 시간 내지 60 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 추가로 과당을 포함할 수 있다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 과당을 직접 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 것으로서, 상기 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 그의 변이체에 의해 과당을 기질로 하여 타가토스가 생성될 수 있다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 당해 타가토스 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 금속을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 출원의 금속은 2가 양이온을 포함하는 금속일 수 있다. 구체적으로 본 출원의 금속은 니켈(Ni), 마그네슘(Mg) 또는 망간(Mn)일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 금속은 금속이온 또는 금속염일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 금속염은 MgSO₄, NiSO₄, NiCl₂, MgCl₂, MnCl₂ 또는 MnSO₄일 수 있다.

본 출원은 다른 양태로서, 과당을 상기 조성물과 접촉시켜 상기 과당을 타가토스로 전환하는 단계를 포함하는 타가토스 제조방법을 제공한다.

일 구현예로, 상기 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 서열번호 1과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 구현예로, 본 출원의 접촉은 pH 5.0 내지 pH 9.0 조건에서, 30℃ 내지 80℃ 온도 조건에서, 및/또는 0.5시간 내지 48시간 동안 수행할 수 있다.

구체적으로, 본 출원의 접촉은 pH 6.0 내지 pH 9.0 조건 또는 pH 7.0 내지 pH 9.0 조건에서 수행할 수 있다. 또한, 본 출원의 접촉은 30℃ 내지 80℃, 35℃ 내지 80℃, 40℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 80℃, 30 ℃ 내지 70℃, 35℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 70℃, 45℃ 내지 70℃, 50℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 65℃, 35℃ 내지 65℃, 40℃ 내지 65℃, 45℃ 내지 65℃, 50℃ 내지 65℃, 30℃ 내지 60℃, 35℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 60℃, 45℃ 내지 60℃, 50℃ 내지 60℃ 온도 조건에서 수행할 수 있다. 더불어, 본 출원의 접촉은 0.5시간 내지 36시간 동안, 0.5시간 내지 24시간 동안, 0.5시간 내지 12시간 동안, 0.5시간 내지 6시간 동안, 1시간 내지 48시간 동안, 1시간 내지 36시간 동안, 1시간 내지 24시간 동안, 1시간 내지 12시간 동안, 1시간 내지 6시간 동안, 3시간 내지 48시간 동안, 3시간 내지 36시간 동안, 3시간 내지 24시간 동안, 3시간 내지 12시간 동안, 3시간 내지 6시간 동안, 6시간 내지 48시간 동안, 6시간 내지 36시간 동안, 6시간 내지 24시간 동안, 6시간 내지 12시간 동안, 12시간 내지 48시간 동안, 12시간 내지 36시간 동안, 12시간 내지 24시간 동안, 18시간 내지 48시간 동안, 18시간 내지 36시간 동안 또는 18시간 내지 30시간 동안 수행할 수 있다.

일 구현예로, 본 출원의 접촉은 금속 존재하에서 수행할 수 있다. 사용될 수 있는 금속은 전술한 양태에서와 같다.

본 출원의 제조방법은 제조된 타가토스를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 및/또는 정제는 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있으며. 비제한적인 예로, 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 이온교환 크로마토그래피 및 분별 결정 등을 사용할 수 있다. 상기 정제는 하나의 방법만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다.

또한, 본 출원의 제조방법은 상기 분리 및/또는 정제하는 단계 이전 또는 이후에 탈색 및/또는 탈염을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 실시함으로써, 보다 품질이 우수한 타가토스를 얻을 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 타가토스로 전환하는 단계, 분리 및/또는 정제하는 단계, 또는 탈색 및/또는 탈염하는 단계 이후 타가토스를 결정화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 결정화는 통상적으로 사용하는 결정화 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 냉각결정화 방법을 사용하여 결 정화를 수행할 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조 방법은 상기 결정화하는 단계 이전에 타가토스를 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 농축은 결정화 효율을 높일 수 있다.

다른 구현예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 분리 및/또는 정제하는 단계 이후 미반응된 과당을 본 출원의 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시키는 단계, 본 출원의 결정화하는 단계 이후 결정이 분리된 모액을 상기 분리 및/또는 정제 단계에 재사용하는 단계, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다.

본 출원의 과당-4-에피머화 효소는 내열성이 우수하여 산업적으로 타가토스 생산이 가능하고, 보편화된 당인 과당을 타가토스로 전환하는 바 경제성이 높은 효과가 있다.

도 1은 가설 단백질(hypothetical protein) 인 CJ_LiA_F4E 의 과당-4-에피머화 효소 활성을 확인한 HPLC 크로마토그래피 그래프이다.
도 2는 가설 단백질(hypothetical protein) 인 CJ_LiA_F4E 의 온도 변화에 따른 과당-4-에피머화 효소 활성을 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 가설 단백질 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환체의 제조

신규한 내열성의 과당-4-에피머화 효소를 발굴하기 위하여, 리토릴리네아 에어로필라(Litorilinea aerophila)로부터 기능이 밝혀지지 않은 가설 단백질의 유전자 정보를 확보하여 대장균 발현 가능 벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.

구체적으로, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 에 등록된 리토릴리네아 에어로필라 (Litorilinea aerophila) 유전자 서열에서 가설 단백질(hypothetical protein) 유전자 서열을 선발하고, 상기 미생물의 아미노산 서열(서열번호 1)과 염기 서열(서열번호 2) 정보를 바탕으로 상기 단백질의 염기서열을 포함하는 대장균 발현 가능한 재조합 벡터 pBT7-C-His-CJ_LiA_F4E 를 제조하였다(㈜바이오니아, 대한민국).

제조한 각각의 재조합 벡터를 이용하여 열 충격(heat shock transformation, Sambrook and Russell: Molecular cloning, 2001)으로 대장균 BL21(DE3)을 형질전환 한 후, 50% 글리세롤에 냉동 보관하여 사용하였다. 상기 형질전환 균주를 E. coli BL21(DE3)/CJ_LiA_F4E 로 명명하였다.

실시예 2: 단백질의 제조 및 정제

단백질을 제조하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조한 형질전환 균주 E. coli BL21(DE3)/CJ_LiA_F4E 를 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃ 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 상기 종균 배양 결과 얻은 배양액을 LB와 단백질 발현조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본 배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃ 조건에서 실시하였다. 다음, 상기 배양액을 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 상기 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액에 재현탁하였다. 상기 재현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이어서, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제한 다음, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위한 정제효소 CJ_LiA_F4E 를 확보하였다.

실시예 3: 가설 단백질의 과당-4-에피머화 효소 활성인 과당으로부터 타가토스로의 전환 및 활성 확인

상기 실시예 2에서 제조한 본 발명 재조합 효소 CJ_LiA_F4E가 과당-4-에피머화 활성을 갖는지 확인하기 위하여, 30 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM NiSO₄ 및 각 20 mg/mL CJ_LiA_F4E 를 첨가하여 55℃에서 10시간 동안 반응시켰다.

반응 후 잔존하는 과당 및 생성물인 타가토스의 정량은 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석은 Shodex Sugar SP0810 컬럼을 사용하였고, 컬럼 온도는 80℃로 하였으며, 이동상인 물의 유속은 1 mL/min으로 흘려주었다(도 1).

실험 결과, 본 발명 CJ_LiA_F4E 효소반응에 의한 과당으로부터 타가토스로의 전환율은 7.24% 로 확인되었다.

이를 통해, 본 발명의 CJ_LiA_F4E 단백질이 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는다는 것을 확인하였으며, 이를 타가토스 제조에 이용할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 4: CJ_LiA_F4E 의 온도에 따른 활성 확인

상기 실시예 2에서 제조한 효소 CJ_LiA_F4E 의 과당-4-에피머화 활성에 대한 온도의 영향력을 조사하기 위하여 10 중량% 과당을 포함하는 50 mM Tris HCl(pH8.0) 완충용액에, 각 10 mg/mL의 CJ_LiA_F4E 를 첨가하여 45℃, 50℃, 55℃, 60℃ 및 65℃의 다양한 온도에서 10시간 동안 반응시켰다. HPLC를 이용하여 상기 반응 완료 후 반응물 내의 타가토스를 정량 분석하였다.

실험 결과, CJ_LiA_F4E 는 55℃에서 최대 활성을 나타내었으며, 모든 온도 범위에서 최대 활성의 60% 이상을 유지하였다(도 2).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A Novel Fructose C4 epimerases and Preparation Method for producing Tagatose using the same <130> KPA181163-KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 431 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Litorilinea aerophila <400> 1 Met Tyr Pro Val Leu Glu Asn Ile Leu Arg Ala Gln Gln Gln Gly Glu 1 5 10 15 Ala Leu Gly Ile Pro Ser Ile Cys Ser Ala His Pro Phe Val Leu Glu 20 25 30 Ala Thr Phe Arg His Ala Leu Thr Thr Gly Arg Thr Val Leu Ile Glu 35 40 45 Ser Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln His Gly Gly Tyr Thr Gly Met Thr 50 55 60 Pro Gly Asp Phe Val Ala Tyr Val Ala Ala Leu Ala Asp Arg Leu His 65 70 75 80 Phe Pro Arg Glu Arg Ile Leu Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Asn 85 90 95 Pro Trp Arg Asp Arg Pro Ala Asp Gln Ala Leu Asn Gln Ala Arg Ile 100 105 110 Leu Val Gln Glu Tyr Val Arg Ala Gly Tyr Gly Lys Ile His Leu Asp 115 120 125 Ala Ser Met Ala Cys Gly Gly Asp Pro Ala Asp Ala Pro Leu Asp Lys 130 135 140 Ala Val Ala Ala Glu Arg Ala Ala Ala Leu Ala Glu Ala Ala Glu Ala 145 150 155 160 Ala Phe Gln Arg Met Gly Ser Gly Thr Pro Pro Cys Tyr Val Ile Gly 165 170 175 Thr Glu Val Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gln Gly Asp Asp Met Pro Leu 180 185 190 Ala Ile Thr Ala Pro Arg Glu Val Ala Glu Thr Ile Glu Leu Thr Gln 195 200 205 Ala Ala Phe Arg Arg Arg Gly Leu Glu Ala Ala Trp Glu Arg Val Ile 210 215 220 Ala Val Val Val Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Asp Glu Gln Val His 225 230 235 240 Pro Tyr Asp Arg Ala Ala Ala Ala Gly Leu Ala Arg Ala Ile Glu Pro 245 250 255 Tyr Gly Arg Leu Val Tyr Glu Ala His Ser Thr Asp Tyr Gln Thr Arg 260 265 270 Gln Ala Leu Arg Asp Leu Val Ala Asp His Phe Ala Ile Leu Lys Val 275 280 285 Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ala Phe Arg Glu Ala Val Phe Ala Leu Ala 290 295 300 Ala Val Glu Glu Glu Trp Leu Ala Gly Gln Ala Gly Val Val Leu Ser 305 310 315 320 Arg Leu Arg Glu Glu Leu Glu Ala Ala Met Ile Gln Asp Pro Thr His 325 330 335 Trp Arg Gly Tyr Tyr Arg Gly Asp Glu Arg His Gln Arg Leu Ala Arg 340 345 350 Arg Tyr Ser Tyr Ser Asp Arg Ala Arg Tyr Tyr Trp Pro Arg Pro Ser 355 360 365 Val Gln Ala Ala Leu Glu Arg Leu Leu His Asn Leu Glu Ala Ala Pro 370 375 380 Pro Pro Leu Thr Leu Leu Ser Gln Tyr Leu Pro Val Gln Tyr Trp Ser 385 390 395 400 Val Arg Glu Gly Leu Leu Glu Pro Thr Pro Arg Ser Leu Ile Val Asp 405 410 415 Lys Ile Ile Gln Val Leu Asn Asp Tyr Thr Trp Ala Cys Gly Gly 420 425 430 <210> 2 <211> 1296 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Litorilinea aerophila <400> 2 atgtaccccg tcctggaaaa catcctgcgc gcccagcagc agggcgaagc cctgggcatc 60 ccgtccatct gctccgcgca cccttttgtg ctggaggcga ctttccgcca cgccctgacc 120 accggccgga ccgtgctcat tgaatccacc tgcaaccagg tgaaccagca cggcggatac 180 acgggcatga cgcccggtga ctttgtggcc tacgtggccg ccctggccga tcggctccac 240 tttccccgag aacgcatcct gttgggtggc gatcacctgg ggcccaaccc ctggcgggat 300 cgcccggcgg accaggccct gaaccaggcc cggatcctgg tccaggaata tgtacgggcc 360 ggctacggca agatccacct ggacgcgagc atggcctgtg gcggggatcc agccgacgcc 420 cccctggaca aagccgtggc ggccgagcgg gccgcagccc tggccgaggc agcggaagcc 480 gcgtttcaac ggatggggag tggaacgccc ccctgctacg tcatcggcac ggaggtgcca 540 cccccgggcg gcgcccaggg agacgacatg cccctggcca tcaccgcgcc ccgggaagtg 600 gccgagacca tcgagctgac ccaggcagcc ttccgccggc gcgggctgga agcagcctgg 660 gaacgggtca ttgcggtggt ggtgcagcca ggcgtggagt tcggcgacga gcaggtgcat 720 ccatatgacc gggctgcggc ggccggcctg gcccgggcca tcgagcccta cgggcggctg 780 gtgtacgagg cccactccac cgactaccag acccgccagg ccctgcggga tctggtggcg 840 gatcactttg ccatcctgaa ggtggggccg gccctcactt ttgcctttcg ggaggcggtc 900 tttgccctgg ctgcggtgga ggaggaatgg ctggccggcc aggcgggggt ggtcctgtcc 960 cggctgcggg aggagctgga ggcagccatg atccaggatc ccacccactg gcggggctat 1020 tatcgagggg atgagcggca tcaacgattg gctcgccgct acagctacag cgaccgggcc 1080 cgctactatt ggccacggcc gtccgtccag gcggcgctgg aacggctgct acacaacctg 1140 gaggccgccc cgccgcccct gaccctgctc agccaatacc tgcctgtgca gtactggagc 1200 gtccgcgaag ggctcctgga gccgacgccc cggtccctga tcgtggacaa aatcatccag 1260 gtgttgaatg actacacctg ggcctgtggg ggatga 1296

Claims

삭제
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
제2항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
제2항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제3항의 벡터를 포함하는 미생물.
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 하나 이상 포함하는 타가토스 생산용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 조성물은 과당을 추가로 포함하는 타가토스 생산용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 조성물은 금속 이온 또는 금속염을 추가로 포함하는 타가토스 생산용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 금속은 니켈(Ni), 마그네슘(Mg) 및 망간(Mn)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 금속인 타가토스 생산용 조성물.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 과당과 접촉시켜, 상기 과당을 타가토스로 전환하는 단계를 포함하는 타가토스 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 접촉은 pH 7.0 내지 9.0, 40℃ 내지 80℃ 온도에서 0.5시간 내지 24시간 동안 수행하는 방법.