JP2023554112A - 熱安定性に優れたアルロースエピマー化酵素変異体、その製造方法およびこれを用いたアルロースの製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素のアミノ酸配列のうち、特定の位置に存在するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された新規なアルロースエピマー化酵素変異体およびその多様な用途が提供される。本発明による新規なアルロースエピマー化酵素変異体は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素またはＤ－アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉに比べて果糖のアルロースへの転換活性が高く、特に６０℃以上の高温条件で熱安定性が非常に優れるため、アルロースの大量生産のための産業化レベルの酵素転換反応時の汚染を防止することができ、生産時間を短縮することができ、生産コストを節約することができる。
Description
本発明は、アルロースエピマー化酵素変異体などに関するものであって、より詳しくは、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素に比べて果糖のアルロースへの転換率および熱安定性が向上されたアルロースエピマー化酵素変異体およびこれより派生する多様な発明に関する。
Ｄ－アルロース（Ｄ－ａｌｌｕｌｏｓｅ）は、果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）の３番目の炭素のエピマー（ｅｐｉｍｅｒ）であって、Ｄ－プシコース（Ｄ－ｐｓｉｃｏｓｅ）とも呼ばれる。Ｄ－アルロース（Ｄ－ａｌｌｕｌｏｓｅ）は、砂糖と比較したとき、７０％の甘味度を有するが（Ｏｓｈｉｍａ ２００６）、エネルギーは０．３％しかないので、ダイエット食品の低カロリー甘味料として適用可能な機能性単糖類である（Ｍａｔｓｕｏ ｅｔ ａｌ．２００２）。また、Ｄ－アルロース（Ｄ－ａｌｌｕｌｏｓｅ）は、ブドウ糖の吸収および血糖を抑制する機能があるため、糖尿病患者用飲食品、痩身用飲食品などに応用することができ、肝臓における脂質合成に関与する酵素活性を阻害することで、腹部の脂肪蓄積を抑えることができるため、健康食品などの様々な機能性食品などに用いることができる（Ｍａｔｓｕｏ ｅｔ ａｌ．２００１；Ｉｉｄａ ｅｔ ａｌ．２００８；Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１０；Ｈｏｓｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１１）。
前記のような特徴により、アルロースは、砂糖の代替として良いソースであるが、自然界にごく稀に存在する単糖類である希少糖に属するため、食品産業に適用するためには、アルロースを効率的に生産する方法が必要である。従来のアルロースの生産方法としては、主に化学的な過程を経て生産された。ビリック（Ｂｉｌｉｋ）らは、モリブデン酸イオンの触媒作用を利用し、果糖をアルロースに転換する方法を提案した。マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）は、１，２：４，５－ジ－δ－イソプロピリデン－β－Ｄ－フラクトピラノース（１，２：４，５－ｄｉ－δ－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｆｒｕｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ）から３段階にわたる化学的な処理過程でアルロースを生産した。また、ドナー（Ｄｏｎｅｒ）は、エタノールとトリメチルアミンと共に果糖を加熱し、アルロースを生産した。しかし、これらの化学的な生産方法は、コストがかかるのに対し、その効率は低く、且つ、かなりの量の副産物が発生するという短所がある。
アルロースを生産する生物学的方法としては、微生物の細胞反応を利用してガラクチトール（ｇａｌａｃｔｉｔｏｌ）、Ｄ－タガトースまたはＤ－タリトールなどからアルロースを生産する方法が提案されている（Ｋｅｎ Ｉｚｕｍｏｒｉ）。しかし、この方法は、基質が希少糖に属するため、産業的生産に応用するのが難しい。産業化に最も効率的な方法は、Ｄ－ケトース３－エピマー化酵素群中で、果糖をアルロースに転換する酵素を見出す方法である。既存に発表された内容は、クロストリジウム・セルロリチクムＨ（１０）（Ｍｕ ｅｔ ａｌ．２０１１）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２００６）、シュードモナス・チコリ（Ｉｔｏｈ ａｔ ａｌ．１９９４）、リゾビウム・スペロイデス（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００９）に由来するＤ－タガトース３－エピマー化酵素を大腸菌に挿入し、形質転換させた後、形質転換された大腸菌で発現されたＤ－タガトース３－エピマー化酵素を用いて果糖からアルロースを生産した。
酵素を用いて果糖からアルロースを生産する技術に関連し、大韓民国登録特許公報第１０－０７４４４７９号には、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに由来するアルロースエピマー化酵素によるアルロースの生産方法が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－０８３２３３９号には、果糖をアルロースに転換する活性を有するシノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）ＹＢ－５８ ＫＣＴＣ １０９８３ＢＰと、これを用いて果糖をアルロースに転換する方法が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－１１０６２５３号には、果糖のアルロースへの転換を触媒する活性を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８のアルロース３－エピマー化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む大腸菌およびこれを用いて果糖からアルロースを生産する方法が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－１３３９４４３号には、リゾビウム属（ｇｅｎｕｓ Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）に属する微生物に由来するケトース３－エピメラーゼ（ｋｅｔｏｓｅ ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）およびそれを用いて果糖をアルロースに転換する方法が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－１３１８４２２号には、クロストリジウム・シンデンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃｉｎｄｅｎｓ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素およびこれを用いて果糖からアルロースを生産する方法が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－１４７３９１８号には、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素およびこれを用いて果糖からアルロースを生産する方法が開示されている。
しかし、微生物に由来する野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）のＤ－アルロース３－エピマー化酵素は、果糖のアルロースへの転換率が高くなく、熱安定性が低くて最適活性温度で失活する速度が速いため、産業化に適していない。したがって、微生物に由来する野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）のＤ－アルロース３－エピマー化酵素に比べて果糖のアルロースへの転換率または熱安定性が改善された新規なＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体の開発が必要である。Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素変異体に関連し、大韓民国公開特許公報第１０－２０１４－００２１９７４号には、遺伝子レベルで突然変異を誘導し、高い温度での速やかなアルロースへの転換速度と安定性を示すトレポネーマ・プリミティアＺＡＳ－１に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－１２０３８５６号には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に由来する野生型アルロースエピマー化酵素の変異により収得した熱安定性が向上したアルロースエピマー化酵素変異体が開示されている。また、大韓民国登録特許公報第１０－２２５４４１１号には、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素のアミノ酸配列のうち、２１６番目の位置に存在するアミノ酸残基であるグリシン（Ｇｌｙ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換された新規なアルロースエピマー化酵素変異体が開示されており、大韓民国公開特許公報第１０－２０２１－０１３２４０５号には、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素のアミノ酸配列のうち、２９番目の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）がリジン（Ｌｙｓ）に置換され、２１６番目の位置に存在するグリシン（Ｇｌｙ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換され、同時に２３４番目の位置に存在するメチオニン（Ｍｅｔ）がイソロイシン（Ｉｌｅ）に置換された新規なアルロースエピマー化酵素変異体が開示されている。
本発明は、従来の背景下で見出されたものであり、本発明の第一の目的は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素に比べて果糖のアルロースへの転換率および熱安定性が向上された新規なＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体を提供することにある。
本発明の第二の目的は、新規なＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体を製造する方法または新規なＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体を製造するために必要な様々な要素を提供することにある。
本発明の第三の目的は、果糖からアルロースを製造する方法または果糖からアルロースを製造するために必要な様々な要素を提供することにある。
本発明の出願人は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素のアミノ酸配列の２１６番目の位置に存在するアミノ酸残基であるグリシン（Ｇｌｙ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換された新規なアルロースエピマー化酵素変異体について特許出願をし、登録を受けており［大韓民国登録特許公報第１０－２２５４４１１号（２０２１．０５．１４）］、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素のアミノ酸配列のうち、２９番目の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）がリジン（Ｌｙｓ）に置換され、２１６番目の位置に存在するグリシン（Ｇｌｙ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換され、同時に２３４番目の位置に存在するメチオニン（Ｍｅｔ）がイソロイシン（Ｉｌｅ）に置換された新規なアルロースエピマー化酵素変異体について特許出願した［大韓民国公開特許公報第１０－２０２１－０１３２４０５号（２０２１．１１．０４）］。前記大韓民国登録特許公報第１０－２２５４４１１号および大韓民国公開特許公報第１０－２０２１－０１３２４０５号に開示されたアルロースエピマー化酵素変異体は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素に比べて熱安定性が改善されたが、６０℃以上の高温で果糖のアルロースへの転換反応を長時間進める場合、酵素活性が劣り、アルロースの大量生産のための産業化の観点で依然として改善される必要がある。本発明の発明者は、大韓民国公開特許公報第１０－２０２１－０１３２４０５号に開示されたアルロースエピマー化酵素変異体の果糖のアルロースへの転換率および熱安定性を向上させるために、タンパク質構造予測技術を活用し、転換率および熱安定性の向上に関連するものと予想されるアミノ酸残基位置の候補をさらに導き、このうちの特定の位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換させる場合にのみ果糖のアルロースへの転換率および熱安定性が向上されることを確認し、本発明を完成した。
前記第１の目的を解決するために、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体を提供する。
前記第二の目的を解決するために、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。また、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された組換え菌株を提供する。また、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された組換え菌株を培養し、アルロースエピマー化酵素変異体を発現させる段階；および前記アルロースエピマー化酵素変異体が発現された組換え菌株の破砕物からアルロースエピマー化酵素変異体を分離する段階を含むアルロースエピマー化酵素変異体の製造方法を提供する。
前記第三の目的を解決するために、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体を含むアルロース生産用組成物を提供する。また、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された組換え菌株、該組換え菌株の培養物または前記組換え菌株の破砕物を含むアルロース生産用組成物を提供する。また、本発明は、果糖を配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体または前記アルロースエピマー化酵素変異体を含む組成物と反応させる段階を含むアルロースの製造方法を提供する。また、本発明は、果糖を配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された組換え菌株、該組換え菌株の培養物、前記組換え菌株の破砕物またはそれらのいずれか１つ以上を含む組成物と反応させる段階を含むアルロースの製造方法を提供する。
本発明に係る新規なアルロースエピマー化酵素変異体は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素またはＤ－アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉに比べて果糖のアルロースへの転換活性が高く、特に６０℃以上の高温条件で熱安定性が非常に優れているため、アルロースの大量生産のための産業化レベルの酵素転換反応時の汚染を防止することができ、生産時間を短縮することができ、生産コストを節約することができる。
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明の一側面は、果糖をアルロースに転換させることができる新規なＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体（以下、「アルロースエピマー化酵素変異体」という）に関するものである。本発明の一例によるアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉは、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素のアミノ酸配列（配列番号１）のうち、２９番目の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）がリジン（Ｌｙｓ）に置換され、７７番目の位置に存在するアラニン（Ａｌｓ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換され、２１６番目の位置に存在するグリシン（Ｇｌｙ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換され、同時に２３４番目の位置に存在するメチオニン（Ｍｅｔ）がイソロイシン（Ｉｌｅ）に置換されたものである。本発明によるアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉは、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素またはその変異体であるＷ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉに比べて果糖のアルロースへの転換活性が高く、特に６０℃以上の高温条件で熱安定性が非常に優れている。前記Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉは、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素のアミノ酸配列（配列番号１）のうち、２９番目の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）がリシン（Ｌｙｓ）に置換され、２１６番目の位置に存在するグリシン（Ｇｌｙ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換され、同時に２３４番目の位置に存在するメチオニン（Ｍｅｔ）がイソロイシン（Ｉｌｅ）に置換されたものであって、配列番号３のアミノ酸配列からなり、大韓民国公開特許公報第１０－２０２１－０１３２４０５号において製造方法および特性が開示されている。前記アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉは、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素の変異体であるＷ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４１をコードするポリヌクレオチド（配列番号４の塩基配列からなる）を鋳型にし、所定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対にしてＰＣＲを行い、その後に増幅した変異体断片の対を鋳型にし、制限酵素認識部位の配列が導入されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、 オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）を行い、アルロースエピマー化酵素変異体のアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を発現ベクターに挿入し、組換え発現ベクターを作製した後、前記組換え発現ベクターで宿主菌株を形質転換させ、組換え菌株を製造した後、前記組換え菌株を培養して発現させる方法により得ることができる。また、前記Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素の変異体であるＷ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉをコードするポリヌクレオチド（配列番号４の塩基配列からなる）は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素をコードするポリヌクレオチド（配列番号２の塩基配列からなる）を鋳型にし、所定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対にしてＰＣＲを行い、その後、増幅した変異体断片の対を鋳型にし、制限酵素認識部位の配列が導入されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）を行うことにより作製することができる。本発明によるアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉは、配列番号５のアミノ酸配列からなるが、本発明によるアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉの均等範囲が必ずしもこれに限定されるものではない。例えば、本発明によるアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉの均等範囲は、果糖をアルロースに転換する活性および６０℃以上の高温で熱安定性が維持される限り、配列番号５のアミノ酸配列のうちの一部が、置換、挿入および／または欠失されたものであってもよい。前記アミノ酸の置換は、好ましくは、タンパク質の特性が変わらない保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）によって行われることが好ましい。また、前記アミノ酸の修飾は、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化などによって行われることができる。また、本発明によるアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉの均等範囲は、アミノ酸配列上の変異または修飾によって、熱、ｐＨなどに対する構造的な安定性が増加したり、果糖のアルロースへの転換に対する活性が増加したタンパク質を含むことができる。また、本発明によるアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉの均等範囲は、配列番号５のアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％、または９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
本発明の他の側面は、新規なアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉの製造方法または新規なアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉの製造に必要な様々な要素に関するものである。前記新規なアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉの製造に必要な様々な要素としては、ポリヌクレオチド、プライマー対、組換えベクター、組換え菌株などがある。
前記ポリヌクレオチドは、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドであり、好ましくは、配列番号９の塩基配列からなる。本発明にて使用される用語「ポリヌクレオチド」は、非修飾（ｎｏｎ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ）または修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）された全てのポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）を意味する。前記ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡまたはこれらのハイブリッド分子を含むが、これに限定されるものではない。また、前記アルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドの均等範囲は、配列番号９の塩基配列に対して実質的同一性を有する配列を含む。前記の実質的な同一性は、配列番号９の塩基配列と任意の他の配列を最大限に対応できるように整列し、その配列を解析し、前記の任意の他の配列が配列番号９の塩基配列と７０％以上、９０％以上、または９８％以上の配列相同性を有することを意味する。当該技術分野における通常の知識を有する技術者は、当該分野に公知された遺伝子組換え技術等を用いて、前記ポリヌクレオチドの塩基配列のうちの１つ以上またはそれ以上の塩基を置換、付加、または欠失させることによって、前記実質的相同性を有する範囲で同一活性を有するアルロースエピマー化酵素変異体を暗号化するポリヌクレオチドを製造することができることが容易に理解される。このような相同性の比較は、市販のコンピュータプログラムを用いて、２個以上の配列間の相同性を百分率（％）で計算することによって実行することができる。
また、前記プライマー対は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを合成するためのものであって、Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素の変異体であるＷ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉをコードするポリヌクレオチド（配列番号４の塩基配列からなる）をテンプレート（鋳型）として用いる場合、以下のような塩基配列を有する順方向プライマーと逆方向プライマーから構成される。
Ａ７７Ｓ
＊順方向プライマー塩基配列（５’→３’）
ＡＡＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧ
＊逆方向プライマー塩基配列（５’→３’）
ＧＡＴＣＧＴＣＧＣＴＧＣＴＣＡＧＧＴＣＧＴＡＴＴＴＧＧＣＣＴＣＣＡ
Ａ７７Ｓ
＊順方向プライマー塩基配列（５’→３’）
ＡＡＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧ
＊逆方向プライマー塩基配列（５’→３’）
ＧＡＴＣＧＴＣＧＣＴＧＣＴＣＡＧＧＴＣＧＴＡＴＴＴＧＧＣＣＴＣＣＡ
また、前記組換えベクターは、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを含む。前記組換えベクターは、アルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを 公知の標準的な方法を使って、クローニングベクターや発現ベクター内に挿入された形態で提供されることができる。本発明にて使用される用語「クローニングベクター」は、宿主細胞内にＤＮＡ断片を運び、それを再生産することができる物質として定義される。本発明におけるクローニングベクターは、ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）、転写終結配列（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、およびマルチクローニングサイト（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）をさらに含むことができる。このとき、前記マルチクローニングサイト（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）は、少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）制限酵素切断部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を含む。また、クローニングベクターは、プロモーターをさらに含むことができる。一例として、本発明におけるアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉをコードするポリヌクレオチドは、ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）および転写終結配列（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）に位置することができる。また、本発明にて使用される用語「発現ベクター」は、適切な宿主内でクローニングされたＤＮＡの転写と翻訳に必要なＤＮＡ配列として定義される。また、本発明にて使用される用語「発現ベクター」は、個体の細胞内に存在する場合、挿入物が発現されるように挿入物に作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子構築物を意味する。前記発現ベクターは、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて製造し精製することができる。前記発現ベクターの種類は、原核細胞および真核細胞の各種宿主細胞において所望する遺伝子を発現し、所望するタンパク質を生産する機能をする限り、特に限定されないが、強力な活性を示すプロモーターと強い発現力を保ちながら、自然状態と同様の形態の外来タンパク質を大量に生産することができるベクターが好ましい。発現ベクターは、少なくともプロモーター、開始コドン、所望するタンパク質をコードする遺伝子および終結コドンターミネーターが含まれていることが好ましい。その外に、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、追加の発現制御配列、所望する遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域、または複製可能単位などを適宜含むこともできる。「プロモーター」とは、転写を指示するのに十分な最小配列を意味する。また、前記プロモーターには、細胞型特異的または外部のシグナルまたは薬剤によって誘導される、調節可能なプロモーター依存性遺伝子を発現可能にするのに十分なプロモーター構成を含むことができ、このような構成は遺伝子の５’または３’部分に位置することができる。前記プロモーターには、保存的プロモーターおよび誘導的プロモーターの両方が含まれる。プロモーター配列は、原核生物、真核生物またはウイルスに由来することができる。本発明にて使用される用語「作動可能に連結された」は、単一ポリヌクレオチド上のポリヌクレオチド配列との関連性によって、ある機能が他のものによって調節されることを意味する。例えば、プロモーターがコーティング配列の発現を制御することができる場合（すなわち、コーティング配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、プロモーターはコーティング配列と連結されて作動するか、またはリボソーム結合部位が翻訳を促進させるようにする位置されていれば、リボソーム結合部位はコーティング配列に連結されて作動するものである。コーティング配列は、センス方向またはアンチセンス方向で制御配列に連結されて作動することができる。本発明による組換えベクターは、好ましくは発現ベクターである。
また、前記組換え菌株は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドによって形質転換されるか、または前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターによって形質転換されたものである。本発明にて使用される用語「組換え菌株」は、１つ以上の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれを有する発現ベクターが宿主細胞に導入され、形質転換された細胞を意味する。前記発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を製造するための方法としては、一過性トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注射、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、細胞融合、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム媒介トランスフェクション（ｌｉｐｏｓｅｍｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥデキストラン－媒介トランスフェクション（ＤＥＡＥ Ｄｅｘｔｒａｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ポリブレン－媒介トランスフェクション（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、電気注入法（ｅｌｅｃｔｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ＰＥＧなどの化学的処理方法、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）などを用いる方法、ヒートショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）方法などがあるが、これに限定されるものではない。本発明にて発現ベクターに形質転換することができる宿主細胞としては、原核細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞など当業界に公知されたものであれば、その種類が大きく制限されず、好ましくは、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主が通常用いられる。例えば、前記宿主細胞は、大腸菌であることができる。前記大腸菌としては、ＢＬ２１、ＪＭ１０９、Ｋ－１２、ＬＥ３９２、ＲＲ１、ＤＨ５α、またはＷ３１１０などであってもよいが、これらに限定されるものではない。この他にも、前記宿主細胞として、バチルス・サブチルス、バチルス・チュリンゲンシスのようなバチルス属菌株、コリネバクテリウム・グルタミカムのようなコリネ・バクテリア属菌株、サルモネラテイフィムリウムなどのサルモネラ属菌株、その他セラチア・マルセッセンスおよび多様なシュードモナス種などの腸内菌と菌株などからなる群から選択された菌株を用いても差し支えない。
また、前記アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉの製造方法は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドによって形質転換されるか、または前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターによって形質転換された組換え菌株を培養し、アルロースエピマー化酵素変異体を発現させる段階；および前記アルロースエピマー化酵素変異体が発現された組換え菌株の破砕物からプシコースエピマー化酵素を分離する段階を含む。宿主細胞によるタンパク質の発現は、ラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）、誘導因子であるＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－１－ｔｈｉｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）などを用いて発現を誘導することができ、誘導時間は、タンパク質の量が最大化となるように調節することができる。本発明におけるアルロースエピマー化酵素変異体は、組換え菌株の破砕物から回収することができる。タンパク質発現に使用された細胞は、凍結融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊、または細胞分解剤など、様々な物質的または化学的手段によって破壊されることができ、通常の生化学的分離技術によって分離または精製が可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｄｅｕｓｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）。例えば、宿主細胞によって発現されたタンパク質の分離または精製方法としては、電気泳動、遠心分離、ゲル濾過、沈殿、透析、クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫吸着親和性クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、ゲル浸透ＨＰＬＣ）、等電点電気泳動およびこれらの様々な変化または複合方法が含まれるが、これらに限定されない。一方、本発明における組換え菌株の破砕物からアルロースエピマー化酵素変異体を分離する段階は、好ましくは、ペプチドタグを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって行うことができる。前記ペプチドタグとしては、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＢＣＣＰ（ｂｉｏｔｉｎ ｃａｒｂｏｘｙｌ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｃ－ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはＭＢＰ（ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）などのように公知の様々なタグを用いることができ、このうち、Ｈｉｓタグであることが好ましい。Ｈｉｓタグ付きタンパク質は、Ｎｉ－ＮＴＡ（ニッケル－ニトリロトリアセテート）樹脂のカラム上に特異的にトラップされ、ＥＤＴＡまたはイミダゾールによって溶出されることができる。
本発明のもう一つの他の側面は、果糖からアルロースを製造する方法、または果糖からアルロースを製造するのに必要な様々な要素に関するものである。前記果糖からアルロースを製造するのに必要とされる様々な要素としては、アルロース生産用組成物がある。
前記アルロース生産用組成物の一例は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉを含む。また、前記アルロース生産用組成物の他の例は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドに形質転換されるか、または前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された組換え菌株、該組換え菌株の培養物または前記組換え菌株の破砕物を含む。このとき、前記アルロース生産用組成物は、好ましくはマンガンイオン、ニッケルイオンおよびコバルトイオンからなる群から選択される１種以上をさらに含むことができ、より好ましくは、マンガンイオンまたはニッケルイオンをさらに含むことができる。本発明による新規なアルロースエピマー化酵素変異体は、金属イオンにより活性化が調節される金属酵素（ｍｅｔａｌｌｏｅｎｚｙｍｅ）の特性を示し、前記酵素による反応をマンガンイオンまたはニッケルイオンのような特定の金属イオンの存在下で行うことにより、アルロースの生産収率を増加させることができる。
前記アルロース生産用組成物の一例は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉを含む。また、前記アルロース生産用組成物の他の例は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドに形質転換されるか、または前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された組換え菌株、該組換え菌株の培養物または前記組換え菌株の破砕物を含む。このとき、前記アルロース生産用組成物は、好ましくはマンガンイオン、ニッケルイオンおよびコバルトイオンからなる群から選択される１種以上をさらに含むことができ、より好ましくは、マンガンイオンまたはニッケルイオンをさらに含むことができる。本発明による新規なアルロースエピマー化酵素変異体は、金属イオンにより活性化が調節される金属酵素（ｍｅｔａｌｌｏｅｎｚｙｍｅ）の特性を示し、前記酵素による反応をマンガンイオンまたはニッケルイオンのような特定の金属イオンの存在下で行うことにより、アルロースの生産収率を増加させることができる。
また、前記果糖からアルロースを製造する方法の一例は、果糖を配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドによって形質転換されるか、または前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターによって形質転換された組換え菌株、該組換え菌株の培養物、前記組換え菌株の破砕物、またはこれらのうちのいずれか１つ以上を含む組成物と反応させる段階を含む。また、前記果糖からアルロースを製造する方法は、金属イオンを添加することをさらに含むことができ、金属イオンの種類は前述のとおりである。一例として、前記金属イオンは、基質である果糖に添加されてもよく、酵素変異体と果糖の混合物に添加されてもよい。また、他の例として、前記金属イオンは、酵素変異体が固定化された担体に添加されるか（果糖添加前）、前記酵素変異体が固定化された担体と果糖の混合物に添加されるか（果糖添加後）、または果糖添加時に果糖と混合物の形態で添加することができる。組換え菌株を用いる場合、前記金属イオンを培養物に添加してもよく、金属イオンを添加した培養培地で培養が行われてもよい。また、前記果糖からアルロースを製造する方法において、前記アルロースエピマー化酵素変異体または前記組換え菌株は、好ましくは、担体に固定化される。前記担体は、固定された酵素の活性が長期間維持され得る環境を造成することができるものであって、酵素固定化の用途で使用することができる公知のあらゆる担体から選択することができる。例えば、前記担体としてアルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ）を用いることができる。アルギン酸ナトリウムは、海藻類の細胞壁に豊富に存在する天然コロイド状の多糖類であって、マンヌロン酸（β－Ｄ－ｍａｎｎｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）とグルロン酸（α－Ｌ－ｇｕｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）が組成されており、含有量の面ではランダムにβ－１，４結合をなして形成されており、菌株または酵素を安定的に固定させることができ、アルロース収率の面で有利であることができる。一例として、アルロースの収率をより増進させるために、１．５～４．０％（ｗ／ｖ）濃度のアルギン酸ナトリウム溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム水溶液）、好ましくは約２．５％（ｗ／ｖ）濃度のアルギン酸ナトリウム溶液を組換え菌株の固定化に使用することができる。また、前記果糖からアルロースを製造する方法において、反応温度は６０～７０℃、好ましくは６０～６７℃、酵素変異体の安定性および最大活性を考慮したとき、より好ましくは６０～６５℃の範囲であり、反応ｐＨは６．５～８、好ましくは６．５～７．５、より好ましくは６．５～７の範囲である。また、前記果糖からアルロースを製造する方法において、果糖の濃度は特に制限されないが、生産性ないし経済性を考慮したとき、全反応物を基準として１～７５％（ｗ／ｗ）であることが好ましく、４～３５％（ｗ／ｗ）であることがより好ましい。また、前記果糖からアルロースを製造する方法におて使用される酵素変異体の濃度は、全反応物基準として０．００１～０．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１～０．２ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０２～０．１ｍｇ／ｍｌであってもよい。また、組換え菌株を用いて果糖からアルロースを製造する場合、前記組換え菌株の宿主菌株は、食品学的に安全な菌株であることが好ましい。前記食品学的に安全な菌株は、一般的に安全と認められるＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔｅｄ ａｓ ｓａｆｅ）級菌株を意味し、例えば、サッカロマイセス属菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、バチルス属菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、コリネバクテリウム属株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）などから選択することができる。前記菌株は、飼料、医薬品、食品などの分野で様々な用途を有する化学物質を生産する産業用微生物である。このような菌株は、遺伝子操作および大量培養に容易であったり、または多様なプロセス条件で高い安定性を有する菌株である。また、このような菌株は、他の細菌に比べて比較的硬い細胞膜構造を有しているため、高糖濃度等による浸透圧の影響下でも菌体が安定した状態で存在する生物学的特性を示す。前記ＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔｅｄ ａｓ ｓａｆｅ）級菌株の具体的な例としては、サッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などがある。
以下、本発明を実施例を通じてより具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明の技術的特徴を明確に例示するためのものに過ぎず、本発明の保護範囲を限定するものではない。
実施例１：Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素転換率および熱安定性を向上させるためのアミノ酸置換位置の追加探索
本発明の出願人は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素の果糖のアルロースへの転換率および熱安定性を向上させるために、野生型Ｄ－アルロース３－エピメラーゼのアミノ酸配列のうち、２９番目の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）がリジン（Ｌｙｓ）に置換され、２１６番目の位置に存在するグリシン（Ｇｌｙ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換され、同時に２３４番目の位置に存在するメチオニン（Ｍｅｔ）がイソロイシン（Ｉｌｅ）に置換された新規なＤ－アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉについて、以前に特許出願した［大韓民国公開特許公報第１０－２０２１－０１３２４０５号（２０２１．１１．０４）］。前記フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素は、配列番号１のアミノ酸配列からなり、野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素を暗号化するポリヌクレオチド断片は、配列番号２の塩基配列からなる。また、前記Ｄ－アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉは、配列番号３のアミノ酸配列からなり、Ｄ－アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片は、配列番号４の塩基配列からなる。
本発明の出願人は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素の果糖のアルロースへの転換率および熱安定性を向上させるために、野生型Ｄ－アルロース３－エピメラーゼのアミノ酸配列のうち、２９番目の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）がリジン（Ｌｙｓ）に置換され、２１６番目の位置に存在するグリシン（Ｇｌｙ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換され、同時に２３４番目の位置に存在するメチオニン（Ｍｅｔ）がイソロイシン（Ｉｌｅ）に置換された新規なＤ－アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉについて、以前に特許出願した［大韓民国公開特許公報第１０－２０２１－０１３２４０５号（２０２１．１１．０４）］。前記フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素は、配列番号１のアミノ酸配列からなり、野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素を暗号化するポリヌクレオチド断片は、配列番号２の塩基配列からなる。また、前記Ｄ－アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉは、配列番号３のアミノ酸配列からなり、Ｄ－アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片は、配列番号４の塩基配列からなる。
本発明の発明者等は、Ｄ－アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉの果糖のアルロースへの転換率および熱安定性を向上させるために、Ｄ－アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉのアミノ酸配列をベースとしてホモロジーモデリング手法を用いて、タンパク質構造を予測し、アミノ酸置換位置を探索した。前記ホモロジーモデリングは、Ｒｏｂｅｔｔａサーバーを用いて行われ、タンパク質構造予測および解析は、Ｃｏｏｔ、ＰｙＭｏｌ、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａのようなソフトウェアプログラムを用いて行われた。Ｄ－アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉの三次元構造モデルの解析により、化学結合が変化する時の転換率および熱安定性の向上に関連すると予想される計４個のアミノ酸残基の位置および前記位置に置換されるアミノ酸残基を選定した。
図１は、本発明の本発明者等がＤ－アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉの果糖のアルロースへの転換率および熱安定性を向上させるために、置換候補として選定した計４個のアミノ酸残基の位置を示すものである。図１における「Ａ７７」は、配列番号３のアミノ酸配列のうち、７７番目の位置に存在するアラニン（Ａｌｓ）を示し、「Ｅ１７３」は、配列番号３のアミノ酸配列のうち、１７３番目の位置に存在するグルタミン酸（Ｇｌｕ）を示し、「Ｗ２０９」は、配列番号３のアミノ酸配列のうち、２０９位の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）を示し、「Ｑ２４０」は、配列番号３のアミノ酸配列のうち、２４０位の位置に存在するグルタミン（Ｇｌｎ）を示す。
また、後述するように配列番号３のアミノ酸配列のうち、７７番目の位置に存在するアラニン（Ａｌｓ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換され、配列番号５のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉを作製し、配列番号３のアミノ酸配列のうち、１７３番目の位置に存在するグルタミン酸（Ｇｌｕ）をアラニン（Ａｌａ）に置換し、配列番号６のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｅ１７３Ａ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉを作製し、配列番号３のアミノ酸配列のうち、２０９位の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）をロイシン（Ｌｅｕ）に置換し、配列番号７のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｗ２０９Ｌ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉを作製し、配列番号３のアミノ酸配列のうち、２４０位の位置に存在するグルタミン（Ｇｌｎ）をアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置換し、配列番号８のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ／Ｑ２４０Ｄを作製した。
実施例２：フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体の過剰発現のための組換えベクターおよび組換え菌株の作製
Ｄ－アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉのポリヌクレオチド（配列番号４）に基づくオーバーラップ伸長ポリメラーゼチェーン鎖反応法（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いて、酵素変異体４種（Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｅ１７３Ａ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｗ２０９Ｌ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ／Ｑ２４０Ｄ）のアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を作製した。
Ｄ－アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉのポリヌクレオチド（配列番号４）に基づくオーバーラップ伸長ポリメラーゼチェーン鎖反応法（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いて、酵素変異体４種（Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｅ１７３Ａ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｗ２０９Ｌ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ／Ｑ２４０Ｄ）のアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を作製した。
まず、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するアルロースエピマー化酵素変異体をコードする遺伝子を作製するために、下記表１に示すプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。具体的には、１００μＭのデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）が添加された反応液に、表１のプライマーであるオリゴヌクレオチド１ｐＭ、テンプレート（鋳型）として用いられるＤ－アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉのポリヌクレオチド（配列番号４）１００ｎｇを混合し、Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＴＰ６００、ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．，ＪＡＰＡＮ）を用いて、ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｂｉｏｎｅｅｒ）１ユニットの存在下で２５～３０サイクルで反応を行った。
プライマーの組合せにより変異体断片を増幅した後、それぞれの対を鋳型にし、ＮｄｅＩとＸｈｏＩ制限酵素認識部位の配列が導入されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）により、最終的に酵素変異体４種（Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｅ１７３Ａ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｗ２０９Ｌ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ／Ｑ２４０Ｄ）のアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を作製した。以下の表２に制限酵素認識部位の配列を導入するために用いられたプライマーの塩基配列を示した。
配列番号９の塩基配列は、酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号１０の塩基配列は、酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｅ１７３Ａ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号１１の塩基配列は、酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｗ２０９Ｌ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号１２の塩基配列は、酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ／Ｑ２４０Ｄのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示す。配列番号９～１２の塩基配列は、酵素変異体のアミノ酸配列に直接対応する塩基配列から構成されており、便宜上、制限酵素認識部位の配列は省略した。
次いで、作製されたポリヌクレオチド断片を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩを用いて発現ベクターであるｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の同じ制限酵素部位に挿入し、組換え発現ベクター４種を作製した。また、ヒートショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．参照）を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組換え発現ベクターを導入させて形質転換し、組換え大腸菌４種を作製した。作製した組換え大腸菌に６０％グリセリン溶液を添加し、酵素発現のための培養を行う前に－７０℃で冷凍保存した。
実施例３：フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピメラーゼ変異体の発現および精製
下記表３の組成（培地１Ｌ基準）を有するタンパク質発現用培地１５０ｍｌが収容された１Ｌ容量のフラスコに実施例２で作製した組換え大腸菌１ｍｌを接種し、振とう培養器で３２℃の温度条件および１４０ｒｐｍの振とう条件を維持しながら２４時間培養した。培地に含まれた１％ラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）でアルロースエピマー化酵素変異体の過剰発現を誘導した。
下記表３の組成（培地１Ｌ基準）を有するタンパク質発現用培地１５０ｍｌが収容された１Ｌ容量のフラスコに実施例２で作製した組換え大腸菌１ｍｌを接種し、振とう培養器で３２℃の温度条件および１４０ｒｐｍの振とう条件を維持しながら２４時間培養した。培地に含まれた１％ラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）でアルロースエピマー化酵素変異体の過剰発現を誘導した。
次いで、過剰発現されたアルロースエピマー化酵素変異体を、以下のような方法により分離した。まず、組換え大腸菌の培養液を４１００×ｇおよび４℃の条件で約１５分間遠心分離し、上澄み液を除去し、組換え大腸菌の菌体を回収した。その後、回収された組換え大腸菌の菌体をｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ第１リン酸カリウム、３００ｍＭ塩化カリウム、５ｍＭイミダゾール含有）に懸濁させた後、超音波破砕機（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）で処理し、細胞を破砕した。次いで、細胞破砕液を１５，８１４×ｇおよび４℃の条件で約１０分間遠心分離し、細胞ペレットを除去し、上澄み液のみを回収した。その後、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－ｔａｇ）アフィニティークロマトグラフィーカラムおよび脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）カラムを用いて回収した上澄み液からアルロースエピマー化酵素変異体を含有した精製酵素液を分離した。
実施例４：Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素変異体の果糖のアルロースへの転換率および熱安定性の確認
本発明の出願人が以前特許出願したＤ－アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ［大韓民国公開特許公報第１０－２０２１－０１３２４０５号（２０２１．１１．０４）］および本発明にて新たに作製したＤ－アルロースエピマー化酵素変異体４種（Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｅ１７３Ａ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｗ２０９Ｌ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ／Ｑ２４０Ｄ）の果糖のアルロースの転換率および熱安定性を確認するために、酵素を高温に一定時間晒した後、果糖のアルロースへの転換活性が低下する程度を解析した。具体的には、大韓民国公開特許公報第１０－２０２１－０１３２４０５号（２０２１．１１．０４）の実施例３で得られたＷ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉの精製酵素液（酵素濃度０．３ｍｇ／ｍｌ）および本発明の実施例３で得られた精製酵素液（酵素濃度０．３ｍｇ／ｍｌ）を６２℃の恒温水槽で０ｈｒ、０．５ｈｒ、１ｈｒ、１．５ｈｒおよび２ｈｒ保管して熱処理した。その後、１０％（ｗ／ｗ）果糖および１ｍＭ硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４）の金属イオンが含まれた５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０）に熱処理された精製酵素液を酵素濃度が７５μｇ／ｍｌとなるように添加し、振とう恒温水槽（ＶＳ－１２０５ＳＷ１、ビジョン科学）を用いて、６２℃の温度条件および１２０ｒｐｍの振とう条件で１０分間反応させた。それから、反応生成液の温度を４℃まで下げて反応を停止させ、１６，６００×ｇおよび４℃の条件で遠心分離して上澄み液を回収した。その後、糖分析カラム（Ｂｅｎｓｏｎ、米国）が取り付けられた高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（ＳＰ９３０Ｄｐｕｍｐ、ヨンリン機器；ＭＩＤＡＳオートサンプラー、Ｓｐａｒｋ Ｈｏｌｌａｎｄ社製）および示差屈折率検出器（２４１４ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて、上澄み液中のアルロース濃度および果糖濃度を測定し、測定した結果から果糖のアルロースへの転換率を計算した後、転換率を酵素活性の指標として用いた。
本発明の出願人が以前特許出願したＤ－アルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ［大韓民国公開特許公報第１０－２０２１－０１３２４０５号（２０２１．１１．０４）］および本発明にて新たに作製したＤ－アルロースエピマー化酵素変異体４種（Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｅ１７３Ａ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｗ２０９Ｌ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ／Ｑ２４０Ｄ）の果糖のアルロースの転換率および熱安定性を確認するために、酵素を高温に一定時間晒した後、果糖のアルロースへの転換活性が低下する程度を解析した。具体的には、大韓民国公開特許公報第１０－２０２１－０１３２４０５号（２０２１．１１．０４）の実施例３で得られたＷ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉの精製酵素液（酵素濃度０．３ｍｇ／ｍｌ）および本発明の実施例３で得られた精製酵素液（酵素濃度０．３ｍｇ／ｍｌ）を６２℃の恒温水槽で０ｈｒ、０．５ｈｒ、１ｈｒ、１．５ｈｒおよび２ｈｒ保管して熱処理した。その後、１０％（ｗ／ｗ）果糖および１ｍＭ硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４）の金属イオンが含まれた５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０）に熱処理された精製酵素液を酵素濃度が７５μｇ／ｍｌとなるように添加し、振とう恒温水槽（ＶＳ－１２０５ＳＷ１、ビジョン科学）を用いて、６２℃の温度条件および１２０ｒｐｍの振とう条件で１０分間反応させた。それから、反応生成液の温度を４℃まで下げて反応を停止させ、１６，６００×ｇおよび４℃の条件で遠心分離して上澄み液を回収した。その後、糖分析カラム（Ｂｅｎｓｏｎ、米国）が取り付けられた高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（ＳＰ９３０Ｄｐｕｍｐ、ヨンリン機器；ＭＩＤＡＳオートサンプラー、Ｓｐａｒｋ Ｈｏｌｌａｎｄ社製）および示差屈折率検出器（２４１４ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて、上澄み液中のアルロース濃度および果糖濃度を測定し、測定した結果から果糖のアルロースへの転換率を計算した後、転換率を酵素活性の指標として用いた。
以下の表４において、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体を熱処理したとき、熱処理条件別、果糖のアルロースへの転換率を示した。
前記の表４に示すように、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉのアミノ酸配列に基づいて新たに作製されたフラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体のほとんどは、Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉよりも果糖のアルロースへの転換活性および熱安定性が低いことが示された。一方、Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ａ７７Ｓ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉは、熱処理時間にかかわらず、Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉと類似またはより高い果糖のアルロースへの転換活性を示し、特に顕著に向上された熱安定性を示した。
以上のように本発明を前記の実施例を通じて説明したが、本発明が必ずしもここに限定されるものではなく、本発明の範囲と思想を逸脱しない範囲内で多様な変形実施が可能であることは勿論である。したがって、本発明の保護範囲は、本発明に添付された特許請求の範囲に属するすべての実施形態を含むものと解釈されるべきである。
Claims (10)
- 配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体。
- 請求項１に記載のアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドは、配列番号９の塩基配列からなることを特徴とする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
- 請求項２に記載のポリヌクレオチド、請求項３に記載のポリヌクレオチド、または請求項４に記載の組換えベクターのいずれかによって形質転換された組換え菌株。
- 請求項５に記載の組換え菌株を培養し、アルロースエピマー化酵素変異体を発現させる工程；および
前記アルロースエピマー化酵素変異体が発現された組換え菌株の破砕物からアルロースエピマー化酵素変異体を分離する工程を含む、アルロースエピマー化酵素変異体の製造方法。 - 請求項１に記載のアルロースエピマー化酵素変異体を含む、アルロース生産用組成物。
- 請求項５に記載の組換え菌株、該組換え菌株の培養物または前記組換え菌株の破砕物を含む、アルロース生産用組成物。
- 果糖を請求項１に記載のアルロースエピマー化酵素変異体または前記アルロースエピマー化酵素変異体を含む組成物と反応させる工程を含む、アルロースの製造方法。
- 果糖を請求項５に記載の組換え菌株、該組換え菌株の培養物、前記組換え菌株の破砕物、またはそれらのうちのいずれか１つ以上を含む組成物と反応させる工程を含む、アルロースの製造方法。
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