KR20230117115A - 신규 l-람노스 이소머라아제 - Google Patents
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Abstract
과제: 식품산업에서 사용할 수 있는 안전성이 높고, 또한 고내열성의 L-람노스 이소머라아제, 이것을 생산하는 미생물, 및 알도오스 또는 케토오스의 제조 방법의 제공.
해결 수단: 엔테로박터(Enterobacter)속에 속하는 미생물 유래의 L-람노스 이소머라아제로서, SDS-PAGE에 의해 측정한 서브유닛의 분자질량이 47kDa이고, 하기 (A) 및 (B)의 기질 특이성을 가지는 L-람노스 이소머라아제.
(A) 알도오스의 C1의 CHO기와 C2의 OH기를 인식하여 반응하고, C1의 CHO기를 OH기로, C2의 OH기를 CO기로 변환하거나, 혹은, 케토오스의 C1의 OH기와 C2의 CO기를 인식하여 반응하고, C1의 OH기를 CHO기로, C2의 CO기를 OH기로 변환하는 이소머라아제 활성을 가진다.
(B) L-람노스, L-릭소스, L-만노스, D-알로스, D-리보스, 및 L-탈로스에 대하여 반응성을 가진다.
해결 수단: 엔테로박터(Enterobacter)속에 속하는 미생물 유래의 L-람노스 이소머라아제로서, SDS-PAGE에 의해 측정한 서브유닛의 분자질량이 47kDa이고, 하기 (A) 및 (B)의 기질 특이성을 가지는 L-람노스 이소머라아제.
(A) 알도오스의 C1의 CHO기와 C2의 OH기를 인식하여 반응하고, C1의 CHO기를 OH기로, C2의 OH기를 CO기로 변환하거나, 혹은, 케토오스의 C1의 OH기와 C2의 CO기를 인식하여 반응하고, C1의 OH기를 CHO기로, C2의 CO기를 OH기로 변환하는 이소머라아제 활성을 가진다.
(B) L-람노스, L-릭소스, L-만노스, D-알로스, D-리보스, 및 L-탈로스에 대하여 반응성을 가진다.
Description
본 발명은, 신규한 L-람노스 이소머라아제와 그 제조 방법, 이것을 생산하는 미생물, 해당 효소를 코딩하는 DNA와 이것을 포함하는 재조합 벡터와 형질전환 숙주세포, 해당 효소의 고정화 효소, 및 해당 L-람노스 이소머라아제에 의한 케토오스 또는 알도오스의 제조 방법에 관한 것이다.
희소당이란, 국제 희소당 학회의 정의에 의하면, 「자연계에 드물게 존재하는 당」이며, 즉 자연계에서의 존재량이 적은 단당이다.
탄소수가 4개인 단당(테트로오스)은 알도오스 4종류, 케토오스 2종류 및 당알코올 3종류 있다. 탄소수가 5개인 단당(펜토오스)은, 알도오스 8종류, 케토오스 4종류 및 당알코올 4종류 있다. 탄소수가 6개인 단당(헥소오스)은 전부 34종류 있고, 알도오스가 16종류, 케토오스가 8종류, 당알코올이 10종류 있다. 탄소수가 7개인 단당(헵토오스)의 종류는, 탄소수 7의 알도헵토오스, 케토헵토오스, 헵티톨은 각각 32, 16, 16종류 존재한다.
이 중, 자연계에 다량으로 존재하는 알도오스는 D-글루코오스, D-갈락토오스, D-만노스, D-리보스, D-자일로스, L-아라비노오스의 6종류이며, 그 이외의 D-알로스 등의 알도오스는 희소당으로 정의된다. 즉, 알도오스 중 희소당으로 여겨지는 것으로서는, L-알로스, L-굴로스, L-글루코오스, L-갈락토오스, L-알트로스, L-이도스, L-만노스, L-탈로스, D-탈로스, D-이도스, D-알트로스, D-굴로스, D-알로스를 들 수 있다. 케토오스로서는, D-프룩토오스는 자연계에 다량으로 존재하는 데에 대하여, 다른 케토오스는, 자연계에 다량으로 존재하지 않으므로, 희소당이라고 할 수 있다. 케토오스 중 희소당으로 여겨지는 것으로서는, D-알룰로오스, D-타가토스, D-소르보스, L-프룩토오스, L-알룰로오스, L-타가토스, L-소르보스를 들 수 있다.
요즘, 모든 희소당 생산의 근간 원료가 되는 D-알룰로오스(별명 D-프시코오스)의 대량 생산 기술이 확립되고, 입수 곤란했던 희소당의 생산이 가능해졌다. 또한 효소 반응에 의해, D-알룰로오스는 D-알로스 등으로의 새로운 희소당 생산의 중심이 된다고 생각된다.
D-알로스는, D-글루코오스와 3위의 탄소의 OH기 방향만 상이한 이성체인 알도오스로서, 케토오스인 D-알룰로오스의 이성체로서도 알려지는 희소당 단당류다. D-알로스는, 그것을 유효 성분으로 하는, 급성 신부전 및 요독증으로부터 선택되는 신질환을 치료하기 위한 의약조성물(특허문헌 1), 근위축성 측삭경화증에 기인하는 운동 장애의 발증 또는 진행을 지연시키기 위한 의약품(특허문헌 2), 혈압 상승 억제제(특허문헌 3), 혈관신생의 억제에 이용하는 것을 특징으로 하는 제(劑)(특허문헌4), T림프구 증식 억제제(특허문헌 5), 또는 복막 투석액에 배합하여 사용되는 복막 열화 억제제(특허문헌 6)가 알려져 있다. 최근에서는, 신장세포 암세포에 받아들여진 항종양 효과(특허문헌 7), 인간 요로상피 암세포에 대한 강한 항종양 효과 (특허문헌 8)에 관한 발명이 공개되어 있다. 이와 같은 특징으로부터, D-알로스는 의약분야에서 차세대의 핵심적인 소재로서 주목을 받고 있고, D-알룰로오스의 다음은 D-알로스의 대량 생산 기술의 확립이 요구되고 있다.
미생물이 생산하는 효소를 이용하여 D-알로스를 생산하는 방법으로서, 본 발명자들은 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri)로부터 단리된 L-람노스 이소머라아제(L-rhamnose isomerase)를 이용하여 알룰로오스로부터 알로스를 생산하는 기술을 개발하였다(비특허문헌 1). L-람노스 이소머라아제는 L-람노스-L-람눌로스 사이의 가역적인 이성화 반응을 촉매하는 효소이지만, P.stutzeri 유래 L-람노스 이소머라아제는, L-람노스-L-람눌로스 사이뿐만 아니라, L-릭소스-L-자일룰로스 사이, L-만노스-L-프룩토오스 사이, D-굴로스-D-소르보스 사이, D-리보스-D-리불로오스 사이, D-알로스-D-알룰로오스 사이, L-탈로스-L-타가토스 사이에도 작용할 수 있는 폭넓은 기질 특이성이 밝혀졌다. 이 넓은 기질 특이성을 이용하여, D-알룰로오스로부터 D-알로스로의 변환을 중심으로, 이즈모링(Izumoring) 상의 다양한 희소 알도오스 및 케토오스의 생산이 가능하게 되었다.
J.Ferment. Bioeng.(1997) Vol. 84, p.319
오늘날, 대부분의 희소당 생산이 가능해져 온 것에 따라, 생리활성이 밝혀진 희소당 D-알로스의 실험실 레벨의 대량 생산으로부터 산업화로 연결되는 시장 규모의 대량 생산으로의 이동이 본 발명자들의 새로운 과제가 되었다. 그리고, 희소당 생산에서의 효율이 양호한 대량 생산을 가능하게 하기 위하여, 높은 열내성 활성과 광범위한 최적 pH를 가지는 효소를 선발하는 것이 과제였으나, 보다 높은 반응 최적 온도, 내열성뿐만 아니라, 희소당의 알칼리 이성화가 일어나기 어려운, 보다 산성측에 최적 pH를 가지는 효소를 선발하는 것이 더욱 필요하게 되어 왔다.
상기한 바와 같이 종래의 기술에서는, 순수한 희소당 D-알룰로오스를 원료로서, 공지의 L-람노스 이소머라아제(EC 5.3.1.14)를 이용하여 희소당 D-알로스를 생산하고 있다. L-람노스 이소머라아제는, L-람노스로부터 L-람눌로스로의 이성화 반응을 촉매하는 효소이며, L-람눌로스로부터 L-람노스로의 이성화도 촉매할 수 있다. D-알로스와 D-알룰로오스 사이의 이성화에도 작용하는 것이 이미 알려져 있다. 이성화 효소는 가장 높은 활성을 나타내는 기질을 기초로 명명되므로, L-람노스 이소머라아제로 명명된 효소 중에서도, 그 기질 특이성은 다양하다.
또한, 해당 공지의 효소에는 D-알로스 생성 시에, 알도오스인 D-알트로스(D-altrose)도 부산물로서 생성시키는 것이 있고, 부산물인 D-알트로스의 존재는, D-알로스 정제 공정에서의 D-알로스의 수율 저하의 원인이 되고 있었다. 그래서, 대량 생산에 의한 희소당 D-알로스의 순도도 과제의 하나가 되었다.
본 발명은, 식품을 제조할 때 사용이 인정되는 독성이 없다고 여겨지는 미생물 유래로서, 내열성이 높고 또한 보다 산성측에 최적 pH를 가지고, 고수율로 D-알룰로오스로부터 D-알로스로 이성화할 수 있는 신규한 L-람노스 이소머라아제의 제공과, 해당 효소를 가지는 미생물의 제공, 및 그 효소를 이용하는 제조 방법을 제공하는 것을 그 과제로 한다.
본 발명자들은, 일본뿐만 아니라 유럽 및 미국에 있어서도, 식품으로서 사용이 인정되고 있는 리스트에 실려 있는 독성이 거의 없다고 여겨지는 균종에 착안하여, 각지의 토양을 채취하고, 그로부터 미생물을 분리하고, L-람노스 이소머라아제 활성을 가지는 미생물의 탐색을 계속하였다.
그 결과, 수없이 단리한 균주 중에 신규한 L-람노스 이소머라아제를 산생하는 엔테로박터(Enterobacter)속에 속하는 미생물을 발견하였다. 이 엔테로박터속 미생물인 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii)는, 내열성이 높고, 또한 보다 산성측에 최적 pH를 가지는 신규한 L-람노스 이소머라아제를 산생한다.
이 미생물 유래의 신규한 L-람노스 이소머라아제는, 알도오스와 대응하는 케토오스 사이의 이성화 반응을 촉매하고, 알도오스의 C1의 CHO기와 C2의 OH기를 인식하여 반응하고, C1의 CHO기를 OH기로, C2의 OH기를 CO기로 변환하거나, 혹은, 케토오스의 C1의 OH기와 C2의 CO기를 인식하여 반응하고, C1의 OH기를 CHO기로, C2의 CO기를 OH기로 변환하는, 알도오스-케토오스 사이의 이소머라아제 활성을 가진다. 또한, D-알룰로오스를 기질로서 D-알로스를 제조할 때, 부생성물인 D-알트로스를 생성하지 않으므로, D-알로스의 제조에 적합하다.
즉, 본 발명은, 하기 (1) 내지 (4)에 기재된 L-람노스 이소머라아제에 관한 것이다.
(1) 엔테로박터(Enterobacter)속에 속하는 미생물 유래의 L-람노스 이소머라아제로서, SDS-PAGE로 측정한 서브유닛의 분자질량이 47kDa이며, 하기 (A) 및 (B)의 기질 특이성을 가지는 L-람노스 이소머라아제.
(A) 알도오스의 C1의 CHO기와 C2의 OH기를 인식하여 반응하고, C1의 CHO기를 OH기로, C2의 OH기를 CO기로 변환하거나, 혹은, 케토오스의 C1의 OH기와 C2의 CO기를 인식하여 반응하고, C1의 OH기를 CHO기로, C2의 CO기를 OH기로 변환하는 이소머라아제 활성을 가진다.
(B) L-람노스, L-릭소스, L-만노스, D-알로스, D-리보스, 및 L-탈로스에 대하여 반응성을 가진다.
(2) 하기 (C) 및 (D)의 이화학적 성질을 가지는, 상기 (1)에 기재된 L-람노스 이소머라아제.
(C) 반응 최적 pH는 8이다.
(D) 반응 최적 온도는 80℃이다.
(3) 엔테로박터속에 속하는 미생물이 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii)인, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 L-람노스 이소머라아제.
(4) 엔테로박터속에 속하는 미생물이 특허 미생물 기탁 센터에 수탁번호 NITE BP-03309로서 국제기탁되어 있는 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii) NrT7-1인, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 L-람노스 이소머라아제.
또한, 본 발명은, 하기 (5)에 기재된 단백질, 하기 (6) 내지 (9)에 기재된 DNA, 재조합 벡터, 또는 형질전환 숙주세포, 혹은 하기 (10)에 기재된 미생물에 관한 것이다.
(5) 이하의 (a) 또는 (b)에 기재된 단백질.
(a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
(b) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지고, 하기 (A) 및 (B)의 L-람노스 이소머라아제 활성을 가지는 단백질.
(A) 알도오스의 C1의 CHO기와 C2의 OH기를 인식하여 반응하고, C1의 CHO기를 OH기로, C2의 OH기를 CO기로 변환하거나, 혹은, 케토오스의 C1의 OH기와 C2의 CO기를 인식하여 반응하고, C1의 OH기를 CHO기로, C2의 CO기를 OH기로 변환하는 이소머라아제 활성을 가진다.
(B) L-람노스, L-릭소스, L-만노스, D-알로스, D-리보스, 및 L-탈로스에 대하여 반응성을 가진다.
(6) 상기 (5)에 기재된 단백질을 코딩하는 DNA.
(7) 이하의 (a) 또는 (b)에 기재된 DNA.
(a) 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지는 DNA.
(b) 서열번호 2로 표시되는 염기서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 염기서열로 이루어지고, 하기 (A) 및 (B)의 L-람노스 이소머라아제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.
(A) 알도오스의 C1의 CHO기와 C2의 OH기를 인식하여 반응하고, C1의 CHO기를 OH기로, C2의 OH기를 CO기로 변환하거나, 혹은, 케토오스의 C1의 OH기와 C2의 CO기를 인식하여 반응하고, C1의 OH기를 CHO기로, C2의 CO기를 OH기로 변환하는 이소머라아제 활성을 가진다.
(B) L-람노스, L-릭소스, L-만노스, D-알로스, D-리보스, 및 L-탈로스에 대하여 반응성을 가진다.
(8) 상기 (6) 또는 (7)에 기재된 DNA를 함유하는 재조합 벡터.
(9) 상기 (8)에 기재된 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환 숙주세포.
(10) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 L-람노스 이소머라아제를 생산하는, 특허 미생물 기탁 센터에 수탁번호 NITE BP-03309로서 국제기탁되어 있는 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii) NrT7-1.
또한, 본 발명은, 하기 (11) 내지 (13)에 기재된 고정화 단백질에 관한 것이다.
(11) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 L-람노스 이소머라아제, 또는 상기 (5)에 기재된 단백질이 담체에 고정화되어 있는, 고정화 단백질.
(12) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 L-람노스 이소머라아제가 균체 파쇄물 중에 존재하는 조효소(粗酵素)의 상태로, 또는 청구항 5에 기재된 단백질이 형질전환 숙주세포의, 균체 파쇄물 중에 존재하는 조단백질의 상태로 담체에 고정화되어 있는, 고정화 단백질.
(13) 상기 담체가, 이온 교환 수지 또는 합성 흡착제인 상기 (11) 또는 (12)에 기재된 고정화 단백질.
또한, 본 발명은, 하기 (14) 내지 (16)에 기재된 L-람노스 이소머라아제의 제조 방법, 또는 케토오스 또는 알도오스의 제조 방법에 관한 것이다.
(14) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 L-람노스 이소머라아제를 생산하는 엔테로박터속 미생물, 또는 청구항 9에 기재된 형질전환 숙주세포를 배지 중에서 배양하여, 미생물 균체 내에 해당 L-람노스 이소머라아제를 축적시키고, 이것을 채취하는 L-람노스 이소머라아제의 제조 방법.
(15) 상기 배지가 L-람노스를 첨가한 무기염 배지인, 상기 (14)에 기재된 L-
람노스 이소머라아제의 제조 방법.
(16) 알도오스 또는 케토오스로부터 선택되는 1종 이상을 함유하는 용액에, 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 L-람노스 이소머라아제, 상기 (5)에 기재된 단백질, 또는 상기 (11) 내지 (13) 중 어느 한 항 기재된 고정화 단백질을 작용시켜, 대응하는 케토오스 또는 알도오스를 생성하게 하고, 이것을 채취하는 것을 특징으로 하는 케토오스 또는 알도오스의 제조 방법.
본 발명의 L-람노스 이소머라아제는, 미생물 유래의 종래의 L-람노스 이소머라아제와 비교하여, 특히 높은 내열성을 가지고, 또한 보다 산성측에 최적 pH를 가지는 것이 특징이다.
예를 들면, 종래의 에르위니아 빌링기아에(Erwinia billingiae) GuaL218-3 유래의 L-람노스 이소머라아제는, 10분간의 반응에서의 최적 온도는 70℃이고, 아르트로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis) M30 유래의 L-람노스 이소머라아제는 50℃이며, 80℃인 본 발명의 L-람노스 이소머라아제의 최적 온도는 우수하다.
또한, 본 발명의 L-람노스 이소머라아제의 10분간의 반응에서의 최적 pH는, pH 8.0(Tris-HCl 완충액)이고, GuaL218-3 유래의 L-람노스 이소머라아제의 pH 9.0(Glycine-NaOH 완충액), M30 유래의 L-람노스 이소머라아제의 pH 10.0(Glycine-NaOH 완충액)과 비교하면, 보다 산성측에 최적 pH를 가지므로, 알칼리 이성화가 일어나기 어려워 D-알로스 생산에 유리하다.
또한, 기질이 D-알룰로오스인 경우, 본 발명의 효소는 D-알로스로만 변환하고, 부생성물인 D-알트로스를 생성하지 않으므로, 수율이 그만큼 높아진다.
[도 1] 본 효소의 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 도면이다.
[도 2] 본 효소의 최적 pH를 나타내는 도면이다.
[도 3] 본 효소의 24시간 후에서의 pH 안정성을 나타내는 도면이다.
[도 4] 본 효소의 최적 온도를 나타내는 도면이다.
[도 5] 본 효소의 10분 보온(60℃)에서의 온도 안정성을 나타내는 도면이다.
[도 6] 본 효소의 기질 특이성을 나타내는 도면이다.
[도 7] 본 효소로의 금속 이온의 영향을 나타내는 도면이다.
[도 8] 재조합 효소를 이용한 D-알룰로오스로부터 D-알로스로의 이성화 반응을 HPLC에 의해 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 9] 재조합 효소의 최적 pH를 나타내는 도면이다.
[도 10] 재조합 효소의 24시간 후에서의 pH 안정성을 나타내는 도면이다.
[도 11] 재조합 효소의 최적 온도를 나타내는 도면이다.
[도 12] 재조합 효소의 10분 보온(60℃)에서의 온도 안정성을 나타내는 도면이다.
[도 13] 재조합 효소의 기질 특이성을 나타내는 도면이다.
[도 14] 재조합 효소로의 금속 이온의 영향을 나타내는 도면이다.
[도 2] 본 효소의 최적 pH를 나타내는 도면이다.
[도 3] 본 효소의 24시간 후에서의 pH 안정성을 나타내는 도면이다.
[도 4] 본 효소의 최적 온도를 나타내는 도면이다.
[도 5] 본 효소의 10분 보온(60℃)에서의 온도 안정성을 나타내는 도면이다.
[도 6] 본 효소의 기질 특이성을 나타내는 도면이다.
[도 7] 본 효소로의 금속 이온의 영향을 나타내는 도면이다.
[도 8] 재조합 효소를 이용한 D-알룰로오스로부터 D-알로스로의 이성화 반응을 HPLC에 의해 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 9] 재조합 효소의 최적 pH를 나타내는 도면이다.
[도 10] 재조합 효소의 24시간 후에서의 pH 안정성을 나타내는 도면이다.
[도 11] 재조합 효소의 최적 온도를 나타내는 도면이다.
[도 12] 재조합 효소의 10분 보온(60℃)에서의 온도 안정성을 나타내는 도면이다.
[도 13] 재조합 효소의 기질 특이성을 나타내는 도면이다.
[도 14] 재조합 효소로의 금속 이온의 영향을 나타내는 도면이다.
본 발명은, 엔테로박터(Enterobacter)속에 속하는 미생물로부터 단리할 수 는 L-람노스 이소머라아제에 관한 것이며, 높은 내열성과, 보다 산성측의 최적 pH에 있어서 특징적인 성질을 가진다.
본 발명의 L-람노스 이소머라아제는, 알도오스의 C1의 CHO기와 C2의 OH기를 인식하여 반응하고, C1의 CHO기를 OH기로, C2의 OH기를 CO기로 변환하여 케토오스로 할 것인지, 혹은, 케토오스의 C1의 OH기와 C2의 CO기를 인식하여 반응하고, C1의 OH기를 CHO기로, C2의 CO기를 OH기로 변환하여 알도오스로 하는 이소머라아제 활성을 가진다.
본 발명에서 말하는 케토오스란, 케토오스 구조를 가지는 6탄당의 케토헥소오스 또는 5탄당의 케토펜토오스를 의미한다. 케토헥소오스에는, 알룰로오스(별명 프시코오스), 소르보스, 타가토스, 프룩토오스가 포함되고, 케토펜토오스에는, 리불로오스, 자일룰로스가 포함된다.
본 발명에서 말하는 알도오스란, 알도오스 구조를 가지는 6탄당의 알도헥소오스 또는 5탄당의 알도펜토오스를 의미한다. 알도헥소오스에는, 글루코오스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 갈락토오스, 만노스가 포함되고, 알도펜토오스에는, 리보스, 아라비노오스, 자일로스, 릭소스가 포함된다. D- 또는 L-이란, 이들 D-체 및 L-체를 의미한다.
본 발명의 L-람노스 이소머라아제는 L-람노스, L-릭소스, L-만노스, D-리보스, L-탈로스, 및 D-알로스에 작용하고, L-람노스-L-람눌로스 사이, L-릭소스-L-자일로스 사이, L-만노스-L-프룩토오스 사이, D-리보스-D-리불로오스 사이, L-탈로스-L-타가토스 사이, 및 D-알로스-D-알룰로오스 사이의 변환을 촉매할 수 있는, 폭넓은 기질 특이성을 가진다.
본 발명의 L-람노스 이소머라아제는 엔테로박터(Enterobacter)속에 속하고, L-람노스 이소머라아제 산생능을 가지는 미생물을 배양하고, 배양액 중에 생육한 균체 중에서 L-람노스 이소머라아제를 단리함으로써 조제할 수 있다. 엔테로박터(Enterobacter)속에 속하는 미생물로서는, 예를 들면, 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii) NrT7-1및 이들의 이변균주 등을 유리하게 이용할 수 있다. 이 출원을 할 때, NrT7-1주는, 2020년 11월 2일에 일본 지바현 기사라즈시 가즈사카마타리 2-5-8 소재의 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터에 국제기탁하고, 수령 번호 NITE ABP-03309로서 수령되고, 그 후 NrT7-1주는, 2020년 11월 30일자로 수탁번호 NITE BP-03309로서 정식으로 부다페스트 조약에 기초하여 국제기탁되었다.
본 발명의 L-람노스 이소머라아제는, 엔테로박터속의, L-람노스 이소머라아제 생산균을, L-람노스를 첨가한 무기염 배지에서 통기 배양한 후, 원심분리에 의해 균체를 배양액으로부터 회수한다. 회수한 균체를 10mM 트리스-HCl 완충액(pH7.5)을 이용하여 세정한 후, 10mL의 10mM 트리스-HCl 완충액(pH7.5) 중에 현탁시키고, 균체 현탁액을 얼음물 중에서 냉각하면서 초음파 호모지나이저로 세포 파쇄한다. 이들의 파쇄물을 원심분리하고, 그 원심 상청을 조효소액으로 한다.
정제 전의 조효소액의 L-람노스 이소머라아제의 활성은 D-알룰로오스를 기질로 하고, D-알로스의 생성량을 측정하는 것에 의해 확인할 수 있다.
역반응인 D-알로스로부터 D-알룰로오스로 변환하는 효소 활성에 대해서도 동일한 조건에서 측정한다. 이들 변환 반응은 통상 다음의 조건에서 행해진다. 기질 농도는 1∼60%(w/V), 바람직하게는, 약 5∼50%(w/V), 반응 온도는 40∼90℃, 바직하게는, 약 60∼90℃, 반응 pH는 6∼10, 바람직하게는, 약 6∼9, 반응 시간은 적절히 선택할 수 있지만, 배치 반응의 경우에는, 통상 4∼20시간의 범위가 선택된다.
조효소액은, 순차 음이온 교환 크로마토그래피와 소수(疏水) 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하여, 정제 효소를 단리할 수 있다. 효소가 정제된 것을 확인하기 위하여, SDS-PAGE(겔 농도 12.5%)에 걸어, 단일의 밴드가 얻어지는 것과 겉보기의 분자질량을 확인한다.
상기한 바와 같이 정제된 본 발명의 L-람노스 이소머라아제는, SDS-PAGE에 의한 서브유닛 분자질량이 약 47kDa이고, 그 활성화도가 금속 이온에 의해 조절되는 금속 효소이다. 기질과의 반응은 망간, 코발트, 마그네슘, 은, 철, 구리, 아연, 니켈, 칼슘, 알루미늄 및 나트륨으로 이루어지는 군으로부터 선택된 금속 이온의 농도 0.5∼5mM에서의 존재 하에서 행해질 수 있다.
본 발명의 L-람노스 이소머라아제는 소정의 아미노산 서열을 가지고 있고, 그 예로서는, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질, 또는 그것과 상동한 아미노산 서열을 가지고, 동등한 L-람노스 이소머라아제 활성을 유지하는 단백질을 들 수 있다. 상동한 아미노산 서열이란, 예를 들면 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 또는 94% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 가지는 것을 가리킨다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열(염기서열)의 동일성(%)은, 예를 들면 이하의 순서로 결정할 수 있다. 먼저, 최적인 비교가 가능하도록 2개의 서열을 늘어놓는다. 이 때, 예를 들면, 제1 서열에 갭을 도입하여, 제2 서열과의 얼라인먼트를 최적화해도 된다. 제1 서열의 특정 위치의 분자(아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드)가, 제2 서열에서의 대응하는 위치의 분자와 같을 때, 그 위치의 분자가 동일하다고 할 수 있다. 2개의 서열의 동일성은, 그 2개의 서열에 공통되는 동일 위치의 수의 함수이며(즉, 동일성(%)=동일 위치의 수/위치의 총수×100), 바람직하게는, 얼라인먼트의 최적화에 필요한 갭의 수 및 사이즈도 고려한다.
또한, 2개의 서열의 비교 및 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 실현 가능하다. 서열의 비교에 이용 가능한 수학적 알고리즘의 구체예로서는, Karlin 및 Altschul(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68에 기재되고, Karlin 및 Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77에 있어서 개변된 알고리즘이 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 이와 같은 알고리즘은, Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10에 기재된 NBLAST 프로그램 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)에 편입되어 있다. 본 발명의 핵산 분자에 등가의 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해서는, 예를 들면, NBLAST 프로그램에서 score=100, wordlength=12로 하여 BLAST 뉴클레오티드 검색을 행하면 된다.
본 발명의 DNA는, 본 발명의 L-람노스 이소머라아제 활성을 코딩하는 유전자이며, 소정의 염기서열을 가진다. 그 예로서는, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열, 서열번호 2로 표시되는 염기서열, 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열과 상동한 염기서열을 가지고, 또한, 서열번호 1의 단백질과 동등한 L-람노스 이소머라아제 활성을 유지하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 들 수 있다.
상동한 염기서열이란, 예를 들면 서열번호 2의 염기서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 또는 94% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상의 염기서열의 동일성을 가지는 것을 가리킨다.
본 발명에 관련된 DNA는 공지의 기술, 예를 들면 하이브리다이제이션 기술이나 PCR 기술 등을 조합하여 단리할 수 있다. 또한, 부위특이적 변이 도입에 의한 염기치환에 의해, L-람노스 이소머라아제 변이체를 작성할 수 있다. 부위특이적 변이 도입법은, 예를 들면 인버스 PCR법이나 가열 냉각법 등(무라마쓰 등 편집, 「개정 제4판 신유전자 공학 핸드북」, 요도샤, p.82-88)의 임의의 방법에 의해 행할 수 있다.
본 발명의 DNA를, 자율 복제 가능한 적의 벡터에 삽입하여 재조합 벡터로 할 수도 있다. 재조합 벡터는 DNA와 자율 복제 가능한 벡터로 이루어지고, DNA를 입수할 수 있으면, 상법의 재조합 DNA 기술에 의해 비교적 용이하게 조제할 수 있다. 클로닝이나 단백질의 발현이라는 사용 목적에 따라, 또한 숙주세포에 따라, 적절한 벡터가 선택된다. 이와 같은 벡터의 예로서는, pBR322, pUC18, pUB110, pTZ4, pC194, pHV14, TRp7, YEp7, pBS7 등의 플라스미드 벡터나 λgt·λC, λgt·λB, ρ11, φ1, φ105 등의 파지 벡터를 들 수 있다.
이와 같이 하여 얻어지는 재조합 벡터를 대장균, 고초균, 방선균, 효모를 비롯한 적절한 숙주세포에 도입할 수 있다. 도입 방법은, 인산칼슘 공침강법, 일렉트로포레이션법, 리포펙션법, 마이크로인젝션법 등의 공지의 방법을 이용한다. 형질전환된 숙주세포를 취득하기 위하여, 콜로니 하이브리다이제이션법 등을 적용한다.
본 발명의 L-람노스 이소머라아제, L-람노스 이소머라아제 활성을 가지는 단백질의 제조 방법은 특별히 한정되지 않고, 공지의 방법을 채용할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 L-람노스 이소머라아제는, 본 발명의 L-람노스 이소머라아제 생산능을 가지는 미생물, 또는 본 발명의 L-람노스 이소머라아제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA로 형질전환된 숙주세포를, 영양배지에서 배양하여 얻어지는 배양물로부터, L-람노스 이소머라아제 활성을 가지는 단백질을 채취함으로써 제조할 수 있다. 배양 방법에는 공지의 방법을 이용할 수 있고, 예를 들면 액체 배양 및 고체 배양 모두 이용할 수 있다.
이와 같이 하여, 균체를 배양한 후, 본 발명의 효소, 단백질을 정제·회수한다. 효소, 단백질의 정제·회수 방법은 공지의 방법을 자유롭게 선택하여 행할 수 있고, 예를 들면 배양액으로부터 회수하는 경우에는, 예를 들면, 배양 상청을 여과, 원심 처리 등을 하는 것에 의해, 불용물을 제거한 후, 한외여과막에 의한 농축, 유안침전 등의 염석, 투석, 이온 교환 수지 등의 각종 크로마토그래피 등을 적절히 조합하여 분리, 정제를 행할 수 있다. 또한, 균체 내로부터 회수하는 경우에는, 예를 들면 균체를 용해 효소 처리, 초음파 처리 등에 의해 파쇄한 후, 동일하게 분리, 정제를 행한다.
또한, 본 발명의 L-람노스 이소머라아제는 다른 이소머라아제와 마찬가지로, 보효소를 필요로 하지 않는 이성화 반응을 촉매하므로, 효소를 고정화해서의 이용이 가능하며, 각종 고정화 방법에 의해 활성이 높은 고정화 효소를 얻을 수 있다. 고정화 효소를 이용함으로써, 연속적으로 대량의 이성화 반응을 행하는 것이 가능하게 되고, 공지의 고정화 수단, 예를 들면, 담체 결합법, 가교법, 겔 포괄법, 마이크로캡슐화법 등을 이용하여 고정화 효소로 할 수 있고, 또한 담체는 공지의 임의의 담체이면 된다.
본 발명의 L-람노스 이소머라아제를 고정화하는 방법의 일태양은, 조효소액을 이용하는 고정화이다. 균체 현탁액을 초음파 처리함으로써 얻어진, L-람노스 이소머라아제를 포함하는 조효소액을 이온 교환 수지 등에 첨가하고, 저온 하에서 결합시키는 것에 의해, L-람노스 이소머라아제를 고정화할 수 있다.
균체 내로부터, L-람노스 이소머라아제를 취출하기 위해서는, 균체 세포벽을 파쇄할 필요가 있고, 초음파 처리 혹은 라이소자임 등의 효소 처리에 의한 파쇄 방법이 있는 것은 전술한 바와 같다. 초음파 처리에 의해 얻어지는 조효소액 중에, 활성을 가지는 L-람노스 이소머라아제가 많이 포함되는 것을 알 수 있었다. 조효소액으로부터 효소를 고정화하는 담체로서도, 고정화 담체로서 공지의 임의의 것을 사용할 수 있지만, 이온 교환 수지, 알긴산나트륨, 합성 흡착제 등이 편리하여 자주 사용된다.
이온 교환 수지 중, 예를 들면, 염기성 음이온 교환 수지로서는, 강염기성 음이온 교환 수지 혹은 약염기성 음이온 교환 수지 모두 사용할 수 있고, 예를 들면, 강염기성 음이온 교환 수지로서는, SA20A, PA418(미쓰비시 케미컬사 제조) 등을 들 수 있고, 약염기성 음이온 교환 수지로서는 WA30(미쓰비시 케미컬사 제조), FPA54, FPA95(오르가노사 제조) 등을 들 수 있다. 합성 흡착제로서는 XAD7HP(오르가노사 제조) 등을 들 수 있다.
약염기성 음이온 교환 수지를 담체에 이용하여 고정화 효소를 제조한 경우, 고정화한 L-람노스 이소머라아제는, 그 반응 후 용이하게 용리시킬 수 있으므로, 고정화 효소의 재생을 매우 간편하게 행할 수 있어, 생산 효율이 양호하다.
본 발명의 L-람노스 이소머라아제는, 본 발명의 L-람노스 이소머라아제 생산능을 가지는 미생물, 또는, L-람노스 이소머라아제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA로 형질전환된 숙주세포를, 영양배지에서 배양하여 얻어지는 배양물로부터, L-람노스 이소머라아제 활성을 가지는 단백질을 채취함으로써 제조할 수 있다. 배양 방법에는 공지의 방법을 이용할 수 있고, 예를 들면 액체 배양 및 고체 배양 모두 이용할 수 있다.
균체를 배지에서 배양한 후, 본 발명의 L-람노스 이소머라아제를 정제·회수한다. 단백질의 정제·회수 방법은 공지의 방법을 자유롭게 선택하여 행할 수 있고, 예를 들면, 배양액으로부터 회수하는 경우에는, 예를 들면 배양 상청을 여과, 원심 처리 등을 하는 것에 의해, 불용물을 제거한 후, 한외여과막에 의한 농축, 유안침전 등의 염석, 투석, 이온 교환 수지 등의 각종 크로마토그래피 등을 적절히 조합하여 분리, 정제를 행할 수 있다. 또한, 균체 내로부터 회수하는 경우에는, 예를 들면 균체를 용해 효소 처리, 초음파 처리 등에 의해 파쇄한 후, 마찬가지로 분리, 정제를 행한다.
본 발명의 정제된 L-람노스 이소머라아제 또는 고정화된 해당 효소를 이용하여, 기질로 될 수 있는 알도오스 또는 케토오스로부터 선택되는 1종 이상을 함유하는 용액에 작용시켜, 대응하는 케토오스 또는 알도오스를 생성하게 하여, 이들을 제조할 수 있다. 본 발명의 L-람노스 이소머라아제는 D-알로스에 대한 기질 특이성이 높고, 또한, 종래의 L-람노스 이소머라아제에 비하여 최적 온도가 80℃로 높고, 또한 보다 산성측에 최적 pH를 가지므로, 알칼리 이성화가 쉽게 일어나기 어려워 D-알로스 생산에 유리하다.
[실시예]
이하, 실험에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.
<실험 1: 균주의 유래 및 동정>
본 발명자들은 스크리닝에 의해 단리한 수많은 균을, L-람노스를 첨가한 액체 배지에 식균(植菌)하여 진탕배양을 행하고, L-람노스를 기질로 하여 L-람눌로스의 생성량을 측정하는 것에 의해, L-람노스 이소머라아제의 활성을 측정하였다.
이와 같이 하여, 가장 활성이 높은 균주로서 미생물 NrT7-1주를 찾아내고, NrT7-1주는 16S rRNA 유전자 염기서열 상동성에 기초하는 계통 해석에 의해, 엔테로박터에 속하는 것이 판명되었다.
<균주의 동정>
(1) 16S rRNA 유전자 염기서열 상동성
16S rRNA 유전자의 1-500bp 영역을 해석하고, 염기수 467bp를 특정하였다.
(2) 상동성 검색
이 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열에 대하여, BLAST 서치(일본 DNA 데이터 뱅크)에 의해 기준균주로 되어 있는 기지의 균종과의 상동성 검색을 행하였다. 상기 특정한 염기수 467bp의 염기서열에 대하여, 상동성 99.5% 이상이었던 균주명과 상동성(%)의 값으로부터, NrT7-1주의 미생물은, 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii)인 것이 결정되었다.
NrT7-1주는 2020년 11월 2일자로, 독립행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터에 국제기탁하고, 수탁번호 NITE BP-03309로서 국제기탁되었다.
<실험 2: 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii) NrT7-1(수탁번호 NITE BP-03309)주의 배양>
L-람노스 1.0%를 탄소원으로 하고 유안을 질소원으로 하는 무기염 액체 배지에, 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii) NrT7-1(수탁번호 NITE BP- 03309)주의 종배양액 1%(V/V)를 무균적으로 첨가하고, 통기 교반하면서 30℃에서 24시간 배양하였다.
<실험 3: 조효소의 조제>
NrT7-1주의 배양액으로부터, 원심분리에 의해 균체를 회수하였다. 회수한 균체는 각각 10mM Glycine-NaOH 완충액(pH9.0)을 이용하여 세정하고, 이어서, 균체를 10mL의 Glycine-NaOH 완충액(pH9.0)에 현탁한 후, 그 균체 현탁액을 얼음물 중에서 냉각하면서 초음파 호모지나이저(일본 에머슨 주식회사)로 세포 파쇄하였다. 파쇄물을 12,000rpm으로 20분간 원심하고, 그 원심 상청을 각각의 조효소로 하였다.
<실험 4: 효소의 정제>
1. 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피에 의한 정제
조효소액을 이온 크로마토그래피에 의한 정제를 행하였다. 이용한 컬럼은 완충액(20mM Tris-HCl pH7.5)에서 평형화한 HiTrapQ HP이며, AKTA 시스템을 이용하여 유속 5mL/min으로 1M NaCl의 농도구배로 0%부터 100%를 5mL씩의 프랙션으로 나누어 분획하였다. 효소 활성이 검출된 프랙션을 회수하여 이온 교환 크로마토 분리에 의한 정제 효소를 얻었다.
2. 이온 교환 크로마토 분리에 의해 정제한 효소를 소수 크로마토그래피에 의해 더 정제하였다. 이용한 컬럼은 HiTrap PHENYL이고, 효소액에 1M로 되도록 유안을 첨가하여 용해하고, 유속 5mL/min으로 2M의 유안 100%로부터 0%까지 농도를 낮추어 용출하고 5mL씩 분획하였다. 효소 활성이 검출된 획분을 투석하고 유안을 제거하여, 소수 크로마토 분리 정제 효소를 얻었다.
3. 소수 크로마토그래피에 의해 정제한 효소를 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 더 정제하였다. 이용한 컬럼은 Resource-Q이고, 효소액을 주입한 후, 유속 6mL/min에서 1M NaCl의 농도 구배로 0%부터 100%를 6mL씩의 프랙션으로 나누어 분획하였다. 효소 활성이 검출된 프랙션을 회수하여 이온 교환 크로마토 분리에 의한 정제 효소를 얻었다.
3. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
상법에 따라서 SDS-PAGE(겔 농도 12.5%)를 행하고, 정제 효소의 순도를 확인하였다. 결과를 도 1에 나타낸다. 결과는 약 47kDa에 단일의 밴드(중앙의 레인)가 인지되고, 이에 의해 효소는 순수하게 정제된 것이 확인되고, 정제한 본 효소는, SDS-PAGE에 의한 서브유닛 분자질량이 약 47kDa인 것이 판명되었다.
<실험 5: 효소의 이화학적 성질의 측정>
정제 효소인 L-람노스 이소머라아제 활성의 측정에 대해서는, 하기의 실험을 행하여 효소 반응을 행하였다. 기질로서 5mM L-람노스를 사용하고, 10분간의 효소 반응을 각 조건 하에서 행하고, 반응 후, 반응액에 10% 트리클로로아세트산 용액을 50μL 가함으로써 반응을 정지하고, 시스테인 카르바졸황산법에 의해 생성한 L-람눌로스를 측정하였다.
1. 반응 최적 pH
측정에 있어서, 반응의 최적 pH에 대하여 5mM L-람노스를 기질로서 사용하고, 각종 완충액 pH4∼11을 사용하여 30℃에서 10분간 반응하고, 생성한 L-람눌로스를 시스테인 카르바졸황산법을 이용하여 측정함으로써 구하였다.
반응 조건을 표 1에 나타낸다. 사용한 완충액을 표 2에 나타낸다.
[표 1]
[표 2]
결과를 도 2에 나타낸다. 본 효소의 반응 최적 pH는 8이고, 종래의 효소보다 산성측에서 높은 활성을 나타낸다.
2. pH 안정성
다음으로, 표 2의 pH4∼11의 4개의 완충액을 이용하여, 각 완충액 중에서, 30℃에서 24시간 유지한 후의 잔존 활성을 도 3에 나타낸다. 본 효소는 pH6∼10에 있어서 안정적이었다.
3. 반응 최적 온도
Tris-HCl 완충액에 의해 pH를 8로 조정하고, 30-100℃의 다양한 온도에서의 반응을 행하고, 최적 온도를 구하였다. 반응 조건을 표 3에, 결과를 도 4에 나타낸다. 각 온도에서 본 효소의 효소 활성이 확인되고, 최적 온도는 80℃인 것이 밝혀졌다.
[표 3]
4. 열안정성
표 3에 나타낸 상기 3.에서 최적 온도를 구한 반응 조건(10분)에 의해, 본 효소를 각 온도에서 10분간 보온한 후의 잔존 활성을 도 5에 나타낸다. 10분간 보온한 후의 온도 안정성에 있어서, 본 효소의 60℃에서의 상대 활성의 감소는 20% 미만이고, 고온에서 보다 안정적인 효소인 것을 알 수 있었다.
5. L-람노스 이소머라아제의 기질 특이성
L-람노스와 5종류의 알도오스(L-만노스, D-알로스, L-탈로스, L-릭소스, D-리보스)에 대한, 본 효소의 기질 특이성에 대하여 검토하였다. 효소 반응 조성은 하기 표 5에 나타내는 반응 조건과 마찬가지로, 각 기질 종농도(終濃度) 5mM, 금속염은 종농도 1mM로 되도록 염화망간을 가하고, 효소액(종농도 50mM Tris-HCl 완충액 pH8.0)에서, 60℃ 10분간 반응시키고 HPLC에 의한 분석에 의해 각각의 알도오스로부터 이성화된 케토오스를 측정하였다.
L-람노스의 이성화 활성을 100으로 하여, 각각의 알도오스에 대한 활성을 상대 활성으로서 나타내고 있다.
D-알로스(D-allose), L-만노스(L-Mannose), L-탈로스(L-Talose), L-릭소스(L-Lyxose), D-리보스(D-Ribose)를 기질로서 활성을 상대 활성으로 하여, 표 4와 도 6에 나타낸다.
[표 4]
가장 L-람노스에 대한 활성이 강하고, 이어서 L-릭소스, L-만노스, D-알로스, D-리보스, L-탈로스의 순이었다. 본 효소는, L-람노스-L-람눌로스 사이, L-릭소스-L-자일룰로스 사이, L-만노스-L-프룩토오스 사이, D-알로스-D-알룰로오스 사이, D-리보스-D-리불로오스 사이, L-탈로스-L-타가토스 사이의 이성화 반응을 촉매한다.
6. 금속 이온의 영향
다음으로, 본 효소 활성에 대한 금속 이온의 영향을 조사할 목적으로, 효소를 일부 투석하여 효소 활성을 측정하였다. 투석은, 효소액을 셀룰로오스막에 넣고, 20mM EDTA를 포함하는 Tris-HCl 완충액(pH8.0)에 담그고, 이 완충액을 천천히 16시간 걸쳐 교반하는 것에 의해 행하고, 다른 금속 이온의 영향을 제거하였다. 이렇게 하여 얻어진 아포효소의 효소 활성은, 각종 2가 및 3가 금속 이온 또는 나트륨 이온을 종농도 1mM의 존재 하(표 5의 반응 조건 하)에서 반응 후, 시스테인 카르바졸법에 의해 측정하였다.
그 결과, MnCl2와 CoCl2는 본 효소 활성을 현저하게 상승시키고, 본 효소는 금속 의존성을 나타내었다(도 7).
[표 5]
<실험 6: 효소를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 이것을 포함하는 재조합 벡터와 형질전환 숙주세포의 조제>
D-알로스 이소머라아제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA를 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii) NrT7-1주로부터 클로닝하고, 자립복제 가능한 재조합 DNA의 제작, 효소를 코딩하는 DNA의 염기서열의 결정, 및 형질전환 미생물의 조제를 행하였다.
<실험 6-1: 염색체 DNA의 전염기서열의 결정>
본균의 D-알로스 이소머라아제 활성을 가지는 효소 유전자는 기존의 유사 효소 유전자와 상이하고, PCR 증폭의 방법이나 기존의 단백질 데이터베이스를 이용하여 단리할 수 없었다. 그래서, 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii) NrT7-1주의 전체 게놈서열을 결정하고, 그 게놈 중의 전ORF를 코딩하는 단백질군의 데이터베이스의 구축을 행하였다. 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii) NrT7-1주 배양 균체를 공시균체로 하여 가부시키가이샤 마크로겐·재팬에 PacBio-RSII/Sequel을 사용한 차세대 시퀀스 해석을 의뢰하였다.
그 결과, 염기수 4,751,985bp와 161,947bp의 2개의 콘티그를 얻어졌다. 이 2개의 콘티그에서 약 4.9Mb이고, 어느 콘티그든 환형화하여 연결되어 있는 것으로부터, 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii) NrT7-1주의 전체 게놈서열을 커버할 수 있다고 생각하였다.
<실험 6-2: 단백질 데이터베이스의 구축>
얻어진 약 4.9Mb의 DNA 서열을 기초로, Prokka 프로그램을 이용하여 4,569개의 ORF를 추정하고, 각각의 ORF에 대하여 아미노산 서열을 추정하였다. 이 4,569개의 아미노산 서열을 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii) NrT7-1주의 단백질 데이터베이스로 하였다.
<실험 6-3: D-알로스 이소머라아제 활성을 가지는 단백질의 동정>
상기의 단백질 데이터베이스를 이용하여, 단백질 동정 시스템인 MASCOTserver(매트릭스 사이언스사)에 등록하고, D-알로스 이소머라아제 활성이 보여진 단백질의 동정을 행하였다. 공시 샘플에는, 단락 [0043]의 SDS-PAGE의 47kDa의 밴드를 사용하여, 환원 처리, 알킬화 처리 후, 트립신 소화한 단편을 LC-MS/MS 해석에 제공하였다.
그 결과, 하기의 419 아미노산으로 이루어지는 서열 1(서열표의 서열번호 1)의 아미노산 서열 중에서 밑줄을 쳐서 나타내는 아미노산 서열과 일치하고, 전체로서 90%의 동일성이 보여진 것으로부터, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii) NrT7-1주의 L-람노스 이소머라아제인 것이 강하게 시사되었다.
[서열 1]
MTTQLEQAWDLAKQRFAAVGVDVEEALRQLDRLPVSMHCWQGDDVAGFENPGGSLTGGIQATGNYPGKARNATELRADLELTLSLIPGPKRLNLHAIYLESDEPVARNEIKPEHFKNWVEWAKANKLGLDFNPSCFSHPLSADGFTLAHADDEIRQFWIDHVKASRRVSAYFGEQLGTPSVMNIWIPDGMKDITVDRLAPRQRLLAALDEAISEKLDPAHHIDAVESKLFGIGAESYTVGSNEFYMGYATSRQTALCLDAGHFHPTEVISDKISAAMLYVPRLLLHVSRPVRWDSDHVVLLDDETQAIASEIIRHDLFDRVHIGLDFFDASINRIAAWVIGTRNMKKALLRALLEPTAELKKLEANGDYTARLALLEEQKSLPWQAVWEMYCQRNDAPAGSQWLDNVRAYEEDVLSQRG
(서열 1 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii) NrT7-1주의 단백질 데이터베이스를 이용하여 동정한 아미노산 서열. 하선부로 나타내는 아미노산 서열이 LC-MS/MS 해석으로 얻어진 피크와 일치한 아미노산 서열.)
<실험 6-4: D-알로스 이소머라아제 활성을 가지는 효소 유전자의 단리>
아미노산 서열로부터 동정한 유전자 서열 2의 DNA 서열(서열표의 서열번호 2)을 합성하고, pQE60 벡터(Qiagen사)에 삽입하고, 발현용 대장균을 형질전환하였다. 구축한 대장균 발현계를 이용하여 유도 효소의 확인을 행하였다. 이 유도된 재조합 효소를 이용하여, 60%(w/V)의 D-알룰로오스를 기질로 30℃에서 12시간 반응시키고, HPLC에 의해 D-알로스 이소머라아제 활성을 확인한 결과, 본 재조합 효소는 D-알룰로오스로부터 D-알로스로의 이성화 반응을 촉매하고, 부생성물로서 우려되었던 D-알트로스도 생성하지 않았다. HPLC의 분석 결과를 도 8에 나타낸다. 15.234분의 피크가 D-알로스이고, 18.719분의 피크가 D-알룰로오스를 나타낸다.
[서열 2]
ATGACCACTCAATTAGAACAAGCCTGGGACCTGGCTAAACAGCGTTTCGCCGCCGTCGGCGTGGATGTCGAAGAGGCCCTGCGCCAGCTCGACCGTCTGCCCGTCTCTATGCACTGCTGGCAGGGCGATGACGTCGCCGGTTTCGAGAACCCGGGCGGTTCCCTGACGGGTGGTATTCAGGCCACGGGTAATTATCCGGGCAAAGCGCGTAACGCGACCGAGCTGCGCGCCGATCTGGAGCTGACCCTGAGCCTGATCCCGGGGCCAAAGCGCCTGAACCTGCACGCGATTTACCTCGAGTCCGACGAGCCGGTGGCGCGCAACGAAATCAAACCGGAGCATTTTAAGAACTGGGTGGAGTGGGCAAAAGCCAATAAGCTGGGCCTGGATTTCAACCCATCCTGCTTCTCGCATCCGCTGAGCGCGGACGGTTTTACCCTCGCCCACGCGGACGATGAAATCCGTCAGTTCTGGATCGACCACGTGAAGGCCAGCCGCCGCGTGTCTGCGTACTTTGGCGAGCAGCTCGGCACACCGTCGGTGATGAACATCTGGATCCCGGACGGCATGAAGGACATCACCGTCGACCGTCTTGCTCCGCGCCAGCGCCTGCTGGCCGCGCTGGATGAGGCCATCAGCGAGAAGCTGGACCCGGCGCACCACATCGACGCCGTGGAGAGCAAGCTGTTCGGCATTGGCGCCGAGAGCTACACCGTCGGCTCGAACGAGTTCTACATGGGGTACGCCACCAGCCGCCAGACCGCGCTGTGCCTGGATGCCGGTCACTTCCATCCGACCGAGGTGATCTCCGACAAAATCTCCGCTGCCATGCTCTACGTGCCGCGCCTGCTGCTGCACGTCAGCCGTCCGGTGCGCTGGGACAGCGACCACGTAGTGCTGCTGGATGACGAAACCCAGGCGATTGCGAGCGAAATCATCCGCCACGACCTCTTTGACCGCGTCCACATCGGCCTCGACTTCTTCGATGCCTCCATCAACCGCATCGCGGCGTGGGTTATCGGCACCCGCAACATGAAGAAAGCCCTGCTGCGCGCCCTGCTGGAGCCGACTGCCGAACTGAAAAAGCTGGAAGCAAACGGTGACTACACCGCGCGTCTGGCGCTGCTGGAAGAGCAGAAATCTCTGCCGTGGCAGGCGGTGTGGGAGATGTACTGCCAGCGTAACGACGCCCCGGCGGGCAGCCAGTGGCTGGACAACGTGCGGGCGTATGAGGAAGACGTGTTGAGTCAGCGCGGGTAA
<실험 7: 재조합 효소의 이화학적 성질의 측정>
실험 6에서 취득한 재조합 효소의 이화학적 성질을 실험 5와 동일한 조건에서 측정하였다.
1. 반응 최적 pH
측정에 있어서, 반응의 최적 pH에 대하여 5mM L-람노스를 기질로서 사용하고, 각종 완충액 pH4∼11을 사용하여 30℃에서 10분간 반응하고, 생성한 L-람눌로스를, 시스테인 카르바졸황산법을 이용하여 측정함으로써 구하였다. 반응 조건은 표 1과 동일하며, 사용한 완충액을 표 6에 나타낸다.
[표 6]
도 9에 결과를 나타낸다. 재조합 효소의 최적 pH는 7.5∼8.0이었다.
2. pH 안정성
표 6의 pH4∼11의 4개의 완충액을 사용하여, 각 완충액 중에서, 30℃에서 24시간 유지한 후의 잔존 활성을 도 10에 나타낸다. 재조합 효소는 pH 7.0∼11.0에 있어서 안정적이었다.
3. 반응 최적 온도
Tris-HCl 완충액에 의해 pH를 7.5로 조정하고, 30-80℃의 다양한 온도에서 10분의 반응을 행하고, 최적 온도를 구하였다. 결과를 도 11에 나타낸다. 최적 온도는 70℃였다.
4. 열안정성
재조합 효소를 상기 3.에서 최적 온도를 구한 반응 조건에 의해, 각 온도에서 10분간 보온한 후의 잔존 활성을 도 12에 나타낸다. 10분간 보온한 후의 온도 안정성은 60℃까지였다.
5. 기질특이성
표 5에 나타내는 효소 반응 조성에 의해, 각 기질 종농도 5mM, 금속염은 종농도 1mM로 되도록 염화망간을 가하고, 효소액(종농도 50mM Tris-HCl 완충액 pH7.5)에서 70℃ 10분간 반응시키고, HPLC에 의한 분석에 의해 각각의 알도오스로부터 이성화된 케토오스를 측정하였다. L-람노스의 이성화 활성을 100으로 하여, 각각의 알도오스에 대한 활성을 상대 활성으로서 도 13에 나타낸다.
L-람노스, L-릭소스(L-Lyxose), L-만노스(L-Mannose), D-리보스(D-Ribose), D-알로스(D-allose)에 대하여 활성을 나타내었다.
6. 금속 이온의 영향
재조합 효소 활성에 대한 금속 이온의 영향을 조사할 목적으로, 효소를 일부 투석하여 효소 활성을 측정하였다. 투석은, 효소액을 셀룰로오스막에 넣고, 20mM EDTA를 포함하는 Tris-HCl 완충액(pH7.5)에 담그고, 이 완충액을 천천히 16시간 걸쳐 교반하는 것에 의해 행하고, 다른 금속 이온의 영향을 제거하였다. 이렇게 하여 얻어진 아포효소의 효소 활성은, 각종 2가 및 3가 금속 이온 또는 나트륨 이온을 종농도 1mM의 존재 하에서 반응 후, 시스테인 카르바졸법에 의해 측정하였다.
결과를 도 14에 나타낸다. CoCl2 및 MnCl2를 첨가함으로써 활성이 증가하였다.
<실험 8: 다른 균주 유래의 L-람노스 이소머라아제와의 비교(그 1)>
1. 효소 반응으로의 금속 이온의 영향
얻어진 NrT7-1 유래 재조합 조효소를 이용하여 D-알룰로오스와 D-알로스 사이의 가역적인 이성화 반응을 행할 때의 금속 이온의 영향에 대하여 Gual218-3 유래 재조합 조효소 및 AgM30 유래 재조합 조효소와 비교하였다.
결과를 표 7에 나타낸다. 금속 이온으로서 2mM의 CoCl2 및 MnCl2를 사용했을 때 이성화 반응을 확인할 수 있었다. 또한, 기준 효소인 AgM30 유래의 재조합 조효소 및 Gual218-3 유래의 재조합 조효소와 비교하여 NrT7-1 유래 재조합 조효소는 높은 활성을 나타내었다.
[표 7]
<실험 9: 본 효소의 배양 시의 금속 이온의 영향>
재조합 효소를 이용한 반응 시에 금속 이온으로서 2mM의 CoCl2 및 MnCl2를 가함으로써 높은 활성을 확인할 수 있었기 때문에, 배양 시에 금속 이온을 가함으로써 반응 시에 금속 이온을 가하지 않아도 반응이 가능한지 검토하였다. 금속 이온을 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 조효소를 이용하여 D-알룰로오스를 기질로 효소 반응을 행한 결과, 표 8에 나타낸 바와 같이, 금속 이온 비첨가 및 MgCl2를 첨가했을 때는 활성이 거의 보여지지 않았다. 그러나, CoCl2 및 MnCl2를 첨가한 배지에서 배양하여 얻어진 조효소에서는 활성을 확인할 수 있고, 특히 MnCl2를 첨가한 배지에서 배양하여 얻어진 조효소는 가장 높은 활성을 나타내었으며, 60℃에서 1시간 열처리했을 때의 잔존 활성도 가장 높았다.
[표 8]
<실험 10: 다른 균주 유래의 L-람노스 이소머라아제와의 비교(그 2)>
2. 최적 온도와 내열성(T70/T50)
본 연구에서 얻어진 NrT7-1 유래의 재조합 조효소 및 이전의 특허에서 기재한 Gual218-3 유래의 재조합 조효소를 이용하여 최적 온도를 검토하였다.
그 결과, NrT7-1 유래의 재조합 조효소의 최적 온도는 70℃이고, Gual218-3 유래의 재조합 조효소의 최적 온도(60℃)보다 높았다. 또한, 내열성의 지표인 70℃의 활성(T70)과 50℃의 활성(T50)의 비(T70/T50)도 NrT7-1 유래의 재조합 조효소는 Gual218-3 유래의 재조합 조효소보다 높았다.
[표 9]
본 발명의 L-람노스 이소머라아제는, 미생물 유래의 종래의 L-람노스 이소머라아제와 비교하여, 특히 높은 내열성을 가지는 것이 특징이다. 예를 들면, 종래의 에르위니아 빌링기아에(Erwinia billingiae) 유래의 L-람노스 이소머라아제는, 최적 온도가 70℃인 것에 대하여, 본 발명의 효소는 80℃로 높아 공업적 생산에서의 사용에 적합하다.
또한, 본 발명의 L-람노스 이소머라아제의 최적 pH는 pH 8.0(Tris-HCl 완충액)이고, GuaL218-3 유래의 L-람노스 이소머라아제의 pH 9.0(Glycine-NaOH 완충액)과 비교하면, 보다 산성측에 최적 pH를 가지므로, 알칼리 이성화가 쉽게 일어나기 어려워 D-알로스 생산에 유리하다.
따라서, 본 발명의 L-람노스 이소머라아제와 그 제조 방법의 확립은, 제당 산업뿐만 아니라, 이것과 관련된 식품, 화장품, 의약품 산업에서의 공업적 의의가 지극히 크다.
SEQUENCE LISTING
<110> NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION KAGAWA UNIVERSITY
<120> Novel L-rhamnose isomerase
<130> PCT21771UK
<150> JP2020-189419
<151> 2020-11-30
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 419
<212> PRT
<213> Enterobacter roggenkampii
<400> 1
Met Thr Thr Gln Leu Glu Gln Ala Trp Asp Leu Ala Lys Gln Arg Phe
1 5 10 15
Ala Ala Val Gly Val Asp Val Glu Glu Ala Leu Arg Gln Leu Asp Arg
20 25 30
Leu Pro Val Ser Met His Cys Trp Gln Gly Asp Asp Val Ala Gly Phe
35 40 45
Glu Asn Pro Gly Gly Ser Leu Thr Gly Gly Ile Gln Ala Thr Gly Asn
50 55 60
Tyr Pro Gly Lys Ala Arg Asn Ala Thr Glu Leu Arg Ala Asp Leu Glu
65 70 75 80
Leu Thr Leu Ser Leu Ile Pro Gly Pro Lys Arg Leu Asn Leu His Ala
85 90 95
Ile Tyr Leu Glu Ser Asp Glu Pro Val Ala Arg Asn Glu Ile Lys Pro
100 105 110
Glu His Phe Lys Asn Trp Val Glu Trp Ala Lys Ala Asn Lys Leu Gly
115 120 125
Leu Asp Phe Asn Pro Ser Cys Phe Ser His Pro Leu Ser Ala Asp Gly
130 135 140
Phe Thr Leu Ala His Ala Asp Asp Glu Ile Arg Gln Phe Trp Ile Asp
145 150 155 160
His Val Lys Ala Ser Arg Arg Val Ser Ala Tyr Phe Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Thr Pro Ser Val Met Asn Ile Trp Ile Pro Asp Gly Met Lys Asp
180 185 190
Ile Thr Val Asp Arg Leu Ala Pro Arg Gln Arg Leu Leu Ala Ala Leu
195 200 205
Asp Glu Ala Ile Ser Glu Lys Leu Asp Pro Ala His His Ile Asp Ala
210 215 220
Val Glu Ser Lys Leu Phe Gly Ile Gly Ala Glu Ser Tyr Thr Val Gly
225 230 235 240
Ser Asn Glu Phe Tyr Met Gly Tyr Ala Thr Ser Arg Gln Thr Ala Leu
245 250 255
Cys Leu Asp Ala Gly His Phe His Pro Thr Glu Val Ile Ser Asp Lys
260 265 270
Ile Ser Ala Ala Met Leu Tyr Val Pro Arg Leu Leu Leu His Val Ser
275 280 285
Arg Pro Val Arg Trp Asp Ser Asp His Val Val Leu Leu Asp Asp Glu
290 295 300
Thr Gln Ala Ile Ala Ser Glu Ile Ile Arg His Asp Leu Phe Asp Arg
305 310 315 320
Val His Ile Gly Leu Asp Phe Phe Asp Ala Ser Ile Asn Arg Ile Ala
325 330 335
Ala Trp Val Ile Gly Thr Arg Asn Met Lys Lys Ala Leu Leu Arg Ala
340 345 350
Leu Leu Glu Pro Thr Ala Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ala Asn Gly Asp
355 360 365
Tyr Thr Ala Arg Leu Ala Leu Leu Glu Glu Gln Lys Ser Leu Pro Trp
370 375 380
Gln Ala Val Trp Glu Met Tyr Cys Gln Arg Asn Asp Ala Pro Ala Gly
385 390 395 400
Ser Gln Trp Leu Asp Asn Val Arg Ala Tyr Glu Glu Asp Val Leu Ser
405 410 415
Gln Arg Gly
<210> 2
<211> 1260
<212> DNA
<213> Enterobacter roggenkampii
<400> 2
atgaccactc aattagaaca agcctgggac ctggctaaac agcgtttcgc cgccgtcggc 60
gtggatgtcg aagaggccct gcgccagctc gaccgtctgc ccgtctctat gcactgctgg 120
cagggcgatg acgtcgccgg tttcgagaac ccgggcggtt ccctgacggg tggtattcag 180
gccacgggta attatccggg caaagcgcgt aacgcgaccg agctgcgcgc cgatctggag 240
ctgaccctga gcctgatccc ggggccaaag cgcctgaacc tgcacgcgat ttacctcgag 300
tccgacgagc cggtggcgcg caacgaaatc aaaccggagc attttaagaa ctgggtggag 360
tgggcaaaag ccaataagct gggcctggat ttcaacccat cctgcttctc gcatccgctg 420
agcgcggacg gttttaccct cgcccacgcg gacgatgaaa tccgtcagtt ctggatcgac 480
cacgtgaagg ccagccgccg cgtgtctgcg tactttggcg agcagctcgg cacaccgtcg 540
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cgccagcgcc tgctggccgc gctggatgag gccatcagcg agaagctgga cccggcgcac 660
cacatcgacg ccgtggagag caagctgttc ggcattggcg ccgagagcta caccgtcggc 720
tcgaacgagt tctacatggg gtacgccacc agccgccaga ccgcgctgtg cctggatgcc 780
ggtcacttcc atccgaccga ggtgatctcc gacaaaatct ccgctgccat gctctacgtg 840
ccgcgcctgc tgctgcacgt cagccgtccg gtgcgctggg acagcgacca cgtagtgctg 900
ctggatgacg aaacccaggc gattgcgagc gaaatcatcc gccacgacct ctttgaccgc 960
gtccacatcg gcctcgactt cttcgatgcc tccatcaacc gcatcgcggc gtgggttatc 1020
ggcacccgca acatgaagaa agccctgctg cgcgccctgc tggagccgac tgccgaactg 1080
aaaaagctgg aagcaaacgg tgactacacc gcgcgtctgg cgctgctgga agagcagaaa 1140
tctctgccgt ggcaggcggt gtgggagatg tactgccagc gtaacgacgc cccggcgggc 1200
agccagtggc tggacaacgt gcgggcgtat gaggaagacg tgttgagtca gcgcgggtaa 1260
Claims (16)
- 엔테로박터(Enterobacter)속에 속하는 미생물 유래의 L-람노스 이소머라아제로서, SDS-PAGE에 의해 측정한 서브유닛의 분자질량이 47kDa이고, 하기 (A) 및 (B)의 기질 특이성을 가지는 L-람노스 이소머라아제:
(A) 알도오스의 C1의 CHO기와 C2의 OH기를 인식하여 반응하고, C1의 CHO기를 OH기로, C2의 OH기를 CO기로 변환하거나, 혹은, 케토오스의 C1의 OH기와 C2의 CO기를 인식하여 반응하고, C1의 OH기를 CHO기로, C2의 CO기를 OH기로 변환하는 이소머라아제 활성을 가지고,
(B) L-람노스, L-릭소스, L-만노스, D-알로스, D-리보스, 및 L-탈로스에 대하여 반응성을 가짐. - 제1항에 있어서,
하기 (C) 및 (D)의 이화학적 성질을 가지는, L-람노스 이소머라아제:
(C) 반응 최적 pH는 8이고,
(D) 반응 최적 온도는 80℃임. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
엔테로박터속에 속하는 미생물이 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii)인, L-람노스 이소머라아제. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
엔테로박터속에 속하는 미생물이 특허 미생물 기탁 센터에 수탁번호 NITE BP-03309로서 국제기탁되어 있는 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii) NrT7-1인, L-람노스 이소머라아제. - 이하의 (a) 또는 (b)에 기재된 단백질:
(a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질
(b) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지고, 하기 (A) 및 (B)의 L-람노스 이소머라아제 활성을 가지는 단백질
(A) 알도오스의 C1의 CHO기와 C2의 OH기를 인식하여 반응하고, C1의 CHO기를 OH기로, C2의 OH기를 CO기로 변환하거나, 혹은, 케토오스의 C1의 OH기와 C2의 CO기를 인식하여 반응하고, C1의 OH기를 CHO기로, C2의 CO기를 OH기로 변환하는 이소머라아제 활성을 가지고,
(B) L-람노스, L-릭소스, L-만노스, D-알로스, D-리보스, 및 L-탈로스에 대하여 반응성을 가짐. - 제5항에 기재된 단백질을 코딩하는 DNA.
- 이하의 (a) 또는 (b)에 기재된 DNA:
(a) 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지는 DNA
(b) 서열번호 2로 표시되는 염기서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 염기서열로 이루어지고, 하기 (A) 및 (B)의 L-람노스 이소머라아제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA
(A) 알도오스의 C1의 CHO기와 C2의 OH기를 인식하여 반응하고, C1의 CHO기를 OH기로, C2의 OH기를 CO기로 변환하거나, 혹은, 케토오스의 C1의 OH기와 C2의 CO기를 인식하여 반응하고, C1의 OH기를 CHO기로, C2의 CO기를 OH기로 변환하는 이소머라아제 활성을 가지고,
(B) L-람노스, L-릭소스, L-만노스, D-알로스, D-리보스, 및 L-탈로스에 대하여 반응성을 가짐. - 제6항 또는 제7항에 기재된 DNA를 함유하는 재조합 벡터.
- 제8항에 기재된 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환 숙주세포.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 L-람노스 이소머라아제를 생산하는, 특허 미생물 기탁 센터에 수탁번호 NITE BP-03309로서 국제기탁되어 있는, 엔테로박터 로겐캄피(Enterobacter roggenkampii) NrT7-1.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 L-람노스 이소머라아제, 또는 제5항에 기재된 단백질이 담체에 고정화되어 있는, 고정화 단백질.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 L-람노스 이소머라아제가 균체 파쇄물 중에 존재하는 조효소(粗酵素)의 상태로, 또는 제5항에 기재된 단백질이 형질전환 숙주세포의, 균체 파쇄물 중에 존재하는 조단백질의 상태로 담체에 고정화되어 있는, 고정화 단백질.
- 제11항 또는 제12항에 있어서,
상기 담체가, 이온 교환 수지 또는 합성 흡착제인, 고정화 단백질. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 L-람노스 이소머라아제를 생산하는 엔테로박터속 미생물, 또는 제9항에 기재된 형질전환 숙주세포를 배지 중에서 배양하여, 미생물 균체 내에 상기 L-람노스 이소머라아제를 축적시키고, 이것을 채취하는, L-람노스 이소머라아제의 제조 방법.
- 제14항에 있어서,
상기 배지가 L-람노스를 첨가한 무기염 배지인, L-람노스 이소머라아제의 제조 방법. - 알도오스 또는 케토오스로부터 선택되는 1종 이상을 함유하는 용액에, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 L-람노스 이소머라아제, 제5항에 기재된 단백질, 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 고정화 단백질을 작용시켜, 대응하는 케토오스 또는 알도오스를 생성하게 하고, 이것을 채취하는, 케토오스 또는 알도오스의 제조 방법.
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