CN116783300A - 新型l－鼠李糖异构酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能够在食品产业中使用的安全性高且高耐热性的L－鼠李糖异构酶、生产该L－鼠李糖异构酶的微生物以及醛糖或酮糖的制造方法。一种L－鼠李糖异构酶，其来自属于肠杆菌(Enterobacter)属的微生物，其中，由SDS－PAGE测定的亚基的分子质量为47kDa，具有下述(A)和(B)的底物特异性。(A)具有识别醛糖的C1的CHO基和C2的OH基并与其反应、将C1的CHO基转换成OH基、将C2的OH基转换成CO基、或识别酮糖的C1的OH基和C2的CO基并与其反应、将C1的OH基转换成CHO基、将C2的CO基转换成OH基的异构酶活性。(B)对L－鼠李糖、L－来苏糖、L－甘露糖、D－阿洛糖、D－核糖和L－塔罗糖具有反应性。

Description

新型L－鼠李糖异构酶
技术领域
本发明涉及新型的L－鼠李糖异构酶和其制造方法、生产其的微生物、编码该酶的DNA和包含该DNA的重组载体和转化宿主细胞、该酶的固定化酶和该L－鼠李糖异构酶的酮糖或醛糖的制造方法。
背景技术
稀少糖根据国际稀少糖学会的定义，为“自然界中仅微量存在的糖”，即自然界中存在量少的单糖。
碳原子数为4的单糖(丁糖)有4种醛糖、2种酮糖和3种糖醇。碳原子数为5的单糖(戊糖)有8种醛糖、4种酮糖和4种糖醇。碳原子数为6的单糖(己糖)全部为34种，醛糖有16种，酮糖有8种、糖醇有10种。关于碳原子数为7个的单糖(庚糖)的种类，碳原子数为7的七碳醛糖、七碳酮糖、庚糖醇分别存在32种、16种、16种。
其中，通常在自然界中大量存在的醛糖为D－葡萄糖、D－半乳糖、D－甘露糖、D－核糖、D－木糖、L－阿拉伯糖的6种，除此以外的D－阿洛糖等的醛糖被定义为稀少糖。即，作为醛糖中被视为稀少糖的糖，可以列举L－阿洛糖、L－古洛糖、L－葡萄糖、L－半乳糖、L－阿卓糖、L－艾杜糖、L－甘露糖、L－塔罗糖、D－塔罗糖、D－艾杜糖、D－阿卓糖、D－古洛糖、D－阿洛糖。作为酮糖，D－果糖在自然界中大量存在，相对于此，其他酮糖在自然界不是大量地存在，因此可以被称为稀少糖。作为酮糖中被视为稀少糖的糖，可举出D－阿卢糖、D－塔格糖、D－山梨糖、L－果糖、L－阿卢糖、L－塔格糖、L－山梨糖。
近来，确立了成为所有稀少糖生产的基本原料的D－阿卢糖(别名D－psicose)的大量生产技术，使得难以获得的稀少糖的生产成为可能。进而还想到通过酶反应，D－阿卢糖会成为生产D－阿洛糖等新的稀少糖的中心。
D－阿洛糖为仅3位碳的OH基方向与D－葡萄糖不同的异构体的醛糖，也已知是酮糖的D－阿卢糖的异构体的稀少糖单糖类。D－阿洛糖已知被使用在以其作为有效成分的用于治疗选自急性肾衰竭和尿毒症的肾疾病的医药组合物(专利文献1)、用于延迟因肌萎缩侧索硬化症引发的运动障碍或其症状恶化的医药品(专利文献2)、血压上升抑制剂(专利文献3)、以用于抑制血管新生为特征的制剂(专利文献4)、T淋巴细胞增殖抑制剂(专利文献5)、或在腹膜透析液中配合使用的腹膜劣化抑制剂(专利文献6)。最近，公开了有关于被肾细胞癌细胞摄入而发挥抗肿瘤效果(专利文献7)、显示对人尿路上皮癌细胞的强抗肿瘤效果(专利文献8)的发明。由于这样的特征，D－阿洛糖在医药领域作为新一代的核心原材料备受瞩目，继D－阿卢糖之后要求确立D－阿洛糖的大量生产技术。
作为使用微生物生产的酶来生产D－阿洛糖的方法，本发明的发明人开发了使用从施氏假单孢菌(Pseudomonas stutzeri)分离得到的L－鼠李糖异构酶(L－rhamnoseisomerase)来从阿卢糖生产阿洛糖的技术(非专利文献1)。L－鼠李糖异构酶是催化L－鼠李糖－L－鼠李树胶糖之间的可逆的异构化反应的酶，但已知来自P.stutzeri的L－鼠李糖异构酶不仅能够作用于L－鼠李糖－L－鼠李树胶糖之间，还能够作用于L－来苏糖－L－木酮糖之间、L－甘露糖－L－果糖之间、D－古洛糖－D－山梨糖之间、D－核糖－D－核酮糖之间、D－阿洛糖－D－阿卢糖之间，L－塔罗糖－L－塔格糖之间，具有广泛的底物特异性。利用该广泛的底物特异性，以从D－阿卢糖向D－阿洛糖的转换为中心，能够生产何森图(Izumoring)上的各种各样的醛糖和酮糖。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第5330976号公报
专利文献2：日本专利第5317055号公报
专利文献3：日本专利第5158779号公报
专利文献4：日本专利第4943839号公报
专利文献5：日本专利第4724824号公报
专利文献6：日本特开2009－269887号公报
专利文献7：国际公开第2020/189000号
专利文献8：国际公开第2020/195037号
非专利文献
非专利文献1：J.Ferment.Biоeng.(1997)Vol.84,p.319
发明内容
发明所要解决的问题
现在，伴随着大部分稀少糖生产成为可能，被发现了生理活性的稀少糖D－阿洛糖从实验室水平的大量生产向涉及产业化的市场规模的大量生产的转变成为本发明人等的新的课题。而且，为了实现高效大量地生产稀少糖，筛选具有高的耐热性活性和大范围的最佳pH的酶是课题，但还需要筛选不仅具有更高的反应最佳温度、耐热性、还不易引起稀少糖的碱异构化、在更靠酸性侧具有最佳pH的酶。
如上所述在现有的技术中，以纯的稀少糖D－阿卢糖为原料，使用公知的L－鼠李糖异构酶(EC 5.3.1.14)，生产稀少糖D－阿洛糖。L－鼠李糖异构酶是催化从L－鼠李糖向L－鼠李树胶糖的异构化反应的酶，也能够催化从L－鼠李树胶糖向L－鼠李糖的异构化。已知也作用于D－阿洛糖与D－阿卢糖之间的异构化。由于异构化酶根据显示最高活性的底物来命名，所以即使在被命名为L－鼠李糖异构酶的酶中，其底物特异性也是各种各样的。
另外，该公知的酶在生成D－阿洛糖时，也是会生成作为副产物的作为醛糖的D－阿卓糖(D－altrose)的酶，作为副产物的D－阿卓糖的存在成为D－阿洛糖纯化工序中D－阿洛糖的收率降低的原因。因此，大量生产时稀少糖D－阿洛糖的纯度也成为课题之一。
本发明的课题在于，提供一种新型的L－鼠李糖异构酶、具有该酶的微生物以及使用该酶的制造方法，该酶来自在制造食品时允许使用且被视为无毒性的微生物，具有耐热性高且在更靠酸性侧具有最佳pH、能够高收率地从D－阿卢糖向D－阿洛糖异构化。
用于解决问题的技术方案
本发明人等着眼于不仅在日本而且在欧洲和美国，均登载于作为食品允许使用的清单之中的被视为基本无毒性的菌种，为此采集各地的土壤，从其中分离微生物，持续探索具有L－鼠李糖异构酶活性的微生物。
其结果，在众多分离的菌株中发现了产生新型的L－鼠李糖异构酶的属于肠杆菌(Enterobacter)属的微生物。作为该肠杆菌属微生物的罗根肠杆菌(Enterobacterroggenkampii)能够产生耐热性高、且在更靠酸性侧具有最佳pH的新型的L－鼠李糖异构酶。
来自该微生物的新型的L－鼠李糖异构酶能够催化醛糖与对应的酮糖之间的异构化反应，具有醛糖－酮糖之间的异构酶活性，即具有识别醛糖的C1的CHO基和C2的OH基并与其反应、将C1的CHO基转换成OH基、将C2的OH基转换成CO基、或识别酮糖的C1的OH基和C2的CO基并与其反应、将C1的OH基转换成CHO基、将C2的CO基转换成OH基的异构酶活性。另外，在以D－阿卢糖为底物制造D－阿洛糖时，由于不生成作为副产物的D－阿卓糖，所以适于D－阿洛糖的制造。
即，本发明涉及下述(1)～(4)所记载的L－鼠李糖异构酶。
(1)一种L－鼠李糖异构酶，其来自属于肠杆菌(Enterobacter)属的微生物，其中，由SDS－PAGE测定的亚基的分子质量为47kDa，具有下述(A)和(B)的底物特异性。
(A)具有识别醛糖的C1的CHO基和C2的OH基并与其反应、将C1的CHO基转换成OH基、将C2的OH基转换成CO基、或识别酮糖的C1的OH基和C2的CO基并与其反应、将C1的OH基转换成CHO基、将C2的CO基转换成OH基的异构酶活性。
(B)对L－鼠李糖、L－来苏糖、L－甘露糖、D－阿洛糖、D－核糖和L－塔罗糖具有反应性。
(2)根据所述(1)所记载的L－鼠李糖异构酶，其中，具有下述(C)和(D)的理化学的性质。
(C)反应最佳pH为8。
(D)反应最佳温度为80℃。
(3)根据所述(1)或(2)所记载的L－鼠李糖异构酶，其中，属于肠杆菌属的微生物是罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)。
(4)属于肠杆菌属的微生物是在日本专利微生物保藏中心进行国际保藏，其保藏编号为NITE BP－03309的罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)NrT7－1。
另外，本发明涉及下述(5)所记载的蛋白质、下述(6)～(9)所记载的DNA、重组载体、或转化宿主细胞、或下述(10)所记载的微生物。
(5)以下的(a)或(b)所记载的蛋白质。
(a)一种蛋白质，其由序列编号1所示的氨基酸序列构成。
(b)一种蛋白质，其由与序列编号1所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列构成，具有下述(A)和(B)的L－鼠李糖异构酶活性。
(A)具有识别醛糖的C1的CHO基和C2的OH基并与其反应、将C1的CHO基转换成OH基、将C2的OH基转换成CO基、或识别酮糖的C1的OH基和C2的CO基并与其反应、将C1的OH基转换成CHO基、将C2的CO基转换成OH基的异构酶活性。
(B)对L－鼠李糖、L－来苏糖、L－甘露糖、D－阿洛糖、D－核糖和L－塔罗糖具有反应性。
(6)一种DNA，其编码所述(5)所记载的蛋白质。
(7)以下的(a)或(b)所记载的DNA。
(a)一种DNA，其由序列编号2所示的碱基序列构成。
(b)一种DNA，其由与序列编号2所示的碱基序列具有80％以上的同源性的碱基序列构成，且编码具有下述(A)和(B)的L－鼠李糖异构酶活性的蛋白质。
(A)具有识别醛糖的C1的CHO基和C2的OH基并与其反应、将C1的CHO基转换成OH基、将C2的OH基转换成CO基、或识别酮糖的C1的OH基和C2的CO基并与其反应、将C1的OH基转换成CHO基、将C2的CO基转换成OH基的异构酶活性。
(B)对L－鼠李糖、L－来苏糖、L－甘露糖、D－阿洛糖、D－核糖和L－塔罗糖具有反应性。
(8)一种重组载体，其含有所述(6)或(7)所记载的DNA。
(9)一种转化宿主细胞，其由所述(8)所记载的重组载体转化而得到。
(10)一种罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)NrT7－1，其产生所述(1)～(4)中任一项所记载的L－鼠李糖异构酶、且在日本专利微生物保藏中心进行国际保藏，其保藏编号为NITE BP－03309。
另外，本发明涉及下述(11)～(13)所记载的固定化蛋白质。
(11)一种固定化蛋白质，固定化有所述(1)～(4)中任一项所记载的L－鼠李糖异构酶、或所述(5)所记载的蛋白质。
(12)一种固定化蛋白质，将所述(1)～(4)中任一项所记载的L－鼠李糖异构酶以存在于菌体破碎物中的粗酶的状态、或将所述5所记载的蛋白质以存在于转化宿主细胞的、菌体破碎物中的粗蛋白质的状态固定化于载体。
(13)根据所述(11)或(12)所记载的固定化蛋白质，其中，所述载体是离子交换树脂或合成吸附剂。
另外，本发明涉及下述(14)～(16)所记载的L－鼠李糖异构酶的制造方法、或酮糖或醛糖的制造方法。
(14)一种L－鼠李糖异构酶的制造方法，在培养基中培养生产所述(1)～(4)中任一项所记载的L－鼠李糖异构酶的肠杆菌属微生物、或所述权利要求9所记载的转化宿主细胞，使该L－鼠李糖异构酶在微生物菌体中积累，并收集该L－鼠李糖异构酶。
(15)根据所述(14)所记载的L－鼠李糖异构酶的制造方法，其中，所述培养基是添加有L－鼠李糖的无机盐培养基。
(16)一种酮糖或醛糖的制造方法，其特征在于，使所述(1)～(4)中任一项所记载的L－鼠李糖异构酶、所述(5)所记载的蛋白质、或所述(11)～(13)中任一项所记载的固定化蛋白质与含有选自醛糖或酮糖中的1种以上的溶液发生作用，生成并收集该对应的酮糖或醛糖。
发明效果
本发明的L－鼠李糖异构酶的特征在于，与来自微生物的现有的L－鼠李糖异构酶相比，具有特别高的耐热性、且在更靠酸性侧具有最佳pH。
例如，来自现有的欧文氏菌(Erwinia billingiae)GuaL218－3的L－鼠李糖异构酶中，10分钟的反应中的最佳温度为70℃，来自球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)M30的L－鼠李糖异构酶为50℃，本发明的L－鼠李糖异构酶的最佳温度为80℃，更为优异。
另外，本发明的L－鼠李糖异构酶的10分钟的反应中的最佳pH为pH8.0(Tris－HCl缓冲液)，与来自GuaL218－3的L－鼠李糖异构酶的pH9.0(甘氨酸－NaOH缓冲液)、来自M30的L－鼠李糖异构酶的pH10.0(甘氨酸－NaOH缓冲液)相比时，在更靠酸性侧具有最佳pH，因此，不易引起碱异构化，有利于D－阿洛糖生产。
另外，在底物为D－阿卢糖的情况下，本发明的酶仅转换成D－阿洛糖，不生成作为副生成物的D－阿卓糖，因此，收率相应地变高。
附图说明
图1是表示本酶的SDS－PAGE的结果的图。
图2是表示本酶的最佳pH的图。
图3是表示本酶的24小时后的pH稳定性的图。
图4是表示本酶的最佳温度的图。
图5是表示本酶的保温10分钟(60℃)的温度稳定性的图。
图6是表示本酶的底物特异性的图。
图7是表示金属离子对本酶的影响的图。
图8是表示通过HPLC分析从使用了重组酶的D－阿卢糖向D－阿洛糖的异构化反应的结果的图。
图9是表示重组酶的最佳pH的图。
图10是表示重组酶的24小时后的pH稳定性的图。
图11是表示重组酶的最佳温度的图。
图12是表示重组酶的保温10分钟(60℃)的温度稳定性的图。
图13是表示重组酶的底物特异性的图。
图14是表示金属离子对重组酶的影响的图。
具体实施方式
本发明涉及能够从属于肠杆菌(Enterobacter)属的微生物分离的L－鼠李糖异构酶，在高的耐热性和更靠酸性侧的最佳pH上具有特征性的性质。
本发明的L－鼠李糖异构酶具有识别醛糖的C1的CHO基和C2的OH基并与其反应、将C1的CHO基转换成OH基、将C2的OH基转换成CO基而设为酮糖、或识别酮糖的C1的OH基和C2的CO基并与其反应、将C1的OH基转换成CHO基、将C2的CO基转换成OH基而设为醛糖的异构酶活性。
本发明中所说的酮糖是指具有酮糖结构的六碳糖的己酮糖或五碳糖的戊酮糖。己酮糖包括阿卢糖(别名阿洛酮糖、psicose)、山梨糖、塔格糖、果糖，戊酮糖包括核酮糖、木酮糖。
本发明中所说的醛糖是指具有醛糖结构的六碳糖的己醛糖或五碳糖的戊醛糖。己醛糖包括葡萄糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、半乳糖、甘露糖，戊醛糖包括核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖。D－或L－是指它们的D－体和L－体。
本发明的L－鼠李糖异构酶作用于L－鼠李糖、L－来苏糖、L－甘露糖、D－核糖、L－塔罗糖和D－阿洛糖，能够催化L－鼠李糖－L－鼠李树胶糖之间、L－来苏糖－L－木糖之间、L－甘露糖－L－果糖之间、D－核糖－D－核酮糖之间、L－塔罗糖－L－塔格糖之间以及D－阿洛糖－D－阿卢糖之间的转换，具有广泛的底物特异性。
本发明的L－鼠李糖异构酶能够通过培养属于肠杆菌(Enterobacter)属、且具有L－鼠李糖异构酶产生能力的微生物，从在培养液中生育的菌体中分离L－鼠李糖异构酶而制备。作为属于肠杆菌(Enterobacter)属的微生物，例如，能够有效利用罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)NrT7－1及它们的变异株等。在提出该申请时，NrT7－1株于2020年11月2日在位于日本千叶县木更津市上总镰足2－5－8的独立行政法人产品评价技术基盘机构日本专利微生物保藏中心进行国际保藏，作为收据编号NITEA BP－03309被接收，然后NrT7－1株在2020年11月30日以保藏编号NITE BP－03309正式基于布达佩斯公约被国际保藏。
就本发明的L－鼠李糖异构酶而言，将肠杆菌属的、L－鼠李糖异构酶生产菌在添加有L－鼠李糖的无机盐培养基进行通气培养后，通过离心分离将菌体从培养液回收。将回收到的菌体使用10mM Tris－HCl缓冲液(pH7.5)清洗后，悬浮在10mL的10m M Tris－HCl缓冲液(pH7.5)中，在冰水中冷却菌体悬浮液，同时利用超声波均质机进行细胞破碎。将这些破碎物离心分离，将其离心上清液作为粗酶液。
纯化前的粗酶液的L－鼠李糖异构酶的活性能够通过以D－阿卢糖为底物，测定D－阿洛糖的生成量来确认。
关于作为逆反应的从D－阿洛糖转变成D－阿卢糖的酶活性也以同样的条件进行测定。这些转变反应通常以如下条件进行。底物浓度为1～60％(w/v)，优选为约5～50％(w/v)，反应温度为40～90℃，优选为约60～90℃，反应pH为6～10，优选为约6～9，反应时间能够适当选择，但在批式反应的情况下，通常选择4～20小时的范围。
粗酶液能够依次通过阴离子交换色谱和疎水色谱、阴离子交换色谱进行纯化，并分离纯化酶。为了确认酶被纯化，进行SDS－PAGE(凝胶浓度12.5％)，确认得到单一条带和表观的分子质量。
上述那样被纯化的本发明的L－鼠李糖异构酶利用SDS－PAGE测定的亚基分子质量约为47kDa，其是活性化度受金属离子调节的金属酶。与底物的反应能够在选自锰、钴、镁、銀、鉄、銅、锌、镍、钙、铝和钠中的金属离子以浓度0.5～5mM的存在下进行。
本发明的L－鼠李糖异构酶具有规定的氨基酸序列，作为其例子，可以列举具有序列编号1所示的氨基酸序列的蛋白质、或具有与其同源的氨基酸序列且维持同等的L－鼠李糖异构酶活性的蛋白质。相同的氨基酸序列是指例如与序列编号1的氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为86、87、88、89、90、91、92、93或94％以上、进一步更优选为95％以上的氨基酸序列的同源性。
两个氨基酸序列或两个核酸序列(碱基序列)的同源性(％)例如能够通过以下程序确定。首先，以能够最好地比较两条序列的方式排列。此时，例如可以在第一序列导入空位，以便于与第二序列的比对。在第一序列的特定位置的分子(氨基酸残基或核苷酸)与第二序列的对应位置的分子相同时，可以说该位置的分子相同。两个序列的同源性是该两个序列共通的同一位置的数量的函数(即，同源性(％)＝同一位置的数/位置的总数×100)，优选也考虑比对的优化时所需要的空位的数量和大小。
另外，两个序列的比较和同源性的确定能够使用数学算法实现。作为序列的比较能够利用的数学算法的具体例，记载于Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264―68，在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873―77中有改良的算法，但并不限定于此。这样的算法被整合入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403―10中记载的NBLAST程序和XBLAST程序(版本2.0)中。为了得到与本发明的核酸分子等价的核苷酸序列，例如用NBLAST程序设为score(得分)＝100、wordlength(字长)＝12进行BLAST核苷酸检索即可。
本发明的DNA是具有本发明的L－鼠李糖异构酶活性的基因，具有规定的碱基序列。作为其例子，可举出编码序列编号1表示的氨基酸序列的DNA序列、具有序列编号2表示的碱基序列、或与序列编号2所示的碱基序列相同的碱基序列、且编码能够维持与序列编号1的蛋白质相等的L－鼠李糖异构酶活性的蛋白质的DNA序列。
相同的碱基序列例如是指与序列编号2的碱基序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为86、87、88、89、90、91、92、93或94％以上、进一步更优选为95％以上的碱基序列的同源性。
本发明的DNA能够组合公知的技术、例如杂交技术或PCR技术等进行分离。另外，通过部位特异性变异导入的碱基取代，能够制作L－鼠李糖异构酶变异体。部位特异性变异导入法能够通过例如反向PCR法或退火法等(村松等人编著、“修订第4版新基因工学手册”、羊土社、p.82－88)的任意方法进行。
本发明的DNA也能够插入能够自主复制的适当载体来制成重组载体。重组载体由DNA和能够自主复制的载体构成，只要能够获得DNA，就能够通过常规方法的重组DNA技术比较容易地制备。根据克隆或蛋白质的表达的使用目的或根据宿主细胞，可以选择适当的载体。作为这样的载体的例子，可以列举pBR322、pUC18、pUB110、pTZ4、pC194、pHV14、TRp7、YEp7、pBS7等的质粒载体或λgt·λC、λgt·λB、ρ11、等的噬菌体载体。
能够将这样得到的重组载体导入以大肠杆菌、枯草杆菌、放线菌、酵母为代表的适当的宿主细胞。导入方法能够使用磷酸钙共沉降法、电穿孔法、脂转染法、微注射法等公知的方法。为了取得转化的宿主细胞，适用菌落杂交法等。
本发明的L－鼠李糖异构酶、具有L－鼠李糖异构酶活性的蛋白质的制造方法没有特别限定，能够采用公知的方法。具体而言，本发明的L－鼠李糖异构酶能够通过从在营养培养基中培养转化了本发明的具有L－鼠李糖异构酶生产能力的微生物、或编码本发明的具有L－鼠李糖异构酶活性的蛋白质的DNA的宿主细胞得到的培养物中，采集具有L－鼠李糖异构酶活性的蛋白质来制造。培养方法可以使用公知的方法，例如液体培养和固体培养的任意一种都可以使用。
这样培养菌体后，将本发明的酶、蛋白质纯化、回收。酶、蛋白质的纯化、回收方法能够自由选择公知的方法来进行，例如在从培养液回收的情况下，例如能够通过将培养上清进行过滤、离心处理等，去除不溶物后，将利用超滤膜的浓缩、硫酸铵沉淀等的盐析、透析、离子交换树脂等各种色谱等适当组合，来进行分离、纯化。另外，在从菌体内回收的情况下，例如将菌体通过溶解酶处理、超声波处理等破碎后，同样地进行分离、纯化。
另外，本发明的L－鼠李糖异构酶与其它的异构酶同样，催化不需要辅酶的异构化反应，因此，可以利用固定化酶，通过各种固定化方法得到活性高的固定化酶。通过使用固定化酶，可以连续地进行大量的异构化反应，能够利用公知的固定化手段、例如载体结合法、交联法、凝胶包裹法、微胶囊化法等制成固定化酶，另外，载体也可以是公知的任意载体。
将本发明的L－鼠李糖异构酶固定化的方法的一个方式为使用粗酶液的固定化。通过将菌体悬液进行超声波处理得到的包含L－鼠李糖异构酶的粗酶液添加到离子交换树脂等中，在低温下进行结合，能够将L－鼠李糖异构酶固定化。
为了从菌体内取出L－鼠李糖异构酶，需要将菌体细胞壁破碎，有利用超声波处理或溶菌酶等的酶处理的破碎方法，其如上所述。可知在通过超声波处理得到的粗酶液中，含有大量具有活性的L－鼠李糖异构酶。作为从粗酶液将酶固定化的载持体，也能够使用作为固定化载持体公知的任意的载体，离子交换树脂、海藻酸钠、合成吸附剂等便利且经常被使用。
离子交换树脂中，例如作为碱性阴离子交换树脂，也可以使用强碱性阴离子交换树脂或弱碱性阴交换树脂的任意一种，例如，作为强碱性阴离子交换树脂，可以列举SA20A、PA418(三菱化学株式会社制)等，作为弱碱性阴离子交换树脂，可以列举WA30(三菱化学株式会社制)、FPA54、FPA95(Organo公司制)等，作为合成吸附剂，可以列举XAD7HP(Organo公司制)等。
在载持体中使用弱碱性阴离子交换树脂制造固定化酶的情况下，固定化的L－鼠李糖异构酶能够在其反应后容易地洗脱，因此能够非常简便地进行固定化酶的再生，生产效率高。
本发明的L－鼠李糖异构酶能够通过从用营养培养基培养本发明的具有L－鼠李糖异构酶生产能力的微生物、或转化了编码具有L－鼠李糖异构酶活性的蛋白质的DNA的宿主细胞得到的培养物中，收集具有L－鼠李糖异构酶活性的蛋白质来制造。培养方法可以使用公知的方法，例如可以使用液体培养和固体培养的任意一种。
将菌体用培养基培养后，纯化、回收本发明的L－鼠李糖异构酶。蛋白质的纯化、回收方法能够自由地选择公知的方法进行，例如在从培养液回收的情况下，例如能够通过过滤培养上清液、离心处理等，将不溶物除去后，将利用超滤膜的浓缩、硫酸铵沉淀等的盐析、透析、离子交换树脂等的各种色谱等适当组合进行分离、纯化。另外，在从菌体内回收的情况下，例如将菌体利用溶解酶处理、超声波处理等破碎后，同样地进行分离、纯化。
能够使用本发明的纯化后的L－鼠李糖异构酶或固定化后的该酶，使其作用于含有选自可成为底物的醛糖或酮糖中的1种以上的溶液，生成对应的酮糖或醛糖，从而制造酮糖或醛糖。本发明的L－鼠李糖异构酶对D－阿洛糖的底物特异性高，另外，与现有的L－鼠李糖异构酶相比，最佳温度高至80℃、且在更靠酸性侧具有最佳pH，因此，不易引起碱异构化，有利于D－阿洛糖生产。
实施例
以下，通过实验详细地说明本发明，但本发明不受以下实施例任何限定。
＜实验1：菌株的来源及鉴定＞
本发明的发明人将通过筛选分离的大量菌接种于添加有L－鼠李糖的液体培养基中进行振荡培养，以L－鼠李糖作为底物，测定L－鼠李树胶糖的生成量，由此测定L－鼠李糖异构酶的活性。
这样，作为活性最高的菌株，发现微生物NrT7－1株，NrT7－1株通过基于16SrRNA基因碱基序列同源性的系统解析，判明属于肠杆菌。
菌株的鉴定
(1)16SrRNA基因碱基序列同源性
分析16SrRNA基因的1－500bp区域，特定碱基数467bp。
(2)同源性检索
关于该菌株的16SrRNA基因的碱基序列，利用BLAST检索(日本DNA数据库)进行与被视为基准菌株的已知菌种的同源性检索。从与相对于上述特定的碱基数467bp的碱基序列、同源性为99.5％以上的菌株名的同源性(％)的值，确定NrT7－1株的微生物为罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)。
NrT7－1株在2020年11月2日、在独立行政法人产品评价技术基盘机构日本专利微生物保藏中心进行国际保藏，并作为保藏编号NITE BP－03309被国际保藏。
＜实验2：罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)NrT7－1(保藏编号NITEBP－03309)株的培养＞
向以L－鼠李糖1.0％为碳源且以硫酸铵为氮源的无机盐液体培养基中，无菌添加罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)NrT7－1(保藏编号NITE BP－03309)株的种培养液1％(v/v)，一边通气搅拌一边在30℃下培养24小时。
＜实验3：粗酶的制备＞
通过离心分离从NrT7－1株的培养液回收菌体。所回收的菌体分别使用10mM甘氨酸－NaOH缓冲液(pH9.0)进行清洗，接着，将菌体悬浮于10mL的甘氨酸－NaOH缓冲液(pH9.0)后，一边在冰水中冷却该菌体悬浮液，一边利用超声波均质机(日本艾默生株式会社)进行细胞破碎。将破碎物以12,000rpm离心20分钟，将其离心上清设为各自的粗酶。
＜实验4：酶的纯化＞
1.通过离子交换色谱、疎水色谱的纯化
通过离子色谱法对粗酶液进行纯化。使用的色谱柱是利用缓冲液(20mM Tris－HCl pH7.5)平衡化的HiTrapQ HP，使用AKTA系统以流速5mL/min、1M NaCl的浓度梯度0％至100％分成各5mL的组分进行分组。将检测出酶活性的组分回收，得到利用离子交换色谱分离的纯化酶。
2.将通过离子交换色谱分离纯化的酶进一步通过疏水色谱进行纯化。使用的色谱柱为HiTrap PHENYL，向酶液中以成为1M的方式添加硫酸铵使其溶解，以流速5mL/min将2M的硫酸铵的浓度从100％降低到0％进行洗脱，每5mL进行分组。将检测出酶活性的组分透析，去除硫酸铵，得到疏水色谱分离纯化酶。
3.将通过疎水色谱纯化的酶进一步通过阴离子交换色谱进行纯化。使用的色谱柱为Resource－Q，注入酶液后，以流速6mL/min、1M NaCl的浓度梯度0％至100％分成各6mL的组分进行分组。将检测出酶活性的组分回收，得到利用离子交换色谱分离的纯化酶。
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳
按照常规方法进行SDS－PAGE(凝胶浓度12.5％)，确认纯化酶的纯度。将结果在图1中示出。结果在约47kDa确认到单一条带(中央的泳道)，由此，确认到酶被纯净地纯化，判明纯化后的本酶的利用SDS-PAGE的亚基分子质量约为47kDa。
＜实验5：酶的理化学的性质的测定＞
关于作为纯化酶的L－鼠李糖异构酶活性的测定，进行下述的实验，进行酶反应。使用5mM L－鼠李糖作为底物，在各条件下进行10分钟的酶反应，反应后，向反应液中添加10％三氯乙酸溶液50μL，由此，停止反应，测定通过半胱氨酸咔唑硫酸法生成的L－鼠李树胶糖。
1.反应最佳pH
在测定时，利用5mM L－鼠李糖作为底物，使用各种缓冲液pH4～11在30℃反应10分钟，将生成的L－鼠李树胶糖利用半胱氨酸咔唑硫酸法进行测定，求出反应的最佳pH。
将反应条件在表1中示出。将使用的缓冲液在表2中示出。
[表1]
[表2]
将结果在图2中示出。本酶的反应最佳pH为8，在更靠酸性侧呈现比现有的酶高的活性。
2.pH稳定性
接着，使用表2的pH4～11的4个缓冲液，将在各缓冲液中以30℃保持24小时后的残留活性在图3中示出。本酶在pH6～10稳定。
3.反应最佳温度
通过Tris－HCl缓冲液将pH调整成8，在30－100℃的各种温度下进行反应，求得最佳温度。将反应条件在表3中示出，将结果在图4中示出。在各温度下确认本酶的酶活性，可知最佳温度为80℃。
[表3]
4.热稳定性
将通过表3所示的上述3.中求得最佳温度的反应条件(10分钟)、将本酶在各温度下保温10分钟后的残留活性在图5中示出。在保温10分钟后的温度稳定性中，本酶在60℃的相对活性的减少低于20％，可知是在高温下更稳定的酶。
5.L－鼠李糖异构酶的底物特异性
对于本酶对L－鼠李糖和5种醛糖(L－甘露糖、D－阿洛糖、L－塔罗糖、L－来苏糖、D－核糖、)的底物特异性进行了研究。酶反应组成与下述表5所示的反应条件相同，以各底物最终浓度5mM、金属盐的最终浓度成为1mM的方式添加氯化锰，在酶液(最终浓度50mMTris－HCl缓冲液pH8.0)中以60℃反应10分钟，通过HPLC的分析，测定从各个醛糖异构化的酮糖。
将L－鼠李糖的异构化活性设为100，将对于各个醛糖的活性作为相对活性表示。
将D－阿洛糖(D－allose)、L－甘露糖(L－Mannose)、L－塔罗糖(L－Talose)、L－来苏糖(L－Lyxose)、D－核糖(D－Ribose)设为底物，将活性作为相对活性，在表4和图6中示出。
[表4]
底物 相对活性(％)
L－鼠李糖 100
L－来苏糖 17.2
L－甘露糖 1.3
D－阿洛糖 1.1
D－核糖 0.7
L－塔罗糖 0.5
对于L－鼠李糖的活性最强，接着依次是L－来苏糖、L－甘露糖、D－阿洛糖、D－核糖、L－塔罗糖。本酶催化L－鼠李糖－L－鼠李树胶糖间、L－来苏糖－L－木酮糖间、L－甘露糖－L－果糖间、D－阿洛糖－D－阿卢糖间、D－核糖－D－核酮糖间，L－塔罗糖－L－塔格糖间、的异构化反应。
6.金属离子的影响
接着，以调查金属离子对本酶活性的影响为目的，将一部分酶透析，测定酶活性。透析通过将酶液加入纤维素膜、浸入包含20mM EDTA的Tris－HCl缓冲液(pH8.0)，将该缓冲液用16小时缓慢搅拌而进行，消除其它的金属离子的影响。将各种二价及三价金属离子或钠离子在最终浓度1mM的存在下(表5的反应条件下)反应后，通过半胱氨酸咔唑法这样得到的酶蛋白的酶活性。
其结果，MnCl2和CoCl2使本酶活性显著上升，本酶表示金属依赖性(图7)。
[表5]
(金属离子的影响确认时的反应条件)
＜实验6：编码酶的DNA的克隆及包含该DNA的重组载体和转化宿主细胞的制备＞
从罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)NrT7－1株克隆编码具有D－阿洛糖异构酶活性的蛋白质的DNA，进行能够自我复制的重组DNA的制作、编码酶的DNA的碱基序列的确定、及转化微生物的制备。
＜实验6－1：染色体DNA的全碱基序列的确定＞
本菌的具有D－阿洛糖异构酶活性的酶基因与现有的类似酶基因不同，不能使用PCR扩增的方法或现有的蛋白质数据库分离。因此，确定罗根肠杆菌(Enterobacterroggenkampii)NrT7－1株的全基因组序列，构建了该基因组中的编码全部ORF的蛋白质群的数据库。将罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)NrT7－1株培养菌体作为供试菌体，委托株式会社Macrogen Japan进行培养，委托进行使用PacBio－RSII/Sequel的新一代测序分析。
其结果，得到碱基数4,751,985bp和161,947bp的两个重叠群。该两个重叠群总计约为4.9Mb，全部重叠群均发生环状化而连在一起，因此，认为能够覆盖罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)NrT7－1株的全基因组序列。
＜实验6－2：蛋白质数据库的构建＞
基于得到的约4.9Mb的DNA序列，使用Prokka程序推测4,569个ORF，对各个ORF推测氨基酸序列。将该4,569个氨基酸序列作为罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)NrT7－1株的蛋白质数据库。
＜实验6－3：具有D－阿卢糖异构酶活性的蛋白质的鉴定＞
使用上述的蛋白质数据库，登录作为蛋白质鉴定系统的MASCOTserver(MatrixScience公司)，鉴定了观察到D－阿卢糖异构酶活性的蛋白质。试样样品使用前述“3.聚丙烯酰胺凝胶电泳”段中所述的SDS－PAGE的47kDa的条带，进行还原处理、烷基化处理后进行了胰蛋白酶消化的片段进行LC－MS/MS解析。
其结果，由于与在下述的由419氨基酸构成的序列1(序列表的序列编号1)的氨基酸序列中画下划线表示的氨基酸序列一致，作为整体观察到90％的同源性，因此，强烈表明由以序列编号1表示的氨基酸序列构成的蛋白质为罗根肠杆菌(Enterobacterroggenkampii)NrT7－1株的L－鼠李糖异构酶。
[序列1]
MTTQLEQAWDLAKQRFAAVGVDVEEALRQLDRLPVSMHCWQGDDVAGFENPGGSLTGGIQATGNYPGKARNATELRADLELTLSLIPGPKRLNLHAIYLESDEPVARNEIKPEHFKNWVEWAKANKLGLDFNPSCFSHPLSADGFT LAHADDEIRQFWIDHVKASRRVSAYFGEQLGTPSVMNIWIPDGMKDITVDRLAPRQRLLAALDEAISEKLDPAHHID AVESKLFGIGAESYTVGSNEFYMGYATSRQTALCLDAGHFHPTEVISDKISAAMLYVPRLLLHVSRPVRWDSDHVVL LDDETQAIASEIIRHDLFDRVHIGLDFFDASINRIAAWVIGTRNMKKALLRALLEPTAELKKLEANGDYTARLALLE EQKSLPWQAVWEMYCQRNDAPAGSQWLDNVRAYEEDVLSQRG
(序列1使用罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)NrT7－1株的蛋白质数据库鉴定的氨基酸序列。以下划线部表示的氨基酸序列是与通过LC－MS/MS解析得到的峰一致的氨基酸序列。)
＜实验6－4：具有D－阿卢糖异构酶活性的酶基因的分离＞
合成通过氨基酸序列鉴定的基因的序列2的DNA序列(序列表的序列编号2)，整合入pQE60载体(Qiagen公司)，转化表达用大肠杆菌。使用构建的大肠杆菌表达体系进行诱导酶的确认。使用该诱导到的重组酶，使60％(w/v)的D－阿卢糖与底物以30℃反应12小时，使用HPLC确认D－阿卢糖异构酶活性的结果，本重组酶催化从D－阿卢糖向D－阿洛糖的异构化反应，也未生成作为副生成物而担心的D－阿卓糖。将HPLC的分析结果在图8中示出。15.234分钟的峰表示D－阿洛糖，18.719分钟的峰表示D－阿卢糖。
[序列2]
ATGACCACTCAATTAGAACAAGCCTGGGACCTGGCTAAACAGCGTTTCGCCGCCGTCGGCGTGGATGTCGAAGAGGCCCTGCGCCAGCTCGACCGTCTGCCCGTCTCTATGCACTGCTGGCAGGGCGATGACGTCGCCGGTTTCGAGAACCCGGGCGGTTCCCTGACGGGTGGTATTCAGGCCACGGGTAATTATCCGGGCAAAGCGCGTAACGCGACCGAGCTGCGCGCCGATCTGGAGCTGACCCTGAGCCTGATCCCGGGGCCAAAGCGCCTGAACCTGCACGCGATTTACCTCGAGTCCGACGAGCCGGTGGCGCGCAACGAAATCAAACCGGAGCATTTTAAGAACTGGGTGGAGTGGGCAAAAGCCAATAAGCTGGGCCTGGATTTCAACCCATCCTGCTTCTCGCATCCGCTGAGCGCGGACGGTTTTACCCTCGCCCACGCGGACGATGAAATCCGTCAGTTCTGGATCGACCACGTGAAGGCCAGCCGCCGCGTGTCTGCGTACTTTGGCGAGCAGCTCGGCACACCGTCGGTGATGAACATCTGGATCCCGGACGGCATGAAGGACATCACCGTCGACCGTCTTGCTCCGCGCCAGCGCCTGCTGGCCGCGCTGGATGAGGCCATCAGCGAGAAGCTGGACCCGGCGCACCACATCGACGCCGTGGAGAGCAAGCTGTTCGGCATTGGCGCCGAGAGCTACACCGTCGGCTCGAACGAGTTCTACATGGGGTACGCCACCAGCCGCCAGACCGCGCTGTGCCTGGATGCCGGTCACTTCCATCCGACCGAGGTGATCTCCGACAAAATCTCCGCTGCCATGCTCTACGTGCCGCGCCTGCTGCTGCACGTCAGCCGTCCGGTGCGCTGGGACAGCGACCACGTAGTGCTGCTGGATGACGAAACCCAGGCGATTGCGAGCGAAATCATCCGCCACGACCTCTTTGACCGCGTCCACATCGGCCTCGACTTCTTCGATGCCTCCATCAACCGCATCGCGGCGTGGGTTATCGGCACCCGCAACATGAAGAAAGCCCTGCTGCGCGCCCTGCTGGAGCCGACTGCCGAACTGAAAAAGCTGGAAGCAAACGGTGACTACACCGCGCGTCTGGCGCTGCTGGAAGAGCAGAAATCTCTGCCGTGGCAGGCGGTGTGGGAGATGTACTGCCAGCGTAACGACGCCCCGGCGGGCAGCCAGTGGCTGGACAACGTGCGGGCGTATGAGGAAGACGTGTTGAGTCAGCGCGGGTAA
＜实验7：重组酶的理化学的性质的测定＞
在与实验5相同的条件下测定实验6中所获取的重组酶的理化学的性质。
1.反应最佳pH
在测定时，反应的最佳pH通过如下求得，使用5mM L－鼠李糖作为底物，使用各种缓冲液pH4～11以30℃反应10分钟，使用半胱氨酸咔唑硫酸法测定所生成的L－鼠李树胶糖。反应条件与表1相同，将使用的缓冲液在表6中示出。
[表6]
在图9中示出结果。重组酶的最佳pH为7.5～8.0。
2.pH稳定性
使用表6的pH4～11的4个缓冲液，将在各缓冲液中以30℃保持24小时之后的残留活性在图10中示出。重组酶在pH7.0～11.0下稳定。
3.反应最佳温度
通过Tris－HCl缓冲液将pH调整成7.5，以30－80℃的各种温度进行10分钟的反应，求得最佳温度。将结果在图11中示出。最佳温度为70℃。
4.热稳定性
将通过上述3.中求得最佳温度的反应条件将重组酶以各温度保温10分钟之后的残留活性在图12中示出。保温10分钟之后的温度稳定性高至60℃。
5.底物特异性
通过表5所示的酶反应组成，以各底物最终浓度成为5mM、金属盐的最终浓度成为1mM的方式添加氯化锰，在酶液(最终浓度50mM Tris－HCl缓冲液pH7.5)中以70℃反应10分钟，通过HPLC的分析测定从各个醛糖异构化的酮糖。将L－鼠李糖的异构化活性设为100，将相对于各个醛糖的活性作为相对活性在图13中示出。
对L－鼠李糖、L－来苏糖(L－Lyxose)、L－甘露糖(L－Mannose)D－核糖(D－Ribose)、D－阿洛糖(D－allose)呈现活性。
6.金属离子的影响
以调查金属离子对重组酶活性的影响为目的，将一部分酶透析，测定酶活性。透析通过将酶液加入纤维素膜、浸入包含20mM EDTA的Tris－HCl缓冲液(pH7.5)，将该缓冲液用16小时缓慢搅拌而进行，消除其它的金属离子的影响。将各种二价及三价金属离子或钠离子在最终浓度1mM的存在下反应后，通过半胱氨酸咔唑法测定这样得到的酶蛋白的酶活性。
将结果在图14中示出。通过添加CoCl2和MnCl2，活性增加。
＜实验8：与来自其它菌株的L－鼠李糖异构酶的比较(其1)＞
1.金属离子对酶反应的影响
关于使用得到的来自NrT7－1的重组粗酶进行D－阿卢糖和D－阿洛糖间的可逆性的异构化反应时的金属离子的影响，与来自Gual218－3的重组粗酶和来自AgM30的重组粗酶进行了比较。
将结果在表7中示出。在使用2mM的CoCl2和MnCl2作为金属离子时，能够确认到异构化反应。另外，与作为基准酶的来自AgM30的重组粗酶及来自Gual218－3的重组粗酶比较，来自NrT7－1的重组粗酶呈现高活性。
[表7]
＜实验9：培养本酶时的金属离子的影响＞
在使用了重组酶的反应时，添加2mM的CoCl2及MnCl2作为金属离子，由此，能够确认到高活性，因此，研究通过在培养时添加金属离子，即使在反应时不添加金属离子是否也能够反应。
使用在包含金属离子的培养基中培养而得到的粗酶，将D－阿卢糖与底物进行酶反应，结果如表8所示，在不添加金属离子以及添加MgCl2时几乎看不到活性。但是，在添加有CoCl2及MnCl2的培养基中培养而得到的粗酶中能够确认到活性，特别是在添加有MnCl2的培养基中培养而得到的粗酶呈现最高的活性，而且，以60℃热处理1小时时的残留活性也最高。
[表8]
＜实验10：与来自其它菌株的L－鼠李糖异构酶的比较(其2)＞
2.最佳温度和耐热性(T70/T50)
使用通过本研究得到的来自NrT7－1的重组粗酶和以前的专利中记载的来自Gual218－3的重组粗酶研究最佳温度。
其结果，来自NrT7－1的重组粗酶的最佳温度为70℃，比来自Gual218－3的重组粗酶的最佳温度(60℃)高。另外，就作为耐热性的指标的70℃的活性(T70)和50℃的活性(T50)之比(T70/T50)而言，来自NrT7－1的重组粗酶也比来自Gual218－3的重组粗酶高。
[表9]
产业上的可利用性
本发明的L－鼠李糖异构酶的特征在于，具有比来自微生物的现有的L－鼠李糖异构酶特高的耐热性。例如，现有的来自欧文氏菌(Erwinia billingiae)的L－鼠李糖异构酶的最佳温度为70℃，与之相对，本发明的酶适于在高至80℃的工业生产中使用。
另外，本发明的L－鼠李糖异构酶的最佳pH为pH8.0(Tris－HCl缓冲液)，当与来自GuaL218－3的L－鼠李糖异构酶的pH9.0(甘氨酸－NaOH缓冲液)相比时，在更靠酸性侧具有最佳pH，因此，不易引起碱异构化，有利于D－阿洛糖生产。
因此，本发明的L－鼠李糖异构酶和其制造方法的建立不仅在制糖产业、而且在与其相关的食品、化妆品、医药品产业上的工业意义也是极大的。
SEQUENCE LISTING
<110> 国立大学法人香川大学
<120> 新型L－鼠李糖异构酶
<130> PCT21771UK
<150> JP2020-189419
<151> 2020-11-30
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 419
<212> PRT
<213> 罗根肠杆菌（Enterobacter roggenkampii）
<400> 1
Met Thr Thr Gln Leu Glu Gln Ala Trp Asp Leu Ala Lys Gln Arg Phe
1 5 10 15
Ala Ala Val Gly Val Asp Val Glu Glu Ala Leu Arg Gln Leu Asp Arg
20 25 30
Leu Pro Val Ser Met His Cys Trp Gln Gly Asp Asp Val Ala Gly Phe
35 40 45
Glu Asn Pro Gly Gly Ser Leu Thr Gly Gly Ile Gln Ala Thr Gly Asn
50 55 60
Tyr Pro Gly Lys Ala Arg Asn Ala Thr Glu Leu Arg Ala Asp Leu Glu
65 70 75 80
Leu Thr Leu Ser Leu Ile Pro Gly Pro Lys Arg Leu Asn Leu His Ala
85 90 95
Ile Tyr Leu Glu Ser Asp Glu Pro Val Ala Arg Asn Glu Ile Lys Pro
100 105 110
Glu His Phe Lys Asn Trp Val Glu Trp Ala Lys Ala Asn Lys Leu Gly
115 120 125
Leu Asp Phe Asn Pro Ser Cys Phe Ser His Pro Leu Ser Ala Asp Gly
130 135 140
Phe Thr Leu Ala His Ala Asp Asp Glu Ile Arg Gln Phe Trp Ile Asp
145 150 155 160
His Val Lys Ala Ser Arg Arg Val Ser Ala Tyr Phe Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Thr Pro Ser Val Met Asn Ile Trp Ile Pro Asp Gly Met Lys Asp
180 185 190
Ile Thr Val Asp Arg Leu Ala Pro Arg Gln Arg Leu Leu Ala Ala Leu
195 200 205
Asp Glu Ala Ile Ser Glu Lys Leu Asp Pro Ala His His Ile Asp Ala
210 215 220
Val Glu Ser Lys Leu Phe Gly Ile Gly Ala Glu Ser Tyr Thr Val Gly
225 230 235 240
Ser Asn Glu Phe Tyr Met Gly Tyr Ala Thr Ser Arg Gln Thr Ala Leu
245 250 255
Cys Leu Asp Ala Gly His Phe His Pro Thr Glu Val Ile Ser Asp Lys
260 265 270
Ile Ser Ala Ala Met Leu Tyr Val Pro Arg Leu Leu Leu His Val Ser
275 280 285
Arg Pro Val Arg Trp Asp Ser Asp His Val Val Leu Leu Asp Asp Glu
290 295 300
Thr Gln Ala Ile Ala Ser Glu Ile Ile Arg His Asp Leu Phe Asp Arg
305 310 315 320
Val His Ile Gly Leu Asp Phe Phe Asp Ala Ser Ile Asn Arg Ile Ala
325 330 335
Ala Trp Val Ile Gly Thr Arg Asn Met Lys Lys Ala Leu Leu Arg Ala
340 345 350
Leu Leu Glu Pro Thr Ala Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ala Asn Gly Asp
355 360 365
Tyr Thr Ala Arg Leu Ala Leu Leu Glu Glu Gln Lys Ser Leu Pro Trp
370 375 380
Gln Ala Val Trp Glu Met Tyr Cys Gln Arg Asn Asp Ala Pro Ala Gly
385 390 395 400
Ser Gln Trp Leu Asp Asn Val Arg Ala Tyr Glu Glu Asp Val Leu Ser
405 410 415
Gln Arg Gly
<210> 2
<211> 1260
<212> DNA
<213> 罗根肠杆菌（Enterobacter roggenkampii）
<400> 2
atgaccactc aattagaaca agcctgggac ctggctaaac agcgtttcgc cgccgtcggc 60
gtggatgtcg aagaggccct gcgccagctc gaccgtctgc ccgtctctat gcactgctgg 120
cagggcgatg acgtcgccgg tttcgagaac ccgggcggtt ccctgacggg tggtattcag 180
gccacgggta attatccggg caaagcgcgt aacgcgaccg agctgcgcgc cgatctggag 240
ctgaccctga gcctgatccc ggggccaaag cgcctgaacc tgcacgcgat ttacctcgag 300
tccgacgagc cggtggcgcg caacgaaatc aaaccggagc attttaagaa ctgggtggag 360
tgggcaaaag ccaataagct gggcctggat ttcaacccat cctgcttctc gcatccgctg 420
agcgcggacg gttttaccct cgcccacgcg gacgatgaaa tccgtcagtt ctggatcgac 480
cacgtgaagg ccagccgccg cgtgtctgcg tactttggcg agcagctcgg cacaccgtcg 540
gtgatgaaca tctggatccc ggacggcatg aaggacatca ccgtcgaccg tcttgctccg 600
cgccagcgcc tgctggccgc gctggatgag gccatcagcg agaagctgga cccggcgcac 660
cacatcgacg ccgtggagag caagctgttc ggcattggcg ccgagagcta caccgtcggc 720
tcgaacgagt tctacatggg gtacgccacc agccgccaga ccgcgctgtg cctggatgcc 780
ggtcacttcc atccgaccga ggtgatctcc gacaaaatct ccgctgccat gctctacgtg 840
ccgcgcctgc tgctgcacgt cagccgtccg gtgcgctggg acagcgacca cgtagtgctg 900
ctggatgacg aaacccaggc gattgcgagc gaaatcatcc gccacgacct ctttgaccgc 960
gtccacatcg gcctcgactt cttcgatgcc tccatcaacc gcatcgcggc gtgggttatc 1020
ggcacccgca acatgaagaa agccctgctg cgcgccctgc tggagccgac tgccgaactg 1080
aaaaagctgg aagcaaacgg tgactacacc gcgcgtctgg cgctgctgga agagcagaaa 1140
tctctgccgt ggcaggcggt gtgggagatg tactgccagc gtaacgacgc cccggcgggc 1200
agccagtggc tggacaacgt gcgggcgtat gaggaagacg tgttgagtca gcgcgggtaa 1260
PCT/RO/134表

Claims (16)

1.一种L－鼠李糖异构酶，其中，
来自属于肠杆菌(Enterobacter)属的微生物，其由SDS－PAGE测定的亚基的分子质量为47kDa，具有下述(A)和(B)的底物特异性，
(A)具有识别醛糖的C1的CHO基和C2的OH基并与其反应、将C1的CHO基转换成OH基、将C2的OH基转换成CO基、或识别酮糖的C1的OH基和C2的CO基并与其反应、将C1的OH基转换成CHO基、将C2的CO基转换成OH基的异构酶活性，
(B)对L－鼠李糖、L－来苏糖、L－甘露糖、D－阿洛糖、D－核糖和L－塔罗糖具有反应性。
2.如权利要求1所述的L－鼠李糖异构酶，其中，
具有下述(C)和(D)的理化学的性质，
(C)反应最佳pH为8，
(D)反应最佳温度为80℃。
3.如权利要求1或2所述的L－鼠李糖异构酶，其中，
属于肠杆菌属的微生物是罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)。
4.如权利要求1～3中任一项所述的L－鼠李糖异构酶，其中，
属于肠杆菌属的微生物是在日本专利微生物保藏中心进行国际保藏，其保藏编号为NITE BP－03309的罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)NrT7－1。
5.一种以下的(a)或(b)所述的蛋白质，其中，
(a)一种蛋白质，其由序列编号1所示的氨基酸序列构成，
(b)一种蛋白质，其由与序列编号1所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列构成，具有下述(A)和(B)的L－鼠李糖异构酶活性，
(A)具有识别醛糖的C1的CHO基和C2的OH基并与其反应、将C1的CHO基转换成OH基、将C2的OH基转换成CO基、或识别酮糖的C1的OH基和C2的CO基并与其反应、将C1的OH基转换成CHO基、将C2的CO基转换成OH基的异构酶活性，
(B)对L－鼠李糖、L－来苏糖、L－甘露糖、D－阿洛糖、D－核糖和L－塔罗糖具有反应性。
6.一种DNA，其编码权利要求5所述的蛋白质。
7.一种以下的(a)或(b)所述的DNA，其特征在于，
(a)一种DNA，其由序列编号2所示的碱基序列构成，
(b)一种DNA，其由与序列编号2所示的碱基序列具有80％以上的同源性的碱基序列构成，且编码具有下述(A)和(B)的L－鼠李糖异构酶活性的蛋白质，
(A)具有识别醛糖的C1的CHO基和C2的OH基并与其反应、将C1的CHO基转换成OH基、将C2的OH基转换成CO基、或识别酮糖的C1的OH基和C2的CO基并与其反应、将C1的OH基转换成CHO基、将C2的CO基转换成OH基的异构酶活性，
(B)对L－鼠李糖、L－来苏糖、L－甘露糖、D－阿洛糖、D－核糖和L－塔罗糖具有反应性。
8.一种重组载体，其中，
含有权利要求6或7所述的DNA。
9.一种转化宿主细胞，其中，
由权利要求8所述的重组载体转化而得到。
10.一种罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)NrT7－1，其中，
其产生权利要求1～4中任一项所述的L－鼠李糖异构酶，且在日本专利微生物保藏中心进行国际保藏，其保藏编号为NITE BP－03309。
11.一种固定化蛋白质，其中，
固定化有权利要求1～4中任一项所述的L－鼠李糖异构酶或权利要求5所述的蛋白质。
12.一种固定化蛋白质，其中，
将权利要求1～4中任一项所述的L－鼠李糖异构酶以存在于菌体破碎物中的粗酶的状态、或将权利要求5所述的蛋白质以存在于转化宿主细胞的菌体破碎物中的粗蛋白质的状态固定化于载体。
13.如权利要求11或12所述的固定化蛋白质，其中，
所述载体是离子交换树脂或合成吸附剂。
14.一种L－鼠李糖异构酶的制造方法，其中，
在培养基中培养生产权利要求1～4中任一项所述的L－鼠李糖异构酶的肠杆菌属微生物、或权利要求9所述的转化宿主细胞，使该L－鼠李糖异构酶在微生物菌体中积累，并收集该L－鼠李糖异构酶。
15.如权利要求14所述的L－鼠李糖异构酶的制造方法，其中，
所述培养基是添加有L－鼠李糖的无机盐培养基。
16.一种酮糖或醛糖的制造方法，其特征在于，
使权利要求1～4中任一项所述的L－鼠李糖异构酶、权利要求5所述的蛋白质、或权利要求11～13中任一项所述的固定化蛋白质与含有选自醛糖或酮糖中的1种以上的溶液发生作用，生成并收集对应的酮糖或醛糖。
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