CN112867793A

CN112867793A - 新型果糖-4-差向异构酶及使用其制备塔格糖的方法

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Publication number: CN112867793A
Application number: CN201980068292.3A
Authority: CN
Inventors: 李英美; 朴逸香; 金成俌; 朴承源; 崔殷姃
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2019-08-09
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2039-08-09
Also published as: KR102194285B1; EP3845643B1; KR20200045059A; EP3845643A4; AR116589A1; WO2020080658A1; CN112867793B; US20220372534A1; EP3845643A1

Abstract

本发明涉及新型果糖‑4‑差向异构酶以及使用其制备塔格糖的方法。

Description

新型果糖-4-差向异构酶及使用其制备塔格糖的方法

技术领域

本发明涉及新型的果糖-C4-差向异构酶和使用其制备塔格糖的方法。

背景技术

塔格糖是一种天然甜味剂，其少量存在于诸如牛奶、奶酪、可可等食物中，以及诸如苹果和橘子的甜水果中。尽管塔格糖的热量值为1.5kcal/g，是蔗糖的三分之一，其血糖指数(Glycemic index，GI)为3，是蔗糖的5％，但塔格糖的物理性质和甜味与蔗糖相似，并且塔格糖具有多种有益于健康的功能。因此，塔格糖可以用作同时满足健康要求和口味的糖替代品。

使用半乳糖作为主要成分，通过本领域众所周知或常用的方法已可制备塔格糖，例如化学方法(催化反应)和生物学方法(异构化酶反应)(PCT WO2006/058092，以及韩国专利号10-0964091和10-1368731)。然而，传统的制备方法中，使用半乳糖作为塔格糖的主要成分，而乳糖已被用作半乳糖的原料，由于乳糖的价格根据原料奶和乳糖的产量、需求和供应而波动，因而难以稳定地供应乳糖。因此需要开发使用普通糖(蔗糖、葡萄糖、果糖等)作为原料制备塔格糖的方法。

发明内容

发明人进行了深入的研究以开发具有将果糖转化为塔格糖的活性的酶，结果发现一种功能尚未被发现的多肽序列具有果糖-C4-差向异构酶活性，并且发明人已经证实，所发现的多肽具有将果糖转化为塔格糖的果糖-C4-差向异构酶活性，从而完成了本发明。

技术方案

本发明的一个目的是提供一种多肽，其具有果糖-C4-差向异构酶活性并且包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

本发明的另一个目的是提供用于制备塔格糖的组合物，其包含以下中的至少一种：多肽；表达所述多肽的微生物；或所述微生物的培养物。

本发明的又一个目的是提供一种微生物，其包含具有果糖-C4-差向异构酶活性的多肽、编码所述多肽的多核苷酸和包含所述多核苷酸的表达载体中的至少一种。

本发明的又一个目的是提供一种制备塔格糖的方法，其包括通过使所述组合物与果糖接触，以将果糖转化为塔格糖。

本发明的又一个目的是提供多肽用作果糖-C4-差向异构酶的用途，所述多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少85％的同源性或相同性的氨基酸序列。

有益效果

本发明的果糖-C4-差向异构酶具有优异的耐热性，可以工业化规模制备塔格糖，并将普通糖果糖转化为塔格糖，因此在经济上是可行的。

附图说明

图1是高效液相色谱(HPLC)图，示出作为假定蛋白的CJ_LiA_F4E的果糖-C4-差向异构酶活性。

图2为随着温度变化，作为假定蛋白的CJ_LiA_F4E的果糖-C4-差向异构酶活性图表。

具体实施方式

在下文中，将详细描述本发明。同时，本发明公开的每个描述和实施方案都可以应用以描述不同的描述和实施方案。即，本发明中公开的各种组份的所有组合都包括在本发明的范围内。此外，本发明的范围不受限于以下具体描述。

本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本发明的具体实施方案的许多等同物。本发明的范围意图涵盖这些等同物。

在一方面，为实现上述目的，本发明提供了一种多肽，其具有果糖-C4-差向异构酶活性并且包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供一种用于制备塔格糖的组合物，其包含以下中的至少一种：多肽，其具有果糖-C4-差向异构酶活性并且包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；表达所述多肽的微生物；或所述微生物的培养物。

根据本发明，发现具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽(蛋白)具有果糖-C4-差向异构酶活性。

果糖-C4-差向异构酶具有将D-果糖在第4碳位置差向异构化，以将D-果糖转化成D-塔格糖的特征。

发明人发现，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽具有果糖-C4-差向异构酶活性。因此，本发明的一个实施方案提供了由果糖制备塔格糖时，多肽的新酶学用途，其中所述多肽具有果糖-C4-差向异构酶活性并且包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，被称为假定蛋白。本发明的另一个实施方案提供了一种使用具有果糖-C4-差向异构酶活性并且包含SEQID NO：1的氨基酸序列的多肽，由果糖制备塔格糖的方法。

本发明的具有果糖-C4-差向异构酶活性的多肽还可以包括具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％同源性或相同性的序列的多肽，而没有限制，以果糖为底物，所述多肽能够制备塔格糖。特别地，果糖-C4-差向异构酶将作为底物的果糖转化为塔格糖的转化率可以为0.01％或更高，优选0.1％或更高，更优选0.3％或更高(转化率＝塔格糖的重量/初始果糖的重量x100)。更特别地，转化率可以为0.01％至40％、0.1％至30％、0.3％至25％或0.3％至20％。

本发明的具有果糖-C4-差向异构酶活性的多肽可以是具有果糖-C4-差向异构酶活性并且衍生自耐热微生物或其变体的酶。例如，衍生自属于Litorilinea sp.的微生物的酶或其变体，但不限于此。特别地，所述多肽可以是衍生自Litorilinea aerophila的酶或其变体。

本发明的具有果糖-C4-差向异构酶活性的多肽可以是具有优异的耐热性的酶。特别地，本发明的具有果糖-C4-差向异构酶活性的多肽可以在30℃至70℃温度下表现出其最大活性的50％至100％、60％至100％、70％至100％或75％至100％的活性。更特别地，本发明的具有果糖-C4-差向异构酶活性的多肽可以在40℃至70℃、40℃至65℃、45℃、50℃、55℃或60℃的温度下表现出其最大活性的80％至100％或85％至100％。此外，具有果糖-C4-差向异构酶活性并且由SEQ ID NO：1的序列组成的多肽可以由SEQ ID NO：2的核苷酸序列编码，但不限于此。

特别地，本发明的具有果糖-C4-差向异构酶活性的多肽可以包含与SEQ ID NO：1具有至少85％相同性的氨基酸序列。作为另一个实例，具有果糖-C4-差向异构酶活性的多肽可以包括由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的多肽，或与SEQ ID NO：1具有至少70％、80％、90％、95％、97％或99％的同源性或相同性的多肽。另外，显而易见的是，具有包括一个或多个氨基酸的缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何多肽，也落入本发明的范围内，只要所述多肽具有保留同源性或相同性的氨基酸序列，以及与由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白相对应的功能(即果糖-C4-差向异构酶活性，通过在第4碳位置将果糖异构化以将果糖转化为塔格糖)。本发明的多肽还可以包括具有果糖-C4-差向异构酶活性，并由任何已知基因序列制备的探针编码的任何多肽，例如，在严格条件下与编码本发明的多肽的核苷酸序列全部或部分互补的核苷酸序列杂交的多核苷酸，而没有限制。所述组合物可以进一步包含至少一种具有果糖-C4-差向异构酶活性并且包含与SEQ ID NO：1具有至少85％相同性的氨基酸序列的多肽。

另外，即使在本文公开为“包含既定SEQ ID NO氨基酸序列的蛋白或多肽”、“由既定SEQ ID NO中列出的氨基酸序列组成的蛋白或多肽”或“具有既定SEQ ID NO中列出的氨基酸序列的蛋白或多肽”，但显而易见的是，具有包括一个或多个氨基酸的缺失、修饰、取代、保守取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白也可以用于本发明，只要所述蛋白具有与多肽相同或相似的活性，所述多肽具有本发明氨基酸序列。其实例可包括在氨基酸序列的N-末端和/或C-末端添加序列而不引起蛋白功能的改变、天然存在的突变体及其沉默突变或其保守取代。

术语“保守取代”是指一个氨基酸被具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代。这类氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。例如，带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

本发明的另一方面提供了一种微生物，其包含具有果糖-C4-差向异构酶活性的多肽、编码所述多肽的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体中的至少一种。

如本文所用，术语“多核苷酸”具有包括DNA或RNA分子的包容性含义，并且作为多核苷酸中的基本结构单元的核苷酸不仅可以包括天然核苷酸，还可以包括糖或碱被修饰的类似物(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980)；Uhlman and Peyman,Chemical Reviews,90:543-584(1990))。

多核苷酸可以是编码具有与本发明的SEQ ID NO：1具有至少85％相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，或编码具有果糖-C4-差向异构酶活性并且与本发明的多肽具有70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的多肽的多核苷酸。特别地，编码具有果糖-C4-差向异构酶活性并包含与SEQ ID NO：1具有至少85％相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸可以是具有与SEQ ID NO：2的核苷酸序列至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性或相同性的多核苷酸。

另外，显而易见的是，所述多核苷酸包括由于密码子简并性而翻译成包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列的蛋白或与其具有同源性或相同性的蛋白的任何多核苷酸。或者，所述多核苷酸可包括任何由已知基因序列制备的探针，例如，在严格条件下与编码蛋白的核苷酸序列全部或部分互补的序列杂交的多核苷酸序列，所述蛋白具有具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白的活性，但不限于此。术语“严格条件”是指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。这些条件在文献中有具体描述(例如，J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,2^nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold SpringHarbor,New York,1989；F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。例如，所述条件可以包括，具有高同源性或相同性的基因彼此杂交，例如，同源性或相同性为70％或更高、80％或更高、85％或更高、特别地，90％或更高，更特别地95％或更高，更特别地97％或更高，更特别地，99％或更高，而同源性或相同性的低于上述同源性或相同性的基因之间不进行杂交的条件；或者在Southern杂交的常规洗涤条件下，即在60℃、1×SSC和0.1％SDS，特别地，60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，以及更特别地，68℃、0.1×SSC和0.1％SDS的盐浓度和温度下，进行一次杂交，特别地，两次或三次杂交。

杂交需要两个多核苷酸具有互补序列，即使碱基之间可能错配，这取决于杂交的严格条件。术语“互补的”用于描述能够彼此杂交的核苷酸的碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明不仅可以包括基本上相似的多核苷酸序列，还可以包括与整个序列互补的分离的多核苷酸片段。

特别地，可以在杂交条件下检测具有同源性或相同性的多核苷酸，所述杂交条件包括上述条件下的T_m值为55℃的杂交步骤。另外，T_m值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且本领域技术人员可以根据其目的适当地调整。

用于杂交多核苷酸的严格条件的严格程度可以取决于多核苷酸的长度以及互补程度，并且参数是本领域众所周知的。

本文所用的术语“同源性”或“相同性”是指两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关性，并且可以表示为百分比。术语“同源性”和“相同性”通常可以互换使用。

保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或相同性可以通过标准比对算法来确定，并且可以与所使用的程序所建立的默认空位罚分一起使用。基本上，在中等或高度严格的条件下，同源或相同序列可以彼此杂交，所述杂交序列为序列全长的全部或至少约50％、60％、70％、80％或90％或更多。杂交还可以考虑简并密码子而非密码子的多核苷酸。

可以使用本领域已知的计算机算法，例如使用默认参数的“FASTA”程序(Pearsonet al(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA8:2444]，来确定两个多核苷酸或多肽序列的同源性、相似性或相同性。或者，也可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定同源性、相似性或相同性，其通过欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS)软件包(Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276-277)(5.0.0或更近的版本)的Needleman程序执行(包括GCG程序包(Devereux,J.,et al,Nucleic AcidsResearch 12:387(1984)),BLASTP,BLASTN,FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL,J MOLECBIOL 215]:403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,[ED.,]AcademicPress,San Diego,1994,and[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，同源性、相似性或相同性可以使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库的BLAST或ClustalW确定。

多核苷酸与多肽之间的同源性、相似性或相同性可以通过使用GAP计算机程序比对序列信息来确定，例如在Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中公开的Needleman et al.(1970),J Mol Biol.48:443引入的程序。简而言之，GAP程序将相似性定义为相似的比对符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短者的符号数值。GAP程序的默认参数可以包括：(1)一元比较矩阵(其包含的数值对于相同为1，对于不相同为0)，以及在Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)(或EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)替换矩阵)中描述的Gribskov等(Nucl.Acids Res.14:6745(1986))的加权比较矩阵；(2)每个空位罚分3.0，对于每个符号的每个空位另加0.10罚分(或空位开放罚分10和空位扩展罚分0.5)和(3)末端空位不罚分。因此，如本文所用，术语“同源性”或“相同性”是指序列之间的相关性。

可用于本发明的表达具有果糖-C4-差向异构酶活性的多肽的微生物可以是这样的微生物，其包括多肽、编码所述多肽的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体中的至少一种。

所述载体可以是与本发明的多核苷酸可操作地连接的形式。如本文所用，术语“可操作地连接”是指为执行一般功能，用于核苷酸表达的调节序列与编码目标蛋白的核苷酸序列的可操作的连接，并且可操作的连接可以影响所编码的核苷酸序列的表达。可以使用本领域已知的基因重组技术来制备与载体的可操作连接，并且可以使用本领域已知的限制酶、连接酶等进行位点特异性的DNA切割和连接。

如本文所用，术语“载体”是指用于将核苷酸序列克隆和/或转移至生物体(例如宿主细胞)中的任何介质。载体可为复制子，其能够使片段进行复制，所述片段与另一个DNA片段结合。如本文所用，术语“复制子”是指任意的遗传单位(例如质粒、噬菌体、粘粒、染色体和病毒)，其作为体内DNA复制的自复制单元起作用，即能够通过自调节进行复制。如本文所用，术语“载体”可以包括用于在体外、离体或体内将核苷酸引入生物体(例如宿主细胞)中的病毒和非病毒介质，并且还可包括微环DNA、转座子(如睡美人)(Izsvak et al.,J.MoI.Biol.302:93-102(2000))或人工染色体。常用的载体的实例可以包括天然或重组状态的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A可用作噬菌体载体或粘粒载体，基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL和pET等的载体可用作质粒载体。本发明使用的载体没有特别限制，并且可以使用任何已知的重组载体。另外，载体可以是进一步包含各种抗生素抗性基因的重组载体。如本文所用，术语“抗生素抗性基因”是指对抗生素具有抗性的基因，并且具有该基因的细胞可在经相应抗生素处理的环境中存活。因此，在大肠杆菌(E.coli)中大量生产质粒的过程中，将抗生素抗性基因有效地用作选择标记。在本发明中，抗生素抗性基因并非对本发明的核心技术(由载体的最佳组合实现的表达效率)产生较大影响的因素，因此可以无限制地将任何通常使用的抗生素抗性基因用作选择标记。例如，可以使用对氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素、链霉素或新霉素具有抗性的基因。

本发明的表达具有果糖-C4-差向异构酶活性的多肽的微生物可以使用将包含编码所述酶的多核苷酸的载体引入宿主细胞的方法制备。转化载体的方法可以包括任何能够将多核苷酸引入细胞的方法，并可以通过选择本领域已知的适当标准技术来进行。例如，可以使用电穿孔，磷酸钙共沉淀，逆转录病毒感染，显微注射，DEAE-葡聚糖法，阳离子脂质体法和热激方法，但不限于此。根据一个实施方案，本发明的表达具有果糖-C4-差向异构酶活性的多肽的微生物可以是包括果糖-C4-差向异构酶或编码所述酶的多核苷酸的微生物，所述果糖-C4-差向异构酶具有与SEQ ID NO：1具有至少85％的相同性的氨基酸序列。

转化的基因可以是以插入宿主细胞的染色体的形式或位于染色体外部的形式，只要所述基因在宿主细胞中表达即可。另外，所述基因包括DNA和RNA作为编码多肽的多核苷酸，并且任何可引入宿主细胞并在宿主细胞中表达的基因都可以不受限制地使用。例如，可以以表达盒的形式将基因引入宿主细胞，所述表达盒为包含自主表达所需的所有元件的多核苷酸构建体。通常，表达盒可以包括与基因可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的重组载体的形式。另外，可以将基因本身或多核苷酸构建体形式的基因引入宿主细胞中，并与在宿主细胞中表达所需的序列可操作地连接。

本发明的微生物可以包括任何原核和真核微生物，其可以包括本发明的多核苷酸或重组载体，并且能够产生本发明的果糖-C4-差向异构酶。微生物的实例可以包括但不限于属于埃希氏菌(Escherichia)属，欧文氏菌(Erwinia)属，沙雷氏菌(Serratia)属，普罗维登斯菌(Providencia)属，棒状杆菌(Corynebacteria)属和短杆菌(Brevibacteria)属的微生物菌株，特别是，大肠杆菌(E.coli)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

可以通过在培养基中培养本发明的微生物来制备本发明的微生物的培养物。微生物的培养物可以是具有果糖-C4-差向异构酶活性并包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽，在与外部底物接触的状态下，所述多肽由本发明的微生物表达，但不限于此。

如本文所用，术语“培养”是指微生物在适当调节的环境中生长。在本发明中，可以在本领域已知的合适的培养基和培养条件下进行培养过程。根据所选择的微生物菌株，进行调整后，本领域普通技术人员可以容易地使用所述培养。微生物的培养可以通过本领域已知的分批培养、连续培养或补料分批培养等连续进行，但培养过程不特别限定于此。特别地，至于培养条件，可使用合适的碱性化合物(例如氢氧化钠、氢氧化钾或氨水)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)，将pH调节到合适的pH(如pH 5至9，特别地，pH 7至9)。另外，在培养过程中可以使用例如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂来抑制泡沫的产生。此外，可以向培养物中引入氧气或含氧气体混合物，以维持培养物的有氧条件，也可以不引入其他气体，向微生物中引入氮气、氢气或二氧化碳气体，以维持培养物的厌氧或微需氧状态。培养温度可以维持在20℃至45℃，特别地，维持在25℃至40℃，但不限于此。另外，可以持续培养直至获得所需物质的所需产量，特别地，持续约0.5小时至160小时，但不限于此。另外，作为培养基中使用的碳源，可以单独或组合使用糖和碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油脂和脂肪(例如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如甘油和乙醇)和有机酸(例如乙酸)，但不限于此。作为培养基中使用的氮源，可以单独或组合使用含氮有机化合物(例如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等，但不限于此。作为培养基中使用的磷源，可以单独或组合使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、其相应的含钠盐等，但不限于此。另外，培养基中可以包含金属盐(例如硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸、维生素等必需的生长刺激物质。

本发明的用于制备塔格糖的组合物可以进一步包含果糖。

本发明的用于制备塔格糖的组合物可以包含多肽，其具有果糖-C4-差向异构酶活性并且直接将果糖转化为塔格糖；表达所述多肽的微生物；或所述微生物的培养物。使用具有果糖-C4-差向异构酶活性的多肽或其变体，可以以果糖作为底物来制备塔格糖。

本发明的用于制备塔格糖的组合物可以进一步包含任何合适的赋形剂，其通常在用于制备塔格糖的组合物中使用。赋形剂的实例可以是防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮液、缓冲溶液、稳定剂或等渗剂，但不限于此。

本发明的用于制备塔格糖的组合物可以进一步包含金属。根据本发明的一个实施方案，金属可以是具有二价阳离子的金属。根据本发明的一个实施例，金属可以是具有二价阳离子的金属。特别地，本发明的金属可以是镍(Ni)、镁(Mg)或锰(Mn)。更特别地，本发明的金属可以是金属离子或金属盐。更特别地，金属盐可以是MgSO₄、NiSO₄、NiCl₂、MgCl₂、MnCl₂或MnSO₄。

本发明另一方面提供了一种制备塔格糖的方法，其包括通过使所述组合物与果糖接触而将果糖转化为塔格糖。

根据一个实施方案，具有果糖-C4-差向异构酶的多肽可以包含与SEQ ID NO：1具有至少85％相同性的氨基酸序列。

根据一个实施例，本发明的接触可以在pH 5.0至9.0，30℃至80℃的温度下进行，和/或进行0.5小时至48小时。

特别地，本发明的接触可以在6.0至9.0或7.0至9.0的pH下进行。另外，本发明的接触可以在30℃至80℃、35℃至80℃、40℃至80℃、50℃至80℃、30℃至70℃、35℃至70℃、40℃至70℃、45℃至70℃、50℃至70℃、30℃至65℃、35℃至65℃、40℃至65℃、45℃至65℃、50℃至65℃、30℃至60℃、35℃至60℃、40℃至60℃、45℃至60℃、或50℃至60℃的温度下进行。另外，本发明的接触可以进行0.5小时至36小时、0.5小时至24小时、0.5小时至12小时、0.5小时至6小时、1小时至48小时、1小时至36小时、1小时至24小时、1小时至12小时、1小时至6小时、3小时至48小时、3小时至36小时、3小时至24小时、3小时至12小时、3小时至6小时、6小时至48小时、6小时至36小时、6小时至24小时、6小时至12小时、12小时至48小时、12小时至36小时、12小时至24小时、18小时至48小时、18小时至36小时、或18小时至30小时。

根据一个实施方案，本发明的接触可以在金属的存在下进行。可以使用的金属如上所述。

本发明的制备方法可以进一步包括分离和/或纯化制备的塔格糖。分离和/或纯化可以使用本领域通常使用的任何方法进行，例如但不限于，透析、沉淀、吸附、电泳、离子交换色谱和分级结晶。可以单独或组合使用这些方法来实施纯化。

另外，本发明的制备方法可以进一步包括在分离和/或纯化之前或之后，对制备的塔格糖脱色和/或脱盐。通过进行脱色和/或脱盐，可以获得质量更高的塔格糖。

根据另一实施方案，本发明的制备方法还可以包括在转化、分离和/或纯化、或脱色和/或脱盐之后使塔格糖结晶。塔格糖的结晶可以通过使用本领域中通常使用的任何结晶方法来进行。例如，可以通过冷却结晶使塔格糖结晶。

根据另一个实施方案，本发明的制备方法可进一步包括在结晶之前浓缩塔格糖。浓缩可以提高结晶效率。

根据另一个实施方案，本发明的制备方法可进一步包括在分离和/或纯化塔格糖之后，将未反应的果糖与本发明的酶、表达所述酶的微生物或所述微生物的培养物接触；在结晶之后，于分离和/或纯化中再使用已经从其中分离出晶体的溶液；或其任何组合。

本发明的另一方面提供了多肽用作果糖-C4-差向异构酶的的用途，所述多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少85％的同源性或相同性的氨基酸序列。

SEQ ID NO的氨基酸序列、同源性和相同性如上所述。

实施例

在下文中，将参考以下实施例和实验例更详细地描述本发明。然而，这些实施例和实验例仅用于示例性目的，并且本发明不意图被这些实施例和实验例所限制。

实施例1：包含假定蛋白基因的重组表达载体和转化的微生物的制备

为了发现新型的耐热果糖-C4-差向异构酶，从Litorilinea aerophile中获得了功能尚未被揭示的假定蛋白的基因信息，制备可在大肠杆菌(E.coli)中表达的载体和转化的微生物。

特别地，从登记在京都基因与基因组百科全书(KEGG)和美国国家生物技术信息中心(NCBI)的Litorilinea aerophile的基因序列中，选择假定蛋白的基因序列，基于微生物(韩国Bioneer公司)的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和核苷酸序列(SEQ ID NO：2)的信息，制备重组载体pBT7-C-His-CJ_LiA_F4E，其包含蛋白的核苷酸序列并且可在大肠杆菌中表达。

使用如上所述制备的重组载体，通过热激转化(Sambrook and Russell：Molecular cloning，2001)转化大肠杆菌BL21(DE3)，然后冷冻保存在50％的甘油中。转化菌株命名为大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_LiA_F4E。

实施例2：蛋白的制备和纯化

为了制备蛋白，将实施例1制备的转化菌株大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_LiA_F4E接种到包含补充有氨苄西林作为抗生素的LB液体培养基的培养管中，在37℃的震荡培养箱中进行种培养，直至600nm的吸光度达到2.0。将种培养获得的培养液接种在包含液体培养基的培养瓶中，所述液体培养基补充有LB和作为蛋白表达调节因子的乳糖，进行主培养。种培养和主培养在180rpm的搅拌速度和37℃下进行。随后，将培养液在8,000rpm和4℃下离心20分钟，并从中收集菌株。收集的菌株用50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)洗涤两次，并重悬于包含10mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH₂PO₄缓冲溶液(pH 8.0)中。用超声仪裂解重悬的菌株，并在13,000rpm和4℃下离心20分钟，并且从中获得上清液。通过His-tag亲和色谱法纯化上清液，并流过10倍填料量的含有20mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH₂PO₄缓冲液(pH8.0)，以除去其中的非特异性结合的蛋白。接下来，进一步流过包含20mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH₂PO₄缓冲溶液(pH 8.0)以洗脱和纯化产物，然后使用50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)进行透析，以获得纯化的酶CJ_LiA_F4E，用于分析酶的特性。

实施例3：假定蛋白的果糖-C4-差向异构酶活性的鉴定以及果糖转化为塔格糖的转化率

为了测量本发明实施例2制备的重组酶CJ_LiA_F4E是否具有果糖-C4-差向异构酶活性，将50mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM NiSO₄以及20mg/mL的CJ_LiA_F4E各添加到30重量％的果糖中，并且使混合物在55℃下反应10小时。

在反应终止后，通过高效液相色谱法(HPLC)对残留的果糖和产生的塔格糖进行定量分析。使用Shodex Sugar SP0810层析柱进行HPLC，柱温保持在80℃，以流速为1mL/min的水作为流动相(图1)。

实验结果证实，通过CJ_LiA_F4E，将果糖转化为塔格糖的转化率为7.24％。

因此，证实了本发明的CJ_LiA_F4E蛋白具有果糖-C4-差向异构酶活性，并且可以用于制备塔格糖。

实施例4：根据温度鉴定CJ_LiA_F4E的活性

为了研究温度对实施例2中制备的酶CJ_LiA_F4E的果糖-C4-差向异构酶活性的影响，将10mg/mL的CJ_LiA_F4E添加到补充有10重量％果糖的50mM Tris HCl缓冲溶液(pH8.0)中，并使混合物在不同的温度下反应，例如在45℃，50℃，55℃，60℃和65℃下反应10小时。反应终止后，通过HPLC对塔格糖进行定量分析。

实验结果证实，在55℃下，CJ_LiA_F4E具有最大活性，并且在所有温度范围内保持最大活性的60％或更高(图2)。

本发明的以上描述是出于示例性的目的，并且本领域技术人员将理解，在不改变本发明的技术概念和基本特征的情况下，可以进行各种改变和修改。因此，显然，在所有方面，上述实施例都是示例性的，并且不限制本发明。本文所公开的各种实施例不是为了限制，其真实范围和精神由以下权利要求书表明。本发明仅由所附权利要求的条款以及这些权利要求所享有的全部等同物范围来限制。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 新型果糖-4-差向异构酶及使用其制备塔格糖的方法

<130> OPA19114

<150> KR10-2018-0125279

<151> 2018-10-19

<160> 2

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 431

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Litorilinea aerophila

<400> 1

Met Tyr Pro Val Leu Glu Asn Ile Leu Arg Ala Gln Gln Gln Gly Glu

1 5 10 15

Ala Leu Gly Ile Pro Ser Ile Cys Ser Ala His Pro Phe Val Leu Glu

20 25 30

Ala Thr Phe Arg His Ala Leu Thr Thr Gly Arg Thr Val Leu Ile Glu

35 40 45

Ser Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln His Gly Gly Tyr Thr Gly Met Thr

50 55 60

Pro Gly Asp Phe Val Ala Tyr Val Ala Ala Leu Ala Asp Arg Leu His

65 70 75 80

Phe Pro Arg Glu Arg Ile Leu Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Asn

85 90 95

Pro Trp Arg Asp Arg Pro Ala Asp Gln Ala Leu Asn Gln Ala Arg Ile

100 105 110

Leu Val Gln Glu Tyr Val Arg Ala Gly Tyr Gly Lys Ile His Leu Asp

115 120 125

Ala Ser Met Ala Cys Gly Gly Asp Pro Ala Asp Ala Pro Leu Asp Lys

130 135 140

Ala Val Ala Ala Glu Arg Ala Ala Ala Leu Ala Glu Ala Ala Glu Ala

145 150 155 160

Ala Phe Gln Arg Met Gly Ser Gly Thr Pro Pro Cys Tyr Val Ile Gly

165 170 175

Thr Glu Val Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gln Gly Asp Asp Met Pro Leu

180 185 190

Ala Ile Thr Ala Pro Arg Glu Val Ala Glu Thr Ile Glu Leu Thr Gln

195 200 205

Ala Ala Phe Arg Arg Arg Gly Leu Glu Ala Ala Trp Glu Arg Val Ile

210 215 220

Ala Val Val Val Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Asp Glu Gln Val His

225 230 235 240

Pro Tyr Asp Arg Ala Ala Ala Ala Gly Leu Ala Arg Ala Ile Glu Pro

245 250 255

Tyr Gly Arg Leu Val Tyr Glu Ala His Ser Thr Asp Tyr Gln Thr Arg

260 265 270

Gln Ala Leu Arg Asp Leu Val Ala Asp His Phe Ala Ile Leu Lys Val

275 280 285

Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ala Phe Arg Glu Ala Val Phe Ala Leu Ala

290 295 300

Ala Val Glu Glu Glu Trp Leu Ala Gly Gln Ala Gly Val Val Leu Ser

305 310 315 320

Arg Leu Arg Glu Glu Leu Glu Ala Ala Met Ile Gln Asp Pro Thr His

325 330 335

Trp Arg Gly Tyr Tyr Arg Gly Asp Glu Arg His Gln Arg Leu Ala Arg

340 345 350

Arg Tyr Ser Tyr Ser Asp Arg Ala Arg Tyr Tyr Trp Pro Arg Pro Ser

355 360 365

Val Gln Ala Ala Leu Glu Arg Leu Leu His Asn Leu Glu Ala Ala Pro

370 375 380

Pro Pro Leu Thr Leu Leu Ser Gln Tyr Leu Pro Val Gln Tyr Trp Ser

385 390 395 400

Val Arg Glu Gly Leu Leu Glu Pro Thr Pro Arg Ser Leu Ile Val Asp

405 410 415

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420 425 430

<210> 2

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<212> DNA

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<220>

<223> Litorilinea aerophila

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atgtaccccg tcctggaaaa catcctgcgc gcccagcagc agggcgaagc cctgggcatc 60

ccgtccatct gctccgcgca cccttttgtg ctggaggcga ctttccgcca cgccctgacc 120

accggccgga ccgtgctcat tgaatccacc tgcaaccagg tgaaccagca cggcggatac 180

acgggcatga cgcccggtga ctttgtggcc tacgtggccg ccctggccga tcggctccac 240

tttccccgag aacgcatcct gttgggtggc gatcacctgg ggcccaaccc ctggcgggat 300

cgcccggcgg accaggccct gaaccaggcc cggatcctgg tccaggaata tgtacgggcc 360

ggctacggca agatccacct ggacgcgagc atggcctgtg gcggggatcc agccgacgcc 420

cccctggaca aagccgtggc ggccgagcgg gccgcagccc tggccgaggc agcggaagcc 480

gcgtttcaac ggatggggag tggaacgccc ccctgctacg tcatcggcac ggaggtgcca 540

cccccgggcg gcgcccaggg agacgacatg cccctggcca tcaccgcgcc ccgggaagtg 600

gccgagacca tcgagctgac ccaggcagcc ttccgccggc gcgggctgga agcagcctgg 660

gaacgggtca ttgcggtggt ggtgcagcca ggcgtggagt tcggcgacga gcaggtgcat 720

ccatatgacc gggctgcggc ggccggcctg gcccgggcca tcgagcccta cgggcggctg 780

gtgtacgagg cccactccac cgactaccag acccgccagg ccctgcggga tctggtggcg 840

gatcactttg ccatcctgaa ggtggggccg gccctcactt ttgcctttcg ggaggcggtc 900

tttgccctgg ctgcggtgga ggaggaatgg ctggccggcc aggcgggggt ggtcctgtcc 960

cggctgcggg aggagctgga ggcagccatg atccaggatc ccacccactg gcggggctat 1020

tatcgagggg atgagcggca tcaacgattg gctcgccgct acagctacag cgaccgggcc 1080

cgctactatt ggccacggcc gtccgtccag gcggcgctgg aacggctgct acacaacctg 1140

gaggccgccc cgccgcccct gaccctgctc agccaatacc tgcctgtgca gtactggagc 1200

gtccgcgaag ggctcctgga gccgacgccc cggtccctga tcgtggacaa aatcatccag 1260

gtgttgaatg actacacctg ggcctgtggg ggatga 1296

Claims

1.一种多肽，其具有果糖-C4-差向异构酶活性并且包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少85％同源性或相同性的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1所述的多肽的多核苷酸。

3.一种载体，其包含权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种微生物，其包含权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的载体。

5.一种用于制备塔格糖的组合物，其包含：

多肽，其具有果糖-C4-差向异构酶活性并且包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQID NO：1具有至少85％的同源性或相同性的氨基酸序列；

表达所述多肽的微生物，或所述微生物的培养物。

6.权利要求5所述的组合物，其进一步包含果糖。

7.权利要求5所述的组合物，其进一步包含金属的离子或盐。

8.权利要求7所述的组合物，其中

所述金属为选自以下的至少一种金属：镍(Ni)、镁(Mg)和锰(Mn)。

9.一种制备塔格糖的方法，其包括

通过使权利要求5-8中任一项所述的组合物与果糖接触，以将果糖转化为塔格糖。

10.权利要求9所述的方法，其中

所述接触在pH 7.0至9.0，在40℃至80℃的温度下，进行0.5小时至24小时。

11.具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少85％同源性或相同性的氨基酸序列的多肽用作果糖-C4-差向异构酶的用途。